JP2003018995A - ジベンゾチオフェン類を分解する微生物脱硫法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 炭化水素燃料中の硫黄含量を低減させる手段
を提供すること。 【解決手段】 ジベンゾチオフェン類分解酵素をコード
する遺伝子及び酸化還元酵素をコードする遺伝子を共発
現するベクターが導入された、ジベンゾチオフェン類分
解微生物、及びその微生物を用いてジベンゾチオフェン
類を分解する。ジベンゾチオフェン類分解酵素をコード
する遺伝子は、ロドコッカス属、スフィンゴモナス属、
ペニバチルス属、アグロバクテリウム属、マイコバクテ
リウム属、ゴルドナ属、バチルス属若しくはアルスロバ
クター属の微生物又はそれらの変異株由来であり、酸化
還元酵素をコードする遺伝子は、ペニバチルス・ボリミ
キサＡ−１株由来である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物を利用する
チオフェン系化合物を分解する機能を有する酵素をコー
ドする遺伝子と、これらと共役してNADHを酸化しFMNを
還元する機能を有する酵素をコードする遺伝子とを微生
物内で共発現するベクターを用いて、脱硫反応を行う微
生物を作出する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】石油のような炭化水素燃料から硫黄を除
去する脱硫のための方法としては、アルカリ洗浄や溶剤
脱硫などの方法も知られているが、現在では水素化脱硫
が主流となっている。水素化脱硫は、石油留分中の硫黄
化合物を触媒の存在下で水素と反応させ、硫化水素とし
て除去して製品の低硫黄化を図る方法である。触媒とし
ては、アルミナを担体としてコバルト、モリブデン、ニ
ッケル、タングステンなどの金属触媒が使用される。モ
リブデン担持アルミナ触媒の場合には、触媒性能を向上
させるために、通常コバルトやニッケルが助触媒として
加えられる。金属触媒を用いた水素化脱硫は、現在世界
中で広く使用されているきわめて完成度の高いプロセス
であることは疑いのないことである。しかし、より厳し
い環境規制に対応した石油製品を作るためのプロセスと
いう観点からは、いくつかの問題点がある。以下にその
例を簡単に記載する。

【０００３】金属触媒は、一般にその基質特異性が低
く、このため多様な種類の硫黄化合物を分解し、化石燃
料全体の硫黄含量を低下させる目的には適しているが、
特定のグループの硫黄化合物、すなわちベンゾチオフェ
ンやジベンゾチオフェン（DBT）のような複素環式有機
硫黄化合物及びそれらのアルキル誘導体類に対してはそ
の脱硫効果が不十分となることがあると考えられる。た
とえば、脱硫後の軽油中にはなおも種々の複素環式有機
硫黄化合物が残存している。このように金属触媒による
脱硫効果が不十分となる原因の一つは、これらの有機硫
黄化合物中の硫黄原子の周囲に存在する置換基による立
体障害が考えられる。これらの置換基のうち、メチル置
換基の存在が水素化脱硫における金属触媒の反応性に及
ぼす影響は、チオフェン、ベンゾチオフェン、DBTなど
について検討されている。それらの結果によると、一般
的には置換基の数が増すほど脱硫反応は減少するが、置
換基の位置が反応性に及ぼす影響もきわめて大きいこと
が明らかである。メチルDBT類の脱硫反応性を比較し、
置換基による立体障害が金属触媒の反応性に及ぼす影響
が非常に大きいことを示した報告は、たとえば、Houall
a, M., Broderick, D.H.,Sapre, A.V., Nag, N.K., de
Beer, V.H., Gates, B.C., Kwart, H.J., Catalt., 61,
523-527(1980)に見られる。実際、これらのDBTの種々
のアルキル化誘導体が軽油中にかなりの量存在すること
が知られている（たとえば、Kabe, T.,Ishihara, A.及
びTajima, H. lnd. Eng. Chem. Res., 31, 1577-1580(1
992)）。

【０００４】上記のように水素化脱硫に抵抗性を示す有
機硫黄化合物を脱硫するためには、現在用いられている
脱硫法よりも高い反応温度や圧力が必要とされ、また、
添加する水素の量も非常に増大すると考えられている。
このような水素化脱硫プロセスの改良は、ばく大な設備
投資と運転コストを必要とすることが予想される。この
ような水素化脱硫に抵抗性を示す有機硫黄化合物を主た
る硫黄化合物種として含むものとしては、たとえば、軽
油があり、軽油のより高度な脱硫（超深度脱硫）を行う
場合には上記のような水素化脱硫プロセスの大幅な改良
が要求される。

【０００５】一方、生物が行う酵素反応は比較的穏和な
条件下で進行し、しかも酵素反応の速度自体は、化学触
媒を用いた反応の速度と遜色のないという特徴を有して
いる。さらに、生体内で起こる多種多様の生物反応に適
切に対応する必要があるため、非常に多くの種類の酵素
が存在し、それらの酵素は一般的に非常に高い基質特異
性を示すことが知られている。このような特徴は、微生
物を用いて化石燃料中に含まれる硫黄化合物中の硫黄の
除去を行ういわゆるバイオ脱硫反応においても活かされ
るものと期待されている（Monticello, D.J., Hydrocar
bon Processing39-45(1994)）。

【０００６】このような背景から、微生物を用いて軽油
から複素環式有機硫黄化合物を分解する方法についても
多数検討されている。原油や石炭のみならず硫黄を含ん
だモデル化合物を分解し、ヘテロ原子である硫黄を選択
的に除去して、硫酸塩や水酸化化合物を産生する微生物
類が報告されている。現在まで知られている複素環式有
機硫黄化合物分解菌の多くは、DBTあるいはアルキルDBT
を分解するものである。このタイプの反応は、その代謝
産物の構造から考えて、硫黄化合物中のC-S 結合を特異
的に切断して、その結果硫黄を硫酸塩の形で遊離する反
応であると考えられる。

【０００７】このようなC-S結合切断型のDBT分解反応を
行う微生物は、いくつかの属の細菌で知られている。例
えば、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus er
ythropolis）IGTS8株(ATCC53968) (Kilbane,J.J. Resou
rces, Conservation and Recycling, 3, 69-70 (1990))
はよく研究されたDBT分解菌株であり、DBTの硫黄原子に
酸素原子を付加し、ジベンゾチオフェンスルホキシド
（DBTO）からジベンゾチオフェンスルホン（DBTO₂）を
生成し、次いで2'-ヒドロキシビフェニル-2-スルフィン
酸塩を経て2-ヒドロキシビフェニル（2-HBP）を生成す
る反応を行う。その他、C-S結合切断型のDBT分解反応を
行う微生物としては、例えば、コリネバクテリウム・エ
スピー（Corynebacterium sp.）SY-1株（Ohmori, T., M
onna,L.,Saiki, Y.及びKodama,T. Appl.Environ. Micro
biol.,58,911-915, 1992）、ブレビバクテリウム・エス
ピー（Brevibacterium sp.）DO株（van Afferden, M.,S
chacht, S., Klein, J.及びTruper,H.G.,Arch. Microbi
ol.,153, 324-328,1990）や、アルスロバクター・エス
ピー（Arthrobacter sp.）K3b株（Dahlberg, M.D.(199
2) Third International Symposium on the Biological
Processing of Coal,May4-7, ClearwaterBeach,FL,pp.
1-10.Electric Power Research Institute, PaloAlto,
CA.）、ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株（特開
平11-9293号公報）などが知られている。

【０００８】C-S 結合切断型の脱硫反応を起こすことが
知られている細菌で、そのDBT分解反応に関与する酵素
活性をコードする遺伝子が同定され、その塩基配列が決
定されているものとして、例えば、ロドコッカス・エリ
スロポリス IGTS8 株のdsz遺伝子（Denome, S., Oldfle
ld., C., Nash, L.J.及びYoung, K. D. J.Bacteriol.,
176:6707-6716, 1994; Piddington, C.S., Kovacevich,
B.R.及びRambosek, J. Appl.Environ. Microbiol., 6
1:468-475, 1995）、スフィンゴモナス・エスピー（Sph
ingomonas sp.）AD109株のdsz遺伝子（米国特許第6,13
3,016号）、並びにペニバチルス・エスピー（Paenibaci
llus sp.）A11-2株のtds遺伝子（Y. Ishii, J. Konish
i, H. Okada, K. Hirasawa, T. Onaka, M. Suzuki., Bi
ochem. Biophy. Res. Comm., 2000）が挙げられる。ロ
ドコッカス・エリスロポリス IGTS8株によるDBT分解反
応は、DBTからDBTOを経てDBTO₂への変換を触媒するDsz
C、DBTO₂から2-(2'-ヒドロキシフェニル)ベンゼンスル
フィン酸への変換を触媒するDszA、及び2-(2'-ヒドロキ
シフェニル)ベンゼンスルフィン酸から2-HBPへの変換を
触媒するDszBの３つの酵素により触媒される（Denome,
S., Oldfield., C., Nash, L.J.及びYoung,K.D. J.Bact
eriol.,176:6707-6716, 1994; Gray, K.A., Pogrebinsh
y, O.S., Mrachko, G.T., Xi, L. Monticello, D.J.及
びSquires, C.H. Nat Biotechnol., 14:1705-1709, 199
6;並びにOldfield, C., Pogrebinsky, O.,Simmonds,
J., Olson, E.S.及びKulpa, C.F., Microbiology, 143:
2961-2973, 1997）。上記それぞれの酵素をコードする
遺伝子はdszC、dszA、及びdszBと呼ばれている。

【０００９】DszCとDszAはモノオキシゲナーゼで、両者
ともその酸素添加反応にはNADH-FMN酸化還元酵素活性の
共存を必要とすることが知られている（Gray, K.A., Po
grebinsky, O.S., Mrachko, G.T., Xi, L. Monticello,
D.J.及びSquires, C.H. NatBiotechnol., 14:1705-170
9, 1996; Xi, L. Squires, C.H., Monticello, D.J.及
びChids, J.D. Biochem. Biophys. Res Commun., 230:7
3-76, 1997）。ロドコッカス・エリスロポリス IGTS8株
由来のNADH-FMN酸化還元酵素活性を有する酵素はDszDと
呼ばれ、その遺伝子配列がGray, K.A.らにより報告され
ている（米国特許第5,804,433号、又は米国特許第5,81
1,285号）。

【００１０】種々のNADH-FMN酸化還元酵素からDszC、Ds
zAに最適なものを選ぶことにより、脱硫活性を向上させ
ることが期待される。NADH-FMN酸化還元酵素は非脱硫細
菌にも広く分布しており、本発明者らは天然界から広く
DBT酸化を促進するNADH-FMN酸化還元酵素生産菌をスク
リーニングした結果、ペニバチルス・ポリミキサ（Paen
ibacillus polymyxa）A-1株を土壌から分離し、それか
らDBT酸化反応を促進する酸化還元酵素Flvをコードする
遺伝子flvの単離に成功した（特開2000-245478号公
報）。flvの塩基配列は、サーマス・サーモフィラス（T
hermus thermophilus）HB8株のNADHデヒドロゲナーゼ及
びビブリオ・フィスケリ（Vibrio fischeri）の主要なN
AD(P)H-フラビンオキシドレダクターゼ（FraseI）など
と相同性が高かった。また、本発明者らはペニバチルス
・ポリミキサA-1株とロドコッカス・エリスロポリスD-1
株の酸化還元酵素のDszC及びDszAに対する活性の違いを
比較した。その結果、ペニバチルス・ポリミキサA-1株
をもちいたカップリングアッセイの場合、DszCで4倍、D
szAで5倍の活性が得られた。しかしながら、脱硫活性を
向上させるためには、より効率性の高い方法の開発が望
まれる。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、遺伝
子工学的手法を用いて、ジベンゾチオフェン類分解酵素
遺伝子及びそれと共役する酸化還元酵素遺伝子とを共発
現させることにより、効率的に炭化水素燃料中の硫黄含
量を低減させる手段を提供することにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ロドコッカス・エ
リスロポリス KA2-5-1株に、ジベンゾチオフェン（DB
T）類分解酵素遺伝子及び非脱硫微生物由来のNADH-FMN
酸化還元酵素遺伝子を導入したところ、得られる形質転
換株のDBT類を分解する能力、すなわち脱硫活性が向上
することを見出し、本発明を完成した。

【００１３】すなわち、本発明は、以下の１〜１６を提
供する。 １．ジベンゾチオフェン類分解酵素をコードする遺伝子
と酸化還元酵素をコードする遺伝子とを共発現すること
ができるベクター。 ２．ジベンゾチオフェン類分解酵素遺伝子が、ロドコッ
カス属、スフィンゴモナス属、ペニバチルス属、アグロ
バクテリウム属、マイコバクテリウム属、ゴルドナ属、
バチルス属若しくはアルスロバクター属に属する微生
物、又はそれらの変異株由来のものである、上記の１記
載のベクター。 ３．ロドコッカス属に属する微生物がロドコッカス・エ
リスロポリスKA2-5-1株、ロドコッカス・エリスロポリ
スIGTS8株、ロドコッカス・エリスロポリス D-1株、ロ
ドコッカス・エリスロポリス H-2株、ロドコッカス・エ
リスロポリス N1-36株、ロドコッカス・エリスロポリス
I-19株、ロドコッカス・エスピー ECRD-1株、ロドコッ
カス・エスピー B1株、ロドコッカス・エスピー SY-1
株、又はロドコッカス・エスピー UM3株若しくはUM9株
である、上記の２記載のベクター。 ４．スフィンゴモナス属に属する微生物がスフィンゴモ
ナス・エスピーAD109株である、上記の２記載のベクタ
ー。 ５．ペニバチルス属に属する微生物がペニバチルス・エ
スピーA11-1株又はペニバチルス・エスピーA11-2株であ
る、上記の２記載のベクター。 ６．アグロバクテリウム属に属する微生物がアグロバク
テリウム・エスピーMC501株である、上記の２記載のベ
クター。 ７．マイコバクテリウム属に属する微生物がマイコバク
テリウム・エスピーG3株である、上記の２記載のベクタ
ー。 ８．ゴルドナ属に属する微生物がゴルドナ・エスピーCY
KS1株である、上記の２記載のベクター。 ９．バチルス属に属する微生物がバチルス・ズブチリス
WU-S2B株である、上記の２記載のベクター。 １０．アルスロバクター属に属する微生物がアルスロバ
クター・エスピーDS7株である、上記の２記載のベクタ
ー。 １１．酸化還元酵素をコードする遺伝子が非脱硫微生物
由来のものであることを特徴とする、上記の１〜１０の
いずれか１つに記載のベクター。 １２．非脱硫微生物がペニバチルス・ポリミキサA-1株
である、上記の１１記載のベクター。 １３．上記の１〜１２のいずれか１つに記載のベクター
を含有する微生物。 １４．上記の１〜１２のいずれか１つに記載のベクター
を宿主に導入することを特徴とする、ジベンゾチオフェ
ン類を分解できる微生物の作出方法。 １５．宿主がロドコッカス属又はエッシュリヒア属に属
する微生物である、上記の１４記載の方法。 １６．上記の１３記載の微生物の休止菌体とジベンゾチ
オフェン類とを接触させることを特徴とするジベンゾチ
オフェン類の分解方法。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１５】本発明は、同一又は異なるベクターにDBT
類分解酵素遺伝子とNADH-FMN酸化還元酵素遺伝子とを組
み込んで両遺伝子を共発現させ、共発現によって得られ
た発現産物である酵素をジベンゾチオフェン類の分解に
利用しようとするものである。

【００１６】（１）本発明の組換えベクターの作製 本発明の組換えベクターは、適当なベクターにDBT類分
解酵素遺伝子、NADH-FMN酸化還元酵素遺伝子、及びこれ
らの遺伝子を共発現させるのに必要な配列を連結（挿
入）することにより得ることができる。共発現とは、２
つの異なるタンパク質をコードする遺伝子が、同じか又
は異なるプロモーターに作動可能に結合されており、同
時に発現されることを意味する。したがって、共発現が
可能であるならば、目的遺伝子を同一のベクターに組み
込んでもよいし、又は、異なるベクターに組み込んでバ
イナリーベクターとして使用してもよい。

【００１７】本発明で使用するDBT類分解酵素遺伝子
は、DBT類から相当するヒドロキシビフェニル体を生成
する一連の酵素遺伝子であれば特に限定されない。例え
ば、ロドコッカス属、スフィンゴモナス（Sphingomona
s）属、ペニバチルス（Penibacillus）属、アグロバク
テリウム（Agrobacterium）属、マイコバクテリウム（M
ycobacterium）属、ゴルドナ（Gordona）属、バチルス
（Bacillus）属、アルスロバクター（Arthrobacter）属
などに属する微生物由来の分解酵素遺伝子を使用するこ
とができる。ロドコッカス属に属する微生物としては、
ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株、ロドコッカ
ス・エリスロポリス IGTS8株（C.S. Piddinton,B.R. Ko
vacevich and J. Rambosek, Appl. Environ. Microbio
l. 61, 468-475(1995)）、ロドコッカス・エリスロポリ
ス D-1株（Izumiら、Appl. Environ. Microbiol. 60, 2
23-226 (1994)）、ロドコッカス・エリスロポリス H-2
株（Ohshiro.T.ら、FEMS Microbiol. Lett. 142, 65-70
(1996)）、ロドコッカス・エリスロポリス N1-36株（W
ang P.ら、Arch. Microbiol., 161, 266-271 (199
4)）、ロドコッカス・エリスロポリス I-19株（Folsom
B.R.ら、Appl. Environ. Microbiol. 65, 4967-4972 (1
999)）、ロドコッカス・エスピー ECRD-1株（Grossman
M.J.ら、Appl. Environ. Microbiol. 65, 181-188 (199
9)）、ロドコッカス・エスピー B1株（Denis-Larose C.
ら、Appl. Environ. Microbiol. 63, 2915-2919 (199
7)）、ロドコッカス・エスピー SY1株（Omori T.ら、Ap
pl. Environ. Microbiol. 59, 1195-1198 (1995)）、又
はロドコッカス・エスピー UM3株若しくはUM9株（Purdy
R.F Curr. Microbiol. 27, 219-222 (1993)）、スフィ
ンゴモナス属に属する微生物としては、スフィンゴモナ
ス・エスピーAD109株（WO98/45446号）、ペニバチルス
属に属する微生物としては、ペニバチルス・エスピーA1
1-1株及びA11-2株（特願平10-310545号公報）、アグロ
バクテリウム属に属する微生物としては、アグロバクテ
リウム・エスピーMC501株（Constanti M. Enzyme Micro
b. Technol. 19, 214-219 (1996)）、マイコバクテリウ
ム属に属する微生物としては、マイコバクテリウム・エ
スピーG3株（Nekodzuka S.ら、Biocatalysis Biotransf
ormation 15, 21-27 (1997)）、ゴルドナ属に属する微
生物としては、ゴルドナ・エスピーCYKS1株（Rhee S.
ら、Appl. Environ. Microbiol. 64, 2327-2332 (199
8)）、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・ズ
ブチリスWU-S2B株（Kirimura K. J. Biosci. Bioeng. 9
1, 262-266 (2001)）、アルスロバクター属に属する微
生物としてはアルスロバクター・エスピーDS7株（Serbo
lisca L.ら、Appl. Microbiol, Biotechnol. 52, 122-1
26 (1999)）等が挙げられる。これらの菌株のうち、代
表的な菌株の寄託番号は下記の通りである。 ・ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株 寄託先：独立行政法人産業技術研究所 特許生物寄託セ
ンター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第
６）、寄託番号FERM P-16277 ・ロドコッカス・エリスロポリス IGTS8株 寄託先：ATCC、寄託番号53968 ・スフィンゴモナス・エスピー AD109株 寄託先：ATCC、寄託番号55954 ・ペニバチルス・エスピー A11-1株 寄託先：独立行政法人産業技術研究所 特許生物寄託セ
ンター、寄託番号FERM BP-6025 ・ペニバチルス・エスピー A11-2株 寄託先：独立行政法人産業技術研究所 特許生物寄託セ
ンター、寄託番号FERM BP-6026

【００１８】また、以上の菌株由来の遺伝子のほか、こ
れらの菌株の変異株由来の遺伝子も使用することができ
る。本発明で使用しうる「変異株」とは、天然又は人為
的に変異した株であるが、本発明に必要なDBT類分解の
機能を有する酵素をコードする遺伝子を有するものを意
味する。

【００１９】本発明で使用するNADH-FMN酸化還元酵素遺
伝子は、NADHを酸化しFMNを還元する酵素遺伝子であれ
ば特に限定されない。DBT類分解酵素遺伝子と共に使用
するために最適なものは、非脱硫微生物由来の酸化還元
酵素遺伝子、特にペニバチルス・ポリミキサA-1株（寄
託先：独立行政法人産業技術研究所 特許生物寄託セン
ター、寄託番号FERM P-17274）由来の酸化還元酵素Flv
をコードするflvである。

【００２０】上記遺伝子は、該遺伝子の配列が公知であ
る場合、その配列に基づいてプライマーを作製しポリメ
ラーゼ連鎖反応（PCR）に用いて、別途調製又は購入さ
れた生物細胞、組織由来のcDNAライブラリー若しくはゲ
ノムライブラリーから目的の遺伝子を増幅し、精製する
ことによって得ることができるし、あるいは、該遺伝子
の配列が明らかでない場合、先ず対応するタンパク質を
精製してその部分配列を決定し、その配列に基づき放射
性標識プローブを作り、これを用いてcDNAライブラリー
若しくはゲノムライブラリーから目的の遺伝子を含むク
ローンをスクリーニングし、必要に応じて再クローン化
することによって該遺伝子を得ることができる。遺伝子
クローニング及びスクリーニングの手法については、例
えば、Sambrook, J.,Fritsch, E., F.及びManiatis, T.
1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2n
d. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sprin
g Harbor, NY.に記載される方法を使用することができ
る。

【００２１】本発明で使用するベクターとしては、宿主
中で複製可能なものであれば特に限定されない。例え
ば、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファ
ージミドなどが挙げられる。プラスミド DNAとしては、
大腸菌由来のプラスミド（例えばpRSET、pBR322, pBR32
5, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19等）、枯草菌由来の
プラスミド（例えばpUB110, pTP5等)、酵母由来のプラ
スミド（例えばYEp13, YEp24, YCp50等)などが挙げら
れ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charo
n21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙
げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイ
ルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫
ウイルスベクターを用いることもできる。

【００２２】宿主として大腸菌を使用する場合には、以
下のようなベクターを使用するのが好ましい：強力なプ
ロモーターとしてlac、lacUV5、trp、tac、trc、λpL、
T7、rrnBなどを含むpUR系、pGEX系、pUC系、pET系、pT7
系、pBluescrIpt系、pKK系、pBS系、pBC系、pCAL系な
ど。ベクターに遺伝子を挿入するには、まず、精製され
たDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNA
の制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入し
てベクターに連結する方法などが採用される。

【００２３】本発明のベクターに必要な遺伝子は、その
遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれ
ることが必要である。そこで、本発明のベクターには、
プロモーター、DBT類分解酵素遺伝子、NADH-FMN酸化還
元酵素遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシ
スエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シ
グナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）
などを連結することができる。なお、選択マーカーとし
ては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリ
ン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられ
る。

【００２４】本発明で使用するベクターの構成要素に関
して、例えば、ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1
株を宿主とした場合には、複製必須領域、選択マーカー
及び大腸菌複製領域が必要である。複製必須領域として
はロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochr
ous）IFO3338株由来の内在性プラスミドpRC4（Y.Hashim
oto, M.Nishiyama, F.Yu, I.Watanabe, S.Horinouchi及
びT.Beppu, J.Gen.Microbiol.138,1003-1010(1992)）を
利用しうる。選択マーカー及び大腸菌複製領域としてpH
SG298（S.Takeshita, M.Sato, M.Toba, W.Masahashi及
びT.Hashimoto-Gotoh,Gene61,63-74(1987)）を利用しう
る。これらの構成要素を用いて融合プラスミドシャトル
ベクターpRHK1を作製することができる。このベクターp
RHK1に、ロドコッカス・エリスロポリス KA2-5-1株由来
のアルキルジベンゾチオフェン分解酵素遺伝子dszA、ds
zB及びdszC、並びにペニバチルス・ポリミキサA-1株由
来の酸化還元酵素遺伝子flvを挿入することによって、
共発現可能なベクターpRH112を作製することができる。

【００２５】共発現可能な遺伝子の組み合わせとして
は、以下のものが挙げられるが、これらに限定されな
い： ・ロドコッカス・エリスロポリス KA2-5-1株由来のDBT
類分解酵素遺伝子（dszA、dszB及びdszC）と、ペニバチ
ルス・ポリミキサA-1株由来の酸化還元酵素遺伝子（fl
v） ・ロドコッカス・エリスロポリス IGTS8株由来のDBT類
分解酵素遺伝子（dsz遺伝子）と、ペニバチルス・ポリ
ミキサA-1株由来の酸化還元酵素遺伝子（flv） ・スフィンゴモナス・エスピー AD109株由来のDBT類分
解酵素遺伝子（dsz遺伝子）と、ペニバチルス・ポリミ
キサA-1株由来の酸化還元酵素遺伝子（flv） ・ペニバチルス・エスピー A11-1株及び／又はペニバチ
ルス・エスピー A11-2由来のDBT類分解酵素遺伝子（tds
遺伝子）と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸
化還元酵素遺伝子（flv） ・ロドコッカス・エリスロポリス D-1株由来のDBT類分
解酵素遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来
の酸化還元酵素遺伝子（flv） ・ロドコッカス・エリスロポリス H-2株由来のDBT類分
解酵素遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来
の酸化還元酵素遺伝子（flv） ・ロドコッカス・エリスロポリス N1-36株由来のDBT類
分解酵素遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由
来の酸化還元酵素遺伝子（flv） ・ロドコッカス・エリスロポリス I-19株由来のDBT類分
解酵素遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来
の酸化還元酵素遺伝子（flv） ・ロドコッカス・エスピー ECRD-1株由来のDBT類分解酵
素遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸
化還元酵素遺伝子（flv） ・ロドコッカス・エスピー B1株由来のDBT類分解酵素遺
伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸化還
元酵素遺伝子（flv） ・ロドコッカス・エスピー SY1株由来のDBT類分解酵素
遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸化
還元酵素遺伝子（flv） ・ロドコッカス・エスピー UM3株及び／又はUM9株由来
のDBT類分解酵素遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA
-1株由来の酸化還元酵素遺伝子（flv） ・アグロバクテリウム・エスピー MC501株由来のDBT類
分解酵素遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由
来の酸化還元酵素遺伝子（flv） ・マイコバクテリウム・エスピー G3株由来のDBT類分解
酵素遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の
酸化還元酵素遺伝子（flv） ・ゴルドナ・エスピー CYKS1株由来のDBT類分解酵素遺
伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸化還
元酵素遺伝子（flv） ・バチルス・ズブチリス WU-S2B株由来のDBT類分解酵素
遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸化
還元酵素遺伝子（flv）。 ・アルスロバクター・エスピー DS7株由来のDBT類分解
酵素遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の
酸化還元酵素遺伝子（flv）。

【００２６】ベクター中に導入する上記組み合わせの遺
伝子の方向及び順序は、それぞれの遺伝子が発現され、
発現されたタンパク質が酵素として機能しうるのであれ
ば、任意に配列及び選択してよい。この場合、DBT類分
解酵素遺伝子は、dszA、dszB及びdszCの３種類を連結す
る必要があるが、その順序は任意でよく、方向も任意で
ある。例えば、dszA、dszB、dszCの順に連結すること
も、dszB、dszC、dszAの順に連結することもできる。さ
らに、上記遺伝子の間に酸化還元酵素が連結されてもよ
く、またこれらの遺伝子は必ずしも隣接していなくても
よい。

【００２７】（２）本発明の遺伝子組換え微生物の作出
方法 本発明の遺伝子組換え微生物は、本発明の組換えベクタ
ーを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入する
ことにより得ることができる。宿主として使用する微生
物は、DBT類を分解する能力を有する微生物に限定され
ず、DBT類分解酵素遺伝子及び酸化還元酵素遺伝子を共
発現できるものであれば特に限定されるものではない。
例えば、ロドコッカス・エリスロポリス等のロドコッカ
ス属、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等の
エッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus s
ubtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（P
seudomonas putida）等のシュードモナス属に属する微
生物が挙げられる。本発明で使用する宿主としては、ロ
ドコッカス属又はエッシュリヒア属に属する微生物が好
ましい。例えば、ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-
1株が好適に用いられる。この菌株は、独立行政法人産
業技術研究所、特許生物寄託センターに受託番号FERM P
-17268として寄託されている。また、他に宿主として使
用できるDBT類を分解する能力を有する微生物として
は、ロドコッカス・エリスロポリス IGTS8株を例示する
ことができる。この菌株は、ATCCに寄託番号53968とし
て寄託されている。

【００２８】大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発
明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると
同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の
遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ま
しい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれて
いてもよい。

【００２９】大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・
コリ（Escherichia coli）K12、DH1などが挙げられ、枯
草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Bacillus
subtilis）などが挙げられる。プロモーターとして
は、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれ
を用いてもよい。例えばtrpプロモーター、lacプロモー
ター、P_Lプロモーター、P_Rプロモーターなどの、大腸菌
やファージに由来するプロモーターが用いられる。tac
プロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプ
ロモーターを用いてもよい。

【００３０】細菌への組換えベクターの導入方法として
は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定される
ものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法(C
ohen, S.N.ら(1972) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69,
2110-2114)、エレクトロポレーション法、電気パルス
法、コンピテントセル法、接合伝達法、プロトプラスト
法などが挙げられる。例えば、ロドコッカス・エリスロ
ポリスKA2-5-1株を宿主としてpRH112又はpRH114を導入
する場合には電気パルス法が用いられる。形質転換体
は、導入する遺伝子内に構成されるマーカー遺伝子の性
質を利用して選択される。例えば、pRH112又はpRH114に
より形質転換したロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-
1株はカナマイシン硫酸を約100mg/L含む寒天LB培地で選
択することが可能である。

【００３１】以上のようにして作出された微生物の培養
は、微生物の通常の培養法にしたがって行われる。培養
の形態は固体培養でも液体培養でもよいが、液体培養が
好ましい。培地の栄養源としては通常用いられているも
のが広く用いられる。炭素源としては利用可能な炭素化
合物であればよく、例えば、グルコース、スクロース、
ラクトース、コハク酸、クエン酸、酢酸などが使用され
る。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよ
く、例えば、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、大豆
粉、カゼイン加水分解物などの有機栄養物質が使用され
る。脱硫反応に影響を与える可能性のある硫黄化合物を
含まない培地で培養するのが望ましい場合には、塩化ア
ンモニウムのような無機窒素化合物も使用することがで
きる。そのほか、リン酸塩、炭酸塩、マグネシウム、カ
ルシウム、カリウム、ナトリウム、鉄、マンガン、亜
鉛、モリブデン、タングステン、銅、ビタミン類などが
必要に応じて用いられる。培養は、微生物が生育可能で
ある温度、pHで行われ、使用する微生物の最適培養条件
で行うのが好ましい。一般的には、培地のpHを適当なp
H、例えばpH６〜８とし、また、適当な温度、例えば約3
0℃にて、振盪又は通気条件下で好気的に行われる。

【００３２】（３）本発明の微生物によるジベンゾチオ
フェン類の分解方法 本発明のDBT類の分解方法は、上記の微生物を利用して
行うことを特徴とするもので、具体的には、上記微生物
の休止菌体とDBT類を接触させる方法である。この方法
は、例えば以下のようにして行われる。

【００３３】なお、ジベンゾチオフェン類としては、ジ
ベンゾチオフェン（DBT）、2-メチルジベンゾチオフェ
ン（2-M-DBT）、3-メチルジベンゾチオフェン（3-M-DB
T）、2,4-ジメチルジベンゾチオフェン（2,4-DM-DB
T）、2,4-ジエチル-ジベンゾチオフェン（2,4-DE-DBT）
などを例示することができる。

【００３４】まず、休止菌体を調製する。新鮮な培地に
種菌を適当量、例えば１〜２容量％接種する。種菌とし
ては、対数増殖期初期から定常期までのいずれかの状態
の菌を用いればよく、好ましくは対数増殖期後期のもの
を用いる。種菌の量は必要に応じて増減することができ
る。その後、pH６〜９、約30℃にて１〜２日間往復又は
回転振盪培養する。また、本発明で使用する培地として
はA培地（Izumi Y.,Ohshiro T.,Ogino H.,Hine及びY.,S
himao M., Applied and Environmental Microbiology,
223-226 (1994)）を用いるのが好適である。次いで、菌
体を分離集菌し、洗浄することにより休止菌体が得られ
る。休止菌体とは、分裂能力を保持するが、一時的に分
裂しない状態にある菌体を指す。集菌は、培養菌体が対
数増殖期初期から定常期までのいずれの状態にある時に
行ってもよいが、対数増殖期中期から後期の状態にある
時に行うのが好ましい。また、集菌は、遠心分離の他、
濾過、沈降分離等のいかなる方法で行ってもよい。菌体
の洗浄には、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液
等のいかなる緩衝液を使用してもよく、また、水を用い
て菌体を洗浄することもできる。

【００３５】休止菌体による分解は、休止菌体を適当な
緩衝液に懸濁して調製した菌懸濁液に基質であるDBT類
を添加して反応させることにより行う。緩衝液としては
種々の緩衝液を使用できる。緩衝液のpHは特に限定され
ないが、pH６〜７が好適である。また、緩衝液の代わり
に、水や培地等を使用することもできる。菌体懸濁液の
濃度は、ＯＤ₆₆₀が１〜10の間が好適であり、必要に応
じて増減できる。基質の濃度は、1〜10,000ppm が好適
であるが、必要に応じて増減できる。反応は30℃で行う
のが好適であるが、そのほかの適当な温度でもよく、ま
た反応時間は１〜２時間が好適であるが、必要に応じて
増減できる。また、基質を添加する前に反応温度と同じ
温度に反応液を予備加熱してもよい。

【００３６】また、休止菌体による反応は、n-テトラデ
カン等の有機溶媒を添加した油水２相系で行うこともで
きる。この場合、使用可能な有機溶媒としては、n-テト
ラデカンの他、Ｃ₈〜Ｃ₂₀のn-パラフィンやケロシン、
軽油、重油などが挙げられる。また、必要に応じて反応
液上方の気相を酸素で置換封入してもよい。分解率の測
定は、ガスクロマトグラフィー（GC）、ガスクロマトグ
ラフィー／質量スペクトル分析（GC/MS）などを使用し
て行うことができる。また、必要に応じて他の分析方法
を併せて利用してもよい。

【００３７】本発明の微生物を利用することにより、石
油等の化石燃料中に含まれるベンゾチオフェンやDBT類
及びこれらの置換体、又はそれらの誘導体中の硫黄を遊
離させることができるので、石油・石炭等の化石燃料の
燃焼により空気中に拡散する硫黄を、化石燃料中から容
易に除去することができるようになる。

【００３８】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明の範囲はこれらの実施例の範囲に限定され
るものではない。

【００３９】実施例中の遺伝子操作に関連した実験は、
主にManiatisらの成書（Sambrook,J.,Fritsch, E., F.
及びManiatis, T. 1989. Molecular Cloning. A Labora
toryManual. 2nd. Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, Cold Spring Harbor, NY.)に詳述されている方法に
従って行った。

【００４０】〔実施例１〕 DBT類分解酵素遺伝子を含
む組み換えプラスミドの作製 ロドコッカス・ロドクロウス IFO3338株より抽出精製し
たプラスミドpRC4をClaI消化し平滑化したものと、宝酒
造(株)より入手したベクターpHSG298をStuIで消化し脱
リン酸化処理したものとをライゲーションし、ロドコッ
カス-大腸菌シャトルベクターpRHK1を構築した(特開200
1-029065号公報)。

【００４１】ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株
からプラークハイブリダイゼーション法によりDBT類分
解酵素遺伝子dszA、dszB及びdszCを含む約11kbのDNA断
片をクローン化した。これをPvuIで消化して生成した約
4.5kbのDNA断片を平滑化し、pBluescriptIIKS(+) SmaI
サイトに組み込み、プラスミドpBKPP及びpBKPPRを構築
した。pBKPP及びpBKPPRをEcoRI及びXbaIで消化し、シャ
トルベクターpRHK1のEcoRI-XbaI消化物とライゲーショ
ンし、分解遺伝子を含むプラスミドpRKPP及びpRKPPRを
構築した(特開2001-029065号公報)。

【００４２】ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株
から調製した染色体DNAから、dszA、dszB及びdszCを含
む断片をPCR法により増幅し、pBluescript SK+のEcoRI-
HindIII部位にクローニングした(pSKEXH)。PCR法の条件
を下記に示す。

【００４３】以下に示すようなPCR用プライマーを作製
した： センスプライマー：5'-ACCATATGACTCAACAACGACAAAGCA-
3'（配列番号１） アンチセンスプライマー：5'-TCAGGAGGTGAAGCCGGGAAT-
3'（配列番号２） これらのセンスプライマーとアンチセンスプライマーを
用いて、ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株から
調製したKA2-5-1株DNA を鋳型として用いて行ったPCR
の条件は以下の通りである。 アニーリング温度：46℃から60℃までの間で 2℃間隔で
温度を変えてPCR を行った PCR サイクル： 94℃（2分） １回 94℃（1分）、46〜60℃（１分）、72℃（３分） 30回 72℃（7分） １回 DNA 増幅機：RobocyclerTMGRADIENT96 温度サイクラー（STRATAGENE社製）。

【００４４】上記の条件でPCRを行った結果、アニーリ
ング温度が46〜54℃の時、約3,600bpの増幅フラグメン
トを与えることが確認された。このPCR産物を、Bluescr
ipt SK(+)ベクターを用いて大腸菌 JM109株にクローン
化した。クローニング断片の塩基配列はdszA、dszB及び
dszCと一致した。

【００４５】〔実施例2〕 DBT類分解酵素遺伝子及びペ
ニバチルス・ポリミキサA-1株の酸化還元酵素遺伝子を
含む組み換えプラスミドの作製 ペニバチルス・ポリミキサA-1株から調製した染色体DNA
から下記のプライマーを用いて酸化還元酵素をコードす
るflvを増幅した： センスプライマー：5'- .GGGAAGCTTGAAATTAGGAGTGTGCCC
AGAATGTC-3'（配列番号３） アンチセンスプライマー：5'- GGGAAGCTTTTAGAAGCTGCCT
TTTACAACAACGTC -3'（配列番号４） PCRの条件は上記と同じである。

【００４６】この断片をpSKEXHのHindIII 部位にクロー
ニングした(pSKEXHflv)。クローニングの向きはdszA、d
szB、dszCと同じ方向である。pSKEXHflvをSphI-ClaIで
切断しdszCの一部分及びflv全長を含む断片を回収し
た。PPRをSphI-ClaIで切断し、この部分にpSHEXHflvのS
phI-ClaI断片をクローニングした(pPRflv)。次にpPRflv
をXbaI-ClaIで切断しT4 DNAポリメラーゼで平滑末端化
した後、dszプロモーター、dszA、dszB、dszC及びflvを
含む断片を回収した。PRHK1をEcoRIで切断し、平滑末端
化した部位にこの断片をクローニングした(pRH112)（図
１）。

【００４７】〔実施例 3〕 DBT類分解酵素遺伝子及び
ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株の酸化還元酵
素遺伝子を含む組み換えプラスミドの作製 ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株から調製した
染色体DNAから以下に示すプライマーにより酸化還元酵
素をコードするdszDを増幅した： センスプライマー：5'- GGGAAGCTTGGAGGATTCCCGATGTCT-
3'（配列番号５） アンチセンスプライマー：5'- GGGAAGCTTTGTAACTTGCTGT
GCGCCTTTA-3'（配列番号６）。

【００４８】この断片をpSKEXHのHindIII 部位にクロー
ニングした(pSKEXHD)。クローニングの向きはdszA、dsz
B、dszCと同じ方向である。pSKEXHDをSphI-ClaIで切断
しdszCの一部分及びdszD全長を含む断片を回収した。PP
RをSphI-ClaIで切断し、この部分にpSHEXHDのSphI-ClaI
断片をクローニングした(pPRD)。pPRDをXbaI-ClaIで切
断しT4 DNAポリメラーゼで平滑末端化した後、dszプロ
モーター、dszA、dszB、dszC及びdszDを含む断片を回収
した。pRHK1をEcoRIで切断し、平滑末端化した部位にこ
の断片をクローニングした(pRH114)（図２）。PPPRをXb
aI-ClaIで切断し、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化し
た後にdszプロモーター、dszA、dszB及びdszCを含む断
片を回収した。pRHK1をEcoRIで切断後、平滑末端化した
部位にこの断片をクローニングした(pRH110)。

【００４９】〔実施例4〕pRH110, pRH112, pRH114, pRH
K1のロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1CS株への形
質転換 ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株をニトロソグ
アニジン処理してジベンゾチオフェン類分解酵素遺伝子
をもつプラスミドを欠失した変異株を取得した(Rhodoco
ccus erythropolis KA2-5-1CS株)。ロドコッカス・エリ
スロポリスKA2-5-1CS株を5mlのA培地（1%ペプトン、1%
グルコース、0.7%肉エキス、0.5%酵母エキス、0.3%塩化
ナトリウム）を入れた18mm試験管に植菌し、2日間、30
℃で往復振とう培養し前培養液を作った。次いで100ml
のA培地を入れた1L坂口フラスコに、前培養液1mlを加
え、２日間、30℃で往復振とう培養を行った。得られた
菌体を遠心分離（8,000×g、４℃、10分）で回収後、滅
菌水にて2回洗浄し、測定波長660nmでの濁度が40になる
ように10％グリセロール水溶液に懸濁した。

【００５０】該懸濁液80μlにpRH110, pRH112, pRH114
及び pRHK1の遺伝子溶液1μlを添加し、Biorad社ジーン
パルサーIIを用いて25μF、400Ω、1.5kV/cmの条件で処
理した。処理液にSOC培地0.42mlを添加し、30℃、3時間
培養を行った。得られた培養液をカナマイシン硫酸塩10
0mg/l及び寒天末15 g/lを含むLB培地（LBAK培地）に塗
末し、30℃、48時間培養した。LBAK培地においてコロニ
ーを形成した菌を再度新鮮なLBAK培地に画線することに
よって菌体を純化し、pRH110/ KA2-5-1CS株, pRH112/ K
A2-5-1CS株, pRH114/ KA2-5-1CS株, pRHK1/ KA2-5-1CS
株とした。

【００５１】pRH110/ KA2-5-1CS株, pRH112/ KA2-5-1CS
株, pRH114/ KA2-5-1CS株, pRHK1/KA2-5-1CS株はDenis-
Laroseらの方法(Appl.Environ.Microbiol.63:2915-2919
(1997))に従ってプラスミドDNAを菌体より抽出、精製
し、制限酵素の切断パターンから、それぞれ、pRH110,
pRH112, pRH114及び pRHK1により形質転換されているこ
とを確認した。

【００５２】〔実施例5〕 pRH110/ KA2-5-1CS株、pRH1
12/ KA2-5-1CS株及びpRH114/ KA2-5-1CS株の培養 DBT25ppm（N,N-ジメチルホルムアミド溶液）を含むA培
地 (Izumi Yら、Applied and Environmental Microbiol
ogy, 223-226 (1994)) 2mlに、1白菌耳量のpRH110/ KA2
-5-1CS株, pRH112/ KA2-5-1CS株又はpRH114/ KA2-5-1CS
株を植菌し、30℃で72時間培養した。A培地中には培地
成分として硫黄源が全く含まれていないことから、上記
培地において該菌株の増殖が認められる場合は、DBTを
唯一の硫黄源として増殖していることが示唆される。得
られた培養液の660nmにおける吸光度(OD₆₆₀)を測定した
ところ、それぞれ2.5, 3.6, 3.3であった。

【００５３】〔実施例 6〕pRH110/ KA2-5-1CS株及びpRH
112/ KA2-5-1CS株の脱硫休止菌体反応によるDBT類の分
解 DBT25ppm（N,N-ジメチルホルムアミド溶液）を含むA培
地100mlに、1白菌耳量のpRH110/ KA2-5-1CS株又はpRH11
2/ KA2-5-1CS株を植菌し、30℃で72時間培養した。得ら
れた培養液を4℃、8,000rpm,5minの条件で遠心分離し、
沈殿をpH7.5の1/15M リン酸緩衝液にて2回洗浄し、同緩
衝液に懸濁して反応用菌体とした。

【００５４】pRH112/ KA2-5-1CS株及びpRH114/ KA2-5-1
CS株の脱硫酵素活性を以下の方法で測定した。pRH112/
KA2-5-1CS株又はpRH114/ KA2-5-1CS株の培養菌体をリン
酸カリウム緩衝液（pH7.0）100mM にOD₆₆₀nm=10になる
よう懸濁した後、DBT 0.24mMを添加し、総体積1 mlで、
30℃で2時間振とう反応を行った後、50μlの1M塩酸を加
えて反応を停止後、1mllの酢酸エチルを加えた。これを
遠心分離し、その上清をガスクロマトグラフィーに注入
し、生成2HBPを定量した。図3に、ロドコッカス・エリ
スロポリスKA-2-5-1 CS株におけるdsz遺伝子及び酸化還
元酵素遺伝子の共発現の結果を示す。その結果、flvとd
szA、dszB及びdszCとを共発現させたpRH112はpRH110に
比較して5倍の脱硫活性が得られた。

【００５５】〔実施例 7〕pRH112/ KA2-5-1CS株及びpRH
114/ KA2-5-1CS株の脱硫休止菌体反応によるDBT類の分
解 実施例６に記載の方法と同様の方法によって、pRH114/
KA2-5-1CS株の脱硫休止菌体反応を測定し、pRH112/ KA2
-5-1CS株と比較した。その結果を図3に示す。Flvを導入
しジベンゾリオフェン類分解酵素と共発現させたpRH112
/ KA2-5-1CS株は、dszDをDBT類分解酵素と共発現させた
pRH114/ KA2-5-1CS株に比較して、1.2倍の脱硫休止菌体
活性が得られた。

【００５６】

【発明の効果】本発明によれば、微生物を利用すること
によりDBT類を穏和な条件で効率的に分解することがで
きる。また、DBT類は化石燃料中に存在する硫黄化合物
であるので、本発明はこれらの化石燃料の脱硫法として
も利用することができる。

【００５７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Cooperation Center, Petroleum <120> A process for desulfurization using microorganisms degradating dibenzothiophenes <130> P01-0225 <140> <141> <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 1 accatatgac tcaacaacga caaagca 27 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 2 tcaggaggtg aagccgggaa t 21 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 3 gggaagcttg aaattaggag tgtgcccaga atgtc 35 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 4 gggaagcttt tagaagctgc cttttacaac aacgtc 36 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 5 gggaagcttg gaggattccc gatgtct 27 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 6 gggaagcttt gtaacttgct gtgcgccttt a 31

【００５８】

【配列表フリーテキスト】配列番号１：ロドコッカス・
エリスロポリスKA2-5-1株からdszA、dszB及びdszCを含
む断片を増幅するためのPCR用センスプライマー。配列
番号２：ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株からd
szA、dszB及びdszCを含む断片を増幅するためのPCR用ア
ンチセンスプライマー。配列番号３：ペニバチルス・ポ
リミキサA-1株からflvを含むを増幅するためのPCR用セ
ンスプライマー。配列番号４：ペニバチルス・ポリミキ
サA-1株からflvを含む断片を増幅するためのPCR用アン
チセンスプライマー。配列番号５：ロドコッカス・エリ
スロポリスKA2-5-1株からdszDを含む断片を増幅するた
めのPCR用センスプライマー。配列番号６：ロドコッカ
ス・エリスロポリスKA2-5-1株からdszDを含む断片を増
幅するためのPCR用アンチセンスプライマー。

【図面の簡単な説明】

【図1】ロドコッカス-大腸菌シャトルベクターpRH112の
構築方法を示す図である。

【図２】ロドコッカス-大腸菌シャトルベクターpRH114
の構築方法を示す図である。

【図３】pRH110/ KA2-5-1CS株、pRH112/ KA2-5-1CS株、
pRH114/ KA2-5-1CS株及びpRHK1/ KA2-5-1CS株の脱硫休
止菌体反応によるDBT類の分解活性を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:06 Ｃ１２Ｒ 1:32） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:06） (72)発明者 太田 嘉則 千葉県柏市２−10−10 シャルムナガオ 103 (72)発明者 丸橋 健司 静岡県清水市袖師町1900 (72)発明者 大城 隆 鳥取県鳥取市北園１−152 (72)発明者 和泉 好計 京都府京都市西京区大原野西境谷町２−９ −23−302 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA08 CA02 DA05 GA11 4B065 AA11 AA13 AA15 AA26 AA36 AA45 AB01 AC14 BA02 CA28 CA56

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ジベンゾチオフェン類分解酵素をコード
   する遺伝子と酸化還元酵素をコードする遺伝子とを共発
   現することができるベクター。
2. 【請求項２】 ジベンゾチオフェン類分解酵素遺伝子
   が、ロドコッカス属、スフィンゴモナス属、ペニバチル
   ス属、アグロバクテリウム属、マイコバクテリウム属、
   ゴルドナ属、バチルス属若しくはアルスロバクター属に
   属する微生物、又はそれらの変異株由来のものである、
   請求項１記載のベクター。
3. 【請求項３】 ロドコッカス属に属する微生物がロドコ
   ッカス・エリスロポリスKA2-5-1株、ロドコッカス・エ
   リスロポリスIGTS8株、ロドコッカス・エリスロポリス
   D-1株、ロドコッカス・エリスロポリス H-2株、ロドコ
   ッカス・エリスロポリス N1-36株、ロドコッカス・エリ
   スロポリス I-19株、ロドコッカス・エスピー ECRD-1
   株、ロドコッカス・エスピー B1株、ロドコッカス・エ
   スピー SY-1株、又はロドコッカス・エスピー UM3株若
   しくはUM9株である、請求項２記載のベクター。
4. 【請求項４】 スフィンゴモナス属に属する微生物がス
   フィンゴモナス・エスピーAD109株である、請求項２記
   載のベクター。
5. 【請求項５】 ペニバチルス属に属する微生物がペニバ
   チルス・エスピーA11-1株又はペニバチルス・エスピーA
   11-2株である、請求項２記載のベクター。
6. 【請求項６】 アグロバクテリウム属に属する微生物が
   アグロバクテリウム・エスピーMC501株である、請求項
   ２記載のベクター。
7. 【請求項７】 マイコバクテリウム属に属する微生物が
   マイコバクテリウム・エスピーG3株である、請求項２記
   載のベクター。
8. 【請求項８】 ゴルドナ属に属する微生物がゴルドナ・
   エスピーCYKS1株である、請求項２記載のベクター。
9. 【請求項９】 バチルス属に属する微生物がバチルス・
   ズブチリスWU-S2B株である、請求項２記載のベクター。
10. 【請求項１０】 アルスロバクター属に属する微生物が
    アルスロバクター・エスピーDS7株である、請求項２記
    載のベクター。
11. 【請求項１１】 酸化還元酵素をコードする遺伝子が非
    脱硫微生物由来のものである、請求項１〜１０のいずれ
    か１項記載のベクター。
12. 【請求項１２】 非脱硫微生物がペニバチルス・ポリミ
    キサA-1株である、請求項１１記載のベクター。
13. 【請求項１３】 請求項１〜１２のいずれか１項記載の
    ベクターを含有する微生物。
14. 【請求項１４】 請求項１〜１２のいずれか１項記載の
    ベクターを宿主に導入することを特徴とする、ジベンゾ
    チオフェン類を分解できる微生物の作出方法。
15. 【請求項１５】 宿主がロドコッカス属又はエッシュリ
    ヒア属に属する微生物である、請求項１４記載の方法。
16. 【請求項１６】 請求項１３記載の微生物の休止菌体と
    ジベンゾチオフェン類とを接触させることを特徴とす
    る、ジベンゾチオフェン類の分解方法。