JP2003009899A - 化合物のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 カルシニューリンの酵素活性を阻害しない薬
物を有効かつ迅速にスクリーニングする方法を提供する
ことを目的とする。 【手段】 カルシニューリンの酵素活性を抑制する化合
物と被検化合物との存在下、カルシニューリン遺伝子破
壊によって合成致死となり得る分裂酵母変異体を培養し
て、該分裂酵母変異体の増殖の有無を測定することによ
りカルシニューリン酵素活性抑制の阻害活性を有する被
検化合物をスクリーニングする化合物のスクリーニング
方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は化合物のスクリーニ
ング方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】未知の遺伝子から出発して薬物開発を目
指す逆薬理学や、副作用原因遺伝子の同定を目指すゲノ
ム薬理学の分野における近年の精力的な研究によって、
免疫抑制薬が、特定の結合タンパク（イムノフィリン）
と結合し、Ｃａ²⁺／カルモジュリン依存性脱リン酸化酵
素として発見されたカルシニューリンの酵素活性を特異
的に阻害し、その結果、免疫抑制効果を発揮することが
明らかにされている。また、薬物とイムノフィリンとの
複合体は、カルシニューリンの脱リン酸化酵素活性に対
する抑制作用のみならず、その他の種々の作用に関与す
ることが解明されている。

【０００３】例えば、免疫抑制薬であるシクロスポリン
やタクロリムス（ＦＫ５０６）は、それぞれ異なる特定
のイムノフィリンと結合して複合体を形成し、これらの
複合体がカルシニューリンの酵素活性を抑制して、最終
的にヘルパーＴ細胞の活性化を抑制し、免疫抑制効果を
発現する。また、タクロリムスは、この特定のイムノフ
ィリン（ＦＫ５０６ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ：ＦＫＢＰ）と結合することにより、免疫抑制作用と
は全く異なる作用として、ロタマーゼの酵素活性を抑制
することも知られている。

【０００４】タクロリムスと構造的に類似し、新規な免
疫抑制薬として臨床応用が期待されているラパマイシン
は、ＦＫＢＰと結合することにより、トル（ＴＯＲ）と
呼ばれるたんぱく質リン酸化酵素と結合し、その結果、
ヘルパーＴ細胞の活性化を抑制し、免疫抑制効果を発現
するが、カルシニューリンの酵素活性に対する阻害作用
を示さない。このため、高血圧や陣障害等のカルシニュ
ーリン活性の抑制に伴う副作用を発現しない。

【０００５】一方、以下の構造を有する化合物である３
−（３−ピリジル）−１−プロピル（２Ｓ）−１−
（３，３−ジメチル−１，２−ジオキソペンチル）−２
−ピロリジンカルボキシレート（ＧＰＩ−１０４６）
は、ＦＫＢＰとは結合するものの、カルシニューリンの
酵素活性に対して阻害作用を示さず、免疫抑制効果も示
さないが、ＦＫＢＰのもつロタマーゼ活性を阻害し、空
間記憶（Ｓｐａｔｉａｌ Ｍｅｍｏｒｙ）を改善するこ
とが知られている。ＦＫＢＰと結合するこれら３種の薬
物（タクロリウム、ラパマイシン、ＧＰＩ−１０４６）
は全てロタマーゼ活性を阻害するとともに、培養神経細
胞の神経突起を伸長させる作用を有している。

【０００６】このような種々の薬物における多様な作用
から、ＧＰＩ−１０４６やラパマイシンのように、ＦＫ
ＢＰに結合するがカルシニューリンの酵素活性を阻害し
ない薬物を簡便にスクリーニングすることができれば、
副作用の少ない新規免疫抑制薬、神経突起伸長作用をも
つ薬物、空間記憶を改善する薬物や外傷後の神経治癒を
促進する薬物等を開発することが可能となる。

【０００７】しかし、通常、カルシニューリンの酵素活
性を阻害しないが、FKBPと結合する薬物をスクリーニン
グしようとする場合、放射性同位元素で標識した化合物
を用いるなどして、その化合物がタンパクに結合して複
合体を形成することを確認した後、個々の酵素活性、つ
まり、カルシニューリンの酵素活性をインビトロにおけ
る複雑な工程により測定する。これらの結果に基づい
て、所望の化合物を選択し、選択された化合物に対し
て、さらに動物を用いて毒性や免疫抑制活性の有無を調
べるという煩雑なスクリーニング方法を実行することが
必要となる。したがって、スクリーニングのために、高
価な試薬や設備等が必要となり、しかも長時間を要する
という問題がある。

【０００８】また、生体で薬物が作用するためには、細
胞内へ浸透する必要があるが、上記のような方法では、
選択された化合物が細胞内へ浸透するか否かを別個の方
法で確認する必要がある。さらに、通常の結合活性、酵
素活性等は、個々に試験されるため、他の酵素活性の影
響や、酵素活性等の相互作用による細胞毒性をもつ化合
物等を除外することができないという問題がある。この
ような状況下、細胞内へ浸透するが、細胞毒性を示さ
ず、かつカルシニューリンの酵素活性を阻害しないよう
な化合物を、有効かつ迅速にスクリーニングする方法が
求められている。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の各薬
物の性質、免疫抑制作用等を発現する作用機序等につい
て鋭意研究を行った結果、イムノフィリンであるＦＫＢ
Ｐとの結合活性、カルシニューリンの酵素活性に対する
阻害活性を測定することにより、ＦＫＢＰには結合する
が、カルシニューリンの酵素活性を阻害しない化合物を
簡便にスクリーニングすることができる方法を見出し、
本発明の完成に至った。また、ＦＫＢＰとの結合に起因
する細胞内カルシニューリン酵素活性の抑制を簡便な方
法により測定することを可能とする、分裂酵母の特有の
変異体を見出し、本発明の完成に至った。

【００１０】すなわち、本発明によれば、イムノフィリ
ンとの結合に起因し、カルシニューリンの酵素活性を抑
制する化合物と被検化合物との存在下、カルシニューリ
ン遺伝子破壊によって合成致死となり得る分裂酵母変異
体を培養して、該分裂酵母変異体の増殖の有無を測定す
ることにより、イムノフィリンには結合するが、カルシ
ニューリン酵素活性を抑制しない被検化合物をスクリー
ニングする化合物のスクリーニング方法が提供される。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明のスクリーニング方法は、
酵母遺伝学における「合成致死」という現象を利用す
る。酵母における合成致死とは、Ａという遺伝子やＢと
いう遺伝子における単独の変異のみでは致死しないが、
ＡとＢとの２つの遺伝子に同時に変異が起こると致死す
るという現象である。このことは、Ａの遺伝子産物がＢ
の遺伝子産物と、生命活動に必須の役割を共有している
と考えられる。例えば、Ａのコードする遺伝子産物の機
能を薬物Ｃが特異的に抑制する場合、分裂酵母の培地に
薬物Ｃを添加しても分裂酵母は死滅しない。また、Ｂと
いう遺伝子に変異があったとしても、分裂酵母はそれ自
体では死滅しない。しかし、Ｂという遺伝子に変異があ
る分裂酵母の培地に薬物Ｃを添加すると分裂酵母は死滅
する。

【００１２】さらに具体的には、野生型の分裂酵母は、
通常、カルシニューリンの触媒サブユニットとＦＫＢＰ
とをコードする遺伝子をそれぞれ有しており、野生型の
分裂酵母の培地に、カルシニューリンの酵素活性を抑制
する薬物を添加しても、この分裂酵母は生育することが
できる。しかし、突然変異によりある種の遺伝子、例え
ば、ＰＩ４Ｐ５キナーゼの触媒サブユニットをコードす
る遺伝子に変異が発生した分裂酵母の培地に、カルシニ
ューリンの酵素活性を阻害する薬物を添加すると、この
分裂酵母の変異体は死滅する。すなわち、カルシニュー
リンとＰＩ４Ｐ５キナーゼは生命活動に必須の役割を共
有していると考えられる。

【００１３】このようなことから、本発明のスクリーニ
ング方法は、カルシニューリン遺伝子破壊によって合成
致死となり得る分裂酵母(fission yeast Schizosacchar
omyces pombe）の変異体を用いることにより実現するこ
とができる。なお、本発明の別の観点から、カルシニュ
ーリン遺伝子破壊によって合成致死となり得る分裂酵母
の変異体とは、生育がカルシニューリン活性に依存する
分裂酵母の変異体と置き換えることも可能である。つま
り、本発明のスクリーニング方法は、カルシニューリン
の有無あるいはそれを生成し得る遺伝子の有無、いいか
えるとカルシニューリン酵素活性の有無によって、生育
するか、死に至るかが決定される分裂酵母の変異体を用
いることにより実現することができる。

【００１４】このような分裂酵母の変異体は、発明者に
よって見出された変異体であり、免疫抑制薬感受性、さ
らに温度感受性を示し、its（Immunosuppressant and T
emperature Sensitive）ミュータントと呼ばれる。例え
ば、its１〜its８の８種類の変異体が使用可能である。
分裂酵母変異体its８、its３及びits２は、Ｓaccharomy
ces pombe its８、its３及びits２として、寄託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１８３３４、ＦＥＲＭ Ｐ−１８３３３及
びＦＥＲＭ Ｐ−１８３３２で、独立行政法人産業技術
総合研究所 特許生物寄託センターに、２００１年５月
１８日に寄託されている。なかでも、分裂酵母変異体it
s８及びits３が好ましい。

【００１５】its８は、図１に示すアミノ酸配列を有す
るたんぱく質をコードする遺伝子を有している（ＪＢＣ
Papers in Press, M009260200, １月３１日（２００
１）参照）。また、its３は、The Journal of Biologic
al Chemistry, vol. 275, No.45, p35600-35606(2000)
に記載されており、図２に示すアミノ酸配列を有するた
んぱく質をコードする遺伝子を有している。なお、分裂
酵母の変異体は、免疫抑制薬感受性を示し、カルシニュ
ーリン遺伝子破壊によって合成致死となり得る酵母であ
れば、特に限定されることなくその全てを使用すること
ができる。例えば、図１のアミノ酸配列において、１も
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミ
ノ酸配列を有するものであってもよい。ただし、本発明
者の研究によれば、例えば、its３変異体では、分裂酵
母の野生型its３遺伝子がコードするタンパク質開始コ
ドンから数えて、２８１番目のグリシンがアスパラギン
酸に置換しており、its８変異体では、分裂酵母の野生
型its８遺伝子がコードするタンパク質開始コドンから
数えて２８８番目のプロリンがセリンに置換している。

【００１６】カルシニューリン遺伝子破壊によって合成
致死となる分裂酵母(fission yeastSchizosaccharomyce
s pombe）変異体は、Moreno S., Klar and Nurse P.,
(1991) Methods Enzymol. 194, p795-823及びThe Journ
al of Biological Chemistry, vol. 275, No. 45, p356
00-35606 (2000)）に記載された方法に従って作製する
ことができる。

【００１７】カルシニューリンの酵素活性を抑制する化
合物と被検化合物との存在下に、上記カルシニューリン
遺伝子破壊によって合成致死となり得る分裂酵母変異体
（単に「変異体」と称する）を培養する。ここで、カル
シニューリンの酵素活性を抑制する化合物とは、免疫抑
制作用を示す化合物が挙げられ、具体的にはタクロリム
ス、シクロスポリン等が挙げられる。なかでも、タクロ
リムスが適している。変異体自体は、突然変異によって
すでに何らかの遺伝子破壊、例えば、イムノフィリン遺
伝子に機能異常が起こっているため、カルシニューリン
の酵素活性を抑制する化合物に対して感受性を示す。つ
まり、カルシニューリンの酵素活性を抑制する化合物を
その培地に添加すれば、変異体は死滅する。しかし、カ
ルシニューリンの酵素活性を抑制する化合物と被検化合
物との存在下に変異体を培養する場合に、変異体が死滅
せずに増殖すれば、被検化合物がカルシニューリンの酵
素活性を抑制する化合物に拮抗する、言い換えると、カ
ルシニューリンの酵素活性を抑制する化合物と被検化合
物との存在により、カルシニューリンの酵素活性は阻害
されなくなると判断することができる。よって、変異体
の増殖の有無を評価することにより、被検化合物がカル
シニューリン酵素活性抑制に対して、拮抗する活性を有
する化合物であるか否かをスクリーニングすることがで
きる。

【００１８】また、上記のスクリーニングをする前に、
あらかじめ、被検化合物がイムノフィリンに結合するか
否かを評価し、イムノフィリンに結合する化合物を予備
的にスクリーニングしておくことにより、イムノフィリ
ンに結合するが、カルシニューリンの酵素活性を抑制し
ない化合物を選択的にスクリーニングすることができ
る。ここで、イムノフィリンとしては、ＦＫＢＰと呼ば
れる結合タンパクが適当である。

【００１９】以下に、本発明の分裂酵母の変異体及びそ
れを用いた化合物のスクリーニング方法について詳細に
説明する。分裂酵母の変異体の作製 Moreno S., Klar and Nurse P., (1991) Methods Enzym
ol. 194, p795-823及びThe Journal of Biological Che
mistry, vol. 275, No. 45, p35600-35606 (2000)）に
記載された方法に従って変異体を作製した。まず、分裂
酵母(fission yeast Schizosaccharomyces pombe）の野
生株を、３００μＭのニトロソグアニジンで、６０分間
処理することにより変異を起こさせた。突然変異を起こ
して生き残った変異体をプレートに広げて、２７℃で、
４日間増殖させた。その後、レプリカ平板法により、増
殖したコロニーに３６℃の温度をかけ、０．５μｇ／ｍ
ｌのタクロリムスを添加して培養し、温度感受性及びタ
クロリムス感受性を示す変異体８種（its1〜its8)を単
離した。得られた変異体のうち、its8のアミノ酸配列
は、図１の配列を含んでいた。また、its 3のアミノ酸
配列は、図２の配列を含んでいた。

【００２０】実施例１ まず、直径１０ｃｍの培養皿に、約２０ｍｌの酵母用寒
天培地を、公知の方法（Moreno S., Klar and Nurse
P., (1991) Methods Enzymol. 194, p795-823）にした
がって調製した。この際に、タクロリムスを５０ｎｇ／
ｍｌ加えたもの、タクロリムスと種々の濃度の被検化合
物を加えたもの、被検化合物のみを加えたもの及び対照
としていずれの化合物も添加してないものを調製した。
被検化合物としては、ラパマイシン５μｇ／ｍｌを用い
た。培養皿を４分割し、分裂酵母の野生株（ＨＭ１２
３）と、its２と、its３と、its8とを滅菌した爪楊枝で
培養皿の培地に塗布し、２７℃で４日間培養した。４日
間の培養後、培養皿の分裂酵母の生育状態を観察した。
タクロリムスを加えた皿で、分裂酵母の野生株の領域で
は、対照及び被検化合物のみを加えたものと同様に分裂
酵母は生育した。一方、変異体であるits２、its３及び
its8の領域では、いずれも分裂酵母はすべて死滅した。

【００２１】タクロリムスと被検化合物との両方を添加
した皿では、変異体であるits２及びits8の領域では、
いずれも分裂酵母の生育を回復させたが、its3の生育は
わずかに回復させるのみであった。このことから、上記
分裂酵母の変異体、すなわちカルシニューリン遺伝子破
壊によって合成致死となり得る分裂酵母の変異体を用い
た場合、タクロリムスによってカルシニューリンの酵素
活性が抑制され、その結果、変異体は死滅することが分
かった。また、タクロリムスとともに、ラパマイシンを
添加した場合には、変異体は合成致死には至らないこと
から、被検化合物が、タクロリムスによるカルシニュー
リンの酵素活性の抑制を阻害することが分かった。

【００２２】実施例２ まず、１５ｍｌのキャップつき滅菌試験管に、５ｍｌの
酵母用液体培地を調製し、実施例１と同様にタクロリム
スや被検化合物を添加し、さらに、分裂酵母の野生株、
３種のits変異体をそれぞれ加えて、２７℃で２日間振
とう培養した。２日後の液体培地を濁度計により測定
し、分裂酵母の生育状態を調べた。その結果、実施例１
と同様に、タクロリムスを加えた、分裂酵母の野生株の
試験管では、対照及び被検化合物のみを加えたものと同
様に分裂酵母は生育した。一方、変異体であるits２、i
ts３及びits8の試験管では、いずれも分裂酵母はすべて
死滅した。

【００２３】タクロリムスと被検化合物との両方を添加
した試験管では、変異体であるits２及びits８の試験管
で、いずれも分裂酵母の生育を回復させたが、its3の生
育はわずかに回復させるのみであった。このことから、
上記分裂酵母の変異体を用いた場合、タクロリムスによ
ってカルシニューリンの酵素活性が抑制され、その結
果、変異体は死滅することが分かった。また、タクロリ
ウムとともに、ラパマイシンを添加した場合には、変異
体は合成致死には至らないことから、被検化合物が、タ
クロリウムによるカルシニューリンの酵素活性の抑制を
阻害することが分かった。

【００２４】

【発明の効果】本発明によれば、カルシニューリン遺伝
子破壊によって合成致死となり得る分裂酵母変異体に、
カルシニューリンの酵素活性を抑制する化合物とともに
被検化合物を添加した後、前記分裂酵母変異体を所定期
間培養して、該分裂酵母変異体の増殖の有無を測定する
ことにより、カルシニューリンの酵素活性の抑制に対し
て拮抗する化合物をスクリーニングできるため、分裂酵
母の変異体を培養するための簡単な培養設備で、さら
に、分裂酵母の増殖の有無を測定するという簡便な工程
により、被検化合物の中から所望の作用を示すもののみ
をスクリーニングでき、高い処理量で化合物をスクリー
ニングすることが可能となる。しかも、本発明によれ
ば、スクリーニングが分裂酵母の死滅を指標とするもで
はなく、増殖を指標とするために、細胞毒性を有するな
ど、結果的に分裂酵母の増殖を阻害する化合物を、容易
に除外することが可能となる。

【００２５】また、インビトロのスクリーニングでは、
化合物の細胞への透過性までも測定できないが、分裂酵
母自体をスクリーニングに使用するために、分裂酵母と
同様の細胞膜を有する哺乳動物の細胞内への浸透が可能
な化合物をスクリーニングすることができる。したがっ
て、本発明の方法によれば、カルシニューリンの酵素活
性を阻害しない化合物を容易かつ簡便にスクリーニング
することができることから、副作用の少ない新規免疫抑
制薬、外傷後の神経治癒を促進する薬物の開発に有用で
ある。

【００２６】特に、あらかじめ、被検化合物がイムノフ
ィリンに結合するか否かを評価し、イムノフィリンに結
合する被検化合物を予備的にスクリーニングしておけ
ば、薬物がイムノフィリンと結合することにより、カル
シニューリンの酵素活性を阻害しない化合物を効率的に
スクリーニングすることが可能となる。また、カルシニ
ューリンの酵素活性を抑制する化合物がタクロリムスで
あり、イムノフィリンがＦＫＢＰである場合には、特定
の結合タンパクであるＦＫＢＰとの結合を介してカルシ
ニューリンの酵素活性の抑制に対して拮抗する化合物を
スクリーニングすることが可能となる。同様に、カルシ
ニューリンの酵素活性を抑制する化合物がシクロスポリ
ンであり、イムノフィリンがシクロフィリンである場合
でも、同じ変異体を用いてシクロスポリンに拮抗する化
合物をスクリーニングすることが可能となる。さらに、
分裂酵母の変異体its８等を用いることにより、上記の
スクリーニング方法を簡便かつ安価に実現することがで
きる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の分裂酵母の変異体its８の遺伝子のア
ミノ酸配列を示す図である。

【図２】本発明の分裂酵母の変異体its３の遺伝子のア
ミノ酸配列を示す図である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 イムノフィリンへの結合を介してカルシ
   ニューリンの酵素活性を抑制する化合物と被検化合物と
   の存在下、カルシニューリン遺伝子破壊によって合成致
   死となり得る分裂酵母変異体を培養して、該分裂酵母変
   異体の増殖の有無を測定することによりイムノフィリン
   には結合するがカルシニューリン酵素活性を抑制しない
   被検化合物をスクリーニングすることを特徴とする化合
   物のスクリーニング方法。
2. 【請求項２】 被検化合物がイムノフィリンに結合する
   か否かをあらかじめ測定し、イムノフィリンに結合する
   被検化合物を予備的にスクリーニングする請求項１に記
   載の方法。
3. 【請求項３】 カルシニューリンの酵素活性を抑制する
   化合物が、タクロリムス又はシクロスポリンである請求
   項１又は２に記載の方法。
4. 【請求項４】 イムノフィリンが、ＦＫＢＰ又はシクロ
   フィリンである請求項２に記載の方法。
5. 【請求項５】 カルシニューリン遺伝子破壊によって合
   成致死となり得る分裂酵母変異体が、免疫抑制薬感受性
   を示す分裂酵母である請求項１〜４のいずれか１つに記
   載の方法。
6. 【請求項６】 カルシニューリン遺伝子破壊によって合
   成致死となり得る分裂酵母変異体が、分裂酵母の野生型
   its８遺伝子がコードするタンパク質開始コドンから数
   えて２８８番目のプロリンがセリンに置換したアミノ酸
   配列を有する遺伝子を含む請求項５に記載の方法。