JP2003018997A - シトシンヌクレオシド化合物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 シトシンヌクレオシド化合物の効率的な合成
法を提供する。 【解決手段】 シトシンに反応性を有するヌクレオシド
ホスホリラーゼまたは該酵素活性を有する微生物を用い
たペントース−１−リン酸とシトシンまたはシトシン誘
導体からのシトシンヌクレオシド化合物の製造法を提供
する。その際、基質あるいは生成物の分解活性を特異的
に減少させる方法を提供することで、効率よくシトシン
ヌクレオシド化合物を製造できる。 【効果】 シトシンヌクレオシド化合物の製造に際し、
ほとんど副生物を生成しない。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は医薬品等の合成原料
として有用なシトシンヌクレオシド化合物の製造方法に
関する。さらに詳しくは、シトシンヌクレオシドホスホ
リラーゼ活性を有する酵素または該酵素活性を有する微
生物の菌体、該菌体もしくはその培養液を処理して得ら
れた酵素調製物等を用いてペントース−１−リン酸とシ
トシンまたはシトシン誘導体からシトシンヌクレオシド
化合物を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヌクレオシドホスホリラーゼはリン酸存
在下でヌクレオシドのＮ−グリコシド結合を加リン酸分
解する酵素の総称であり、リボヌクレオシドを例にする
と次式で表される反応を触媒する。

【０００３】リボヌクレオシド ＋ リン酸（塩） →
核酸塩基 ＋ リボース１−リン酸 プリンヌクレオシドホスホリラーゼとピリミジンヌクレ
オシドホスホリラーゼに大別される該酵素は、広く生物
界に分布し、哺乳類、鳥類、魚類などの組織、酵母、細
菌に存在する。この酵素反応は可逆的であり、逆反応を
利用した各種ヌクレオシドの合成が以前より知られてい
る。例えば、２´−デオキシリボース１−リン酸と核酸
塩基（チミン、アデニンまたはグアニン）からチミジン
（特開平０１−１０４１９０号公報）、２´−デオキシ
アデノシン（特開平１１−１３７２９０号公報）または
２´−デオキシグアノシン（特開平１１−１３７２９０
号公報）を製造する方法が知られている。この様にヌク
レオシドホスホリラーゼを用いるヌクレオシド化合物の
製造は、穏和な条件で位置、立体特異的に製造すること
が可能であり、多くのヌクレオシド化合物の合成が検討
されている。

【０００４】特開平１−６０３９６号公報ではデオキシ
リボース−１−リン酸とシトシンから菌体そのものを触
媒として用いた反応によりデオキシシチジンを製造する
方法が示されている。しかし、該公報の方法は菌体その
ものを触媒として用いる反応でありシトシンヌクレオシ
ドホスホリラーゼそのものの存在は確認されていない。
例えば、菌体内に蓄積したデオキシシチジンが反応中に
菌体内より溶出したものであったり、菌体内のヌクレオ
シドデオキシリボシルトランスファラーゼにより、基質
として添加したシトシンが菌体内のデオキシヌクレオシ
ドの塩基に転移した結果、デオキシシチジンが検出され
た可能性も考えられる。本発明者らはそれらの点をはっ
きりさせるため、該公報の実施例で寄託されている７株
を取り寄せ実施例と同じ方法でデオキシリボース−１−
リン酸とシトシンからデオキシシチジンが生成するかを
試験した。その結果、何れの菌株を用いた反応において
も反応液中にデオキシシチジンは全く検出されず、菌株
そのものにシトシンヌクレオシドホスホリラーゼに相当
する活性が存在することは確認されなかった。

【０００５】一方、特開平３−１２７８６号公報ではプ
リン塩基とピリミジン塩基の両方に作用する新規なヌク
レオシドホスホリラーゼが報告されており、ピリミジン
塩基としてデオキシウリジン、デオキシシチジン、デオ
キシチミジンに作用すると記載されてはいるが、明細書
中にはその基質特異性は何ら開示されていない。また、
該公報はすでに取り下げられており、その活性を確認す
ることはできないが、該公報の発明者らは、該公報に開
示の微生物と同一名の菌株よりヌクレオシドホスホリラ
ーゼを精製し、その特徴をＡｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅ
ｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ，Ｖｏｌ．５６，ＰＰ３８３０−３８３４，（１９９
０）で報告している。該文献においてこの酵素はシトシ
ン、シチジン及びデオキシシチジンに対する活性はない
と記載されている。

【０００６】上記以外ではプリンヌクレオシドホスホリ
ラーゼあるいはピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ
の何れにおいても核酸塩基としてシトシンまたはシトシ
ン誘導体が基質となることは報告されておらず、例え
ば、Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５
１，ＰＰ４３７〜４４２（１９７８）ではサルモネラ・
チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｒａ ｔｙｐｈｉｍｕ
ｒｉｕｍ）のピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼの
一種であるチミジンホスホリラーゼにはデオキシシチジ
ンに対する反応性は認められないと記載されている。ま
た、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２４８，Ｎ
ｏ．６，ＰＰ２０４０〜２０４３（１９７３）ではサル
モネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｒａ ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ）のプリンヌクレオシドホスホリラー
ゼにはピリミジンヌクレオシドへの活性は認められない
と記載され、ウリジン、シチジン、デオキシウリジン、
デオキシシチジンが例示されている。

【０００７】これらの報告を総合的に勘案すると本発明
に係るシトシンヌクレオシドホスホリラーゼに相当する
酵素の存在を予測させる知見はあったものの、それらの
先行技術文献の何れにおいても、その存在を確認し、実
際にこの酵素が取得されたという報告は見当たらない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】ヌクレオシドホスホリ
ラーゼを用いるヌクレオシド化合物の製造は、穏和な条
件で位置、立体特異的にヌクレオシド化合物を製造する
ことが可能であり、種々のヌクレオシド化合物の合成研
究が盛んに行われているが、これまでシトシンまたはシ
トシン誘導体とリン酸化糖を基質としてシトシンヌクレ
オシド化合物を合成することが可能な単離精製されたヌ
クレオシドホスホリラーゼは報告されていなかった。

【０００９】また、本発明者等の検討によると、一般に
微生物にはシトシンデアミナーゼ活性およびシチジンデ
アミナーゼ活性が存在するため、微生物の菌体自体を用
いたり、菌体やその培養液から調製された酵素調製物に
これらのデアミナーゼ活性が残存している場合には、基
質としてのシトシンまたはシトシン誘導体および反応生
成物としてのシトシンヌクレオシド化合物のデアミノ体
が合成されてしまい、効率的にシトシンヌクレオシド化
合物を蓄積することは困難となる。

【００１０】すなわち、本発明の目的は、シトシンヌク
レオシド化合物の合成が可能なヌクレオシドホスホリラ
ーゼのアミノ酸配列を提供することである。更に該遺伝
子のを含む組換えプラスミド、該組換えプラスミドを含
む形質転換体、該形質転換菌株を用いた該酵素の産生方
法および該形質転換菌株を用いたシトシンヌクレオシド
化合物を製造する方法を提供することである。更に、ヌ
クレオシドホスホリラーゼの活性を維持したままシトシ
ンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの活性を減
少させること、あるいは、両酵素を欠損している微生物
にシトシンヌクレオシドホスホリラーゼを発現させた微
生物を用いることで効率的にシトシンヌクレオシド化合
物を製造する方法を提供することにある。

【００１１】加えて、原料であるリン酸化糖の脱リン酸
酵素の活性を減少させること、あるいは、該酵素を欠損
している微生物にシトシンヌクレオシドホスホリラーゼ
を発現させた微生物を用いることで効率的にシトシンヌ
クレオシド化合物を製造する方法を提供することにあ
る。

【００１２】シトシンヌクレオシド化合物を製造する場
合、特に医薬品の原料として利用する場合は微量の副生
物の混入も大変な問題となる。精製工程での副生ヌクレ
オシドの分離は精製負荷が大きくなるとともに、シトシ
ンヌクレオシド化合物の回収率を低下させることとなり
工業的に製造する場合は大きな問題となる。このような
目的に使用する場合には、酵素調製物から、シトシンデ
アミナーゼ活性及びシチジンデアミナーゼ活性をほぼ完
全に失活させる必要がある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らはこれらの課
題を解決するために鋭意検討した結果、本来プリン塩基
を基質とする反応を触媒するプリンヌクレオシドホスホ
リラーゼが、驚くべきことにピリミジン塩基であるシト
シンまたはシトシン誘導体とペントース−１−リン酸か
らシトシンヌクレオシド化合物を生成する反応を触媒す
ることを見出した。

【００１４】また、本発明者らによって見出されたこの
プリンヌクレオシドホスホリラーゼの存在は、シトシン
ヌクレオシドホスホリラーゼの存在を示すものである。

【００１５】一方、本発明者等は、この酵素活性を有す
る微生物を用いてシトシンまたはシトシン誘導体とペン
トース−１−リン酸からシトシンヌクレオシド化合物を
生成する反応を試みたところ、生成物のほとんどが、シ
トシンまたはシトシン誘導体とシトシンヌクレオシド化
合物のデアミノ体であり、目的物であるシトシンヌクレ
オシド化合物を効率的に蓄積できなかった。そこで鋭意
検討を重ねた結果、このデアミノ体の形成が、デアミナ
ーゼの作用によるものであり、このデアミナーゼ活性を
有する菌体を有機溶媒中に攪拌あるいは静置することに
より、または、この菌体を加熱することによりシトシン
デアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの活性を失活
させることができること、更に、これらの処理は共に処
理溶液中にリン酸塩またはリン酸化糖を存在させること
で維持すべきシトシンヌクレオシドホスホリラーゼの失
活をより効果的に抑制できることを見出した。

【００１６】上述の方法により、ヌクレオシドホスホリ
ラーゼの活性を維持したまま、基質と生成物の分解活性
の両方を特異的に減少させることが可能となり、上記の
ようなデアミナーゼ活性の失活または低減化処理を施し
た菌体を用いることで、シトシンまたはシトシン誘導体
とリン酸化糖から副生物をほとんど生成せずにシトシン
ヌクレオシド化合物を製造できることを見出し、本発明
を完成させるに至った。

【００１７】本発明のデアミナーゼの失活または低減化
処理によればシトシンヌクレオシドホスホリラーゼの活
性をほぼ完全に維持しつつ、分解活性はほぼ完全に失活
させることも可能である。更に本発明者らは、シトシン
デアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両酵素活性
を欠損した微生物に該酵素を発現させることでシトシン
ヌクレオシド化合物を効率的に製造できることも見出
し、本発明を完成させるに至った。

【００１８】また、原料であるリン酸化糖を脱リン酸す
る酵素活性の存在下、反応収率が低下することを見いだ
した。該酵素活性を有する菌体の細胞破砕物に極性溶媒
を添加することで該酵素活性を選択的に除けることを見
いだした。また、塩析による分画やイオン交換樹脂など
の担体でシトシンヌクレオシドホスホリラーゼを精製す
ることで該酵素活性を除くこともできる。この様な処理
物を用いることでシトシンヌクレオシド化合物を効率的
に製造できることも見出し、本発明を完成させるに至っ
た。更に本発明者らは、該酵素活性を欠損した微生物に
シトシンヌクレオシドホスホリラーゼを発現させること
でシトシンヌクレオシド化合物を効率的に製造できるこ
とも見出し、本発明を完成させるに至った。

【００１９】本発明によれば、従来達成できなかったシ
トシンヌクレオシドホスホリラーゼによるシトシンヌク
レオシド化合物の効率的な合成方法を提供することがで
きる。

【００２０】即ち本発明は以下の通りである。

【００２１】本発明にかかるシトシンヌクレオシド化合
物の製造方法は、リン酸化糖と、シトシンまたはシトシ
ン誘導体とを、シトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活
性を有する酵素の存在下で反応させて、シトシンヌクレ
オシド化合物を得る工程を有することを特徴とする。

【００２２】上記の酵素としては、プリンヌクレオシド
ホスホリラーゼ活性を有する酵素を用いることができ、
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素を
含む酵素調製物は、本発明にかかるシトシンヌクレオシ
ド化合物の製造方法に好適に利用できる。なお、このよ
うなプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵
素としては、例えば、大腸菌由来の酵素を挙げることが
できる。

【００２３】上記のシトシン誘導体としては、下記式
（Ｉ）：

【００２４】

【化２】 （上記式（Ｉ）中、Ｘは炭素原子または窒素原子を、Ｙ
は水素原子、ハロゲン原子または低級アルキル基を示
す。）で表される化合物を用いることができる。その具
体例としては、例えばアザシトシン及び５−フルオロシ
トシンを挙げることができる。

【００２５】更に、上記のシトシンヌクレオシドホスホ
リラーゼ活性を有する酵素は、この酵素を有する微生物
の菌体またはその培養液、あるいはこれらから得られた
粗酵素抽出液、粗酵素溶液、粗酵素調製物および精製酵
素調製物など酵素調製物の形態で反応系中に供給するこ
とができる。

【００２６】これらの菌体あるいは酵素調製物として
は、シトシンデアミナーゼ活性およびシチジンデアミナ
ーゼ活性がないか、あるいは存在していてもシトシンヌ
クレオシドホスホリラーゼ活性を利用したシトシンヌク
レオシド化合物の製造が可能である程度に低いものであ
ることが好ましい。例えば、シトシンデアミナーゼ活性
およびシチジンデアミナーゼ活性よりもシトシンヌクレ
オシドホスホリラーゼ活性が高い菌体及び酵素調製物を
好適に用いることができる。

【００２７】このような菌体及び酵素調製物の一例とし
ては、これらの有するシトシンデアミナーゼ活性および
シチジンデアミナーゼ活性を低減化処理によって低下さ
せたものを挙げることができる。

【００２８】上記のデアミナーゼ活性の失活または低減
化のための処理が施された微生物の菌体は、例えばシト
シンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物の
菌体を有機溶媒を含む水に接触させて、シトシンデアミ
ナーゼ活性およびシチジンデアミナーゼ活性を選択的に
減少させて得ることができる。この有機溶媒としては、
アルコール類などの極性溶媒を利用することができる。
この有機溶媒としては、例えばメチルアルコール、エチ
ルアルコール、プロピルアルコール、ブチルアルコー
ル、ジオキサン及びアセトンの中から選ばれる１種以上
の有機溶媒が利用できる。

【００２９】更に、有機溶媒によりシトシンデアミナー
ゼ活性およびシチジンデアミナーゼ活性を失活または低
減化させる際に、水中の有機溶媒濃度を２０容量％以上
とすることが好ましい。

【００３０】一方、デアミナーゼ活性の失活または低減
化のための処理が施された微生物の菌体は、シトシンヌ
クレオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物の菌体を
水性媒体中でシトシンデアミナーゼ活性およびシチジン
デアミナーゼ活性を選択的に減少させる温度で加熱処理
して得ることもできる。この加熱処理の条件としては、
５０℃以上で１０分間以上４０時間以内の条件を採用す
ることができる。

【００３１】一方、デアミナーゼ活性の失活または低減
化のための処理を行う際に、ペントース−１−リン酸を
存在させることで、維持すべきシトシンヌクレオシドホ
スホリラーゼ活性をより効果的に維持することが可能と
なる。その際のペントース−１−リン酸の濃度は１ｍＭ
以上１００ｍＭ以下とすることが好ましい。

【００３２】

【発明の実施の形態】本発明においてシトシンヌクレオ
シドホスホリラーゼとは、シトシンまたはシトシン誘導
体を基質としてシトシンヌクレオシド化合物を生成する
活性を有する酵素を指しており、この要件を満たす限り
動物、植物、微生物の何れの起源であっても構わない。
シトシンヌクレオシドホスホリラーゼなる酵素は当該分
野においては一般的に知られていない。そのため、本発
明においてのみかかる用語を上記の通り規定して用い
る。このようなヌクレオシドホスホリラーゼの具体例と
しては、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）等のエシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ）属に含まれる微生物の従来のプリンヌクレオシドホ
スホリラーゼとして知られている酵素でシトシンヌクレ
オシドホスホリラーゼ活性も有するものを好適な例とし
て挙げることができる。具体的な例として、エシェリシ
ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のプリ
ンヌクレオシドホスホリラーゼのＤＮＡ塩基配列を配列
番号３に、該塩基配列より翻訳されるアミノ酸配列を配
列番号：４に例示した。また、近年の遺伝子工学の進歩
により塩基配列の一部を失活、挿入、置換によりアミノ
酸配列を改変することが容易となった。かかる技術水準
に鑑み、該塩基配列の一部を、所望とする酵素活性に影
響を及ぼさない範囲内、例えば酵素活性を維持または向
上できる範囲内で、改変してアミノ酸配列を改変したも
のも本発明のシトシンヌクレオシドホスホリラーゼに包
含されるものとする。例えば、配列番号：４に示したア
ミノ酸配列に、目的とする酵素活性に影響を及ぼさない
範囲内で２〜３個のアミノ酸の欠失、置換または付加が
行われたものや、配列番号：３の塩基配列に目的とする
酵素活性に影響を及ぼさず、かつ、その相補配列がスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし得る範囲内で
の欠失、置換または付加等の変異を生じさせた塩基配列
によってコードされたアミノ酸配列を有するものを用い
ることができる。

【００３３】この様に、プリンヌクレオシドスホリラー
ゼ活性を有すると、プリン型ヌクレオシド化合物とシト
シンヌクレオシド化合物を１種類の酵素で製造すること
が可能となり、ヌクレオシド類の工業的な製造には大変
有利である。

【００３４】本発明の方法に用いるシトシンヌクレオシ
ドホスホリラーゼ活性を有する酵素は、該酵素を有する
微生物の菌体、この菌体またはその培養液から調製され
た酵素調製物などの形態で反応系に供給することができ
る。なお、この酵素調製物には、菌体またはその培養液
の各種処理物、酵素抽出物、酵素抽出物を用いた粗精製
品及び単離精製品などが含まれる。

【００３５】これらの微生物の菌体や酵素調製物として
は、市販のものや各種方法を利用して調製したものを用
いることができる。例えば、この酵素活性を有する調製
物としては市販の酵素、該酵素活性を有する微生物菌
体、及び菌体処理物またはそれらの固定化物などが使用
できる。菌体処理物とは、例えばアセトン乾燥菌体や機
械的破壊、超音波破砕、凍結融解処理、加圧減圧処理、
浸透圧処理、自己消化、細胞壁分解処理、界面活性剤処
理などにより調製した菌体破砕物などであり、また、必
要に応じて硫安沈殿やアセトン沈殿、カラムクロマトグ
ラフィーにより精製を重ねたものを用いても良い。

【００３６】なお、シトシンヌクレオシドホスホリラー
ゼ活性を有する微生物は、シトシンまたはシトシン誘導
体を基質としてシトシンヌクレオシド化合物を生成する
ヌクレオシドホスホリラーゼを発現しているものであれ
ば、特に限定されない。このような微生物は、例えば、
一般的なヌクレオシドホスホリラーゼを発現しているも
のから選択することができる。そのようなヌクレオシド
ホスホリラーゼを生産する微生物の具体例としては、エ
シェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）
等のエシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に含ま
れる微生物を好適な例として挙げることができる。

【００３７】近年の分子生物学および遺伝子工学の進歩
により、上述の微生物株のプリンヌクレオシドホスホリ
ラーゼの分子生物学的な性質やアミノ酸配列等を解析す
ることにより、該蛋白質の遺伝子を該微生物株より取得
し、該遺伝子および発現に必要な制御領域が挿入された
組換えプラスミドを構築し、これを任意の宿主に導入
し、該蛋白質を発現させた遺伝子組換え菌を作出するこ
とが可能となり、かつ、比較的容易にもなった。かかる
技術水準に鑑み、このようなヌクレオシドホスホリラー
ゼの遺伝子を任意の宿主に導入した遺伝子組換え菌も本
発明のヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生
物に包含されるものとする。

【００３８】ここでいう発現に必要な制御領域とは、プ
ロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含
む）・リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）・転写終結配列
等を示している。プロモーター配列の具体例としては、
大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモー
ター・ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター・ラム
ダファージ由来のＰＬプロモーター及びＰＲプロモータ
ーや、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター
（ｇｎｔ）・アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐ
ｒ）・中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）・α−
アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等が挙げられる。ま
た、ｔａｃプロモーターのように独自に改変・設計され
た配列も利用できる。リボゾーム結合配列としては、大
腸菌由来または枯草菌由来の配列が挙げられるが、大腸
菌や枯草菌等の所望の宿主内で機能する配列であれば特
に限定されるものではない。たとえば、１６Ｓリボゾー
ムＲＮＡの３’末端領域に相補的な配列が４塩基以上連
続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成してこ
れを利用してもよい。転写終結配列は必ずしも必要では
ないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテイン
ターミネーター・ｔｒｐオペロンターミネーター等が利
用できる。これら制御領域の組換えプラスミド上での配
列順序は、５’末端側上流からプロモーター配列、リボ
ゾーム結合配列、ヌクレオシドホスホリラーゼをコード
する遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。

【００３９】ここでいうプラスミドの具体例としては、
大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３
２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ
（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中
での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐ
ＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等をベク
ターとして利用することができる。また、２種類以上の
宿主内での自律複製が可能なプラスミドの例として、ｐ
ＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７をベクター
として利用することができる。

【００４０】ここでいう任意の宿主には、後述の実施例
のように大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定され
るのものではなく枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微
生物菌株も含まれる。

【００４１】本発明におけるシトシンヌクレオシド化合
物とはリン酸化糖と核酸塩基としてシトシンまたはシト
シン誘導体がＮ−グリコシド結合で結合した化合物のこ
とである。その代表例を挙げると、例えばシチジン、デ
オキシシチジン、ジデオキシシチジン、アザシチジン、
デオキシアザシチジン、５−フルオロシチジン及び５−
フルオロデオキシシチジンなどを挙げられるが、これら
に限定されるものではない。

【００４２】本発明におけるシトシン誘導体とは、シト
シン構造部分を有し、このシトシン構造部分がシトシン
ヌクレオシドホスホリラーゼ活性の作用によりシトシン
ヌクレオシド構造に変化し得るものである。このシトシ
ン誘導体の好ましい例としは、前記一般式（Ｉ）で表さ
れるシトシン誘導体を挙げることができる。前記一般式
（Ｉ）におけるＹとしての低級アルキル基としては、炭
素数１〜４のアルキル基、例えば、メチル基、エチル
基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、
sec−ブチル基及びtert−ブチル基を挙げることができ
る。これらのシトシン誘導体の中では、例えば、アザシ
トシン、５−フルオロシトシン、５―メチルシトシンな
どが特に好ましい。

【００４３】本発明におけるリン酸化糖とは、ポリヒド
ロキシアルデヒドまたはポリヒドロキシケトンおよびそ
の誘導体の１位にリン酸がエステル結合したもののこと
である。その好ましい代表例を挙げると、例えばリボー
ス１−リン酸、２´−デオキシリボース１−リン酸、２
´，３´−ジデオキシリボース１−リン酸、アラビノー
ス１−リン酸、ジオキソラン糖−リン酸などが挙げられ
る。

【００４４】ここでいうポリヒドロキシアルデヒドまた
はポリヒドロキシケトンとは、天然物由来のものとして
は、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロ
ース、Ｌ−リキソーズ、Ｄ−リボースのようなアルドペ
ントース、Ｄ−キシルロース、Ｌ−キシルロース、Ｄ−
リブロースのようなケトペントース、Ｄ−２−デオキシ
リボース、Ｄ−２，３−ジデオキシリボースのようなデ
オキシ糖類を挙げることができるが、これらに限定され
るものではない。

【００４５】これらリン酸化糖は、ヌクレオシドホスホ
リラーゼの作用によりヌクレオシド化合物の加リン酸分
解反応を行って製造する方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｖｏｌ．１８４、４３７、１９５０）や、アノマー
選択的な化学合成法等によっても調製することができ
る。また、ＷＯ ０１／１４５６６に記載の酵素的なデ
オキリボースー１−リン酸の合成方法によっても調整す
ることができる。（ロッシュの特許のdRP合成ルートも
記載。）本発明において、シトシンデアミナーゼ活性お
よびシチジンデアミナーゼ活性の低減化処理とは、ヌク
レオシドホスホリラーゼを失活させず、シトシンデアミ
ナーゼ活性およびシチジンデアミナーゼ活性を失活また
は低減化させることができれば特に限定されないが、例
えば該微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物を有
機溶媒中にさらしたり、加熱処理を施すことを好適な例
として挙げることができる。

【００４６】本発明において、有機溶媒とはシトシンデ
アミナーゼ活性およびシチジンデアミナーゼ活性を失活
させることが可能な溶媒であれば特に限定されないが、
具体的にはメチルアルコール、エチルアルコール、プロ
ピルアルコール、ブチルアルコール、ジオキサン、テト
ラヒドロフラン、メチルエチルケトン及びアセトン等の
極性溶媒や１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタ
ノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−
１−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノー
ル、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタ
ノール、１−ノナノール等のアルコール類、酢酸プロピ
ル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸sec−ブチル、
酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸シクロヘキシ
ル、酢酸ベンジル等のエステル類、ペンタン、ヘキサ
ン、２−メチルヘキサン、２，２−ジメチルブタン、
２，３−ジメチルブタン、シクロヘキサン、メチルシク
ロヘキサン、ヘプタン、シクロヘプタン、オクタン、シ
クロオクタン、イソオクタン、ノナン、デカン、ドデカ
ン、石油エーテル、石油ベンジン、リグロイン、工業ガ
ソリン、灯油、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチル
ベンゼン、プロピルベンゼン、クメン、メシチレン、ナ
フタレン等の炭化水素類、ジクロロメタン、クロロホル
ム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジ
クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類、クレゾー
ル、キシレノール等のフェノール類、メチルイソブチル
ケトン、２−ヘキサノン等のケトン類、ジプロピルエー
テル、ジイソプロピルエーテル、ジフェニルエーテル、
ジベンジルエーテル等のエーテル類が挙げられ、ペンタ
ン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、シクロペンタン、
シクロヘキサン、シクロヘプタン、シクロオクタン、ト
ルエン、エチルベンゼン等の炭化水素類が挙げられる。
また、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−
メチル−２−ピロリドン、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ
−エチルホルムアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、ホル
ムアミド、アセチルアミド、安息香酸アミド等のアミド
化合物や、ウレア、Ｎ，Ｎ’−ジメチルウレア、テトラ
メチルウレア、Ｎ，Ｎ−ジメチルイミダゾリジノン等の
ウレア化合物が挙げられ、ジメチルスルホキシド、ジエ
チルスルホキシド、ジフェニルスルホキシド等のスルホ
キシド化合物が挙げられる。

【００４７】本発明でいうデアミナーゼ活性の失活また
は低減化のための有機溶媒処理とは、ヌクレオシドホス
ホリラーゼを失活させず、シトシンデアミナーゼ活性お
よびシチジンデアミナーゼ活性を失活または低減化させ
ることができれば特に限定されないが、例えば該微生物
の菌体、培養液またはそれらの処理物をｐＨは通常４．
０以上１０．０以下であり、好ましくは６．０以上９．
０以下で、有機溶媒を水中濃度として、例えば１０容量
％以上、好ましくは２０容量％以上、より好ましくは３
０容量％以上の濃度で、通常０℃以上の温度、好ましく
は２０℃、更には５０℃以上で、８０℃以下の温度で、
通常１０分間以上で４０時間以下、より好ましくは１時
間以上２０時間以下の時間で静置または懸濁するような
方法を挙げることができる。

【００４８】また、処理液中にリン酸化糖を１ｍＭ以上
好ましくは１００ｍＭ以下添加することにより、ヌクレ
オシドホスホリラーゼをより安定化させることができ
る。

【００４９】また、反応液中にこれらの有機溶媒を添加
することによっても同様の効果を得ることが可能であ
る。

【００５０】本発明でいう熱処理とはヌクレオシドホス
ホリラーゼを失活させず、シトシンデアミナーゼ活性お
よびシチジンデアミナーゼ活性を失活または低減化させ
ることができれば特に限定されないが、例えば、該微生
物の菌体、培養液またはそれらの処理物を水性媒体中で
ｐＨは通常４．０以上１０．０以下であり、好ましくは
６．０以上９．０以下で、温度は通常５０℃以上、好ま
しくは６０℃以上８０℃以下で１０分間以上、より好ま
しくは３０分間以上静置または懸濁するような方法を挙
げることができる。加熱時間は４０時間以下が更に好ま
しい。また、処理液中にリン酸化糖を１ｍＭ以上、好ま
しくは１０ｍＭ以上１００ｍＭ以下添加することによ
り、ヌクレオシドホスホリラーゼをより安定化させるこ
とができる。

【００５１】本発明でいうシトシンデアミナーゼおよび
シチジンデアミナーゼの両酵素活性を有さない微生物と
は、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌ではシチジンデアミ
ナーゼのみ存在し、シトシンデアミナーゼの存在は知ら
れていない。この様にＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌のシチジ
ンデアミナーゼ欠損株を用いることが可能である。例え
ばＢａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃ
ｅｎｔｅｒ（ＢＧＣＳ）より入手が可能なＢａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ １Ａ４７９などが例示でき
る。このような菌株にヌクレオシドホスホリラーゼを発
現させた菌体を用いることも可能である。

【００５２】本発明でいうホスファターゼの欠損株と
は、例えばアルカリホスファターゼの欠損株としては大
腸菌Ｋ−１２ ＤＨ５αを例示することができる。この
様な菌株に、シトシンヌクレオシドホスホリラーゼを発
現させた菌体を用いることも可能である。

【００５３】この様な菌体を加熱処理する事により酸性
ホスファターゼを失活または低減化することが可能であ
り、更に高い反応収率を達成することができる。例え
ば、該微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物を水
性媒体中でｐＨは通常４．０以上１０．０以下であり、
好ましくは６．０以上９．０以下で、温度は通常５０℃
以上、好ましくは６０℃以上８０℃以下で１０分間以
上、より好ましくは３０分間以上静置または懸濁するよ
うな方法を挙げることができる。

【００５４】本発明でいうシトシンヌクレオシドホスホ
リラーゼ活性を阻害する物質を低減化または除去すると
は、反応を阻害する物質を除去または低減化できれば特
に限定されないが、例えば菌体を超音波破砕などにより
酵素液を調整し、該酵素液に極性溶媒を加えることでシ
トシンヌクレオシドホスホリラーゼを沈殿として得る方
法や硫酸アンモニウムなどを加える塩析により沈殿とし
て集める方法、或いはイオン交換樹脂等で精製する方法
等によりシトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を阻
害する物質を除去または低減化することが可能である。

【００５５】本発明におけるシトシンヌクレオシド化合
物の合成反応は、シトシンまたはシトシン誘導体とリン
酸化糖を基質としてシトシンヌクレオシド化合物を合成
できるヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生
物であって、シトシンまたはシトシン誘導体やシトシン
ヌクレオシド化合物を分解する活性を失活、あるいは欠
損した微生物の菌体、培養液それらの処理物を用い、適
切なｐＨや温度などの反応条件を選べばよいが通常はｐ
Ｈ４〜１０、温度１０〜８０℃の範囲で行うことができ
る。反応に使用するリン酸化糖とシトシンまたはシトシ
ン誘導体の濃度は０．１〜１０００ｍＭ程度が適当であ
り、両者のモル比は添加するシトシンまたはシトシン誘
導体の比率をリン酸化糖またはその塩に対して０．１〜
１０倍モル量で行える。反応転化率を考えれば０．９５
倍モル量程度が好ましい。

【００５６】また、反応液中に生成するリン酸をトラッ
プする目的でリン酸と難溶性の金属塩類を存在させた
り、イオン交換樹脂等の担体を存在させることで反応収
率を高めることも可能である。

【００５７】反応液よりシトシンヌクレオシド化合物を
採取する方法は、水等の溶媒に対する溶解度差を利用し
たり、イオン交換や吸着樹脂を用いる方法で行うことが
できる。

【００５８】反応液中に残存する微量のシトシンをシト
シンデアミナーゼの発現している微生物を用い、シチジ
ンデアミナーゼの低減化または失活処理を施すか、或い
はシチジンデアミナーゼ欠損株にシトシンデアミナーゼ
を発現させた微生物を用い、反応液中に存在させること
で微量のシトシンをウラシルに変換することができる。
該反応液を陽イオン交換樹脂に通すことで未反応のシト
シンが変換されたウラシルやシトシンヌクレオシド化合
物の分解物であるウラシルヌクレオシド化合物は吸着せ
ず、シトシンヌクレオシド化合物のみを吸着させること
で容易に精製することができる。

【００５９】

【実施例】以下に実施例で本発明を説明するが、本発明
はこれら実施例によって何等制限されるものではない。 ［分析法］生成したヌクレオシド化合物はすべて高速液
体クロマトグラフィーにより定量した。分析条件は以下
による。 カラム；Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＭＧ−５ ４．
６×２５０ｍｍ（野村化学） カラム温度；４０℃ ポンプ流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ． 検出；ＵＶ２５４ｎｍ、 溶離液；５０ｍＭリン酸１カリウム：メタノール＝８：
１（Ｖ／Ｖ） 参考例１（特開平１−６０３９６公報の再現性試験） 特開平１−６０３９６公報の実施例１に従ってデオキシ
シチジンの合成を検討した。即ち、実施例１記載の菌株
２４株の中から表１に示す７寄託株を取り寄せた。酵母
エキス０．５ｇ／ｄｌ、ペプトン１．０ｇ／ｄｌ、肉エ
キス１．０ｇ／ｄｌおよびＮａＣｌ０．５ｇ／ｄｌを含
む培地（ｐＨ７．０）５０ｍｌを５００ｍｌ容肩付フラ
スコに分注し殺菌した。この培地に、ブイヨン寒天培地
にて３０℃，１６時間前培養した表１に示す微生物を１
白金耳ずつ接種し、３０℃にて１６時間振とう培養し
た。得られた培養液より菌体を遠心分離により分離した
後、０．０５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で洗浄
し、更に遠心分離することにより洗浄菌体を調製した。

【００６０】上記洗浄菌体を２０ｍＭの２’−デオキシ
リボース−１−リン酸と２０ｍＭのシトシンを含む０．
０５Ｍトリスバッファー（ｐＨ７．２）１０ｍｌに５ｇ
／ｄｌになる様に添加し、６０℃，２４時間反応させ
た。反応液を希釈しＨＰＬＣで分析した結果、何れも基
質であるシトシンは分解されほとんど消失されていた
が、デオキシシチジンは検出されなかった。

【００６１】

【表１】

【００６２】参考例２（ＰＮＰクローニングと発現株作
製、対照菌体の作製） 大腸菌染色体ＤＮＡを次のようにして調製した。

【００６３】エシェリヒア・コリＫ−１２／ＸＬ−１０
株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を５０ｍｌのＬＢ培地に
接種し、３７℃で一夜培養した後集菌し、リゾチーム１
ｍｇ／ｍｌを含む溶菌液で溶菌した。溶菌液をフェノー
ル処理した後、通常の方法によりエタノール沈殿により
ＤＮＡを沈殿させた。生じたＤＮＡの沈殿は、ガラス棒
に巻き付けて回収した後、洗浄し、ＰＣＲに用いた。

【００６４】ＰＣＲ用のプライマーには、エシェリヒア
・コリの既知のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（以
下ＰＮＰと表記する）をコードするｄｅｏＤ遺伝子の塩
基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．
ＡＥ０００５０８（コード領域は塩基番号１１５３１
−１２２５０）に基づいて設計した配列番号１及び２に
示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（北海道シス
テム・サイエンス株式会社に委託して合成した）を用い
た。これらのプライマーの５’末端付近及び３’末端付
近には、それぞれＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限
酵素認識配列を有する。

【００６５】制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した
前記大腸菌染色体ＤＮＡ ６ｎｇ／μｌ及びプライマー
各３μＭを含む０．１ｍｌのＰＣＲ反応液を用いて、変
性：９６℃、１分間、アニーリング：５５℃、１分間、
伸長反応：７４℃、１分間からなる反応サイクルを、３
０サイクルの条件でＰＣＲを行った。

【００６６】上記反応産物及びプラスミドｐＵＣ１８
（宝酒造（株））を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで
消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用い
て連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エ
シェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換した。形質転換株
を、アンピシリン（Ａｍ）５０μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａ
ｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐
性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。

【００６７】このようにして得られた形質転換株よりプ
ラスミドを抽出し、目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラ
スミドを、ｐＵＣ−ＰＮＰ７３と命名した。ｐＵＣ−Ｐ
ＮＰ７３に導入されたＤＮＡ断片の塩基配列を通常の塩
基配列の決定法に従い塩基配列を確認した。得られた塩
基配列を配列番号３に、塩基配列より翻訳されたアミノ
酸配列を配列番号４に示した。本酵素のサブユニットの
分子量は約２６０００であり、６量体として活性発現し
ていることが知られている。本酵素の至適温度は約７０
℃であり、至適ｐＨは約７．０から７．５である。こう
して得られた形質転換体を、エシェリヒア・コリ ＭＴ
−１０９０５と名づけた。

【００６８】エシェリヒア・コリ ＭＴ−１０９０５株
をＡｍ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬで３７
℃・１晩振とう培養した。培養液を１３０００ｒｐｍで
１０ｍｉｎ遠心分離し、得られた菌体を２０ｍＬの１０
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。懸
濁液を再度１３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、
得られた菌体を２ｍＬの１００ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）、１０ｍＭの２´−デオキシリボース１
−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（Ｓ
ＩＧＭＡ製）に懸濁し、−２０℃にて凍結保存した。

【００６９】プラスミドｐＵＣ１８（宝酒造（株））を
用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換した。
形質転換株をｐＵＣ１８／ＤＨ５αと名づけた。ｐＵＣ
１８／ＤＨ５α株をＡｍ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地
１００ｍＬで３７℃・１晩振とう培養した。培養液を１
３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、得られた菌体
を２０ｍＬの１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）に懸濁した。懸濁液を再度１３０００ｒｐｍで１０
ｍｉｎ遠心分離し、得られた菌体を２ｍＬの１００ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭの２´−デ
オキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアン
モニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）に懸濁し、−２０℃にて
凍結保存した。

【００７０】比較例１（ＰＮＰを組換えた大腸菌でのデ
オキシシチジン合成） ２０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノ
シクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２
０ｍＭのシトシン（和光純薬製、特級）、１００ｍＭの
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、参考例２で得られた
ｐＵＣ１８／ＤＨ５α株の菌体懸濁液０．１ｍＬからな
る反応液１．０ｍｌを５０℃で２０時間反応させた。基
質を入れずに同様に保温したものを比較例とした。反応
液を希釈した後分析したところデオキシシチジンは検出
されなかった。図１（Ａ）に比較例、図１（Ｂ）に反応
液のＨＰＬＣの分析チャートを示した。

【００７１】比較例２（ＰＮＰを組み換えていない大腸
菌のデオキシシチジン合成） ２０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノ
シクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２
０ｍＭのシトシン（和光純薬製、特級）、１００ｍＭの
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、参考例２で得られた
ＭＴ―１０９０５株の菌体懸濁液０．１ｍＬからなる反
応液１．０ｍｌを５０℃で２０時間反応させた。基質を
入れずに同様に保温したものを比較例とした。反応液を
希釈した後分析したところ、１０ｍＭのデオキシウリヂ
ン、３ｍＭのウラシルが生成していたがデオキシシチジ
ンは検出されなかった。図２（Ａ）に比較例、図２
（Ｂ）に反応液のＨＰＬＣの分析チャートを示した。

【００７２】実施例１（有機溶媒処理） 参考例２のＭＴ−１０９０５株の懸濁液にメタノール
（ＭｅＯＨ）を表２に示すような濃度で添加して３０℃
にて１時間保温した。以下シチジンデアミナーゼはｃｄ
ｄと表記する。ｃｄｄの活性測定は１００ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２０ｍＭシチジンの反応液
１．０ｍｌに菌体懸濁液を加えて５０℃で２ｈｒ反応さ
せることにより測定した。上述の菌体懸濁液にＭｅＯＨ
を添加せずに、３０℃にて１時間保温したものを１００
％として相対値で示した。

【００７３】ＰＮＰの活性は２０ｍＭの２´−デオキシ
リボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウ
ム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、５．４ｍＭのアデニン（和光
純薬製、特級）、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）反応液１．０ｍｌに菌体を添加し５０℃で１５
分反応させることにより測定した。デオキシアデノシン
の生成量が２ｍＭ以下の生成量である菌体量を用い反応
を行った。上述の菌体懸濁液にＭｅＯＨを添加せずに３
０℃にて１時間保温したものを１００％として相対値で
示した。結果を表２に示した通り、ＰＮＰ活性はほとん
ど低下しなかったが、ｃｄｄ活性はほとんど失活してい
た。

【００７４】

【表２】

【００７５】実施例２（有機溶媒処理） 参考例２のＭＴ−１０９０５株の懸濁液に表３に示すよ
うな有機溶媒を添加し、３０℃にて１時間保温した。結
果は表３に示した通り、ＰＮＰの活性はほとんど低下し
なかったが、ｃｄｄの活性はほとんど失活していた。

【００７６】

【表３】

【００７７】実施例３（加熱処理） 参考例２のＭＴ−１０９０５株の懸濁液を６０℃にて保
温した。以下シトシンデアミナーゼはｃｏｄと表記す
る。ｃｏｄ活性は１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）、２０ｍＭシトシンに菌体懸濁液を添加して５
０℃で２ｈｒ反応させることにより測定した。無処理の
菌体を添加した時のシトシン分解量を１００％として、
残存活性を相対値で表した。結果を表４に示した通り、
ＰＮＰの活性はほとんど低下しなかったが、ｃｏｄの活
性はほとんど失活していた。

【００７８】

【表４】

【００７９】実施例４（加熱処理＋有機溶媒処理） 実施例３で得た加熱処理２０ｈｒの菌体を実施例１と同
じ方法でＭｅＯＨ処理を行った。実施例３の２０ｈｒ処
理の菌体活性を１００％としたときの相対値として表示
した。結果を表５に示す通り、ＰＮＰの活性はほとんど
低下しなかったが、ｃｏｄとｃｄｄの活性はほとんど失
活していた。

【００８０】

【表５】

【００８１】実施例５（実施例４の処理を施した組換え
ＰＮＰ発現菌によるデオキシシチジンの合成） ２０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノ
シクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２
０ｍＭのシトシン（和光純薬製、特級）、１００ｍＭの
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、実施例４で得られた
５０％ＭｅＯＨでの処理菌体液０．１ｍｌからなる反応
液１．０ｍｌを５０℃で２０時間反応させた。反応液を
希釈した後分析したところ、１０．７ｍＭのデオキシシ
チジン、０．２ｍＭのデオキシウリヂン、０．１ｍＭの
ウラシルが生成していた。その時の反応収率は５３％で
あった。図２（Ｃ）に反応液のＨＰＬＣの分析チャート
を示した。

【００８２】実施例６（実施例４の処理を施した大腸菌
によるデオキシシチジンの合成） ２０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノ
シクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２
０ｍＭのシトシン（和光純薬製、特級）、１００ｍＭの
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、参考例２で得られた
ｐＵＣ１８／ＤＨ５αの菌体懸濁液を実施例４と同様の
方法で５０％ＭｅＯＨ処理をした菌体懸濁液０．１ｍｌ
からなる反応液１．０ｍｌを５０℃で２０時間反応させ
た。反応液を希釈した後分析したところ、０．１４ｍＭ
のデオキシシチジン、０．１７ｍＭのデオキシウリヂン
が生成していた。その時の反応収率は０．７％であっ
た。図１（Ｃ）に反応液のＨＰＬＣの分析チャートを示
した。

【００８３】実施例７（実施例４の処理を施した組換え
ＰＮＰ発現菌によるシチジンの合成） ２０ｍＭのリボース１−リン酸ジ（シクロヘキシルアン
モニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２０ｍＭのシトシン
（和光純薬製、特級）、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）、実施例４で得られた５０％ＭｅＯＨ処
理の菌体懸濁液０．１ｍｌからなる反応液１．０ｍｌを
５０℃で２０時間反応させた。反応液を希釈した後分析
したところ、５ｍＭのシチジン、０．１ｍＭのウリヂ
ン、０．１ｍＭのウラシルが生成していた。その時の反
応収率は２５％であった。

【００８４】実施例８（ＰＮＰの精製と精製ＰＮＰによ
るデオキシシチジンの合成） 実施例４で得られた菌体を１０ｍＬの１０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波破砕機で菌体
を破砕した。次いで破砕液を遠心分離により粗酵素液を
調整し、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平
衡化したＤＥＡＥ−トヨパール（トーソー）３ｃｍ×１
０ｃｍのカラムに加え、５０ｍＭＮａＣｌから５００ｍ
ＭＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出し、活性画分を
回収した。溶離液を７０％硫安飽和で沈殿として回収
し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して
透析した。１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で
平衡化したハイドロキシアパタイトカラム（３ｃｍ×１
５ｃｍ）に透析液を加え、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）から５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で溶出し、活性画分を回収した。酵素液を７０
％硫安飽和で沈殿として回収し、１ｍＬの１０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、１０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析し精製ＰＮＰを
２ｍＬを得た。こうして得た精製ＰＮＰはＳＤＳ−ポリ
アクリルアミド電気泳動により単一のバンドであること
を確認した。結果を図３に示した。 ２０ｍＭの２´−
デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルア
ンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２０ｍＭのシトシン
（和光純薬製、特級）、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）、精製酵素０．１ｍｌからなる反応液
１．０ｍｌを５０℃で２０時間反応させた。反応液を希
釈した後分析したところ、１１．５ｍＭのデオキシシチ
ジンが生成し、その時の反応収率は５７．５％であっ
た。

【００８５】実施例９（実施例４の処理を施した組換え
ＰＮＰ発現菌によるアザシチジンの合成） ２０ｍＭのリボース１−リン酸ジ（シクロヘキシルアン
モニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２０ｍＭのアザシトシ
ン（ＳＩＧＭＡ製）、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）、実施例４で得られた５０％ＭｅＯＨ処
理の菌体懸濁液０．１ｍｌからなる反応液１．０ｍｌを
５０℃で２０時間反応させた。反応液を希釈した後分析
したところ、３．２ｍＭのアザシチジンが生成してい
た。その時の反応収率は１６％であった。

【００８６】実施例１０（実施例４の処理を施した組換
えＰＮＰ発現菌によるフルオロシチジンの合成） ２０ｍＭのリボース１−リン酸ジ（シクロヘキシルアン
モニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２０ｍＭの５−フルオ
ロシトシン（ＳＩＧＭＡ製）、１００ｍＭのトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８．０）、実施例４で得られた５０％Ｍｅ
ＯＨ処理の菌体懸濁液０．１ｍｌからなる反応液１．０
ｍｌを５０℃で２０時間反応させた。反応液を希釈した
後分析したところ、２．４ｍＭの５−フルオロシチジン
が生成していた。その時の反応収率は１２％であった。

【００８７】実施例１１（実施例４の処理を施した組換
えＰＮＰ発現菌によるメチルシチジンの合成） ２０ｍＭのリボース１−リン酸ジ（シクロヘキシルアン
モニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２０ｍＭの５−メチル
シトシン（ＳＩＧＭＡ製）、１００ｍＭのトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）、実施例４で得られた５０％ＭｅＯ
Ｈ処理の菌体懸濁液０．１ｍｌからなる反応液１．０ｍ
ｌを５０℃で２０時間反応させた。反応液を希釈した後
分析したところ、２．1ｍＭの５−メチルシチジンが生
成していた。その時の反応収率は１０．５％であった。

【００８８】実施例１２（分解活性欠損株にＰＮＰを組
込んだ菌体によりデオキシシチジンを合成） （１）大腸菌ＰＮＰを枯草菌で発現させる大腸菌‐枯草
菌シャトルベクターｐＰＮＰ０４、及びｐＰＮＰ０５の
作製 ｐＵＣ−ＰＮＰ７３を鋳型として、配列番号５と配列番
号６の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣ
Ｒ法により大腸菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺
伝子を増幅し、０．８ｋｂのＤＮＡ断片Ａを得た。次
に、特開昭６０−２１０９８６公報に記載のプラスミド
ｐＮＰ１５０（ＦＥＲＭ ＢＰ‐４２５）を鋳型とし
て、配列番号７と配列番号８の合成オリゴヌクレオチド
プライマーを用いたＰＣＲ法によりバチルス・アミロリ
キファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕ
ｅｆａｃｉｅｎｓ）の中性プロテアーゼ由来の転写プロ
モーター、及び翻訳調節部位を含む領域を増幅し、１．
０ｋｂのＤＮＡ断片Ｂを得た。続いて、ＤＮＡ断片Ａと
ＤＮＡ断片Ｂの重複領域同士を用いてアニーリングし、
この生成断片を鋳型として配列番号６、及び配列番号７
の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法
により増幅し、約１．８ｋｂのＤＮＡ断片Ｃを得た。こ
のＤＮＡ断片Ｃを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ
で消化し、インサートフラグメントとした。ベクターＤ
ＮＡは、枯草菌・大腸菌シャトルベクターｐＲＢ３７
３、及びｐＲＢ３７４をＢａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＧＳＣ；ＯＨ）よ
り入手し、それぞれを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩ
ＩＩで消化し、ベクターフラグメントを調製した。この
ベクターフラグメントを上記インサートフラグメントの
過剰量存在下でライゲートし、大腸菌プリンヌクレオシ
ドホスホリラーゼ発現シャトルベクターｐＰＮＰ０４、
及びｐＰＮＰ０５を作製した。 （２）枯草菌へのｐＰＮＰ０４、及びｐＰＮＰ０５の導
入、および形質転換体を用いたデオキシシチジンの合成 枯草菌としては、シチジンデアミナーゼ活性を有さない
バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）１Ａ４７９株及びバチルス・ズブチリス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ４８０株をＢａ
ｃｉｌｌｕｓＧｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅ
ｒ（ＢＧＳＣ；ＯＨ）より入手して用いた。

【００８９】（１）で得られたプラスミドｐＰＮＰ０
４、及びｐＰＮＰ０５による形質転換はＣｈａｎｇのプ
ロトプラスト法（Ｃｈａｎｇ．Ｓ ａｎｄ Ｃｏｈｅ
ｎ，Ｓ．Ｎ．；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ． １６
８， １１１（１９７８））に従って実施し、形質転換
体１Ａ４８０（ｐＰＮＰ０４）、１Ａ４８０（ｐＰＮＰ
０５）及び１Ａ４７９（ｐＰＮＰ０４）及び１Ａ４７９
（ｐＰＮＰ０５）を得た。

【００９０】次に、１Ａ４８０（ｐＰＮＰ０４）株につ
いてデオキシシチジン合成活性を以下のように評価し
た。

【００９１】１Ａ４８０（ｐＰＮＰ０４）を２倍濃度の
Ｌ培地２０ｍＬで３５℃、１７時間培養した。この培養
液１．５ｍＬを遠心して得られた菌体を−２０℃で凍結
保存した。２４ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン
酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭ
Ａ製）、２０ｍＭのシトシン（和光純薬製、特級）、１
００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）よりなる反
応液１ｍｌを凍結菌体に加えて５０℃にて振とうした。
１．５時間及び１８時間後にサンプリングを行ない、水
で２０倍に希釈、遠心して菌体を除去した後に上清をＨ
ＰＬＣにて分析したところ、１．５時間で１．４〜１．
５ｍＭ、１８時間で６．４〜７．０ｍＭのデオキシシチ
ジンを蓄積し、基質及び生成物の分解物は認められなか
った。

【００９２】１Ａ４８０（ｐＰＮＰ０５）、１Ａ４７９
（ｐＰＮＰ０４）及び１Ａ４７９（ｐＰＮＰ０５）につ
いてもデオキシシチジン合成を測定した結果、１Ａ４８
０（ｐＰＮＰ０４）株とほぼ同等のデオキシシチジン合
成能力を保持していることが明らかとなった。

【００９３】実施例１３（シトシンヌクレオシドホスホ
リラーゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得） 参考例２で得られたｐＵＣ−ＰＮＰ７３のプラスミドＤ
ＮＡを鋳型として、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のＱｕｉｃ
ｋＣｈａｎｇｅ Site-Directed MutagenesisKitを用い
て変異を導入した。以降単にキットと呼ぶ。以下の実施
例では、基本的にキットの原理および操作方法を踏襲し
た。

【００９４】３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培
地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブによ
り滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとな
るようにアンピシリンを添加した後、参考例２で得られ
たＭＴ−１０９０５株を一白菌耳植菌し、３７℃・３０
０ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適
当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００
ｒｐｍ×５分）により該菌体を分離した。続いてアルカ
リＳＤＳ抽出法により該菌体よりｐＵＣ−ＰＮＰ７３の
プラスミドＤＮＡを調製した。

【００９５】ｐＵＣ−ＰＮＰ７３のプラスミドＤＮＡを
鋳型として配列番号９と１０、１１と１２、１３と１
４、１５と１６、１７と１８、１９と２０、２１と２
２、２３と２４、２５と２６、２７と２８、２９と３
０、３１と３２、３３と３４、３５と３６、３７と３
８、３９と４０、４１と４２、４３と４４、４５と４６
のＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを実施した。ＰＣＲ
反応液の組成を表６に示した。増幅条件を表７に示し
た。

【００９６】上記ＰＣＲ増幅反応液に制限酵素ＤｐｎＩ
を４ｕｎｉｔ加え、３７℃にて１ｈｒ保温した。この反
応液１μＬを大腸菌Ｋ−１２ＤＨ５αのコンピテントセ
ル（東洋紡）１００μＬに加え、氷中で３０分間保持し
た。４２℃の恒温水槽に３０秒間浸した後、コンピテン
トセルに付属するNZY+培地０．９ｍＬを加え３７℃で１
時間振とうした。上記培養液をＬＢ寒天培地にアンピシ
リンを１００μｇ／ｍＬとなるように加えた培地上に塗
抹し、３７℃で２０時間保温しコロニーを形成させた。

【００９７】該コロニーより任意に選別した５クローン
を各一白菌耳ずつ植菌し、Ａｍ５０μｇ／ｍｌを含むＬ
Ｂ培地１００ｍＬで３７℃・１晩振とう培養した。培養
液を１３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、得られ
た菌体を２０ｍＬの１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）に懸濁した。懸濁液を再度１３０００ｒｐｍで
１０ｍｉｎ遠心分離し、得られた菌体を２ｍＬの１００
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭの２´
−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシル
アンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）に懸濁し、実施例４
と同じ方法で菌体の処理を施し、実施例５と同じ方法で
デオキシシチジンの合成反応を行った。ＨＰＬＣ分析に
よりデオキシシチジンを測定した結果、５クローン中４
クローンでデオキシシチジンの生成が検出され、シトシ
ンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を保持していること
が確認された。

【００９８】シトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性
の測定に供した上記培養液の残部１ｍｌより該４クロー
ンの菌体をそれぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法によ
り各クローンのプラスミドＤＮＡを調製した。ＤＮＡ断
片の塩基配列を通常の塩基配列の決定法に従い塩基配列
を確認した。活性は、実施例１と同じ方法で測定した。
結果の一覧を表８に示した。

【００９９】

【表６】

【０１００】

【表７】

【０１０１】

【表８】

【０１０２】参考例３（大腸菌Ｋ―１２ Ｗ３１１０株
への形質転換） 参考例２で得たプラスミドｐＵＣ−ＰＮＰ７３を通常の
方法に従って大腸菌Ｋ−１２ Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ
２７３２５）に形質転換した。得られた形質転換体をＭ
Ｔ−１０９４８と名づけた。参考例２と同様の方法で培
養した形質転換体の活性は大腸菌Ｋ−１２ ＤＨ５α株
への形質転換体の２倍の活性を有していた。

【０１０３】実施例１４（反応阻害物質の除去：極性溶
媒による沈殿） 参考例２と同じ方法で培養したＭＴ−１０９４８菌体を
超音波破砕機で破砕した。破砕液と同容量のアセトンを
加えて沈殿を遠心分離により沈殿を除いた。次に上記遠
心上清液に上記の半分のアセトンを加え沈殿を遠心分離
により回収した。回収沈殿は真空乾燥機により乾固し
た。乾燥沈殿を２ｍＬの１００ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）、１０ｍＭの２´−デオキシリボース１
−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（Ｓ
ＩＧＭＡ製）に溶解し、実施例４と同じ方法で処理し
た。アセトンで分画した酵素液２ｍＬをシトシン（６．
９６ｇ）、２´−デオキシリボース１−リン酸２アンモ
ニウム塩（１８．７ｇ）、水酸化マグネシウム（６．２
ｇ）を水（１０５．３ｇ）に加え、５０℃で２４ｈｒ反
応した。反応終了後、ＨＰＬＣで分析した所、２'−デ
オキシシチジンを１１．４ｇ（８０％）得た。比較例と
してアセトン処理前の菌体液２ｍＬ上記と同様に反応し
たところ２'−デオキシシチジンを８．５ｇ（６０％）
得た。

【０１０４】実施例１５（反応阻害物質の除去：硫酸ア
ンモニウムによる沈殿） 参考例２と同じ方法で培養したＭＴ−１０９４８菌体を
超音波破砕機で破砕した。破砕液に粉砕した硫酸アンモ
ニウムをゆっくりと加えていき、硫安飽和４０％まで添
加した。氷水中で１時間ゆっくり攪拌し、遠心分離によ
り沈殿を除いた。遠心上精液に粉砕した硫酸アンモニウ
ムを硫安飽和７０％まで添加し、同様に氷水中で１時間
ゆっくり攪拌し、遠心分離により沈殿を得た。沈殿を２
ｍＬの１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１
０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシ
クロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）に溶解
した。実施例４と同じ方法で処理し、実施例１４と同じ
方法で反応したところ、２'−デオキシシチジンを１
１．０ｇ（８０％）得た。

【０１０５】実施例１６（反応阻害物質の除去：精製酵
素は実施例８の酵素） 実施例８と同様の方法で得た酵素液２ｍＬを用いて実施
例１４と同様の反応を行ったところ、２'−デオキシシ
チジンを１１．０ｇ（８０％）得た。

【０１０６】実施例１７（ｐｈｏＡ欠損株の効果） 実施例４で得た菌体２ｍｌを用い、実施例１４と同じ反
応を行ったところ２'−デオキシシチジンを１１．０ｇ
（８０％）得た。一方、ＭＴ−１０９４８株を実施例４
と同じ方法で処理したところ活性はＭＴ−１０９０５の
２倍検出されたが、実施例１４と同じ反応を行ったとこ
ろ２'−デオキシシチジンは８．５ｇ（６０％）しか得
られなかった。

【０１０７】実施例１８ シトシン６．９６ｇ（６２．６ｍｍｏｌ）、２´−デオ
キシリボース１−リン酸２アンモニウム塩１８．７ｇ
（７５．４ｍｍｏｌ）、水酸化マグネシウム７．５８ｇ
（１３２ｍｍｏｌ）、参考例３で調整した凍結菌体
（２．０ｇ）を水（９６．４ｇ）、シクロヘキサン４．
８ｇの混合液に加え、酢酸にて反応液のｐＨを８．８に
コントロールしながら４５℃で１８ｈｒ反応した。反応
終了後、ＨＰＬＣで分析した所、目的物である、２'−
デオキシシチジンを１０．０３ｇ（７０．５モル％／シ
トシン）得た。この時、副生物であるウラシルは０・７
３ｇ（１０．４モル％／シトシン）、２'−デオキシウ
リジンは１．８０ｇ（１２．６モル％／シトシン）であ
った。

【０１０８】実施例１９ 実施例１８と同様の条件で、菌体処理に用いる溶媒、反
応時に添加する溶媒を変えて２'−デオキシシチジンの
合成を行なった時の結果を表９及び表１０に示す。

【０１０９】

【表９】

【０１１０】

【表１０】

【０１１１】実施例２０ ２´−デオキシシチジンの合成 純水２０ｇに強塩基性アニオン交換樹脂（ＭＰ５００
レバチッド：交換容量１．１ｅｑ／Ｌ）２０ｍｌ（総交
換容量 ２４ｍｍｏｌ）と２−デオキシリボース１−リ
ン酸ジ（アンモニウム）塩（４．９６ｇ、２０ｍｍｏ
ｌ）を加え、室温下、３０分間攪拌した。３０分後、実
施例４と同じ方法で調整した酵素液（０．５ｍｌ）とシ
トシン（２．１１ｇ、１９ｍｍｏｌ）加え、攪拌下、５
０℃で１０時間反応した。１０時間後に反応マスをＨＰ
ＬＣにて分析した結果、所望の２´−デオキシシチジン
を反応収率８０％で得た。

【０１１２】

【発明の効果】ヌクレオシドホスホリラーゼを用いるヌ
クレオシド化合物の製造は、穏和な条件で位置、立体特
異的にヌクレオシド化合物を製造することが可能であ
り、工業的な製造法の確立が望まれているがこれまでヌ
クレオシドホスホリラーゼによる工業的なシトシンヌク
レオシド化合物の合成方法は知られていなかった。

【０１１３】本発明によればシトシンに反応性を有する
ヌクレオシドホスホリラーゼを用い、ペントース−１−
リン酸とシトシンまたはシトシン誘導体からのシトシン
ヌクレオシド化合物の製造が可能となる。その際、基質
あるいは生成物の分解活性を特異的に減少させる方法を
提供することで、効率よくシトシンヌクレオシド化合物
を製造できる。

【０１１４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> MITSUI CHEMICALS, INC. <120> A method of producing a cytosine nucleside compound <130> P0001150 <160> 46 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer for cloning of purine nucle oside phophrylase of E.coli K-12 <400> 1 gtgaattcac aaaaaggata aaacaatggc 30 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer for cloning of purine nucle oside phophrylase of E.coli K-12 <400> 2 tcgaagcttg cgaaacacaa ttactcttt 29 <210> 3 <211> 720 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 atggctaccc cacacattaa tgcagaaatg ggcgatttcg ctgacgtagt tttgatgcca 60 ggcgacccgc tgcgtgcgaa gtatattgct gaaactttcc ttgaagatgc ccgtgaagtg 120 aacaacgttc gcggtatgct gggcttcacc ggtacttaca aaggccgcaa aatttccgta 180 atgggtcacg gtatgggtat cccgtcctgc tccatctaca ccaaagaact gatcaccgat 240 ttcggcgtga agaaaattat ccgcgtgggt tcctgtggcg cagttctgcc gcacgtaaaa 300 ctgcgcgacg tcgttatcgg tatgggtgcc tgcaccgatt ccaaagttaa ccgcatccgt 360 tttaaagacc atgactttgc cgctatcgct gacttcgaca tggtgcgtaa cgcagtagat 420 gcagctaaag cactgggtat tgatgctcgc gtgggtaacc tgttctccgc tgacctgttc 480 tactctccgg acggcgaaat gttcgacgtg atggaaaaat acggcattct cggcgtggaa 540 atggaagcgg ctggtatcta cggcgtcgct gcagaatttg gcgcgaaagc cctgaccatc 600 tgcaccgtat ctgaccacat ccgcactcac gagcagacca ctgccgctga gcgtcagact 660 accttcaacg acatgatcaa aatcgcactg gaatccgttc tgctgggcga taaagagtaa 720 <210> 4 <211> 239 <212> PRT <213> Escherichia coli <300> <400> 4 Met Ala Thr Pro His Ile Asn Ala Glu Met Gly Asp Phe Ala Asp Val 1 5 10 15 Val Leu Met Pro Gly Asp Pro Leu Arg Ala Lys Tyr Ile Ala Glu Thr 20 25 30 Phe Leu Glu Asp Ala Arg Glu Val Asn Asn Val Arg Gly Met Leu Gly 35 40 45 Phe Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Arg Lys Ile Ser Val Met Gly His Gly 50 55 60 Met Gly Ile Pro Ser Cys Ser Ile Tyr Thr Lys Glu Leu Ile Thr Asp 65 70 75 80 Phe Gly Val Lys Lys Ile Ile Arg Val Gly Ser Cys Gly Ala Val Leu 85 90 95 Pro His Val Lys Leu Arg Asp Val Val Ile Gly Met Gly Ala Cys Thr 100 105 110 Asp Ser Lys Val Asn Arg Ile Arg Phe Lys Asp His Asp Phe Ala Ala 115 120 125 Ile Ala Asp Phe Asp Met Val Arg Asn Ala Val Asp Ala Ala Lys Ala 130 135 140 Leu Gly Ile Asp Ala Arg Val Gly Asn Leu Phe Ser Ala Asp Leu Phe 145 150 155 160 Tyr Ser Pro Asp Gly Glu Met Phe Asp Val Met Glu Lys Tyr Gly Ile 165 170 175 Leu Gly Val Glu Met Glu Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Val Ala Ala Glu 180 185 190 Phe Gly Ala Lys Ala Leu Thr Ile Cys Thr Val Ser Asp His Ile Arg 195 200 205 Thr His Glu Gln Thr Thr Ala Ala Glu Arg Gln Thr Thr Phe Asn Asp 210 215 220 Met Ile Lys Ile Ala Leu Glu Ser Val Leu Leu Gly Asp Lys Glu 225 230 235 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 5 cattattttc aaaaaggggg atttattatg gctaccccac ac 42 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 6 cagaagcttg cgaaacacaa ttac 24 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 7 tttgaattcc ttagtgcttt catagattaa act 33 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 8 ttctgcatta atgtgtgggg tagccataat aaatccccct tt 42 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 9 ccacacatta atgcagaagc aggcgatttc gct 33 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 10 agcgaaatcg cctgcttctg cattaatgtg tgg 33 <210> 11 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 11 cttgaagatg cccgtgaagt gaacctggtt cgcggtatgc t 41 <210> 12 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 12 agcataccgc gaaccaggtt cacttcacgg gcatcttcaa g 41 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 13 ctgggcttca ccggtactta ctccggccgc aaaatttccg ta 42 <210> 14 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 14 tacggaaatt ttgcggccgg agtaagtacc ggtgaagccc ag 42 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 15 atgggtcacg gtatgggtct gccgtcctgc tccatctaca 40 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 16 tgtagatgga gcaggacggc agacccatac cgtgacccat 40 <210> 17 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 17 cgcgtgggta acctgttctc ctccgacctg ttctactctc cg 42 <210> 18 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 18 cggagagtag aacaggtcgg aggagaacag gttacccacg cg 42 <210> 19 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 19 atggaaaaat acggcattct cgcagtggaa atggaagcgg ct 42 <210> 20 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 20 agccgcttcc atttccactg cgagaatgcc gtatttttcc at 42 <210> 21 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 21 aaatacggca ttctcggcac cgaaatggaa gcggctggta t 41 <210> 22 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> <400> 22 ataccagccg cttccatttc ggtgccgaga atgccgtatt t 41 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 23 gtatctgacc acatccgcac tctggagcag accactgccg ct 42 <210> 24 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 24 agcggcagtg gtctgctcca gagtgcggat gtggtcagat ac 42 <210> 25 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 25 accttcaacg acatgatcaa atccgcactg gaatccgttc tg 42 <210> 26 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 26 cagaacggat tccagtgcgg atttgatcat gtcgttgaag gt 42 <210> 27 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 27 atcaaaatcg cactggaatc cctgctgctg ggcgataaag a 41 <210> 28 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 28 tctttatcgc ccagcagcag ggattccagt gcgattttga t 41 <210> 29 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 29 attctcggcg tggaaatgga atccgctggt atctacggcg tc 42 <210> 30 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 30 gacgccgtag ataccagcgg attccatttc cacgccgaga at 42 <210> 31 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 31 gaatttggcg cgaaagccct ggcaatctgc accgtatctg ac 42 <210> 32 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 32 gtcagatacg gtgcagattg ccagggcttt cgcgccaaat tc 42 <210> 33 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 33 tactctccgg acggcgaaac gttcgacgtg atggaaaaa 39 <210> 34 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 34 tttttccatc acgtcgaacg tttcgccgtc cggagagta 39 <210> 35 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 35 tctccggacg gcgaaatgtc cgacgtgatg gaaaaatac 39 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 36 gtatttttcc atcacgtcgg acatttcgcc gtccggaga 39 <210> 37 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 37 ggcgatttcg ctgacgcagt tttgatgcca ggcgac 36 <210> 38 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 38 gtcgcctggc atcaaaactg cgtcagcgaa atcgcc 36 <210> 39 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 39 accatctgca ccgtatttga ccacatccgc actcac 36 <210> 40 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 40 gtgagtgcgg atgtggtcaa atacggtgca gatggt 36 <210> 41 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 41 ccgtcctgct ccatctacgc caaagaactg atcacc 36 <210> 42 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 42 ggtgatcagt tctttggcgt agatggagca ggacgg 36 <210> 43 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 43 atcgctgact tcgacatgat gcgtaacgca gtagat 36 <210> 44 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 44 atctactgcg ttacgcatca tgtcgaagtc agcgat 36 <210> 45 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 45 gtaaaactgc gcgacatcgt tatcggtatg ggtgcc 36 <210> 46 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequece <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 46 ggcacccata ccgataacga tgtcgcgcag ttttac 36

【図面の簡単な説明】

【図１】（Ａ）は比較例１におけるＨＰＬＣの分析チャ
ートであり、（Ｂ）は比較例１の反応液のＨＰＬＣの分
析チャートであり、（Ｃ）は実施例６のＨＰＬＣの分析
チャートである。

【図２】（Ａ）は比較例２における比較例におけるＨＰ
ＬＣの分析チャートであり、（Ｂ）は比較例２の反応液
のＨＰＬＣの分析チャートであり、（Ｃ）は実施例５の
ＨＰＬＣの分析チャートである。

【図３】実施例８にけるＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動の結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 19/40 5/00 Ａ (72)発明者 的石 かおり 千葉県茂原市東郷1144 三井化学株式会社 内 (72)発明者 阿部 玲子 千葉県茂原市東郷1144 三井化学株式会社 内 (72)発明者 及川 利洋 千葉県茂原市東郷1144 三井化学株式会社 内 (72)発明者 松葉 泰子 福岡県大牟田市浅牟田町30 三井化学株式 会社内 (72)発明者 長原 清輝 福岡県大牟田市浅牟田町30 三井化学株式 会社内 (72)発明者 福入 靖 福岡県大牟田市浅牟田町30 三井化学株式 会社内 (72)発明者 石橋 大樹 福岡県大牟田市浅牟田町30 三井化学株式 会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA10 BA80 CA04 DA01 DA02 DA05 DA06 DA11 EA04 GA11 HA08 HA09 4B050 CC03 DD02 LL05 4B064 AF33 CA02 CA05 CA10 CA11 CA19 CB27 CC24 CD01 CD12 DA01 4B065 AA01X AA26X AA26Y AA57X AA87X AB01 BD26 BD28 BD34 CA23 CA44

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 シトシンヌクレオシド化合物の製造方法
   において、リン酸化糖と、シトシンまたはシトシン誘導
   体とを、シトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有
   する酵素の存在下で反応させて、シトシンヌクレオシド
   化合物を得る工程を有することを特徴とするシトシンヌ
   クレオシド化合物の製造方法。
2. 【請求項２】 前記酵素がプリンヌクレオシドホスホリ
   ラーゼ活性を有する請求項１に記載の製造方法。
3. 【請求項３】 前記酵素が大腸菌由来である請求項１ま
   たは２記載の製造方法。
4. 【請求項４】 前記シトシン誘導体が下記式（Ｉ）： 【化１】 （上記式（Ｉ）中、Ｘは炭素原子または窒素原子を、Ｙ
   は水素原子、ハロゲン原子または低級アルキル基を示
   す。）で表される化合物である請求項１〜３のいずれか
   に記載の製造方法。
5. 【請求項５】 リン酸化糖が、リボース−１−リン酸、
   ２−デオキシリボース−１−リン酸または２’，３’−
   ジデオキシリボース１−リン酸、ジオキソラン糖リン酸
   である請求項１〜３記載の製造方法。
6. 【請求項６】 前記酵素が、シトシンヌクレオシドホス
   ホリラーゼ活性を有する微生物の菌体、あるいは該菌体
   もしくはその培養液から得られた酵素調製物として供給
   される請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
7. 【請求項７】 前記微生物がシトシンヌクレオシドホス
   ホリラーゼ活性を有し、シトシンデアミナーゼ活性およ
   び／又はシチジンデアミナーゼ活性およびまたはホスフ
   ァターゼ活性がないことを特徴とする請求項６に記載の
   製造方法。
8. 【請求項８】 前記菌体または前記酵素調製物のシトシ
   ンデアミナーゼ活性および／又はシチジンデアミナーゼ
   活性が低減化処理によって失活または低下している請求
   項７に記載の製造方法。
9. 【請求項９】 前記低減化処理された微生物の菌体が、
   シトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する微生
   物の菌体を有機溶媒を含む水に接触させて、シトシンデ
   アミナーゼ活性およびシチジンデアミナーゼ活性を選択
   的に失活または減少させて得られたものである請求項８
   に記載の製造方法。
10. 【請求項１０】 前記の菌体またはその酵素調製物が、
    以下のａ）からｃ）のいずれかの手段によりシトシンヌ
    クレオシドホスホリラーゼ活性を阻害する物質が除去さ
    れている請求項７に記載の製造方法。 ａ）前記酵素調製物から極性溶媒でシトシンヌクレオシ
    ドホスホリラーゼを沈殿として得る、 ｂ）前記酵素調製物から塩析によりシトシンヌクレオシ
    ドホスホリラーゼを沈殿として得る、 ｃ）前記酵素調製物から樹脂等の適当な担体によりシト
    シンヌクレオシドホスホリラーゼを分離する。
11. 【請求項１１】 配列番号：４記載のアミノ酸配列の１
    ０番目、４２番目、５４番目、６７番目、１５７番目、
    １７８番目、１７９番目、１８３番目、１９９番目、２
    １０番目、２２８番目、２３３番目の何れか一つ以上の
    アミノ酸を他のアミノ酸に置換して得られるシトシンヌ
    クレオシドホスホリラーゼ。
12. 【請求項１２】 配列番号：４記載のアミノ酸配列の１
    ６０番目がフェニルアラニン、２０５番目がアスパラギ
    ン酸であるシトシンヌクレオシドホスホリラーゼ。
13. 【請求項１３】 請求項１１又は１２に記載のシトシン
    ヌクレオシドホスホリラーゼをコードする遺伝子を含ん
    でいる組み換えプラスミド。
14. 【請求項１４】 請求項１３に記載の組み換えプラスミ
    ドを保持する形質転換株。
15. 【請求項１５】 請求項１４記載の形質転換株を培養
    し、培養によって得られた形質転換株、培養液、および
    それらの処理物からシトシンヌクレオシドホスホリラー
    ゼを回収することを特徴とするシトシンヌクレオシドホ
    スホリラーゼの生産方法。
16. 【請求項１６】 請求項７〜９の何れか一項に記載の酵
    素調製物であって、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ
    活性を有する酵素を含有することを特徴とする酵素調製
    物。