JP2003015048A

JP2003015048A - 格子照明顕微鏡

Info

Publication number: JP2003015048A
Application number: JP2001195248A
Authority: JP
Inventors: Hisao Osawa; 日佐雄大澤
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2001-06-27
Filing date: 2001-06-27
Publication date: 2003-01-15

Abstract

(57)【要約】【課題】格子照明顕微鏡を蛍光顕微鏡としても用い
る。【解決手段】格子照明顕微鏡は、一次元格子３からの
一次元格子模様の励起照明光を出射する照明光学系と、
励起照明光を受けて蛍光を発する標本１６を載置な標本
載置面１５ａを有した標本台１５と、標本台１５の上方
に配設された対物レンズ８と、標本載置面１５ａに載置
された標本１６から対物レンズ６を通って出射される蛍
光を受けて標本の像をＣＣＤカメラ８に結像させる結像
光学系と、一次元格子３の位置調整を行う位置調整装置
２０とを備えて構成される。位置調整装置２０は一次元
格子３を光軸方向に移動させるマイクロメータ機構２２
を備え、このマイクロメータ機構２２により一次元格子
３を光軸方向に移動させ、励起光と蛍光との波長の相違
により生じる焦点ずれを補正することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、標本に格子模様の
照明を行う格子照明顕微鏡に関する。

【０００２】

【従来の技術】通常の光学顕微鏡は標本の三次元構造
（立体構造）の観察には適していないが、このことにつ
いて簡単に説明する。通常の光学顕微鏡では、焦点をぼ
かしたときに標本に細かい構造がなければ焦点がぼける
だけで合焦時の像と変わりない像しか得ることができな
い。なお、標本に細かい構造がある場合には焦点ずれに
対応して細かい構造の見え方に変化があると考えられる
が、焦点をぼかしたときには像全体の光量の積分強度は
ほとんど変化しないため、焦点ずれに伴う細かい構造の
見え方に変化があったとしても、背景光に邪魔されてそ
の変化を観察するのが困難であった。このことから分か
るように通常の顕微鏡では、標本における光学系の光軸
方向の情報変化を得ることが困難であり、このため、標
本の三次元構造（立体構造）の観察には不向きであっ
た。

【０００３】一方、標本の三次元構造の観察が可能な顕
微鏡として共焦点顕微鏡がある。共焦点顕微鏡は、標本
を点状に照明するとともにその照明点で散乱された光を
もう一度結像させて点状の光検出器で捉えることによ
り、標本中で焦点の合っている面のみの情報を得ること
ができるようになっている。このため、この照明点を標
本の表面において二次元的に走査することで、従来の顕
微鏡で得ることができる標本の二次元的な情報のみなら
ず、光軸方向における第３次元の情報を得ることがで
き、標本の三次元観察が可能である。このようなことか
ら、共焦点顕微鏡は標本の立体構造を観察したいという
要求のあるところに、近年急速にその利用が広まってい
る。

【０００４】ところが共焦点顕微鏡はその原理上、標本
の表面に点状の照明光（光スポット）を照射し、これを
標本表面において二次元的に走査しながらこれと同期し
て光強度を計測する必要がある。このため、光スポット
を標本に照射する光学系として、レーザー、リレーレン
ズ、偏向光学素子もしくは、ニポウディスク、ディスク
回転機構が必要になる。この結果、顕微鏡システム全体
が大型化しやすく、製造コストが高くなるという問題が
あった。

【０００５】これに対して、安価に標本の三次元画像を
得ることのできる小型の顕微鏡として、格子状に標本を
照明する顕微鏡（以下、格子照明顕微鏡と称する）があ
る。この格子照明顕微鏡は、標本に照明されてここで散
乱された照明光において、焦点ずれに対して０次光の信
号強度はほとんど変化しないのに対し、０次光以外の光
は焦点ずれによって急速に信号強度を失っていくことに
着目して作られている。すなわち、格子照明顕微鏡で
は、標本を格子状に照明してわざと散乱光の主成分が０
次光以外となるようにしておき、残った０次光を画像間
演算によって除去し、焦点ずれに対して敏感な顕微鏡を
構成している。このため、格子照明顕微鏡を用いて標本
のうちの焦点があっている面のみからの信号を求める操
作を、光軸方向に標本を移動させながら行うことで標本
の三次元像を得ることができる。

【０００６】この格子照明顕微鏡の原理を簡単に説明す
る。まず、標本の照明パターンとして、ピッチΛの一次
元正弦波を仮定すると、式（１）の関係が成立するた
め、画像上の各点における光強度Ｉ(ｔ,ω)は、式
（２）のようになる。

【０００７】

【数１】Ｓ(ｔ,ω)＝１＋ｍ・cos(ν・ｔ＋φ) ・・・（１）但し、ν＝λ／（Λ・ｎ・ＮＡ）

【０００８】

【数２】Ｉ(ｔ,ω)＝Ｉ_０＋Ｉ_ｃcosφ_０＋Ｉ_ｓsinφ_０・・・（２）

【０００９】なお、式（１）において、Ｓ(ｔ,ω)は標
本上の光強度分布である。(ｔ,ω)は標本上の実座標
(ｘ,ｙ)を波長λと屈折率ｎおよび開口数ＮＡで規格化
した座標であり、(ｔ,ω)＝(２πｎＮＡ／λ)・(ｘ,ｙ)
の関係が成立する。符号ｍは正弦波の振幅を示し、ｍが
大きい方がコントラストの高い正弦波状照明となること
を意味する。νは標本上に投影されている照明パターン
のピッチΛ、対物レンズ−標本間の屈折率ｎから決まる
空間周波数である。ＮＡは開口数で、ＮＡ＝sinαであ
り、αは対物レンズの最も外側を通ってくる光と主光線
とのなす角度である。φは正弦波状照明の原点における
位相であり、本顕微鏡では３枚の画像を３つの位相で取
得するが、φ_０はその一つ目の位相である。よって、以
下に示すφ _１は二つ目の位相、φ_２は三つ目の位相であ
る。

【００１０】ここで、φ_０＝０、φ_１＝２π／３、φ_２
＝４π／３とすることで、通信工学におけるSquare-Law
と同様に、式（３）のようになって０次光を除去する
ことができる。その結果、このときの焦点ずれに対する
信号応答は、式（４）のように表される。従って、光学
系の光軸方向の分解能がおおよそ、式（５）に示すよう
になる。なお、これらの式において、Ｊ１は一次のベッ
セル関数であり、λは光波長であり、ｎは対物レンズと
標本の間の屈折率である。

【００１１】

【数３】

【００１２】

【数４】

【００１３】

【数５】

【００１４】このように式（５）により、適切なνを選
択することで光軸方向の分解能Δｚは非常に小さな値に
することが可能となり、その場合は焦点ずれに対して敏
感となることが分かる。このため、この顕微鏡による観
察では光軸方向における極く小さな幅の領域においての
み焦点が合うことになり、このように焦点が合った状態
で光軸方向に観察標本を移動させて、得られた観察画像
を光軸方向の移動量に対応させて処理することにより観
察標本の三次元画像を得ることができる。

【００１５】上記の原理に従って構成された格子照明顕
微鏡の例を図３に示している。この顕微鏡は、矢印Ａ方
向に変化する正弦波状の透過率分布を持った一次元格子
５３を有し、この一次元格子５３が白色光源５１から出
射した光をコンデンサレンズ５２でほぼ平行光束とされ
た光で照明される。これにより、光強度が一次元方向に
正弦波状に変化する一次元格子模様（縞模様）の光が一
次元格子５３から出射され、この光が照明レンズ５６を
透過してハーフミラー５７により顕微鏡観察光学経路内
に入射される。

【００１６】この光学経路内には、ハーフミラー５７の
下側に位置する対物レンズ５８と、対物レンズ５８の下
側に配設された標本台６０と、ハーフミラー５７の上側
に位置するリレーレンズ６１と、リレーレンズ６１の上
側に位置するＣＣＤカメラ（撮像素子）６２とが垂直に
延びる同一光軸上に並んで配設されている。上記のよう
にして一次元格子５３から出射されて照明レンズ５６を
透過した一次元格子模様の光はハーフミラー５７により
反射され、照明レンズ５６と瞳位置を共有する対物レン
ズ５８を透過して標本台６０の標本載置面６０ａに結像
される。すなわち、照明レンズ５６に対する一次元格子
５３の位置と、対物レンズ５８に対する標本載置面６０
ａの位置とが共役な関係に設定されており、標本台６０
の標本載置面６０ａに一次元格子５３の像ができるよう
になっている。この結果、標本台６０の標本載置面６０
ａに載置された標本が、一次元格子５３を透過して作ら
れて一次元的に正弦波状に変化する強度分布をもった一
次元格子模様の光による照明を受ける。

【００１７】このようにして一次元格子模様の照明がな
された標本の像を、対物レンズ５８、リレーレンズ６１
からなる結像光学系を通してＣＣＤカメラ６２に結像さ
せ、その信号を制御用コンピュータ６３に取り込んで格
子状の標本像を得る。

【００１８】次に、制御用コンピュータ６３から圧電素
子ドライバ５５に制御信号を出力し、圧電素子ドライバ
５５により圧電素子５４をわずかに伸縮させ、この圧電
素子５４に繋がる上記一次元格子５３を格子の並びの方
向（矢印Ａ方向）に移動させる。このとき圧電素子５４
の伸縮長さを、上記一次元格子５３の格子ピッチの１／
３となるようにしておく。すると、標本載置面６０ａ上
の標本に照明される格子模様（縞）はその位相が１／３
だけずれた模様となる。そして、このときの標本像を上
記と同様にＣＣＤカメラ６２により撮像しておく。

【００１９】さらに、同様にして圧電素子５４により一
次元格子５３を格子ピッチの２／３だけ移動させて標本
を照明し、このときの標本像もＣＣＤカメラ６２により
撮像しておく。

【００２０】以上のようにして撮像されたときの各画像
を、上記の式（３）におけるＩ_１，Ｉ_２，Ｉ_３として式
（３）により光強度Ｉ_ｐを計算すれば、標本上の焦点の
合っている高さにおける画像のみを得ることができる。
そして、標本台６０を光軸方向に移動させて上記と同様
にして焦点の合っている高さにおける画像を取り込むこ
とにより、標本の三次元画像を得ることができる。

【００２１】

【発明が解決しようとする課題】ところで、本発明者は
図３に示したような構成の格子照明顕微鏡を蛍光顕微鏡
として用いることを考えた。この場合には、白色光源５
１に代えて励起光光源を用い、この励起光光源から出射
される励起光をコンデンサレンズ５２を通して一次元格
子５３に照射し、一次元格子模様の励起光を作り出す。
そして、この一次元模様の励起光を照明レンズ５６から
ハーフミラー５７を介して顕微鏡観察光学経路内に入射
させ、対物レンズ５８を通して標本台６０上の標本６０
ａに照射させる。この標本６０ａは励起光の照射を受け
て蛍光を発し、この蛍光が対物レンズ５８、リレーレン
ズ６１を通ってＣＣＤカメラ６２に受光され、標本６０
ａの蛍光像が得られる。これを上記と同様に処理するこ
とにより標本の蛍光に基づく三次元画像が得られる。

【００２２】なお、このように図３の格子照明顕微鏡を
蛍光顕微鏡として用いる場合には、ハーフミラー５７
を、励起光波長に対しては高い反射率を持ち、蛍光波長
に対しては高い透過率を持つダイクロイックミラーから
構成する。これにより、標本６０ａに一次元格子模様の
励起光照明がなされ、ＣＣＤカメラ６２によりこの励起
光照明を受けて発光する蛍光波長で見た標本像を撮影す
ることができ、これを制御用コンピュータ６３により演
算処理して標本の三次元画像が得られる。

【００２３】ところで、上記のようにして格子照明顕微
鏡を蛍光顕微鏡として用いる場合、対物レンズ５８は励
起光および蛍光が通過する構成であり、この対物レンズ
５８のこれらの光に対する軸上色収差が問題となる。こ
れを具体的に説明する。通常の格子照明顕微鏡では標本
に照射された照明光の反射光がＣＣＤカメラ６２に受光
される構成であり、対物レンズ５８を通過する照明光と
反射光は同一波長の光である。しかしながら、蛍光顕微
鏡の場合には励起光と蛍光という異なる波長の光が通過
するため、これらの光に対する対物レンズ５８の軸上色
収差が発生する。このため、励起光による一次元格子像
が標本上に正確に結像されているときに、この標本から
の蛍光に基づく像がＣＣＤカメラ６２上に正確に結像し
なくなるという問題がある。

【００２４】これは対物レンズの軸上色収差により焦点
位置がずれるために生ずるものであり、励起光による一
次元格子像を標本上に正確に結像させるように照明光学
系の焦点位置調整を行うとともに、蛍光による標本像を
ＣＣＤカメラに正確に結像させるように結像光学系の焦
点位置調整を行えば解決できると考えられる。しかしな
がら、通常の格子照明顕微鏡を蛍光顕微鏡として用いる
には、その都度このような調整が必要であり、さらに、
蛍光顕微鏡に用いる励起光および蛍光の組み合わせが異
なるたびにこのような調整が必要であるという問題があ
り、上述の構成の格子照明顕微鏡を蛍光顕微鏡として用
いることが難しかった。

【００２５】本発明はこのような問題に鑑みたもので、
格子照明顕微鏡を蛍光顕微鏡として簡単に用いることが
できるようにすることを目的とする。

【００２６】

【課題を解決するための手段】このような目的達成のた
め、本発明においては、照明光を出射する照明光源と、
標本を載置するための標本台と、この標本台の上方に配
設された対物レンズと、照明光源から出射された照明光
を対物レンズを通して標本台上の標本に格子模様の照明
を行う照明光学系と、格子模様の照明を受けることによ
り標本台上の標本から対物レンズを通して出射される観
察光を受けて標本の像を結像させる結像光学系とを備え
て格子照明顕微鏡が構成され、照明光と観察光との波長
が相違し、照明光の波長における照明光学系の焦点が合
致するとともに、観察光の波長における結像光学系の焦
点が合致するように、照明光学系および結像光学系の少
なくともいずれか一方の焦点調整を行う焦点補正手段を
有する。

【００２７】本発明に係る格子照明顕微鏡においては、
照明光として通常の白色光源を用いて標本からの反射光
を結像させて観察する一般的な格子照明顕微鏡をそのま
ま蛍光顕微鏡として用いるときには、焦点補正手段によ
り照明光として用いられる励起光の波長と標本から出射
する蛍光の波長との相違に対応して焦点位置調整を行え
ば良い。

【００２８】上記構成の格子照明顕微鏡を、照明レンズ
を透過した照明光を結像光学系の光路内に入れて対物レ
ンズに向けて照射させる光路変更光学素子を設けて構成
することができる。

【００２９】なお、焦点補正手段は、照明光学系により
標本台上の標本に格子模様の照明を行うときに格子模様
の照明のピントを合わせるように照明光学系の焦点位置
調整を行うように構成しても良い。

【００３０】この場合、照明光学系を、格子模様に対応
する透過率分布を有し透過光を格子模様の照明光にして
出射させる格子部材と、対物レンズと組み合わせること
により格子模様の光を受けて格子模様の像を標本台に置
かれた標本上に投影する照明レンズとを有して構成し、
焦点補正手段が格子部材の光軸方向の位置調整を行う格
子位置調整手段から構成することができる。

【００３１】そして、この格子位置調整手段を、格子部
材を軸方向に移動させる格子移動機構と外部操作されて
格子移動機構を作動させる格子操作部材とを備えて構成
し、格子操作部材に照明光と観察光との波長の相違に対
応した操作位置を示す目印を設けるのが好ましい。

【００３２】また、上記焦点補正手段を、照明光学系の
光路内に配設されて照明光学系の焦点位置調整を行う照
明光学系用補正光学要素から構成しても良い。この場
合、照明光学系用補正光学要素が着脱交換可能であり、
照明光および観察光の種類や、対物レンズの種類に応じ
て交換されるようにするのが好ましい。

【００３３】焦点補正手段を、結像光学系により標本台
上の標本から出射される観察光を受けて標本の像を結像
させるときにピントを合わせるように結像光学系の焦点
位置調整を行うように構成することができる。

【００３４】この場合、焦点補正手段を、結像光学系の
光路内に配設されて結像光学系の焦点位置調整を行う結
像光学系用補正光学要素から構成しても良い。この構成
では、結像光学系用補正光学要素が着脱交換可能であ
り、照明光および観察光の種類や、対物レンズの種類に
応じて交換されるようにするのが好ましい。

【００３５】また、結像光学系により結像された標本の
像を撮影する撮像素子を設け、焦点補正手段を撮像素子
の光軸方向の位置調整を行う撮像素子位置調整手段から
構成しても良い。

【００３６】この場合、撮像素子位置調整手段を、撮像
素子を軸方向に移動させる撮像素子移動機構と外部操作
されて撮像素子移動機構を作動させる撮像素子操作部材
とを備えて構成し、撮像素子操作部材に照明光と観察光
との波長の相違に対応した操作位置を示す目印を設ける
のが好ましい。

【００３７】

【発明の実施の形態】以下、図面を参照して本発明の好
ましい実施形態について説明する。本発明の第１の実施
形態に係る格子照明顕微鏡の構成を図１に示している。
この構成は、図３に示した従来の反射型格子照明顕微鏡
の構成と類似しており、矢印Ａ方向に変化する正弦波状
の透過率分布を持った一次元格子３を有し、この一次元
格子３が励起光源１から出射した励起光をコンデンサレ
ンズ２でほぼ平行光束とされた光で照明される。これに
より、光強度が一次元方向に正弦波状に変化する一次元
格子模様（縞模様）の励起照明光が一次元格子３から出
射される。そして、この励起照明光が照明レンズ４を透
過してハーフミラー５により顕微鏡観察光学経路（結像
光学系を含む）内に入射されるように照明光学系が構成
される。一次元格子を用いることにより、格子照明顕微
鏡構成が最も簡単となり、さらに、三次元観察が最も容
易である。

【００３８】なお、一次元格子３は位置調整装置２０に
より支持されている。この位置調整装置２０は、一次元
格子３に繋がってこの一次元格子３を格子の透過率分布
変化方向（矢印Ａ方向）に移動させる圧電素子２１と、
この圧電素子２１を光軸方向（矢印Ｂ方向）に移動させ
て一次元格子３を光軸方向（矢印Ｂ方向）に移動させる
マイクロメータ機構２２とから構成される。圧電素子２
１は制御用コンピュータ９からの制御信号を受ける圧電
素子ドライバ１０により作動されて僅かに伸縮し、一次
元格子３を矢印Ａ方向に移動させるようになっている。
また、マイクロメータ機構２２は調整つまみ２２ａを回
転操作することにより圧電素子２１を光軸方向（矢印Ｂ
方向）に移動させ、一次元格子３を光軸方向（矢印Ｂ方
向）に移動させることができるようになっている。

【００３９】上記顕微鏡観察光学経路内には、ハーフミ
ラー５の下側に位置する対物レンズ６と、対物レンズ６
の下側に配設された標本台１５と、ハーフミラー５の上
側に位置するリレーレンズ７と、リレーレンズ７の上側
に位置するＣＣＤカメラ（撮像素子）８とが垂直に延び
る同一光軸上に並んで配設されている。上記のようにし
て一次元格子３から出射されて照明レンズ４を透過した
一次元格子模様の励起照明光はハーフミラー５により反
射され、対物レンズ６を透過して標本台１５に向けて照
射される。このことから分かるように、ハーフミラー５
は励起光波長に対して高い反射率特性を有するダイクロ
イックミラーから構成される。

【００４０】上記のように対物レンズ６を透過して標本
台１５に照射された励起照明光により、標本台１５の上
面に一次元格子３の格子像が結像される。すなわち、照
明レンズ４に対する一次元格子３の位置と対物レンズ６
に対する標本載置面１５ａの位置とが共役な関係に設定
されており、標本台１５の標本載置面１５ａに一次元格
子３の像ができるようになっている。この結果、標本載
置面１５ａに載置された標本が、一次元格子３を透過し
て作られて一次元的に正弦波状に変化する強度分布をも
った一次元格子模様の励起光による照明を受ける。これ
により、格子部材の像を標本台１５の標本載置面１５ａ
に結像させることができ、標本載置面１５ａの上に置か
れた標本を格子模様に照明することができる。

【００４１】標本は蛍光物質を有しており、励起光源１
からの励起光を受けると蛍光を発し、このように標本か
ら発光する蛍光を対物レンズ６およびリレーレンズ７か
らなる結像光学系を通して集光してＣＣＤカメラ８に標
本の像を結像させ、その信号を制御用コンピュータ９に
取り込んで干渉縞の像を得る。このため、ハーフミラー
５は上記蛍光波長に対して高い透過率特性を有するダイ
クロイックミラーから構成される。すなわち、ハーフミ
ラー５は励起光を反射し、蛍光を透過させる特性を有す
るダイクロイックミラーから構成されている。

【００４２】ここで、励起光と蛍光の波長が相違するた
め、これらの光がともに通過する対物レンズ６における
軸上色収差が相違する。このため、ＣＣＤカメラ８によ
り撮像された標本の像を制御用コンピュータ９に繋がれ
たモニタ１１に表示させ、結像光学系のピント調整（顕
微鏡において通常行われるピント調整であり、例えば、
標本台を上下させて行う調整）を行って標本載置面１５
ａに置かれた標本の蛍光像が鮮明に見えるようにしたと
きに、標本に照射された格子模様はピントがずれてぼや
けた状態となることが多い。

【００４３】そこでこの状態から、位置調整装置２０に
おける調整つまみ２２ａを操作して一次元格子３を光軸
方向（矢印Ｂ方向）に移動させる調整を行うと、標本の
蛍光像は鮮明なまま変化せずに格子模様のピントがあっ
て、標本像に格子模様の像が重畳した状態となる。これ
は、上記の軸上色収差による焦点位置のずれが位置調整
装置２０による調整によって修正され、励起光による標
本上の格子像が、ＣＣＤカメラ８で観察している標本上
の面と正確に同一面になるためである。そこで、この位
置で一次元格子３の位置を固定する。このため、マイク
ロメータ機構２２に調整つまみ２２ａを固定保持する手
段を設けるのが好ましい。

【００４４】このようにして焦点調整を行った状態でＣ
ＣＤカメラ８により標本の像を撮像し、その信号を制御
用コンピュータ９に取り込み記憶しておく。次に、制御
用コンピュータ９から圧電素子ドライバ１０に制御信号
を出力し、圧電素子ドライバ１０より圧電素子２１をわ
ずかに伸縮させる制御を行い、この圧電素子２１に繋が
る上記一次元格子３を格子の並びの方向（矢印Ａ方向）
に移動させる。このとき圧電素子２１の伸縮長さを、上
記一次元格子３の格子ピッチの１／３となるようにして
おく。すると、標本載置面１５ａ上の標本に照明される
格子模様（縞）はその位相が１／３だけずれた模様とな
る。そして、このときの標本像を上記と同様にＣＣＤカ
メラ８により撮像し、その信号を制御用コンピュータ９
に取り込み記憶しておく。

【００４５】さらに、同様にして圧電素子２１により一
次元格子３を格子ピッチの２／３だけ移動させて標本を
照明し、このときの標本像もＣＣＤカメラ８により撮像
し、その信号を制御用コンピュータ９に取り込み記憶し
ておく。

【００４６】以上のようにして撮像されたときの各画像
を、上記の式（３）におけるＩ_１，Ｉ_２，Ｉ_３として式
（３）により光強度Ｉ_ｐを計算すれば、標本上の焦点の
合っている高さにおける画像のみを得ることができる。
そして、標本台１５を標本台移動機構１２により光軸方
向に移動させて上記と同様にして焦点の合っている高さ
における画像を取り込む。このときの標本台移動機構１
２による移動情報を制御用コンピュータ９に入力させ、
移動情報と上述のようにして得られた画像とを組み合わ
せて画像処理することにより、標本載置面１５ａの上に
載置された標本の三次元画像を得ることができる。

【００４７】なお、励起光と蛍光の波長の相違により発
生する対物レンズ６における軸上色収差を位置調整装置
２０における調整つまみ２２ａの操作により修正すると
きに、調整つまみ２２ａの調整位置は、対物レンズ６の
種類、励起光および蛍光の波長に対応して一義的に決ま
る。このため、対物レンズ６の種類と、励起光および蛍
光の波長に対して調整つまみ２２ａの調整位置を予め測
定もしくはシミュレーション設定しておき、この調整位
置に目印を設けておけば、この調整作業が非常に容易と
なる。一般に、蛍光顕微鏡観察を行う場合の励起光波長
と蛍光波長の組み合わせは様々なものが存在するが、生
体標本に特定の蛍光プローブを付けて観察を行う用途に
おいては、励起光と蛍光の組み合わせはほぼ決まってお
り、これらに対して調整つまみ２２ａの調整位置に目印
を設けておけばこの観察が容易となる。

【００４８】次に、本発明に係る格子照明顕微鏡の異な
る実施形態について、図２を参照して説明する。なお、
この実施形態において図１に示した装置と同一構成部分
については同一番号を付してその説明を省略し、主とし
て相違する構造について説明する。

【００４９】この装置（図２に示す装置）は、図１の装
置における位置調整装置２０に代えて圧電素子１８のみ
を有して構成される。このためこの装置においては、圧
電素子ドライバ１０によって圧電素子を伸縮させ、一次
元格子３を矢印Ａ方向に移動させることはできるが、図
１の装置のように一次元格子３を光軸方向に移動させる
制御はできないようになっている。しかしながら、この
装置には照明レンズ４の後に補正光学要素３０が設けら
れており、この補正光学要素３０により上述した軸上色
収差により生じる焦点位置ずれを修正している。

【００５０】すなわち、この装置においては、前述した
ように励起光と蛍光の波長の相違による対物レンズ６に
おける軸上色収差を補正光学要素３０により補正するよ
うに構成されているため、標本の上にピントがあった状
態で格子模様の励起光を照射させることができ、標本像
に格子模様の像が鮮明に重畳した状態でＣＣＤカメラ８
により標本の像を撮像することができる。そこで、この
撮像信号を制御用コンピュータ９に取り込み記憶してお
く。以下、図１の装置と同様にして、圧電素子１８によ
り一次元格子３を格子ピッチの１／３および２／３だけ
移動させて標本を照明し、このときの標本像もＣＣＤカ
メラ８により撮像し、その信号を制御用コンピュータ９
に取り込み記憶しておく。

【００５１】以上のようにして撮像されたときの各画像
を、上記の式（３）におけるＩ_１，Ｉ_２，Ｉ_３として式
（３）により光強度Ｉ_ｐを計算し標本上の焦点の合って
いる高さにおける画像のみを得る。そして、標本台１５
を標本台移動機構１２により光軸方向に移動させて上記
と同様にして焦点の合っている高さにおける画像を取り
込む。このときの標本台移動機構１２による移動情報を
制御用コンピュータ９に入力させ、移動情報と上述のよ
うにして得られた画像とを組み合わせて画像処理するこ
とにより、標本載置面１５ａの上に載置された標本の三
次元画像を得ることができる。

【００５２】なお、この装置においては、励起光と蛍光
との波長の相違に起因して対物レンズ６において生じる
軸上色収差を照明光学系に配設した補正光学要素３０に
より補正しているが、図２において破線で示すように結
像光学系に補正光学要素３１を配設してこの軸上色収差
の補正を行っても良い。

【００５３】あるいは、図１に用いたマイクロメータ機
構２２と同様な構成のマイクロメータ機構３２により撮
像素子８の位置調整を行って軸上色収差の補正を行うよ
うに構成しても良い。

【００５４】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
格子照明顕微鏡において、照明光と観察光との波長に対
応して照明光学系および結像光学系の少なくともいずれ
かの焦点調整を行う焦点補正手段を有するので、例え
ば、照明光として通常の白色光源を用いて標本からの反
射光を結像させて観察する一般的な格子照明顕微鏡をそ
のまま蛍光顕微鏡として用いるときに、焦点補正手段に
より照明光として用いられる励起光の波長と標本から出
射する蛍光の波長との相違に対応して焦点位置調整を行
えば、通常の格子照明顕微鏡を簡単に蛍光顕微鏡観察に
も用いることができる。さらに、蛍光顕微鏡観察を行う
ときに、波長の異なる励起光を用いて出射する蛍光の波
長も異なる場合でも、焦点補正手段によりこれら励起光
および蛍光の波長に対応した焦点位置調整を行うだけ
で、簡単に対応することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１実施形態に係る格子照明顕微鏡の
構成を説明する概略図である。

【図２】本発明の第２実施形態に係る格子照明顕微鏡の
構成を説明する概略図である。

【図３】従来の格子照明顕微鏡の構成を説明する概略図
である。

【符号の説明】

３一次元格子４照明レンズ５ハーフミラー６対物レンズ７リレーレンズ８ＣＣＤカメラ９制御用コンピュータ１５標本台１８，２１圧電素子２０，３２位置調整装置２２マイクロメータ機構２２ａ調整つまみ３０，３１補正光学要素

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】照明光を出射する照明光源と、標本を載置するための標本台と、前記標本台の上方に配設された対物レンズと、前記照明光源から出射された照明光を前記対物レンズを
通して前記標本台上の標本に格子模様の照明を行う照明
光学系と、前記格子模様の照明を受けた記標本台上の標本から前記
対物レンズを通して出射される観察光を受けて前記標本
の像を結像させる結像光学系とを備え、前記照明光と前記観察光との波長が相違し、前記照明光
の波長における前記照明光学系の焦点が合致するととも
に、前記観察光の波長における前記結像光学系の焦点が
合致するように、前記照明光学系および前記結像光学系
の少なくともいずれか一方の焦点調整を行う焦点補正手
段を有することを特徴とする格子照明顕微鏡。
【請求項２】前記標本台上に励起光を受けて蛍光発光
する標本が載置され、前記照明光として前記励起光が用
いられ、前記観察光が前記標本から発光する蛍光である
ことを特徴とする請求項１に記載の格子照明顕微鏡。
【請求項３】前記焦点補正手段が、前記照明光学系に
より前記標本台上の標本に格子模様の照明を行うときに
前記格子模様の照明のピントを合わせるように前記照明
光学系の焦点位置調整を行うことを特徴とする請求項１
〜２のいずれかに記載の格子照明顕微鏡。
【請求項４】前記照明光学系が、前記格子模様に対応
する透過率分布を有し透過光を前記格子模様の照明光に
して出射させる格子部材と、前記対物レンズと組み合わ
せることにより前記格子模様の光を受けて前記格子模様
の像を前記標本台に置かれた標本上に投影する照明レン
ズとを有して構成され、前記焦点補正手段が前記格子部材の光軸方向の位置調整
を行う格子位置調整手段からなることを特徴とする請求
項３に記載の格子照明顕微鏡。
【請求項５】前記格子位置調整手段が、前記格子部材
を軸方向に移動させる格子移動機構と、外部操作されて
前記格子移動機構を作動させる格子操作部材とを備え、前記格子操作部材に、前記照明光と前記観察光との波長
の相違に対応した操作位置を示す目印が設けられている
ことを特徴とする請求項４に記載の格子照明顕微鏡。
【請求項６】前記焦点補正手段が、前記照明光学系の
光路内に配設されて前記照明光学系の焦点位置調整を行
う照明光学系用補正光学要素からなることを特徴とする
請求項３に記載の格子照明顕微鏡。
【請求項７】前記照明光学系用補正光学要素が着脱交
換可能であり、前記照明光および前記観察光の種類や、
前記対物レンズの種類に応じて交換されるようになって
いることを特徴とする請求項６に記載の格子照明顕微
鏡。
【請求項８】前記焦点補正手段が、前記結像光学系に
より前記標本台上の標本から出射される観察光を受けて
前記標本の像を結像させるときにピントを合わせるよう
に前記結像光学系の焦点位置調整を行うことを特徴とす
る請求項１〜２のいずれかに記載の格子照明顕微鏡。
【請求項９】前記焦点補正手段が、前記結像光学系の
光路内に配設されて前記結像光学系の焦点位置調整を行
う結像光学系用補正光学要素からなることを特徴とする
請求項８に記載の格子照明顕微鏡。
【請求項１０】前記結像光学系用補正光学要素が着脱
交換可能であり、前記照明光および前記観察光の種類
や、前記対物レンズの種類に応じて交換されるようにな
っていることを特徴とする請求項９に記載の格子照明顕
微鏡。
【請求項１１】前記結像光学系により結像された前記
標本の像を撮影する撮像素子を備え、前記焦点補正手段が前記撮像素子の光軸方向の位置調整
を行う撮像素子位置調整手段からなることを特徴とする
請求項８に記載の格子照明顕微鏡。
【請求項１２】前記撮像素子位置調整手段が、前記撮
像素子を軸方向に移動させる撮像素子移動機構と、外部
操作されて前記撮像素子移動機構を作動させる撮像素子
操作部材とを備え、前記撮像素子操作部材に、前記照明光と前記観察光との
波長の相違に対応した操作位置を示す目印が設けられて
いることを特徴とする請求項１１に記載の格子照明顕微
鏡。