JP2003088368A - プレニルアルコールの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 プレニルアルコールの製造方法の提供。 【解決手段】 翻訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝
子の転写産物量を減少できるように変異させた変異型細
胞を培養し、得られる培養物からプレニルアルコールを
採取することを特徴とするプレニルアルコールの製造方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、プレニルアルコー
ルの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体内でのテルペノイド（イソプレノイ
ド）合成は、アリル性二リン酸基質にイソペンテニル二
リン酸（isopentenyl diphosphate）(IPP, C₅)を順次縮
合することによって直鎖プレニル二リン酸であるゲラニ
ル二リン酸（geranyl diphosphate (GPP, C₁₀ )）、フ
ァルネシル二リン酸（farnesyl diphosphate (FPP,
C₁₅)）、ゲラニルゲラニル二リン酸（geranylgeranyl d
iphosphate (GGPP, C₂₀)）が生合成されるところから始
まる（図1）。図1中で、枠で囲まれた文字は酵素を表
し、hmgRはヒドロキシメチルグルタリルCo-A（hydroxym
ethyl glutaryl-CoA：HMG-CoA）還元酵素、GGPSはGGPP
合成酵素、FPSはFPP合成酵素を示す。

【０００３】プレニル二リン酸のなかでも、FPPは最も
重要な生合成中間体であり、膨大な種類のテルペノイド
類、例えば、エルゴステロール（プロビタミンD₂）を含
むステロイド類、キノン（ビタミンK, VK）の側鎖、セ
スキテルペン類、スクアレン（SQ）、ファルネシル化タ
ンパク質のアンカー分子、ドリコール、バクトプレノー
ル、天然ゴムなどの合成前駆体である。

【０００４】GGPPもまた、生体内では重要な生合成中間
体であり、フィトエン、リコペン、フィカプレノール、
レチノール（ビタミンA, VA）、β-カロテン（プロビタ
ミンA）、フィロキノン（ビタミンK₁, VK₁）、トコフェ
ロール類（ビタミンE, VE）、ゲラニルゲラニル化タン
パク質のアンカー分子、葉緑素の側鎖、ジベレリン、ア
ーキアのエーテル型脂質などを始めとする化合物の生合
成に必須である。

【０００５】これら炭素数20までのプレニル二リン酸は
生体内ではtrans型（（E）型）に縮合し、（E,E）-FP
P、(E,E,E)-GGPPであることが知られており、これら炭
素数15又は20までの全trans型((all-E)型)由来の幾何異
性を有するプレニル二リン酸又はプレニル基を前駆体と
して生理活性のある化合物の合成が行われる（K. Ogura
and T. Koyama, (1998) Chemical Reviews, 98, 1263-1
276; IUPAC-IUB JointCommission on Biochemical Nome
nclature (JCBN) Prenol nomenclature, Recommendatio
ns 1986, (http: //www. chem. qmw. ac. uk /iupac /m
isc /prenol. html)）。炭素数20又は15以下のプレニル
二リン酸でcis型（（Z）型）幾何異性を持つ唯一の例外
は、ネロールに代表されるモノテルペノイドの前駆体と
して知られる炭素数10のネリル二リン酸であるが、この
物質は、アリル性二リン酸基質としてジメチルアリル二
リン酸（DMAPP; 3,3-dimethylallyl diphosphate）にIP
Pが縮合して合成されるのか、炭素数10のtrans型((E)
型)幾何異性体であるゲラニル二リン酸（GPP）の異性化
によって合成されるのか明らかになっていない。cis型
（（Z）型）に縮合合成して合成されるイソプレノイ
ド、例えば、ドリコール、バクトプレノール（ウンデカ
プレノール）、フィカプレノール又は天然ゴムも、アリ
ル性プライマー基質として（E,E）-FPP又は(E,E,E)-GGP
Pから合成される（K. Ogura and T. Koyama, (1998) Ch
emical Reviews, 98, 1263-1276; IUPAC-IUB Joint Com
mission on Biochemical Nomenclature (JCBN) Prenol
nomenclature, Recommendations 1986, (http: //www.
chem. qmw. ac. uk /iupac /misc/prenol. html)）。

【０００６】(E,E)-FPPのアルコール誘導体である(E,E)
-ファルネソール(farnesol)(FOH, C ₁₅)、その三級アル
コールの異性体である(E)-ネロリドール(nerolidol)(NO
H, C_{1 5})、又は(E,E,E)-GGPPのアルコール誘導体である
(E,E,E)-ゲラニルゲラニオール（geranylgeraniol)((E,
E,E)-GGOH, C₂₀)等は、香料として用いられる精油中の
芳香物質として知られるが、薬理作用物質として有用な
上記ビタミン類をはじめとする化合物の合成出発物質と
してもまた重要な物質である（図1）。

【０００７】IPPの生体内での合成は、すべてメバロン
酸経路（アセチル補酵素A（acetyl-CoA）からメバロン
酸を経てIPPを合成する経路）によると考えられてきた
が、1980年代末より、M. Rohmerらがバクテリアを用い
て新しいIPP合成経路を明らかにした。これは、非メバ
ロン酸経路、DXP (1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate)経
路、MEP （2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate）経
路又はRohmer経路と呼ばれており、グリセルアルデヒド
3-リン酸とピルビン酸から1-deoxy-D-xylulose 5-phosp
hateを経てIPPを合成する経路である。つまり、現在で
はIPP合成経路としてメバロン酸経路と非メバロン酸経
路の二つの主要経路が知られていることになる。

【０００８】FOHやNOHは、精油等の天然物から少量調製
される以外には、現在化学合成法により合成されてい
る。また、GGOHも化学合成法により合成されている（特
開平8-133999号公報）。化学合成法で合成されるFOH、N
OH又はGGOHは、一般的には炭素骨格が同じであるが、二
重結合が(E)-型(trans型)と(Z)-型(cis型)の混合物とし
て得られる。(all-E)-型である(E,E)-FOH、(E)-NOH又は
(E,E,E)-GGOHは生物の代謝経路で合成される幾何異性を
持つ化合物であり、工業的利用価値を有する。(E,E)-FO
H、(E)-NOH又は(E,E,E)-GGOHを純粋な形で得るために
は、カラムクロマトグラフィーや精密蒸留などを利用し
た精製が必要である。しかし、熱的に不安定なアリルア
ルコール(allylalcohol)であるFOHとその異性体であるN
OHの精密蒸留、あるいはGGOHの精密蒸留は困難である。
また、カラムクロマトグラフィーによる精製は、多量の
溶媒充填剤を必要とし、順次溶出してくる各画分を分析
しながら回収し、さらに溶媒を除去しなければならない
など、操作が煩雑でコストも高く、工業実施には適さな
い。実際、実験用試薬として市販されている(E,E)-FO
H、(E,E,E)-GGOHは非常に高価である。そこで、(E)-、
(Z)-幾何異性体の生成制御や反応産物の繰り返し構造な
どの特徴から、(E,E)-FOH（以下「FOH」と記す）、(E)-
NOH（以下「NOH」と記す）、(E,E,E)-GGOH（以下「GGO
H」と記す）などの、cis-,trans-((Z)-, (E)-)異性体混
合物でないいわゆる活性型プレニルアルコールの純品を
大量に生産できる系の確立が望まれている。

【０００９】FOH、NOHやGGOHの生体内での合成基質は、
例えば出芽酵母であるサッカロマイセス・セレビシアエ
(Saccharomyces cerevisiae)の細胞内ではメバロン酸経
路を経て供給されるが、そのキー酵素と考えられるHMG-
CoA還元酵素を利用しても、FOHやGGOHに比べはるかに安
価に市販されている物質であるスクアレンの蓄積量が上
がることしか知られていない(特開平5-192184号公報；
Donald et al. (1997)Appl. Environ. Microbiol. 63,
3341-3344)。また、スクアレン合成酵素遺伝子ERG9の変
異導入によりスクアレン合成酵素遺伝子欠損株（ATCC64
031）を作製し、かつ、ステロール取り込み能を獲得し
た特別な出芽酵母を培養すると、培養液1リットルあた
り1.3mgのFOHを蓄積することが知られている (Chambon
et al.,(1990) Curr. Genet., 18, 41-46)。ATCC64031
は、我々がスクアレン合成酵素遺伝子ERG9の塩基配列決
定を行ったところ、ERG9遺伝子コード領域に置換変異が
導入された結果スクアレン合成酵素遺伝子欠損株である
erg9株になり、その結果1.3mg/lのFOH生産性を獲得して
いることが確認された。ATCC64031のスクアレン合成酵
素遺伝子コード領域に第745ヌクレオチドのCがTに、第7
97ヌクレオチドのTがGに2箇所置換変異しており、結果
としてコードするポリペプチドの第249アミノ酸残基のG
lnが終止コドンに（Q249STOP）、第266アミノ酸残基のI
leがArgに（I266R）置換変異し、コードするポリペプチ
ドの第249アミノ酸残基以降が欠失した酵素活性の無い
変異型スクアレン合成酵素を発現していたことがわかっ
ている。しかし、通常の株でERG9を欠損させても、生育
に必須なエルゴステロールが合成できず、かつ、通常培
養条件では外部からステロール類を取りこむ機能も無い
ため致死性となり、ERG9欠損株が得られず、FOH生産系
を構築することができない。また、(E)-NOH（以下「NO
H」と記す）の生合成法は知られていない。また、たと
え致死性を回避する新たな形質を付与できたとしても培
地中にエルゴステロール添加が必要になるなどの工業生
産には不利な条件が生じる。

【００１０】GGOHの生合成に関しては、特開平9-238692
号公報において、植物細胞培養により1リットル培養液
あたり0.66-3.25mgの生産が報告されているが、工業化
には適さない高価な植物細胞培養用培地が必要であるう
え培養にも光が必要であり、従来の精油等の天然物から
のGGOH調製に比べても実用的でなく、より工業化に適し
た生合成法、例えば微生物培養による生合成法は全く知
られていない。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、翻訳活性の
あるスクアレン合成酵素遺伝子転写産物量を減少させる
ことによって、プレニルアルコールを製造するための方
法を提供することを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意研究を行った結果、スクアレン合成酵
素遺伝子において翻訳活性を有する転写産物の量（「翻
訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝子転写産物量」と
いう）を減少させるために、スクアレン合成酵素遺伝子
の転写プロモーター領域を転写抑制型プロモーターで置
換してなる変異型細胞を転写抑制条件で培養することに
よってプレニルアルコール生産系の開発を行った。ま
た、HMG-CoA還元酵素遺伝子を代表とするIPP合成経路関
連酵素遺伝子又はそれらの変異型若しくは融合型遺伝子
を宿主細胞内で人為的に発現させる系を構築するため
に、恒常発現型又は誘導発現型転写プロモーターを含
み、各種栄養要求性マーカーを持った発現シャトルベク
ターの作製を行い、これに目的の遺伝子又はその変異型
遺伝子を組み込み、これを本発明の翻訳活性のあるスク
アレン合成酵素遺伝子転写産物量を減少できる変異型細
胞へ導入した。そして、その培養物からプレニルアルコ
ールを得、上記目的を達成することに成功し、本発明を
完成するに至った。

【００１３】すなわち、本発明は以下の通りである。 (1)翻訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝子転写産物
量が減少できるように変異させた変異型細胞を培養し、
得られる培養物からプレニルアルコールを採取すること
を特徴とするプレニルアルコールの製造方法。 (2)翻訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝子転写産物
量が減少できるように変異させた変異型細胞に、IPP合
成経路関連酵素遺伝子を含む発現用組換えDNA又はゲノ
ムインテグレート用DNAを導入して組換え体を作製し、
該組換え体を培養し、得られる培養物からプレニルアル
コールを採取することを特徴とするプレニルアルコール
の製造方法。

【００１４】(3)スクアレン合成酵素遺伝子の転写プロ
モーター領域を転写抑制型プロモーターで置換したプロ
モーター領域を含む変異型細胞を、転写抑制条件下で培
養し、翻訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝子転写産
物量を減少させることによって、得られる培養物からプ
レニルアルコールを採取することを特徴とするプレニル
アルコールの製造方法。 (4)スクアレン合成酵素遺伝子の転写プロモーター領域
を転写抑制型プロモーターで置換したプロモーター領域
を含み、翻訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝子転写
産物量を減少できるようにした変異型細胞に、IPP合成
経路関連酵素遺伝子を含む発現用組換えDNA又はゲノム
インテグレート用DNAを導入して組換え体を作製し、該
組換え体を転写抑制条件下で培養し、得られる培養物か
らプレニルアルコールを採取することを特徴とするプレ
ニルアルコールの製造方法。

【００１５】上記製造方法において、IPP合成経路関連
酵素遺伝子には、解糖系又はクエン酸回路に位置する化
合物からIPPが合成される反応にかかわる酵素遺伝子、
及び各種プレニル二リン酸合成酵素遺伝子が含まれる。
IPP合成経路関連遺伝子としてはメバロン酸経路関連酵
素遺伝子だけでなく、主に原核生物や、葉緑体などで近
年新たに見出されたIPP合成経路であるいわゆる非メバ
ロン酸経路（DXP(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate)経
路、MEP（2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate）経路
又はRohmer経路と呼ばれる場合もある）関連酵素遺伝子
も含まれる。

【００１６】また、上記製造方法において、転写抑制型
プロモーターとしては例えばGAL1プロモーターが挙げら
れ、GAL1プロモーター転写抑制条件としては例えばグル
コース含有培地を用いたものが挙げられ、IPP合成経路
関連酵素遺伝子として、例えば下記の(a) - (l)の遺伝
子からなる群から選ばれるいずれかの遺伝子が挙げられ
る。

【００１７】(a) ファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子 (b) ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子 (c) ヒドロキシメチルグルタリルCoA還元酵素遺伝子 (d) イソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼ遺伝子 (e) メバロン酸キナーゼ遺伝子 (f) アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ遺伝子 (g) ヒドロキシメチルグルタリル-CoA合成酵素遺伝子 (h) メバロン酸リン酸キナーゼ遺伝子 (i) メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素遺伝子 (j) 上記(a) - (i)の遺伝子の変異型遺伝子 (k) 上記(a) - (i)の遺伝子からなる群から選ばれる一
つの遺伝子又はその変異型遺伝子と、他の遺伝子又はそ
の変異型遺伝子との融合遺伝子（二つの遺伝子結合領域
に人工的な配列を挿入しても良い） (l) 上記(a) - (k)の遺伝子に、コードするポリペプチ
ドが小胞体シグナルを有するように、付加、置換又は挿
入変異を施した遺伝子

【００１８】上記融合遺伝子中の遺伝子結合領域には、
融合前のそれぞれの遺伝子がコードするポリペプチドが
適切に機能するコンフォメーションがとれるような人工
的なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を自由
に挿入することもできる。たとえばGly Serをコードす
る^5’GGGTCC^3’などである。小胞体シグナルとしては、
例えば、サッカロマイセス・セレビシアエの場合C末端
に位置するHis Asp Glu Leu（配列番号30、「HDEL配
列」という）、又はAspAsp Glu Leu配列（配列番号31）
が知られ、真核生物一般では、C末端に位置するLys Asp
Glu Leu（配列番号32）が知られ、機能は全く同等であ
る小胞体保留シグナル（ER retension signal）として
働くことがわかっている（B.Lewin “Genes V” (199
4), Oxford University Press, New York, U.S.A., pp.
279-318;B. Alberts et al. “Molecular Biology of T
he Cell, third edtion” (1994), Garland Publishin
g. Inc., New York, U.S.A., §12−§13）（これらを
総称し「HDEL配列等」とする）。またこれらC末端4アミ
ノ酸残基による小胞体保留シグナル以外のシステムによ
る小胞体移行蛋白質の一部分のドメイン、たとえば、小
胞体への輸送シグナルとして機能するN末端側のシグナ
ルペプチド ⁺H₃N MetMet Ser Phe Val Ser Leu Leu Leu
Val Gly Ile Leu Phe Trp Ala Thr Glu AlaGlu Gln Le
u Thr Lys Cys Glu Val Phe Gln（配列番号33）などを
用いることもできる（B.Lewin “Genes V” (1994), Ox
ford University Press, New York, U.S.A., pp.279-31
8; B. Alberts et al. “Molecular Biology of The Ce
ll, third edtion” (1994), Garland Publishing. In
c., New York, U.S.A., §12−§13）。

【００１９】遺伝子の付加、置換又は挿入変異により、
小胞体シグナルを付加、置換又は挿入したポリペプチド
は、野生型ポリペプチドにさらに4アミノ酸残基を付
加、置換又は挿入させた変異型ポリペプチドと見ること
もでき、ポリペプチドをコードする遺伝子は、野生型の
遺伝子にさらに1-12塩基程度のヌクレオチド配列を付
加、置換又は挿入した変異型遺伝子と見ることもでき
る。また、前記融合遺伝子がコードするポリペプチドも
また、野生型ポリペプチドに300アミノ酸残基以上のア
ミノ酸残基を付加、置換又は挿入させた変異型ポリペプ
チドと見ることもでき、融合遺伝子は野生型遺伝子に10
00塩基程度のヌクレオチド配列を付加、置換又は挿入さ
せた変異型遺伝子と見ることもできる。すなわち、シグ
ナルを新たに創出したアミノ酸残基をコードする遺伝子
又は融合遺伝子は、それ自体変異型遺伝子である。

【００２０】HDEL配列等をC末端に創出するためには置
換変異のほか、たとえば、１塩基の挿入によってフレー
ムがシフトしHDEL配列等を創出したり、2塩基の置換に
よってもともとのC末端（たとえばHDGIなど）からHDEL
配列等に変えることもできる。C末端付近にHDEL配列等
が存在していれば（例えばBTS1の場合）、ストップコド
ンを導入するだけでC末端にHDEL配列等を創出すること
もできる。さらに、C末端に新たな12ヌクレオチドを付
加してHDEL配列等をC末端に創出することもできる。

【００２１】また、宿主細胞としては、例えば酵母、例
えば、子嚢菌類（Ascomycota）の子嚢菌酵母、担子菌類
（Basidiomycota）の担子菌酵母、又は不完全菌類（Fun
gi Imperfecti）の不完全菌酵母を用いることができ
る。好ましくは、子嚢菌酵母、特に出芽酵母であるサッ
カロマイセス・セレビシアエ、キャンディダ・ユーティ
リス(Candida utilis)又はピキア・パストリス(Pichia
pastris)等、分裂酵母であるシゾサッカロマイセス・ポ
ンベ(Shizosaccharomyces pombe)等が用いられる。種だ
けでなく株もプレニルアルコールを生産することができ
る限り特に限定されるものではなく、例えばサッカロマ
イセス・セレビシアエの株としては、A451、YPH499、YP
H500、W303-1A又はW303-1Bなどが挙げられる。また、プ
レニルアルコールとしては、FOH、NOH及び/又はGGOHを
例示することができる。

【００２２】また、上記製造方法において、転写抑制条
件下で培養する前に、非転写抑制条件下で培養すること
もできる。転写抑制条件下での培養はグルコース含有培
地での培養であり、非転写抑制条件下での培養はガラク
トース含有培地での培養である。ファルネシル二リン酸
合成酵素遺伝子は配列番号２又は４に示されるアミノ酸
配列をコードし、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺
伝子は配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードし、
ヒドロキシメチルグルタリルCoA還元酵素遺伝子は配列
番号８に示されるアミノ酸配列をコードし、メバロン酸
二リン酸脱炭酸酵素遺伝子は配列番号10に示されるアミ
ノ酸配列をコードするものを使用することができる。ま
た、ヒドロキシメチルグルタリルCoA還元酵素遺伝子の
変異型遺伝子は、配列番号11、13及び15-24に示される
いずれかの塩基配列を含むものである。

【００２３】(5) 翻訳活性のあるスクアレン合成酵素遺
伝子転写産物量を減少できるように変異させた変異型細
胞。 (6) スクアレン合成酵素遺伝子の転写プロモーター領域
を転写抑制型プロモーターで置換したプロモーター領域
を含み、翻訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝子転写
産物量を減少できるように変異させた変異型細胞。以
下、本発明を詳細に説明する。

【００２４】

【発明の実施の形態】本発明者は、代謝工学的な手法を
用い、生体内で活性型プレニルアルコール、特にFOH、N
OH又はGGOHを生産させる系の開発に臨んだ。本発明で
は、宿主細胞として酵母、特に出芽酵母サッカロマイセ
ス・セレビシアエを選び、その酵母において、スクアレ
ン合成酵素遺伝子ERG9の転写プロモーター領域と考えら
れるゲノムDNA部分を、グルコースで転写抑制できる転
写抑制型プロモーターのひとつであるGAL1遺伝子の転写
プロモーターで置き換えた株（EUG株）を作製した。そ
して、好気的培養条件下ではステロール取り込み能がな
い通常の組換え宿主株を特別な添加物の無い一般的なグ
ルコース含有培地（YM7培地、YPD培地、SD培地など）で
好気的に培養するだけでプレニルアルコールを培養液内
に蓄積できる系を開発した。

【００２５】一般に、FPPは、FPP合成酵素の触媒によ
り、IPP及びDMAPPを基質として合成される。FPP以降の
経路としては、通常はFOHへの脱リン酸化反応は進行せ
ず、スクアレン合成酵素によるスクアレン・各種ステロ
ール合成、GGPP合成酵素によるGGPP・プレニル化蛋白質
合成、ヘキサプレニル二リン酸合成酵素、ヘプタプレニ
ル二リン酸合成酵素などの中鎖プレニル二リン酸合成酵
素によるヘキサプレニル二リン酸、ヘプタプレニル二リ
ン酸などの中鎖又は長鎖プレニル二リン酸・ユビキノン
合成、プレニル化蛋白質合成などに進行する（図1）(K.
Ogura and T. Koyama, (1998) Chemical Reviews, 98,
1263-1276）。つまり、翻訳活性のあるスクアレン合成
酵素遺伝子転写産物量を減少させ、細胞内のスクアレン
合成酵素活性を減少させると、FPPがある程度蓄積する
こと、FPPを基質とした反応経路の最終産物であるプレ
ニル化蛋白質やユビキノンが蓄積すること、又は生育必
須成分であるエルゴステロール合成ができなくなること
から生育阻害がかかることは予想できても、10mg/l又は
100mg/l以上の生産性を示すようなFOHの大量生産系を構
築できることは予想できない。さらにはNOHや、GGPP脱
リン酸化物のGGOHの生産系が得られることも予想できな
い（図1）。また、IPP合成経路関連酵素の酵素活性を増
大させることによってIPP合成を増強させても、FPP合成
の方向に効果が出るのかGGPP合成の方向に効果が出るの
か予想できないし、ましてや脱リン酸化物のFOH・GGOH
の高生産やFOH異性体のNOHの高生産は期待できない（図
1）。

【００２６】本発明は、翻訳活性のあるスクアレン合成
酵素遺伝子転写産物量を減少できるように当該細胞を変
異させ、その変異型細胞を培養し、翻訳活性を有するス
クアレン合成酵素遺伝子の転写産物量を減少させること
により、一般的な代謝経路マップ（Gerhard Michal編 B
iochemical Pathways; An Atlas of Biochemistry and
Molecular Biology (1999) John Wiley & Sons, Inc.,
New York）中にも明記されていないFOH、NOHやGGOH等の
プレニルアルコールを産生することができることを見出
し、プレニルアルコールの生物学的な大量生産系を開発
したものである。また、IPP合成経路関連酵素遺伝子、
その変異型遺伝子、それらの融合遺伝子等を転写ユニッ
トとして本発明で得られるプレニルアルコール生産型の
変異型細胞に導入し、さらなるプレニルアルコールの生
物学的な大量生産系を開発したものである。

【００２７】1．スクアレン合成酵素転写産物変異株の
作製 本発明において使用する変異型細胞は、宿主細胞のスク
アレン合成酵素遺伝子のコード領域には置換、挿入また
は付加のどの変異も導入しておらず、翻訳活性のあるス
クアレン合成酵素遺伝子転写産物量を減少させることが
できるように改変したスクアレン合成酵素遺伝子を含む
ものである。翻訳活性のある転写産物量を減少させるに
は、たとえば遺伝子の転写活性を抑制させ転写産物量自
体を減少させる方法や、アンチセンスRNAを利用するこ
とによって転写されたｍRNAの翻訳活性を抑制する方法
などがある。転写活性を抑えるには、例えば宿主ゲノム
に含まれるスクアレン合成酵素遺伝子の転写プロモータ
ー領域を転写抑制型プロモーターで置換したり、スクア
レン合成酵素遺伝子の転写に関わる領域に転写抑制活性
のある塩基配列を作出すればよい。また、翻訳活性を抑
制するには、たとえばスクアレン合成酵素遺伝子に対す
るアンチセンスRNAを転写する遺伝子を過剰発現させれ
ばよい。アンチセンスRNAとは標的の遺伝子から転写さ
れたRNAに対して相補的な塩基配列を有しているRNAのこ
とで、原核細胞、真核細胞のどちらの転写翻訳系システ
ムにおいても翻訳活性のあるmRNA量を低下させ、遺伝子
発現のリプレッサーとしての機能を持つRNAのことであ
る。例えば「遺伝子の発現と制御I（シリーズ分子生物
学の進歩）」日本分子生物学会 編・丸善株式会社1989
年6月30日発行・ISBN4-621-03375-1の第5章「細菌膜蛋
白質合成の制御」（水野猛 著）では、アンチセンスRNA
を用いてエシェリシア・コーライの遺伝子ompFの翻訳活
性のあるmRNA量を低下させOmpF蛋白質合成を抑制できる
ことが報告されている。水野がこの著書で述べているよ
うにある遺伝子のアンチセンスRNAは天然に存在し、タ
ーゲット遺伝子を決めれば遺伝子工学的手法によって発
現抑制活性のある人工アンチセンスRNAを作製すること
は当業者なら容易である。人工アンチセンスRNA技術
は、細菌であるエシェリシア・コーライだけでなく高等
生物、例えば哺乳類（マウス）、昆虫（ドロソフィラ・
メラノガスター（Drosophila melanogaster））や被子
植物（トマト）を宿主とした場合でも知られている（Mi
zunoet al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 8
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ol., 101, 1094-1099;Coleman et al. (1984) Cell, 3
7, 429-36; Han et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A., 88, 4313-4317; Hackett et al. (2000) Pl
ant Physiol., 124, 1079-86）。

【００２８】本発明において使用される宿主細胞とし
て、たとえば、発酵工業に古来から広く用いられ、IPP
合成経路としてメバロン酸経路を持ち、遺伝子組換えに
関する様々な手法を駆使できるもの、例えば出芽酵母等
の酵母を例示することができる。出芽酵母としては、例
えばサッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomycesc
erevisiae）を例示できるが、必ずしもサッカロマイセ
ス・セレビシアエなどの酵母に限定されるわけではな
く、スクアレン合成酵素遺伝子を保持している他の様々
な細胞を宿主に用いることができる。そして、スクアレ
ン合成酵素遺伝子コード領域に置換、挿入または欠失の
変異を導入する方法によってスクアレン合成酵素欠損を
導入しなくても、翻訳活性のあるスクアレン合成酵素遺
伝子の転写産物量を減少させれば、各種活性型プレニル
アルコールを生産させることができる。

【００２９】翻訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝子
の転写産物量を減少させるためには、例えば転写抑制型
プロモーターを利用することができる。転写抑制型プロ
モーターとしては各種培養条件で転写制御できる転写プ
ロモーターであればどの転写プロモーターでも良い。例
えば、グルコース含有培地で転写抑制されるGAL1, GAL
2, GAL7, GAL10, GAL80, MEL1、グルコース枯渇条件で
転写抑制されるADH1, ENO2、高リン酸条件で転写抑制さ
れるPHO5, PHO81、細胞周期のG₁期以外で転写抑制され
るHO、などの遺伝子の転写を司る転写プロモーターを挙
げることができる。他にも、L. Wodicka et al., (199
7) Nautre Biotechnology, 15, 1359-1367で報告されて
いるような、ある培養条件で転写産物が相当量検出され
るにもかかわらず別の培養条件では転写産物量が著しく
低下する遺伝子の転写を司る転写プロモーターも転写抑
制型プロモーターとして利用できる。例えば、(i)通常
栄養培地（rich medium）で転写産物が検出されないが
最小培地（minimal medium）で相当量検出される遺伝子
HSP12, INO1, YBR147W, YGR243Wなどの転写を司る転写
プロモーター、あるいは(ii)最小培地で転写産物が検出
されないが通常栄養培地で相当量検出される遺伝子YDR0
46C, GNP1, CHA1, PTR2などの転写を司る転写プロモー
ターなどが挙げられる。さらに、出芽酵母以外の転写抑
制型転写プロモーターを用いることも可能である。プロ
モーターは、必ずしも宿主細胞内で転写抑制活性を有す
るものである必要はなく、例えば、転写抑制因子遺伝子
を宿主細胞に導入し、その転写因子制御下で初めて転写
抑制されるタイプの転写プロモーターを用いることもで
きる。さらに、翻訳活性のあるスクアレン合成酵素転写
産物量を減少させることができれば、必ずしも宿主細胞
内で直接転写抑制制御、つまりmRNA合成制御が行える転
写プロモーターを利用する必要も無く、アンチセンスRN
Aなどの技術によって転写産物であるmRNAの翻訳活性を
不活性化させることによって、転写抑制型プロモーター
を利用した場合と同様に、スクアレン合成酵素遺伝子の
コード領域を改変せずに、プレニルアルコール生産させ
ることもできる。

【００３０】宿主細胞としてサッカロマイセス・セレビ
シアエを用い、細胞中のスクアレン合成酵素遺伝子転写
プロモーターを転写抑制型プロモーターで置換する方法
を以下に説明する。まず、酵母ゲノムデータベース（Sa
ccharomyces Genome Database (SGD); http://genome-w
ww.stanford.edu./Saccharomyces/）から、スクアレン
合成酵素遺伝子ERG9付近の遺伝子地図を引き出し、ERG9
転写プロモーター(ERG9p)置換用DNA断片増幅のためのPC
RプライマーDNAを設計した（図2）。

【００３１】次に、pYES2（図2C,図3）を制限酵素処理
した後、Klenow酵素で平滑末端化し、セルフライゲーシ
ョンにより2μ ori部分を削除したpYES2Δ（図2B）を鋳
型にしてPCR増幅することにより、形質転換体選択マー
カー遺伝子URA3と転写プロモーターGAL1pを含むDNA断片
を作製する。このDNAの一方の側に、ERG9遺伝子の一部
のDNAを、他方の側にERG9遺伝子の近傍に存在するYHR18
9WのDNAを連結して、形質転換用DNA断片を調製する（図
2A）。

【００３２】本発明において、変異型細胞を作製するた
めの宿主は特に限定されないが、工業上利用上重要な酵
母、例えば、子嚢菌類（Ascomycota）の子嚢菌酵母、担
子菌類（Basidiomycota）の担子菌酵母、又は不完全菌
類（Fungi Imperfecti）の不完全菌酵母を用いることが
できる。好ましくは、子嚢菌酵母、特に出芽酵母である
サッカロマイセス・セレビシアエ(S. cerevisiae)、キ
ャンディダ・ユーティリス(Candida utilis)又はピキア
・パストリス(Pichia pastris)等、分裂酵母であるシゾ
サッカロマイセス・ポンベ(Shizosaccharomyces pombe)
等が用いられる。サッカロマイセス・セレビシアエの場
合、変異導入のための宿主株として、例えば下記のA45
1、YPH499、YPH500、W303-1A、W303-1Bなどを使用する
ことができる。

【００３３】 A451 (ATCC200589, MATα can1 leu2 trp1 ura3 aro7) YPH499（ATCC76625, MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101
trp1-Δ63 his3- Δ 200 leu2- Δ 1, Stratagene , La
Jolla, CA） YPH500（ATCC76626, MATα ura3-52 lys2-801 ade2-101
trp1-Δ63 his3- Δ200 leu2- Δ 1, Stratagene） W303-1A（ATCC208352, MATa leu2-3 leu2-112 his3-11
ade2-1 ura3-1 trp1-1can1-100） W303-1B（ATCC208353, MATα leu2-3 leu2-112 his3-11
ade2-1 ura3-1 trp1-1 can1-100）

【００３４】DNA断片の形質転換は、公知の任意の手法
又は市販のキットを用いることができる。例えば、Zymo
Research (Orange, CA) より購入したFrozen EZ yeast
transformation II kitを用いて酵母にベクターの導入
を行う。宿主に導入した組換え用DNAは、相同組換えに
より宿主のゲノムDNAに組み込まれる。これを利用し
て、スクアレン合成酵素遺伝子ERG9の転写プロモーター
領域を転写抑制型プロモーターであるGAL1プロモーター
で置換し、変異株を得る。

【００３５】翻訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝子
ERG9の転写産物量を減少させるために、ERG9プロモータ
ーを転写抑制型プロモーターであるGAL1プロモーターで
置換し、取得した組換え体をEUG (ERG9p::URA3-GAL1p)
株と名付けた。A451由来のクローンをEUG1-10、YPH499
由来のクローンをEUG11-20、YPH500由来のクローンをEU
G21-30、W303-1A由来のクローンをEUG31-50、W303-1B由
来のクローンをEUG51-70とする。

【００３６】EUG1-10 (A451, ERG9p::URA3-GAL1p)は、
本発明において樹立されたA451由来株であり、翻訳活性
のあるスクアレン合成酵素遺伝子ERG9転写産物量を減少
させることができる株である。この株は、スクアレン合
成酵素遺伝子ERG9のポリペプチドコード領域、形質転換
体選択マーカー遺伝子URA3及びERG9遺伝子座に転写プロ
モーターGAL1pを含む。

【００３７】EUG11-20 (YPH499, ERG9p::URA3-GAL1p)
は、本発明において樹立されたYPH499由来株であり、翻
訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝子ERG9転写産物量
を減少させることができる株である。この株は、ERG9の
ポリペプチドコード領域、URA3及びERG9遺伝子座にGAL1
pを含む。

【００３８】EUG21-30 (YPH500, ERG9p::URA3-GAL1p)
は、本発明において樹立されたYPH500由来株であり、翻
訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝子ERG9転写産物量
を減少させることができる株である。この株は、ERG9の
ポリペプチドコード領域、URA3及びERG9遺伝子座にGAL1
pを含む。

【００３９】EUG31-50 (W303-1A, ERG9p::URA3-GAL1p)
は、本発明において樹立されたW303-1A由来株であり、
翻訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝子ERG9転写産物
量を減少させることができる株である。この株は、ERG9
のポリペプチドコード領域、URA3及びERG9遺伝子座にGA
L1pを含む。

【００４０】EUG51-70 (W303-1B, ERG9p::URA3-GAL1p)
は、本発明において樹立されたW303-1B由来株であり、
翻訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝子ERG9転写産物
量を減少させることができる株である。この株は、ERG9
のポリペプチドコード領域、URA3及びERG9遺伝子座にGA
L1pを含む。

【００４１】本発明において、このようにして得られた
EUG株をGAL1pの転写抑制条件であるグルコース含有培地
で培養し（培養法は後述）、ATCC64031で公知になって
いるようなスクアレン合成酵素遺伝子コード領域に置
換、挿入または欠失の変異を導入することをせずに、翻
訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝子転写産物量を減
少させることにより、エルゴステロールや界面活性剤な
どの特別な添加物無しに各種プレニルアルコールを生産
することができる。

【００４２】2．発現用組換えDNA又はゲノムインテグレ
ート用DNA断片の作製 本発明において、上記EUG株を単独で培養するほか、IPP
合成経路関連酵素遺伝子を含む発現用組換えDNA又はゲ
ノムインテグレート用DNA断片を作製し、これを上記EUG
株に導入して培養してもよい。EUG株をさらに形質転換
するための発現用組換えDNAは、IPP合成経路関連酵素遺
伝子に、転写プロモーター及び転写ターミネーターDNA
を連結又は挿入することにより得ることができる。ま
た、IPP合成経路関連酵素遺伝子に、予め転写プロモー
ター及び転写ターミネーターが連結された遺伝子発現カ
セット（転写ユニット）を作製しておいて、これをベク
ターに組み込むこともできる。連結及び挿入の順序は任
意であるが、IPP合成経路関連酵素遺伝子の上流に転写
プロモーターを連結し、IPP合成経路関連酵素遺伝子の
下流に転写ターミネーターを連結することが好ましい。
本発明においては、適当なDNA、例えばベクターDNAに順
次IPP合成経路関連酵素遺伝子、転写プロモーター及び
転写ターミネーターを組み込んでもよく、転写方向が考
慮されていれば順不同で組み込んでもよい。また、遺伝
子発現を増強するエンハンサー配列、遺伝子発現を調節
する各種シスエレメントを転写ユニット周辺に組込んで
も良い。

【００４３】IPP合成経路関連酵素遺伝子としては、以
下のものを例示することができる。 (a) ファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子（FPP合成酵
素遺伝子） (b) ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子（GGPP合
成酵素遺伝子） (c) ヒドロキシメチルグルタリルCoA還元酵素遺伝子（H
MG-CoA還元酵素遺伝子） (d) イソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼ遺伝子（I
PPΔ-イソメラーゼ遺伝子） (e) メバロン酸キナーゼ遺伝子 (f) アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ遺伝子 (g) ヒドロキシメチルグルタリル-CoA合成酵素遺伝子 (h) メバロン酸リン酸キナーゼ遺伝子 (i) メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素遺伝子

【００４４】FPP合成酵素遺伝子としては、例えばサッ
カロマイセス・セレビシアエERG20（配列番号１）、エ
シェリシア・コーライispA (配列番号３)、バチルス・
ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilu
s)由来のFPP合成酵素遺伝子（特開平5-219961号公報、
米国特許5,786,192号）、シネココッカス・エロンガタ
ス（Synechococcus elongatus）由来のFPP合成酵素遺伝
子（C. Ohto et al., (1999) Plant Mol. Biol., 40, 3
07-321）などが挙げられる。GGPP合成酵素遺伝子として
は、例えばサッカロマイセス・セレビシアエBTS1（配列
番号５）、スルフォロバス・アシドカルダリウス(Sulfo
lobus acidocaldarius)crtE（C. Ohto et al., (1998)
Biosci. Biotechnol. Biochem., 62, 1243-1246、特開
平7-308913号公報、米国特許5,773,273号）、サーマス
・サーモフィラス(Thermus thermophilus)Tth GGPP合成
酵素遺伝子（C. Ohto et al., (1999) Biosci. Biotech
nol. Biochem., 63, 261-270、特開平9-107974号公報、
米国特許6,107,072号）、シネココッカス・エロンガタ
ス（Synechococcus elongatus）由来のGGPP合成酵素遺
伝子（C. Ohto et al., (1999) Plant Mol. Biol., 40,
307-321）などが挙げられる。HMG-CoA還元酵素遺伝子
としては、サッカロマイセス・セレビシアエHMG1（配列
番号７）、HMG2、ストレプトマイセス(Streptomyces s
p.)CL190由来のHMG-CoA還元酵素遺伝子（S Takahashi e
t al., (1999) J. Bacteriol., 181, 1256-1263、）な
どが挙げられる。IPPΔ-イソメラーゼ遺伝子としては、
エシェリシア・コーライ（Escherichia coli）由来のid
i（配列番号25）などが挙げられる。その他のIPP合成経
路関連酵素遺伝子としては、以下の塩基配列を有するも
のを例示することができる。

【００４５】メバロン酸キナーゼ遺伝子ERG12（配列番
号26） アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ遺伝子ERG10
（配列番号27） HMG-CoA合成酵素遺伝子HMGS (ERG13)（配列番号28） メバロン酸リン酸キナーゼ遺伝子ERG8（配列番号29） メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素遺伝子ERG19（配列番号
7）

【００４６】また、宿主によっては非メバロン酸経路が
IPP合成の主要経路になっているので、IPP合成経路関連
遺伝子として非メバロン酸経路関連酵素遺伝子、たとえ
ばDXP合成酵素遺伝子、DXP還元異性化酵素遺伝子、MEP
シチジル転移酵素遺伝子、CDP-MEキナーゼ遺伝子、MECD
P合成酵素遺伝子など(K. Kaneda et al., (2001) PNAS,
98, 932-937、T. Kuzuyama et al., (2000) J. Bacter
iol., 182, 891-897、T. Kuzuyama et al., (2000) J.
Biol. Chem., 275, 19928-19932、S. Takahashi et a
l., (1998) PNAS, 95, 9879-9884)も利用することがで
きる。

【００４７】これらの遺伝子は、公知の遺伝子単離方法
により、又は市販のキットを用いて当業者であれば容易
に得ることができる。また、本発明においては、上記IP
P合成経路関連酵素遺伝子の変異体（変異型遺伝子）を
使用することも可能である。上記IPP合成経路関連酵素
遺伝子の変異型は、その一部の領域（例えばHMG-CoA還
元酵素遺伝子では最大で2217塩基）が欠損した欠失型
や、野生型遺伝子又はこれら欠失型遺伝子の塩基配列の
うち1個又は数個-10数個の塩基が欠失、付加、置換又は
挿入した変異型遺伝子でもよい。1000個程度の塩基を付
加、置換又は挿入させることもできる。従って、変異型
遺伝子によりコードされるアミノ酸配列においても、IP
P合成経路関連酵素のアミノ酸配列（例えばFPP合成酵
素,配列番号２；GGPP合成酵素,配列番号６；野生型HMG-
CoA還元酵素,配列番号８）のうち1個又は数個（例えば1
個-10個、好ましくは1個-3個）、さらには300個以上の
アミノ酸に欠失、付加、置換又は挿入等の変異が生じて
もよく、野生型HMG-CoA還元酵素のアミノ酸配列（配列
番号８）のうち最大で739個のアミノ酸が欠失した欠失
型や、これら欠失型酵素から1個又は数個（例えば1個-1
0個、好ましくは1個-3個）のアミノ酸に欠失、置換又は
付加等の変異が生じてもよい。野生型FPP合成酵素に4ア
ミノ酸を付加した変異型酵素FHDEL、野生型FPP合成酵素
C末端側に300以上のアミノ酸を付加した変異型酵素であ
るFGGとFGGHDEL、野生型FPP合成酵素N末端側に300以上
のアミノ酸を付加した変異型酵素であるGGF、野生型FPP
合成酵素N末端側とC末端側にそれぞれ300以上と4つのア
ミノ酸を付加したGGFHDEL、野生型GGPP合成酵素C末端側
に300以上のアミノ酸を付加した変異型酵素であるGGFと
GGFHDEL、野生型GGPP合成酵素N末端側に300以上のアミ
ノ酸を付加した変異型酵素であるFGG、野生型GGPP合成
酵素N末端側に300以上のアミノ酸を付加しさらにC末端
側の10個のアミノ酸を欠失させたFGGHDELが変異型酵素
の例として挙げられる。

【００４８】また、本発明において使用することができ
る変異型遺伝子としては、ERG20の3’側に12塩基を付加
したpRS435FHDEL中の変異型ERG20、ERG20の3’側にBTS1
とGly Alaをコードする塩基配列約1000塩基を付加したp
RS435FGG中の変異型ERG20遺伝子、これにさらに3’側の
30塩基を欠失させたpRS435FGGHDEL中の変異型ERG20遺伝
子、ERG20の5’側にBTS1とGly Alaをコードする塩基配
列約1000塩基を付加したpRS435GGF中の変異型ERG20遺伝
子、ERG20の5’側にBTS1とGly Alaをコードする塩基配
列約1000塩基を付加しさらに3’側に12塩基を付加したp
RS435GGFHDEL中の変異型ERG20遺伝子、BTS1の3’側の30
塩基を欠失させたpRS435GGHDEL中の変異型BTS1、BTS1の
3’側にERG20とGly Alaをコードする塩基配列約1000塩
基を付加したpRS435GGF中の変異型BTS1遺伝子、これに
さらに12塩基を付加したpRS435GGFHDEL中の変異型BTS1
遺伝子、BTS1の5’側にERG20とGly Alaをコードする塩
基配列約1000塩基を付加したpRS435FGG中の変異型BTS1
遺伝子、BTS1の5’側にERG20とGly Alaをコードする塩
基配列約1000塩基を付加しさらに3’側の30塩基を欠失
させたpRS435FGGHDEL中の変異型BTS1遺伝子が挙げられ
る。

【００４９】さらに、IPP合成経路関連酵素遺伝子をPCR
で増幅させる場合において、Taq DNAポリメラーゼ等の
忠実性（fidelity）の低いDNAポリメラーゼを用いたPCR
(polymerase chain reaction)で野生型DNAを増幅させた
DNA断片に生じる塩基の置換変異を「PCRエラー」とい
い、例えば、野生型HMG-CoA還元酵素遺伝子（配列番号
７）を鋳型に用いたときのPCRエラーによる塩基の置換
変異に起因する塩基配列を有するHMG-CoA還元酵素遺伝
子（「HMG1'」とする）（コードされるポリペプチドに
置換変異を生じ得る）も、本発明において使用すること
ができる。野生型HMG-CoA還元酵素遺伝子（配列番号
７）を鋳型にしたときの、PCRエラーによる塩基の置換
の態様を図4Aに示す。HMG1'は配列番号11に示す塩基配
列を有しており、これによってコードされるアミノ酸配
列を配列番号12に示す。図4Aにおいて、ヌクレオチドの
変異は、置換前の塩基（1文字表記）、HMG-CoA還元酵素
遺伝子の開始コドンの第1塩基を1としたときの塩基番
号、置換後の塩基（1文字表記）の順で表示してある。
アミノ酸の変異は、PCRエラー型HMG-CoA還元酵素のアミ
ノ酸配列において、置換前のアミノ酸残基（1文字表
記）、HMG-CoA還元酵素のアミノ酸番号、置換後のアミ
ノ酸残基（1文字表記）の順で表示してある。さらに、
上記PCRエラー型の塩基配列を部位特異的変異誘発法等
により一部修正することもでき、このような修正型のHM
G-CoA還元酵素（配列番号14）をコードする遺伝子（配
列番号13）も、本発明において使用することができる。

【００５０】また、HMG-CoA還元酵素の膜貫通ドメイン
と予想されている領域を欠損させた欠失体をコードする
HMG-CoA還元酵素遺伝子（PCRエラー型を含む）として、
例えば、PCRエラー型HMG-CoA還元酵素遺伝子HMG1'の欠
失型遺伝子HMG1Δの例を示す（図4B）。最上段は欠失の
ない遺伝子HMG1'である。細線（−）で表した部分は欠
失した領域である。それぞれの欠失型遺伝子において、
HMG1'遺伝子（配列番号11）のうちどの領域を欠失させ
たのかを表1に示す。HMG1'欠失型遺伝子は、欠失のパタ
ーンに従ってHMG1Δxxyで表す。xxは欠失のパターン
を、yは作業番号（任意の数字）を表す。図4Bには、HMG
1Δ02yの例として「Δ026」を表示した（他の欠失パタ
ーンのものも同様に表示した）。欠失は最大で1317塩
基。

【００５１】

【表1】

【００５２】また、本発明においては、IPP合成経路関
連酵素遺伝子から選ばれる一つの遺伝子又はその変異型
と、他の遺伝子又はその変異型とを連結し、生産される
ポリペプチドが融合タンパク質になるようにすることも
できる。本発明において、このような2種類以上の遺伝
子を結合させ、発現産物が融合タンパク質になるように
構築した遺伝子を「融合遺伝子」という。融合遺伝子の
塩基配列は、一方の野生型遺伝子の塩基配列を基準にす
ると1000塩基程度の付加変異型遺伝子と考えることもで
き、それにコードされるポリペプチドは300アミノ酸残
基以上を付加した付加変異型ポリペプチドと捉えること
もできる。融合遺伝子を作製するには、一方のDNAを適
当な制限酵素で切断し、これに、同じ制限酵素で切断し
ておいた他方のDNAを、該DNAによりコードされるタンパ
ク質のアミノ酸配列の読み枠がずれないように連結する
方法などが採用される。融合遺伝子化に用いる複数の遺
伝子結合領域に、それぞれの遺伝子翻訳産物が適切に機
能するコンフォメーションがとれるように人工的なヌク
レオチド配列を自由に挿入することもできる。たとえば
Gly Serをコードする5’ GGGTCC 3’（図29の「GS」）
などである。

【００５３】さらに、本発明においては、IPP合成経路
関連酵素遺伝子若しくはその変異型遺伝子又は前記融合
遺伝子の発現により生産されるタンパク質が小胞体に移
行するように改変したポリペプチドをコードする遺伝子
を作製し利用することもできる。小胞体移行型ポリペプ
チドとしては、C末端の小胞体保留シグナル（ER retent
ion signal）としてサッカロマイセス・セレビシアエで
はHis Asp Glu Leu（配列番号30））又はAsp Asp Glu L
eu（配列番号31）、一般的な真核生物のC末端シグナル
としてはLys Asp Glu Leu配列（配列番号32）が知ら
れ、機能は全く同等である小胞体保留シグナル（ER ret
ension signal）として働くことがわかっている（B.Lew
in “Genes V” (1994), Oxford University Press, Ne
w York, U.S.A., pp.279-318; B. Alberts et al. “Mo
lecular Biology of The Cell, third edtion” (199
4), Garland Publishing. Inc., New York, U.S.A., §
12−§13）。またこれらC末端4アミノ酸残基による小胞
体保留シグナル以外のシステムによる小胞体移行蛋白質
の一部分のドメイン、例えば小胞体への輸送シグナルと
して機能するN末端側のシグナルペプチド ⁺H₃N Met Met
Ser Phe Val Ser LeuLeu Leu Val Gly Ile Leu Phe Tr
p Ala Thr Glu Ala Glu Gln Leu Thr Lys CysGlu Val P
he Gln（配列番号33）などを用いることもできる（B.Le
win “GenesV” (1994), Oxford University Press, Ne
w York, U.S.A., pp.279-318; B. Alberts et al. “Mo
lecular Biology of The Cell, third edtion” (199
4), Garland Publishing. Inc., New York, U.S.A., §
12−§13）。小胞体シグナルを付加、置換又は挿入させ
たポリペプチドは、野生型ポリペプチドにさらに4アミ
ノ酸残基程度を付加、置換又は挿入した変異型ポリペプ
チドと見ることもでき、ポリペプチドをコードする遺伝
子は、野生型の遺伝子にさらに12塩基程度のヌクレオチ
ド配列を付加させた付加又は置換変異型遺伝子と見るこ
ともできる。

【００５４】遺伝子組換えのために使用されるDNAは、
宿主細胞に遺伝的に保持される可能性のあるものであれ
ば特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、バクテリ
オファージ、レトロトランスポゾンDNA、酵母人工染色
体DNA（YAC: yeast artificial chromosome）等が挙げ
られる。また、ゲノムインテグレーションによる導入の
ための発現用組換えDNA断片としては、複製機能は必要
ではなく、PCR法又は化学合成により作製されたものを
使用することも可能である。

【００５５】プラスミドDNAとしては、例えばpRS413、p
RS414、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112又はpAUR123な
どのYCp型大腸菌-酵母シャトルベクター、pYES2又はYEp
13などのYEp型大腸菌-酵母シャトルベクター、pRS403、
pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101又はpAUR135などのYI
p型大腸菌-酵母シャトルベクター、大腸菌由来のプラス
ミド（pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC118、pUC11
9、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396
又はpTrc99AなどのColE系プラスミド、pACYC177又はpAC
YC184などのp15A系プラスミド、pMW118、pMW119、pMW21
8又はpMW219などのpSC101系プラスミド等）、枯草菌由
来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)などが挙げら
れ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charo
n21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）、φX17
4、M13mp18又はM13mp19等が挙げられる。レトロトラン
スポゾンとしては、Ty因子などが挙げられる。YAC用ベ
クターとしてはpYACC2などが挙げられる。

【００５６】宿主への組換えDNAの導入には、選択マー
カー遺伝子を用いる場合が多いが、マーカー遺伝子に起
因しない組換え体選抜の何らかのアッセイ法がある場合
は、必ずしもマーカー遺伝子は必要ではない。IPP合成
経路関連酵素遺伝子、その変異型酵素遺伝子、これらの
融合遺伝子、又はそれらがコードするポリペプチドに小
胞体シグナルを付加、置換又は挿入したポリペプチドを
コードする遺伝子を転写発現させるための転写プロモー
ターは、恒常発現型プロモーター又は誘導発現型プロモ
ーターを用いることができる。恒常発現型プロモーター
とは、主要代謝経路に関わる遺伝子の転写プロモーター
を意味し、どの生育条件でも転写活性を有するプロモー
ターである。誘導発現型プロモーターとは、特定の生育
条件で転写が誘導されるプロモーターである。

【００５７】転写プロモーターは、酵母等の宿主中で活
性を持つものであればいずれを用いてもよい。例えば酵
母での発現用として、GAL1プロモーター、GAL10プロモ
ーター、TDH3(GAP)プロモーター、ADH1プロモーター、T
EF2プロモーター等を用いることができる。また、大腸
菌での発現用として、trp、lac、trc、tacなどのプロモ
ーターを用いることができる。さらに、所望によりエン
ハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナ
ル、ポリA付加シグナル、選択マーカーなどを連結する
ことができる。なお、選択マーカーとしては、URA3、LE
U2、TRP1、HIS3、ADE2、LYS2などの栄養非要求性の表現
型を指標とするマーカー遺伝子や、Amp^r、Tet^r、Cm^r、K
m^r、AUR1-C、can1等の抗生物質耐性遺伝子が挙げられ
る。

【００５８】転写ターミネーターは、酵母等の宿主中で
活性を持つものであればいずれの遺伝子に由来するター
ミネーターを用いてもよい。例えば酵母での発現用とし
て、ADH1ターミネーター、CYC1ターミネーター等を用い
ることができる。本発明において遺伝子導入用組換えDN
Aとして作製された発現ベクターは、プラスミド名の次
に遺伝子名を表示することで命名及び識別することがで
きる。プラスミドとしてpRS434GAP又はpRS435GAPを使用
したときの発現ベクター名とその構成との関係を表2に
示す。例えば、プラスミドpRS434GAPにHMG1遺伝子を連
結した場合は「pRS434GAP-HMG1」のように、プラスミド
名の次に遺伝子名を表示することとする。この記載は、
pRS434、pRS444、pRS435GAP 及びpRS445プラスミドのい
ずれの場合も、上記プロモーターとの組み合わせによ
り、同じ要領で記載することができる。

【００５９】

【表２】

【００６０】3．組換え体の作製 本発明の組換え体は、本発明の組換えDNAを、各種IPP合
成経路関連酵素遺伝子（変異型遺伝子、融合遺伝子、及
び小胞体シグナルを付加、置換又は挿入したポリペプチ
ドをコードする遺伝子を含む）が発現し得るように前記
変異株、例えばEUG株に導入することにより得ることが
できる。

【００６１】遺伝子が宿主細胞に導入されたか否かの確
認は、PCR(polymerase chain reaction)法、サザンハイ
ブリダイゼーション法等により行うことができる。例え
ば、組換え体からDNAを調製し、導入DNA特異的プライマ
ーを設計してPCRを行う。その後は、PCR増幅産物につい
てアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジ
ウム、SYBR Green液等により染色するか、あるいはUV検
出器でDNAを検出し、増幅産物を1本のバンド又はピーク
として検出することにより、導入DNAを確認する。ま
た、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いて
PCRを行い、増幅産物を検出することもできる。

【００６２】4．プレニルアルコールの生産 本発明において、プレニルアルコールは、上記変異株、
例えばEUG株を培養し、その培養物から採取することに
より得ることができる。また上記変異株、例えばEUG株
にIPP合成経路関連酵素遺伝子（変異型遺伝子及び融合
遺伝子を含む）を導入して組換え体を得た後、この組換
え体を転写抑制条件下で培養し、その培養物から採取す
ることにより得ることができる。「培養物」とは、培養
上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体自体又は細胞若
しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
本発明の変異株、例えばEUG株又はその組換え体を培養
する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従っ
て行われる。プレニルアルコールとしては、例えばFO
H、NOH又はGGOHが挙げられる。上記プレニルアルコール
は、それぞれ単独又は混合物として上記培養物中に蓄積
される。

【００６３】微生物を宿主として得られた組換え体を培
養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無
機塩類等を含有し、組換え体の培養を効率的に行うこと
ができる培地であれば、複合天然培地、合成培地のいず
れを用いてもよい。炭素源としては例えば糖源を用いる
ことができ、通常はグルコースを含む。糖源は0.1-20%
(w/v)、好ましくは1-7% (w/v)であり、そのうちグルコ
ースの含有量は10-100%(w/w)、好ましくは50-100% (w/
w)であり、培養条件（使用宿主の種類、導入された組換
えベクターの種類、培養日数等）により適宜設定でき
る。但し、グルコースと併用してガラクトース、フラク
トース、スクロース、ラフィノース、ラクトース、デン
プン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エ
タノール、プロパノール等のアルコール類を炭素源とし
て使用してもよい。この場合、グルコース含有培地で培
養する前にガラクトース含有培地で前培養することも可
能である。前培養するときのガラクトースの含有量は、
混在する炭素源によって様々な値を取りうるが、通常糖
源あたり50-100% (w/w)、好ましくは糖源あたり100%(w/
w)である。EUG株の場合はガラクトース含有かつグルコ
ース非含有培地での培養がスクアレン合成酵素遺伝子ER
G9非転写抑制条件であり、グルコース含有培地での培養
がスクアレン合成酵素遺伝子ERG9転写抑制条件であり、
グルコース含培地での培養で、翻訳活性のあるスクアレ
ン合成酵素転写産物量が減少する。

【００６４】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム
塩又はその他の含窒素化合物が挙げられ、その他ペプト
ン、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸
等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウ
ム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マ
グネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガ
ン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。培養は、
通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、
26℃-42℃、好ましくは30℃で2-7日行う。pHの調整は、
無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。

【００６５】転写プロモーターとして誘導型転写プロモ
ーターを用いた発現ベクターを用いて遺伝子導入した組
換え体を培養する場合は、必要に応じて転写誘導物質
（インデューサー）を培地に添加してもよい。例えばGA
L1プロモーターを用いた場合、インデューサーとしてガ
ラクトースを使用することができる。上記培養条件で培
養すると、高収率でプレニルアルコールを生産すること
ができる。また、プレニルアルコールを大量培養するに
は、ジャーファーメンター培養装置等を用いることもで
きる。

【００６６】本発明において作製したプレニルアルコー
ル生産型変異細胞は、スクアレン合成酵素遺伝子欠損株
（erg9株；ATCC64031）におけるエルゴステロールのよ
うに特別な必須培地添加成分が無くても、翻訳活性のあ
るスクアレン合成酵素遺伝子転写産物量を調節すること
により生育かつプレニルアルコール高生産が可能である
が、通常培地に、さらにテルペノイド、油脂、界面活性
剤等を添加したり、窒素源や炭素源濃度を高くしてプレ
ニルアルコールの生産効率をさらに高めることもでき
る。これらの添加剤としては以下のものを例示できる。

【００６７】 テルペノイド： スクアレン、トコフェロール、IPP、DMAPP 油脂： 大豆油、魚油、アーモンド油、オリーブ油 界面活性剤： タージトール、トリトンX-305、スパン85、アデカノール L G-109 (旭電化製)、アデカノールLG-294(旭電化製)、アデカノールLG-295S (旭 電化製)、アデカノールLG-297 (旭電化製)、アデカノールB-3009A (旭電化製)、 アデカプロニックL-61 (旭電化製)

【００６８】油脂濃度は0.01%(w/v)以上、好ましくは1-
3%(w/v)であり、界面活性剤濃度は0.005-1%(w/v)、好ま
しくは0.05-0.5%(w/v)であり、テルペノイド濃度は0.01
%(w/v)以上、好ましくは1-3%(w/v)である。培養後、プ
レニルアルコールが菌体内又は細胞内に生産される場合
には、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を
破砕することにより目的のプレニルアルコールを採取す
る。また、細胞を破砕せずに有機溶媒等で直接抽出して
もよい。あるいは、本発明のプレニルアルコールが菌体
外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま
使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去す
る。その後、有機溶媒による抽出等により前記培養物中
からプレニルアルコールを採取し、必要に応じてさらに
各種クロマトグラフィー等を用いて単離精製することが
できる。本発明において、各EUG株のプレニルアルコー
ル生産量、並びにプレニルアルコール生産に関するEUG
株とベクターとの好ましい組み合わせを例示すると表3
の通りである。

【００６９】

【表３】

【００７０】(i) A451株由来のEUG5又はEUG8をグルコ
ース培地であるYM7培地で培養すると8.5-9.1mg/lのFOH
を生産し、糖源や窒素源を高濃度にし油を加えたYPDO7r
ich培地で培養すると57.5mg/lのFOHを生産し、0.43mg/l
のNOH、1.65mg/lのGGOHを生産した。YPH499株由来のEUG
12をYM7培地で培養すると7.4-40.6mg/lのFOHを生産す
る。YPH500株由来のEUG24又はEUG27をYM7培地で培養す
ると4.9-18.0mg/lのFOHを生産し、YPDO7rich培地で培養
すると42.2mg/lのFOHを生産し、1.75mg/lのNOH、1.26mg
/lのGGOHを生産した。W303-1A由来のEUG36、W303-1B由
来のEUG64を同様にYPDO7rich培地で培養すると、FOHを
それぞれ43mg/l、101.7m/l生産した。各EUG株はガラク
トース培地で前培養した後転写抑制条件であるグルコー
ス含有培地で本培養した。

【００７１】(ii) TDH3（GAP）プロモーター下流にHMG
-CoA還元酵素遺伝子HMG1を組み込んでプラスミドを作製
し、これを宿主であるEUG株に導入すると、FOH蓄積量が
さらに高くなり、株によってはGGOH蓄積量も増加した。
EUG5で67.9mg/lのFOH、2.68mg/lのGGOHを生産した。GGO
H蓄積量の増加はEUG12、EUG27でも見られどちらも最大
で2.05mg/lのGGOHを生産した。 (iii) HMG1置換変異型遺伝子HMG1’の欠失型遺伝子HMG
ΔxyyをEUG5に導入するとYM7培地培養条件で、HMGΔxyy
導入前の8.5mg/lより高いFOH生産性を示し、最大でHMG
Δ122の12.1mg/l FOHであった。

【００７２】(iv) TDH3（GAP）プロモーター下流にGGP
P合成酵素遺伝子BTS1を組み込んでプラスミドを作製
し、これを宿主である各EUG株に導入すると、FOH、GGOH
が生産される。EUG5へのBTS1導入によりBTS1導入前のYM
7培地培養による8.5mg/lより高いFOH生産性（11.0mg/
l）を示した。EUG12株を宿主にするとYM7培地で1.6mg/l
のGGOHを生産し、EUG27株を宿主にするとYM7培地で1.5m
g /lのGGOHを生産する。YPDO7rich培地で培養すると、E
UG5で19.8mg/l GGOH、EUG36で26.9mg/l GGOH、EUG64で6
2.7mg/l GGOHの生産性を示した。小胞体シグナルHDELを
C末端に持つ変異型GGPP合成酵素をコードする変異型BTS
1遺伝子を導入すると野生型BTS1と比べFOH生産性がEUG1
2で上昇（2.6mg/l→9.7mg/l）した。

【００７３】(v) YPH499株にERG20を導入してもプレニ
ルアルコールの生産はほとんどないのに対し（0.05mg/l
以下）、EUG12を宿主にすると4.5mg/lのFOHを生産し、G
GOH生産にも効果があり6.6mg/l GGOHを生産した。HDEL
を付加した変異型ERG20導入するとNOH生産に効果がある
場合があり、EUG12で0.62mg/lのNOHを生産した。 (vi) BTS1-ERG20融合遺伝子、あるいは、融合遺伝子の
末端がHDEL配列をコードする様にした遺伝子をA451に導
入しても0.26mg/l程度のGGOH生産であるのに対し、EUG5
に導入すると、6.5-6.6mg/l GGOHを生産する（YM7培
地）。

【００７４】(vii) ERG20-BTS1融合遺伝子、あるい
は、融合遺伝子の末端がHDEL配列をコードする様にした
遺伝子をEUG5に導入すると(vi)と同様に0.79-2.43mg/l
のGGOHを生産する。 (viii) ERG19を各EUG株に導入すると、どの株もそれほ
どFOH生産は向上していないように見えるが、培養液OD
₆₀₀値あたりのFOH生産量を比較すると、YPH株由来のEUG
12、EUG24で2倍から数倍FOH生産効率がよくなってい
た。

【００７５】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲が限定されるものではない。本実施例は、以下の内容
を包含する。 (1) ゲノムDNA中のスクアレン合成酵素遺伝子転写プロ
モーターを転写抑制型プロモーターGAL1転写プロモータ
ーで置換して変異株(EUG株)を作製し、プレニルアルコ
ール生産菌とする。EUG株を転写抑制条件(グルコース含
有培地)で培養し、プレニルアルコールの生産量を測定
する。〔実施例1-2〕 (2) EUG株への遺伝子導入のため、Stratagene社のpRS
系各ベクター、Invitrogen社のpYES、又はS. cerevisia
e由来のゲノムDNAをもとにして、発現ベクターpRS435GA
Pなどを作製する。〔実施例3〕

【００７６】(3) IPP合成経路関連酵素遺伝子のクロー
ニング 上記EUG株への導入用遺伝子として、HMG-CoA還元酵素遺
伝子、メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素遺伝子、FPP合成
酵素遺伝子、GGPP合成酵素遺伝子、又はこれらの変異型
遺伝子をクローニングし、発現用プラスミドを作製す
る。〔実施例4-6,8〕 (4) (3)の各種遺伝子を導入して得た組換え体を転写抑
制条件(グルコース培地)で培養し、プレニルアルコール
の生産量を測定する。〔実施例7-8〕 (5) グルコース濃度を変化させた培地、あるいは、糖
源・窒素源や油添加物を加えた培地でEUG株を培養し、
プレニルアルコール生産に好適な条件を検討する。〔実
施例9-10〕 〔実施例1〕 各EUG株の作製 SGDから、スクアレン合成酵素遺伝子ERG9付近の遺伝子
地図を引き出し、ERG9転写プロモーター (ERG9p) 置換
用DNA断片増幅のためのPCRプライマーDNAを設計した
（図2）。形質転換体選択マーカー遺伝子URA3と転写プ
ロモーターGAL1pを含む1.8 kbp DNA断片（図2A(2)）
は、pYES2（図2C）をNaeIとNheIで切断後Klenow酵素で
平滑末端化し、セルフライゲーションにより2μ ori部
分を削除したpYES2Δ（図2B）を鋳型にしてPCR増幅によ
り調製した。PCRで使用したプライマーは以下の通りで
ある。

【００７７】E-MCSf：5'- GCC GTT GAC AGA GGG TCC GA
G CTC GGT ACC AAG -3'（配列番号34） E-URA3r：5'- CAT ACT GAC CCA TTG TCA ATG GGT AAT A
AC TGA T -3'（配列番号35）

【００７８】上記プライマーには、S.cerevisiae ゲノ
ム中のオープンリーディングフレームYHR189Wの下流部
分を含む0.7 kbpDNA断片と、ERG9の上流部分を含む 0.9
kbpDNA断片とでT/AライゲーションできるようにEam110
5I認識部位（配列中、下線部分）を加えてある。YHR189
W断片は、PCRプライマーYHR189WfとYHR189Wrを用いてYP
H499ゲノムDNAを鋳型にPCRにより調製し、ERG9断片は、
PCRプライマーERG9fとERG9rを用いてYPH499ゲノムDNAを
鋳型にPCRにより調製した。YPH499ゲノムDNAは、酵母ゲ
ノムDNA調製用キット「Genとるくん」（宝酒造）を用い
て調製した。

【００７９】YHR189Wf：5'-TGT CCG GTA AAT GGA GAC-
3'(配列番号36) YHR189Wr：5'-TGT TCT CGC TGC TCG TTT-3'(配列番号3
7) ERG9f：5'-ATG GGA AAG CTA TTA CAA T-3'(配列番号38) ERG9r：5'-CAA GGT TGC AAT GGC CAT-3'(配列番号39)

【００８０】1.8 kbp DNA断片をEam1105Iで消化後、0.7
kbpDNA断片とライゲーションし、これを鋳型にしてプ
ライマーYHR189WfとE-MCSfを用いて2nd PCRを行った。
増幅した2.5 kbp DNA断片（図2A(5)）をEam1105Iで消化
後、0.9 kbp DNA断片とライゲーションし、これを鋳型
にしてプライマーYHR189W-3fとERG9-2rを用いて3rd PCR
を行った。増幅した3.4 kbp DNA断片を形質転換用DNA断
片とした。

【００８１】YHR189W-3f：5'-CAA TGT AGG GCT ATA TAT
G-3'(配列番号40) ERG9-2r：5'-AAC TTG GGG AAT GGC ACA-3'(配列番号41) Zymo Research (Orange, CA) より購入したFrozen EZ y
east transformationII kitを用いて酵母に形質転換用D
NA断片の導入を行った。形質転換用DNA断片導入用宿主
として、A451、YPH499、YPH500、W303-1A及びW303-1Bを
用いた。

【００８２】組換え体は、SGR培地（SD(synthetic dext
rose)培地のグルコース成分をガラクトースとラフィノ
ースで置き換えたもの）をベースにし、CSM-URA (BIO 1
01 (Vista, CA) より購入) と、アデニン硫酸塩（終濃
度40 mg/l）とを加えた寒天培地（SGR-U培地）上で30℃
で培養し、生育してきた菌体をもう一度同じ培地に広
げ、培養しシングルコロニーアイソレーションを行っ
た。取得した組換え体は、EUG (ERG9p::URA3-GAL1p) 株
と名付け、A451由来のクローンをEUG1-10、YPH499由来
のクローンをEUG11-20、YPH500由来のクローンをEUG21-
30、W303-1A由来のクローンをEUG31-50、W303-1B由来の
クローンをEUG51-70とした。

【００８３】SD培地でグルコースリプレッションにより
翻訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝子転写産物量が
減少し、増殖速度が低下したクローンを選抜し、A451か
らEUG8が、YPH499からEUG12が、YPH500からEUG27が得ら
れた。SD-U寒天培地とSGR-U寒天培地上での生育状態の
代表例を図5に示す。SGR-Uプレート（図5右パネル）で
は正常に生育するがグルコースリプレッションによりGA
L1プロモーター制御下のスクアレン合成酵素遺伝子転写
抑制された結果、翻訳活性のあるスクアレン合成酵素遺
伝子転写産物量が減少し、SD-Uプレート上（図5左パネ
ルSDで示した）では増殖速度が低下した株を得ることが
できた（図5ではEUG1-6のうちEUG5）。

【００８４】翻訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝子
転写産物量が減少し、増殖速度が低下した組換え体のう
ち、EUG8、EUG12、EUG27から「Genとるくん」を用いて
ゲノムDNAを調製し、これを鋳型にし、YHR189WfとERG9-
2 (5'- TCA CGC TCT GTG TAAAGT GTA TA-3'(配列番号4
2)) をプライマーに用いてPCRを行い、増幅したDNA断片
の大きさをアガロースゲル電気泳動で調べた結果、URA3
とGAL1pを含む1.8 kbpのPCR断片がゲノムのスクアレン
合成酵素遺伝子座にインテグレートされていることが確
認できた。

【００８５】〔実施例2〕 各EUG株によるプレニルアル
コール生産 (1) プレニルアルコール生産量測定-1 (1-1) 培養 EUG8、EUG12、EUG27をSGR-U培地で前培養し、0.3 mlの
前培養液を30 mlのYM7培地、YME培地又はYM7(Gal)培地
にそれぞれ加え、300 ml 三角フラスコで30℃ 130 r.p.
m.の往復振盪培養で培養した。YM7培地とは、YM培地をN
aOHでpH7に調製した培地である。YME培地とは、YM7培地
に50 mg/lのエルゴステロールを加えた培地であってエ
タノール-タージトール溶液（50 mg/mlのストック液）
を1000分の一添加したものである。YM7(Gal)培地とは、
YM7培地のグルコースをガラクトースで置き換えたもの
である。

【００８６】培養開始後、1日、2日、3日、4日、7日、8
日、9日目に2.5 mlの培養液を取り出しプレニルアルコ
ール生産量を定量した。すなわち、培養液にメタノール
を2.5 ml 加えて混合し、ペンタンを約5 ml 加えて激し
く攪拌後静置した。ペンタン層を新しいガラス試験管に
とり、ドラフト中でペンタンを気化させ溶質成分を濃縮
後、ガスクロマトグラフィー/質量分析（GC/MS）でプレ
ニルアルコールを同定、定量した。また、その際、菌体
増殖の度合いを調べるため、培養液50μlを水で30倍に
希釈し、600 nmの吸光度を測定した。

【００８７】(1-2) GC/MS解析 ペンタン抽出画分をHP6890/5973 GC/MSシステム (Hewle
tt-Packard, Wilmington, DE) を用いて分離、同定、定
量した。使用カラムはHP-5MS (0.25 mm x 30 m、フィル
ム厚0.25 μm)であり、分析条件は以下の通りである。
本明細書中でのGC/MS分析条件は、全て同様である。

【００８８】インレット温度 250℃ 検出器温度 260℃ [MS ゾーン温度] MS Quad 150℃ MS Source 230℃ マススキャン範囲35-200 [インジェクションパラメーター] 自動インジェクションモード サンプル容量 2 μl 3回のメタノール洗浄及び2回のヘキサン洗浄 スプリット比 1/20 キャリヤーガス ヘリウム 1.0 ml/分 溶媒遅延 2 分 [オーブン加熱条件] 115℃90 秒 70℃/分で250℃まで加熱し、2分間維持 70℃/分で300℃まで加熱し、7分間維持 内部標準 エタノール中0.01 μl 1-ウンデカノール 信頼標準 (all-E)-ネロリドール (エーザイ) (all-E)-ファルネソール (Sigma) (all-E)-ゲラニルゲラニオール (エーザイ) スクアレン (東京化成工業)

【００８９】(2) プレニルアルコール生産量測定-2 SD培地で増殖速度が低下したEUG株を1-5 mlのYM7培地中
で1-7日間、30℃ 130r.p.m.の往復振盪培養で培養し
た。培養開始後、1日、2日、3日、4日、7日に0.8-2.5 m
lの培養液を取り出し、前記(1)と同様にしてプレニルア
ルコール量を定量した。

【００９０】(3) 糖組成によるプレニルアルコール生産
量変化 YM7培地のグルコース (Glc) 成分を表4に示すように変
え、まず2日間30℃ 130r.p.m.の往復振盪培養で培養し
たのち、表5に示すように、YMGlc培地としては5%(w/v)G
lcを、YMGal培地としては5%(w/v)ガラクトース (Gal)を
加えさらに培養を7日目まで継続した。YMrich培地では
培養開始からYM7の全糖濃度を 6%(w/v)とし、その成分
は表4に示すようにしてある。結局、培地成分と培養時
間との関係は表5に示すようになる。培養開始後、2日、
4日、7日に2.5 mlの培養液を取り出し前記(1)と同様に
してプレニルアルコール生産量を定量した。

【００９１】

【表４】

【表５】

【００９２】(4) 結果と考察 (4-1) EUG株によるプレニルアルコール生産 A451、YPH499、YPH500由来でGlc増殖速度低下がみら
れ、ゲノムへのインテグレーションも完全に行われたEU
G株（それぞれEUG8、EUG12、EU27）を選び、プレニルア
ルコール生産量を測定した。結果を図6に示す。Glcを炭
素源としたYM7、YME培地で培養するとFOHを生産する系
が得られた。エルゴステロールを含むYME培地で培養し
た場合、EUG12とEUG27でFOH濃度が上昇する傾向が見ら
れ、それぞれ最大で40.6mg/l、18.0mg/lのFOHを蓄積し
た。A451株由来のEUG8と、YPH499株由来のEUG12及びYPH
500株由来のEUG27との間では生産プロファイルが異な
り、YPH系の株の方がより生産に適していると考えられ
る。そして、従来EUG9欠損株(erg9株： ATCC64031)で生
育に必須だったエルゴステロール(Erg)を添加せずに一
般的なYM7培地で4日培養するだけで30 mg/l程度のFOHを
生産する酵母が開発できた（図6のEUG12）。

【００９３】次にEUG1-70のうちSD培地で増殖速度低下
のみられたクローンを培養し、プレニルアルコール生産
量を比較した（図7-11）。FOH生産量は、A451株由来の
もの（図7）ではEUG5（8.5 mg/l）、YPH499由来のもの
（図8）ではEUG12（17.8 mg/l）、YPH500由来のもの
（図9）ではEUG24（17.9 mg/l）及びEUG27（10.5 mg/
l）が、他のクローンと比較して高かった。また、W303-
1A由来のもの（図10）及びW303-1B由来のもの（図11）
では、それぞれの図に示す株が他のクローンと比較して
高かった。

【００９４】W303-1A由来：EUG31（16mg/l）、EUG33（4
1mg/l）、EUG35（38mg/l）、EUG36（43mg/l）、EUG38
（17mg/l）、EUG39（24mg/l）、EUG42（24mg/l）、EUG4
4（21mg/l）、EUG49（21mg/l） W303-1B由来：EUG51（28mg/l）、EUG56（16mg/l）、EUG
59（37mg/l）、EUG61（27mg/l）、EUG63（16mg/l）、EU
G64（38mg/l）

【００９５】(4-2) グルコース濃度変化による生産性の
違い GlcとGalの糖濃度を変えてEUG8、EUG12、EUG27を培養し
た時のプレニルアルコール生産量を図12-14に示す。生
産物質はほとんどFOHのみであるが、A451由来株のEUG8
（図12）と、YPH由来株のEUG12（図13）及びEUG27（図1
4）との間では生産プロファイルが異なることがわか
る。EUG8ではいずれの条件でも初期培地条件の糖成分が
100% Glcのときに生産量が最大であったが、EUG12及びE
UG27では初期培地条件の糖成分が75%Glcの時に生産量が
よく、また、初期培地条件の糖成分が75% Glc (1%(w/v)
sugar)の後、2日目に終濃度5%(w/v)になるようにさら
にGlcを添加した条件でFOHをよく生産した。初期培地条
件の糖成分が75%Glc条件下で生育に最低限のERG9転写を
行わせることによって細胞増殖とFOHのバランスがちょ
うどよい条件になったと考えられる。YMGal培養条件に
おいて4日目以降にFOH生産が減少するのは、Gal添加でE
RG9の転写が促進され、Ergが細胞内で合成されるに従っ
て培地中のFOHを資化するためであることが予想され
る。FOH生産についてのみまとめた結果（図15）をみる
と、上記A451由来株EUG8と、YPH由来株EUG12及びEUG27
との生産プロファイルの違いがわかりやすい。また、
「初期条件の糖成分が75% Glc (1%(w/v) sugar)のの
ち、2日目に終濃度5%(w/v)になるようにさらにGlcを添
加した条件」ではOD₆₀₀値がほとんど変わらないのに対
し、2日目から4日目、7日目とFOH生産量が増加している
ことから、このときの細胞は細胞分裂なしにFOHを生産
する生理的な状態であったと予想できる。このような菌
体を固定化できればFOH生産の効率よい系が開発できる
可能性が示された。

【００９６】本実施例で示したEUG株の開発により、翻
訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝子の転写産物量を
減少させることができる。そして、EUG株は、スクアレ
ン合成酵素コード領域に置換、挿入または欠失の変異を
導入して作製したスクアレン合成酵素遺伝子欠損株、た
とえばATCC64031などと異なり、ステロール取りこみ能
付加やErg添加などのスクアレン合成酵素欠損による致
死性を相補する特別なメカニズムを導入することなしに
YM7などの一般的な培地で培養すれば活性型プレニルア
ルコールであるFOHを発酵生産する系を作製できること
がわかった。また、EUG株は通常遺伝子組換え宿主株を
元にしているので、ATCC64031などと異なり、さらに遺
伝子工学的な改変を行うことが簡便にできさらに生産性
の高い株の開発に応用できる。

【００９７】〔実施例3〕 発現ベクターの構築 (1) E. coli-S. cerevisiaeシャトルベクター Stratagene社よりプラスミドpRS404、pRS405を購入し
た。Invitrogen社 (Carlsbad, CA) からpYES2（図3）を
購入した。 (2) ゲノムDNAS . cerevisiaeゲノムDNAは、「Genとるくん」を購入
し、添付のプロトコルに従ってS. cerevisiae YPH499
からゲノムDNAを調製した。E. coli からのプラスミドD
NAは、Promega (Madison, WI) のWizard PureFection P
lasmid DNA Purification System を用いて調製した。

【００９８】(3) pRSベクターへCYC1t断片の挿入CYC1 転写ターミネーターCYC1t断片はPCRで調製した。以
下のPCR用オリゴDNA：XhoI-Tcyc1FW とApaI-Tcyc1RVと
の組合せをPCR用プライマーDNAに用い、鋳型としてpYES
2を用いた。 XhoI-Tcyc1FW：5'- TGC ATC TCG AGG GCC GCA TCA TGT
AAT TAG -3'（配列番号43） ApaI-Tcyc1RV：5'- CAT TAG GGC CCG GCC GCA AAT TAA
AGC CTT CG -3'（配列番号44）

【００９９】反応は、0.1 μg pYES2, 50 pmol プライ
マー DNA, MgSO₄ 含有1x Pfu バッファー(Promega, Mad
ison, WI), 10 nmol dNTP, 1.5 u Pfu DNA ポリメラー
ゼ (Promega)及び 1 μl Perfect Match ポリメラーゼ
エンハンサー (Stratagene)を含む50 μlの反応液を調
製し、95℃ 2分、(95℃ 45秒、60℃ 30秒、72℃ 1分)×
30サイクル、72℃ 5分、4℃ストックの反応条件で行っ
た。増幅した2種のDNAをそれぞれXhoIとApaIで切断し、
アガロースゲル電気泳動で260 bpのDNA断片を精製しCYC
1t-XAとした。pRS404、pRS405のXhoI-ApaI部位にCYC1t-
XAを挿入し、それぞれ、pRS404Tcyc、pRS405Tcycとし
た。

【０１００】(4) 転写プロモーターの調製 酵母ゲノムDNAを鋳型にしてPCRにより転写プロモーター
を含むDNA断片を調製した。使用したDNAプライマーは以
下の通りである。 SacI-Ptdh3FW：5'-CAC GGA GCT CCA GTT CGA GTT TAT C
AT TAT CAA-3'（配列番号45） SacII-Ptdh3RV：5'-CTC TCC GCG GTT TGT TTG TTT ATG
TGT GTT TAT TC -3'（配列番号46）

【０１０１】反応溶液は、0.46 μg 酵母ゲノムDNA, 10
0 pmol プライマー DNA, 1x ExTaqバッファー(宝酒造),
20 nmol dNTP, 0.5 u ExTaq DNAポリメラーゼ(宝酒造)
及び1 μl Perfect Match ポリメラーゼエンハンサーを
含む100 μl溶液を調製し、95℃ 2分、(95℃ 45秒、60
℃ 1分、72℃ 2分)×30サイクル、72℃ 4分、4℃ストッ
クの反応条件で行った。増幅したDNAをSacIとSacIIで切
断し、アガロースゲル電気泳動で0.7kbpのDNA断片を精
製し、TDH3pとした。

【０１０２】(5) 2μ DNA複製開始領域の調製 YEpベクターであるpYES2をSspIとNheIで切断後、2μ DN
A複製開始点（2 μ ori）を含む1.5 kbp断片をアガロー
スゲル電気泳動により精製し、Klenow酵素で平滑末端化
し、このDNA断片を2μOriSNとした。 (6) YEp型発現ベクターの作製 pRS404Tcyc、pRS405TcycをBAP（bacterial alkaline ph
osphatase, 宝酒造）処理したNaeI部位に2μOriSNを挿
入し、E. coli SURE2に形質転換した後、プラスミドDNA
を調製した。これを、DraIII及びEcoRI、HpaI、又は、P
stI及びPvuIIにより切断後、アガロースゲル電気泳動
し、2μ oriの挿入とその向きをチェックした。作製し
たpRS404Tcyc、pRS405TcycにpYES2と同じ向きで2 μ or
iが挿入されたプラスミドをそれぞれpRS434Tcyc2μOr
i、pRS435Tcyc2μOriとし、pRS404Tcyc、pRS405Tcycにp
YES2と反対向きで2 μ oriが挿入されたプラスミドをそ
れぞれpRS444Tcyc2μOri、pRS445Tcyc2μOriとした。

【０１０３】pRS434Tcyc2μOri、pRS435Tcyc2μOri、pR
S444Tcyc2μOri及びpRS445Tcyc2μOriの4種のプラスミ
ドのSacI-SacII部位に、転写プロモーターを含む断片TD
H3p(GAPp)を挿入しDNAをクローン化した。その結果、
(i) pRS434Tcyc2μOriからpRS434GAPが、 (ii) pRS435T
cyc2μOriからpRS435GAPが、(iii) pRS444Tcyc2μOri
からpRS444GAPが、 (iv) pRS445Tcyc2μOriからpRS445G
APが、それぞれ得られた（図16A-16D）。

【０１０４】(7) YEp型発現ベクターの酵母への導入 各YEp型発現ベクター約40 ngをFrozen-EZ Yeast Transf
ormation II (Zymo Research, Orange, CA) を用いた方
法でYPH499へ導入し（手順はキット同封の説明書に従っ
た）、SD-W寒天プレート(DOB+CSM-Trp, BIO101, Vista,
CA)上30℃で1000以上のTrp非要求性コロニーが観察さ
れたので、作製したYEp型発現ベクターのDNA複製領域が
機能し組換え体内でプラスミドとして正常に保持されて
いる事が確認された。

【０１０５】〔実施例4〕 IPP合成経路関連酵素遺伝子
のクローニング 酵母cDNAからの遺伝子クローニングの際には、Clontech
社 (Palo Alto, CA)より購入したS. cerevisiae DBY746
由来のcDNA ライブラリ“Quick-Clone cDNA”を用い
た。 (1) ファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子のクローニン
グS. cerevisiae由来のFPP合成酵素遺伝子ERG20：PCR(pol
ymerase chain reaction)法でS. cerevisiae FPP合成酵
素遺伝子ERG20約0.9 kbp断片（配列番号１）を、cDNAを
鋳型にして増幅した。PCRプライマーは以下の通りであ
る。

【０１０６】Primer 1 (SCFPS1):5'-ATG GCT TCA GAA A
AA GAA ATT AG-3'（配列番号47） Primer 2 (SCFPS 2):5'-CTA TTT GCT TCT CTT GTA AAC
TT-3'（配列番号48）

【０１０７】上記反応溶液を用い、94℃ 45秒、55℃ 1
分、72℃ 2分を30サイクル行った。なお、後述のPCR
は、特別な記載がない限り上記と同様の条件で行った。
PCR断片をアガロースゲル電気泳動で精製後、pT7Blue-T
(Novagen, Madison,WI)へT/Aライゲーションによりク
ローニングした。ERG20はpT7Blue-T内のlacZと同じ向き
に挿入されていた。クローニングした断片の塩基配列決
定を行いSGDの配列と比較したところ、1-300塩基と610-
1059塩基の部分でのPCRエラーは無かった。なお、ERG20
によりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
作成したプラスミドDNAをpT7ERG20とした。

【０１０８】(2) ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺
伝子のクローニングS . cerevisiaeのGGPP合成酵素遺伝子BTS1（配列番号
３）のクローニングは、以下のように行った。GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html/)
にあるS. cerevisiae由来GGPP合成酵素遺伝子(アクセッ
ション番号（A.N.）： U31632)(Y. Jiang, et al., J.
Biol. Chem. 270 (37), 21793-21799 (1995))の情報を
もとに、該遺伝子によりコードされるタンパク質のN末
端、C末端にマッチするプライマーを作製し、これを用
いて酵母のcDNAライブラリー（Clontech No.CL7220-1）
を鋳型としたPCRを行った。

【０１０９】N末端側プライマー：5'-ATG GAG GCC AAG
ATA GAT GAG CT-3' (配列番号49) C末端側プライマー：5'-TCA CAA TTC GGA TAA GTG GTC
TA-3' (配列番号50) PCRは、Perfect Matchポリメラーゼエンハンサーを使用
し、94℃ 45秒の変性、55℃ 1分のアニーリング及び72
℃ 2分の伸長を1サイクルとしてこれを30サイクル行っ
た。

【０１１０】目的の断片（約1.0kbp）が確認されたの
で、BTS1断片をTAクローニング可能なpT7Blue Tベクタ
ーにクローニングし、BTS1の全領域の塩基配列を決定し
た。その結果、GenBankの配列と完全に一致し、S. cere
visiae由来の遺伝子であることを確認した。BTS1により
コードされるアミノ酸配列を配列番号４に示す。

【０１１１】(3) HMG-CoA還元酵素遺伝子のクローニン
グS . cerevisiae HMG-CoA還元酵素遺伝子HMG1のクローニ
ングは、以下のように行った。GenBankにあるS. cerevi
siae由来HMG-CoA還元酵素遺伝子HMG1 (A.N.：M22002)
(M. E. Basson, et al., Mol. Cell. Biol. 8, 3797-38
08 (1988):配列番号５)の情報をもとにN末端、C末端に
マッチするプライマーを作製し、これを用いて酵母のcD
NAライブラリー（Clontech）を鋳型としたPCRを行っ
た。

【０１１２】N末端側プライマー：5'-ATG CCG CCG CTA
TTC AAG GGA CT-3' (配列番号51) C末端側プライマー：5'-TTA GGA TTT AAT GCA GGT GAC
GG-3' (配列番号52) PCRは、Perfect Matchポリメラーゼエンハンサーを使用
し、94℃ 45秒の変性、55℃ 1分のアニーリング及び72
℃ 2分の伸長を1サイクルとしてこれを30サイクル行っ
た。

【０１１３】目的の断片(3.2kbp)が確認されたので、HM
G1をTAクローニング可能なpT7BlueTベクターにクローニ
ングし(これをpT7HMG1とした)、HMG1の塩基配列を決定
した。その結果、配列番号５の塩基配列及び配列番号６
のアミノ酸配列を確認した。決定された塩基配列は、Ge
nBankの配列に示した塩基配列と一部異なっており、PCR
エラーを起こしていた（図4A）。このPCRエラーを含ん
だ変異型HMG-CoA還元酵素遺伝子をHMG1'とする。

【０１１４】(4) HMG-CoA還元酵素遺伝子のPCRエラーの
修正 PCRエラーは、pT7HMG1からHMG1遺伝子断片をサブクロー
ニングし、HMG1部分のPCRエラーによるアミノ酸置換変
異部分を修正した。HMG-CoA還元酵素遺伝子HMG1のPCRエ
ラー型DNAであるHMG1'を有するpT7HMG1からHMG1'遺伝子
断片をサブクローニングし、HMG1部分のPCRエラーによ
るアミノ酸置換変異部分を、部位特異的変異誘発法によ
り修正し、pALHMG106を作製した。作製方法の詳細は以
下の通りである。

【０１１５】プラスミドpT7HMG1をクローン化HMG1とし
て用いた。また、部位特異的変異導入用ベクターとして
pALTER-1を購入した(Promega)。部位特異的変異(site-d
irected mutagenesis)は、Promega発行の"Protocols an
d application guide, third edition, 1996 Promega,
ISBN 1-882274-57-1"に記載の方法で行った。変異導入
用オリゴは、次の3種類を化学合成した。

【０１１６】HMG1(190-216) 5'-CCAAATAAAGACTCCAACACT
CTATTT-3'（配列番号53） HMG1(1807-1833) 5'-GAATTAGAAGCATTATTAAGTAGTGGA-3'
（配列番号54） HMG1(2713-2739) 5'-GGATTTAACGCACATGCAGCTAATTTA-3'
（配列番号55）

【０１１７】部位特異的変異導入は、pT7HMG1をSmaI、A
paLI、SalIで切断し、3.2kbpのHMG1断片をアガロースゲ
ル電気泳動で調製した。これをpALTER-1のSmaI-SalI部
位に挿入し、pALHMG1を作製した。pALHMG1をアルカリ変
性後、上記変異導入オリゴ、リペアオリゴとしてAmp re
pair oligo(Promega)、及びノックアウトオリゴとしてT
et knockout oligo(Promega)をアニーリングさせ、E. c
oli ES1301(Promega)に導入後、125μg/mlアンピシリン
で部位特異的変異が導入されたプラスミドを保持する形
質転換体を集積培養し、プラスミドDNAを調製した。以
下の配列を有するプライマーを用いて塩基配列をチェッ
クしたところ、HMG1(190-216)、 HMG1(1807-1833)、 HM
G1(2713-2739)に相当する配列は全てこれらオリゴヌク
レオチドの配列に修正されていた（配列番号13）。な
お、修正された配列によりコードされるアミノ酸配列
（配列番号14）は、HMG1'によりコードされるアミノ酸
配列（配列番号12）と一致していた（サイレント変
異）。 HMG1(558-532) 5'-GTCTGCTTGGGTTACATTTTCTGAAAA-3'
（配列番号56） HMG1(1573-1599) 5'-CATACCAGTTATACTGCAGACCAATTG-3'
（配列番号57） HMG1(2458-2484) 5'-GAATACTCATTAAAGCAAATGGTAGAA-3'
（配列番号58） このHMG1内の配列が修正されたプラスミドをpALHMG106
とした（図17）。

【０１１８】(5) メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素遺伝子
のクローニング PCR法でS. cerevisiaeメバロン酸二リン酸脱炭酸酵素遺
伝子ERG19(MVD1)約1.2kbp断片(配列番号７)をcDNAを鋳
型に増幅した。PCRプライマーは以下の通りである。 Primer 1 (SCU-1):5'-AAC TGC AGA TGA CCG TTT ACA CA
G CAT CCG T-3'（配列番号59） Primer 2 (SCU-2):5'-CGG AAT TCT TAT TCC TTT GGT AG
A CCA GTC T-3'（配列番号60） (下線部分は制限酵素認識部位)

【０１１９】PCR断片をPstIとEcoRIで切断後アガロース
ゲル電気泳動で精製し、pT7BlueのPstI-EcoRI部位にク
ローニングした。これで、ERG19(MVD1)はpT7BlueのlacZ
と反対向きに挿入されることになる。クローニングした
断片の塩基配列決定を行いSGDの配列と比較したとこ
ろ、PCRエラーは無かった。なおERG19によりコードされ
るアミノ酸配列を配列番号８に示す。作成したプラスミ
ドDNAをpT7ERG19とした。

【０１２０】〔実施例5〕 変異型遺伝子のクローニン
グ 欠失型HMG-CoA還元酵素遺伝子のクローニング 実施例4(3)で作製したpT7HMG1をBamHI、SalI、ScaI処理
してPCRエラー配列を有するHMG1'遺伝子を取り出し、こ
れをpYES2(Invitrogen, Carlsbad, CA)のBamHI-XhoI部
位に導入した。得られた組換えベクターをpYES-HMG1と
した。ベクター内の塩基配列を確認したところ、配列番
号９の塩基配列であることを確認した。なお、pYES2
は、複製起点として酵母2μmDNAのori、及びガラクトー
スで誘導可能なGAL1プロモーターをもつ酵母発現用シャ
トルベクターである（図3）。

【０１２１】HMG-CoA還元酵素の膜貫通ドメインに対応
する領域を欠損させた欠失型HMG-CoA還元酵素遺伝子を
作製するため、前記の通り作製したpYES-HMG1を鋳型と
して、PCR法でベクター部分とともにHMG1コード領域の
一部分を欠失させた断片を調製した。得られた断片をKl
enow酵素で平滑末端にした後、セルフライゲーションに
より再び環化し、E. coli JM109へ形質転換させ、プラ
スミドDNAを調製した。プライマーとして使用した合成D
NA配列とその組合せを前記表1に示した。

【０１２２】得られたプラスミドDNA内のHMG1上流、下
流のアミノ酸の読み枠がずれていないことと、その結合
部位近辺にPCRエラーによるアミノ酸置換が起きていな
いことを373A DNA sequencer (Perkin Elmer, Foster C
ity, CA) で確認した。その結果、結合部位近辺にPCRエ
ラーによるアミノ酸置換がなく、読み枠がずれずに遺伝
子を欠失する事のできた以下のプラスミドを得た。欠失
型HMG1遺伝子は、欠失のパターンに従ってΔ02y(yは任
意の作業番号を表す。)のように記載し、Δ02yを含むpY
ES2ベクターを例えばpYHMG026と記すこととする（他の
欠失体も同様）。

【０１２３】HMG1Δ026：配列番号15HMG1 Δ044：配列番号16HMG1 Δ056：配列番号17HMG1 Δ062：配列番号18HMG1 Δ076：配列番号19HMG1 Δ081：配列番号20HMG1 Δ100：配列番号21HMG1 Δ112：配列番号22HMG1 Δ122：配列番号23HMG1 Δ133：配列番号24 プラスミド：pYHMG026, pYHMG027, pYHMG044, pYHMG04
5, pYHMG059, pYHMG062, pYHMG063, pYHMG065, pYHMG07
6, pYHMG081, pYHMG083, pYHMG085, pYHMG094,pYHMG10
0, pYHMG106, pYHMG107, pYHMG108, pYHMG109, pYHMG11
2, pYHMG122, pYHMG123, pYHMG125, pYHMG133, pYHMG13
4 〔実施例6〕 遺伝子のサブクローニング 今回使用した恒常発現型転写プロモーターをもつE. col
i- S. cerevisiae YEp型シャトルベクターであるpRSベ
クターは、実施例3において作製したものを使用した。 (1) FPP合成酵素遺伝子のサブクローニングS . cereviae由来のFPP合成酵素遺伝子ERG20：実施例4
(1)に記載のpT7ERG20 をXbaIとBamHIで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動により1.1 kbpのERG20遺伝子断片を精
製した。これを、pRS435GAPとpRS445GAPのXbaI-BamHI部
位に挿入し、それぞれpRS435GAP-ERG20、pRS445GAP-ERG
20とした。

【０１２４】(2) GGPP合成酵素遺伝子又はその変異型遺
伝子のサブクローニングS . cereviae由来のGGPP合成酵素遺伝子BTS1：実施例4
(2)に記載のpT7Blue TベクターをBamHI、SalI処理してB
TS1断片を取り出し、これを、pYES2(Invitrogen社)のBa
mHI、XhoIサイトに導入した。得られた組換えベクター
をpYESGGPSとした。pYESGGPSをBamHIとMluIで切断し、
アガロースゲル電気泳動により1.3 kbp断片を精製し
た。これを、pRS435GAPとpRS445GAPのBamHI-MluI部位に
挿入し、それぞれpRS435GAP-BTS1、pRS445GAP-BTS1とし
た。

【０１２５】(3) HMG-CoA還元酵素遺伝子又はその変異
型遺伝子のサブクローニング 実施例4(4)に記載のpALHMG106 （図17）をSmaIとSalIで
切断後、アガロースゲル電気泳動で3.2 kbpのPCRエラー
修正後のHMG1遺伝子断片を精製した。これをpRS434GA
P、pRS444GAPのSmaI-SalI部位へ挿入した。HMG1をサブ
クローン化したプラスミドは、XhoI、SpeI、NaeI及びSp
hIの各制限酵素マッピングと、挿入された3.2 kbp HMG1
遺伝子断片のボーダー領域の塩基配列確認とにより物理
地図をチェックし、計画通りに作製できたプラスミドを
選抜した。選抜したプラスミドはそれぞれ、pRS434GAP-
HMG1、pRS444GAP-HMG1とした。HMG-CoA還元酵素遺伝子
の欠失変異型遺伝子は、pYES2由来の欠失変異型HMG1を
組み込んであるプラスミド（実施例5記載）から上記と
同様にしてpRS434GAPへクローニングした。

【０１２６】(4) メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素遺伝子
のサブクローニング 実施例4(5)に記載のpT7ERG19をBamHI、SalIで切断後、
アガロースゲル電気泳動によりBamHI-SalI 1.5 kbpのER
G19遺伝子断片を精製し、pRS435GAPとpRS445GAPのBamHI
-SalI部位に挿入した。ERG19をサブクローン化したプラ
スミドはXbaI認識部位マッピングにより計画通りに作製
できたプラスミドを選抜した。選抜したプラスミドは、
それぞれpRS435GAP-ERG19、pRS445GAP-ERG19とした。

【０１２７】〔実施例7〕 遺伝子導入EUG株によるプレ
ニルアルコール生産 (1) 使用した菌株 EUG株としてEUG5、EUG8、EUG12、EUG24、EUG27、EUG3
6、EUG64を用いた。 (2) 発現プラスミド メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素遺伝子（ERG19）発現プ
ラスミドとしてpRS445GAP-ERG19を用いた。 HMG-CoA還元酵素遺伝子（HMG1）発現プラスミドとしてp
RS434GAP-HMG1、pRS444GAP-HMG1を用い、欠失型HMG1発
現プラスミドとしてはpRS434GAP-HMG026、pRS434GAP-HM
G044、pRS434GAP-HMG056、pRS434GAP-HMG062、pRS434GA
P-HMG076、pRS434GAP-HMG081、pRS434GAP-HMG100、pRS4
34GAP-HMG112、pRS434GAP-HMG122、pRS434GAP-HMG133を
用いた。上記ベクター名のHMG以下の番号は欠失パター
ンを示す (図4B)。欠失部分は 表1 に示したプライマー
DNAを用いPCRによって削除した。 FPP合成酵素遺伝子（ERG20）発現プラスミドとしてpRS4
35GAP-ERG20、pRS445GAP-ERG20を用いた。 GGPP合成酵素遺伝子（BTS1）発現プラスミドとしてpRS4
35GAP-BTS1、pRS445GAP-BTS1を用いた。 (3) 形質転換 Zymo Research (Orange, CA) より購入したFrozen EZ y
east transformationII kitを用いて酵母の形質転換を
行った。形質転換体は、SGR培地をベースにして適宜栄
養要求性を指標とした選択培地寒天プレート上で生育さ
せた。クローン化のため選択培地寒天プレート培養は2
回行った。

【０１２８】(4) 培養 作製した形質転換体をSGR選択培地で前培養し、0.01-0.
05 mlの前培養液を1-5mlのYM7にそれぞれ加え、18mm径
の試験管で30℃ 130 r.p.m.の往復振盪培養で培養し
た。 (5) プレニルアルコール生産量測定 培養液にメタノールを等量加えて混合後、ペンタンを約
二倍量加えて激しく攪拌後静置した。ペンタン層を新し
いガラス試験管にとり、ドラフト中でペンタンを気化さ
せ溶質成分を濃縮後、GC/MSでプレニルアルコールを同
定、定量した。また、その際、菌体増殖の度合いを調べ
るため、培養液50μlを水で30倍に希釈し、600 nmの吸
光度を測定した。プレニルアルコール生産量は、実施例
２(1-2)と同様にHP6890/5973 GC/MSシステムを用いて測
定した。

【０１２９】(6) 結果と考察 (6-1) ERG19発現株のプレニルアルコール生産 まず初めに、メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素遺伝子ERG1
9発現プラスミドをEUG株に導入してみた。pRS445GAP-ER
G19をA451由来のEUG5、YPH499由来のEUG12、YPH500由来
のEUG24株にそれぞれ導入し、プレニルアルコール生産
量を測定した (図18A)。どの株もそれほどFOH生産は向
上していないように見えるが、培養液OD_{6 00}値あたりのF
OH生産量を比較すると、YPH株由来のEUG12、EUG24で2倍
から数倍FOH生産効率がよくなっていた (図18B)。従っ
て、本発明で作製した変異型細胞、すなわちスクアレン
合成酵素遺伝子を完全欠損又は部分欠損させることをせ
ずに、翻訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝子の転写
産物量を減少できる変異型細胞を宿主に用いれば、ERG1
9発現強化により菌体数が少ない環境でも効率よくFOHを
生産することができることがわかった。

【０１３０】(6-2) HMG1、HMG1D 発現株のプレニルアル
コール生産 まず、A451とA451由来のEUG8各5コロニーのプレニルア
ルコール生産量を図19に示す。宿主のEUG8は培養2日後
に平均2.5mg/l（最高3.3mg/l）のFOHを生産していた。p
RS434GAP-HMG1/EUG8（図20A）とpRS444GAP-HMG1/EUG8
（図20B）をそれぞれ5コロニーずつ培養し、プレニルア
ルコール生産量の平均と標準偏差をグラフ化したとこ
ろ、2日後にそれぞれ平均4.8mg/l（最高6.7mg/l）、平
均3.5mg/l（最高4.0mg/l）のFOH生産をしていた。EUG8
を宿主にした場合A451を宿主にした場合と比べてHMG1遺
伝子発現によるプレニルアルコール生産性向上効果が優
れていることがわかった。

【０１３１】次に、HMG1遺伝子発現増強が、YPH499由来
のEUG12及びYPH500由来のEUG27に与える効果について調
べた。なお、HMG1をYPH499、YPH500に導入した株では、
すでに報告されているように(特開平5-192184号公報；
Donald et al. (1997) Appl.Environ. Microbiol. 63,
3341-3344)、SQの増加は観察されるがプレニルアルコー
ルはほとんど生産されないことを予備的実験により確認
してある。EUG12とEUG27の5コロニー由来の液体培養4日
目と7日目の生産量を測定した。EUG12、EUG27のプレニ
ルアルコール生産量を図21に示す。主要生産物はFOHで
あり、その他異性体のNOH がわずかに生産され、GGOHは
ほとんど生産されない。これにHMG1発現プラスミド(pRS
434GAP-HMG1, pRS444GAP-HMG1)を導入した結果を図22に
示す。HMG1遺伝子発現増強によりerg9の表現型がある程
度相補され、菌体量が増加しているのが顕著であった。
さらに、FOH生産量については、EUG12を用いた場合は宿
主に対して約2倍の効果があったが（図22A）、EUG27で
は同レベルであった（図22B）。一方、どちらの株でもG
GOH生産には効果がみられ最大でどちらも2.05mg/lのGGO
Hを蓄積した。GGOH生産については、pRS444GAP-HMG1導
入株の方が効果が高かった。従って、EUG12、EUG27を宿
主にした時、HMG1遺伝子がFOHだけでなくGGOH生産にも
効果があることが示された。ただし、7日培養で生産量
が低下する傾向はEUG株に特徴的なものである。HMG1の
各欠失型遺伝子をEUG5とEUG12で発現させた結果を図23-
24に示す。EUG5において、各欠失型HMG1遺伝子発現増強
により生産性の向上はそれほど顕著ではなかった。EUG1
2においては、HMG完全長遺伝子ほどではなかったがGGOH
生産性の向上に効果があった（図24B）。

【０１３２】(6-3) ERG20発現株のプレニルアルコール
生産 pRS435GAP-ERG20/EUG8（図25A）とpRS445GAP-ERG20/EUG
8（図25B）をそれぞれ5コロニーずつ培養したときのFOH
生産量の平均は、それぞれ0.9 mg/l、0.5mg/lであった
（最大値は1.5mg/l）。次に、ERG20遺伝子発現増強がYP
H499、YPH500由来のEUG12、EUG27に与える効果について
調べた。pRS435GAP-ERG20とpRS445GAP-ERG20を導入した
株をそれぞれ5コロニーずつ培養し、プレニルアルコー
ル生産量の平均と標準偏差をグラフ化したところ、ERG2
0遺伝子発現のプレニルアルコール生産に対する効果
は、pRS435GAP-HMG1をEUG12、EUG27に導入した場合に、
7日培養でそれぞれ平均2.7 mg/l（最大値は3.6mg/l）、
1.1 mg/l（最大値は1.37mg/l）のGGOHを生産した（図26
A,B）。ERG20はFPP合成酵素をコードしているので、ERG
20発現増強によりGGOHが生産されるのは、実はGGPP合成
酵素はホモアリル性プライマー基質としてDMAPPでな
く、FPPを利用しERG20発現増強により細胞内FPP合成活
性があがった結果GGOH生産能が上昇したためであること
が示唆される。従って、ERG20はEUG株においてGGOH生産
に効果があることがわかった。

【０１３３】(6-4) BTS1発現株のプレニルアルコール生
産 pRS435GAP-BTS1/EUG8（図27A）とpRS445GAP-BTS1/EUG8
（図27B）をそれぞれ5コロニーずつ培養し、プレニルア
ルコール生産量の平均と標準偏差をグラフ化したとこ
ろ、BTS1遺伝子発現のプレニルアルコール生産に対する
効果は、pRS435GAP-BTS1を導入した場合に平均0.5 mg/l
程度（最大値は1.42mg/l）のGGOH生産性向上効果がみら
れた。A451株にpRS435GAP-BTS1を導入した場合でも0.1-
0.3 mg/l程度のGGOH生産能があることが予備実験でわか
っているので、EUG株を宿主にした場合でも同様にGGOH
生産に効果があることがわかった。

【０１３４】次に、BTS1遺伝子発現増強がYPH499、YPH5
00由来のEUG12、EUG27に与える効果について調べた。pR
S435GAP-BTS1とpRS445GAP-BTS1を導入した株をそれぞれ
5コロニーずつ培養し、プレニルアルコール生産量の平
均と標準偏差をグラフ化したところ、BTS1遺伝子発現の
プレニルアルコール生産に対する効果は、pRS435GAP-BT
S1を導入した場合に、7日培養で平均3.7-3.8 mg/l程度
（最大値はそれぞれ4.2mg/l、4.4mg/l）のGGOH生産性が
みられた（図28A,B）。YPH499、YPH500株にpRS435GAP-B
TS1を導入した場合でも0.1-0.2 mg/l程度のGGOH生産能
があることが予備実験でわかっているので、EUG株を宿
主にした場合通常の組換え体宿主よりGGOH生産に効果が
あることがわかった。

【０１３５】上記の結果から、本発明で作製した変異型
細胞、すなわちスクアレン合成酵素遺伝子を完全欠損又
は部分欠損させることをせずに、翻訳活性のあるスクア
レン合成酵素遺伝子転写産物量を減少できるようにした
変異型細胞（例えばEUG株）に、IPP合成経路関連酵素遺
伝子（例えばHMG1、ERG20又はBTS1）を含む発現用組換
えDNA又はゲノムインテグレート用DNAを導入して組換え
体を作製し、該組換え体を培養すると、翻訳活性を有す
るスクアレン合成酵素遺伝子の転写産物量が減少するこ
とによって、プレニルアルコールを製造できる系が構築
できたことになる。

【０１３６】〔実施例8〕 融合遺伝子導入EUG株による
プレニルアルコールの生産 実施例7でEUG株を宿主にしFPP合成酵素遺伝子を導入す
るとGGOH生産性が向上する予想外の結果が得られた。こ
れは、S. cerevisiae BTS1がコードしているGGPP合成酵
素は、プライマー基質としてDMAPPよりもFPPを好む事を
示唆している。よって、IPPからGGOH前駆体であるGGPP
への合成能をさらに強化するためには、FPP合成能を同
時に補強する必要があると考えられた。そこで、本実施
例では、BTS1とERG20の融合遺伝子を作製した。

【０１３７】本実施例では、融合遺伝子をS.cerevisiae
細胞内で発現させ、GGOH生産能が向上するかを確かめる
ことにした。また、あわせて小胞体シグナルをコードす
る塩基配列がBTS1、ERG20やその融合タンパク質遺伝子
の3’末端に位置するようにBTS1、ERG20、又はそれらの
融合遺伝子の変異型遺伝子を作製し、作製した遺伝子導
入によるプレニルアルコール生産に与える影響を調べる
ことにした。

【０１３８】(1) 融合遺伝子導入用プラスミドDNAの作
製 GGPP合成酵素遺伝子BTS1をpYES2に組み込んだpYESGGPS
と、FPP合成酵素遺伝子ERG20をpT7に組み込んだpT7ERG2
0とを鋳型に用い、PCRを行った。使用したPCRプライマ
ーは以下の通りである。

【０１３９】SacII-BTS1:5'-TCC CCG CGG ATG GAG GCC
AAG ATA GAT-3'（配列番号70） BTS1-XhoI:5'-CAA CTC GAG TCA CAA TTC GGA TAA GTG-
3'（配列番号71） ERG20HDEL-XbaI:5'-GCT CTA GAG TTC GTC GTG TTT GCT
TCT CTT GTA AAC TT-3'（配列番号72） BTS1HDEL-XhoI:5'-TAT CTC GAG TCA CAA TTC GTC ATG T
AA ATT GG-3'（配列番号73） BTSI-109I:5'-GCA GGG ACC CCA ATT CGG ATA AGT GGT C
-3'（配列番号74） 109I-BTS1:5'-GTA GGG TCC CTG GAG GCC AAG ATA GAT G
-3'（配列番号75） ERG20-109I:5'-GCA GGG ACC CTT TGC TTC TCT TGT AAA
CT-3'（配列番号76） 109I-ERG20:5'-GTA GGG TCC TCA GAA AAA GAA ATT AGG
AG-3'（配列番号77） -21:5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'（配列番号78） T7:5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3'（配列番号79）

【０１４０】ERG20HDEL-XbaIの第3番目-第8番目の塩基
及びBTS1HDEL-XhoIの第4番目-第9番目の塩基（それぞ
れ、6塩基分を下線で施した部分）は、ベクター連結用
のSacII、XhoI又は XbaI認識部位を示す。また、BTSI-1
09I、109I-BTS1、ERG20-109I及び109I-ERG20の第4番目-
第10番目の塩基（それぞれ、7塩基分を下線で施した部
分）は融合遺伝子作製用のEcoO109I認識部位を示す。PC
Rは以下の反応液で行った。

【０１４１】

【０１４２】KOD-Plusには1.6 μg/μlのKOD抗体が含ま
れている。反応条件は、94℃ で2分の反応後、94℃ 15
秒、55℃ 30秒及び68℃ 1分のサイクルを30サイクル行
い、その後68℃ 2分保温した。1st PCRは以下の鋳型、
プライマー（primer 1, primer 2）の組合せで行った。
(表6、図29)。PCR産物名も表6及び図29に示した。図29
において、最も左側の列に最終的なプラスミド名を記し
た。グレーの文字で示した配列はアミノ酸配列を意味
し、このうちGSは融合遺伝子の結合配列に導入し、HDEL
は小胞体シグナルとして、挿入又は欠失変異により遺伝
子3’末端に位置するようにした。くさび形矢印は、PCR
で使用したプライマーの位置と向きを示している。

【０１４３】

【表６】

【０１４４】PCR産物#9、#10、#11、#12、#13、#14を制
限酵素EcoO109Iで消化後、#9と#11、#10と#12、#9と#1
3、#10と#14とをそれぞれライゲーションした。このラ
イゲーション溶液をPCRの鋳型とし、それぞれ、SacII-B
TS1と-21、T7とBTS1-XhoI、SacII-BTS1とERG20HDEL-Xba
I、T7とBTS1HDEL-XhoIを、それぞれprimer 1とprimer2
に用いて、2nd PCRを1st PCRと同じ条件で行い、2nd PC
R産物#9-#11、#10-#12、#9-#13、#10-#14を得た。

【０１４５】#9-#11をSacIIとBamHIで切断後pRS435GAP
とpRS445GAPのSacII-BamHI部位に挿入し、それぞれpRS4
35GGFとpRS445GGFとした。#10-#12をXbaIとXhoIで切断
後pRS435GAPとpRS445GAPのXbaI-XhoI部位に挿入し、そ
れぞれpRS435FGGとpRS445FGGとした。#9-#13をSacIIとX
baIで切断後pRS435GAPのSacII-XbaI部位に挿入し、それ
ぞれpRS435GGFHDELとした。

【０１４６】#10-#14をXbaIとXhoIで切断後pRS435GAPと
pRS445GAPのXbaI-XhoI部位に挿入し、それぞれpRS435FG
GHDELとpRS445FGGHDELとした。#7をSacIIとXbaIで切断
後pRS435GAPとpRS445GAPのSacII-XbaI部位に挿入し、そ
れぞれpRS435FHDELとpRS445FHDELとした。#6をBamHIとX
hoIで切断後pRS435GAPとpRS445GAPのBamHI-XhoI部位に
挿入し、それぞれpRS435GGHDELとpRS445GGHDELとした。

【０１４７】作製したプラスミドDNAは、DNAシークエン
シングにより設計通りの塩基配列を持っていることを確
認してある。BTS1-ERG20融合遺伝子をGGF、ERG20-BTS1
融合遺伝子をFGG、GGFの3’末端にHDELをコードする配
列が位置するように組換えた遺伝子をGGFHDEL、FGGの
3’末端にHDELをコードする配列が位置するように組換
えた遺伝子をFGGHDELとし、BTS1の3’末端にHDELをコー
ドする配列が位置するように組換えた遺伝子をGGHDELと
した。

【０１４８】融合遺伝子でないBTS1、ERG20の発現プラ
スミドとして、pRS435GAP-BTS1（pRS435GGという）、pR
S445GAP-BTS1（pRS445GGという）、pRS435GAP-ERG20（p
RS435Fという）、pRS445GAP-ERG20（pRS445FGという）
を利用し、HMG1発現用に使用したプラスミドとしてpRS4
34TEF-HMG1とpRS434GAP-HMG1を利用した。

【０１４９】(2) 組換え体の作製 組換え体の作製は、Zymo Research (Orange, CA)のFroz
en EZ yeast transformation kitを用いて、上記の通り
作製したプラスミドを宿主に導入することにより行っ
た。宿主はEUG5、EUG12を使用し、対照としてA451、YPH
499、を使用した。

【０１５０】(3) プレニルアルコール生産量測定 A451とYPH499はSD培地に接種し、EUG株、及びEUG株を宿
主にしたさらなる組換え体をSGR選択培地に接種し、30
℃で培養し前培養液とした。培養した前培養液10又は25
μlを、1.0若しくは2.5 mlのYM7+ade (YM, pH7, 40 μ
g/ml アデニン硫酸塩) 培地又はYMO7 (YM7+ade, 1%(w/
v)大豆油, 0.1%(w/v) アデカノール LG-109 (Asahi Den
ka Kogyo, Tokyo, Japan)) 培地に加え、30℃で4日間又
は7日間130r.p.m.で往復振盪培養した。

【０１５１】培養後、メタノールを等量加えて混合し、
ペンタンを約2倍量加えて激しく攪拌した。静置後、ペ
ンタン層を新しいガラス試験管にとり、ドラフト中でペ
ンタンを気化させ、溶質成分を濃縮後、GC/MSでプレニ
ルアルコールを同定・定量し、内部標準としてウンデカ
ノールを用いて定量した。また、その際、菌体増殖の度
合いを調べるため、培養液20 μlを水で30倍に希釈し、
600 nmの吸光度を測定した。プレニルアルコール生産量
は、実施例２(1-2)と同様にHP6890/5973 GC/MSシステム
を用いて測定した。

【０１５２】(4) 結果と考察 作製した各組換え体をYM7培地とYMO7培地で4日から7日
培養し、プレニルアルコール生産量を測定した。A451系
統の株を宿主としたときの結果を図30、31に示し、YPH4
99系統の株を宿主としたときの結果を図32、33に示し
た。図30、31において、GGFHDELはpRS435GGFHDELを示
す。「-1」は4日培養後の生産量、「-2」は7日培養後の
生産量を示す。YMO7培地では大豆油懸濁のため菌体量を
細胞数で示した。「10^3 cell/ul」は1マイクロリット
ルあたりの細胞数を1000で割った値を示す。

【０１５３】pRS435GGF/A451は、YM7培地で7日培養した
ときの生産量（図30、上パネルGGF/A451 -2）が平均0.2
6mg/l GGOH (最大0.28mg/l)であり、YMO7培地中では平
均0.98 mg/l (最大1.0mg/l)（図31、上パネルのGGF/A45
1-2）であった。一方、EUG5を宿主にした場合は、pRS43
5GGF導入により、YM7培地、7日間培養で平均6.6mg/l
（最大7.3mg/l）GGOHであり（図30、下パネルのGGF/EUG
5-2）、YMO7培地で培養すると平均9.6mg/l（最大10.1mg
/l）のGGOHを生産するようになった（図31、下パネルの
GGF/EUG5-2）。

【０１５４】pRS435GGFを導入したYPH499をYM7で7日間
培養したときに平均0.19mg/l（最大0.37mg/l）（図32、
上パネルのGGF/YPH499-2）、YMO7培地では平均2.5mg/l
（最大2.9mg/l）のGGOHを生産した（図33、上パネルのG
GF/YPH499-2）。一方、YPH499から作製したEUG12株を宿
主にしたときには、pRS435GGFやpRS435GGFHDEL導入株を
YMO培地で培養すると3.7-4.0mg/l（最大5.4-5.8mg/l）
のGGOHを生産し（図33、下パネルのGGF/EUG12-2, GGFHD
EL/EUG12-2）。したがって、YPH499やA451と言った通常
組換え宿主を用いてGGOH生産株を作製するよりも、本発
明で作製したスクアレン合成酵素遺伝子を完全欠損又は
部分欠損させることをせずに、翻訳活性のあるスクアレ
ン合成酵素遺伝子転写産物量を減少できるようにした変
異型細胞であるEUG5やEUG12を宿主にしたほうが、よりG
GOH高生産性の組換え体を作製できることが示された。

【０１５５】〔実施例9〕 各グルコース-ガラクトース
糖組成培地を用いたときの遺伝子導入EUG株によるプレ
ニルアルコール生産 (1) ベクターの宿主への導入及び培養 本実施例では、Glc-Gal糖組成変化により出芽酵母のプ
レニルアルコール生産がどう変わるかを確認する。併せ
て、BTS1-ERG20融合遺伝子発現によるプレニルアルコー
ル生産への効果も調べる。

【０１５６】Zymo Research (Orange, CA) より購入し
たFrozen EZ yeast transformationII kitを用いて酵母
にベクターの導入を行った。ERG20、BTS1融合遺伝子発
現プラスミドとしてpRS435GGF、pRS435GGFHDELを用い
た。また、宿主としてEUG5、EUG12を用いた。対照の宿
主としてA451、YPH499を用いた。

【０１５７】各組換え体はSGR選択培地で前培養し、0.0
1-0.05mlの前培養液を1-5mlのYM7培地にそれぞれ加え、
18mm径の試験管で30℃、130r.p.m.の往復振盪培養条件
で培養した。YM7培地の糖成分（GlcとGalとの組成比）
として、0%、Glc-100%Gal、20%Glc-80%Gal、50%Glc-50%
Gal、75%Glc-25%Gal、100%Glc-0%Galの組成の各培地を
作製し、これらの培地でまず30℃、130r.p.m.の往復振
盪培養条件で培養した。2日培養後、終濃度5%(w/v)にな
るようにGlcをさらに加え、培養を7日目まで継続した。

【０１５８】(2) 結果と考察 (2-1) EUG5のGGOH生産 EUG5にpRS435GGF、pRS435GGFHDELを導入したときのGGOH
生産の結果を図34に示す。pRS435GGF導入株（図34中、
「GGF/EUG5」と表示）及びpRS435GGFHDEL導入株（図34
中、「HDEL/EUG5」と表示）のいずれの場合も、2-4日の
培養、初期条件20-80%Glcが良好であった。

【０１５９】(2-2) EUG12のGGOH生産 EUG12にpRS435GGF、pRS435GGFHDELを導入したときのプ
レニルアルコール生産の結果を図35に示す。初期条件20
%Glcのときに、いずれの場合（宿主、発現プラスミド）
でも高いプレニルアルコールの生産性を示した。pRS435
GGF/EUG12（図35中、「GGF/EUG12」と表示）とpRS435GG
FHDEL/EUG12（図35中、「HDEL/EUG12」と表示）の初期
条件20%Glc、4日培養の場合は、それぞれ菌体がOD₆₀₀＝
1.1、0.70に相当する量であっても、FOHは、それぞれ平
均7.6mg/l(最大10.5mg/l)、平均8.1mg/l(最大12.6mg/l)
（図面に表示せず）であった一方、GGOHは、それぞれ平
均5.4mg/l(最大7.0mg/l)、5.6mg/l（最大8.0mg/l）の生
産性があった。これは、菌体あたりの生産性としては非
常に効率が良いと考えられる。

【０１６０】〔実施例10〕 YPDO7rich培地を用いたと
きのプレニルアルコール生産量 (1) 培養とプレニルアルコール量測定 実施例1で作製したEUG5、EUG24、EUG36及びEUG64、並び
にそれらを宿主としてpRS434GAP-HMG1を導入した組換え
体、その作製した各組換え体にさらにpRS435GGを導入し
た組換え体をYPDO7rich培地（YPD, 1%(v/v) 大豆油, 0.
1%(v/v) アデカノール LG-109, 5%(w/v) Glc (終濃度 7
%(w/v) Glc), pH7）で30℃、130r.p.m.で往復振盪培養
し実施例2と同様にしてプレニルアルコール量を測定し
た。

【０１６１】(2) 結果と考察 培養液中のプレニルアルコール蓄積量と600nmの吸光度O
D₆₀₀をグラフにまとめたものが図36である。YM培地より
窒素源と糖源を高濃度で含むYPDO7rich培地培養によ
り、より高濃度のプレニルアルコールを生産させること
ができた。EUG5をYPDO7rich培地で培養すると3日培養後
にFOHとGGOHをそれぞれ57.5mg/l、1.70mg/l生産した
（図36中「EUG5 in YPDO7rich」）。EUG24は培養3日後
にそれぞれ42.2mg/l、0.87mg/lを（図36中「EUG24 in Y
PDO7rich」）、EUG36は培養7日後にそれぞれ37.8mg/l、
0.98mg/lを（図36中「EUG36 in YPDO7rich」）、EUG64
は培養7日後にそれぞれ101.7mg/l、2.92mg・l（図36中
「EUG64 in YPDO7rich」）生産した。つまり、本発明で
作製したスクアレン合成酵素遺伝子を完全欠損又は部分
欠損させることをせずに、翻訳活性のあるスクアレン合
成酵素遺伝子転写産物量を減少できるようにした変異型
細胞、たとえばEUG64を宿主に用い、IPP合成経路関連酵
素遺伝子を含む発現用組換えDNA又はゲノムインテグレ
ート用DNAを導入して組換え体を作製し、組換え体を培
養した後、翻訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝子転
写産物量を減少させれば、単純なスクアレン合成酵素遺
伝子欠損株、たとえばS. cerevisiae ATCC64031とは異
なり、エルゴステロール要求性に起因する培地へのステ
ロール類の添加をしなくても培養液1リットルあたり0.1
gを超えるプレニルアルコール生産系を構築することが
できることがわかった。

【０１６２】HMG1を導入した組換え体ではEUG5宿主の場
合3日培養後FOHを67.9mg/l生産した（図36中「HMG1/EUG
5 in YPDO7rich」）が、その他のEUG株では宿主よりFOH
生産性が向上しなかった。HMG1を導入した組換え体にさ
らにBTS1を導入したEUG5では、FOH生産を宿主並に確保
しつつGGOH高生産を示し、3日培養後に16.7mg/l、7日培
養後に19.8mg/l生産した（図36中「BTS1&HMG1/EUG5 in
YPDO7rich」）。特にEUG64を宿主とした場合7日培養後
に62.7mg/lのGGOHを生産した。つまり、本発明で作製し
た変異型細胞、すなわちスクアレン合成酵素遺伝子を完
全欠損又は部分欠損させることをせずに、翻訳活性のあ
るスクアレン合成酵素遺伝子転写産物量を減少できるよ
うにした変異型細胞（例えばEUG64）を宿主に用い、IPP
合成経路関連酵素遺伝子を含む発現用組換えDNA又はゲ
ノムインテグレート用DNAを導入して組換え体を作製
し、その組換え体を培養すると、翻訳活性のあるスクア
レン合成酵素遺伝子の転写産物量が減少することによっ
て、単純なスクアレン合成酵素遺伝子欠損株、例えばS.
cerevisiae ATCC64031株の培養液では検出されない種
類のプレニルアルコール（例えばGGOH）を、培養液1リ
ットルあたり0.06gを超えるレベルで生産させる系を構
築することができることがわかった。

【０１６３】

【発明の効果】本発明により、各種天然型の幾何異性を
有するプレニルアルコールの製造方法が提供される。本
発明によれば、各種天然型の幾何異性を有する活性型プ
レニルアルコールを大量に入手できるため、生体内にお
いて重要な膨大な種類のイソプレノイド・テルペノイド
化合物の工業生産に利用することができる点で、また、
活性型プレニルアルコールの新たな生理活性を見出すた
めの基本システムとして利用できる点で、本発明の方法
は有用である。

【０１６４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TOYOTA JIDOSHA KABUSHIKI KAISHA <120> A METHOD OF PRODUCING PRENYLALCOHOL <130> P00-0911 <140> <141> <160> 79 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1059 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> CDS <222> (1)..(1056) <400> 1 atg gct tca gaa aaa gaa att agg aga gag aga ttc ttg aac gtt ttc 48 Met Ala Ser Glu Lys Glu Ile Arg Arg Glu Arg Phe Leu Asn Val Phe 1 5 10 15 cct aaa tta gta gag gaa ttg aac gca tcg ctt ttg gct tac ggt atg 96 Pro Lys Leu Val Glu Glu Leu Asn Ala Ser Leu Leu Ala Tyr Gly Met 20 25 30 cct aag gaa gca tgt gac tgg tat gcc cac tca ttg aac tac aac act 144 Pro Lys Glu Ala Cys Asp Trp Tyr Ala His Ser Leu Asn Tyr Asn Thr 35 40 45 cca ggc ggt aag cta aat aga ggt ttg tcc gtt gtg gac acg tat gct 192 Pro Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Val Asp Thr Tyr Ala 50 55 60 att ctc tcc aac aag acc gtt gaa caa ttg ggg caa gaa gaa tac gaa 240 Ile Leu Ser Asn Lys Thr Val Glu Gln Leu Gly Gln Glu Glu Tyr Glu 65 70 75 80 aag gtt gcc att cta ggt tgg tgc att gag ttg ttg cag gct tac ttc 288 Lys Val Ala Ile Leu Gly Trp Cys Ile Glu Leu Leu Gln Ala Tyr Phe 85 90 95 ttg gtc gcc gat gat atg atg gac aag tcc att acc aga aga ggc caa 336 Leu Val Ala Asp Asp Met Met Asp Lys Ser Ile Thr Arg Arg Gly Gln 100 105 110 cca tgt tgg tac aag gtt cct gaa gtt ggg gaa att gcc atc aat gac 384 Pro Cys Trp Tyr Lys Val Pro Glu Val Gly Glu Ile Ala Ile Asn Asp 115 120 125 gca ttc atg tta gag gct gct atc tac aag ctt ttg aaa tct cac ttc 432 Ala Phe Met Leu Glu Ala Ala Ile Tyr Lys Leu Leu Lys Ser His Phe 130 135 140 aga aac gaa aaa tac tac ata gat atc acc gaa ttg ttc cat gag gtc 480 Arg Asn Glu Lys Tyr Tyr Ile Asp Ile Thr Glu Leu Phe His Glu Val 145 150 155 160 acc ttc caa acc gaa ttg ggc caa ttg atg gac tta atc act gca cct 528 Thr Phe Gln Thr Glu Leu Gly Gln Leu Met Asp Leu Ile Thr Ala Pro 165 170 175 gaa gac aaa gtc gac ttg agt aag ttc tcc cta aag aag cac tcc ttc 576 Glu Asp Lys Val Asp Leu Ser Lys Phe Ser Leu Lys Lys His Ser Phe 180 185 190 ata gtt act ttc aag act gct tac tat tct ttc tac ttg cct gtc gca 624 Ile Val Thr Phe Lys Thr Ala Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro Val Ala 195 200 205 ttg gcc atg tac gtt gcc ggt atc acg gat gaa aag gat ttg aaa caa 672 Leu Ala Met Tyr Val Ala Gly Ile Thr Asp Glu Lys Asp Leu Lys Gln 210 215 220 gcc aga gat gtc ttg att cca ttg ggt gaa tac ttc caa att caa gat 720 Ala Arg Asp Val Leu Ile Pro Leu Gly Glu Tyr Phe Gln Ile Gln Asp 225 230 235 240 gac tac tta gac tgc ttc ggt acc cca gaa cag atc ggt aag atc ggt 768 Asp Tyr Leu Asp Cys Phe Gly Thr Pro Glu Gln Ile Gly Lys Ile Gly 245 250 255 aca gat atc caa gat aac aaa tgt tct tgg gta atc aac aag gca ttg 816 Thr Asp Ile Gln Asp Asn Lys Cys Ser Trp Val Ile Asn Lys Ala Leu 260 265 270 gaa ctt gct tcc gca gaa caa aga aag act tta gac gaa aat tac ggt 864 Glu Leu Ala Ser Ala Glu Gln Arg Lys Thr Leu Asp Glu Asn Tyr Gly 275 280 285 aag aag gac tca gtc gca gaa gcc aaa tgc aaa aag att ttc aat gac 912 Lys Lys Asp Ser Val Ala Glu Ala Lys Cys Lys Lys Ile Phe Asn Asp 290 295 300 ttg aaa att gaa cag cta tac cac gaa tat gaa gag tct att gcc aag 960 Leu Lys Ile Glu Gln Leu Tyr His Glu Tyr Glu Glu Ser Ile Ala Lys 305 310 315 320 gat ttg aag gcc aaa att tct cag gtc gat gag tct cgt ggc ttc aaa 1008 Asp Leu Lys Ala Lys Ile Ser Gln Val Asp Glu Ser Arg Gly Phe Lys 325 330 335 gct gat gtc tta act gcg ttc ttg aac aaa gtt tac aag aga agc aaa 1056 Ala Asp Val Leu Thr Ala Phe Leu Asn Lys Val Tyr Lys Arg Ser Lys 340 345 350 tag 1059 <210> 2 <211> 352 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 Met Ala Ser Glu Lys Glu Ile Arg Arg Glu Arg Phe Leu Asn Val Phe 1 5 10 15 Pro Lys Leu Val Glu Glu Leu Asn Ala Ser Leu Leu Ala Tyr Gly Met 20 25 30 Pro Lys Glu Ala Cys Asp Trp Tyr Ala His Ser Leu Asn Tyr Asn Thr 35 40 45 Pro Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Val Asp Thr Tyr Ala 50 55 60 Ile Leu Ser Asn Lys Thr Val Glu Gln Leu Gly Gln Glu Glu Tyr Glu 65 70 75 80 Lys Val Ala Ile Leu Gly Trp Cys Ile Glu Leu Leu Gln Ala Tyr Phe 85 90 95 Leu Val Ala Asp Asp Met Met Asp Lys Ser Ile Thr Arg Arg Gly Gln 100 105 110 Pro Cys Trp Tyr Lys Val Pro Glu Val Gly Glu Ile Ala Ile Asn Asp 115 120 125 Ala Phe Met Leu Glu Ala Ala Ile Tyr Lys Leu Leu Lys Ser His Phe 130 135 140 Arg Asn Glu Lys Tyr Tyr Ile Asp Ile Thr Glu Leu Phe His Glu Val 145 150 155 160 Thr Phe Gln Thr Glu Leu Gly Gln Leu Met Asp Leu Ile Thr Ala Pro 165 170 175 Glu Asp Lys Val Asp Leu Ser Lys Phe Ser Leu Lys Lys His Ser Phe 180 185 190 Ile Val Thr Phe Lys Thr Ala Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro Val Ala 195 200 205 Leu Ala Met Tyr Val Ala Gly Ile Thr Asp Glu Lys Asp Leu Lys Gln 210 215 220 Ala Arg Asp Val Leu Ile Pro Leu Gly Glu Tyr Phe Gln Ile Gln Asp 225 230 235 240 Asp Tyr Leu Asp Cys Phe Gly Thr Pro Glu Gln Ile Gly Lys Ile Gly 245 250 255 Thr Asp Ile Gln Asp Asn Lys Cys Ser Trp Val Ile Asn Lys Ala Leu 260 265 270 Glu Leu Ala Ser Ala Glu Gln Arg Lys Thr Leu Asp Glu Asn Tyr Gly 275 280 285 Lys Lys Asp Ser Val Ala Glu Ala Lys Cys Lys Lys Ile Phe Asn Asp 290 295 300 Leu Lys Ile Glu Gln Leu Tyr His Glu Tyr Glu Glu Ser Ile Ala Lys 305 310 315 320 Asp Leu Lys Ala Lys Ile Ser Gln Val Asp Glu Ser Arg Gly Phe Lys 325 330 335 Ala Asp Val Leu Thr Ala Phe Leu Asn Lys Val Tyr Lys Arg Ser Lys 340 345 350 <210> 3 <211> 900 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(897) <400> 3 atg gac ttt ccg cag caa ctc gaa gcc tgc gtt aag cag gcc aac cag 48 Met Asp Phe Pro Gln Gln Leu Glu Ala Cys Val Lys Gln Ala Asn Gln 1 5 10 15 gcg ctg agc cgt ttt atc gcc cca ctg ccc ttt cag aac act ccc gtg 96 Ala Leu Ser Arg Phe Ile Ala Pro Leu Pro Phe Gln Asn Thr Pro Val 20 25 30 gtc gaa acc atg cag tat ggc gca tta tta ggt ggt aag cgc ctg cga 144 Val Glu Thr Met Gln Tyr Gly Ala Leu Leu Gly Gly Lys Arg Leu Arg 35 40 45 cct ttc ctg gtt tat gcc acc ggt cat atg ttc ggc gtt agc aca aac 192 Pro Phe Leu Val Tyr Ala Thr Gly His Met Phe Gly Val Ser Thr Asn 50 55 60 acg ctg gac gca ccc gct gcc gcc gtt gag tgt atc cac gct tac tca 240 Thr Leu Asp Ala Pro Ala Ala Ala Val Glu Cys Ile His Ala Tyr Ser 65 70 75 80 tta att cat gat gat tta ccg gca atg gat gat gac gat ctg cgt cgc 288 Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ala Met Asp Asp Asp Asp Leu Arg Arg 85 90 95 ggt ttg cca acc tgc cat gtg aag ttt ggc gaa gca aac gcg att ctc 336 Gly Leu Pro Thr Cys His Val Lys Phe Gly Glu Ala Asn Ala Ile Leu 100 105 110 gct ggc gac gct tta caa acg ctg gcg ttc tcg att tta agc gat gcc 384 Ala Gly Asp Ala Leu Gln Thr Leu Ala Phe Ser Ile Leu Ser Asp Ala 115 120 125 gat atg ccg gaa gtg tcg gac cgc gac aga att tcg atg att tct gaa 432 Asp Met Pro Glu Val Ser Asp Arg Asp Arg Ile Ser Met Ile Ser Glu 130 135 140 ctg gcg agc gcc agt ggt att gcc gga atg tgc ggt ggt cag gca tta 480 Leu Ala Ser Ala Ser Gly Ile Ala Gly Met Cys Gly Gly Gln Ala Leu 145 150 155 160 gat tta gac gcg gaa ggc aaa cac gta cct ctg gac gcg ctt gag cgt 528 Asp Leu Asp Ala Glu Gly Lys His Val Pro Leu Asp Ala Leu Glu Arg 165 170 175 att cat cgt cat aaa acc ggc gca ttg att cgc gcc gcc gtt cgc ctt 576 Ile His Arg His Lys Thr Gly Ala Leu Ile Arg Ala Ala Val Arg Leu 180 185 190 ggt gca tta agc gcc gga gat aaa gga cgt cgt gct ctg ccg gta ctc 624 Gly Ala Leu Ser Ala Gly Asp Lys Gly Arg Arg Ala Leu Pro Val Leu 195 200 205 gac aag tat gca gag agc atc ggc ctt gcc ttc cag gtt cag gat gac 672 Asp Lys Tyr Ala Glu Ser Ile Gly Leu Ala Phe Gln Val Gln Asp Asp 210 215 220 atc ctg gat gtg gtg gga gat act gca acg ttg gga aaa cgc cag ggt 720 Ile Leu Asp Val Val Gly Asp Thr Ala Thr Leu Gly Lys Arg Gln Gly 225 230 235 240 gcc gac cag caa ctt ggt aaa agt acc tac cct gca ctt ctg ggt ctt 768 Ala Asp Gln Gln Leu Gly Lys Ser Thr Tyr Pro Ala Leu Leu Gly Leu 245 250 255 gag caa gcc cgg aag aaa gcc cgg gat ctg atc gac gat gcc cgt cag 816 Glu Gln Ala Arg Lys Lys Ala Arg Asp Leu Ile Asp Asp Ala Arg Gln 260 265 270 tcg ctg aaa caa ctg gct gaa cag tca ctc gat acc tcg gca ctg gaa 864 Ser Leu Lys Gln Leu Ala Glu Gln Ser Leu Asp Thr Ser Ala Leu Glu 275 280 285 gcg cta gcg gac tac atc atc cag cgt aat aaa taa 900 Ala Leu Ala Asp Tyr Ile Ile Gln Arg Asn Lys 290 295 <210> 4 <211> 299 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Met Asp Phe Pro Gln Gln Leu Glu Ala Cys Val Lys Gln Ala Asn Gln 1 5 10 15 Ala Leu Ser Arg Phe Ile Ala Pro Leu Pro Phe Gln Asn Thr Pro Val 20 25 30 Val Glu Thr Met Gln Tyr Gly Ala Leu Leu Gly Gly Lys Arg Leu Arg 35 40 45 Pro Phe Leu Val Tyr Ala Thr Gly His Met Phe Gly Val Ser Thr Asn 50 55 60 Thr Leu Asp Ala Pro Ala Ala Ala Val Glu Cys Ile His Ala Tyr Ser 65 70 75 80 Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ala Met Asp Asp Asp Asp Leu Arg Arg 85 90 95 Gly Leu Pro Thr Cys His Val Lys Phe Gly Glu Ala Asn Ala Ile Leu 100 105 110 Ala Gly Asp Ala Leu Gln Thr Leu Ala Phe Ser Ile Leu Ser Asp Ala 115 120 125 Asp Met Pro Glu Val Ser Asp Arg Asp Arg Ile Ser Met Ile Ser Glu 130 135 140 Leu Ala Ser Ala Ser Gly Ile Ala Gly Met Cys Gly Gly Gln Ala Leu 145 150 155 160 Asp Leu Asp Ala Glu Gly Lys His Val Pro Leu Asp Ala Leu Glu Arg 165 170 175 Ile His Arg His Lys Thr Gly Ala Leu Ile Arg Ala Ala Val Arg Leu 180 185 190 Gly Ala Leu Ser Ala Gly Asp Lys Gly Arg Arg Ala Leu Pro Val Leu 195 200 205 Asp Lys Tyr Ala Glu Ser Ile Gly Leu Ala Phe Gln Val Gln Asp Asp 210 215 220 Ile Leu Asp Val Val Gly Asp Thr Ala Thr Leu Gly Lys Arg Gln Gly 225 230 235 240 Ala Asp Gln Gln Leu Gly Lys Ser Thr Tyr Pro Ala Leu Leu Gly Leu 245 250 255 Glu Gln Ala Arg Lys Lys Ala Arg Asp Leu Ile Asp Asp Ala Arg Gln 260 265 270 Ser Leu Lys Gln Leu Ala Glu Gln Ser Leu Asp Thr Ser Ala Leu Glu 275 280 285 Ala Leu Ala Asp Tyr Ile Ile Gln Arg Asn Lys 290 295 <210> 5 <211> 1008 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> CDS <222> (1)..(1005) <400> 5 atg gag gcc aag ata gat gag ctg atc aat aat gat cct gtt tgg tcc 48 Met Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Ile Asn Asn Asp Pro Val Trp Ser 1 5 10 15 agc caa aat gaa agc ttg att tca aaa cct tat aat cac atc ctt ttg 96 Ser Gln Asn Glu Ser Leu Ile Ser Lys Pro Tyr Asn His Ile Leu Leu 20 25 30 aaa cct ggc aag aac ttt aga cta aat tta ata gtt caa att aac aga 144 Lys Pro Gly Lys Asn Phe Arg Leu Asn Leu Ile Val Gln Ile Asn Arg 35 40 45 gtt atg aat ttg ccc aaa gac cag ctg gcc ata gtt tcg caa att gtt 192 Val Met Asn Leu Pro Lys Asp Gln Leu Ala Ile Val Ser Gln Ile Val 50 55 60 gag ctc ttg cat aat tcc agc ctt tta atc gac gat ata gaa gat aat 240 Glu Leu Leu His Asn Ser Ser Leu Leu Ile Asp Asp Ile Glu Asp Asn 65 70 75 80 gct ccc ttg aga agg gga cag acc act tct cac tta atc ttc ggt gta 288 Ala Pro Leu Arg Arg Gly Gln Thr Thr Ser His Leu Ile Phe Gly Val 85 90 95 ccc tcc act ata aac acc gca aat tat atg tat ttc aga gcc atg caa 336 Pro Ser Thr Ile Asn Thr Ala Asn Tyr Met Tyr Phe Arg Ala Met Gln 100 105 110 ctt gta tcg cag cta acc aca aaa gag cct ttg tat cat aat ttg att 384 Leu Val Ser Gln Leu Thr Thr Lys Glu Pro Leu Tyr His Asn Leu Ile 115 120 125 acg att ttc aac gaa gaa ttg atc aat cta cat agg gga caa ggc ttg 432 Thr Ile Phe Asn Glu Glu Leu Ile Asn Leu His Arg Gly Gln Gly Leu 130 135 140 gat ata tac tgg aga gac ttt ctg cct gaa atc ata cct act cag gag 480 Asp Ile Tyr Trp Arg Asp Phe Leu Pro Glu Ile Ile Pro Thr Gln Glu 145 150 155 160 atg tat ttg aat atg gtt atg aat aaa aca ggc ggc ctt ttc aga tta 528 Met Tyr Leu Asn Met Val Met Asn Lys Thr Gly Gly Leu Phe Arg Leu 165 170 175 acg ttg aga ctc atg gaa gcg ctg tct cct tcc tca cac cac ggc cat 576 Thr Leu Arg Leu Met Glu Ala Leu Ser Pro Ser Ser His His Gly His 180 185 190 tcg ttg gtt cct ttc ata aat ctt ctg ggt att att tat cag att aga 624 Ser Leu Val Pro Phe Ile Asn Leu Leu Gly Ile Ile Tyr Gln Ile Arg 195 200 205 gat gat tac ttg aat ttg aaa gat ttc caa atg tcc agc gaa aaa ggc 672 Asp Asp Tyr Leu Asn Leu Lys Asp Phe Gln Met Ser Ser Glu Lys Gly 210 215 220 ttt gct gag gac att aca gag ggg aag tta tct ttt ccc atc gtc cac 720 Phe Ala Glu Asp Ile Thr Glu Gly Lys Leu Ser Phe Pro Ile Val His 225 230 235 240 gcc ctt aac ttc act aaa acg aaa ggt caa act gag caa cac aat gaa 768 Ala Leu Asn Phe Thr Lys Thr Lys Gly Gln Thr Glu Gln His Asn Glu 245 250 255 att cta aga att ctc ctg ttg agg aca agt gat aaa gat ata aaa cta 816 Ile Leu Arg Ile Leu Leu Leu Arg Thr Ser Asp Lys Asp Ile Lys Leu 260 265 270 aag ctg att caa ata ctg gaa ttc gac acc aat tca ttg gcc tac acc 864 Lys Leu Ile Gln Ile Leu Glu Phe Asp Thr Asn Ser Leu Ala Tyr Thr 275 280 285 aaa aat ttt att aat caa tta gtg aat atg ata aaa aat gat aat gaa 912 Lys Asn Phe Ile Asn Gln Leu Val Asn Met Ile Lys Asn Asp Asn Glu 290 295 300 aat aag tat tta cct gat ttg gct tcg cat tcc gac acc gcc acc aat 960 Asn Lys Tyr Leu Pro Asp Leu Ala Ser His Ser Asp Thr Ala Thr Asn 305 310 315 320 tta cat gac gaa ttg tta tat ata ata gac cac tta tcc gaa ttg tga 1008 Leu His Asp Glu Leu Leu Tyr Ile Ile Asp His Leu Ser Glu Leu 325 330 335 <210> 6 <211> 335 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 6 Met Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Ile Asn Asn Asp Pro Val Trp Ser 1 5 10 15 Ser Gln Asn Glu Ser Leu Ile Ser Lys Pro Tyr Asn His Ile Leu Leu 20 25 30 Lys Pro Gly Lys Asn Phe Arg Leu Asn Leu Ile Val Gln Ile Asn Arg 35 40 45 Val Met Asn Leu Pro Lys Asp Gln Leu Ala Ile Val Ser Gln Ile Val 50 55 60 Glu Leu Leu His Asn Ser Ser Leu Leu Ile Asp Asp Ile Glu Asp Asn 65 70 75 80 Ala Pro Leu Arg Arg Gly Gln Thr Thr Ser His Leu Ile Phe Gly Val 85 90 95 Pro Ser Thr Ile Asn Thr Ala Asn Tyr Met Tyr Phe Arg Ala Met Gln 100 105 110 Leu Val Ser Gln Leu Thr Thr Lys Glu Pro Leu Tyr His Asn Leu Ile 115 120 125 Thr Ile Phe Asn Glu Glu Leu Ile Asn Leu His Arg Gly Gln Gly Leu 130 135 140 Asp Ile Tyr Trp Arg Asp Phe Leu Pro Glu Ile Ile Pro Thr Gln Glu 145 150 155 160 Met Tyr Leu Asn Met Val Met Asn Lys Thr Gly Gly Leu Phe Arg Leu 165 170 175 Thr Leu Arg Leu Met Glu Ala Leu Ser Pro Ser Ser His His Gly His 180 185 190 Ser Leu Val Pro Phe Ile Asn Leu Leu Gly Ile Ile Tyr Gln Ile Arg 195 200 205 Asp Asp Tyr Leu Asn Leu Lys Asp Phe Gln Met Ser Ser Glu Lys Gly 210 215 220 Phe Ala Glu Asp Ile Thr Glu Gly Lys Leu Ser Phe Pro Ile Val His 225 230 235 240 Ala Leu Asn Phe Thr Lys Thr Lys Gly Gln Thr Glu Gln His Asn Glu 245 250 255 Ile Leu Arg Ile Leu Leu Leu Arg Thr Ser Asp Lys Asp Ile Lys Leu 260 265 270 Lys Leu Ile Gln Ile Leu Glu Phe Asp Thr Asn Ser Leu Ala Tyr Thr 275 280 285 Lys Asn Phe Ile Asn Gln Leu Val Asn Met Ile Lys Asn Asp Asn Glu 290 295 300 Asn Lys Tyr Leu Pro Asp Leu Ala Ser His Ser Asp Thr Ala Thr Asn 305 310 315 320 Leu His Asp Glu Leu Leu Tyr Ile Ile Asp His Leu Ser Glu Leu 325 330 335 <210> 7 <211> 3165 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> CDS <222> (1)..(3162) <400> 7 atg ccg ccg cta ttc aag gga ctg aaa cag atg gca aag cca att gcc 48 Met Pro Pro Leu Phe Lys Gly Leu Lys Gln Met Ala Lys Pro Ile Ala 1 5 10 15 tat gtt tca aga ttt tcg gcg aaa cga cca att cat ata ata ctt ttt 96 Tyr Val Ser Arg Phe Ser Ala Lys Arg Pro Ile His Ile Ile Leu Phe 20 25 30 tct cta atc ata tcc gca ttc gct tat cta tcc gtc att cag tat tac 144 Ser Leu Ile Ile Ser Ala Phe Ala Tyr Leu Ser Val Ile Gln Tyr Tyr 35 40 45 ttc aat ggt tgg caa cta gat tca aat agt gtt ttt gaa act gct cca 192 Phe Asn Gly Trp Gln Leu Asp Ser Asn Ser Val Phe Glu Thr Ala Pro 50 55 60 aat aaa gac tcc aac act cta ttt caa gaa tgt tcc cat tac tac aga 240 Asn Lys Asp Ser Asn Thr Leu Phe Gln Glu Cys Ser His Tyr Tyr Arg 65 70 75 80 gat tcc tct cta gat ggt tgg gta tca atc acc gcg cat gaa gct agt 288 Asp Ser Ser Leu Asp Gly Trp Val Ser Ile Thr Ala His Glu Ala Ser 85 90 95 gag tta cca gcc cca cac cat tac tat cta tta aac ctg aac ttc aat 336 Glu Leu Pro Ala Pro His His Tyr Tyr Leu Leu Asn Leu Asn Phe Asn 100 105 110 agt cct aat gaa act gac tcc att cca gaa cta gct aac acg gtt ttt 384 Ser Pro Asn Glu Thr Asp Ser Ile Pro Glu Leu Ala Asn Thr Val Phe 115 120 125 gag aaa gat aat aca aaa tat att ctg caa gaa gat ctc agt gtt tcc 432 Glu Lys Asp Asn Thr Lys Tyr Ile Leu Gln Glu Asp Leu Ser Val Ser 130 135 140 aaa gaa att tct tct act gat gga acg aaa tgg agg tta aga agt gac 480 Lys Glu Ile Ser Ser Thr Asp Gly Thr Lys Trp Arg Leu Arg Ser Asp 145 150 155 160 aga aaa agt ctt ttc gac gta aag acg tta gca tat tct ctc tac gat 528 Arg Lys Ser Leu Phe Asp Val Lys Thr Leu Ala Tyr Ser Leu Tyr Asp 165 170 175 gta ttt tca gaa aat gta acc caa gca gac ccg ttt gac gtc ctt att 576 Val Phe Ser Glu Asn Val Thr Gln Ala Asp Pro Phe Asp Val Leu Ile 180 185 190 atg gtt act gcc tac cta atg atg ttc tac acc ata ttc ggc ctc ttc 624 Met Val Thr Ala Tyr Leu Met Met Phe Tyr Thr Ile Phe Gly Leu Phe 195 200 205 aat gac atg agg aag acc ggg tca aat ttt tgg ttg agc gcc tct aca 672 Asn Asp Met Arg Lys Thr Gly Ser Asn Phe Trp Leu Ser Ala Ser Thr 210 215 220 gtg gtc aat tct gca tca tca ctt ttc tta gca ttg tat gtc acc caa 720 Val Val Asn Ser Ala Ser Ser Leu Phe Leu Ala Leu Tyr Val Thr Gln 225 230 235 240 tgt att cta ggc aaa gaa gtt tcc gca tta act ctt ttt gaa ggt ttg 768 Cys Ile Leu Gly Lys Glu Val Ser Ala Leu Thr Leu Phe Glu Gly Leu 245 250 255 cct ttc att gta gtt gtt gtt ggt ttc aag cac aaa atc aag att gcc 816 Pro Phe Ile Val Val Val Val Gly Phe Lys His Lys Ile Lys Ile Ala 260 265 270 cag tat gcc ctg gag aaa ttt gaa aga gtc ggt tta tct aaa agg att 864 Gln Tyr Ala Leu Glu Lys Phe Glu Arg Val Gly Leu Ser Lys Arg Ile 275 280 285 act acc gat gaa atc gtt ttt gaa tcc gtg agc gaa gag ggt ggt cgt 912 Thr Thr Asp Glu Ile Val Phe Glu Ser Val Ser Glu Glu Gly Gly Arg 290 295 300 ttg att caa gac cat ttg ctt tgt att ttt gcc ttt atc gga tgc tct 960 Leu Ile Gln Asp His Leu Leu Cys Ile Phe Ala Phe Ile Gly Cys Ser 305 310 315 320 atg tat gct cac caa ttg aag act ttg aca aac ttc tgc ata tta tca 1008 Met Tyr Ala His Gln Leu Lys Thr Leu Thr Asn Phe Cys Ile Leu Ser 325 330 335 gca ttt atc cta att ttt gaa ttg att tta act cct aca ttt tat tct 1056 Ala Phe Ile Leu Ile Phe Glu Leu Ile Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Ser 340 345 350 gct atc tta gcg ctt aga ctg gaa atg aat gtt atc cac aga tct act 1104 Ala Ile Leu Ala Leu Arg Leu Glu Met Asn Val Ile His Arg Ser Thr 355 360 365 att atc aag caa aca tta gaa gaa gac ggt gtt gtt cca tct aca gca 1152 Ile Ile Lys Gln Thr Leu Glu Glu Asp Gly Val Val Pro Ser Thr Ala 370 375 380 aga atc att tct aaa gca gaa aag aaa tcc gta tct tct ttc tta aat 1200 Arg Ile Ile Ser Lys Ala Glu Lys Lys Ser Val Ser Ser Phe Leu Asn 385 390 395 400 ctc agt gtg gtt gtc att atc atg aaa ctc tct gtc ata ctg ttg ttt 1248 Leu Ser Val Val Val Ile Ile Met Lys Leu Ser Val Ile Leu Leu Phe 405 410 415 gtc ttc atc aac ttt tat aac ttt ggt gca aat tgg gtc aat gat gcc 1296 Val Phe Ile Asn Phe Tyr Asn Phe Gly Ala Asn Trp Val Asn Asp Ala 420 425 430 ttc aat tca ttg tac ttc gat aag gaa cgt gtt tct cta cca gat ttt 1344 Phe Asn Ser Leu Tyr Phe Asp Lys Glu Arg Val Ser Leu Pro Asp Phe 435 440 445 att acc tcg aat gcc tct gaa aac ttt aaa gag caa gct att gtt agt 1392 Ile Thr Ser Asn Ala Ser Glu Asn Phe Lys Glu Gln Ala Ile Val Ser 450 455 460 gtc acc cca tta tta tat tac aaa ccc att aag tcc tac caa cgc att 1440 Val Thr Pro Leu Leu Tyr Tyr Lys Pro Ile Lys Ser Tyr Gln Arg Ile 465 470 475 480 gag gat atg gtt ctt cta ttg ctt cgt aat gtc agt gtt gcc att cgt 1488 Glu Asp Met Val Leu Leu Leu Leu Arg Asn Val Ser Val Ala Ile Arg 485 490 495 gat agg ttc gtc agt aaa tta gtt ctt tcc gcc tta gta tgc agt gct 1536 Asp Arg Phe Val Ser Lys Leu Val Leu Ser Ala Leu Val Cys Ser Ala 500 505 510 gtc atc aat gtg tat tta ttg aat gct gct aga att cat acc agt tat 1584 Val Ile Asn Val Tyr Leu Leu Asn Ala Ala Arg Ile His Thr Ser Tyr 515 520 525 act gca gac caa ttg gtg aaa act gaa gtc acc aag aag tct ttt act 1632 Thr Ala Asp Gln Leu Val Lys Thr Glu Val Thr Lys Lys Ser Phe Thr 530 535 540 gct cct gta caa aag gct tct aca cca gtt tta acc aat aaa aca gtc 1680 Ala Pro Val Gln Lys Ala Ser Thr Pro Val Leu Thr Asn Lys Thr Val 545 550 555 560 att tct gga tcg aaa gtc aaa agt tta tca tct gcg caa tcg agc tca 1728 Ile Ser Gly Ser Lys Val Lys Ser Leu Ser Ser Ala Gln Ser Ser Ser 565 570 575 tca gga cct tca tca tct agt gag gaa gat gat tcc cgc gat att gaa 1776 Ser Gly Pro Ser Ser Ser Ser Glu Glu Asp Asp Ser Arg Asp Ile Glu 580 585 590 agc ttg gat aag aaa ata cgt cct tta gaa gaa tta gaa gca tta tta 1824 Ser Leu Asp Lys Lys Ile Arg Pro Leu Glu Glu Leu Glu Ala Leu Leu 595 600 605 agt agt gga aat aca aaa caa ttg aag aac aaa gag gtc gct gcc ttg 1872 Ser Ser Gly Asn Thr Lys Gln Leu Lys Asn Lys Glu Val Ala Ala Leu 610 615 620 gtt att cac ggt aag tta cct ttg tac gct ttg gag aaa aaa tta ggt 1920 Val Ile His Gly Lys Leu Pro Leu Tyr Ala Leu Glu Lys Lys Leu Gly 625 630 635 640 gat act acg aga gcg gtt gcg gta cgt agg aag gct ctt tca att ttg 1968 Asp Thr Thr Arg Ala Val Ala Val Arg Arg Lys Ala Leu Ser Ile Leu 645 650 655 gca gaa gct cct gta tta gca tct gat cgt tta cca tat aaa aat tat 2016 Ala Glu Ala Pro Val Leu Ala Ser Asp Arg Leu Pro Tyr Lys Asn Tyr 660 665 670 gac tac gac cgc gta ttt ggc gct tgt tgt gaa aat gtt ata ggt tac 2064 Asp Tyr Asp Arg Val Phe Gly Ala Cys Cys Glu Asn Val Ile Gly Tyr 675 680 685 atg cct ttg ccc gtt ggt gtt ata ggc ccc ttg gtt atc gat ggt aca 2112 Met Pro Leu Pro Val Gly Val Ile Gly Pro Leu Val Ile Asp Gly Thr 690 695 700 tct tat cat ata cca atg gca act aca gag ggt tgt ttg gta gct tct 2160 Ser Tyr His Ile Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser 705 710 715 720 gcc atg cgt ggc tgt aag gca atc aat gct ggc ggt ggt gca aca act 2208 Ala Met Arg Gly Cys Lys Ala Ile Asn Ala Gly Gly Gly Ala Thr Thr 725 730 735 gtt tta act aag gat ggt atg aca aga ggc cca gta gtc cgt ttc cca 2256 Val Leu Thr Lys Asp Gly Met Thr Arg Gly Pro Val Val Arg Phe Pro 740 745 750 act ttg aaa aga tct ggt gcc tgt aag ata tgg tta gac tca gaa gag 2304 Thr Leu Lys Arg Ser Gly Ala Cys Lys Ile Trp Leu Asp Ser Glu Glu 755 760 765 gga caa aac gca att aaa aaa gct ttt aac tct aca tca aga ttt gca 2352 Gly Gln Asn Ala Ile Lys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Ser Arg Phe Ala 770 775 780 cgt ctg caa cat att caa act tgt cta gca gga gat tta ctc ttc atg 2400 Arg Leu Gln His Ile Gln Thr Cys Leu Ala Gly Asp Leu Leu Phe Met 785 790 795 800 aga ttt aga aca act act ggt gac gca atg ggt atg aat atg att tct 2448 Arg Phe Arg Thr Thr Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Ile Ser 805 810 815 aaa ggt gtc gaa tac tca tta aag caa atg gta gaa gag tat ggc tgg 2496 Lys Gly Val Glu Tyr Ser Leu Lys Gln Met Val Glu Glu Tyr Gly Trp 820 825 830 gaa gat atg gag gtt gtc tcc gtt tct ggt aac tac tgt acc gac aaa 2544 Glu Asp Met Glu Val Val Ser Val Ser Gly Asn Tyr Cys Thr Asp Lys 835 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cac att gtc tcc gaa aat aac ttt 336 Pro Thr Leu Ser Gln Trp Lys Leu His Ile Val Ser Glu Asn Asn Phe 100 105 110 cct aca gca gct ggt tta gct tcc tcc gct gct ggc ttt gct gca ttg 384 Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ala Ser Ser Ala Ala Gly Phe Ala Ala Leu 115 120 125 gtc tct gca att gct aag tta tac caa tta cca cag tca act tca gaa 432 Val Ser Ala Ile Ala Lys Leu Tyr Gln Leu Pro Gln Ser Thr Ser Glu 130 135 140 ata tct aga ata gca aga aag ggg tct ggt tca gct tgt aga tcg ttg 480 Ile Ser Arg Ile Ala Arg Lys Gly Ser Gly Ser Ala Cys Arg Ser Leu 145 150 155 160 ttt ggc gga tac gtg gcc tgg gaa atg gga aaa gct gaa gat ggt cat 528 Phe Gly Gly Tyr Val Ala Trp Glu Met Gly Lys Ala Glu Asp Gly His 165 170 175 gat tcc atg gca gta caa atc gca gac agc tct gac tgg cct cag atg 576 Asp Ser Met Ala Val Gln Ile Ala Asp Ser Ser Asp Trp Pro Gln Met 180 185 190 aaa gct tgt gtc cta gtt gtc agc gat att aaa aag gat gtg agt tcc 624 Lys Ala Cys Val Leu Val Val Ser Asp Ile Lys Lys Asp Val Ser Ser 195 200 205 act cag ggt atg caa 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Ile His Ile Ile Leu Phe 20 25 30 tct cta atc ata tcc gca ttc gct tat cta tcc gtc att cag tat tac 144 Ser Leu Ile Ile Ser Ala Phe Ala Tyr Leu Ser Val Ile Gln Tyr Tyr 35 40 45 ttc aat ggt tgg caa cta gat tca aat agt gtt ttt gaa act gct cca 192 Phe Asn Gly Trp Gln Leu Asp Ser Asn Ser Val Phe Glu Thr Ala Pro 50 55 60 aat aaa gac ttc aac act cta ttt caa gaa tgt tcc cat tac tac aga 240 Asn Lys Asp Phe Asn Thr Leu Phe Gln Glu Cys Ser His Tyr Tyr Arg 65 70 75 80 gat tcc tct cta gat ggt tgg gta tca atc acc gcg cat gaa gct agt 288 Asp Ser Ser Leu Asp Gly Trp Val Ser Ile Thr Ala His Glu Ala Ser 85 90 95 gag tta cca gcc cca cac cat tac tat cta tta aac ctg aac ttc aat 336 Glu Leu Pro Ala Pro His His Tyr Tyr Leu Leu Asn Leu Asn Phe Asn 100 105 110 agt cct aat gaa act gac tcc att cca gaa cta gct aac acg gtt ttt 384 Ser Pro Asn Glu Thr Asp Ser Ile Pro Glu Leu Ala Asn Thr Val Phe 115 120 125 gag aaa gat aat aca aaa tat att ctg caa gaa gat ctc agc gtt tcc 432 Glu Lys Asp Asn Thr Lys Tyr Ile Leu Gln Glu Asp Leu Ser Val Ser 130 135 140 aaa gaa att tct tct act gat gga acg aaa tgg agg tta aga agt gac 480 Lys Glu Ile Ser Ser Thr Asp Gly Thr Lys Trp Arg Leu Arg Ser Asp 145 150 155 160 aga aaa agt ctt ttc gac gta aag acg tta gca tat tct ctc tac gat 528 Arg Lys Ser Leu Phe Asp Val Lys Thr Leu Ala Tyr Ser Leu Tyr Asp 165 170 175 gta ttt tca gaa aat gta acc caa gca gac ccg ttt gac gtc ctt att 576 Val Phe Ser Glu Asn Val Thr Gln Ala Asp Pro Phe Asp Val Leu Ile 180 185 190 atg gtt act gcc tac cta atg atg ttc tac acc ata ttc ggc ctc ttc 624 Met Val Thr Ala Tyr Leu Met Met Phe Tyr Thr Ile Phe Gly Leu Phe 195 200 205 aat gac atg agg aag acc ggg tca aat ttt tgg ttg agc gcc tct aca 672 Asn Asp Met Arg Lys Thr Gly Ser Asn Phe Trp Leu Ser Ala Ser Thr 210 215 220 gtg gtc aat tct gca tca tca ctt ttc tta gca ttg tat gtc acc caa 720 Val Val Asn Ser Ala Ser Ser Leu Phe Leu Ala Leu Tyr Val Thr Gln 225 230 235 240 tgt att cta ggc aaa gaa gtt tcc gca tta act ctt ttt gaa ggt ttg 768 Cys Ile Leu Gly Lys Glu Val Ser Ala Leu Thr Leu Phe Glu Gly Leu 245 250 255 cct ttc att gta gtt gtt gtt ggt ttc aag cac aaa atc aag att gcc 816 Pro Phe Ile Val Val Val Val Gly Phe Lys His Lys Ile Lys Ile Ala 260 265 270 cag tat gcc ctg gag aaa ttt gaa aga gtc ggt tta tct aaa agg att 864 Gln Tyr Ala Leu Glu Lys Phe Glu Arg Val Gly Leu Ser Lys Arg Ile 275 280 285 act acc gat gaa atc gtt ttt gaa tcc gtg agc gaa gag ggt ggt cgt 912 Thr Thr Asp Glu Ile Val Phe Glu Ser Val Ser Glu Glu Gly Gly Arg 290 295 300 ttg att caa gac cat ttg ctt tgt att ttt gcc ttt atc gga tgc tct 960 Leu Ile Gln Asp His Leu Leu Cys Ile Phe Ala Phe Ile Gly Cys Ser 305 310 315 320 atg tat gct cac caa ttg aag act ttg aca aac ttc tgc ata tta tca 1008 Met Tyr Ala His Gln Leu Lys Thr Leu Thr Asn Phe Cys Ile Leu Ser 325 330 335 gca ttt atc cta att ttc gaa ttg att tta act cct aca ttt tat tct 1056 Ala Phe Ile Leu Ile Phe Glu Leu Ile Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Ser 340 345 350 gct atc tta gcg ctt aga ctg gaa atg aat gtt atc cac aga tct act 1104 Ala Ile Leu Ala Leu Arg Leu Glu Met Asn Val Ile His Arg Ser Thr 355 360 365 att atc aag caa aca tta gaa gaa gac ggt gtt gtt cca tct aca gca 1152 Ile Ile Lys Gln Thr Leu Glu Glu Asp Gly Val Val Pro Ser Thr Ala 370 375 380 aga atc att tct aag gca gaa aag aaa tcc gta tct tct ttc tta aat 1200 Arg Ile Ile Ser Lys Ala Glu Lys Lys Ser Val Ser Ser Phe Leu Asn 385 390 395 400 ctc agt gtg gtt gtc att atc atg aaa ctc tct gtc ata ctg ttg ttc 1248 Leu Ser Val Val Val Ile Ile Met Lys Leu Ser Val Ile Leu Leu Phe 405 410 415 gtc ttc atc aac ttt tat aac ttt ggt gca aat tgg gtc aat gat gcc 1296 Val Phe Ile Asn Phe Tyr Asn Phe Gly Ala Asn Trp Val Asn Asp Ala 420 425 430 ttc aat tca ttg tac ttc gat aag gaa cgt gtt tct cta cca gat ttt 1344 Phe Asn Ser Leu Tyr Phe Asp Lys Glu Arg Val Ser Leu Pro Asp Phe 435 440 445 att acc tcg aat gcc tct gaa aac ttt aaa gag caa gct att gtt agt 1392 Ile Thr Ser Asn Ala Ser Glu Asn Phe Lys Glu Gln Ala Ile Val Ser 450 455 460 gtc acc cca tta tta tat tac aaa ccc att aag tcc tac caa cgc att 1440 Val Thr Pro Leu Leu Tyr Tyr Lys Pro Ile Lys Ser Tyr Gln Arg Ile 465 470 475 480 gag gat atg gtt ctt cta ttg ctt cgt aat gtc agt gtt gcc att cgt 1488 Glu Asp Met Val Leu Leu Leu Leu Arg Asn Val Ser Val Ala Ile Arg 485 490 495 gat agg ttc gtc agt aaa tta gtt ctt tcc gcc tta gta tgc agt gct 1536 Asp Arg Phe Val Ser Lys Leu Val Leu Ser Ala Leu Val Cys Ser Ala 500 505 510 gtc atc aat gtg tat tta tta aat gct gct aga att cat acc agt tat 1584 Val Ile Asn Val Tyr Leu Leu Asn Ala Ala Arg Ile His Thr Ser Tyr 515 520 525 act gca gac caa ttg gtg aag act gaa gtc acc aag aag tct ttt act 1632 Thr Ala Asp Gln Leu Val Lys Thr Glu Val Thr Lys Lys Ser Phe Thr 530 535 540 gct cct gta caa aag gct tct aca cca gtt tta acc aat aaa aca gtc 1680 Ala Pro Val Gln Lys Ala Ser Thr Pro Val Leu Thr Asn Lys Thr Val 545 550 555 560 att tct gga tcg aaa gtc aaa agt tta tca tct gcg caa tcg agc tca 1728 Ile Ser Gly Ser Lys Val Lys Ser Leu Ser Ser Ala Gln Ser Ser Ser 565 570 575 tca gga cct tca tca tct agt gag gaa gat gat tcc cgc gat att gaa 1776 Ser Gly Pro Ser Ser Ser Ser Glu Glu Asp Asp Ser Arg Asp Ile Glu 580 585 590 agc ttg gat aag aaa ata cgt cct tta gaa gaa tta gaa gca tca tta 1824 Ser Leu Asp Lys Lys Ile Arg Pro Leu Glu Glu Leu Glu Ala Ser Leu 595 600 605 agt agt gga aat aca aaa caa ttg aag aac aaa gag gtc gct gcc ttg 1872 Ser Ser Gly Asn Thr Lys Gln Leu Lys Asn Lys Glu Val Ala Ala Leu 610 615 620 gtt att cac ggt aag tta cct ttg tac gct ttg gag aaa aaa tta ggt 1920 Val Ile His Gly Lys Leu Pro Leu Tyr Ala Leu Glu Lys Lys Leu Gly 625 630 635 640 gat act acg aga gcg gtt gcg gta cgt agg aag gct ctt tca att ttg 1968 Asp Thr Thr Arg Ala Val Ala Val Arg Arg Lys Ala Leu Ser Ile Leu 645 650 655 gca gaa gct cct gta tta gca tct gat cgt tta cca tat aaa aat tat 2016 Ala Glu Ala Pro Val Leu Ala Ser Asp Arg Leu Pro Tyr Lys Asn Tyr 660 665 670 gac tac gac cgc gta ttt ggc gct tgt tgt gaa aat gtt ata ggt tac 2064 Asp Tyr Asp Arg Val Phe Gly Ala Cys Cys Glu Asn Val Ile Gly Tyr 675 680 685 atg cct ttg ccc gtt ggt gtt ata ggc ccc ttg gtt atc gat ggt aca 2112 Met Pro Leu Pro Val Gly Val Ile Gly Pro Leu Val Ile Asp Gly Thr 690 695 700 tct tat cat ata cca atg gca act aca gag ggt tgt ttg gta gct tct 2160 Ser Tyr His Ile Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser 705 710 715 720 gcc atg cgt ggc tgt aag gca atc aat gct ggc ggt ggt gca aca act 2208 Ala Met Arg Gly Cys Lys Ala Ile Asn Ala Gly Gly Gly Ala Thr Thr 725 730 735 gtt tta act aag gat ggt atg aca aga ggc cca gta gtc cgt ttc cca 2256 Val Leu Thr Lys Asp Gly Met Thr Arg Gly Pro Val Val Arg Phe Pro 740 745 750 act ttg aaa aga tct ggt gcc tgt aag ata tgg tta gac tca gaa gag 2304 Thr Leu Lys Arg Ser Gly Ala Cys Lys Ile Trp Leu Asp Ser Glu Glu 755 760 765 gga caa aac gca att aaa aaa gct ttt aac tct aca tca aga ttt gca 2352 Gly Gln Asn Ala Ile Lys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Ser Arg Phe Ala 770 775 780 cgt ctg caa cat att caa act tgt cta gca gga gat tta ctc ttc atg 2400 Arg Leu Gln His Ile Gln Thr Cys Leu Ala Gly Asp Leu Leu Phe Met 785 790 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Leu Val Gln Ser His Met Thr His Asn 1010 1015 1020 agg aaa cct gct gaa cca aca aaa cct aac aat ttg gac gcc act gat 3120 Arg Lys Pro Ala Glu Pro Thr Lys Pro Asn Asn Leu Asp Ala Thr Asp 1025 1030 1035 1040 ata aat cgt ttg aaa gat ggg tcc gtc acc tgc att aaa tcc taa 3165 Ile Asn Arg Leu Lys Asp Gly Ser Val Thr Cys Ile Lys Ser 1045 1050 <210> 12 <211> 1054 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 12 Met Pro Pro Leu Phe Lys Gly Leu Lys Gln Met Ala Lys Pro Ile Ala 1 5 10 15 Tyr Val Ser Arg Phe Ser Ala Lys Arg Pro Ile His Ile Ile Leu Phe 20 25 30 Ser Leu Ile Ile Ser Ala Phe Ala Tyr Leu Ser Val Ile Gln Tyr Tyr 35 40 45 Phe Asn Gly Trp Gln Leu Asp Ser Asn Ser Val Phe Glu Thr Ala Pro 50 55 60 Asn Lys Asp Phe Asn Thr Leu Phe Gln Glu Cys Ser His Tyr Tyr Arg 65 70 75 80 Asp Ser Ser Leu Asp Gly Trp Val Ser Ile Thr Ala His Glu Ala Ser 85 90 95 Glu Leu Pro Ala Pro His His Tyr Tyr Leu Leu Asn Leu Asn Phe Asn 100 105 110 Ser Pro Asn Glu Thr Asp Ser Ile Pro Glu Leu Ala Asn Thr Val Phe 115 120 125 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cta gat tca aat agt gtt ttt gaa act gct cca 192 Phe Asn Gly Trp Gln Leu Asp Ser Asn Ser Val Phe Glu Thr Ala Pro 50 55 60 aat aaa gac tcc aac act cta ttt caa gaa tgt tcc cat tac tac aga 240 Asn Lys Asp Ser Asn Thr Leu Phe Gln Glu Cys Ser His Tyr Tyr Arg 65 70 75 80 gat tcc tct cta gat ggt tgg gta tca atc acc gcg cat gaa gct agt 288 Asp Ser Ser Leu Asp Gly Trp Val Ser Ile Thr Ala His Glu Ala Ser 85 90 95 gag tta cca gcc cca cac cat tac tat cta tta aac ctg aac ttc aat 336 Glu Leu Pro Ala Pro His His Tyr Tyr Leu Leu Asn Leu Asn Phe Asn 100 105 110 agt cct aat gaa act gac tcc att cca gaa cta gct aac acg gtt ttt 384 Ser Pro Asn Glu Thr Asp Ser Ile Pro Glu Leu Ala Asn Thr Val Phe 115 120 125 gag aaa gat aat aca aaa tat att ctg caa gaa gat ctc agc gtt tcc 432 Glu Lys Asp Asn Thr Lys Tyr Ile Leu Gln Glu Asp Leu Ser Val Ser 130 135 140 aaa gaa att tct tct act gat gga acg aaa tgg agg tta aga agt gac 480 Lys Glu Ile Ser Ser Thr Asp Gly Thr Lys Trp Arg Leu Arg Ser Asp 145 150 155 160 aga aaa agt ctt ttc gac gta aag acg tta gca tat tct ctc tac gat 528 Arg Lys Ser Leu Phe Asp Val Lys Thr Leu Ala Tyr Ser Leu Tyr Asp 165 170 175 gta ttt tca gaa aat gta acc caa gca gac ccg ttt gac gtc ctt att 576 Val Phe Ser Glu Asn Val Thr Gln Ala Asp Pro Phe Asp Val Leu Ile 180 185 190 atg gtt act gcc tac cta atg atg ttc tac acc ata ttc ggc ctc ttc 624 Met Val Thr Ala Tyr Leu Met Met Phe Tyr Thr Ile Phe Gly Leu Phe 195 200 205 aat gac atg agg aag acc ggg tca aat ttt tgg ttg agc gcc tct aca 672 Asn Asp Met Arg Lys Thr Gly Ser Asn Phe Trp Leu Ser Ala Ser Thr 210 215 220 gtg gtc aat tct gca tca tca ctt ttc tta gca ttg tat gtc acc caa 720 Val Val Asn Ser Ala Ser Ser Leu Phe Leu Ala Leu Tyr Val Thr Gln 225 230 235 240 tgt att cta ggc aaa gaa gtt tcc gca tta act ctt ttt gaa ggt ttg 768 Cys Ile Leu Gly Lys Glu Val Ser Ala Leu Thr Leu Phe Glu Gly Leu 245 250 255 cct ttc att gta gtt gtt gtt ggt ttc aag cac aaa atc aag att gcc 816 Pro Phe Ile Val Val Val Val Gly Phe Lys His Lys Ile Lys Ile Ala 260 265 270 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Asn Val Ser Val Ala Ile Arg 485 490 495 gat agg ttc gtc agt aaa tta gtt ctt tcc gcc tta gta tgc agt gct 1536 Asp Arg Phe Val Ser Lys Leu Val Leu Ser Ala Leu Val Cys Ser Ala 500 505 510 gtc atc aat gtg tat tta tta aat gct gct aga att cat acc agt tat 1584 Val Ile Asn Val Tyr Leu Leu Asn Ala Ala Arg Ile His Thr Ser Tyr 515 520 525 act gca gac caa ttg gtg aag act gaa gtc acc aag aag tct ttt act 1632 Thr Ala Asp Gln Leu Val Lys Thr Glu Val Thr Lys Lys Ser Phe Thr 530 535 540 gct cct gta caa aag gct tct aca cca gtt tta acc aat aaa aca gtc 1680 Ala Pro Val Gln Lys Ala Ser Thr Pro Val Leu Thr Asn Lys Thr Val 545 550 555 560 att tct gga tcg aaa gtc aaa agt tta tca tct gcg caa tcg agc tca 1728 Ile Ser Gly Ser Lys Val Lys Ser Leu Ser Ser Ala Gln Ser Ser Ser 565 570 575 tca gga cct tca tca tct agt gag gaa gat gat tcc cgc gat att gaa 1776 Ser Gly Pro Ser Ser Ser Ser Glu Glu Asp Asp Ser Arg Asp Ile Glu 580 585 590 agc ttg gat aag aaa ata cgt cct tta gaa gaa tta gaa gca tta tta 1824 Ser Leu Asp Lys Lys Ile Arg Pro Leu Glu Glu Leu Glu Ala Leu Leu 595 600 605 agt agt gga aat aca aaa caa ttg aag aac aaa gag gtc gct gcc ttg 1872 Ser Ser Gly Asn Thr Lys Gln Leu Lys Asn Lys Glu Val Ala Ala Leu 610 615 620 gtt att cac ggt aag tta cct ttg tac gct ttg gag aaa aaa tta ggt 1920 Val Ile His Gly Lys Leu Pro Leu Tyr Ala Leu Glu Lys Lys Leu Gly 625 630 635 640 gat act acg aga gcg gtt gcg gta cgt agg aag gct ctt tca att ttg 1968 Asp Thr Thr Arg Ala Val Ala Val Arg Arg Lys Ala Leu Ser Ile Leu 645 650 655 gca gaa gct cct gta tta gca tct gat cgt tta cca tat aaa aat tat 2016 Ala Glu Ala Pro Val Leu Ala Ser Asp Arg Leu Pro Tyr Lys Asn Tyr 660 665 670 gac tac gac cgc gta ttt ggc gct tgt tgt gaa aat gtt ata ggt tac 2064 Asp Tyr Asp Arg Val Phe Gly Ala Cys Cys Glu Asn Val Ile Gly Tyr 675 680 685 atg cct ttg ccc gtt ggt gtt ata ggc ccc ttg gtt atc gat ggt aca 2112 Met Pro Leu Pro Val Gly Val Ile Gly Pro Leu Val Ile Asp Gly Thr 690 695 700 tct tat cat ata cca atg gca act aca gag ggt tgt ttg gta gct tct 2160 Ser Tyr His Ile Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser 705 710 715 720 gcc atg cgt ggc tgt aag gca atc aat gct ggc ggt ggt gca aca act 2208 Ala Met Arg Gly Cys Lys Ala Ile Asn Ala Gly Gly Gly Ala Thr Thr 725 730 735 gtt tta act aag gat ggt atg aca aga ggc cca gta gtc cgt ttc cca 2256 Val Leu Thr Lys Asp Gly Met Thr Arg Gly Pro Val Val Arg Phe Pro 740 745 750 act ttg aaa aga tct ggt gcc tgt aag ata tgg tta gac tca gaa gag 2304 Thr Leu Lys Arg Ser Gly Ala Cys Lys Ile Trp Leu Asp Ser Glu Glu 755 760 765 gga caa aac gca att aaa aaa gct ttt aac tct aca tca aga ttt gca 2352 Gly Gln Asn Ala Ile Lys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Ser Arg Phe Ala 770 775 780 cgt ctg caa cat att caa act tgt cta gca gga gat tta ctc ttc atg 2400 Arg Leu Gln His Ile Gln Thr Cys Leu Ala Gly Asp Leu Leu Phe Met 785 790 795 800 aga ttt aga aca act act ggt gac gca atg ggt atg aat atg att tct 2448 Arg Phe Arg Thr Thr Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Ile Ser 805 810 815 aag ggt gtc gaa tac tca tta aag caa atg gta gaa gag tat ggc tgg 2496 Lys Gly Val Glu Tyr Ser Leu Lys Gln Met Val Glu Glu Tyr Gly Trp 820 825 830 gaa gat atg gag gtt gtc tcc gtt tct ggt aac tac tgt acc gac aaa 2544 Glu Asp Met Glu Val Val Ser Val Ser Gly Asn Tyr Cys Thr Asp Lys 835 840 845 aaa cca gct gcc atc aac tgg atc gaa ggt cgt ggt aag agt gtc gtc 2592 Lys Pro Ala Ala Ile Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val 850 855 860 gca gaa gct act att cct ggt gat gtt gtc aga aaa gtg tta aaa agt 2640 Ala Glu Ala Thr Ile Pro Gly Asp Val Val Arg Lys Val Leu Lys Ser 865 870 875 880 gat gtt tcc gca ttg gtt gag ttg aac att gct aag aat ttg gtt gga 2688 Asp Val Ser Ala Leu Val Glu Leu Asn Ile Ala Lys Asn Leu Val Gly 885 890 895 tct gca atg gct ggg tct gtt ggt gga ttt aac gca cat gca gct aat 2736 Ser Ala Met Ala Gly Ser Val Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ala Asn 900 905 910 tta gtg aca gct gtt ttc ttg gca tta gga caa gat cct gca caa aat 2784 Leu Val Thr Ala Val Phe Leu Ala Leu Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn 915 920 925 gtc gaa agt tcc aac tgt ata aca ttg atg aaa gaa gtg gac ggt gat 2832 Val Glu Ser Ser Asn Cys Ile Thr Leu Met Lys Glu Val Asp Gly Asp 930 935 940 ttg aga att tcc gta tcc atg cca tcc atc gaa gta ggt acc atc ggt 2880 Leu Arg Ile Ser Val Ser Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Ile Gly 945 950 955 960 ggt ggt act gtt cta gaa cca caa ggt gcc atg ttg gac tta tta ggt 2928 Gly Gly Thr Val Leu Glu Pro Gln Gly Ala Met Leu Asp Leu Leu Gly 965 970 975 gta aga ggc cca cat gct acc gct cct ggt acc aac gca cgt caa tta 2976 Val Arg Gly Pro His Ala Thr Ala Pro Gly Thr Asn Ala Arg Gln Leu 980 985 990 gca aga ata gtt gcc tgt gcc gtc ttg gca ggt gaa tta tcc tta tgt 3024 Ala Arg Ile Val Ala Cys Ala Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Cys 995 1000 1005 gct gcc cta gca gcc ggc cat ttg gtt caa agt cat atg acc cac aac 3072 Ala Ala Leu Ala Ala Gly His Leu Val Gln Ser His Met Thr His Asn 1010 1015 1020 agg aaa cct gct gaa cca aca aaa cct aac aat ttg gac gcc act gat 3120 Arg Lys Pro Ala Glu Pro Thr Lys Pro Asn Asn Leu Asp Ala Thr Asp 1025 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Thr Leu Ala Tyr Ser Leu Tyr Asp 165 170 175 Val Phe Ser Glu Asn Val Thr Gln Ala Asp Pro Phe Asp Val Leu Ile 180 185 190 Met Val Thr Ala Tyr Leu Met Met Phe Tyr Thr Ile Phe Gly Leu Phe 195 200 205 Asn Asp Met Arg Lys Thr Gly Ser Asn Phe Trp Leu Ser Ala Ser Thr 210 215 220 Val Val Asn Ser Ala Ser Ser Leu Phe Leu Ala Leu Tyr Val Thr Gln 225 230 235 240 Cys Ile Leu Gly Lys Glu Val Ser Ala Leu Thr Leu Phe Glu Gly Leu 245 250 255 Pro Phe Ile Val Val Val Val Gly Phe Lys His Lys Ile Lys Ile Ala 260 265 270 Gln Tyr Ala Leu Glu Lys Phe Glu Arg Val Gly Leu Ser Lys Arg Ile 275 280 285 Thr Thr Asp Glu Ile Val Phe Glu Ser Val Ser Glu Glu Gly Gly Arg 290 295 300 Leu Ile Gln Asp His Leu Leu Cys Ile Phe Ala Phe Ile Gly Cys Ser 305 310 315 320 Met Tyr Ala His Gln Leu Lys Thr Leu Thr Asn Phe Cys Ile Leu Ser 325 330 335 Ala Phe Ile Leu Ile Phe Glu Leu Ile Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Ser 340 345 350 Ala Ile Leu Ala Leu Arg Leu Glu Met Asn Val Ile His Arg Ser Thr 355 360 365 Ile Ile Lys Gln Thr Leu Glu Glu Asp Gly Val Val Pro Ser Thr Ala 370 375 380 Arg Ile Ile Ser Lys Ala Glu Lys Lys Ser Val Ser Ser Phe Leu Asn 385 390 395 400 Leu Ser Val Val Val Ile Ile Met Lys Leu Ser Val Ile Leu Leu Phe 405 410 415 Val Phe Ile Asn Phe Tyr Asn Phe Gly Ala Asn Trp Val Asn Asp Ala 420 425 430 Phe Asn Ser Leu Tyr Phe Asp Lys Glu Arg Val Ser Leu Pro Asp Phe 435 440 445 Ile Thr Ser Asn Ala Ser Glu Asn Phe Lys Glu Gln Ala Ile Val Ser 450 455 460 Val Thr Pro Leu Leu Tyr Tyr Lys Pro Ile Lys Ser Tyr Gln Arg Ile 465 470 475 480 Glu Asp Met Val Leu Leu Leu Leu Arg Asn Val Ser Val Ala Ile Arg 485 490 495 Asp Arg Phe Val Ser Lys Leu Val Leu Ser Ala Leu Val Cys Ser Ala 500 505 510 Val Ile Asn Val Tyr Leu Leu Asn Ala Ala Arg Ile His Thr Ser Tyr 515 520 525 Thr Ala Asp Gln Leu Val Lys Thr Glu Val Thr Lys Lys Ser Phe Thr 530 535 540 Ala Pro Val Gln Lys Ala Ser Thr Pro Val Leu Thr Asn Lys Thr Val 545 550 555 560 Ile Ser Gly Ser Lys Val Lys Ser Leu Ser Ser Ala Gln Ser Ser Ser 565 570 575 Ser Gly Pro Ser Ser Ser Ser Glu Glu Asp Asp Ser Arg Asp Ile Glu 580 585 590 Ser Leu Asp Lys Lys Ile Arg Pro Leu Glu Glu Leu Glu Ala Leu Leu 595 600 605 Ser Ser Gly Asn Thr Lys Gln Leu Lys Asn Lys Glu Val Ala Ala Leu 610 615 620 Val Ile His Gly Lys Leu Pro Leu Tyr Ala Leu Glu Lys Lys Leu Gly 625 630 635 640 Asp Thr Thr Arg Ala Val Ala Val Arg Arg Lys Ala Leu Ser Ile Leu 645 650 655 Ala Glu Ala Pro Val Leu Ala Ser Asp Arg Leu Pro Tyr Lys Asn Tyr 660 665 670 Asp Tyr Asp Arg Val Phe Gly Ala Cys Cys Glu Asn Val Ile Gly Tyr 675 680 685 Met Pro Leu Pro Val Gly Val Ile Gly Pro Leu Val Ile Asp Gly Thr 690 695 700 Ser Tyr His Ile Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser 705 710 715 720 Ala Met Arg Gly Cys Lys Ala Ile Asn Ala Gly Gly Gly Ala Thr Thr 725 730 735 Val Leu Thr Lys Asp Gly Met Thr Arg Gly Pro Val Val Arg Phe Pro 740 745 750 Thr Leu Lys Arg Ser Gly Ala Cys Lys Ile Trp Leu Asp Ser Glu Glu 755 760 765 Gly Gln Asn Ala Ile Lys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Ser Arg Phe Ala 770 775 780 Arg Leu Gln His Ile Gln Thr Cys Leu Ala Gly Asp Leu Leu Phe Met 785 790 795 800 Arg Phe Arg Thr Thr Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Ile Ser 805 810 815 Lys Gly Val Glu Tyr Ser Leu Lys Gln Met Val Glu Glu Tyr Gly Trp 820 825 830 Glu Asp Met Glu Val Val Ser Val Ser Gly Asn Tyr Cys Thr Asp Lys 835 840 845 Lys Pro Ala Ala Ile Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val 850 855 860 Ala Glu Ala Thr Ile Pro Gly Asp Val Val Arg Lys Val Leu Lys Ser 865 870 875 880 Asp Val Ser Ala Leu Val Glu Leu Asn Ile Ala Lys Asn Leu Val Gly 885 890 895 Ser Ala Met Ala Gly Ser Val Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ala Asn 900 905 910 Leu Val Thr Ala Val Phe Leu Ala Leu Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn 915 920 925 Val Glu Ser Ser Asn Cys Ile Thr Leu Met Lys Glu Val Asp Gly Asp 930 935 940 Leu Arg Ile Ser Val Ser Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Ile Gly 945 950 955 960 Gly Gly Thr Val Leu Glu Pro Gln Gly Ala Met Leu Asp Leu Leu Gly 965 970 975 Val Arg Gly Pro His Ala Thr Ala Pro Gly Thr Asn Ala Arg Gln Leu 980 985 990 Ala Arg Ile Val Ala Cys Ala Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Cys 995 1000 1005 Ala Ala Leu Ala Ala Gly His Leu Val Gln Ser His Met Thr His Asn 1010 1015 1020 Arg Lys Pro Ala Glu Pro Thr Lys Pro Asn Asn Leu Asp Ala Thr Asp 1025 1030 1035 1040 Ile Asn Arg Leu Lys Asp Gly Ser Val Thr Cys Ile Lys Ser 1045 1050 <210> 15 <211> 2925 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 15 atgccgccgc tattcaaggg actgaaacag atggcaaagc caattgccta tgtttcaaga 60 ttttcggcga aacgaccaat tcatataata cttttttctc taatcatatc cgcattcgct 120 tatctatccg tcattcagta ttacttcaat ggttggcaac tagattcaaa tagtgttttt 180 gaaactgctc caaataaaga cttcaacact ctatttcaag aatgttccca ttactacaga 240 gattcctctc tagatggttg ggtatcaatc accgcgcatg aagctagtga gttaccagcc 300 ccacaccatt actatctatt aaacctgaac ttcaatagtc ctaatgaaac tgactccatt 360 ccagaactag ctaacacggt ttttgagaaa gataatacaa aatatattct gcaagaagat 420 ctcagcgttt ccaaagaaat ttcttctact gatggaacga aatggaggtt aagaagtgac 480 agaaaaagtc ttttcgacgt aaagacgtta gcatattctc tctacgatgt attttcagaa 540 aatgtaaccc aagcagacca caaaatcaag 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ttttaaccaa taaaacagtc 1440 atttctggat cgaaagtcaa aagtttatca tctgcgcaat cgagctcatc aggaccttca 1500 tcatctagtg aggaagatga ttcccgcgat attgaaagct tggataagaa aatacgtcct 1560 ttagaagaat tagaagcatc attaagtagt ggaaatacaa aacaattgaa gaacaaagag 1620 gtcgctgcct tggttattca cggtaagtta cctttgtacg ctttggagaa aaaattaggt 1680 gatactacga gagcggttgc ggtacgtagg aaggctcttt caattttggc agaagctcct 1740 gtattagcat ctgatcgttt accatataaa aattatgact acgaccgcgt atttggcgct 1800 tgttgtgaaa atgttatagg ttacatgcct ttgcccgttg gtgttatagg ccccttggtt 1860 atcgatggta catcttatca tataccaatg gcaactacag agggttgttt ggtagcttct 1920 gccatgcgtg gctgtaaggc aatcaatgct ggcggtggtg caacaactgt tttaactaag 1980 gatggtatga caagaggccc agtagtccgt ttcccaactt tgaaaagatc tggtgcctgt 2040 aagatatggt tagactcaga agagggacaa aacgcaatta aaaaagcttt taactctaca 2100 tcaagatttg cacgtctgca acatattcaa acttgtctag caggagattt actcttcatg 2160 agatttagaa caactactgg tgacgcaatg ggtatgaata tgatttctaa gggtgtcgaa 2220 tactcattaa agcaaatggt agaagagtat ggctgggaag 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<213> Saccharomyces cerevisiae <400> 23 atgccgccgc tattcaaggg actgaaatct gatcgtttac catataaaaa ttatgactac 60 gaccgcgtat ttggcgcttg ttgtgaaaat gttataggtt acatgccttt gcccgttggt 120 gttataggcc ccttggttat cgatggtaca tcttatcata taccaatggc aactacagag 180 ggttgtttgg tagcttctgc catgcgtggc tgtaaggcaa tcaatgctgg cggtggtgca 240 acaactgttt taactaagga tggtatgaca agaggcccag tagtccgttt cccaactttg 300 aaaagatctg gtgcctgtaa gatatggtta gactcagaag agggacaaaa cgcaattaaa 360 aaagctttta actctacatc aagatttgca cgtctgcaac atattcaaac ttgtctagca 420 ggagatttac tcttcatgag atttagaaca actactggtg acgcaatggg tatgaatatg 480 atttctaagg gtgtcgaata ctcattaaag caaatggtag aagagtatgg ctgggaagat 540 atggaggttg tctccgtttc tggtaactac tgtaccgaca aaaaaccagc tgccatcaac 600 tggatcgaag gtcgtggtaa gagtgtcgtc gcagaagcta ctattcctgg tgatgttgtc 660 agaaaagtgt taaaaagtga tgtttccgca ttggttgagt tgaacattgc taagaatttg 720 gttggatctg caatggctgg gtctgttggt ggatttaacg cacgtgcagc taatttagtg 780 acagctgttt tcttggcatt aggacaagat cctgcacaaa 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tatcactggc cttagctatg 480 gcctacttgg gggggttaat aggatctaat gacttggaaa agctgtcaga aaacgataag 540 catatagtga atcaatgggc cttcataggt gaaaagtgta ttcacggtac cccttcagga 600 atagataacg ctgtggccac ttatggtaat gccctgctat ttgaaaaaga ctcacataat 660 ggaacaataa acacaaacaa ttttaagttc ttagatgatt tcccagccat tccaatgatc 720 ctaacctata ctagaattcc aaggtctaca aaagatcttg ttgctcgcgt tcgtgtgttg 780 gtcaccgaga aatttcctga agttatgaag ccaattctag atgccatggg tgaatgtgcc 840 ctacaaggct tagagatcat gactaagtta agtaaatgta aaggcaccga tgacgaggct 900 gtagaaacta ataatgaact gtatgaacaa ctattggaat tgataagaat aaatcatgga 960 ctgcttgtct caatcggtgt ttctcatcct ggattagaac ttattaaaaa tctgagcgat 1020 gatttgagaa ttggctccac aaaacttacc ggtgctggtg gcggcggttg ctctttgact 1080 ttgttacgaa gagacattac tcaagagcaa attgacagct tcaaaaagaa attgcaagat 1140 gattttagtt acgagacatt tgaaacagac ttgggtggga ctggctgctg tttgttaagc 1200 gcaaaaaatt tgaataaaga tcttaaaatc aaatccctag tattccaatt atttgaaaat 1260 aaaactacca caaagcaaca aattgacgat ctattattgc caggaaacac 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tatcggacct ggaaaataat 540 gtagacaaat atagagaagt tattcataat ttagcacaag ttgctcattg tcaagctcag 600 ggtaaaattg gaagcgggtt tgatgtagcg gcggcagcat atggatctat cagatataga 660 agattcccac ccgcattaat ctctaatttg ccagatattg gaagtgctac ttacggcagt 720 aaactggcgc atttggttga tgaagaagac tggaatatta cgattaaaag taaccattta 780 ccttcgggat taactttatg gatgggcgat attaagaatg gttcagaaac agtaaaactg 840 gtccagaagg taaaaaattg gtatgattcg catatgccag aaagcttgaa aatatataca 900 gaactcgatc atgcaaattc tagatttatg gatggactat ctaaactaga tcgcttacac 960 gagactcatg acgattacag cgatcagata tttgagtctc ttgagaggaa tgactgtacc 1020 tgtcaaaagt atcctgaaat cacagaagtt agagatgcag ttgccacaat tagacgttcc 1080 tttagaaaaa taactaaaga atctggtgcc gatatcgaac ctcccgtaca aactagctta 1140 ttggatgatt gccagacctt aaaaggagtt cttacttgct taatacctgg tgctggtggt 1200 tatgacgcca ttgcagtgat tactaagcaa gatgttgatc ttagggctca aaccgctaat 1260 gacaaaagat tttctaaggt tcaatggctg gatgtaactc aggctgactg gggtgttagg 1320 aaagaaaaag atccggaaac ttatcttgat aaataa 1356 <210> 30 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of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 37 tgttctcgct gctcgttt 18 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 38 atgggaaagc tattacaat 19 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 39 caaggttgca atggccat 18 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 40 caatgtaggg ctatatatg 19 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 41 aacttgggga atggcaca 18 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 42 tcacgctctg tgtaaagtgt ata 23 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 43 tgcatctcga gggccgcatc atgtaattag 30 <210> 44 <211> 32 <212> DNA 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Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 50 tcacaattcg gataagtggt cta 23 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 51 atgccgccgc tattcaaggg act 23 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 52 ttaggattta atgcaggtga cgg 23 <210> 53 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 53 ccaaataaag actccaacac tctattt 27 <210> 54 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 54 gaattagaag cattattaag tagtgga 27 <210> 55 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 55 ggatttaacg cacatgcagc taattta 27 <210> 56 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 56 gtctgcttgg 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 63 agaagatacg gatttctttt ctgcttt 27 <210> 64 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 64 aactttggtg caaattgggt caatgat 27 <210> 65 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 65 ttgctcttta aagttttcag aggcatt 27 <210> 66 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 66 gcattattaa gtagtggaaa tacaaaa 27 <210> 67 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 67 cctttgtacg ctttggagaa aaaatta 27 <210> 68 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 68 tctgatcgtt taccatataa aaattat 27 <210> 69 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 69 aaggatggta tgacaagagg cccagta 27 <210> 70 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 70 tccccgcgga tggaggccaa gatagat 27 <210> 71 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 71 caactcgagt cacaattcgg ataagtg 27 <210> 72 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 72 gctctagagt tcgtcgtgtt tgcttctctt gtaaactt 38 <210> 73 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 73 tatctcgagt cacaattcgt catgtaaatt gg 32 <210> 74 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 74 gcagggaccc caattcggat aagtggtc 28 <210> 75 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 75 gtagggtccc tggaggccaa gatagatg 28 <210> 76 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 76 gcagggaccc tttgcttctc ttgtaaact 29 <210> 77 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 77 gtagggtcct cagaaaaaga aattaggag 29 <210> 78 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 78 tgtaaaacga cggccagt 18 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 79 taatacgact cactataggg 20

【０１６５】

【配列表フリーテキスト】配列番号34-79: 合成DNA

【図面の簡単な説明】

【図１】IPP合成経路関連酵素の代謝経路を示す図であ
る。

【図２】ERG9遺伝子座周辺の物理地図と、ERG9プロモー
ター領域置換変異用DNA断片の構築図である。

【図３】発現シャトルベクターpYES2の物理地図。

【図４】欠失型HMG1’の置換変異(A)及び構築図（B）を
示す図である。

【図５】寒天プレート培地上でのEUG株のコロニー形成
を示した写真。

【図６】EUG8、EUG12及びEUG27のプレニルアルコール生
産を示す図である。

【図７】A451由来のEUG株であるEUG5のプレニルアルコ
ール生産を示す図である。

【図８】YPH499由来のEUG株であるEUG12のプレニルアル
コール生産を示す図である。

【図９】YPH500由来のEUG株であるEUG24、EUG27のプレ
ニルアルコール生産を示す図である。

【図１０】W303-1A由来の各EUG株のプレニルアルコール
生産を示す図である。

【図１１】W303-1B由来の各 EUG株のプレニルアルコー
ル生産を示す図である。

【図１２】培養液の初期糖濃度組成を変えた培地で培養
したときのEUG8によるプレニルアルコール生産を示す図
である。

【図１３】培養液の初期糖濃度組成を変えた培地で培養
したときのEUG12によるプレニルアルコール生産を示す
図である。

【図１４】培養液の初期糖濃度組成を変えた培地で培養
したときのEUG27によるプレニルアルコール生産を示す
図である。

【図１５】培養液の初期糖濃度組成を変えた培地で培養
したときのEUG8、EUG12及びEUG27によるFOH生産を示す
図である。

【図１６Ａ】プラスミドpRS434GAPを示す図である。

【図１６Ｂ】プラスミドpRS435GAPを示す図である。

【図１６Ｃ】プラスミドpRS444GAPを示す図である。

【図１６Ｄ】プラスミドpRS445GAPを示す図である。

【図１７】プラスミドpALHMG106の物理地図を示す図で
ある。

【図１８】ERG19発現プラスミドを導入したEUG株のプレ
ニルアルコール生産を示す図である。

【図１９】A451又はEUG8によるプレニルアルコール生産
を示す図である。

【図２０】pRS434GAP-HMG1又はpRS444GAP-HMG1をEUG8に
導入したときのプレニルアルコール生産を示す図であ
る。

【図２１】EUG12又はEUG27によるプレニルアルコール生
産を示す図である。

【図２２】pRS434GAP-HMG1又はpRS444GAP-HMG1をEUG12
又はEUG27に導入したときのプレニルアルコール生産を
示す図である。

【図２３】欠失型HMG1遺伝子発現プラスミドをEUG5へ導
入した株のプレニルアルコール生産量を示す図である。

【図２４】欠失型HMG1遺伝子発現プラスミドをEUG12へ
導入した株のプレニルアルコール生産量を示す図であ
る。

【図２５】ERG20遺伝子発現プラスミドをEUG8へ導入し
た株のプレニルアルコール生産量を示す図である。

【図２６】ERG20遺伝子発現プラスミドをEUG12又はEUG2
7へ導入した株のプレニルアルコール生産量を示す図で
ある。

【図２７】BTS1遺伝子発現プラスミドpRS435GAP-BTS1又
はpRS445GAP-BTS1をEUG8へ導入した株のプレニルアルコ
ール生産量を示す図である。

【図２８】BTS1遺伝子発現プラスミドをEUG12又はEUG27
へ導入した株のプレニルアルコール生産量を示す図であ
る。

【図２９】BTS1とERG20の融合遺伝子及び小胞体シグナ
ルをC末端にもつポリペプチドをコードする遺伝子を作
製するために使用するプライマー並びにその位置及び方
向を示す図である。

【図３０】A451、EUG5を宿主としたときのYM7培地中で
のGGOH生産量を測定した結果を示す図である。

【図３１】A451、EUG5を宿主としたときのYMO7培地中で
のGGOH生産量を測定した結果を示す図である。

【図３２】YPH499、EUG12を宿主としたときのYM7培地中
でのGGOH生産量を測定した結果を示す図である。

【図３３】YPH499、EUG12を宿主としたときのYMO7培地
中でのGGOH生産量を測定した結果を示す図である。

【図３４】EUG5にpRS435GGFとpRS435GGFHDELを導入し、
所定の初期糖組成で培養したときのGGOHの生産量を示す
図である。

【図３５】EUG12にpRS435GGFとpRS435GGFHDELを導入
し、所定の初期糖組成で培養したときのGGOHの生産量を
示す図である。

【図３６】EUG5、EUG24、EUG36及びEUG64並びにそれら
を宿主とした組換え体をYPDO7rich培地で培養したとき
のプレニルアルコール生産量とOD₆₀₀値の時間変化。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:86） Ｃ１２Ｒ 1:865 (Ｃ１２Ｐ 7/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA10 BA80 CA04 DA12 EA04 FA02 FA17 GA11 GA19 4B064 AC09 CA06 CA19 CC24 DA16 4B065 AA80X AB01 AC14 AC15 BA02 BB15 CA05 CA29 4H006 AA02 FC74 FE11

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 翻訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝
   子転写産物量を減少できるように変異させた変異型細胞
   を培養し、得られる培養物からプレニルアルコールを採
   取することを特徴とするプレニルアルコールの製造方
   法。
2. 【請求項２】 翻訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝
   子転写産物量を減少できるように変異させた変異型細胞
   に、IPP合成経路関連酵素遺伝子を含む発現用組換えDNA
   又はゲノムインテグレート用DNAを導入して組換え体を
   作製し、該組換え体を培養し、得られる培養物からプレ
   ニルアルコールを採取することを特徴とするプレニルア
   ルコールの製造方法。
3. 【請求項３】 スクアレン合成酵素遺伝子の転写プロモ
   ーター領域を転写抑制型プロモーターで置換したプロモ
   ーター領域を含む変異型細胞を、転写抑制条件下で培養
   し、翻訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝子転写産物
   量を減少させ、得られる培養物からプレニルアルコール
   を採取することを特徴とするプレニルアルコールの製造
   方法。
4. 【請求項４】 スクアレン合成酵素遺伝子の転写プロモ
   ーター領域を転写抑制型プロモーターで置換したしたプ
   ロモーター領域を含み、翻訳活性のあるスクアレン合成
   酵素遺伝子転写産物量を減少できるようにした変異型細
   胞に、IPP合成経路関連酵素遺伝子を含む発現用組換えD
   NA又はゲノムインテグレート用DNAを導入して組換え体
   を作製し、該組換え体を転写抑制条件下で培養し、得ら
   れる培養物からプレニルアルコールを採取することを特
   徴とするプレニルアルコールの製造方法。
5. 【請求項５】 転写抑制型プロモーターがGAL1プロモー
   ターである請求項３又は４記載の製造方法。
6. 【請求項６】 転写抑制条件がグルコース含有培地を用
   いたものである請求項３又は４記載の製造方法。
7. 【請求項７】 IPP合成経路関連酵素遺伝子が、以下の
   (a) - (l)の遺伝子からなる群から選ばれるいずれかの
   遺伝子である請求項２又は４記載の製造方法。 (a) ファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子 (b) ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子 (c) ヒドロキシメチルグルタリルCoA還元酵素遺伝子 (d) イソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼ遺伝子 (e) メバロン酸キナーゼ遺伝子 (f) アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ遺伝子 (g) ヒドロキシメチルグルタリル-CoA合成酵素遺伝子 (h) メバロン酸リン酸キナーゼ遺伝子 (i) メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素遺伝子 (j) 上記(a) - (i)の遺伝子の変異型遺伝子 (k) 上記(a) - (i)の遺伝子からなる群から選ばれる遺
   伝子又はその変異型遺伝子と、他の遺伝子又はその変異
   型遺伝子との融合遺伝子 (l) 上記(a) - (k)の遺伝子に、コードするポリペプチ
   ドが小胞体シグナルを有するように、付加、置換又は挿
   入変異を施した遺伝子
8. 【請求項８】 小胞体シグナルが配列番号30、31又は32
   に示されるものである請求項7記載の製造方法。
9. 【請求項９】 細胞が酵母である請求項1-8のいずれか
   に記載の製造方法。
10. 【請求項１０】 酵母がサッカロマイセス・セレビシア
    エである請求項９記載の製造方法。
11. 【請求項１１】 サッカロマイセス・セレビシアエが、
    サッカロマイセス・セレビシアエA451株、YPH499株、YP
    H500株、W303-1A株又はW303-1B株である請求項10記載の
    製造方法。
12. 【請求項１２】 プレニルアルコールが、ファルネソー
    ル、ネロリドール及び/又はゲラニルゲラニオールであ
    る請求項1-11のいずれかに記載の製造方法。
13. 【請求項１３】 転写抑制条件下で培養する前に、非転
    写抑制条件下で培養することを特徴とする請求項3-12の
    いずれかに記載の製造方法。
14. 【請求項１４】 転写抑制条件がグルコース含有培地を
    用いたものであり、非転写抑制条件がガラクトース含有
    培地を用いたものである請求項13記載の製造方法。
15. 【請求項１５】 ファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子
    が、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列をコード
    するものである請求項7記載の製造方法。
16. 【請求項１６】 ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺
    伝子が、配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードす
    るものである請求項7記載の製造方法。
17. 【請求項１７】 ヒドロキシメチルグルタリルCoA還元
    酵素遺伝子が、配列番号８に示されるアミノ酸配列をコ
    ードするものである請求項7記載の製造方法。
18. 【請求項１８】 ヒドロキシメチルグルタリルCoA還元
    酵素遺伝子の変異型遺伝子が、配列番号11、13及び15-2
    4に示されるいずれかの塩基配列を含むものである請求
    項7記載の製造方法。
19. 【請求項１９】 メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素遺伝子
    が、配列番号10に示されるアミノ酸配列をコードするも
    のである請求項7記載の製造方法。
20. 【請求項２０】 翻訳活性のあるスクアレン合成酵素遺
    伝子転写産物量を減少できるように変異させた変異型細
    胞。
21. 【請求項２１】 スクアレン合成酵素の転写プロモータ
    ー領域を転写抑制型プロモーターで置換したプロモータ
    ー領域を含み、翻訳活性のあるスクアレン合成酵素遺伝
    子転写産物量を減少できるように変異させた変異型細
    胞。