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JP2003018984A - 多分化能を有する細胞の製造法 - Google Patents

多分化能を有する細胞の製造法

Info

Publication number
JP2003018984A
JP2003018984A JP2001207010A JP2001207010A JP2003018984A JP 2003018984 A JP2003018984 A JP 2003018984A JP 2001207010 A JP2001207010 A JP 2001207010A JP 2001207010 A JP2001207010 A JP 2001207010A JP 2003018984 A JP2003018984 A JP 2003018984A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
cell
mesodermal
tissue
derived
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001207010A
Other languages
English (en)
Inventor
Arihiro Hashimoto
有弘 橋本
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mitsubishi Chemical Corp
Original Assignee
Mitsubishi Chemical Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitsubishi Chemical Corp filed Critical Mitsubishi Chemical Corp
Priority to JP2001207010A priority Critical patent/JP2003018984A/ja
Publication of JP2003018984A publication Critical patent/JP2003018984A/ja
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  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 哺乳類成体より取り出した筋組織に由来し、
筋細胞、骨細胞、脂肪細胞等に分化することが可能な中
胚葉性細胞への多分化能を有する細胞を提供する。 【解決手段】 哺乳類成体より取り出した筋組織由来の
中胚葉性幹細胞を含む細胞群を、繊維芽細胞増殖因子及
び／またはIL-6ファミリーに属するサイトカインの存在
下で培養することにより、中胚葉性細胞への多分化能を
有する細胞を得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、哺乳類筋組織由来
の中胚葉性幹細胞を含む細胞群から、中胚葉性細胞への
多分化能を有する細胞を取得する方法、ならびに、当該
多分化能を有する細胞を骨形成能を有する細胞等の所望
の中胚葉性細胞へ分化誘導する方法、およびそれにより
得られる代替骨等の組織に関する。さらに当該分化誘導
法を用いることによる、骨形成に影響を与える因子のス
クリーニング方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】様々な細胞から、増殖能を有しかつ分化
した細胞を作る能力を併せ持った細胞（これを「幹細
胞」とよぶことがある）が見い出されている。幹細胞と
は、幼若、未分化な状態で組織等に存在し、組織の修復
が必要な場合等に増殖・分化・成熟して定常状態を保つ
ために存在する細胞であり、例えば神経幹細胞は神経細
胞やグリア細胞に分化する(R.McKay, Science, 276,66
(1997)）。しかし、これら神経幹細胞は異所的に骨格筋
や血液細胞にも分化する、いわゆる多分化能をもつとの
報告がある(C.R.R.Bjornson, et al., Science 283,534
(1999), R.Galli,etal., Nature Neurosci. 3, 986(200
0))。一方、骨髄の間葉系の幹細胞においても、骨形成
性の細胞、骨格筋細胞、神経細胞などに分化する多分化
能を有するとの報告がある(D.J.Prockop,Science 276,7
1(1997)）。幹細胞とは必ずしも多分化能を有するもの
ではないが、成体由来細胞から幹細胞を分離し、多分化
能を有する細胞を得て、これを所望の細胞に分化させる
方法が開発されれば、移植や再生医療の分野で新しい方
法が提供できるものと期待されている。
【０００３】骨格筋由来の中胚葉性幹細胞はこれまでの
組織病理学的研究から、筋の再生期間において分裂刺激
を受け細胞同士で融合しあい、筋管もしくは筋繊維に分
化することが明らかにされている(Y.Saito,i.Nonaka, A
cta Neuropathol. 88, 252 (1994)）。しかしながら、
このような正常組織に存在する筋の幹細胞を、均一な集
団として取り出し、これが、筋細胞以外の細胞に分化で
きる多分化能を有することを示した例はない。筋組織由
来の中胚葉性幹細胞由来と考えられている不死化したマ
ウスの筋細胞株であるC2C12細胞は、培養条件を選ぶこ
とにより、筋管のみならず骨芽細胞や脂肪細胞にも分化
する能力を持っているとの報告がある(T.Katagiri, et
al., J. Cell Biol. 127, 1775(1994), L. Teboul et a
l., J. biol. Chem. 270, 28183 (1995))。しかし、不
死化したマウスの細胞株は一種の腫瘍細胞であり、成体
のなかにある正常な筋組織由来の細胞とは遺伝子発現の
制御等において異なっている可能性が高く、従って各種
の外界からの刺激に対する応答なども正常の細胞を必ず
しも反映せず、このような細胞株を用いて得られる知見
がそのまま正常細胞に適用できるものではないと考えら
れる。また、この不死化した細胞株を用いた実験では、
例えば骨芽細胞の性質を示すようにはなるが、骨基質形
成（細胞外カルシウム蓄積）にまで至ったという報告は
ない。さらに不死化したマウスの筋細胞株を骨芽細胞に
分化することができても、この分化した細胞をそのまま
骨再生のための移植治療に用いることは、異種動物によ
る臓器拒絶反応の問題や腫瘍細胞の投与の是非といった
問題があり、実施するわけにはいかない。
【０００４】特に、近年高齢化に伴う骨粗鬆症や、骨
折、骨損傷後の回復困難、閉経後の骨密度の低下などが
社会的問題となっていることから、細胞の供給源として
摘出手術の安全性が高く、採取が容易な筋組織由来の細
胞を培養し、これを骨細胞へと分化誘導させる方法が確
立されれば、骨の移植や骨の再生医療の分野で大きな福
音となることが期待される。
【０００５】しかしながら、哺乳類成体から取り出した
筋組織由来細胞を培養し、これを骨形成能を有する細胞
へ分化誘導させ、骨基質形成までさせたという報告はこ
れまでなく、このような方法の開発、応用に大きな期待
がかけられている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、筋組織由来
の細胞群を培養し、中胚葉性細胞への多分化能を有する
細胞を取得する方法を提供することを課題とする。さら
に、上記多分化能を有する細胞から、骨粗鬆症など骨疾
患の移植治療用細胞として利用可能な、骨形成能を有す
る細胞等の所望の中胚葉性細胞を提供することを課題と
する。また、新たな骨形成促進因子など骨形成能に影響
を与える物質のスクリーニング方法および、当該スクリ
ーニングにより得られた物質を用いた骨形成能を有する
細胞の製造法の提供を課題とする。さらには、上記骨形
成能を有する細胞を用いる代替骨組織の製造法、およ
び、該方法により得られる代替骨組織、ならびに上記多
分化能を有する細胞、または幹細胞と、TGF−βスーパ
ーファミリーに属するタンパク質の組合せを含む骨形成
促進剤をも提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は上記課題を解
決すべくマウス筋組織由来細胞の培養法に関し鋭意検討
を行った結果、筋組織由来の中胚葉性幹細胞が特異的に
増殖する培養条件下で、さらに繊維芽細胞増殖因子であ
る塩基性繊維芽細胞増殖因子、および／またはIL-6ファ
ミリーに属するサイトカインである白血球阻害因子の存
在下にて培養することにより、筋細胞、骨細胞、脂肪細
胞といった中胚葉性細胞への多分化能を有する細胞の取
得に成功し、さらに当該細胞をBMP-2（BMP:骨形成因子
(bone morphogenetic protein)）及び／またはβグリセ
ロリン酸の存在下で培養することにより、骨細胞のマー
カーであるアルカリフォスファターゼ陽性及び／または
オステオカルシン陽性を示す細胞の取得に成功した。さ
らに培養を継続することにより、コブ状の細胞塊が認め
られ、その細胞外基質にはカルシウムが蓄積し、当該細
胞が骨形成能を有することが認められた。
【０００８】さらに本発明者等は、上記の方法をヒトに
も応用し、ヒト筋組織由来の細胞から、同様の方法にて
骨細胞のマーカー陽性細胞を取得し、培養を継続したと
ころ、コブ状の細胞塊が認められ、その細胞外基質には
カルシウムが蓄積し、当該細胞が骨形成能を有すること
が認められた。本発明は、上記のようにして完成するに
至ったものであり、その要旨は以下のとおりである。
【０００９】（１）哺乳類筋組織由来の中胚葉性幹細胞
を含む細胞群を、繊維芽細胞増殖因子及び／またはIL-6
ファミリーに属するサイトカインの存在下で培養するこ
とを特徴とする、中胚葉性細胞への多分化能を有する細
胞の製造法。 （２）筋組織由来の中胚葉性幹細胞を含む細胞群を、繊
維芽細胞増殖因子及びIL-6ファミリーに属するサイトカ
インの存在下で培養する、（１）に記載の方法。 （３）筋組織由来の中胚葉性幹細胞を含む細胞群を、中
胚葉性幹細胞が選択的に増殖する培養条件下で繊維芽細
胞増殖因子及びIL-6ファミリーに属するサイトカインの
非存在下で培養し、出現したコロニーのうち未分化な細
胞により構成されるコロニーを回収し、回収されたコロ
ニーに含まれる細胞を繊維芽細胞増殖因子及び／または
IL-6ファミリーに属するサイトカインの存在下で培養維
持することを特徴とする、（１）又は（２）に記載の方
法。 （４）筋組織由来の中胚葉性幹細胞を含む細胞群を、中
胚葉性幹細胞が選択的に増殖する培養条件下で繊維芽細
胞増殖因子及び／またはIL-6ファミリーに属するサイト
カインの存在下で培養し、出現したコロニーのうち未分
化な細胞により構成されるコロニーを回収し、回収され
たコロニーに含まれる細胞を繊維芽細胞増殖因子及び／
またはIL-6ファミリーに属するサイトカインの存在下で
培養維持することを特徴とする、（１）又は（２）に記
載の方法。 （５）繊維芽細胞増殖因子が、塩基性繊維芽細胞増殖因
子である（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。 （６）IL-6ファミリーに属するサイトカインが、白血球
阻害因子(LIF)であることを特徴とする、（１）〜
（５）のいずれかに記載の方法。 （７）中胚葉性細胞への多分化能を有する細胞が、中胚
葉性細胞に特異的な転写因子陽性であることを特徴とす
る（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。 （８）中胚葉性細胞に特異的な転写因子が、MyoD、Runx
2あるいはPPARγである（７）に記載の方法。 （９）中胚葉性細胞が、筋細胞、骨細胞、脂肪細胞のい
ずれかであることを特徴とする（１）〜（８）のいずれ
かに記載の方法。 （１０）（１）〜（９）のいずれかに記載の方法により
製造された中胚葉性細胞への多分化能を有する細胞。 （１１）（１０）に記載の細胞、または幹細胞を所望の
中胚葉性細胞に分化させる条件で培養することを特徴と
する、所望の中胚葉性細胞または該細胞群由来の組織を
製造する方法。 （１２）所望の中胚葉性細胞が骨形成能を有する細胞で
ある、（１１）に記載の方法。 （１３）骨形成能を有する細胞に分化させる条件が、
（１０）に記載の細胞、または幹細胞を、１×１０3〜
１×１０6/cm2の密度でTGF−βスーパーファミリーに属
するタンパク質の存在下で培養するものである（１２）
に記載の方法。 （１４）骨形成能を有する細胞に分化させる条件が、
（１０）に記載の細胞、または幹細胞を１×１０3〜１
×１０6/cm2の密度でBMP-2及び／またはβグリセロリン
酸の存在下で培養するものである（１２）に記載の方
法。 （１５）アルカリフォスファターゼ陽性、及び／又はオ
ステオカルシン陽性であることを指標として、骨形成能
を有する細胞を取得する、（１１）〜（１４）のいずれ
かに記載の方法。 （１６）骨基質形成能を指標として、骨形成能を有する
細胞を取得する（１１）〜（１４）のいずれかに記載の
方法。 （１７）（１１）〜（１６）のいずれかに記載の方法に
より得られた細胞または該細胞群由来の組織。 （１８）（１０）に記載の細胞に、被検物質を投与し、
誘導された細胞の骨形成能を評価することを特徴とす
る、骨形成能に影響を与える物質のスクリーニング方
法。 （１９）（１８）に記載のスクリーニング方法により選
抜された物質。 （２０）（１０）に記載の細胞、または幹細胞を、（１
９）に記載の物質の存在下で培養することを特徴とする
骨形成能を有する細胞を製造する方法。 （２１）（１７）に記載の細胞を支持体に付着させて培
養することにより骨組織を形成させる、代替骨組織の製
造法。 （２２）（２１）に記載の方法により取得される代替骨
組織。 （２３）（１０）に記載の細胞、または幹細胞のうちの
いずれかの細胞と、TGF−βスーパーファミリーに属す
るタンパク質の組合せを含む骨形成促進剤。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法は、筋組織由来の中胚葉性幹細胞を含む細
胞群から、中胚葉性細胞への多分化能を有する細胞を製
造する方法である。ここで、幹細胞とは、幼若・未分化
な状態で組織に存在し、組織の修復が必要な場合等に、
増殖、分化、成熟して定常状態を保つために存在する細
胞を意味する。例えば、筋組織に存在する中胚葉性幹細
胞はケガにより筋肉が損傷した場合等に筋細胞に分化
し、修復を行う。本発明の方法は、このような筋組織由
来の中胚葉性幹細胞を含む細胞群から、筋細胞以外の中
胚葉性細胞にも分化する能力を有する細胞、すなわち、
中胚葉性細胞への多分化能を有する細胞を製造すること
を特徴とする。
【００１１】本発明の方法に用いる筋組織由来の中胚葉
性細胞を含む細胞群としては、哺乳類成体より取り出し
た筋組織由来細胞が材料として好適に用いられる。哺乳
類としては、マウス、ラット、イヌ、ブタ、サル等の実
験動物、又はヒトが挙げられる。また、成体としては、
筋組織が採集できる程度に成長した個体である。一般に
移植医療を行う場合、他人の組織ではなく、自分自身の
組織を用いることが拒絶反応を回避するために望まし
い。自分自身の組織の損傷や機能不全を自らの組織で修
復するために、成体由来の筋組織を用いて本発明の中胚
葉性細胞への多分化能を有する細胞を製造することが好
ましい。
【００１２】本発明に用いる筋組織由来の中胚葉性幹細
胞を含む細胞群の採取源としては、該細胞が存在してい
る筋組織であればよく、骨格筋、平滑筋、心筋等を用い
ることができるが、中でも腓腹筋組織、皮下筋組織等の
骨格筋組織が好ましく用いられる。
【００１３】上記のような筋組織由来細胞群は、中胚葉
性幹細胞の他に、繊維芽細胞、筋繊維、神経細胞、血球
・造血系幹細胞等を含む。このような細胞群の中から、
中胚葉性幹細胞を取得するためには、該中胚葉性幹細胞
が選択的に増殖する培養法により培養することが好まし
い。具体的には、培養開始時に培養液中の細胞密度が２
００個／ｃｍ2以下、好ましくは１５〜１００個／ｃｍ2
となるように細胞を培養する方法や、通常用いられる細
胞培養液にサプリメントを添加する方法等が挙げられ
る。添加するサプリメントとしては、Ultraser G（Bios
epra社製）、ウシの下垂体抽出物等が挙げられるが、Ul
traser Gを用いることが好ましい。また、この培養にお
いては、細胞の増殖を促進し、分化を抑制する物質の存
在下で行うことにより、効果的に中胚葉性幹細胞の選択
的培養を行うことができる。細胞の増殖を促進し、分化
を抑制する物質としては、繊維芽増殖因子、またはIL-6
ファミリーに属するサイトカインが挙げられ、ｂＦＧＦ
や白血球阻害因子（LIF）等が好ましく用いられる。こ
のような培養により出現したコロニーのうち、未分化な
細胞で構成されるコロニーを回収し、得られたコロニー
に含まれる細胞を繊維芽細胞増殖因子及び／またはIL-6
ファミリーに属するサイトカインの存在下で培養するこ
とにより、中胚葉性細胞への多分化能を有する細胞を得
ることができる。また、このようにして得られた細胞
は、繊維芽細胞増殖因子及び／またはIL-6ファミリーに
属するサイトカインの存在下で培養維持することができ
る。以下に、上記した方法の具体例を示す。
【００１４】成熟マウス、好ましくは8〜12週齢のマウ
スの腓腹筋、または成人ヒト背部皮下筋組織片を取り出
し、シャーレに入れ、余分な脂肪組織などを除去し細か
く裁断する。
【００１５】裁断された筋組織にコラゲナーゼV（シグ
マ社製）とトリプシン（ライフテック社製）を含む細胞
分散液で分散し、遠心し上澄を回収する。このような操
作を数回、好ましくは5回くり返し細胞を分離する。
【００１６】集めた細胞をpmGM 培地[Primary Myocyte
Growth Medium； 20% 牛胎児血清,2% Ultraser G（Bios
epra社製）を含む hDMEM（4.5mg/mlのグルコースを含む
ダルベッコ変法イーグル培地）]に均一に懸濁し、I型コ
ラーゲンをコートしたディッシュ（スミロン社製）に、
線維芽細胞増殖因子及び／またはIL-6ファミリーに属す
るサイトカインの存在下で培養する。このとき、細胞密
度は２００個／ｃｍ 2以下、好ましくは１５〜１００個
／ｃｍ2以下に調整する。培養３〜４日後に、小さなコ
ロニーが形成され、以後加速度的に増殖が進む。培養７
〜１０日後に、出現したコロニーのうち、未分化な細胞
により構成されるコロニーを回収する。
【００１７】本発明の好ましい形態では、このように出
現したコロニーのうちで未分化な細胞により構成される
コロニーを回収することを特徴としている。すなわち筋
組織由来の細胞群には上記したような様々な細胞が混在
しているが、このような未分化な細胞により構成される
コロニーを回収することにより本発明の中胚葉性細胞へ
の多分化能を有する細胞以外の細胞を除去することがで
きる。未分化な細胞から構成されるコロニーは、球形の
細胞で構成される散在型のコロニーを選択することによ
り、取得することができる。
【００１８】ここで、コロニーを回収する方法として
は、リング法（組織培養の技術（朝倉書店）、P34-35）
等が用いられる。具体的には例えば、倒立顕微鏡下で分
離したいコロニーを選びマークし、培地を捨て、底面に
あらかじめ高圧滅菌したシリコングリースを塗ったステ
ンレススチールのシリンダー(10mmx10mm)をかぶせる。
そこにトリプシンEDTA液を注射器またはパスツールピペ
ットで少量入れて細胞をはがし回収することができる。
【００１９】次に、上記方法で得られたコロニーに含ま
れる細胞を、あらかじめＩ型コラーゲンにてコートして
ある直径35-mmシャーレ（スミロン社製）等に播き、繊
維芽細胞増殖因子および／またはIL-6ファミリーに属す
るサイトカインの存在下で培養維持することにより、中
胚葉性細胞への多分化能を有する細胞を取得することが
できる。線維芽細胞増殖因子及びIL-6ファミリーに属す
るサイトカインは、細胞の増殖性、未分化状態維持を促
進する因子として機能する。繊維芽細胞増殖因子として
は、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）が好ましい。ま
たIL-6ファミリーに属するサイトカインとしては、白血
球阻害因子（LIF）が好ましい。繊維芽細胞増殖因子及
びIL-6ファミリーに属するサイトカインは、単独でも用
いることができるが、これらを併用すると、加算効果が
認められる。
【００２０】bFGFは、通常5ng/ml〜50ng/ml、好ましく
は10ng/ml〜20ng/ml程度の濃度で用いられる。白血球阻
害因子(LIF)は、通常102u/ml〜104u/ml、好ましくは103
u/ml程度の濃度で用いられる。また、培養に用いる培地
としては、pmGM [Primary Myocyte Growth Medium]等が
挙げられる。
【００２１】上記のようにして、筋組織由来の中胚葉性
幹細胞の増殖性を保ったまま、自発的な分化を抑制し、
未分化状態を維持した細胞、すなわち中胚葉性細胞への
多分化能を有する細胞を得ることができる。上記のよう
にして得られる本発明の中胚葉性細胞への多分化能を有
する細胞は、中胚葉性細胞に特異的な転写因子陽性であ
ることを指標にして確認することができる。このような
因子としては、MyoD（筋細胞分化を制御する転写因
子）、Runx2（骨形成に関わる転写因子）、PPARγ（脂
肪細胞分化に関わる転写因子）が挙げられる。該細胞が
分化し得る中胚葉性細胞としては、少なくとも筋細胞、
骨細胞、脂肪細胞が挙げられる。この様にして得られた
中胚葉性細胞への多分化能を有する細胞は、繊維芽細胞
増殖因子および／またはIL-6ファミリーに属するサイト
カインの存在下で培養維持することができるが、例え
ば、マウス由来の細胞においては継代培養が比較的容易
であるが、ヒト由来細胞においては、その継代は15代以
下、好ましくは10代までがよい。
【００２２】次に本発明の方法により製造された中胚葉
性細胞への多分化能を有する細胞、または幹細胞を、所
望の中胚葉性細胞に分化させる条件で培養し、所望の中
胚葉性細胞または該細胞群由来の組織を得ることができ
る。ここで本発明の方法により製造された中胚葉性細胞
への多分化能を有する細胞以外にも用いることができる
幹細胞としては、胚性幹細胞（ES細胞）、神経幹細胞、
毛包幹細胞、小腸上皮幹細胞等が挙げられる。所望の中
胚葉性細胞としては、例えば、骨形成能を有する細胞、
筋細胞、脂肪細胞等が挙げられ、該細胞群由来の組織と
しては、例えば、骨基質や骨組織、筋組織、脂肪組織等
が挙げられる。すなわち、該細胞群由来の組織とは、該
細胞群からなる組織だけでなく、骨基質等の該細胞群か
ら生じた物質等を含む組織でもよい。ここで、骨基質と
は、骨形成能を有する細胞によって作られ、細胞外へ分
泌された物質が蓄積したものを意味し、その主要な成分
はリン酸カルシウム等であって、オステオカルシンやオ
ステオポンチン、オステオネクチン、コラーゲン等のタ
ンパク質を含むものである。
【００２３】骨形成能を有する細胞に分化させる方法と
しては、例えば、本発明の方法により製造された中胚葉
性細胞への多分化能を有する細胞、または幹細胞を、TG
F−βスーパーファミリーに属するタンパク質の存在下
で培養する方法が好ましく用いられる。TGF−βスーパ
ーファミリーに属するタンパク質としては、BMP-2、BMP
-4、BMP-5、BMP-7等が挙げられ、好ましくはBMP-2、BMP
-4が、特に好ましくはBMP-2が用いられる。培養時の細
胞密度は、TGF-βスーパーファミリーに属するタンパク
質が効果的に作用する密度であって、細胞が増殖する上
で阻害が起きない程度に高い密度で播くことが好まし
い。細胞密度は、１×１０3〜１×１０6／ｃｍ2、好ま
しくは１〜３×１０4／ｃｍ2に調整することが好まし
い。また、過剰な増殖を抑制するため、培養液中のウシ
胎児血清（FCS）の濃度を０〜５％、好ましくは２〜３
％に調整することが好ましい。また、培養を行う際に
は、さらに、骨基質に含まれるタンパク質の発現活性化
物質、リン酸供給源、あるいは、コラーゲン合成促進物
質等を添加してもよい。骨基質に含まれるタンパク質の
発現活性化物質としては、デキサメタゾン、ビタミンＤ
３等が、リン酸供与源としてはβ-グリセロリン酸等
が、コラーゲン合成促進物質としてはアスコルビン酸等
が挙げられる。これらは用いる細胞の種類や状態に応じ
て適宜組み合わせて選択可能であって、その添加濃度に
ついても、用いる細胞に応じて決定すればよい。
【００２４】さらに具体的には、例えば、BMP-2および
／またはβ-グリセロリン酸の存在下で、培養開始時に
培養液中の細胞密度が１×１０3〜１×１０6／ｃｍ2、
好ましくは１〜３×１０4／ｃｍ2の密度となるように培
養する方法や、通常用いられる細胞培養液に添加するウ
シ胎児血清（FCS）の濃度を０〜５％、好ましくは２〜
３％とする方法が挙げられる。該方法においては、例え
ば、ヒト由来の細胞ではBMP-2単独でも用いることがで
きるが、マウス由来の細胞の場合には、β-グリセロリ
ン酸を併用することが好ましい。ここで、骨形成能を有
する細胞を取得する際には、アルカリフォスファターゼ
陽性および／またはオステオカルシン陽性であることを
指標にすることができる。また、骨基質形成能を指標に
して骨形成能を有する細胞を取得することもできる。骨
基質形成能は、アリザリン染色法等により検出される細
胞外へのカルシウムの蓄積を指標にして確認することが
できる。
【００２５】また、本発明の中胚葉性細胞への多分化能
を有する細胞を、ガンマリノレン酸存在下で培養するこ
とによって、細胞質に多数の脂肪滴を有する脂肪細胞に
分化させることができる。培地としては、例えば、ガン
マリノレン酸の他に、１０％ウシ胎児血清を添加したDM
EM等が好ましく用いられる。さらに、該中胚葉性細胞へ
の多分化能を有する細胞を、トランスフェリン、インシ
ュリン、セレンを含む筋分化用培地（pmDM培地；２％ウ
シ胎児血清、５μｇ／ｍｌトランスフェリン、１０μｇ
／ｍｌインシュリン、１０ｎＭセレンを添加したhDME
M）等で培養することにより、筋管細胞への誘導が認め
られる。このことは、筋特異的クレアチンキナーゼ陽
性、筋特異的ミオシン重鎖陽性等を指標にして確認する
ことができる。
【００２６】以下に、骨形成能を有する細胞を取得する
方法を例示する。本発明の中胚葉性細胞への多分化能を
有する細胞を前記したような方法で取得した後、細胞密
度を１×１０3〜１×１０6／ｃｍ2、好ましくは１〜３
×１０4／ｃｍ2で播く。ヒト・リコンビナントBMP-2（S
trathmanBiotech社製）を200ng/ml〜1000ng/ml、好まし
くは300ng/ml〜500ng/ml含む筋分化用培地(pmDM)に培地
を交換し、10% CO2, 37℃、湿度100% で4〜6日間培養を
行う。この培養期間中は、培地交換の必要はない。マウ
ス由来の細胞の場合には、上記培地にさらにβ-グリセ
ロリン酸（シグマ社製）を5ｍM〜20mM、好ましくは10ｍ
Mになるよう添加する。これによって、アルカリフォス
ファターゼ及びオステオカルシン陽性の細胞、すなわ
ち、骨形成能を有する細胞を取得することができる。さ
らに培養を継続することによりコブ状の細胞塊(nodule)
がディッシュ中央部に形成され、周囲に骨基質が蓄積す
る。このことは、中心部は光を通さないため、暗く見え
るようになることから簡単に確認することができる。
【００２７】上記したように、骨形成能を有する細胞は
アルカリフォスファターゼ陽性および／またはオステオ
カルシン陽性であること等を指標にして取得することが
できるので、これらの指標を用いれば、骨形成能に影響
を与える物質をスクリーニングすることができる。すな
わち、本発明の中胚葉性細胞への多分化能を有する細胞
に被検物質を投与し、誘導された細胞の骨形成能を上記
したような指標を用いて評価することにより、該被検物
質が骨形成能に与える影響を検出することができる。か
くして選抜された物質は、骨形成能に影響を与える物質
であって、骨粗鬆症、骨折や骨損傷、閉経後の骨密度低
下などの骨疾患等に対して有効である。
【００２８】本発明の方法を用いて製造した骨形成能を
有する細胞は、該細胞を支持体に付着させて培養するこ
とにより骨組織を形成させ、代替骨組織を製造すること
ができる。例えば、上田らの方法（日本口腔外科学会
誌、47,1,1-7(2001))等によって該細胞の足場となる支
持体に付着させて培養することにより、代替骨組織を製
造することができる。支持体としては、人工細胞外マト
リックスや多孔性セラミック、また、ゼラチンやコラー
ゲン、セルロース等の再吸収性バイオポリマー等を用い
ることもでき、これらをスポンジ、パウダー、ゲル、ウ
エブ等の形態で用いて製造した代替骨組織を移植するこ
とによって、移植部位において骨形成治癒を生じさせる
ことができる。このような代替骨組織は、さらに抗生
剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、保存剤、賦形剤等の薬剤を
含有することができる。また、本発明の中胚葉性細胞へ
の多分化能を有する細胞、または幹細胞と、TGF-βスー
パーファミリーに属するタンパク質の組合せは、骨形成
促進剤として用いることができる。該骨形成促進剤はさ
らに、骨基質に含まれるタンパク質の発現活性化物質、
リン酸供給源、あるいは、コラーゲン合成促進物質等を
含むこともできる。骨基質に含まれるタンパク質の発現
活性化物質としては、デキサメタゾン、ビタミンＤ３等
が、リン酸供与源としてはβ−グリセロリン酸等が、コ
ラーゲン合成促進物質としてはアスコルビン酸等が挙げ
られる。
【００２９】このような本発明の骨形成促進剤は、生理
学的に許容される形態であればいかなるものでもよい
が、このましくは注射剤等であって、注射剤として投与
される場合にはパイロジェンを含まないものとして調製
される。注射剤の形態としては、例えば、本発明の細
胞、または幹細胞とTGF-βスーパーファミリーに属する
タンパク質を、骨、軟骨、組織等の損傷部分に送達する
ためにカプセル封入したり、あるいは粘度のある液体と
して調製することができる。また、該細胞、または幹細
胞と該タンパク質の放出を制御するようなマトリックス
等を含有してもよく、該マトリックスは体内に吸収され
るものでもよい。該骨形成促進剤の投与量等の投与規則
は、形成が望まれる骨の重量、骨損傷部位、損傷の状
態、患者の年齢や性別、投与期間、剤形および他の臨床
的因子等を考慮して適宜決定すればよい。また、このよ
うな骨形成促進剤を投与した場合は、効果を把握するた
めに骨の成長および／または修復の度合いを定期的にモ
ニターすることが好ましい。例えば、Ｘ線や組織形態学
的測定等を用いてモニターすることにより、効果を把握
することができる。
【００３０】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、下記の実施例は本発明についての具体的認
識を得る一助と見なすべきものであり、本発明の範囲は
下記の実施例により何ら限定されるべきものではない。
【００３１】
【実施例１】中胚葉性細胞への多分化能を有する細胞の
調製 （１）8〜12週齢の雌 ICRマウスから、長さ約3mm、直径
約3mmの大きさの腓腹筋組織を、無菌的に取り出した。
滅菌したPBS（リン酸緩衝生理食塩水）10 mlを入れた直
径100mmシャーレを３枚用意し、順に前記筋組織を浸け
て洗った。余分な脂肪組織などをできるだけ丁寧にピン
セットで除去した。
【００３２】ヒト由来筋組織の場合は、摘出したヒト背
部皮下筋組織片を、滅菌PBSを浸したガーゼで包み、滅
菌シャーレに入れた後、氷冷した。摘出後10時間以内に
その一部（面積として約10mmx10mm程度）を切り取り、
皮膚をメスで除去した。以下の操作はマウスとヒトで全
く同じに行った。
【００３３】（２）得られた筋組織を50mlチューブに移
し、眼科用ハサミでできるだけ細かく裁断した。
【００３４】（３）裁断された筋組織に細胞分散液（0.
05%トリプシン（DIFCO社製）、0.025%コラゲナーゼV
（シグマ社製）を含むhDMEM（4.5mg/mlのグルコースを
含むダルベッコ変法イーグル培地、アサヒテクノグラス
社製））５mlを入れ、室温で５分間、手でおだやかに混
和した後、100rpmで2分間遠心した。上澄を新しい50ml
チューブに移し、牛胎児血清1mlを加えた。この操作を
さらに４回繰り返した。
【００３５】（４）集めた上澄約30mlのうち、3mlに塩
基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）（Peprotech社製）な
らびに白血球阻害因子（LIF）（Chemicon社製）を、そ
れぞれ終濃度10ng/ml、1000u/mlとなるように添加したp
mGM培地[Primary Myocyte GrowthMedium； 20%牛胎児血
清, 2% Ultraser G（Biosepra社製）を含む hDMEM（4.5
mg/mlのグルコースを含むダルベッコ変法イーグル培地
（アサヒテクノグラス社製））] 12 mlを加え、均一に
懸濁した。この懸濁液3mlずつをあらかじめ、bFGFなら
びにLIFが、それぞれ終濃度10ng/ml、1000u/mlとなるよ
うに添加したpmGM培地7mlを入れておいた直径100mmのＩ
型コラーゲンでコートしてあるシャーレ（collagen typ
e I-coated dish (スミロン社製)）に均一に撒いた。以
後特に記載のない限り、中胚葉性細胞への多分化能を有
する細胞を取得する培養過程においては、上記bFGFおよ
びLIFを含むpmGM培地にて培養をおこなった。
【００３６】（５）培養3〜4日後に小さなコロニー形成
が認められ、以後加速度的に増殖が進んだ。7〜10日後
に、リング法（組織培養の技術（朝倉書店）、P34-35）
により、未分化な細胞により構成されるコロニーの細胞
を0.05%トリプシン（DIFCO社製）と1mM EDTAを含むPBS
でシャーレからはがして回収し、直径35mmのcollagen t
ype I-coated dish (スミロン社製) に均一に播いた。
【００３７】（６）2〜4日後、細胞が20〜30%コンフル
エントになった時点で、その半量を、直径100mm のcoll
agen type I-coated dish (スミロン社製)に播いた。２
〜３日毎に、細胞密度をあまり下げないように（直径10
0mmディッシュ当たり1〜2×104の細胞）、新しいシャー
レに播き直しながら培養を続けた。
【００３８】（７）（６）で得られた細胞を、あらかじ
めＩ型コラーゲンにてコートしてある直径35-mmシャー
レ（スミロン社製）に細胞数1×105/ディッシュで播
き、bFGF及びLIFを含むpmGM培地で20-24時間培養し、以
下の中胚葉性細胞への分化の実験に用いることとした。
【００３９】
【実施例２】FGF及び／またはLIFの添加効果の検討 実施例１の（３）で得られた細胞の1/100量を35-mmＩ型
コラーゲン・コートディッシュ（スミロン社製）に播い
た。培地としてはpmGMにbFGFを終濃度20ng/ml、LIFを終
濃度1000u/mlとなるよう添加したものを用いた。培養７
日後にコロニー形成数および得られたコロニーの形態を
顕微鏡で観察した。その結果pmGM培地のみの場合得られ
たコロニー数は10、bFGF添加培地の場合得られたコロニ
ー数は9、LIFのみ添加の場合得られたコロニー数は6、b
FGF及びLIFを添加した場合得られたコロニー数は12であ
った。
【００４０】それぞれの条件で得られたコロニーにつき
顕微鏡で観察したところ、pmGM培地のみの場合は、得ら
れたコロニーすべてに筋管細胞の存在が認められ、かつ
個々のコロニー内の細胞数は少なく、大部分の細胞は筋
芽細胞に分化していた（図７；７−１）。ここで、筋芽
細胞とは紡錘形の細胞であって、さらに分化が進むと融
合して筋管（細胞）を形成するものである。次に、bFGF
のみの場合は得られたコロニーすべてに筋管細胞の存在
が認められたが、個々のコロニー内の細胞の数は増加傾
向にあり、コロニー内での筋管細胞の存在比率も低下傾
向にあった（図７；７−２）。LIFのみの場合は、得ら
れたコロニーで筋管細胞の存在が認められた割合は低
く、コロニー内での筋管細胞の存在比率も低下傾向にあ
った（図７；７−３）。しかしながらこれらのbFGFまた
はLIFを単独で添加した条件の場合、筋管細胞が認めら
れないコロニーにも筋管細胞に分化しつつある、紡錘形
の筋芽細胞は認められた。一方、bFGF及びLIFの両者の
存在下にて培養した場合は、得られたコロニーのうち筋
管細胞の存在が認められたコロニーの割合は非常に低
く、かつ個々のコロニー内の細胞数が大きく増加してい
るにもかかわらず、コロニー内にはほとんど筋芽細胞お
よび筋管細胞の出現は見られず球形の細胞で構成されて
いた（図７；７−４）。
【００４１】
【実施例３】 MyoDおよびRunx2の検出 実施例１の（７）で得られた細胞（1×105細胞／35mmデ
ィッシュ）を、２日後にPBSで洗った後、４％パラフォ
ルムアルデヒドで固定した。さらにトライトンX-100
0.5％を含むリン酸緩衝生理食塩水（Ｔ-ＰＢＳ）で洗っ
た後、1％正常ロバ血清で室温１０分間ブロッキングし
た。次に抗MyoD抗体（Novocastra社製、20倍希釈）と４
℃で一晩反応させた後、洗い、Cy3標識抗マウスIgG抗体
（ジャクソン・イムノラボラトリー社製、500倍希釈）
と室温で１時間反応させた。
【００４２】上記と同様にして細胞を固定し、正常ロバ
血清でブロッキングした後、抗Runx2抗体（ハイブリド
ーマ培養上清）と４℃で一晩反応させた後、洗い、ビオ
チン標識抗マウスIgG抗体（ジャクソン・イムノラボラ
トリー社製、500倍希釈）と室温で１時間反応させた。
さらに西洋わさびペルオキシダーゼ標識ストレプトアビ
ジン（NEN社製、100倍希釈）と室温で２０分間反応させ
た。その後、FITC標識チラミドと室温で１０分間反応さ
せた。尚、抗Runx2抗体は、京都大学医学部 伊藤嘉明
教授より分与いただいた。（抗体の調製方法は、Yu-Wen
Zhang, et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1054
9 (2000)を参照。） いずれも、蛍光の観察は落斜蛍光顕微鏡を用いて行い、
それぞれの転写因子陽性であることを確認した。
【００４３】
【実施例４】骨形成能を有する細胞の調製 （１）実施例１で得られた細胞を、ヒト・リコンビナン
トBMP-2 (300〜500ng/ml)（StrathmanBiotech社製）を
含む筋分化用培地(pmDM)に培地を交換し、10% CO2, 37
℃、湿度100%で4〜6日間培養した。培養期間中、培地交
換はしなかった。マウスの筋組織より得られた細胞の場
合には 上記培地にさらにβグリセロリン酸（シグマ社
製）が10ｍMになるよう添加した。
【００４４】（２）培養3〜4日後、コブ状の細胞塊(nod
ule)がディッシュ中央部に形成された。培養後4〜6日で
さらに細胞塊周辺に骨基質が蓄積し、中心部は光を通さ
ないため、暗く見えるようになった（マウスは図１、ヒ
トは図４）。
【００４５】
【実施例５】アルカリ性フォスファターゼ活性の検出と
カルシウム蓄積の検出 （１）実施例４の（１）で得られた細胞を４%パラフォ
ルムアルデヒド（メルク社製）で、4℃、10分間固定し
た後、100 mM Tris-HCl(pH 9.6)、100 mM NaCl, 20 mM
MgCl2, 0.01% naphtol AS-MX（シグマ社製）, 0.5 mg/m
l Fast Blue RR（シグマ社製）中で20分間反応させ、常
法に従ってアルカリ性フォスファターゼ活性を組織化学
的に検出した。
【００４６】（２）（１）でパラフォルムアルデヒド固
定した細胞をアリザリン赤S（シグマ社製）で30分間染
色した後、PBSにて30〜60分間洗浄した。図２及び図４
に示すように骨基質はアリザリン赤Sにて染色され、細
胞外にカルシウムが蓄積していることがわかった。
【００４７】
【実施例６】オステオカルシンの検出 実施例５の（１）にてパラフォルムアルデヒド固定した
細胞に、抗マウスオステオカルシン羊抗体(400倍希釈,
Biomedical Tech社製) を 0.1% saponin (Sigma社製)含
有PBSで希釈したものを加え、4℃で12〜20時間反応させ
た。続いて、FITC標識抗羊IgG抗体 (200倍希釈, ジャク
ソン・イムノラボラトリー社製) と室温で1時間反応さ
せた後、蛍光顕微鏡にて観察した。その結果、オステオ
カルシンはカルシウムと同じ細胞外基質部分に蓄積して
いた（図３）。
【００４８】
【実施例７】脂肪細胞への分化誘導 実施例１で得られたマウス由来細胞を1×105細胞/100mm
Ｉ型コラーゲンコートディッシュ（スミロン社製）に播
いた。これをpmGM培地 [Primary Myocyte Growth Mediu
m； 20% 牛胎児血清, 2% Ultraser G（Biosepra社製）
を含むhDMEM（4.5mg/mlのグルコースを含むダルベッコ
変法イーグル培地）]で培養し、20〜24時間後に、培地
を、100μmoleのガンマリノレン酸（シグマ社製）およ
び１０％牛胎児血清を加えたDMEM培地に変え、10% CO2
存在下、37℃で培養を継続したところ、６日〜９日後
に、細胞質に多数の脂肪滴をもつ脂肪細胞が出現した
（図５）。
【００４９】
【実施例８】筋管細胞への分化誘導 実施例１で得られたマウス由来細胞を、1×105細胞/100
mmＩ型コラーゲンコートディッシュ（スミロン社製）に
播いた。これを、2%牛胎児血清、5μg/mlトランスフェ
リン（シグマ社製）、10μg／mlインシュリン（シグマ
社製）、10nMセレン（シグマ社製）を含むhDMEM培地（p
mDM培地）にて培養したところ、筋管細胞への誘導が認
められた（図６）。
【００５０】
【発明の効果】本発明により、筋組織由来の中胚葉性幹
細胞を含む細胞群から、中胚葉性細胞への多分化能を有
する細胞を製造する方法が提供される。また、前記多分
化能を有する細胞、または幹細胞を分化させて所望の中
胚葉性細胞または該細胞群由来組織を製造する方法が提
供される。本発明の方法により、骨疾患における骨形成
細胞移植治療法に用いるための細胞が得られる。筋組織
の取得は、骨髄細胞等の取得に比べて簡便かつ安全性が
高いため、患者本人の筋組織由来の細胞を用いて骨形成
能を有する細胞を得ることが可能である。その結果、免
疫的拒絶反応のない、自己細胞移植を実現できる。ま
た、この細胞を用いて新たな骨形成促進因子などの検
出、スクリーニングが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の方法によってマウス筋組織由来の細
胞から得られた中胚葉性細胞への多分化能を有する細胞
による骨基質形成を示す写真。
【図２】 本発明の方法によってマウス筋組織由来の細
胞から得られた中胚葉性細胞への多分化能を有する細胞
におけるカルシウム蓄積を示す写真。アリザリン赤Sで
染色したもの。
【図３】 本発明の方法によってマウス筋組織由来の細
胞から得られた中胚葉性細胞への多分化能を有する細胞
において形成された骨基質を、抗マウスオステオカルシ
ン抗体により免疫染色した結果を示す写真。
【図４】 本発明の方法によりヒト筋組織由来の細胞か
ら得られた中胚葉性細胞への多分化能を有する細胞にお
けるカルシウム蓄積を示す写真。アリザリン赤Sで染色
したもの。
【図５】 本発明の方法によってマウス筋組織由来の細
胞から得られた中胚葉性細胞への多分化能を有する細胞
から分化した、細胞質に多数の脂肪滴をもつ脂肪細胞の
写真。
【図６】 本発明の方法によってマウス筋組織由来の細
胞から得られた中胚葉性細胞への多分化能を有する細胞
から誘導された筋管細胞の写真。
【図７】 bFGF及び／またはLIFの添加効果を示す写
真。 ７−１；bFGF及びLIF無添加の場合。 ７−２；bFGFのみを添加した場合。 ７−３；LIFのみを添加した場合。 ７−４；bFGF及びLIFを添加した場合。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/24 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 4B063 QA01 QA18 QQ08 QQ20 QQ33 QR57 QR77 QS03 QX01 4B065 AA91X AA93X BB19 BB34 CA44 CA60 4C084 AA02 AA03 BA44 DB61 MA02 ZA961 ZA962 ZC032 4C087 AA01 AA02 BB47 BB64 CA04 MA02 ZA96

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 哺乳類筋組織由来の中胚葉性幹細胞を含
    む細胞群を、繊維芽細胞増殖因子及び／またはIL-6ファ
    ミリーに属するサイトカインの存在下で培養することを
    特徴とする、中胚葉性細胞への多分化能を有する細胞の
    製造法。
  2. 【請求項２】 筋組織由来の中胚葉性幹細胞を含む細胞
    群を、繊維芽細胞増殖因子及びIL-6ファミリーに属する
    サイトカインの存在下で培養する、請求項１に記載の方
    法。
  3. 【請求項３】 筋組織由来の中胚葉性幹細胞を含む細胞
    群を、中胚葉性幹細胞が選択的に増殖する培養条件下で
    繊維芽細胞増殖因子及びIL-6ファミリーに属するサイト
    カインの非存在下で培養し、出現したコロニーのうち未
    分化な細胞により構成されるコロニーを回収し、回収さ
    れたコロニーに含まれる細胞を繊維芽細胞増殖因子及び
    ／またはIL-6ファミリーに属するサイトカインの存在下
    で培養維持することを特徴とする、請求項１又は２に記
    載の方法。
  4. 【請求項４】 筋組織由来の中胚葉性幹細胞を含む細胞
    群を、中胚葉性幹細胞が選択的に増殖する培養条件下で
    繊維芽細胞増殖因子及び／またはIL-6ファミリーに属す
    るサイトカインの存在下で培養し、出現したコロニーの
    うち未分化な細胞により構成されるコロニーを回収し、
    回収されたコロニーに含まれる細胞を繊維芽細胞増殖因
    子及び／またはIL-6ファミリーに属するサイトカインの
    存在下で培養維持することを特徴とする、請求項１又は
    ２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 繊維芽細胞増殖因子が、塩基性繊維芽細
    胞増殖因子である請求項１〜４のいずれか一項に記載の
    方法。
  6. 【請求項６】 IL-6ファミリーに属するサイトカイン
    が、白血球阻害因子(LIF)であることを特徴とする、請
    求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 中胚葉性細胞への多分化能を有する細胞
    が、中胚葉性細胞に特異的な転写因子陽性であることを
    特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 中胚葉性細胞に特異的な転写因子が、My
    oD、Runx2あるいはPPARγである請求項７に記載の方
    法。
  9. 【請求項９】 中胚葉性細胞が、筋細胞、骨細胞、脂肪
    細胞のいずれかであることを特徴とする請求項１〜８の
    いずれか一項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか一項に記載の
    方法により製造された中胚葉性細胞への多分化能を有す
    る細胞。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の細胞、または幹細
    胞を所望の中胚葉性細胞に分化させる条件で培養するこ
    とを特徴とする、所望の中胚葉性細胞または該細胞群由
    来の組織を製造する方法。
  12. 【請求項１２】 所望の中胚葉性細胞が骨形成能を有す
    る細胞である、請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 骨形成能を有する細胞に分化させる条
    件が、請求項１０に記載の細胞、または幹細胞を、１×
    １０3〜１×１０6/cm2の密度でTGF−βスーパーファミ
    リーに属するタンパク質の存在下で培養するものである
    請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 骨形成能を有する細胞に分化させる条
    件が、請求項１０に記載の細胞、または幹細胞を１×１
    ０3〜１×１０6/cm2の密度でBMP-2及び／またはβグリ
    セロリン酸の存在下で培養するものである請求項１２に
    記載の方法。
  15. 【請求項１５】 アルカリフォスファターゼ陽性、及び
    ／又はオステオカルシン陽性であることを指標として、
    骨形成能を有する細胞を取得する、請求項１１〜１４の
    いずれか一項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 骨基質形成能を指標として、骨形成能
    を有する細胞を取得する請求項１１〜１４のいずれか一
    項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１１〜１６のいずれか一項に記
    載の方法により得られた細胞または該細胞群由来の組
    織。
  18. 【請求項１８】 請求項１０に記載の細胞に、被検物質
    を投与し、誘導された細胞の骨形成能を評価することを
    特徴とする、骨形成能に影響を与える物質のスクリーニ
    ング方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１８に記載のスクリーニング方
    法により選抜された物質。
  20. 【請求項２０】 請求項１０に記載の細胞、または幹細
    胞を、請求項１９に記載の物質の存在下で培養すること
    を特徴とする骨形成能を有する細胞を製造する方法。
  21. 【請求項２１】 請求項１７に記載の細胞を支持体に付
    着させて培養することにより骨組織を形成させる、代替
    骨組織の製造法。
  22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の方法により取得さ
    れる代替骨組織。
  23. 【請求項２３】 請求項１０に記載の細胞、または幹細
    胞のうちのいずれかの細胞と、TGF−βスーパーファミ
    リーに属するタンパク質の組合せを含む骨形成促進剤。
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