JP2003052391A - 淋菌の検出及びニューキノロン剤感受性評価を行う方法 - Google Patents
淋菌の検出及びニューキノロン剤感受性評価を行う方法Info
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Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 淋菌の検出を迅速に行え、かつ淋菌のニュー
キノロン剤感受性を迅速に検出することが可能な方法を
提供する。 【解決手段】 淋菌の検出及びニューキノロン剤感受性
評価を行う方法であって、以下のステップを含む： (1) 淋菌gyrA遺伝子において特定の多型部位をコード
する領域を含むターゲットDNAを特異的に増幅させるス
テップ； (2) 前記ターゲットDNAと、該ターゲットDNAの前記多
型部位を含む部分に特異的にハイブリダイズ可能な核酸
プローブとの融解温度を解析するステップ。
キノロン剤感受性を迅速に検出することが可能な方法を
提供する。 【解決手段】 淋菌の検出及びニューキノロン剤感受性
評価を行う方法であって、以下のステップを含む： (1) 淋菌gyrA遺伝子において特定の多型部位をコード
する領域を含むターゲットDNAを特異的に増幅させるス
テップ； (2) 前記ターゲットDNAと、該ターゲットDNAの前記多
型部位を含む部分に特異的にハイブリダイズ可能な核酸
プローブとの融解温度を解析するステップ。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、淋菌の検出及びニュー
キノロン剤感受性を評価する方法に関する。本発明は、
淋菌感染症の診断、治療に利用できる。また、ニューキ
ノロン剤の不適切な使用を防止でき、これによりキノロ
ン剤耐性菌の増加を抑止することができる。従って、予
防医療的な利用もできる。
キノロン剤感受性を評価する方法に関する。本発明は、
淋菌感染症の診断、治療に利用できる。また、ニューキ
ノロン剤の不適切な使用を防止でき、これによりキノロ
ン剤耐性菌の増加を抑止することができる。従って、予
防医療的な利用もできる。
【０００２】
【従来の技術】ニューキノロン剤は淋菌に優れた抗菌活
性を有することから（Hooper, D. C.,and J. S. Wolfso
n. 1991. Fluoroquinolone antimicrobial agents. N.
Engl.J. Med. 324:384-394.）、ニューキノロン剤の一
部は淋菌感染症の第一選択薬として推奨されてきた（Ce
nters for Disease Control and Prevention. 1993.Sex
ually transmitted diseases treatment guidelines. M
orbid. Mortal. Weekly Rep. 42:57-59.）。ニューキノ
ロン剤が繁用され、また、一部で不適当な使用がなされ
ていることより、ニューキノロン剤に対する耐性淋菌が
出現し始めている（Birley, H., P. McDonald, and P.
Carey. 1994. High-level ciprofloxacin resistance i
n Neisseria gonorrhoeae. Genitourin. Med. 70:292-2
93.、Centers for Disease Control and Prevention. 1
994. Decreased susceptibility of Neisseria gonorrh
oeae to fluoroquinolones-Ohio and Hawaii, 1992-199
4.Morbid. Mortal. Weekly Rep. 42:57-59.、Gransden,
W. R., C. A. WarrenmI. Phillips, M. Hodges, and
D. Barlow. 1990. Decreased susceptibility ofNeisse
ria gonorrhoeae to ciprofloxacin. Lancet 335:51.、
Jephcott, A. E., and A. Turner. 1990. Ciprofloxaci
n resistance in gonococci. Lancet 335:165.、Kam,
K. M., P. W. Wong, M. M. Cheung, N. K. Y. Ho, and
K. K. Lo.1996. Quinolone-resistant Neisseria gonor
rhoeae in Hong Kong. Sex. Transm. Dis. 23:103-10
6.、Tanaka, M., J. Kumazawa, T. Matsumoto, and I.
Kobayashi. 1994. High prevalence of Neisseria gon
orrhoeae strains with reduced susceptibility to fl
uoroquinolones in Japan. Genitourin. Med. 70:90-9
3.、Tapsall, J. W., E. A. Limnios, C. Thacker, B.
Donovan, S. D. Lynch,L. J. Kirby, K. A. Wise, and
C. J. Carnody. 1995. High-level quinolone resistan
ce in Neisseria gonorrhoeae: a report of two case
s. Sex. Transm.Dis. 22:310-311.）。実際の治療にお
いてもニューキノロン剤無効例が報告され、徐々にニュ
ーキノロン剤の有用性が損なわれつつあり日本を含め世
界中で大きな問題となっている（Tanaka, M., T. Matsu
moto, M. Sakumoto, K. Takahashi,T. Saika, I. Kobay
ashi, J. Kumazawa, and The Pazufloxacin STD Group.
1998. Reduced clinical efficacy of pazufloxacin a
gainst gonorrhea due to high prevalence of quinolo
ne-resistant isolates with the GyrA mutation. Anti
microb. Agents. Chemother. 42:579-582.）。
性を有することから（Hooper, D. C.,and J. S. Wolfso
n. 1991. Fluoroquinolone antimicrobial agents. N.
Engl.J. Med. 324:384-394.）、ニューキノロン剤の一
部は淋菌感染症の第一選択薬として推奨されてきた（Ce
nters for Disease Control and Prevention. 1993.Sex
ually transmitted diseases treatment guidelines. M
orbid. Mortal. Weekly Rep. 42:57-59.）。ニューキノ
ロン剤が繁用され、また、一部で不適当な使用がなされ
ていることより、ニューキノロン剤に対する耐性淋菌が
出現し始めている（Birley, H., P. McDonald, and P.
Carey. 1994. High-level ciprofloxacin resistance i
n Neisseria gonorrhoeae. Genitourin. Med. 70:292-2
93.、Centers for Disease Control and Prevention. 1
994. Decreased susceptibility of Neisseria gonorrh
oeae to fluoroquinolones-Ohio and Hawaii, 1992-199
4.Morbid. Mortal. Weekly Rep. 42:57-59.、Gransden,
W. R., C. A. WarrenmI. Phillips, M. Hodges, and
D. Barlow. 1990. Decreased susceptibility ofNeisse
ria gonorrhoeae to ciprofloxacin. Lancet 335:51.、
Jephcott, A. E., and A. Turner. 1990. Ciprofloxaci
n resistance in gonococci. Lancet 335:165.、Kam,
K. M., P. W. Wong, M. M. Cheung, N. K. Y. Ho, and
K. K. Lo.1996. Quinolone-resistant Neisseria gonor
rhoeae in Hong Kong. Sex. Transm. Dis. 23:103-10
6.、Tanaka, M., J. Kumazawa, T. Matsumoto, and I.
Kobayashi. 1994. High prevalence of Neisseria gon
orrhoeae strains with reduced susceptibility to fl
uoroquinolones in Japan. Genitourin. Med. 70:90-9
3.、Tapsall, J. W., E. A. Limnios, C. Thacker, B.
Donovan, S. D. Lynch,L. J. Kirby, K. A. Wise, and
C. J. Carnody. 1995. High-level quinolone resistan
ce in Neisseria gonorrhoeae: a report of two case
s. Sex. Transm.Dis. 22:310-311.）。実際の治療にお
いてもニューキノロン剤無効例が報告され、徐々にニュ
ーキノロン剤の有用性が損なわれつつあり日本を含め世
界中で大きな問題となっている（Tanaka, M., T. Matsu
moto, M. Sakumoto, K. Takahashi,T. Saika, I. Kobay
ashi, J. Kumazawa, and The Pazufloxacin STD Group.
1998. Reduced clinical efficacy of pazufloxacin a
gainst gonorrhea due to high prevalence of quinolo
ne-resistant isolates with the GyrA mutation. Anti
microb. Agents. Chemother. 42:579-582.）。
【０００３】一方で、ニューキノロン剤に耐性を示す淋
菌の耐性メカニズムが検討されてきた（Belland, R.
J., S. G. Morrison, C. Ison, and W. M. Huang. 199
4. Neisseria gonorrhoeae acquires mutations in ana
logous of gyrA and parC in fluoroquinolone-resista
nt isolates. Mol. Microbiol. 14:371-380.、Corkill,
J. E., A. Percival, and M. Lind. 1991. Reduced upt
ake of ciprofloxacin in a resistant strain of Neis
seria gonorrhoeae and transformation of resistance
to other strains. J. Antimicrob. Chemother. 28:60
1-604.、Deguchi,T., M. Yasuda, M. Asano, K. Tada,
H. Iwata, H. Komeda, T. Ezaki, I. Saito, and Y. Ka
wada. 1995. DNA gyrase mutations in quinolone-resi
stant clinical isolates of Neisseria gonorrhoeae.
Antimicrob. Agents Chemother. 39:561-563.、 Deguch
i, T., M. Yasuda, M. Nakano, S. Ozeki, T. Ezaki,
I. Saito, and Y. Kawada. 1996. Quinolone-resistant
Neisseria gonorrhoeae: correlation of alterations
in the GyrA subunit of DNA gyrase and the ParCsub
unit of topoisomerase IV with antimicrobial suscep
tibility profiles.Antimicrob. Agents Chemother. 4
0:1020-1023.、Tanaka, M., H. Fukuda, K. Hirai, M.
Hosaka, T. Matsumoto, and J. Kumazawa. 1994. Redu
ced uptake and accumulation of norfloxacin In resi
stant strains of Neisseria gonorrhoeae isolated in
Japan. Genitourin. Med. 70:253-255.）。ニューキノ
ロン剤は淋菌のDNA gyraseとtopoisomerase IVに直接働
き抗菌活性を発揮する。これらの標的酵素であるDNA gy
raseはgyrA遺伝子とgyrB遺伝子とによりそれぞれコード
されるGyrA蛋白とGyrB蛋白からなり、topoisomerase IV
はparC遺伝子とparE遺伝子とにそれぞれコードされるPa
rC蛋白とParE蛋白とからなる。淋菌においてはDNA gyra
seが主たる標的であり（Tress, D. L., A. L. Sandul,
V. Peto-Mesola,M. R. Aplasca, H. B. Leng, W. L. Wh
ittington, and J. S. Knapp. 1999. Alterations with
in the resistance-determining regions of GyrA and
ParC of Neisseria gonorrhoeae isolated in the Far
East ant the United States. Int. J. Antomicrob. A
gents. 12:325-332.）、gyrA遺伝子の変異によるGyrA蛋
白、特に91番のアミノ酸のセリンと95番のアミノ酸のア
スパラギン酸の変化がニューキノロン剤耐性の中心的役
割を果たしている（Belland, R. J., S. G. Morrison,
C. Ison, and W. M. Huang. 1994. Neisseria gonorrho
eae acquires mutations in analogous of gyrA and pa
rC in fluoroquinolone-resistant isolates. Mol. Mic
robiol. 14:371-380.、Deguchi, T., M. Yasuda, M. Na
kano, S. Ozeki, T. Ezaki, I. Saito, and Y. Kawada.
1996. Quinolone-resistant Neisseria gonorrhoeae:
correlation of alterations in the GyrA subunit of
DNA gyrase and the ParC subunit of topoisomerase I
V with antimicrobial susceptibility profiles. Anti
microb. Agents Chemother. 40:1020-1023.）。したが
って、これらのアミノ酸変化を解析することは、ニュー
キノロン剤耐性淋菌の耐性メカニズムの理解と耐性淋菌
の流行および伝搬の疫学的な調査にとって重要で欠くこ
とのできないことである。また、これらのアミノ酸の変
化を解析することにより、検体における淋菌のニューキ
ノロン剤感受性を評価でき、耐性の高い淋菌に対して無
用にニューキノロン剤を投与するなどの不適切な処置を
防止できる。
菌の耐性メカニズムが検討されてきた（Belland, R.
J., S. G. Morrison, C. Ison, and W. M. Huang. 199
4. Neisseria gonorrhoeae acquires mutations in ana
logous of gyrA and parC in fluoroquinolone-resista
nt isolates. Mol. Microbiol. 14:371-380.、Corkill,
J. E., A. Percival, and M. Lind. 1991. Reduced upt
ake of ciprofloxacin in a resistant strain of Neis
seria gonorrhoeae and transformation of resistance
to other strains. J. Antimicrob. Chemother. 28:60
1-604.、Deguchi,T., M. Yasuda, M. Asano, K. Tada,
H. Iwata, H. Komeda, T. Ezaki, I. Saito, and Y. Ka
wada. 1995. DNA gyrase mutations in quinolone-resi
stant clinical isolates of Neisseria gonorrhoeae.
Antimicrob. Agents Chemother. 39:561-563.、 Deguch
i, T., M. Yasuda, M. Nakano, S. Ozeki, T. Ezaki,
I. Saito, and Y. Kawada. 1996. Quinolone-resistant
Neisseria gonorrhoeae: correlation of alterations
in the GyrA subunit of DNA gyrase and the ParCsub
unit of topoisomerase IV with antimicrobial suscep
tibility profiles.Antimicrob. Agents Chemother. 4
0:1020-1023.、Tanaka, M., H. Fukuda, K. Hirai, M.
Hosaka, T. Matsumoto, and J. Kumazawa. 1994. Redu
ced uptake and accumulation of norfloxacin In resi
stant strains of Neisseria gonorrhoeae isolated in
Japan. Genitourin. Med. 70:253-255.）。ニューキノ
ロン剤は淋菌のDNA gyraseとtopoisomerase IVに直接働
き抗菌活性を発揮する。これらの標的酵素であるDNA gy
raseはgyrA遺伝子とgyrB遺伝子とによりそれぞれコード
されるGyrA蛋白とGyrB蛋白からなり、topoisomerase IV
はparC遺伝子とparE遺伝子とにそれぞれコードされるPa
rC蛋白とParE蛋白とからなる。淋菌においてはDNA gyra
seが主たる標的であり（Tress, D. L., A. L. Sandul,
V. Peto-Mesola,M. R. Aplasca, H. B. Leng, W. L. Wh
ittington, and J. S. Knapp. 1999. Alterations with
in the resistance-determining regions of GyrA and
ParC of Neisseria gonorrhoeae isolated in the Far
East ant the United States. Int. J. Antomicrob. A
gents. 12:325-332.）、gyrA遺伝子の変異によるGyrA蛋
白、特に91番のアミノ酸のセリンと95番のアミノ酸のア
スパラギン酸の変化がニューキノロン剤耐性の中心的役
割を果たしている（Belland, R. J., S. G. Morrison,
C. Ison, and W. M. Huang. 1994. Neisseria gonorrho
eae acquires mutations in analogous of gyrA and pa
rC in fluoroquinolone-resistant isolates. Mol. Mic
robiol. 14:371-380.、Deguchi, T., M. Yasuda, M. Na
kano, S. Ozeki, T. Ezaki, I. Saito, and Y. Kawada.
1996. Quinolone-resistant Neisseria gonorrhoeae:
correlation of alterations in the GyrA subunit of
DNA gyrase and the ParC subunit of topoisomerase I
V with antimicrobial susceptibility profiles. Anti
microb. Agents Chemother. 40:1020-1023.）。したが
って、これらのアミノ酸変化を解析することは、ニュー
キノロン剤耐性淋菌の耐性メカニズムの理解と耐性淋菌
の流行および伝搬の疫学的な調査にとって重要で欠くこ
とのできないことである。また、これらのアミノ酸の変
化を解析することにより、検体における淋菌のニューキ
ノロン剤感受性を評価でき、耐性の高い淋菌に対して無
用にニューキノロン剤を投与するなどの不適切な処置を
防止できる。
【０００４】一方、淋菌感染症の患者に対しては、初診
時に淋菌培養と分離された淋菌の感受性試験に提出する
か、あるいは淋菌検出のための遺伝子診断法に提出する
かのいずれかであった。培養検査では淋菌の検出および
感受性検査に3日以上有することより、初診時において
はそれらの結果をみずに抗菌剤による治療を開始しなけ
ればならない。また、現在利用可能な遺伝子診断につい
ては、結果を得るまでに半日程度の時間ですむが、淋菌
の検出のみで感受性に関する情報を得ることはできな
い。これら従来の遺伝子診断法を用いても、培養検査と
同様に初診時においては淋菌検出の結果をみずに抗菌剤
による治療を開始しなければならず、治療が不成功な場
合にも感受性の情報が無いために、次の適切な抗菌剤の
選択が極めて困難となる。
時に淋菌培養と分離された淋菌の感受性試験に提出する
か、あるいは淋菌検出のための遺伝子診断法に提出する
かのいずれかであった。培養検査では淋菌の検出および
感受性検査に3日以上有することより、初診時において
はそれらの結果をみずに抗菌剤による治療を開始しなけ
ればならない。また、現在利用可能な遺伝子診断につい
ては、結果を得るまでに半日程度の時間ですむが、淋菌
の検出のみで感受性に関する情報を得ることはできな
い。これら従来の遺伝子診断法を用いても、培養検査と
同様に初診時においては淋菌検出の結果をみずに抗菌剤
による治療を開始しなければならず、治療が不成功な場
合にも感受性の情報が無いために、次の適切な抗菌剤の
選択が極めて困難となる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】以上のように、淋菌感
染症の治療においては淋菌の迅速な検出が重要であり、
また、適切な治療方法の選択のためには淋菌のニューキ
ノロン剤感受性を評価することが極めて重要である。し
かしながら、臨床応用可能な程度に多数の検体を短時間
で処理できる方法がないのが現状である。本発明は、以
上の事情に鑑みなされたものであり、淋菌の検出を迅速
に行え、かつ淋菌のニューキノロン剤感受性を迅速に検
出することが可能な方法を提供することを目的とする。
染症の治療においては淋菌の迅速な検出が重要であり、
また、適切な治療方法の選択のためには淋菌のニューキ
ノロン剤感受性を評価することが極めて重要である。し
かしながら、臨床応用可能な程度に多数の検体を短時間
で処理できる方法がないのが現状である。本発明は、以
上の事情に鑑みなされたものであり、淋菌の検出を迅速
に行え、かつ淋菌のニューキノロン剤感受性を迅速に検
出することが可能な方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、以上の課
題を解決すべく臨床検体を用いて検討を行った。即ち、
淋菌gyrA遺伝子において多型部位（91番アミノ酸をコー
ドする領域、及び95番アミノ酸をコードする領域）を含
むターゲットDNAの増幅と、当該多型部位の解析用に設
計された核酸プローブによる融解温度解析とを組み合わ
せた方法により、各検体における淋菌の検出、及び淋菌
gyrA遺伝子における多型の検出を試みた。その結果、極
めて迅速に多型の検出ができ、得られた多型情報は淋菌
のニューキノロン剤感受性と高い相関のあることが実証
された。同時に、臨床検体において淋菌の検出が迅速に
行えることが確認された。本発明は以上の検討結果に基
づき完成されたものであり、次の構成からなる。 [１] 淋菌の検出及びニューキノロン剤感受性評価を行
う方法であって、以下のステップを含む： (a) 淋菌gyrA遺伝子において91番アミノ酸をコードす
る領域を含むターゲットDNAを特異的に増幅させるステ
ップ； (b) 前記ターゲットDNAと、該ターゲットDNAの前記領
域を含む部分に特異的にハイブリダイズ可能な核酸プロ
ーブとの融解温度を解析するステップ。 [２] 淋菌の検出及びニューキノロン剤感受性評価を行
う方法であって、以下のステップを含む： (A) 淋菌gyrA遺伝子において95番アミノ酸をコードす
る領域を含むターゲットDNAを特異的に増幅させるステ
ップ； (B) 前記ターゲットDNAと、該ターゲットDNAの前記領
域を含む部分に特異的にハイブリダイズ可能な核酸プロ
ーブとの融解温度を解析するステップ。
題を解決すべく臨床検体を用いて検討を行った。即ち、
淋菌gyrA遺伝子において多型部位（91番アミノ酸をコー
ドする領域、及び95番アミノ酸をコードする領域）を含
むターゲットDNAの増幅と、当該多型部位の解析用に設
計された核酸プローブによる融解温度解析とを組み合わ
せた方法により、各検体における淋菌の検出、及び淋菌
gyrA遺伝子における多型の検出を試みた。その結果、極
めて迅速に多型の検出ができ、得られた多型情報は淋菌
のニューキノロン剤感受性と高い相関のあることが実証
された。同時に、臨床検体において淋菌の検出が迅速に
行えることが確認された。本発明は以上の検討結果に基
づき完成されたものであり、次の構成からなる。 [１] 淋菌の検出及びニューキノロン剤感受性評価を行
う方法であって、以下のステップを含む： (a) 淋菌gyrA遺伝子において91番アミノ酸をコードす
る領域を含むターゲットDNAを特異的に増幅させるステ
ップ； (b) 前記ターゲットDNAと、該ターゲットDNAの前記領
域を含む部分に特異的にハイブリダイズ可能な核酸プロ
ーブとの融解温度を解析するステップ。 [２] 淋菌の検出及びニューキノロン剤感受性評価を行
う方法であって、以下のステップを含む： (A) 淋菌gyrA遺伝子において95番アミノ酸をコードす
る領域を含むターゲットDNAを特異的に増幅させるステ
ップ； (B) 前記ターゲットDNAと、該ターゲットDNAの前記領
域を含む部分に特異的にハイブリダイズ可能な核酸プロ
ーブとの融解温度を解析するステップ。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明は、淋菌の検出及びニュー
キノロン剤感受性評価を行う方法に関し、(1)淋菌gyrA
遺伝子において特定の多型部位を含むターゲットDNAを
特異的に増幅させるステップと、(2)前記ターゲットDNA
と該ターゲットDNAの前記多型部位を含む部分に特異的
にハイブリダイズ可能な核酸プローブとの融解温度を解
析するステップを含んで構成される。
キノロン剤感受性評価を行う方法に関し、(1)淋菌gyrA
遺伝子において特定の多型部位を含むターゲットDNAを
特異的に増幅させるステップと、(2)前記ターゲットDNA
と該ターゲットDNAの前記多型部位を含む部分に特異的
にハイブリダイズ可能な核酸プローブとの融解温度を解
析するステップを含んで構成される。
【０００８】本発明を適用した結果、特異的に増幅され
るターゲットDNAが検出されれば淋菌の存在が確認され
る。また、検体中に淋菌が存在する場合には融解温度解
析により当該淋菌のニューキノロン剤に対する感受性の
評価が行われる。本発明が適用される検体としては、被
疑感染者の尿道分泌物、尿、咽頭擦過物、子宮頸管分泌
物などが挙げられる。これらの検体は、予め適当なDNA
抽出処理を施しておくことが好ましい。例えば、プロテ
アーゼや界面活性剤による細胞の破砕、クロロフォルム
抽出、エタノール沈殿などを組み合わせてDNAの抽出を
行うことができる。また、検体によっては熱処理により
DNAの抽出を行うことも可能である。このような熱処理
によるDNA抽出によれば操作時間を短縮できる。例え
ば、被疑感染者の尿道分泌物を適当なバッファーで希釈
した後、熱処理をしてDNAの抽出を行うことができる。
るターゲットDNAが検出されれば淋菌の存在が確認され
る。また、検体中に淋菌が存在する場合には融解温度解
析により当該淋菌のニューキノロン剤に対する感受性の
評価が行われる。本発明が適用される検体としては、被
疑感染者の尿道分泌物、尿、咽頭擦過物、子宮頸管分泌
物などが挙げられる。これらの検体は、予め適当なDNA
抽出処理を施しておくことが好ましい。例えば、プロテ
アーゼや界面活性剤による細胞の破砕、クロロフォルム
抽出、エタノール沈殿などを組み合わせてDNAの抽出を
行うことができる。また、検体によっては熱処理により
DNAの抽出を行うことも可能である。このような熱処理
によるDNA抽出によれば操作時間を短縮できる。例え
ば、被疑感染者の尿道分泌物を適当なバッファーで希釈
した後、熱処理をしてDNAの抽出を行うことができる。
【０００９】ニューキノロン剤とは、淋菌に対して優れ
た抗菌活性を有することで知られる薬剤である。従来の
キノロン剤（オールドキノロン剤）の構造にフッ素原子
が付加され、その他の側鎖を変換することにより抗菌力
の増強がされたものであって、別名フルオロキノロンと
も呼ばれる。ノルフロキサシン以降のキノロン剤がニュ
ーキノロン剤に分類され、シプロフロキサシン（ciprof
loxacin：CPFX）、レボフロキサシンなどが含まれる。
淋菌感染症の化学療法は、ペニシリン系、テトラサイク
リン系、セフェム系抗菌剤などが使用されてきたが、こ
れらの抗菌剤に感受性の低下した耐性菌が出現してい
る。ニューキノロン剤はこのような各種の耐性菌を含む
淋菌に対して優れた抗菌活性を有することから、淋菌感
染症に繁用されてきた抗菌剤である。
た抗菌活性を有することで知られる薬剤である。従来の
キノロン剤（オールドキノロン剤）の構造にフッ素原子
が付加され、その他の側鎖を変換することにより抗菌力
の増強がされたものであって、別名フルオロキノロンと
も呼ばれる。ノルフロキサシン以降のキノロン剤がニュ
ーキノロン剤に分類され、シプロフロキサシン（ciprof
loxacin：CPFX）、レボフロキサシンなどが含まれる。
淋菌感染症の化学療法は、ペニシリン系、テトラサイク
リン系、セフェム系抗菌剤などが使用されてきたが、こ
れらの抗菌剤に感受性の低下した耐性菌が出現してい
る。ニューキノロン剤はこのような各種の耐性菌を含む
淋菌に対して優れた抗菌活性を有することから、淋菌感
染症に繁用されてきた抗菌剤である。
【００１０】ニューキノロン剤は細菌のDNAgyrase及びD
NAtopoisomeraseIVを阻害することによりその抗菌活性
を発揮する。DNAgyraseはGyrAタンパク２分子とGyrBタ
ンパク２分子とからなる４量体であり、淋菌を含むグラ
ム陰性菌ではGyrAタンパクの変化が耐性化に重要な役割
を演じることが知られている。
NAtopoisomeraseIVを阻害することによりその抗菌活性
を発揮する。DNAgyraseはGyrAタンパク２分子とGyrBタ
ンパク２分子とからなる４量体であり、淋菌を含むグラ
ム陰性菌ではGyrAタンパクの変化が耐性化に重要な役割
を演じることが知られている。
【００１１】本発明では、まず淋菌gyrA遺伝子において
特定の多型部位を含むターゲットDNAを特異的に増幅さ
せるステップ（ステップ(1)）が行われる。ここでの特
定の多型部位は、淋菌のGyrAタンパクの91番アミノ酸及
び95番アミノ酸をコードする領域に存在する（本明細書
において、前者を「第１領域」、後者を「第２領域」ともい
う）。第１領域及び第２領域を含むターゲットDNAを特
異的に増幅させることもでき、この場合には後述のステ
ップにおいて第１領域及び第２領域のそれぞれについて
融解温度解析を行い、得られた結果を総合的に評価して
淋菌のニューキノロン剤感受性を評価することができ
る。尚、GyrAタンパクの91番アミノ酸とはGyrAタンパク
のN末端から数えて91番目に位置するアミノ酸であり、
同様に、95番アミノ酸とはN末端から数えて95番目に位
置するアミノ酸である。GyrAタンパクの91番アミノ酸は
野生型ではセリン（Ser）であり、フェニルアラニン又
はチロシンに変化する変異（多型）が存在することが知
られている。他方、GyrAタンパクの95番アミノ酸は、野
生型ではアスパラギン酸（Asp）であり、アスパラギン
又はグリシンに変化する変異（多型）が存在することが
知られている。
特定の多型部位を含むターゲットDNAを特異的に増幅さ
せるステップ（ステップ(1)）が行われる。ここでの特
定の多型部位は、淋菌のGyrAタンパクの91番アミノ酸及
び95番アミノ酸をコードする領域に存在する（本明細書
において、前者を「第１領域」、後者を「第２領域」ともい
う）。第１領域及び第２領域を含むターゲットDNAを特
異的に増幅させることもでき、この場合には後述のステ
ップにおいて第１領域及び第２領域のそれぞれについて
融解温度解析を行い、得られた結果を総合的に評価して
淋菌のニューキノロン剤感受性を評価することができ
る。尚、GyrAタンパクの91番アミノ酸とはGyrAタンパク
のN末端から数えて91番目に位置するアミノ酸であり、
同様に、95番アミノ酸とはN末端から数えて95番目に位
置するアミノ酸である。GyrAタンパクの91番アミノ酸は
野生型ではセリン（Ser）であり、フェニルアラニン又
はチロシンに変化する変異（多型）が存在することが知
られている。他方、GyrAタンパクの95番アミノ酸は、野
生型ではアスパラギン酸（Asp）であり、アスパラギン
又はグリシンに変化する変異（多型）が存在することが
知られている。
【００１２】ターゲットDNAを特異的に増幅させる方法
は特に限定されず、公知の方法を適宜選択して採用でき
る。例えば、周知のPCR法、鎖置換型増幅法（特公平７
−１１４７１８号公報等）等を利用することができる。
高い特異性及び効率をもって増幅可能な方法（例えばPC
R法）を用いることが好ましく、中でも、リアルタイムP
CR法（Molecular Cloning， Third Edition，8.94-8.9
5，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）
を利用することが特に好ましい。リアルタイムPCR法は
特定の核酸配列の増幅及び定量を同時にかつリアルタイ
ムに行うことを可能とする方法であり、専用の装置が市
販されている（例えば、LightCycler（Roche社製）、Ge
neAmp5700 system、ABI Prism7700 system（以上、Perk
in-ElmerBiosystems社製））。リアルタイムPCR法を採
用することにより、リアルタイムにターゲットDNAの増
幅を検出することができる。
は特に限定されず、公知の方法を適宜選択して採用でき
る。例えば、周知のPCR法、鎖置換型増幅法（特公平７
−１１４７１８号公報等）等を利用することができる。
高い特異性及び効率をもって増幅可能な方法（例えばPC
R法）を用いることが好ましく、中でも、リアルタイムP
CR法（Molecular Cloning， Third Edition，8.94-8.9
5，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）
を利用することが特に好ましい。リアルタイムPCR法は
特定の核酸配列の増幅及び定量を同時にかつリアルタイ
ムに行うことを可能とする方法であり、専用の装置が市
販されている（例えば、LightCycler（Roche社製）、Ge
neAmp5700 system、ABI Prism7700 system（以上、Perk
in-ElmerBiosystems社製））。リアルタイムPCR法を採
用することにより、リアルタイムにターゲットDNAの増
幅を検出することができる。
【００１３】PCR法（リアルタイムPCR法を含む）を行う
際に使用するプライマーは、ターゲットDNAを特異的に
増幅可能なものであれば特に限定されない。また、プラ
イマーの長さはPCRプライマーとして機能する限り限定
されず、例えば１５〜３０bp、好ましくは２０〜３０b
p、更に好ましくは２０〜２５bpである。尚、プライマ
ーとそれがハイブリダイズする淋菌gyrA遺伝子の領域と
の間に１〜数個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは
１〜３個程度のミスマッチが存在していてもよい。プラ
イマーセットの具体例としては、図１に示す部分DNA
（符号１）に相補的なプライマーDNA（配列番号：
１）、及び部分DNA（符号２）に相補的なプライマーDNA
（配列番号：２）のセットを挙げることができる。尚、
図１は淋菌gyrA遺伝子のDNA配列の一部を示したもので
あり、図中矢じりは91番アミノ酸をコードする領域にお
ける変異部位、矢印は95番アミノ酸をコードする領域に
おける変異部位をそれぞれ示す。ターゲットDNAの長さ
は、例えば５０〜５００bp、好ましくは１５０〜３００
bp、更に好ましくは２００〜２５０bpである。
際に使用するプライマーは、ターゲットDNAを特異的に
増幅可能なものであれば特に限定されない。また、プラ
イマーの長さはPCRプライマーとして機能する限り限定
されず、例えば１５〜３０bp、好ましくは２０〜３０b
p、更に好ましくは２０〜２５bpである。尚、プライマ
ーとそれがハイブリダイズする淋菌gyrA遺伝子の領域と
の間に１〜数個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは
１〜３個程度のミスマッチが存在していてもよい。プラ
イマーセットの具体例としては、図１に示す部分DNA
（符号１）に相補的なプライマーDNA（配列番号：
１）、及び部分DNA（符号２）に相補的なプライマーDNA
（配列番号：２）のセットを挙げることができる。尚、
図１は淋菌gyrA遺伝子のDNA配列の一部を示したもので
あり、図中矢じりは91番アミノ酸をコードする領域にお
ける変異部位、矢印は95番アミノ酸をコードする領域に
おける変異部位をそれぞれ示す。ターゲットDNAの長さ
は、例えば５０〜５００bp、好ましくは１５０〜３００
bp、更に好ましくは２００〜２５０bpである。
【００１４】ステップ(1)の後、ターゲットDNAと該ター
ゲットDNAの前記多型部位を含む部分に特異的にハイブ
リダイズ可能な核酸プローブとの融解温度を解析するス
テップが行われる（ステップ(2)）。融解温度（Tm）と
は、一般にDNA又はRNA分子の二本鎖部分が一本鎖へと変
性し、二本鎖と一本鎖とが１：１で存在することとなる
温度をいい、本発明においては、ステップ(1)で増幅さ
れたターゲットDNAと、このターゲットDNAの特定の多型
部位を含む部分に特異的にハイブリダイズ可能な核酸プ
ローブとにより形成される二本鎖核酸が一本鎖へと変性
し、二本鎖と一本鎖とが１：１で存在することとなる温
度をいう。
ゲットDNAの前記多型部位を含む部分に特異的にハイブ
リダイズ可能な核酸プローブとの融解温度を解析するス
テップが行われる（ステップ(2)）。融解温度（Tm）と
は、一般にDNA又はRNA分子の二本鎖部分が一本鎖へと変
性し、二本鎖と一本鎖とが１：１で存在することとなる
温度をいい、本発明においては、ステップ(1)で増幅さ
れたターゲットDNAと、このターゲットDNAの特定の多型
部位を含む部分に特異的にハイブリダイズ可能な核酸プ
ローブとにより形成される二本鎖核酸が一本鎖へと変性
し、二本鎖と一本鎖とが１：１で存在することとなる温
度をいう。
【００１５】核酸プローブは、ターゲットDNAの多型部
位（91番アミノ酸又は95番アミノ酸をコードする領域）
を含む部分に特異的にハイブリダイズするものであれ
ば、特に限定されない。このような核酸プローブをター
ゲットDNAにハイブリダイズさせた場合、ターゲットDNA
の多型部位に変異が存在すれば核酸プローブとの間にミ
スマッチが生ずるため、核酸プローブとターゲットDNA
との結合力が弱くなり、融解温度（Tm）が低くなる。従
って、核酸プローブとターゲットDNAとの融解温度を解
析することにより、ターゲットDNAの多型部位における
変異が検出できる。換言すれば、多型部位における遺伝
子配列を求めることができる。核酸プローブとしては、
特定の多型（野生型又は特定の変異型）を有するターゲ
ットDNAの一部に相補的な配列を有するものを用いるこ
とが好ましい。但し、１〜数個、好ましくは１〜５個、
更に好ましくは１〜３個程度のミスマッチを含むもので
あってもよい。DNAプローブ、RNAプローブのいずれも用
いることができるが、特異性の高さを考慮すれば、DNA
プローブを用いることが好ましい。核酸プローブの長さ
については特に限定されず、例えば５〜１００bp、好ま
しくは１０〜８０bp、更に好ましくは１５〜５０bpであ
る。
位（91番アミノ酸又は95番アミノ酸をコードする領域）
を含む部分に特異的にハイブリダイズするものであれ
ば、特に限定されない。このような核酸プローブをター
ゲットDNAにハイブリダイズさせた場合、ターゲットDNA
の多型部位に変異が存在すれば核酸プローブとの間にミ
スマッチが生ずるため、核酸プローブとターゲットDNA
との結合力が弱くなり、融解温度（Tm）が低くなる。従
って、核酸プローブとターゲットDNAとの融解温度を解
析することにより、ターゲットDNAの多型部位における
変異が検出できる。換言すれば、多型部位における遺伝
子配列を求めることができる。核酸プローブとしては、
特定の多型（野生型又は特定の変異型）を有するターゲ
ットDNAの一部に相補的な配列を有するものを用いるこ
とが好ましい。但し、１〜数個、好ましくは１〜５個、
更に好ましくは１〜３個程度のミスマッチを含むもので
あってもよい。DNAプローブ、RNAプローブのいずれも用
いることができるが、特異性の高さを考慮すれば、DNA
プローブを用いることが好ましい。核酸プローブの長さ
については特に限定されず、例えば５〜１００bp、好ま
しくは１０〜８０bp、更に好ましくは１５〜５０bpであ
る。
【００１６】融解温度解析は、例えば核酸プローブに結
合させた蛍光標識などを指標として行うことができる。
好ましくは、異なる蛍光物質でそれぞれ標識された一対
の核酸プローブを用いた方法により行うことができる。
以下に、このような一対の核酸プローブを用いる場合
の、各核酸プローブの性状を記載する。 (i)ターゲットDNAに１〜５塩基のギャップを挟んで特異
的にハイブリダイズ可能である、(ii)片方が特定の多型
部位（91番アミノ酸をコードする領域又は95番アミノ酸
をコードする領域）をカバーし且つ他方より融解温度が
高いように設計される、(iii)ターゲットDNAにハイブリ
ダイズしたときに前記ギャップ側に位置する末端に、第
１蛍光物質が結合した第１核酸プローブと、前記ターゲ
ットDNAにハイブリダイズしたときに前記ギャップ側に
位置する末端に、前記第１蛍光物質の蛍光により励起し
て蛍光を発する第２蛍光物質が結合した第２核酸プロー
ブとからなる。以上のような一対の核酸プローブを用い
た融解温度解析は次のようにして行うことができる。ま
ず、(2-1)上記一対の核酸プローブを検体に添加し、(2-
2)第１核酸プローブ及び第２核酸プローブがターゲット
DNAにハイブリダイズする温度まで降温させ、(2-3)連続
的又は段階的に昇温させるとともに、前記第１蛍光物質
の励起波長の光を検体に照射し、前記第２蛍光物質から
発せられる蛍光量を測定する。
合させた蛍光標識などを指標として行うことができる。
好ましくは、異なる蛍光物質でそれぞれ標識された一対
の核酸プローブを用いた方法により行うことができる。
以下に、このような一対の核酸プローブを用いる場合
の、各核酸プローブの性状を記載する。 (i)ターゲットDNAに１〜５塩基のギャップを挟んで特異
的にハイブリダイズ可能である、(ii)片方が特定の多型
部位（91番アミノ酸をコードする領域又は95番アミノ酸
をコードする領域）をカバーし且つ他方より融解温度が
高いように設計される、(iii)ターゲットDNAにハイブリ
ダイズしたときに前記ギャップ側に位置する末端に、第
１蛍光物質が結合した第１核酸プローブと、前記ターゲ
ットDNAにハイブリダイズしたときに前記ギャップ側に
位置する末端に、前記第１蛍光物質の蛍光により励起し
て蛍光を発する第２蛍光物質が結合した第２核酸プロー
ブとからなる。以上のような一対の核酸プローブを用い
た融解温度解析は次のようにして行うことができる。ま
ず、(2-1)上記一対の核酸プローブを検体に添加し、(2-
2)第１核酸プローブ及び第２核酸プローブがターゲット
DNAにハイブリダイズする温度まで降温させ、(2-3)連続
的又は段階的に昇温させるとともに、前記第１蛍光物質
の励起波長の光を検体に照射し、前記第２蛍光物質から
発せられる蛍光量を測定する。
【００１７】第１核酸プローブ又は第２核酸プローブに
結合される蛍光物質（第１蛍光物質又は第２蛍光物質）
の種類は特に限定されず、例えば、フルオレセインイソ
チオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシア
ネート、テキサスレッド、エオシンイソチオシアネー
ト、シアニン染料などを用いることができる。第１核酸
プローブ及び第２核酸プローブの蛍光物質による標識化
は、ターミナルトランスフェラーゼを用いた方法などに
より行うことができる（Molecular Cloning， Third Ed
ition，9.76-9.81，Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess, New York）。
結合される蛍光物質（第１蛍光物質又は第２蛍光物質）
の種類は特に限定されず、例えば、フルオレセインイソ
チオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシア
ネート、テキサスレッド、エオシンイソチオシアネー
ト、シアニン染料などを用いることができる。第１核酸
プローブ及び第２核酸プローブの蛍光物質による標識化
は、ターミナルトランスフェラーゼを用いた方法などに
より行うことができる（Molecular Cloning， Third Ed
ition，9.76-9.81，Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess, New York）。
【００１８】第１核酸プローブと第２核酸プローブは、
１〜５塩基のギャップを挟んで前記ターゲットDNAにハ
イブリダイズするように設計されている。両プローブが
ターゲットDNAにハイブリダイズした状態では、各プロ
ーブに結合した蛍光物質が当該ギャップを挟み、近接し
て存在することとなる。これにより、第１蛍光物質に対
して励起光を照射すれば、第１蛍光物質から蛍光が発せ
られ、かかる蛍光のエネルギーにより第２の蛍光物質が
励起される。その結果、第２蛍光物質特有の蛍光が観察
される。そして、連続的又は段階的に昇温し、多型部位
をカバーする核酸プローブの融解温度に近づけると、当
該核酸プローブがターゲットDNAより遊離し始める。こ
のような遊離が生ずると、もはや第１蛍光物質と第２蛍
光物質とは近接して存在せず、第１蛍光物質の蛍光エネ
ルギーによって第２蛍光物質が励起され、蛍光を発する
ことがなくなる。即ち、当該核酸プローブの融解温度付
近で第２蛍光物質からの蛍光量が減少する。
１〜５塩基のギャップを挟んで前記ターゲットDNAにハ
イブリダイズするように設計されている。両プローブが
ターゲットDNAにハイブリダイズした状態では、各プロ
ーブに結合した蛍光物質が当該ギャップを挟み、近接し
て存在することとなる。これにより、第１蛍光物質に対
して励起光を照射すれば、第１蛍光物質から蛍光が発せ
られ、かかる蛍光のエネルギーにより第２の蛍光物質が
励起される。その結果、第２蛍光物質特有の蛍光が観察
される。そして、連続的又は段階的に昇温し、多型部位
をカバーする核酸プローブの融解温度に近づけると、当
該核酸プローブがターゲットDNAより遊離し始める。こ
のような遊離が生ずると、もはや第１蛍光物質と第２蛍
光物質とは近接して存在せず、第１蛍光物質の蛍光エネ
ルギーによって第２蛍光物質が励起され、蛍光を発する
ことがなくなる。即ち、当該核酸プローブの融解温度付
近で第２蛍光物質からの蛍光量が減少する。
【００１９】一方、増幅されたターゲットDNAの多型部
位を含む部分と、多型部位をカバーしてハイブリダイズ
する核酸プローブとの間にミスマッチがある場合には、
より低い温度で当該核酸プローブの遊離がおこる。この
ため、第２蛍光物質からの蛍光量が減少する温度が低温
側へとシフトする。従って、第２蛍光物質からの蛍光量
の減少する温度を測定すれば、多型の種類を判定するこ
とが可能である。好ましくは、第２の蛍光物質からの蛍
光量の減少率が最大となる温度を求め、この温度を基に
多型部位の変異の有無を決定することができる。
位を含む部分と、多型部位をカバーしてハイブリダイズ
する核酸プローブとの間にミスマッチがある場合には、
より低い温度で当該核酸プローブの遊離がおこる。この
ため、第２蛍光物質からの蛍光量が減少する温度が低温
側へとシフトする。従って、第２蛍光物質からの蛍光量
の減少する温度を測定すれば、多型の種類を判定するこ
とが可能である。好ましくは、第２の蛍光物質からの蛍
光量の減少率が最大となる温度を求め、この温度を基に
多型部位の変異の有無を決定することができる。
【００２０】上記のように、第１核酸プローブと第２核
酸プローブとは１〜５塩基のギャップを挟んでターゲッ
トDNAにハイブリダイズするように設計されるが、好ま
しくは１〜３塩基、更に好ましくは１塩基のギャップを
挟んでターゲットDNAにハイブリダイズするように両核
酸プローブを設計する。両核酸プローブが挟むギャップ
をできるだけ小さくすれば、両核酸プローブがハイブリ
ダイズした状態において第１蛍光物質と第２蛍光物質と
をより近接させることができることから、第１蛍光物質
からの光を効率的に第２蛍光物質に照射でき、第２蛍光
物質から発せられる蛍光量の増大を図ることができる。
もって、検出感度を向上できる。
酸プローブとは１〜５塩基のギャップを挟んでターゲッ
トDNAにハイブリダイズするように設計されるが、好ま
しくは１〜３塩基、更に好ましくは１塩基のギャップを
挟んでターゲットDNAにハイブリダイズするように両核
酸プローブを設計する。両核酸プローブが挟むギャップ
をできるだけ小さくすれば、両核酸プローブがハイブリ
ダイズした状態において第１蛍光物質と第２蛍光物質と
をより近接させることができることから、第１蛍光物質
からの光を効率的に第２蛍光物質に照射でき、第２蛍光
物質から発せられる蛍光量の増大を図ることができる。
もって、検出感度を向上できる。
【００２１】一対の核酸プローブ（第１核酸プローブ及
び第２核酸プローブからなる）の具体例としては、91番
アミノ酸をコードする領域の多型を検出するものとし
て、図１に示した部分DNA（符号３）に相補的なDNA
（３’末端が蛍光物質で標識化されている、配列番号：
３）及び部分DNA（符号４）に相補的なDNA（５’末端が
蛍光物質で標識化されている、配列番号：４）からなる
一対のDNAプローブを挙げることができる。また、95番
アミノ酸をコードする領域の多型を検出するものとし
て、図１に示した部分DNA（符号５）に相補的なDNA
（３’末端が蛍光物質で標識化されている、配列番号：
５）及び部分DNA（符号６）に相補的なDNA（５’末端が
蛍光物質で標識化されている、配列番号：６）からなる
一対のDNAプローブを挙げることができる。
び第２核酸プローブからなる）の具体例としては、91番
アミノ酸をコードする領域の多型を検出するものとし
て、図１に示した部分DNA（符号３）に相補的なDNA
（３’末端が蛍光物質で標識化されている、配列番号：
３）及び部分DNA（符号４）に相補的なDNA（５’末端が
蛍光物質で標識化されている、配列番号：４）からなる
一対のDNAプローブを挙げることができる。また、95番
アミノ酸をコードする領域の多型を検出するものとし
て、図１に示した部分DNA（符号５）に相補的なDNA
（３’末端が蛍光物質で標識化されている、配列番号：
５）及び部分DNA（符号６）に相補的なDNA（５’末端が
蛍光物質で標識化されている、配列番号：６）からなる
一対のDNAプローブを挙げることができる。
【００２２】第１の核酸プローブ及び第２の核酸プロー
ブを、ターゲットDNAを増幅させるステップ（ステップ
(1)）の前に添加しておくことができる。このようにす
れば、ターゲットDNAの増幅を第１の核酸プローブ又は
第２の核酸プローブからの蛍光を利用してモニターする
ことができる。従って、ターゲットDNAにおける変異の
検出及び淋菌の検出を同時に行うことが可能となる。例
えば、以下のステップを含むことにより、淋菌の検出及
びニューキノロン剤感受性評価を行う方法を構築でき
る。 (c) 淋菌gyrA遺伝子において91番アミノ酸をコードす
る領域を含むターゲットDNAを特異的に増幅可能なPCRプ
ライマーを検体に添加するステップ、 (d) 前記ターゲットDNAに１〜５塩基のギャップを挟ん
で特異的にハイブリダイズ可能であり、片方が前記領域
をカバーし且つ他方より融解温度が高いように設計され
た一対の核酸プローブであって、前記ターゲットDNAに
ハイブリダイズしたときに前記ギャップ側に位置する末
端に、第１蛍光物質が結合した第１核酸プローブ、及び
前記ターゲットDNAにハイブリダイズしたときに前記ギ
ャップ側に位置する末端に、前記第１蛍光物質の蛍光に
より励起して蛍光を発する第２蛍光物質が結合した第２
核酸プローブ、からなる一対の核酸プローブを検体に添
加するステップ； (e) リアルタイムPCR法を実行するステップ； (f) 前記第１核酸プローブ及び前記第２核酸プローブ
が前記ターゲットDNAにハイブリダイズする温度まで降
温させるステップ； (g) 連続的又は段階的に昇温させるとともに、前記第
１蛍光物質の励起波長の光を検体に照射し、前記第２蛍
光物質から発せられる蛍光量を測定するステップ； (h) 前記蛍光量の減少率が最大となる温度を求め、該
温度よりgyrA遺伝子において91番アミノ酸をコードする
領域の配列を決定するステップ。
ブを、ターゲットDNAを増幅させるステップ（ステップ
(1)）の前に添加しておくことができる。このようにす
れば、ターゲットDNAの増幅を第１の核酸プローブ又は
第２の核酸プローブからの蛍光を利用してモニターする
ことができる。従って、ターゲットDNAにおける変異の
検出及び淋菌の検出を同時に行うことが可能となる。例
えば、以下のステップを含むことにより、淋菌の検出及
びニューキノロン剤感受性評価を行う方法を構築でき
る。 (c) 淋菌gyrA遺伝子において91番アミノ酸をコードす
る領域を含むターゲットDNAを特異的に増幅可能なPCRプ
ライマーを検体に添加するステップ、 (d) 前記ターゲットDNAに１〜５塩基のギャップを挟ん
で特異的にハイブリダイズ可能であり、片方が前記領域
をカバーし且つ他方より融解温度が高いように設計され
た一対の核酸プローブであって、前記ターゲットDNAに
ハイブリダイズしたときに前記ギャップ側に位置する末
端に、第１蛍光物質が結合した第１核酸プローブ、及び
前記ターゲットDNAにハイブリダイズしたときに前記ギ
ャップ側に位置する末端に、前記第１蛍光物質の蛍光に
より励起して蛍光を発する第２蛍光物質が結合した第２
核酸プローブ、からなる一対の核酸プローブを検体に添
加するステップ； (e) リアルタイムPCR法を実行するステップ； (f) 前記第１核酸プローブ及び前記第２核酸プローブ
が前記ターゲットDNAにハイブリダイズする温度まで降
温させるステップ； (g) 連続的又は段階的に昇温させるとともに、前記第
１蛍光物質の励起波長の光を検体に照射し、前記第２蛍
光物質から発せられる蛍光量を測定するステップ； (h) 前記蛍光量の減少率が最大となる温度を求め、該
温度よりgyrA遺伝子において91番アミノ酸をコードする
領域の配列を決定するステップ。
【００２３】同様に、以下のステップを含むことによ
り、淋菌の検出及びニューキノロン剤感受性評価を行う
方法を構築できる。 (C) 淋菌gyrA遺伝子において95番アミノ酸をコードす
る領域を含むターゲットDNAを特異的に増幅可能なPCRプ
ライマーを検体に添加するステップ、 (D) 前記ターゲットDNAに１〜５塩基のギャップを挟ん
で特異的にハイブリダイズ可能であり、片方が前記領域
をカバーし且つ他方より融解温度が高いように設計され
た一対の核酸プローブであって、前記ターゲットDNAに
ハイブリダイズしたときに前記ギャップ側に位置する末
端に、第１蛍光物質が結合した第１核酸プローブ、及び
前記ターゲットDNAにハイブリダイズしたときに前記ギ
ャップ側に位置する末端に、前記第１蛍光物質の蛍光に
より励起して蛍光を発する第２蛍光物質が結合した第２
核酸プローブ、からなる一対の核酸プローブを検体に添
加するステップ； (E) リアルタイムPCR法を実行するステップ； (F) 前記第１核酸プローブ及び前記第２核酸プローブ
が前記ターゲットDNAにハイブリダイズする温度まで降
温させるステップ； (G) 連続的又は段階的に昇温させるとともに、前記第
１蛍光物質の励起波長の光を検体に照射し、前記第２蛍
光物質から発せられる蛍光量を測定するステップ； (H) 前記蛍光量の減少率が最大となる温度を求め、該
温度よりgyrA遺伝子において95番アミノ酸をコードする
領域の配列を決定するステップ。
り、淋菌の検出及びニューキノロン剤感受性評価を行う
方法を構築できる。 (C) 淋菌gyrA遺伝子において95番アミノ酸をコードす
る領域を含むターゲットDNAを特異的に増幅可能なPCRプ
ライマーを検体に添加するステップ、 (D) 前記ターゲットDNAに１〜５塩基のギャップを挟ん
で特異的にハイブリダイズ可能であり、片方が前記領域
をカバーし且つ他方より融解温度が高いように設計され
た一対の核酸プローブであって、前記ターゲットDNAに
ハイブリダイズしたときに前記ギャップ側に位置する末
端に、第１蛍光物質が結合した第１核酸プローブ、及び
前記ターゲットDNAにハイブリダイズしたときに前記ギ
ャップ側に位置する末端に、前記第１蛍光物質の蛍光に
より励起して蛍光を発する第２蛍光物質が結合した第２
核酸プローブ、からなる一対の核酸プローブを検体に添
加するステップ； (E) リアルタイムPCR法を実行するステップ； (F) 前記第１核酸プローブ及び前記第２核酸プローブ
が前記ターゲットDNAにハイブリダイズする温度まで降
温させるステップ； (G) 連続的又は段階的に昇温させるとともに、前記第
１蛍光物質の励起波長の光を検体に照射し、前記第２蛍
光物質から発せられる蛍光量を測定するステップ； (H) 前記蛍光量の減少率が最大となる温度を求め、該
温度よりgyrA遺伝子において95番アミノ酸をコードする
領域の配列を決定するステップ。
【００２４】市販のLightCycler（ロッシュ・ダイアグ
ノスティック株式会社）等を利用すれば、ターゲットDN
Aを増幅させるステップ（ステップ(1)）、融解温度解析
を行うステップ（ステップ(2)）を連続して行うことが
できる。また、短時間の解析が可能である。
ノスティック株式会社）等を利用すれば、ターゲットDN
Aを増幅させるステップ（ステップ(1)）、融解温度解析
を行うステップ（ステップ(2)）を連続して行うことが
できる。また、短時間の解析が可能である。
【００２５】上記のターゲットDNAを特異的に増幅させ
るプライマー及び一対の核酸プローブを組み合わせるこ
とにより、淋菌の検出及びニューキノロン剤感受性を評
価するキットを構成することができる。即ち、本発明の
他の局面は以下の構成（（I）又は(II)）からなるキッ
トに関する。 (I)淋菌gyrA遺伝子において91番アミノ酸をコードする
領域を含むターゲットDNAを特異的に増幅可能な一対の
プライマーと、前記ターゲットDNAに１〜５塩基のギャ
ップを挟んで特異的にハイブリダイズ可能であり、片方
が前記領域をカバーし、かつ他方より融解温度が高いよ
うに設計された一対の核酸プローブであって、前記ター
ゲットDNAにハイブリダイズしたときに前記ギャップ側
に位置する末端に、第１蛍光物質が結合した第１核酸プ
ローブ、及び前記ターゲットDNAにハイブリダイズした
ときに前記ギャップ側に位置する末端に、前記第１蛍光
物質の蛍光により励起して蛍光を発する第２蛍光物質が
結合した第２核酸プローブ、からなる一対の核酸プロー
ブと、を含む。 (II)淋菌gyrA遺伝子において95番アミノ酸をコードする
領域を含むターゲットDNAを特異的に増幅可能な一対の
プライマーと、前記ターゲットDNAに１〜５塩基のギャ
ップを挟んで特異的にハイブリダイズ可能であり、片方
が領域をカバーし、かつ他方より融解温度が高いように
設計された一対の核酸プローブであって、前記ターゲッ
トDNAにハイブリダイズしたときに前記ギャップ側に位
置する末端に、第１蛍光物質が結合した第１核酸プロー
ブ、及び前記ターゲットDNAにハイブリダイズしたとき
に前記ギャップ側に位置する末端に、前記第１蛍光物質
の蛍光により励起して蛍光を発する第２蛍光物質が結合
した第２核酸プローブ、からなる一対の核酸プローブ
と、を含む。これらのキットには、ターゲットDNAの増
幅の際必要な酵素、試薬などを適宜含有させることがで
きる。
るプライマー及び一対の核酸プローブを組み合わせるこ
とにより、淋菌の検出及びニューキノロン剤感受性を評
価するキットを構成することができる。即ち、本発明の
他の局面は以下の構成（（I）又は(II)）からなるキッ
トに関する。 (I)淋菌gyrA遺伝子において91番アミノ酸をコードする
領域を含むターゲットDNAを特異的に増幅可能な一対の
プライマーと、前記ターゲットDNAに１〜５塩基のギャ
ップを挟んで特異的にハイブリダイズ可能であり、片方
が前記領域をカバーし、かつ他方より融解温度が高いよ
うに設計された一対の核酸プローブであって、前記ター
ゲットDNAにハイブリダイズしたときに前記ギャップ側
に位置する末端に、第１蛍光物質が結合した第１核酸プ
ローブ、及び前記ターゲットDNAにハイブリダイズした
ときに前記ギャップ側に位置する末端に、前記第１蛍光
物質の蛍光により励起して蛍光を発する第２蛍光物質が
結合した第２核酸プローブ、からなる一対の核酸プロー
ブと、を含む。 (II)淋菌gyrA遺伝子において95番アミノ酸をコードする
領域を含むターゲットDNAを特異的に増幅可能な一対の
プライマーと、前記ターゲットDNAに１〜５塩基のギャ
ップを挟んで特異的にハイブリダイズ可能であり、片方
が領域をカバーし、かつ他方より融解温度が高いように
設計された一対の核酸プローブであって、前記ターゲッ
トDNAにハイブリダイズしたときに前記ギャップ側に位
置する末端に、第１蛍光物質が結合した第１核酸プロー
ブ、及び前記ターゲットDNAにハイブリダイズしたとき
に前記ギャップ側に位置する末端に、前記第１蛍光物質
の蛍光により励起して蛍光を発する第２蛍光物質が結合
した第２核酸プローブ、からなる一対の核酸プローブ
と、を含む。これらのキットには、ターゲットDNAの増
幅の際必要な酵素、試薬などを適宜含有させることがで
きる。
【００２６】
【実施例】以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説
明する。本実施例では、LightCycler(ロッシュ・ダイア
グノスティック株式会社)を利用して淋菌の検出及び淋
菌のニューキノロン剤感受性の評価を行った。 （材料及び方法） （１）使用した菌株、検体 被験対象として91検体を用意した。この中で、55検体は
コントロールの淋菌である。コントロールの淋菌のニュ
ーキノロン剤に対する感受性については、National Com
mittee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)の
方法（National Committee for Clinical Laboratory S
tandards. 1993. Method for dilution antimicrobial
susceptibility test for bacteria that grow aerobic
ally, 3rded. Approved standard M7-A3. National Com
mittee for Clinical LaboratoryStandards, Villanov
a, Pa.）により、さらにGyrA蛋白91番のアミノ酸のセリ
ンと95番のアミノ酸のアスパラギン酸の変化については
従来の塩基配列の決定法（Deguchi, T., M. Yasuda, M.
Asano, K. Tada, H. Iwata, H. Komeda, T. Ezaki, I.
Saito, and Y. Kawada. 1995. DNA gyrase mutations
in quinolone-resistant clinical isolates of Neisse
ria gonorrhoeae. Antimicrob. Agents Chemother. 39:
561-563.、Deguchi, T., M. Yasuda, M. Nakano, S. Oz
eki, T. Ezaki, I. Saito, and Y. Kawada. 1996. Quin
olone-resistant Neisseria gonorrhoeae: correlation
of alterations in the GyrA subunit of DNA gyrase
and the ParC subunit of topoisomerase IV with anti
microbial susceptibility profiles. Antimicrob. Age
nts Chemother. 40:1020-1023.）にて検索されたもので
ある。これらのうち25株はgyrA遺伝子に変異のないニュ
ーキノロン剤感受性株であり、27株はGyrA蛋白91番のア
ミノ酸のセリンあるいは95番のアミノ酸のアスパラギン
酸の変化のいずれか一方の変化があるニューキノロン剤
低感受性株であり、残りの3株は両者に変化のあるニュ
ーキノロン剤耐性株である。36検体の尿道分泌物は、19
99年から2000年にかけトヨタ記念病院泌尿器科を受診し
た淋菌性尿道炎患者から得たものである。これらの検体
から淋菌を培養した（Deguchi, T.,M. Yasuda, M. Asan
o, K. Tada, H. Iwata, H. Komeda, T. Ezaki, I. Sait
o,and Y. Kawada. 1995. DNA gyrase mutations in qui
nolone-resistant clinical isolates of Neisseria go
norrhoeae. Antimicrob. Agents Chemother. 39:561-56
3.、Deguchi, T., M. Yasuda, M. Nakano, S. Ozeki,
T. Ezaki, I. Saito,and Y. Kawada. 1996. Quinolone-
resistant Neisseria gonorrhoeae: correlation of al
terations in the GyrA subunit of DNA gyrase and th
e ParC subunit of topoisomerase IV with antimicrob
ial susceptibility profiles. Antimicrob. Agents Ch
emother. 40:1020-1023.）。また、これらの尿道分泌物
の一部は、トリス-EDTA緩衝液に懸濁し、LightCyclerに
よる解析に用いるまで-80℃で凍結保存した。
明する。本実施例では、LightCycler(ロッシュ・ダイア
グノスティック株式会社)を利用して淋菌の検出及び淋
菌のニューキノロン剤感受性の評価を行った。 （材料及び方法） （１）使用した菌株、検体 被験対象として91検体を用意した。この中で、55検体は
コントロールの淋菌である。コントロールの淋菌のニュ
ーキノロン剤に対する感受性については、National Com
mittee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)の
方法（National Committee for Clinical Laboratory S
tandards. 1993. Method for dilution antimicrobial
susceptibility test for bacteria that grow aerobic
ally, 3rded. Approved standard M7-A3. National Com
mittee for Clinical LaboratoryStandards, Villanov
a, Pa.）により、さらにGyrA蛋白91番のアミノ酸のセリ
ンと95番のアミノ酸のアスパラギン酸の変化については
従来の塩基配列の決定法（Deguchi, T., M. Yasuda, M.
Asano, K. Tada, H. Iwata, H. Komeda, T. Ezaki, I.
Saito, and Y. Kawada. 1995. DNA gyrase mutations
in quinolone-resistant clinical isolates of Neisse
ria gonorrhoeae. Antimicrob. Agents Chemother. 39:
561-563.、Deguchi, T., M. Yasuda, M. Nakano, S. Oz
eki, T. Ezaki, I. Saito, and Y. Kawada. 1996. Quin
olone-resistant Neisseria gonorrhoeae: correlation
of alterations in the GyrA subunit of DNA gyrase
and the ParC subunit of topoisomerase IV with anti
microbial susceptibility profiles. Antimicrob. Age
nts Chemother. 40:1020-1023.）にて検索されたもので
ある。これらのうち25株はgyrA遺伝子に変異のないニュ
ーキノロン剤感受性株であり、27株はGyrA蛋白91番のア
ミノ酸のセリンあるいは95番のアミノ酸のアスパラギン
酸の変化のいずれか一方の変化があるニューキノロン剤
低感受性株であり、残りの3株は両者に変化のあるニュ
ーキノロン剤耐性株である。36検体の尿道分泌物は、19
99年から2000年にかけトヨタ記念病院泌尿器科を受診し
た淋菌性尿道炎患者から得たものである。これらの検体
から淋菌を培養した（Deguchi, T.,M. Yasuda, M. Asan
o, K. Tada, H. Iwata, H. Komeda, T. Ezaki, I. Sait
o,and Y. Kawada. 1995. DNA gyrase mutations in qui
nolone-resistant clinical isolates of Neisseria go
norrhoeae. Antimicrob. Agents Chemother. 39:561-56
3.、Deguchi, T., M. Yasuda, M. Nakano, S. Ozeki,
T. Ezaki, I. Saito,and Y. Kawada. 1996. Quinolone-
resistant Neisseria gonorrhoeae: correlation of al
terations in the GyrA subunit of DNA gyrase and th
e ParC subunit of topoisomerase IV with antimicrob
ial susceptibility profiles. Antimicrob. Agents Ch
emother. 40:1020-1023.）。また、これらの尿道分泌物
の一部は、トリス-EDTA緩衝液に懸濁し、LightCyclerに
よる解析に用いるまで-80℃で凍結保存した。
【００２７】（２）感受性試験
尿道分泌物から培養分離した36株に対するシプロフロキ
サシン（CPFX）の最小発育阻止濃度（MIC）をNCCLSの方
法（National Committee for Clinical Laboratory Sta
ndards. 1993. Method for dilution antimicrobial su
sceptibility test for bacteria that grow aerobical
ly, 3rd ed. Approved standard M7-A3.National Commi
ttee for Clinical Laboratory Standards, Villanova,
Pa.）に準じて測定した。
サシン（CPFX）の最小発育阻止濃度（MIC）をNCCLSの方
法（National Committee for Clinical Laboratory Sta
ndards. 1993. Method for dilution antimicrobial su
sceptibility test for bacteria that grow aerobical
ly, 3rd ed. Approved standard M7-A3.National Commi
ttee for Clinical Laboratory Standards, Villanova,
Pa.）に準じて測定した。
【００２８】（３）DAN抽出
55株のコントロール検体からのDNA抽出は、通常のアル
カリドデシル硫酸ナトリウム処理、フェノール・クロロ
フォルム抽出およびエタノール沈殿で行った（Deguchi,
T., M. Yasuda, M. Asano, K. Tada, H. Iwata, H. Ko
meda, T. Ezaki,I. Saito, and Y. Kawada. 1995. DNA
gyrase mutations in quinolone-resistant clinical i
solates of Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob. Agen
ts Chemother. 39:561-563.、Deguchi, T., M. Yasuda,
M. Nakano, S. Ozeki, T. Ezaki,I. Saito, and Y. Ka
wada. 1996. Quinolone-resistant Neisseria gonorrho
eae: correlation of alterations in the GyrA subuni
t of DNA gyrase and theParC subunit of topoisomera
se IV with antimicrobial susceptibility profiles.
Antimicrob. Agents Chemother. 40:1020-1023.）。Lig
htCycler解析用の尿道分泌物からのDNAの抽出は、トリ
ス-EDTA緩衝液に懸濁され凍結保存されていた尿道分泌
物36検体を、それらの保存容器であるエッペンドルフチ
ューブごと直接熱湯中に5分間入れることにより行い、D
NAをさらに純化するための処理は加えなかった。
カリドデシル硫酸ナトリウム処理、フェノール・クロロ
フォルム抽出およびエタノール沈殿で行った（Deguchi,
T., M. Yasuda, M. Asano, K. Tada, H. Iwata, H. Ko
meda, T. Ezaki,I. Saito, and Y. Kawada. 1995. DNA
gyrase mutations in quinolone-resistant clinical i
solates of Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob. Agen
ts Chemother. 39:561-563.、Deguchi, T., M. Yasuda,
M. Nakano, S. Ozeki, T. Ezaki,I. Saito, and Y. Ka
wada. 1996. Quinolone-resistant Neisseria gonorrho
eae: correlation of alterations in the GyrA subuni
t of DNA gyrase and theParC subunit of topoisomera
se IV with antimicrobial susceptibility profiles.
Antimicrob. Agents Chemother. 40:1020-1023.）。Lig
htCycler解析用の尿道分泌物からのDNAの抽出は、トリ
ス-EDTA緩衝液に懸濁され凍結保存されていた尿道分泌
物36検体を、それらの保存容器であるエッペンドルフチ
ューブごと直接熱湯中に5分間入れることにより行い、D
NAをさらに純化するための処理は加えなかった。
【００２９】（４）LightCyclerによる淋菌のgyrA遺伝
子の増幅とgyrA遺伝子の変異の解析 LightCyclerによる淋菌gyrA遺伝子のPCRによる特異的な
増幅は、一対のPCR用プライマーにて行い、淋菌のgyrA
遺伝子の増幅の確認とgyrA遺伝子の変異の検出は、一対
のプローブ（フルオレセインを標識したプローブとLC R
ed 640を標識したプローブ）を二組用いたハイブリダイ
ゼーションにより行った。図２にPCR用プライマー（gyr
A-up（配列番号：１）及びgyrA-down（配列番号：
２））、91番アミノ酸検出用プローブ（gyrA-Ser-Flu
（配列番号：３）及びgyrA-Ser-LC（配列番号：
４））、95番アミノ酸検出用プローブ（gyrA-Asp-Flu
（配列番号：５）及びgyrA-Asp-LC（配列番号：６））
を示す。PCR用プライマー（gyrA-upとgyrA-down）は、
淋菌gyrA遺伝子の塩基174位から398位までの225塩基対
のDNA断片（ターゲットDNA）を増幅するようにデザイン
した（図１及び図２参照）。ここで用いたプライマーの
淋菌gyrA遺伝子に対する特異性は、データベース上の他
の遺伝子情報との比較により確認した。
子の増幅とgyrA遺伝子の変異の解析 LightCyclerによる淋菌gyrA遺伝子のPCRによる特異的な
増幅は、一対のPCR用プライマーにて行い、淋菌のgyrA
遺伝子の増幅の確認とgyrA遺伝子の変異の検出は、一対
のプローブ（フルオレセインを標識したプローブとLC R
ed 640を標識したプローブ）を二組用いたハイブリダイ
ゼーションにより行った。図２にPCR用プライマー（gyr
A-up（配列番号：１）及びgyrA-down（配列番号：
２））、91番アミノ酸検出用プローブ（gyrA-Ser-Flu
（配列番号：３）及びgyrA-Ser-LC（配列番号：
４））、95番アミノ酸検出用プローブ（gyrA-Asp-Flu
（配列番号：５）及びgyrA-Asp-LC（配列番号：６））
を示す。PCR用プライマー（gyrA-upとgyrA-down）は、
淋菌gyrA遺伝子の塩基174位から398位までの225塩基対
のDNA断片（ターゲットDNA）を増幅するようにデザイン
した（図１及び図２参照）。ここで用いたプライマーの
淋菌gyrA遺伝子に対する特異性は、データベース上の他
の遺伝子情報との比較により確認した。
【００３０】淋菌gyrA遺伝子の増幅の確認とGyrA蛋白91
番アミノ酸のセリンの変化に関わるgyrA遺伝子変異を検
出するために、この領域をカバーする5'側にLC Red 640
を標識したプローブ（gyrA-Ser-LC）と1塩基のギャップ
を置き3'側にフルオレセインを標識したプローブ（gyrA
-Ser-Flu）をデザインした（図１及び図２参照）。プロ
ーブgyrA-Ser-LCとプローブgyrA-Ser-Fluのそれぞれの
理論上の融解温度（Tm、50％のDNAが１本鎖になり、残
りの50％のDNAが2本鎖である状態の温度）は、66.8℃と
91.1℃であった。
番アミノ酸のセリンの変化に関わるgyrA遺伝子変異を検
出するために、この領域をカバーする5'側にLC Red 640
を標識したプローブ（gyrA-Ser-LC）と1塩基のギャップ
を置き3'側にフルオレセインを標識したプローブ（gyrA
-Ser-Flu）をデザインした（図１及び図２参照）。プロ
ーブgyrA-Ser-LCとプローブgyrA-Ser-Fluのそれぞれの
理論上の融解温度（Tm、50％のDNAが１本鎖になり、残
りの50％のDNAが2本鎖である状態の温度）は、66.8℃と
91.1℃であった。
【００３１】理論上、両プローブが増幅されたgyrA遺伝
子（ターゲットDNA）にハイブリダイズした場合には、
隣接するフルオレセインの蛍光がLC Red 640を励起し、
LC Red 640から蛍光が発せられる。PCRにより増幅され
るDNA量が増加するにしたがって、ハイブリダイズする
プローブ量が上昇し、発せられる蛍光が増加する。した
がって、蛍光強度によってPCRによるgyrA遺伝子（ター
ゲットDNA）の増幅をモニターすることができる。さら
に、プローブがハイブリダイズした状態から徐々に温度
を上昇し、Tmの温度付近に近づくとプローブgyrA-Ser-L
CがターゲットDNAより遊離し始め、フルオレセインの蛍
光がLC Red 640を励起しなくなりLC Red 640からの蛍光
が消失する。この時に、91番のアミノ酸のセリンの変化
に関わるgyrA遺伝子の変異があるとプローブgyrA-Ser-L
CとgyrA遺伝子との結合はミスマッチの塩基があり弱い
ため、プローブの遊離はより低温でおこり蛍光が消失す
る。したがって、LC Red 640からの蛍光の減少率が最も
大きい温度を観察することにより91番のアミノ酸のセリ
ンの変化に関わるgyrA遺伝子の変異の有無を知ることが
できる。
子（ターゲットDNA）にハイブリダイズした場合には、
隣接するフルオレセインの蛍光がLC Red 640を励起し、
LC Red 640から蛍光が発せられる。PCRにより増幅され
るDNA量が増加するにしたがって、ハイブリダイズする
プローブ量が上昇し、発せられる蛍光が増加する。した
がって、蛍光強度によってPCRによるgyrA遺伝子（ター
ゲットDNA）の増幅をモニターすることができる。さら
に、プローブがハイブリダイズした状態から徐々に温度
を上昇し、Tmの温度付近に近づくとプローブgyrA-Ser-L
CがターゲットDNAより遊離し始め、フルオレセインの蛍
光がLC Red 640を励起しなくなりLC Red 640からの蛍光
が消失する。この時に、91番のアミノ酸のセリンの変化
に関わるgyrA遺伝子の変異があるとプローブgyrA-Ser-L
CとgyrA遺伝子との結合はミスマッチの塩基があり弱い
ため、プローブの遊離はより低温でおこり蛍光が消失す
る。したがって、LC Red 640からの蛍光の減少率が最も
大きい温度を観察することにより91番のアミノ酸のセリ
ンの変化に関わるgyrA遺伝子の変異の有無を知ることが
できる。
【００３２】95番のアミノ酸のアスパラギン酸の変化の
検出のためには、この領域をカバーする3'側にフルオレ
セインを標識したプローブ（gyrA-Asp-Flu）と1塩基の
ギャップを置き5'側にLC Red 640を標識したプローブ
（gyrA-Asp-LC）をデザインした（図１及び図２参
照）。プローブgyrA-Asp-LCとプローブgyrA-Asp-Fluの
それぞれの理論上のTmは、68.2℃と90.8℃であった。両
プローブが増幅されたgyrA遺伝子（ターゲットDNA）に
ハイブリダイズした場合には、隣接するフルオレセイン
の蛍光がLC Red 640を励起し、LC Red 640から蛍光が発
せられる。この状態から徐々に温度を上昇し、Tmの温度
付近でプローブgyrA-Asp-FluがgyrA遺伝子（ターゲット
DNA）より遊離するとフルオレセインの蛍光がLC Red 64
0を励起しなくなり、LC Red 640からの蛍光が消失す
る。この時に、95番のアミノ酸のアスパラギン酸の変化
に関わるgyrA遺伝子の変異があるとプローブgyrA-Asp-F
luの遊離はより低温でおこり、蛍光が消失する。したが
って、LC Red 640からの蛍光の減少率が最も大きい温度
を観察することにより95番のアミノ酸のアスパラギン酸
の変化に関わるgyrA遺伝子の変異の有無を知ることがで
きる。
検出のためには、この領域をカバーする3'側にフルオレ
セインを標識したプローブ（gyrA-Asp-Flu）と1塩基の
ギャップを置き5'側にLC Red 640を標識したプローブ
（gyrA-Asp-LC）をデザインした（図１及び図２参
照）。プローブgyrA-Asp-LCとプローブgyrA-Asp-Fluの
それぞれの理論上のTmは、68.2℃と90.8℃であった。両
プローブが増幅されたgyrA遺伝子（ターゲットDNA）に
ハイブリダイズした場合には、隣接するフルオレセイン
の蛍光がLC Red 640を励起し、LC Red 640から蛍光が発
せられる。この状態から徐々に温度を上昇し、Tmの温度
付近でプローブgyrA-Asp-FluがgyrA遺伝子（ターゲット
DNA）より遊離するとフルオレセインの蛍光がLC Red 64
0を励起しなくなり、LC Red 640からの蛍光が消失す
る。この時に、95番のアミノ酸のアスパラギン酸の変化
に関わるgyrA遺伝子の変異があるとプローブgyrA-Asp-F
luの遊離はより低温でおこり、蛍光が消失する。したが
って、LC Red 640からの蛍光の減少率が最も大きい温度
を観察することにより95番のアミノ酸のアスパラギン酸
の変化に関わるgyrA遺伝子の変異の有無を知ることがで
きる。
【００３３】PCRの反応を行う際、Taqポリメラーゼ、反
応緩衝液、デオキシヌクレオチドと10 mM MgCl2を含む
市販の反応液であるLightCycler-DNA master hybridiza
tionprobes（ロッシュ・ダイアグノスティック株式会
社）2μlに、マグネシウムの最終濃度が4 mMになるよう
にMgCl2を加え、プライマーおよびプローブをそれぞれ
0.5 mM及び0.2 mM加えた。さらに、コントロールの淋菌
より抽出したDNAの溶解液、あるいは5分間熱湯に入れDN
Aを抽出した尿道分泌物試料を2μl加え、蒸留水にて最
終容量を20μlにした。この反応液をガラスキャピラリ
ー管に入れLightCyclerにセットした。LightCyclerによ
るPCRの条件は、1サイクル目には変性95℃、5分間、2サ
イクル目以降では5秒とし、アニーリングおよび伸長は
それぞれ1サイクル目より55℃、5秒、及び72℃、10秒と
した。変性、アニーリングおよび伸長を1サイクルとし
て46サイクル繰り返した。この過程が終了した後に、一
旦95℃に加熱し、直ちに40℃に冷却して5秒保ち、その
後、0.1℃/秒の速度で80℃まで再加熱を行った。
応緩衝液、デオキシヌクレオチドと10 mM MgCl2を含む
市販の反応液であるLightCycler-DNA master hybridiza
tionprobes（ロッシュ・ダイアグノスティック株式会
社）2μlに、マグネシウムの最終濃度が4 mMになるよう
にMgCl2を加え、プライマーおよびプローブをそれぞれ
0.5 mM及び0.2 mM加えた。さらに、コントロールの淋菌
より抽出したDNAの溶解液、あるいは5分間熱湯に入れDN
Aを抽出した尿道分泌物試料を2μl加え、蒸留水にて最
終容量を20μlにした。この反応液をガラスキャピラリ
ー管に入れLightCyclerにセットした。LightCyclerによ
るPCRの条件は、1サイクル目には変性95℃、5分間、2サ
イクル目以降では5秒とし、アニーリングおよび伸長は
それぞれ1サイクル目より55℃、5秒、及び72℃、10秒と
した。変性、アニーリングおよび伸長を1サイクルとし
て46サイクル繰り返した。この過程が終了した後に、一
旦95℃に加熱し、直ちに40℃に冷却して5秒保ち、その
後、0.1℃/秒の速度で80℃まで再加熱を行った。
【００３４】PCRによる増幅過程および40℃からの再加
熱による融解過程を通じてLC Red 640からの蛍光をモニ
ターし、LightCyclerに附属するソフトウェアーでDNAの
増幅曲線と融解曲線を描いた。増幅曲線はPCRのサイク
ル数をX軸としLC Red 640の蛍光強度をY軸として描い
た。融解曲線は、温度をX軸とし蛍光の減少率をY軸とし
て描いた。
熱による融解過程を通じてLC Red 640からの蛍光をモニ
ターし、LightCyclerに附属するソフトウェアーでDNAの
増幅曲線と融解曲線を描いた。増幅曲線はPCRのサイク
ル数をX軸としLC Red 640の蛍光強度をY軸として描い
た。融解曲線は、温度をX軸とし蛍光の減少率をY軸とし
て描いた。
【００３５】（５）LightCyclerによる淋菌gyrA遺伝子
の検出感度 コントロールの淋菌の菌株の1つから抽出したDNAを用い
てLightCyclerによる淋菌gyrA遺伝子の検出感度の検討
を行った。DNAを定量し、10 mg/lに調整し、10倍希釈を
繰り返し、1ｘ10-5 mg/lまでのDNAの希釈系列を作製し
た。このDNA希釈系列を用いて、上記と同様の条件にてL
ightCyclerによるPCRを行った。その時の反応液中に含
まれるDNA量は、10 mg/lが淋菌のゲノムの5ｘ106コピー
に、1ｘ10- 5 mg/lが5コピーに相当する量であった。
の検出感度 コントロールの淋菌の菌株の1つから抽出したDNAを用い
てLightCyclerによる淋菌gyrA遺伝子の検出感度の検討
を行った。DNAを定量し、10 mg/lに調整し、10倍希釈を
繰り返し、1ｘ10-5 mg/lまでのDNAの希釈系列を作製し
た。このDNA希釈系列を用いて、上記と同様の条件にてL
ightCyclerによるPCRを行った。その時の反応液中に含
まれるDNA量は、10 mg/lが淋菌のゲノムの5ｘ106コピー
に、1ｘ10- 5 mg/lが5コピーに相当する量であった。
【００３６】（結果）
（１）ニューキノロン剤感受性
36株の淋菌が尿道分泌物36検体から培養分離され、これ
らに対するCPFXのMICを測定した。MICは0.002μg/mlか
ら8μg/mlであった。MICが0.002μg/mlから0.015μg/ml
である感受性株が15株であり、0.06μg/mlから0.5μg/m
lである低感受性株が10株で、1μg/mlから8μg/mlであ
る耐性株が11株であった。
らに対するCPFXのMICを測定した。MICは0.002μg/mlか
ら8μg/mlであった。MICが0.002μg/mlから0.015μg/ml
である感受性株が15株であり、0.06μg/mlから0.5μg/m
lである低感受性株が10株で、1μg/mlから8μg/mlであ
る耐性株が11株であった。
【００３７】（２）LightCyclerによる淋菌gyrA遺伝子
検出の検出感度 コントロールの淋菌の1株から抽出したDNAの希釈系列を
用いた検討では、最小の濃度のDNA溶液を用いた場合に
も、LightCyclerにより淋菌gyrA遺伝子の増幅が可能で
あった。gyrA-Ser-LCとgyrA-Ser-Fluのプローブを用い
た場合にも、gyrA-Asp-FluとgyrA-Asp-LCのプローブを
用いた場合にも同様にgyrA遺伝子の増幅が確認された。
LightCyclerを用いた本法の淋菌の検出感度は、淋菌の
ゲノム5コピー、すなわち5菌体であることが示された。
図３はgyrA-Ser-LCとgyrA-Ser-Fluのプローブを用いた
場合の増幅曲線を示す。
検出の検出感度 コントロールの淋菌の1株から抽出したDNAの希釈系列を
用いた検討では、最小の濃度のDNA溶液を用いた場合に
も、LightCyclerにより淋菌gyrA遺伝子の増幅が可能で
あった。gyrA-Ser-LCとgyrA-Ser-Fluのプローブを用い
た場合にも、gyrA-Asp-FluとgyrA-Asp-LCのプローブを
用いた場合にも同様にgyrA遺伝子の増幅が確認された。
LightCyclerを用いた本法の淋菌の検出感度は、淋菌の
ゲノム5コピー、すなわち5菌体であることが示された。
図３はgyrA-Ser-LCとgyrA-Ser-Fluのプローブを用いた
場合の増幅曲線を示す。
【００３８】（３）コントロール55株を用いての淋菌gy
rA遺伝子の増幅と変異の検出 gyrA遺伝子の変異の明らかなコントロールの淋菌を用い
てLightCyclerによるgyrA遺伝子変異の検出を行った結
果の代表例を図４に示す。91番のアミノ酸のセリンの変
化に関わるgyrA遺伝子の変異がない菌株と変異のある菌
株をプローブgyrA-Ser-LCとプローブgyrA-Ser-Fluとを
用いて検討した時の代表的な融解曲線が図４のAに示さ
れる。変異がない菌株では、蛍光の減少率が最も大きい
のは、gyrA-Ser-LCのTmに等しい66.8℃であったが、変
異のある菌株では9℃低い57.8℃であり、融解曲線にて
明らかな温度の差を認めることができた。図４のBは、9
5番のアミノ酸のアスパラギン酸の変化に関わるgyrA遺
伝子の変異がない菌株と変異のある菌株をプローブgyrA
-Asp-LCとプローブgyrA-Asp-Fluとを用いて検討した時
の代表的な融解曲線を示す。変異がない菌株では、蛍光
の減少率が最も大きいのは、gyrA-Asp-FluのTmに等しい
68.2℃であったが、変異のある菌株では5.6℃低い62.6
℃であり、融解曲線にて明らかな温度の差を認めること
ができた。コントロール55株について91番のアミノ酸の
セリンと95番のアミノ酸のアスパラギン酸の変化に関わ
るgyrA遺伝子の変異をLightCyclerを用いて検討した
が、得られた変異の有無の結果は、以前に得られていた
塩基配列決定法により確認されていた変異の有無と完全
に一致した。
rA遺伝子の増幅と変異の検出 gyrA遺伝子の変異の明らかなコントロールの淋菌を用い
てLightCyclerによるgyrA遺伝子変異の検出を行った結
果の代表例を図４に示す。91番のアミノ酸のセリンの変
化に関わるgyrA遺伝子の変異がない菌株と変異のある菌
株をプローブgyrA-Ser-LCとプローブgyrA-Ser-Fluとを
用いて検討した時の代表的な融解曲線が図４のAに示さ
れる。変異がない菌株では、蛍光の減少率が最も大きい
のは、gyrA-Ser-LCのTmに等しい66.8℃であったが、変
異のある菌株では9℃低い57.8℃であり、融解曲線にて
明らかな温度の差を認めることができた。図４のBは、9
5番のアミノ酸のアスパラギン酸の変化に関わるgyrA遺
伝子の変異がない菌株と変異のある菌株をプローブgyrA
-Asp-LCとプローブgyrA-Asp-Fluとを用いて検討した時
の代表的な融解曲線を示す。変異がない菌株では、蛍光
の減少率が最も大きいのは、gyrA-Asp-FluのTmに等しい
68.2℃であったが、変異のある菌株では5.6℃低い62.6
℃であり、融解曲線にて明らかな温度の差を認めること
ができた。コントロール55株について91番のアミノ酸の
セリンと95番のアミノ酸のアスパラギン酸の変化に関わ
るgyrA遺伝子の変異をLightCyclerを用いて検討した
が、得られた変異の有無の結果は、以前に得られていた
塩基配列決定法により確認されていた変異の有無と完全
に一致した。
【００３９】（４）LightCyclerによる尿道分泌物36検
体からの淋菌の検出とgyrA遺伝子の変異の検出 5分間熱湯中に入れ、DNAの抽出を行った尿道分泌物試料
を用いて、LightCyclerによる淋菌gyrA遺伝子の増幅と
変異の検出を行った結果を図５に示す。図５は、プロー
ブgyrA-Ser-LCとプローブgyrA-Ser-Fluとを用いた時の
尿道分泌物36検体からの淋菌gyrA遺伝子の増幅曲線であ
る。全ての検体より淋菌gyrA遺伝子の増幅が確認され
た。すなわち、LightCyclerを用いた検出系により尿道
分泌物から直接に淋菌が検出された。プローブgyrA-Asp
-LCとプローブgyrA-Asp-Fluとを用いた場合にも、同様
に全ての検体より淋菌gyrA遺伝子が増幅され、すなわ
ち、淋菌が検出された（データ示さず）。gyrA遺伝子を
増幅後の融解温度解析の結果（融解曲線）を図６に示し
た。プローブgyrA-Ser-LCとプローブgyrA-Ser-Fluとを
用いて解析を行った場合には、57.8℃に蛍光の減少率が
最も大きい検体と66.8℃に蛍光の減少率が最も大きい検
体が観察された（図６のA）。57.8℃に蛍光の減少率が
最も大きい検体では、検体中の淋菌は91番のアミノ酸の
セリンの変化に関わるgyrA遺伝子の変異を有し、66.8℃
に蛍光の減少率が最も大きい検体では、91番のアミノ酸
のセリンの変化に関わるgyrA遺伝子の変異を有さないも
のと判定した。プローブgyrA-Asp-LCとプローブgyrA-As
p-Fluとを用いて検討した場合には、62.6℃に蛍光の減
少率が最も大きい検体と68.2℃に蛍光の減少率が最も大
きい検体が観察された（図６のB）。62.6℃に蛍光の減
少率が最も大きい検体では、検体中の淋菌は95番のアミ
ノ酸のアスパラギン酸の変化に関わるgyrA遺伝子の変異
を有し、68.2℃に蛍光の減少率が最も大きい検体では、
95番のアミノ酸のアスパラギン酸の変化に関わるgyrA遺
伝子の変異を有さないものと判定した。即ち、15株が91
番と95番のアミノ酸の変化に関わるgyrA遺伝子の変異を
有さず、10株が91番のみのアミノ酸の変化に関わるgyrA
遺伝子の変異を有し、11株が91番と95番の両方のアミノ
酸の変化に関わるgyrA遺伝子の変異を有するものと判断
した。以上のLightCyclerによる尿道分泌物からの淋菌
の検出とgyrA遺伝子の変異の解析は、熱湯中でのDNA抽
出、PCRによる増幅と融解曲線解析による変異を含め60
分以内に結果を得ることができた。
体からの淋菌の検出とgyrA遺伝子の変異の検出 5分間熱湯中に入れ、DNAの抽出を行った尿道分泌物試料
を用いて、LightCyclerによる淋菌gyrA遺伝子の増幅と
変異の検出を行った結果を図５に示す。図５は、プロー
ブgyrA-Ser-LCとプローブgyrA-Ser-Fluとを用いた時の
尿道分泌物36検体からの淋菌gyrA遺伝子の増幅曲線であ
る。全ての検体より淋菌gyrA遺伝子の増幅が確認され
た。すなわち、LightCyclerを用いた検出系により尿道
分泌物から直接に淋菌が検出された。プローブgyrA-Asp
-LCとプローブgyrA-Asp-Fluとを用いた場合にも、同様
に全ての検体より淋菌gyrA遺伝子が増幅され、すなわ
ち、淋菌が検出された（データ示さず）。gyrA遺伝子を
増幅後の融解温度解析の結果（融解曲線）を図６に示し
た。プローブgyrA-Ser-LCとプローブgyrA-Ser-Fluとを
用いて解析を行った場合には、57.8℃に蛍光の減少率が
最も大きい検体と66.8℃に蛍光の減少率が最も大きい検
体が観察された（図６のA）。57.8℃に蛍光の減少率が
最も大きい検体では、検体中の淋菌は91番のアミノ酸の
セリンの変化に関わるgyrA遺伝子の変異を有し、66.8℃
に蛍光の減少率が最も大きい検体では、91番のアミノ酸
のセリンの変化に関わるgyrA遺伝子の変異を有さないも
のと判定した。プローブgyrA-Asp-LCとプローブgyrA-As
p-Fluとを用いて検討した場合には、62.6℃に蛍光の減
少率が最も大きい検体と68.2℃に蛍光の減少率が最も大
きい検体が観察された（図６のB）。62.6℃に蛍光の減
少率が最も大きい検体では、検体中の淋菌は95番のアミ
ノ酸のアスパラギン酸の変化に関わるgyrA遺伝子の変異
を有し、68.2℃に蛍光の減少率が最も大きい検体では、
95番のアミノ酸のアスパラギン酸の変化に関わるgyrA遺
伝子の変異を有さないものと判定した。即ち、15株が91
番と95番のアミノ酸の変化に関わるgyrA遺伝子の変異を
有さず、10株が91番のみのアミノ酸の変化に関わるgyrA
遺伝子の変異を有し、11株が91番と95番の両方のアミノ
酸の変化に関わるgyrA遺伝子の変異を有するものと判断
した。以上のLightCyclerによる尿道分泌物からの淋菌
の検出とgyrA遺伝子の変異の解析は、熱湯中でのDNA抽
出、PCRによる増幅と融解曲線解析による変異を含め60
分以内に結果を得ることができた。
【００４０】（５）LightCyclerによる尿道分泌物36検
体から淋菌gyrA遺伝子の変異を検出した結果と、尿道分
泌物36検体から培養分離された淋菌36株に対するCPFXの
MICとの関連 91番と95番のアミノ酸の変化に関わるgyrA遺伝子の変異
を有さないと判定した15検体から培養分離された淋菌15
株に対するCPFXのMICは、0.002μg/mlから0.015μg/ml
であり（図７の左欄）、これら15株は感受性株であっ
た。91番のみのアミノ酸の変化に関わるgyrA遺伝子の変
異を有した10検体から培養分離された10株に対するCPFX
のMICは、0.06μg/mlから0.5μg/mlであり（図７の中央
欄）、これら10株は低感受性株であった。91番と95番の
両方のアミノ酸の変化に関わるgyrA遺伝子の変異を有す
る11検体から培養分離された11株に対するCPFXのMIC
は、1μg/mlから8μg/mlであり（図７の右欄）、これら
11株は耐性菌であった。以上より、LightCyclerによる
尿道分泌物からの淋菌gyrA遺伝子の変異の検出により、
淋菌のCPFXに対する感受性の判定が可能であることが判
明した。
体から淋菌gyrA遺伝子の変異を検出した結果と、尿道分
泌物36検体から培養分離された淋菌36株に対するCPFXの
MICとの関連 91番と95番のアミノ酸の変化に関わるgyrA遺伝子の変異
を有さないと判定した15検体から培養分離された淋菌15
株に対するCPFXのMICは、0.002μg/mlから0.015μg/ml
であり（図７の左欄）、これら15株は感受性株であっ
た。91番のみのアミノ酸の変化に関わるgyrA遺伝子の変
異を有した10検体から培養分離された10株に対するCPFX
のMICは、0.06μg/mlから0.5μg/mlであり（図７の中央
欄）、これら10株は低感受性株であった。91番と95番の
両方のアミノ酸の変化に関わるgyrA遺伝子の変異を有す
る11検体から培養分離された11株に対するCPFXのMIC
は、1μg/mlから8μg/mlであり（図７の右欄）、これら
11株は耐性菌であった。以上より、LightCyclerによる
尿道分泌物からの淋菌gyrA遺伝子の変異の検出により、
淋菌のCPFXに対する感受性の判定が可能であることが判
明した。
【００４１】以上の結果から、LightCyclerを利用した
遺伝子変異の検出方法は迅速で簡易な方法であり、いく
つかの利点を備えた有用な方法であることがわかった。
このLightCyclerを用いた方法は、尿道分泌物より直接
に淋菌を検出し、かつgyrA遺伝子の変異を同時に知るこ
との出来る全く新しい検出系である。この方法は、淋菌
のgyrA遺伝子に特異的なプライマーとプローブを用いて
いることより、特異性に優れ、かつ淋菌5菌体を検出で
きる高感度の検出法である。また、臨床検体より淋菌を
培養することなく、直接に淋菌のニューキノロン剤の感
受性に関わるgyrA遺伝子の変異の検出が可能であり、そ
の検出結果はニューキノロン剤に対する感受性を的確に
反映した。通常の淋菌感染症の診断法では、分泌物より
培養法により淋菌を分離しなければならず、同定および
感受性試験を行うためには最低3日を要する。これに対
して、上記のLightCyclerを用いた方法は、尿道分泌物
の処理を含め60分以内に淋菌の検出及びgyrA遺伝子の変
異を検出することが可能であり、極めて迅速な方法であ
る。また、従来のPCRを利用した検出系では、PCR後にPC
Rにより増幅されたDNAを取り扱う際のコンタミネーショ
ンにより疑陽性を引き起こすことなど、検出系の信頼性
や再現性が損なわれる危険があるが、リアルタイムPCR
を用いた上記の方法は、PCRにより増幅されるDNAをリア
ルタイムにモニターでき、さらにPCRを行った後の融解
曲線分析時にPCRで増幅されたDNAをガラスキャピラリー
管から取り出す必要が全く無く、そのままgyrA遺伝子の
変異についての解析が進められることから、コンタミネ
ーションの危険の無い信頼性の高い検出方法であると言
える。さらに、上記の方法は、PCR反応液を調整しLight
Cyclerにセットするだけで済み、手技は極めて簡単で特
別な訓練なしに信頼の置けるデータを得ることができ
る。
遺伝子変異の検出方法は迅速で簡易な方法であり、いく
つかの利点を備えた有用な方法であることがわかった。
このLightCyclerを用いた方法は、尿道分泌物より直接
に淋菌を検出し、かつgyrA遺伝子の変異を同時に知るこ
との出来る全く新しい検出系である。この方法は、淋菌
のgyrA遺伝子に特異的なプライマーとプローブを用いて
いることより、特異性に優れ、かつ淋菌5菌体を検出で
きる高感度の検出法である。また、臨床検体より淋菌を
培養することなく、直接に淋菌のニューキノロン剤の感
受性に関わるgyrA遺伝子の変異の検出が可能であり、そ
の検出結果はニューキノロン剤に対する感受性を的確に
反映した。通常の淋菌感染症の診断法では、分泌物より
培養法により淋菌を分離しなければならず、同定および
感受性試験を行うためには最低3日を要する。これに対
して、上記のLightCyclerを用いた方法は、尿道分泌物
の処理を含め60分以内に淋菌の検出及びgyrA遺伝子の変
異を検出することが可能であり、極めて迅速な方法であ
る。また、従来のPCRを利用した検出系では、PCR後にPC
Rにより増幅されたDNAを取り扱う際のコンタミネーショ
ンにより疑陽性を引き起こすことなど、検出系の信頼性
や再現性が損なわれる危険があるが、リアルタイムPCR
を用いた上記の方法は、PCRにより増幅されるDNAをリア
ルタイムにモニターでき、さらにPCRを行った後の融解
曲線分析時にPCRで増幅されたDNAをガラスキャピラリー
管から取り出す必要が全く無く、そのままgyrA遺伝子の
変異についての解析が進められることから、コンタミネ
ーションの危険の無い信頼性の高い検出方法であると言
える。さらに、上記の方法は、PCR反応液を調整しLight
Cyclerにセットするだけで済み、手技は極めて簡単で特
別な訓練なしに信頼の置けるデータを得ることができ
る。
【００４２】この発明は、上記発明の実施の形態及び実
施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の
範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲
で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の
範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲
で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【００４３】
【発明の効果】本発明の方法では、臨床検体からの淋菌
の検出とニューキノロン剤耐性の検索が同時に極めて短
時間で可能であり、初診時治療開始前に検査結果を知る
ことができる。すなわち、淋菌感染症を確認し、ニュー
キノロン剤に対する感受性を知ることができ、耐性淋菌
に対してニューキノロン剤の不適当な投与を避けること
が可能となり、より適正な抗菌化学療法を初診時から行
えることになる。本発明の臨床への応用は、淋菌感染症
の化学療法の適正化に大いに寄与するものと考えられ
る。
の検出とニューキノロン剤耐性の検索が同時に極めて短
時間で可能であり、初診時治療開始前に検査結果を知る
ことができる。すなわち、淋菌感染症を確認し、ニュー
キノロン剤に対する感受性を知ることができ、耐性淋菌
に対してニューキノロン剤の不適当な投与を避けること
が可能となり、より適正な抗菌化学療法を初診時から行
えることになる。本発明の臨床への応用は、淋菌感染症
の化学療法の適正化に大いに寄与するものと考えられ
る。
【００４４】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> NAGOYA INDUSTRIAL SCIENCE RESEARCH INSTITUTE
<120> A method for detecting Neisseria gonorrhoeae and for
evaluating fluoroquinolone resistance thereof.
<130> Quinolone GyrA
<140>
<141>
<160> 6
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
designed for amplifing a portion of gyrA gene of
N. gonorrhoeae
<400> 1
cgcgatgcac gagctgaaaa a 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
designed for amplifing a portion of gyrA gene of
N. gonorrhoeae
<400> 2
atttcggtat agcgcatggc tg 22
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial
Sequence:Oligonucleotides probe for detecting
mutation in codon Ser-91 of gyrA gene
<400> 3
gcatcgtcgg cgacgtcatc ggtaaatacc acccc 35
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial
Sequence:Oligonucleotides probe for detecting
mutation in codon Ser-91 of gyrA gene
<400> 4
acggcgattc cgcagtt 17
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial
Sequence:Oligonucleotides probe for detecting
mutation in codon Asp-95 of gyrA gene
<400> 5
gcagtttacg acaccatcgt c 21
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial
Sequence:Oligonucleotides probe for detecting
mutation in codon Asp-95 of gyrA gene
<400> 6
gtatggcgca aaatttcgct atgcgttatg tgctgataga cggac 45
【図１】図１は、淋菌gyrA遺伝子の一部のDNA配列を示
した図である。図中矢じりは91番アミノ酸をコードする
領域における変異部位、矢印は95番アミノ酸をコードす
る領域における変異部位をそれぞれ示す。符号１及び符
号２は、91番アミノ酸位置における多型を検出するため
の一対の核酸プローブがハイブリダイズする部分DNAを
表す。同様に、符号４及び符号５は、95番アミノ酸位置
における多型を検出するための一対の核酸プローブがハ
イブリダイズする部分DNAを表す。
した図である。図中矢じりは91番アミノ酸をコードする
領域における変異部位、矢印は95番アミノ酸をコードす
る領域における変異部位をそれぞれ示す。符号１及び符
号２は、91番アミノ酸位置における多型を検出するため
の一対の核酸プローブがハイブリダイズする部分DNAを
表す。同様に、符号４及び符号５は、95番アミノ酸位置
における多型を検出するための一対の核酸プローブがハ
イブリダイズする部分DNAを表す。
【図２】図２は、本発明の実施例において使用されるPC
Rプライマー及びプローブを示した表である。各オリゴ
ヌクレオチドの位置（Position）はGenBank accessionn
umber U08817に対応する。LC Red640及びLightCycler-R
ed640は、ともに吸収極大を622nmに、発光極大を638nm
に有する蛍光標識である。LC Red640で標識化されたプ
ローブの3'末端は、PCR反応中にプローブからの伸長を
防止すべくリン酸化されている。Fluは、フルオレセイ
ン（Fluorescein）を表す。
Rプライマー及びプローブを示した表である。各オリゴ
ヌクレオチドの位置（Position）はGenBank accessionn
umber U08817に対応する。LC Red640及びLightCycler-R
ed640は、ともに吸収極大を622nmに、発光極大を638nm
に有する蛍光標識である。LC Red640で標識化されたプ
ローブの3'末端は、PCR反応中にプローブからの伸長を
防止すべくリン酸化されている。Fluは、フルオレセイ
ン（Fluorescein）を表す。
【図３】図３は、本発明の実施例においてLightCycler
による淋菌gyrA遺伝子検出の検出感度を検討した結果で
ある。gyrA-Ser-LCとgyrA-Ser-Fluのプローブを用いた
場合の増幅曲線を示し、DNA量10ｘ10-6mg/lの試料を2μ
lを用いた場合まで淋菌gyrA遺伝子の増幅が認められ、
淋菌のゲノム5コピー、すなわち5菌体までの淋菌の検出
が可能であったことがわかる。グラフ中の７本の曲線
は、左から10 mg/l、10ｘ10-1 mg/l、10ｘ10-2 mg/l、1
0ｘ10-3mg/l、10ｘ10-4 mg/l、10ｘ10-5mg/lと10ｘ10-6
mg/lの試料を用いた場合の結果である。
による淋菌gyrA遺伝子検出の検出感度を検討した結果で
ある。gyrA-Ser-LCとgyrA-Ser-Fluのプローブを用いた
場合の増幅曲線を示し、DNA量10ｘ10-6mg/lの試料を2μ
lを用いた場合まで淋菌gyrA遺伝子の増幅が認められ、
淋菌のゲノム5コピー、すなわち5菌体までの淋菌の検出
が可能であったことがわかる。グラフ中の７本の曲線
は、左から10 mg/l、10ｘ10-1 mg/l、10ｘ10-2 mg/l、1
0ｘ10-3mg/l、10ｘ10-4 mg/l、10ｘ10-5mg/lと10ｘ10-6
mg/lの試料を用いた場合の結果である。
【図４】図４は、実施例において、コントロールの淋菌
を用いてLightCyclerによるgyrA遺伝子変異を検出した
結果である。91番のアミノ酸のセリンの変化に関わるgy
rA遺伝子の変異がない菌株と変異のある菌株をプローブ
gyrA-Ser-LCとプローブgyrA-Ser-Fluとを用いて検討し
た時の代表的な融解曲線が図４のAに示される。変異が
ない菌株では、蛍光の減少率が最も大きいのは、gyrA-S
er-LCのTmに等しい66.8℃であったが、変異のある菌株
では9℃低い57.8℃であり、融解曲線にて明らかな温度
の差を認めることができる。図４のBは、95番のアミノ
酸のアスパラギン酸の変化に関わるgyrA遺伝子の変異が
ない菌株と変異のある菌株をプローブgyrA-Asp-LCとプ
ローブgyrA-Asp-Fluとを用いて検討した時の代表的な融
解曲線を示す。変異がない菌株では、蛍光の減少率が最
も大きいのは、gyrA-Asp-FluのTmに等しい68.2℃であっ
たが、変異のある菌株では5.6℃低い62.6℃であり、融
解曲線にて明らかな温度の差を認めることができる。
を用いてLightCyclerによるgyrA遺伝子変異を検出した
結果である。91番のアミノ酸のセリンの変化に関わるgy
rA遺伝子の変異がない菌株と変異のある菌株をプローブ
gyrA-Ser-LCとプローブgyrA-Ser-Fluとを用いて検討し
た時の代表的な融解曲線が図４のAに示される。変異が
ない菌株では、蛍光の減少率が最も大きいのは、gyrA-S
er-LCのTmに等しい66.8℃であったが、変異のある菌株
では9℃低い57.8℃であり、融解曲線にて明らかな温度
の差を認めることができる。図４のBは、95番のアミノ
酸のアスパラギン酸の変化に関わるgyrA遺伝子の変異が
ない菌株と変異のある菌株をプローブgyrA-Asp-LCとプ
ローブgyrA-Asp-Fluとを用いて検討した時の代表的な融
解曲線を示す。変異がない菌株では、蛍光の減少率が最
も大きいのは、gyrA-Asp-FluのTmに等しい68.2℃であっ
たが、変異のある菌株では5.6℃低い62.6℃であり、融
解曲線にて明らかな温度の差を認めることができる。
【図５】図５は、実施例において、LightCyclerによる
尿道分泌物36検体からの淋菌の検出を検討した結果であ
る。プローブgyrA-Ser-LCとプローブgyrA-Ser-Fluとを
用いた時の尿道分泌物36検体からの淋菌gyrA遺伝子の増
幅曲線が示される。全ての検体より淋菌gyrA遺伝子の増
幅が確認できる。
尿道分泌物36検体からの淋菌の検出を検討した結果であ
る。プローブgyrA-Ser-LCとプローブgyrA-Ser-Fluとを
用いた時の尿道分泌物36検体からの淋菌gyrA遺伝子の増
幅曲線が示される。全ての検体より淋菌gyrA遺伝子の増
幅が確認できる。
【図６】図６は、実施例において、LightCyclerによる
尿道分泌物からの淋菌gyrA遺伝子の変異の検出を検討し
た結果である。プローブgyrA-Ser-LCとプローブgyrA-Se
r-Fluとを用いて場合の融解曲線では、57.8℃に蛍光の
減少率が最も大きい検体と66.8℃に蛍光の減少率が最も
大きい検体が観察される（図６のA）。57.8℃に蛍光の
減少率が最も大きい尿道分泌物では、検体中の淋菌は91
番のアミノ酸のセリンの変化に関わるgyrA遺伝子の変異
を有し、66.8℃に蛍光の減少率が最も大きい尿道分泌物
では、91番のアミノ酸のセリンの変化に関わるgyrA遺伝
子の変異を有さないものと判定した。プローブgyrA-Asp
-LCとプローブgyrA-Asp-Fluとを用いて検討した場合に
は、62.6℃に蛍光の減少率が最も大きい検体と68.2℃に
蛍光の減少率が最も大きい検体が観察された（図６の
B）。62.6℃に蛍光の減少率が最も大きい検体では、検
体中の淋菌は95番のアミノ酸のアスパラギン酸の変化に
関わるgyrA遺伝子の変異を有し、68.2℃に蛍光の減少率
が最も大きい検体では、95番のアミノ酸のアスパラギン
酸の変化に関わるgyrA遺伝子の変異を有さないものと判
定した。
尿道分泌物からの淋菌gyrA遺伝子の変異の検出を検討し
た結果である。プローブgyrA-Ser-LCとプローブgyrA-Se
r-Fluとを用いて場合の融解曲線では、57.8℃に蛍光の
減少率が最も大きい検体と66.8℃に蛍光の減少率が最も
大きい検体が観察される（図６のA）。57.8℃に蛍光の
減少率が最も大きい尿道分泌物では、検体中の淋菌は91
番のアミノ酸のセリンの変化に関わるgyrA遺伝子の変異
を有し、66.8℃に蛍光の減少率が最も大きい尿道分泌物
では、91番のアミノ酸のセリンの変化に関わるgyrA遺伝
子の変異を有さないものと判定した。プローブgyrA-Asp
-LCとプローブgyrA-Asp-Fluとを用いて検討した場合に
は、62.6℃に蛍光の減少率が最も大きい検体と68.2℃に
蛍光の減少率が最も大きい検体が観察された（図６の
B）。62.6℃に蛍光の減少率が最も大きい検体では、検
体中の淋菌は95番のアミノ酸のアスパラギン酸の変化に
関わるgyrA遺伝子の変異を有し、68.2℃に蛍光の減少率
が最も大きい検体では、95番のアミノ酸のアスパラギン
酸の変化に関わるgyrA遺伝子の変異を有さないものと判
定した。
【図７】図７は、LightCyclerによる尿道分泌物からの
淋菌gyrA遺伝子の変異の検出結果と尿道分泌物から培養
分離された淋菌に対するCPFXのMICとの関連が示され
る。91番と95番のアミノ酸の変化に関わるgyrA遺伝子の
変異を有さないと判定した15検体から培養分離された淋
菌15株に対するCPFXのMICは、0.002μg/mlから0.015μg
/mlであり（左欄）、これら15株は感受性株であった。9
1番のみのアミノ酸の変化に関わるgyrA遺伝子の変異を
有した10検体から培養分離された10株に対するCPFXのMI
Cは、0.06μg/mlから0.5μg/mlであり（中央欄）、これ
ら10株は低感受性株であった。91番と95番の両方のアミ
ノ酸の変化に関わるgyrA遺伝子の変異を有する11検体か
ら培養分離された11株に対するCPFXのMICは、1μg/mlか
ら8μg/mlであり（右欄）、これら11株は耐性菌であっ
た。LightCyclerによる尿道分泌物からの淋菌gyrA遺伝
子の変異の検出により、淋菌のCPFXに対する感受性の判
定が可能であった。
淋菌gyrA遺伝子の変異の検出結果と尿道分泌物から培養
分離された淋菌に対するCPFXのMICとの関連が示され
る。91番と95番のアミノ酸の変化に関わるgyrA遺伝子の
変異を有さないと判定した15検体から培養分離された淋
菌15株に対するCPFXのMICは、0.002μg/mlから0.015μg
/mlであり（左欄）、これら15株は感受性株であった。9
1番のみのアミノ酸の変化に関わるgyrA遺伝子の変異を
有した10検体から培養分離された10株に対するCPFXのMI
Cは、0.06μg/mlから0.5μg/mlであり（中央欄）、これ
ら10株は低感受性株であった。91番と95番の両方のアミ
ノ酸の変化に関わるgyrA遺伝子の変異を有する11検体か
ら培養分離された11株に対するCPFXのMICは、1μg/mlか
ら8μg/mlであり（右欄）、これら11株は耐性菌であっ
た。LightCyclerによる尿道分泌物からの淋菌gyrA遺伝
子の変異の検出により、淋菌のCPFXに対する感受性の判
定が可能であった。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ
Ｇ０１Ｎ 21/64 33/566
33/53 33/573 Ｚ
33/566 33/58 Ａ
33/573 Ｃ１２Ｒ 1:01
33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
//(Ｃ１２Ｑ 1/04 Ａ
Ｃ１２Ｒ 1:01）
Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 BA17 DA02 DA08
EA01 GA25 GB07 GB21 KA02
KA05 MA16
2G045 AA25 AA28 CB21 DA12 DA13
DA14 FB02 FB07 FB12
4B024 AA01 AA11 CA01 CA11 HA14
4B063 QA01 QA13 QA18 QA19 QQ06
QQ44 QR32 QR56 QR62 QS22
QS25 QS34 QS36 QX02
Claims (13)
- 【請求項１】 淋菌の検出及びニューキノロン剤感受性
評価を行う方法であって、以下のステップを含む： (a) 淋菌gyrA遺伝子において91番アミノ酸をコードす
る領域を含むターゲットDNAを特異的に増幅させるステ
ップ； (b) 前記ターゲットDNAと、該ターゲットDNAの前記領
域を含む部分に特異的にハイブリダイズ可能な核酸プロ
ーブとの融解温度を解析するステップ。 - 【請求項２】 前記ステップ(a)がリアルタイムPCR法に
より行われる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 請求項１又は２に記載の方法であって、
前記ステップ(b)が以下のステップを含む： (b1) 前記ターゲットDNAに１〜５塩基のギャップを挟
んで特異的にハイブリダイズ可能であり、片方が前記領
域をカバーし且つ他方より融解温度が高いように設計さ
れた一対の核酸プローブであって、 前記ターゲットDNAにハイブリダイズしたときに前記ギ
ャップ側に位置する末端に、第１蛍光物質が結合した第
１核酸プローブ、及び前記ターゲットDNAにハイブリダ
イズしたときに前記ギャップ側に位置する末端に、前記
第１蛍光物質の蛍光により励起して蛍光を発する第２蛍
光物質が結合した第２核酸プローブ、からなる一対の核
酸プローブを検体に添加するステップ； (b2) 前記第１核酸プローブ及び前記第２核酸プローブ
が前記ターゲットDNAにハイブリダイズする温度まで降
温させるステップ； (b3) 連続的又は段階的に昇温させるとともに、前記第
１蛍光物質の励起波長の光を検体に照射し、前記第２蛍
光物質から発せられる蛍光量を測定するステップ。 - 【請求項４】 請求項３に記載の方法であって、以下の
ステップをさらに含む： (b4) ステップ(b3)の後に、前記蛍光量の減少率が最大
となる温度を求め、該温度よりgyrA遺伝子において91番
アミノ酸をコードする領域の配列を決定するステップ。 - 【請求項５】 淋菌の検出及びニューキノロン剤感受性
評価を行う方法であって、以下のステップを含む： (c) 淋菌gyrA遺伝子において91番アミノ酸をコードす
る領域を含むターゲットDNAを特異的に増幅可能なPCRプ
ライマーを検体に添加するステップ、 (d) 前記ターゲットDNAに１〜５塩基のギャップを挟ん
で特異的にハイブリダイズ可能であり、片方が前記領域
をカバーし且つ他方より融解温度が高いように設計され
た一対の核酸プローブであって、 前記ターゲットDNAにハイブリダイズしたときに前記ギ
ャップ側に位置する末端に、第１蛍光物質が結合した第
１核酸プローブ、及び 前記ターゲットDNAにハイブリダイズしたときに前記ギ
ャップ側に位置する末端に、前記第１蛍光物質の蛍光に
より励起して蛍光を発する第２蛍光物質が結合した第２
核酸プローブ、からなる一対の核酸プローブを検体に添
加するステップ； (e) リアルタイムPCR法を実行するステップ； (f) 前記第１核酸プローブ及び前記第２核酸プローブ
が前記ターゲットDNAにハイブリダイズする温度まで降
温させるステップ； (g) 連続的又は段階的に昇温させるとともに、前記第
１蛍光物質の励起波長の光を検体に照射し、前記第２蛍
光物質から発せられる蛍光量を測定するステップ； (h) 前記蛍光量の減少率が最大となる温度を求め、該
温度よりgyrA遺伝子において91番アミノ酸をコードする
領域の配列を決定するステップ。 - 【請求項６】 淋菌の検出及びニューキノロン剤感受性
評価を行う方法であって、以下のステップを含む： (A) 淋菌gyrA遺伝子において95番アミノ酸をコードす
る領域を含むターゲットDNAを特異的に増幅させるステ
ップ； (B) 前記ターゲットDNAと、該ターゲットDNAの前記領
域を含む部分に特異的にハイブリダイズ可能な核酸プロ
ーブとの融解温度を解析するステップ。 - 【請求項７】 前記ステップ(A)がリアルタイムPCR法に
より行われる、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 請求項６又は７に記載の方法であって、
前記ステップ(B)が以下のステップを含む： (B1) 前記ターゲットDNAに１〜５塩基のギャップを挟
んで特異的にハイブリダイズ可能であり、片方が前記領
域をカバーし且つ他方より融解温度が高いように設計さ
れた一対の核酸プローブであって、 前記ターゲットDNAにハイブリダイズしたときに前記ギ
ャップ側に位置する末端に、第１蛍光物質が結合した第
１核酸プローブ、及び 前記ターゲットDNAにハイブリダイズしたときに前記ギ
ャップ側に位置する末端に、前記第１蛍光物質の蛍光に
より励起して蛍光を発する第２蛍光物質が結合した第２
核酸プローブ、からなる一対の核酸プローブを検体に添
加するステップ； (B2) 前記第１核酸プローブ及び前記第２核酸プローブ
が前記ターゲットDNAにハイブリダイズする温度まで降
温させるステップ； (B3) 連続的又は段階的に昇温させるとともに、前記第
１蛍光物質の励起波長の光を検体に照射し、前記第２蛍
光物質から発せられる蛍光量を測定するステップ。 - 【請求項９】 請求項８に記載の方法であって、以下の
ステップをさらに含む： (B4) 前記ステップ(B3)の後に、前記蛍光量の減少率が
最大となる温度を求め、該温度よりgyrA遺伝子において
95番アミノ酸をコードする領域の配列を決定するステッ
プ。 - 【請求項１０】 淋菌の検出及びニューキノロン剤感受
性評価を行う方法であって、以下のステップを含む： (C) 淋菌gyrA遺伝子において95番アミノ酸をコードす
る領域を含むターゲットDNAを特異的に増幅可能なPCRプ
ライマーを検体に添加するステップ、 (D) 前記ターゲットDNAに１〜５塩基のギャップを挟ん
で特異的にハイブリダイズ可能であり、片方が前記領域
をカバーし且つ他方より融解温度が高いように設計され
た一対の核酸プローブであって、 前記ターゲットDNAにハイブリダイズしたときに前記ギ
ャップ側に位置する末端に、第１蛍光物質が結合した第
１核酸プローブ、及び前記ターゲットDNAにハイブリダ
イズしたときに前記ギャップ側に位置する末端に、前記
第１蛍光物質の蛍光により励起して蛍光を発する第２蛍
光物質が結合した第２核酸プローブ、からなる一対の核
酸プローブを検体に添加するステップ； (E) リアルタイムPCR法を実行するステップ； (F) 前記第１核酸プローブ及び前記第２核酸プローブ
が前記ターゲットDNAにハイブリダイズする温度まで降
温させるステップ； (G) 連続的又は段階的に昇温させるとともに、前記第
１蛍光物質の励起波長の光を検体に照射し、前記第２蛍
光物質から発せられる蛍光量を測定するステップ； (H) 前記蛍光量の減少率が最大となる温度を求め、該
温度よりgyrA遺伝子において95番アミノ酸をコードする
領域の配列を決定するステップ。 - 【請求項１１】 淋菌の検出及びニューキノロン剤感受
性の評価を行う方法であって、以下のステップを含む： (x) 淋菌gyrA遺伝子において91番アミノ酸をコードす
る第１領域及び95番アミノ酸をコードする第２領域を含
むターゲットDNAを特異的に増幅させるステップ； (y) 前記ターゲットDNAと、該ターゲットDNAの前記第
１領域を含む部分に特異的にハイブリダイズ可能な核酸
プローブとの融解温度を解析するステップ； (z) 前記ターゲットDNAと、該ターゲットDNAの前記第
２領域を含む部分に特異的にハイブリダイズ可能な核酸
プローブとの融解温度を解析するステップ。 - 【請求項１２】 淋菌gyrA遺伝子において91番アミノ酸
をコードする領域を含むターゲットDNAを特異的に増幅
可能な一対のプライマーと、 前記ターゲットDNAに１〜５塩基のギャップを挟んで特
異的にハイブリダイズ可能であり、片方が前記領域をカ
バーし、かつ他方より融解温度が高いように設計された
一対の核酸プローブであって、前記ターゲットDNAにハ
イブリダイズしたときに前記ギャップ側に位置する末端
に、第１蛍光物質が結合した第１核酸プローブ、及び前
記ターゲットDNAにハイブリダイズしたときに前記ギャ
ップ側に位置する末端に、前記第１蛍光物質の蛍光によ
り励起して蛍光を発する第２蛍光物質が結合した第２核
酸プローブ、からなる一対の核酸プローブと、を含む淋
菌の検出及びニューキノロン剤感受性評価用キット。 - 【請求項１３】 淋菌gyrA遺伝子において95番アミノ酸
をコードする領域を含むターゲットDNAを特異的に増幅
可能な一対のプライマーと、 前記ターゲットDNAに１〜５塩基のギャップを挟んで特
異的にハイブリダイズ可能であり、片方が前記領域をカ
バーし、かつ他方より融解温度が高いように設計された
一対の核酸プローブであって、前記ターゲットDNAにハ
イブリダイズしたときに前記ギャップ側に位置する末端
に、第１蛍光物質が結合した第１核酸プローブ、及び前
記ターゲットDNAにハイブリダイズしたときに前記ギャ
ップ側に位置する末端に、前記第１蛍光物質の蛍光によ
り励起して蛍光を発する第２蛍光物質が結合した第２核
酸プローブ、からなる一対の核酸プローブと、を含む淋
菌の検出及びニューキノロン剤感受性評価用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001242334A JP2003052391A (ja) | 2001-08-09 | 2001-08-09 | 淋菌の検出及びニューキノロン剤感受性評価を行う方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001242334A JP2003052391A (ja) | 2001-08-09 | 2001-08-09 | 淋菌の検出及びニューキノロン剤感受性評価を行う方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003052391A true JP2003052391A (ja) | 2003-02-25 |
Family
ID=19072620
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001242334A Pending JP2003052391A (ja) | 2001-08-09 | 2001-08-09 | 淋菌の検出及びニューキノロン剤感受性評価を行う方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003052391A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009542207A (ja) * | 2006-06-30 | 2009-12-03 | キヤノン ユー．エス． ライフ サイエンシズ， インコーポレイテッド | Ｄｎａ分子の増幅および解離挙動を監視するシステムおよび方法 |
| JP2021048812A (ja) * | 2019-09-26 | 2021-04-01 | 学校法人 埼玉医科大学 | 淋菌のｄｎａジャイレースのサブユニットａの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのプライマーセット、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのプライマーセット、及びそれらの使用 |
-
2001
- 2001-08-09 JP JP2001242334A patent/JP2003052391A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009542207A (ja) * | 2006-06-30 | 2009-12-03 | キヤノン ユー．エス． ライフ サイエンシズ， インコーポレイテッド | Ｄｎａ分子の増幅および解離挙動を監視するシステムおよび方法 |
| US9573132B2 (en) | 2006-06-30 | 2017-02-21 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | System and methods for monitoring the amplification and dissociation behavior of DNA molecules |
| JP2021048812A (ja) * | 2019-09-26 | 2021-04-01 | 学校法人 埼玉医科大学 | 淋菌のｄｎａジャイレースのサブユニットａの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのプライマーセット、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのプライマーセット、及びそれらの使用 |
| JP7387357B2 (ja) | 2019-09-26 | 2023-11-28 | 直 早川 | 淋菌のｄｎａジャイレースのサブユニットａの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのプライマーセット、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのプライマーセット、及びそれらの使用 |
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