JP2003047483A - インターロイキン−６スプライス変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 ヒトＩＬ−６ＳＶポリペプチド、該ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド、及び組み換え法に
よる該ポリペプチドの製造方法、および該ポリペプチド
を治療的に使用する方法、さらに、ＩＬ−６ＳＶ核酸配
列の突然変異および宿主から誘導した試料中の該ポリペ
プチドのレベルを検出する方法を提供する。 【解決手段】 (a)特定の配列のポリペプチド、該ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び組み換え
法による該ポリペプチドの製造方法、および該ポリペプ
チドを治療的に使用する方法、さらに、ＩＬ−６ＳＶ核
酸配列の突然変異および宿主から誘導した試料中の該ポ
リペプチドのレベルを検出する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規に同定された
ポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによっ
てコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオ
チド及びポリペプチドの使用、並びにそのようなポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの製造に関するものであ
る。より具体的には、本発明のポリペプチドは、推定
上、インターロイキン−６ スプライス変異体（ＩＬ−
６ＳＶ）として同定された。本発明はまた、そのような
ポリペプチドの作用を阻害することに関する。

【０００２】

【従来の技術】インターロイキン−６は、種々の異なっ
た細胞種により、産生され、分泌される多機能なサイト
カインである。このサイトカインは、免疫応答、急性期
応答及び造血を含む、細胞防御メカニズムにおける中心
的な役割を果している。インターロイキン−６（ＩＬ−
６）は、２０から２６ｋＤａのリン糖タンパク質であ
り、既にクローンされている［Mayら，プロシーディン
グ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンセス・Ｕ
ＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．USA），８３巻，８９５
７頁，（１９８６年）；Zilbersteinら，ＥＭＢＯ ジャ
ーナル（ＥＭＢＯＪ.），５巻，２５２９頁，（１９８
６年）；Hiranoら，ネイチャー（ロンドン）（Nature
（London）），２３４−７３,（１９８６年）］。ＩＬ
−６は、以前は、Ｂ細胞刺激因子２（ＢＳＦ−２）、イ
ンターフェロン−ベータ２（ＩＮＦ−β２）および肝細
胞刺激因子と呼ばれていた。ＩＬ−６は、肝臓、脾臓、
および骨髄を含む多くの組織、並びに単球、線維芽細
胞、内皮細胞、Ｂ−細胞およびＴ−細胞を含む様々な細
胞種によって分泌される。

【０００３】ＩＬ−６は、ウイルス、２本鎖ＲＮＡ、細
菌および細菌性リポ多糖、並びにＩＬ−１及びＴＮＦ等
の炎症性サイトカインを含む様々なシグナルによって転
写レベルで活性化される。このタンパク質は、多くの細
胞種において作用する多機能な成長因子である。ＩＬ−
６は、肝細胞培養において、一組の急性期タンパク質を
転写において活性化する。不死化されたＢリンパ球をＩ
Ｌ−６で処理する場合、ＩＬ−６は成長因子として作用
し、免疫グロブリンの産生を刺激する。ＩＬ−６はま
た、Ｔ細胞補助シグナルとしても作用し、細胞毒性のＴ
細胞を誘発する。

【０００４】細胞分化を誘導するその能力に基づいて、
ＩＬ−６は、幾つかの白血病／リンパ腫細胞系、神経細
胞および繊維芽細胞における成長を阻害することが示さ
れてきた［Chenら，プロシーディング・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンセス・ＵＳＡ（Proc．Natl．
Acad．Sci．USA），８５巻，８０３７頁，（１９８８
年）］。Ｂ細胞新生細胞は、その病気の攻撃性に関係す
るＢ細胞の様々な成熟状態によって特徴づけられる疾患
の異種の群である。慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は増
殖によって特徴付けられ、Ｂ−リンパ性白血病（ＢＬ
Ｌ）の蓄積は、形態学的に成熟しているようにみえるが
生物学的には未成熟なＢリンパ球の増殖と蓄積によって
特徴付けられる。この病気は、西洋諸国の白血病の約３
０％を占める。この病気は、免疫グロブリンを産生でき
ない生物学的に未成熟のリンパ球の増殖によって特徴付
けられ、リンパ節の肥大を招く。ＩＬ−６は、ＣＬＬ患
者由来の白血病Ｂ細胞の成長を促進するであろうと予想
されるのだが、ＩＬ−６は、この細胞の増殖を阻害す
る。

【０００５】さらにＩＬ−６は、ＩＬ−３と相乗的に作
用して、多効力の造血母細胞のＩＬ−３依存コロニー形
成とマクロファージ／好中球骨髄コロニーの分化の両方
を増大させる。

【０００６】ＩＬ−６は、細菌ＬＰＳ、重篤な火傷及び
敗血症を含む多くの傷害に対するインビボの重要な媒介
体である。腫瘍を有する動物において、循環性ＩＬ−６
のレベルが増加することが見いだされた。さらに、ＴＮ
ＦまたはＩＬ−２で処置されたがん患者において、ＩＬ
−６のレベルが増加することが示された。

【０００７】ＰＣＴ出願ＷＯ８８／００２０６号は、組
み換えＤＮＡ技術により産生されるＩＬ−６を開示して
いる。このＩＬ−６ペプチドは、がん患者における造血
細胞及び他の造血との組み合わせの欠損によって特徴付
けられる疾患の治療に有用である。

【０００８】カナダ特許第２０８０５０４号は、ＣＬＬ
またはＢ−細胞リンパ腫の治療のための医薬組成物の製
造におけるＩＬ−６の使用に関するものである。

【０００９】ＰＣＴ出願ＷＯ９３／０１２１２号は、組
み換えＤＮＡ技術によって製造されるＩＬ−６のムテイ
ンおよび先端が切り取られた（トランケートされた）Ｉ
Ｌ−６を開示している。そのムテインにおいては、成
熟、天然ＩＬ−６の４５および５１番の位置、又はそれ
らに対応する位置にあるシステイン残基が、他のアミノ
酸によって置換されている。７４及び８４番の位置、又
はそれらに対応する位置にあるシステイン残基は保持さ
れる。この分子は、少なくとも天然ＩＬ−６の活性に匹
敵する生物学的活性を有する。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、少なくとも
天然ＩＬ−６に匹敵する生物学的活性を有するＩＬ−６
のスプライス変異体に関するものである。

【００１１】本発明のひとつの態様によれば、新規の成
熟ポリペプチドが提供され、並びに生物学的に活性で診
断的または治療に有用なそのフラグメント、アナログお
よび誘導体が提供される。本発明のポリペプチドは、ヒ
ト由来のものである。

【００１２】本発明の別の態様によれば、ｍＲＮＡ、Ｄ
ＮＡ、ｃＤＮＡ、染色体ＤＮＡを含む単離された核酸分
子、並びにそれらのアナログおよび生物学的に活性で診
断的または治療に有用なフラグメントが提供される。

【００１３】本発明のさらなる態様によれば、組み換え
技術によるこのようなポリペプチドを製造するための方
法が提供され、その方法は、本発明のポリペプチドをコ
ードする核酸配列を含む。組み換え原核生物及び／又は
または真核生物宿主細胞を該タンパク質の発現を促進す
る条件下で、培養し、その後、該タンパク質を回収をす
ることを含んでなる。

【００１４】本発明のさらなる態様によれば、このよう
なポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを治療目的に利用するための方
法が提供される。例えば、がんの治療、免疫不全疾患の
治療、血小板の減少状態、ショック症候群を治療するた
め、抗ウイルス薬として、白血病細胞の増殖を阻害する
ため、がん細胞を殺すためのヒトリンパ球の毒性を改善
するため、細胞移植治療に使用するため、及び炎症に利
用するための方法である。

【００１５】本発明のさらなる態様によれば、核酸配列
に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの核酸分
子を含んでなる核酸プローブも提供される。

【００１６】本発明のさらなる態様によれば、このよう
なポリペプチドに対する抗体が提供される。

【００１７】本発明のさらなる態様によれば、このよう
なポリペプチドに対するアンタゴニストが提供される。
このアンタゴニストは、このようなポリペプチドの作用
を阻害するために使用し得る。例えば、自己免疫性、免
疫炎症性、多発性骨髄腫及びカポジ肉腫を含む腫瘍性の
及び感染性疾患の治療おいて使用し得る。

【００１８】本発明のさらなる別の態様によれば、この
ようなポリペプチドをコードする核酸配列の変異に関係
する疾患を検出するため、およびポリペプチドのレベル
の変化を検出するための診断的分析を提供する。

【００１９】本発明のさらなる態様によれば、このよう
なレセプターポリペプチド、またはこのようなポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドを、科学的な研究、
ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関わるイン
ビトロの目的のために利用するための方法が提供され
る。

【００２０】本発明のこれらまたはその他の態様は、以
下に記載する技術から当業者には明らかとなろう。

【００２１】以下の図面は、本発明の態様の説明であっ
て、請求の範囲が包含する本発明の範囲の限定を意味す
るものではない。

【００２２】

【課題を解決するための手段】本発明の態様によれば、
図１および２に示した推定アミノ酸配列（配列番号２）
を有する成熟ポリペプチドまたはＡＴＣＣ受託番号７５
６９７として１９９４年３月４日に寄託されたクローン
のｃＤＮＡによってコードされた成熟ポリペプチドをコ
ードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供さ
れる。

【００２３】本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドは、活性化されたマクロファージから得られ
たｃＤＮＡライブラリーにおいて発見されたものであ
る。このポリヌクレオチドは、ＩＬ−６と構造的に関連
している。このポリヌクレオチドは、１６７アミノ酸残
基のタンパク質をコードする読み取りフレーム（open r
eading frame）を含んでいる。ＩＬ−６ＳＶポリペプチ
ドの最初の８０ヌクレオチド（図示していない）は、解
裂して成熟ポリペプチドを形成するシグナルペプチドを
表すアミノ酸をコードする。

【００２４】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡまた
はＤＮＡの形で存在し得る。このＤＮＡには、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。この
ＤＮＡは２本鎖でも１本鎖でもよく、１本鎖の場合は、
コード鎖でも非コード（アンチセンス）鎖でもよい。成
熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１および
２に示したコード配列（配列番号１）と同一、または寄
託されたクローンのコード配列と同一でもよく、または
そのコード配列が、遺伝コードの重複又は縮重の結果、
図１および２のＤＮＡ（配列番号１）または寄託された
ｃＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードするコード配
列と異なっていてもよい。

【００２５】図１および２の成熟ポリペプチド（配列番
号２）または寄託されたｃＤＮＡによってコードされる
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、次のも
のを包含し得るが、これに限られない：成熟ポリペプチ
ドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列と
リーダー若しくは分泌配列又はプロタンパク配列等の付
加コード配列；成熟ポリペプチド（および、場合により
付加コード配列）のコード配列、並びにイントロン又は
成熟ポリペプチドのコード配列の５'及び／又は３'の非
コード配列。

【００２６】「ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド」なる語は、ポリペプチドのコード配列のみを含む
ポリヌクレオチド、並びに付加的なコード配列及び／又
は非コード配列を含むポリヌクレオチドを意味する。

【００２７】本発明はさらに、図１および２の推定アミ
ノ酸配列（配列番号２）を有するポリペプチドまたは寄
託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされるポリ
ペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコー
ドする、前記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポ
リヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの自然に
生じるアレル変異体でも、ポリヌクレオチドの自然に生
じない変異体でもよい。

【００２８】したがって、本発明は、図１および２に示
したのと同一の成熟ポリペプチド（配列番号２）又は寄
託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされる同一
の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並
びに、このようなポリペプチドの変異体を包含し、該変
異体は、図１および２のポリペプチド（配列番号２）又
は寄託されたクローンのｃＤＮＡによりコードされるポ
リペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコ
ードする。このようなヌクレオチド変異体には欠失変異
体、置換変異体および付加変異体または挿入変異体が含
まれる。

【００２９】上記で示したようにポリヌクレオチドは、
図１および２に示したコード配列（配列番号１）の、又
は寄託されたクローンのコード配列の、自然に生じるア
レル変異体であるコード配列を有していてもよい。当技
術分野では公知であるようにアレル変異体は、１または
それ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し
得るポリヌクレオチド配列の別の形である。このアレル
変異体は、コードされるポリペプチドの機能を実質的に
変化させるものではない。

【００３０】本発明はまた、同一の読み取りフレーム内
で、成熟ポリペプチドのコード配列が、宿主細胞からの
ポリペプチドの発現及び分泌を助けるポリヌクレオチド
配列、例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御す
るための分泌配列として機能するリーダー配列に融合さ
れていることもあるポリヌクレオチドを包含する。リー
ダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であ
り、ポリペプチドの成熟体を形成するために宿主細胞に
よって解裂されるリーダー配列を有していてもよい。ポ
リペプチドはまた、成熟タンパク質 ＋ 付加５'アミノ
酸残基であるプロタンパク質をコードしてもよい。プロ
配列を有する成熟タンパク質は、プロタンパク質であっ
て、タンパク質の不活性型である。プロ配列が解裂すれ
ば活性な成熟タンパク質が生成する。

【００３１】したがって、例えば、本発明のポリヌクレ
オチドは、成熟タンパク質、プロ配列を有するタンパク
質又はプロ配列とプレ配列（リーダー配列）の両方を有
するタンパク質をコードし得る。

【００３２】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列のフレ
ームに（in frame）融合したコード配列を有してもよ
い。マーカー配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに
融合した成熟ポリペプチドの精製が行われるためにｐＱ
Ｅ−９ベクターにより提供されるヘキサヒスチジンタグ
（tag）であることもあり、あるいは、例えばＣＯＳ−
７細胞等の哺乳類の宿主を使用する場合には、赤血球凝
集素（ＨＡ）タグでもよい。ＨＡタグは、インフルエン
ザ赤血球凝集素タンパク（Wilson,Ｉら，Cell，37，767
頁，（1984年））から得られるエピトープに相当する。

【００３３】本発明はさらに、配列の間に少なくとも７
０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少
なくとも９５％の同一性があれば、上記の配列とハイブ
リダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特
に、緊縮（ストリジェント）条件下で上記のポリヌクレ
オチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書に使用される「緊縮条件」なる語は、配列
の間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％
の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイーションが起
こり得ることを意味する。好ましい態様における、上記
のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオ
チドは、図１および２のｃＤＮＡ（配列番号１）又は寄
託されたｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチ
ドと実質的に同じ生物学的機能又は活性を保持するポリ
ペプチドをコードする。

【００３４】あるいは、このポリヌクレオチドは、上記
のように、本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズ
し、本発明のポリヌクレオチドに対して同一性を有し、
また、活性を保持していてもいなくてもよい、少なくと
も２０塩基、好ましくは３０塩基、より好ましくは少な
くとも５０塩基を有してもよい。例えば、このようなポ
リヌクレオチドは、配列番号１のポリヌクレオチドのプ
ローブとして、例えば、このポリヌクレオチドの回収の
ために使用し得るか又はＰＣＲプライマーとして使用し
得る。

【００３５】したがって、本発明は、配列番号２のポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して、少な
くとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％、
より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリ
ヌクレオチド、及び少なくとも３０塩基、好ましくは少
なくとも５０塩基を有するそのポリヌクレオチドのフラ
グメント、並びにこれらのポリヌクレオチドによってコ
ードされるポリペプチドに関する。

【００３６】本明細書中で言及する寄託物は、特許手続
上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約
の条項下で維持されるであろう。これらの寄託物は、単
に当業者への便宜上提供されるものであって、寄託が米
国特許法第１１２条の下で要求されるという承認ではな
い。寄託された物質に含まれたポリヌクレオチドの配
列、並びにこのポリヌクレオチドによりコードされるポ
リペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成
し、本明細書のいずれかの配列の記載と矛盾する場合に
は照らし合わせる。その寄託された物質を製造、使用、
又は販売するためには、ライセンスが必要になることも
あり、本明細書によってライセンスが許可されるという
ことはない。

【００３７】本発明はさらに、図１および２（配列番号
２）の推定アミノ酸配列を有するか、又は寄託されたｃ
ＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するＩＬ
−６ＳＶポリペプチド、並びにこのようなポリペプチド
のフラグメント、アナログ及び誘導体に関する。

【００３８】

【発明の実施の形態】図１および２（配列番号２）のポ
リペプチドまたは寄託されたｃＤＮＡによってコードさ
れるポリペプチドをいう場合、「フラグメント」「誘導
体」及び「アナログ」なる語は、このポリペプチドと実
質的に同じ生物学的機能又は活性を保持しているポリペ
プチドを意味する。したがって、アナログには、プロタ
ンパク質部分を解裂し、活性な成熟ポリペプチドを産生
することによって活性化され得るプロタンパク質が含ま
れる。

【００３９】本発明のポリペプチドは、組み換えポリペ
プチドでも、天然ポリペプチドでも合成ポリペプチドで
もよいが、組み換えポリペプチドが好ましい。

【００４０】図１および２のポリペプチド（配列番号
２）又は寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリ
ペプチドのフラグメント、誘導体若しくはアナログは、
（ｉ）１又はそれ以上のアミノ酸残基が、同型の又は非
同型のアミノ酸残基（好ましくは同型のアミノ酸残基）
で置換されているものであり、また、このような置換さ
れたアミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるもの
であってもなくてもよい、（ｉｉ）１またはそれ以上の
アミノ酸残基が置換基を含んでいるもの、（ｉｉｉ）成
熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増すための
化合物等の別の化合物と融合しているもの（例えば、ポ
リエチレングリコール）、または（ｉｖ）リーダー若し
くは分泌配列、成熟ポリペプチドの精製のために使用さ
れる配列、又はプロタンパク質配列等の、付加アミノ酸
が成熟ポリペプチドに融合しているものであってよい。
このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本
明細書の教示から、当業者の範囲内であると考られる。

【００４１】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは単離された形で提供され、均一にま
で精製されていることが好ましい。

【００４２】「単離された」なる語は、物質が、その元
々の環境（例えば、それが天然に存在するものならば天
然の環境）から分離されていることを意味する。例え
ば、生きている動物中に存在している天然に存在するポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていな
いが、自然の系において共存する物質の幾つか又はすべ
てから分離された、同じポリヌクレオチド又はポリペプ
チドは単離されている。このようなポリヌクレオチド
は、ベクターの一部であり得、及び／又はこのようなポ
リヌクレオチド若しくはポリペプチドは、組成物の一部
でもあり得る。このようなベクター又は組成物が、その
天然の環境の部分でないという点において、そのような
ポリヌクレオチド又はポリペプチドになお単離されてい
る。

【００４３】本発明のポリペプチドには、配列番号２の
ポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）、並びに配列番
号２のポリペプチドに対して少なくとも７０％の類似性
（好ましくは７０％の同一性）、より好ましくは配列番
号２のポリペプチドに対して９０％の類似性（より好ま
しくは９０％の同一性）、そしてさらに好ましくは配列
番号２のポリペプチドに対して９５％の類似性（さらに
好ましくは９０％の同一性）を有するポリペプチドを包
含し、また、少なくとも３０個のアミノ酸、及びより好
ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を通常含んでい
る、ポリペプチドのこのような部分を有するポリペプチ
ドの部分も含まれる。

【００４４】当技術分野では知られているように、２つ
のポリペプチドの間の「類似性」は、１つのポリペプチ
ドと別のポリペプチドのアミノ酸配列及びその同型のア
ミノ酸置換基を比較することによって決定される。

【００４５】本発明のポリペプチドのフラグメント又は
部分は、対応する完全長のポリペプチドを、ペプチド合
成により製造するためにに使用してもよい；したがっ
て、このフラグメントは、完全長のポリペプチドを製造
するための中間体として使用し得る。本発明のポリヌク
レオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の完全長
のポリヌクレオチドを合成するために使用し得る。

【００４６】「遺伝子」なる語は、ペプチド鎖の産生に
関わるＤＮＡの部分を意味する；これには、コード領域
の上流および下流の領域（リーダーおよびトレーラ
ー）、並びに個々のコード部分（エキソン）の間の介在
配列（イントロン）が含まれる。

【００４７】完全長の遺伝子のフラグメントは、完全長
の遺伝子を単離するため、又はその遺伝子に対して高い
配列類似性若しくは類似の生物学的活性を有する他の遺
伝子を単離するためにｃＤＮＡライブラリーに対するハ
イブリダイゼーションプローブとして使用し得る。この
種のプローブは、少なくとも３０塩基を有することが好
ましく、また、例えば５０若しくはそれ以上の塩基を含
んでいてもよい。このプローブはまた、完全長の転写物
に対応するｃＤＮＡクローンおよびゲノムクローン、又
は調節若しくはプロモーター領域、エキソン及びイント
ロンを含んでいる完全なＩＬ−６ＳＶ遺伝子を含むクロ
ーンを同定するためにも使用し得る。スクリーニングの
一例は、オリゴヌクレオチドプローブを合成する既知の
ＤＮＡ配列を使用することによって遺伝子のコード領域
を単離することを含んでなる。本発明の遺伝子の配列と
相補的な配列を有する標識されたオリゴヌクレオチド
は、ライブラリーの構成要素の内のどれが、そのプロー
ブとハイブリダイズするのかを決定するために、ヒトｃ
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーのス
クリーニングに使用される。

【００４８】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
を含むベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作され
た宿主細胞、及び組み換え技術による本発明のポリペプ
チドの製造に関する。

【００４９】宿主細胞は、本発明のベクターで遺伝的に
操作（形質導入、形質転換又はトランスフェクト）され
る。本発明のベクターは、例えば、クローニングベクタ
ーでも発現ベクターでもよい。このベクターは、例え
ば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態でよ
い。操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形
質転換体の選択又は遺伝子の増幅に適するように改変さ
れた、慣用の栄養培地中で培養し得る。温度、pＨ等の
培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に以前か
ら使用された条件であり、これは当業者には明らかであ
ろう。

【００５０】本発明のポリヌクレオチドは、組み換え技
術によってポリペプチドを製造するために使用し得る。
したがって、例えば、ポリヌクレオチドには、ポリペプ
チドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか１
つに含まれていてもよい。このようなベクターには、染
色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列が含まれる。例え
ばＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮ
Ａ；バクロウイルス；酵母プラスミド；プラスミド及び
ファージＤＮＡの組み合わせから生じるプラスミド、バ
シニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス及び仮性狂犬病
等のウイルスＤＮＡである。しかし、複製可能であり、
宿主内で生育可能な限りは他のいずれのベクターも使用
し得る。

【００５１】適当なＤＮＡ配列を、様々な手順によって
ベクター中に挿入し得る。一般的に、ＤＮＡ配列は、当
業者に既知の手順によって適当な制限エンドヌクレアー
ゼ部位へ挿入される。このような手順や他の手順は、当
業者の範囲内であると考えられる。

【００５２】発現ベクター内のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ
合成を目的として、作動可能なように適当な発現制御配
列（プロモーター）に連結される。このようなプロモー
ターの代表的な例として、次のものが挙げられる：ＬＴ
ＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃ又はｔｒ
ｐ、ファージラムダＰ_Lプロモーター及び原核生物又は
真核生物細胞若しくはそれらのウイルスにおいて遺伝子
の発現を制御することが知られている他のプロモータ
ー。発現ベクターは、翻訳開始部位に対するリボソーム
結合部位及び転写終止部位も含んでいる。ベクターはま
た、発現を増幅するための適当な配列を含んでいてもよ
い。

【００５３】さらに、発現ベクターは、真核生物細胞培
養についてのジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシ
ン耐性等、又は大腸菌におけるテトラサイクリン若しく
はアンピシリン耐性等の形質転換された宿主細胞の選択
のための表現型を得るために１又はそれ以上の選択可能
なマーカー遺伝子を含むのが好ましい。

【００５４】上記の適当なＤＮＡ配列、並びに適当なプ
ロモーター又は制御配列を含むベクターを、適当な宿主
の形質転換に使用して、宿主がタンパク質を発現するの
を可能にできる。

【００５５】適当な宿主の代表的な例として、次のもの
が挙げられる：大腸菌のような細菌細胞、Streptomyce
s、Salmonella typhimurium；酵母等の菌類の細胞；Dro
sophila S2 及び Spodoptera Sf9等の昆虫細胞；ＣＨ
Ｏ、ＣＯＳ又はBowes黒色腫等の動物細胞；アデノウイ
ルス；植物細胞等。適当な宿主の選択は、本明細書の教
示から当業者の範囲内と考えられる。

【００５６】より具体的には、本発明は、上で広く記載
した、１またはそれ以上の配列を含んでなる組み換え構
築物も包含する。この構築物は、その中に本発明の配列
が順方向または逆方向で挿入されたプラスミド又はウイ
ルスベクター等のベクターを含んでなる。本発明の好ま
しい態様では、構築物は、作動可能なように配列に連結
した、例えば、プロモーターのような調節配列をさらに
含んでなる。非常に多くの適当なベクターおよびプロモ
ーターが当業者に知られており、商業的に入手可能であ
る。以下のベクターが、例として挙げられる；細菌：pQ
E70、pQE60、pQE-9（Qiagen)、pBS、pD10、ファージス
クリプト、psiX174、ファージスクリプトSK、 pbsks、
pNH8A、pNH16a、pNH18A、 pNH46A（Stratagene）； ptr
c99a、 pKK223-3、 pKK233-3、 pDR540、 pRIT5（ファ
ルマシア）；真核生物： pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT
1、pSG (Stratagene) pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(ファル
マシア)。しかし、それらが宿主において複製可能であ
り生存可能である限り、他のいずれのプラスミドまたは
ベクターも使用し得る。

【００５７】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクター又は他の選択
可能なマーカーを有するベクターを用いて所望の遺伝子
から選択し得る。pKK232-8とpCM7の２つのベクターが適
当である。具体的な命名された細菌プロモーターには、
lacＩ、lacＺ、T3、T7、gpt、ラムダP_R、P_L、及びtrpが
含まれる。真核生物のプロモーターには、ＣＭＶ 即時
（immediate early）、HSVチミジンキナーゼ、初期及び
後期SV40、レトロウイルス由来のLTRs 及びメタロチオ
ネイン−Ｉが含まれる。適当なベクター及びプロモータ
ーの選択は、当技術における一般的な水準の範囲内に十
分入っている。

【００５８】さらなる態様では、本発明は、上記の構築
物を含む宿主細胞に関する。この宿主細胞は、哺乳動物
細胞等の高等真核生物細胞でも、酵母細胞等の下等真核
生物細胞でもよい。宿主細胞は、細菌細胞等の原核細胞
でもよい。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシ
ウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒
介トランスフェクション、又は電気穿孔法[Davis, L.,
Dibner, M., Battey,I., Basic Methods in Molecular
Biology, (1986)]によって達成することができる。

【００５９】宿主細胞中の構築物を慣用の方法で使用し
て、組み換え配列によってコードされる遺伝子産物を製
造することができる。別法として、本発明のポリペプチ
ドは、慣用のペプチドシンセサイザーにより製造するこ
とができる。

【００６０】成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
制御下に哺乳細胞、酵母、細菌又はその他の細胞中で発
現し得る。無細胞翻訳系を用いて、本発明のＤＮＡ構築
物から得られるＲＮＡを使用して、このようなタンパク
質を製造し得る。原核および真核宿主に使用するため
の、適当なクローニングおよび発現ベクターは、Sambro
ok,et.al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Se
cond Edition, Co-ld Spring Harbor,N/Y.,(1989)によ
って記載されており、この開示は本発明の一部を構成す
る。

【００６１】高等真核生物による本発明のポリペプチド
をコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベク
ターに挿入することによって増大する。エンハンサー
は、ＤＮＡのcis−活性化エレメントであり、通常は、
約１０から３００ｂｐであり、プロモーター上で作用し
てＤＮＡの転写を増大させる。複製起点bp１００から２
７０の後期側（late side）のSV40エンハンサー、サイ
トメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製
起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイ
ルスエンハンサーが、例として挙げられる。

【００６２】通常は、組み換え発現ベクターは、宿主細
胞の形質転換を可能にする複製の起点と選択可能なマー
カー、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子とＳ．セ
レビシエTRP1遺伝子、及び下流の構造配列の転写を司る
高度に発現した遺伝子から得られるプロモーターを含
む。このようなプロモーターは、３−ホスホグリセリン
酸キナーゼ（ＰＧＫ）等の解糖系の酵素、α−因子、酸
性ホスファターゼ、熱ショック（heat shock）タンパク
質等をコードするオペロンから得ることができる。ヘテ
ロローガスな構造配列が、翻訳開始、翻訳終止配列、及
び好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔又は
細胞外培地中への分泌を司ることが可能なリーダー配列
とともに、適当な相（phase）に組み立てられる。場合
により、このヘテロローガスな配列は、例えば発現され
た組み換え生成物の安定化又は単純化された精製等の、
所望の特性を与えるＮ−末端同定ペプチドを含む融合タ
ンパク質をコードできる。

【００６３】細菌に使用する有用な発現ベクターは、機
能的なプロモーターを有する作動可能な読み取り相（re
ading phase）内に、適当な翻訳開始及び翻訳終止シグ
ナルとともに、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮ
Ａ配列を挿入することによって構築される。ベクター
は、１又はそれ以上の、表現型の選択が可能なマーカー
と複製の起点を含んでなり、ベクターの維持を確実に
し、望ましい場合は宿主内で増幅される。形質転換に適
当な原核生物宿主には、大腸菌，Bacillus subtilis、 S
almonela typhimurium、及びPseudomonas、Streptmyce
s、Staphylococcus属内の様々な種が含まれるが、その
他の原核生物も選択の問題として使用し得る。

【００６４】代表的であるが限定ではない例として、細
菌に使用するための有用な発現ベクターは、周知のクロ
ーニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）
の遺伝子エレメントを含んでなる、市販のプラスミドか
ら得られた、選択可能なマーカーと細菌複製起点を含め
ることができる。このような市販のベクターには、例え
ば、ｐＫＫ２２３−３（ファルマシア・ファイン・ケミ
カルズ、Uppsala、スウェーデン）およびGEM１（Promeg
a Biotec，Madison，WI，米国）が含まれる。これらの
ｐＢＲ３２２「骨格」部分を、適当なプロモーターと発
現させる構造配列に結合させる。

【００６５】適当な宿主株を形質転換し、適当な細胞密
度にまで宿主株を成育させた後、選択されたプロモータ
ーを適当な手段（例えば、温度変化または化学的導入）
で誘導し、細胞をさらに培養する。

【００６６】細胞を、典型的には、遠心分離により回収
し、物理的又は化学的手段により破壊し、得られた粗抽
出物をさらに精製する。

【００６７】タンパク質の発現に使用する微生物の細胞
は、凍結−解凍の繰り返し、音波処理、機械的破壊又は
細胞溶解試剤の使用を含む便利な方法により破壊するこ
とができ、このような方法は当業者には周知である。

【００６８】様々な哺乳類細胞培養系もまた、組み換え
タンパク質を発現させるために使用し得る。哺乳類発現
系の例には、Gluzman，Cell，23，175頁，（1981年）に
記載のサルの腎臓繊維芽細胞のＣＯＡ−７細胞系、及び
適合性のベクターを発現することが可能な他の細胞系、
例えばC127，3T3，CHO，HeLa，及びBHK細胞系が含まれ
る。哺乳類発現ベクターは、複製起点、適当なプロモー
ター及びエンハンサー、また、いずれかの必要なリボソ
ーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与及
び受容部位、転写終止配列、及び５'フランキング非転
写配列をも含んでなるであろう。SV40スプライスから得
られるＤＮＡ配列、及びポリアデニル化部位は、必要と
される非転写遺伝子エレメントを得るために使用し得
る。

【００６９】硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸
抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、
ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレ
クチンクロマトグラフィーを含む方法により、ポリペプ
チドを組み換え細胞培養から回収し、精製し得る。必要
に応じて、成熟タンパク質の立体配置を完全にする、タ
ンパク質の再生工程を使用し得る。最後に、高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終の精製工程に使用
し得る。

【００７０】本発明のポリペプチドは、自然に精製され
た生成物でも、化学合成法による生成物でも、組み換え
技術によって原核生物又は真核生物宿主（例えば、培養
物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、及び哺乳類細胞に
よって）から製造されたものでもよい。組み換えによる
製造法に使用する宿主によって、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化されていてもグリコシル化されていな
くてもよい。本発明のポリペプチドはまた、最初のメチ
オニンアミノ酸残基をも含んでいてもよい。

【００７１】ＩＬ−６ＳＶを、細胞溶解活性を有する成
熟リンパ様細胞に使用し得る。したがって、ＩＬ−６Ｓ
Ｖは、抗癌剤及び抗ウイルス治療として治療目的に使用
し得る。ＩＬ−６ＳＶは、転移性のがんの治療に使用し
得る。ＩＬ−６ＳＶは、がん細胞を殺すためのヒトリン
パ球の毒的活性を改善する。これらの同じ点で、ＩＬ−
６ＳＶは、がん治療後の骨髄の抑止（suppression）に
よっておこる出血の治療または予防に使用し得る。さら
に種々の細胞系統に関わる悪性疾患を、本発明のＩＬ−
６ＳＶで治療できる。

【００７２】分類不能型免疫不全のような、Ｂ細胞の機
能不全に関係する免疫不全疾患は、ＩＬ−６ＳＶ投与に
応答するであろう。したがって、特に、ＡＩＤＳのよう
なＴ４サブセットに関わるＴ細胞免疫不全疾患は、ＩＬ
−６ＳＶで治療し得る。ＩＬ−６ＳＶはまた、ヒト骨髄
多能力造血前駆細胞の成長を誘発し、また、マクロファ
ージ／好中球骨髄クローンの分化を促進することにも使
用し得る。したがって、ＩＬ−６ＳＶは、先天性の骨髄
機能不全又は後天性の骨髄機能不全、例えば化学治療の
結果もたらされた状態の治療に使用し得る。

【００７３】ＩＬ−６ＳＶは、肝細胞に「急性期タンパ
ク質」と呼ばれる多くのタンパク質を産生させるのに使
用し得る。急性期タンパク質は、通常、外傷、細菌性シ
ョック等の急性傷害の後に誘発される。したがって、シ
ョック中のＩＬ−６ＳＶの投与は、回復の促進に有益で
あろう。

【００７４】ＩＬ−６ＳＶはまた、自原性の骨髄移植治
療を含む細胞移植治療にも使用し得る。ＩＬ−６ＳＶは
また、炎症、腎不全、ＡＩＤＳ及びがんに関わる貧血を
治療するためにエリスロポエチン生産を増大させるのに
も使用し得る。

【００７５】ＩＬ−６ＳＶは、単独で又は他の治療用製
品と組み合わせて、造血系における骨髄性又はリンパ性
細胞レベルの減少によって特徴づけられる疾患の治療に
使用し得る。このタンパク質はまた、アクセサリー細胞
と成熟細胞、例えば単球を刺激し、他の造血様因子を産
生することが可能であり、次いでそれが他の造血細胞の
コロニーの形成、並びに他の造血様活性を刺激する。

【００７６】例えば、Ｔ及び／又はＢリンパ球における
様々な免疫不全、又はリウマチ様関節炎等の免疫疾患も
また、ＩＬ−６ＳＶで有益に治療し得る。末梢血液内の
循環性白血球の数の減少である白血球減少症のような免
疫不全は、例えば、ＨＩＶのようなウイルス感染、放射
線への激しい暴露、がん治療の副作用の結果又は他の医
学的処置の結果、なり得るものである。ＩＬ−６ＳＶ組
成物での白血球減少症の治療的処置により、従来入手可
能な薬物での処置により引き起こされる好ましくない副
作用を回避できる。ＩＬ−６ＳＶに感受性である他の状
態には、骨髄移植から回復途中の患者が含まれる。

【００７７】ＩＬ−６ＳＶはまた、他の治療用薬剤との
同時投与で、インビボの体液性又は細胞性免疫応答の増
大にも使用し得る。例えば、ＩＬ−６ＳＶは、ＨＩＶ又
は腫瘍抗原ワクチン等のウイルス抗原ワクチンの効力を
増大させることに使用し得る。

【００７８】ＩＬ−６ＳＶはまた、ハイブリドーマ細胞
系に対し、培地中でハイブリドーマ成長因子として機能
してハイブリドーマの収量を増加させる。

【００７９】ＩＬ−６ＳＶポリペプチドは、免疫治療の
組成物及び抗炎症組成物に使用し得る。ＩＬ−６ＳＶは
また、骨髄移植のために化学療法を受けている患者の処
置に使用し得る。ＩＬ−６ＳＶはさらに、角膜損傷、角
膜炎及び潰瘍の治療に利用し得る。

【００８０】ＩＬ−６ＳＶは、巨核球成長を促進し血小
板産生細胞への分化を増強するので、ＩＬ−６ＳＶが使
用し得る他の治療には、例えば血小板減少症の状態の軽
減が含まれる。ＩＬ−６ＳＶはまた、がん治療及び骨髄
移植における好中球及び血小板数の回復にも使用し得
る。

【００８１】本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチ
ドは、ヒトの疾患の治療及び予防の発見のための研究試
薬及び物質として使用し得る。

【００８２】この発明はＩＬ−６ＳＶポリペプチドに対
する受容体の確認法を提供する。本受容体をコードする
遺伝子は発現クローニングによって確認できる。略述す
れば、ポリアデニル化ＲＮＡをＩＬ−６ＳＶポリペプチ
ドに反応性のある細胞から調製し、このＲＮＡから作成
したｃＤＮＡライブラリーを集めてプールとして、ＩＬ
−６ＳＶに反応しないＣＯＳ細胞またはその他の細胞に
遺伝子移入するために使用する。遺伝子移入した細胞を
ガラススライドグラス上で成長させて標識ＩＬ−６ＳＶ
と接触させる。ＩＬ−６ＳＶポリペプチドは、たとえば
ヨード化または部位特異性プロテインキナーゼに対する
認識部位の挿入を含む様々な手段で標識できる。固定化
およびインキュベーションに続いて、スライドグラスを
オートラジオグラフィー分析にかける。陽性のプールを
確認し、サブプールを調製し、反復サブプール作成およ
び再スクリーニングの過程を使用して再遺伝子移入し
て、結局推測上の受容体をコードする単一クローンを得
る。受容体確認に対する別の手法として、標識ＩＬ−６
ＳＶを受容体分子を発現する細胞膜または抽出物製剤に
光親和的に結合できる。交差結合した物質をＰＡＧＥで
分離し、Ｘ線フィルムに露光する。リガンド−受容体を
含む標識複合体を切り出し、ペプチド断片を分離し、蛋
白質微量配列決定法に付すことができる。微量配列決定
法から得られたアミノ酸配列は推測上の受容体をコード
する遺伝子の確認用にｃＤＮＡライブラリーを検索する
目的で一群の縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計す
るために使用されよう。

【００８３】この発明はＩＬ−６ＳＶの作用に類似する
もの（アゴニスト）またはＩＬ−６ＳＶとその受容体と
の相互作用を阻害するもの（アンタゴニスト）を確認す
るために化合物を検索する方法を提供する。一例として
は、ＩＬ−６ＳＶ受容体を発現する哺乳類細胞または膜
製剤を化合物の存在下に標識ＩＬ−６ＳＶとインキュベ
ーションする。これでその化合物がこの相互作用を阻害
する性能を測定できよう。アゴニストを検索する時には
反応混合物にはＩＬ−６ＳＶを添加せずに、アゴニスト
候補化合物がＩＬ−６ＳＶ受容体に結合する性能をその
化合物に結合する分析的に検出可能な試薬、例えば放射
能などによって測定する。

【００８４】それとは別に、ある化合物とＩＬ−６ＳＶ
受容体との相互反応に続いて既知の第二メッセンジャー
系の反応を測定する。これに限定するものではないが、
このような第二メッセンジャー系にはｃＡＭＰグアニレ
ートサイクラーゼ、イオンチャネルまたはホスホイノシ
チド加水分解を含む。例えば、アゴニストはＩＬ−６Ｓ
Ｖの不在下に第二メッセンジャー反応を誘導するが、一
方アンタゴニストは受容体に結合するがこのような第二
メッセンジャー反応を誘発しない。

【００８５】潜在的なアンタゴニストにはこのポリペプ
チドに結合する抗体、または場合によってはオリゴペプ
チドを含む。あるいは、潜在的なアンタゴニストは、例
えば受容体部位に結合するが不活性型のポリペプチドで
あって、受容体部位を占拠してＩＬ−６ＳＶの作用を阻
止する端を切り取ったポリペプチドなど、近縁の蛋白質
でありうる。

【００８６】他の潜在的なアンタゴニストはアンチセン
ス技術を使用して製造したアンチセンス構築物である。
アンチセンス技術はいずれもＤＮＡまたはＲＮＡへのポ
リヌクレオチドの結合に基づく方法である３重ラセン形
成またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡによって遺伝
子発現を制御するために使用できる。例えば、本発明の
成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の
５’−コード部分を使用して長さ約１０から４０塩基対
のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。
転写に関与する遺伝子の領域に相補的（３重ラセン−Ｌ
eeら、ＮucleicＡcids Ｒes．、６巻：３０７３頁（１
９７９年）；Ｃooneyら、Ｓcience、２４１巻：４５６
頁（１９８８年）；およびＤervanら、Ｓcience、２５
１巻：１３６０頁（１９９１年））であって、それによ
り転写およびＩＬ−６ＳＶの産生を阻止するようにＤＮ
Ａオリゴヌクレオチドを設計する。アンチセンスＲＮＡ
オリゴヌクレオチドは生体内でｍＲＮＡにハイブリダイ
ズしてｍＲＮＡ分子のＩＬ−６ＳＶポリペプチドへの翻
訳を阻止する（アンチセンス−Ｏkano、Ｊ．Ｎeuroche
m．、５６巻：５６０頁（１９９１年）；遺伝子発現の
アンチセンス阻害剤としてのオリゴデオキシヌクレオチ
ド、ＣＲＣ出版、Ｂoca Ｒaton、ＦＬ（１９８８
年））。前記のオリゴヌクレオチドはＩＬ−６ＳＶの産
生を阻止するためにアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡが
生体内で発現されうるように細胞に送達することもでき
る。

【００８７】潜在的アンタゴニストにはポリペプチドの
触媒部位に結合し、占拠して正常な生物学的活性を阻害
するように触媒部位が基質に結合できないようにする低
分子を含む。これに限定するものではないが、低分子の
例には小さい分子のペプチドまたはペプチド様分子を含
む。

【００８８】腫瘍を持つ動物においては循環ＩＬ−６レ
ベルの増大が検出されている。これに加えて、ＴＮＦま
たはＩＬ−２で処置した癌患者でもＩＬ−６レベル増大
が観察される。ＩＬ−６の高水準生産はＣastleman病、
多発性骨髄腫、心粘液腫、頚部腫瘍、リューマチ様関節
炎および自己免疫性糖尿病を含むヒトの疾患数種の病原
にも関係するとされている。従って、ＩＬ−６ＳＶは多
発性骨髄腫およびカポジ肉腫を含む自己免疫性、免疫炎
症性、新生物性および感染性疾患の処置のために採用し
うる。ＩＬ−６ＳＶの阻害はＣastleman病、多発性骨髄
腫、心粘液腫、頚部癌、リューマチ様関節炎および自己
免疫性糖尿病の処置のためにも重要である。これらアン
タゴニストは敗血症の処置のためにも採用しうる。

【００８９】これらアンタゴニストは、たとえば本明細
書に後記するように医薬的に許容できる担体とともに組
成物の形で採用しうる。

【００９０】本発明のポリペプチドおよびアンタゴニス
トは適当な医薬的担体と組み合せて使用しうる。このよ
うな組成物は治療的有効量のポリペプチドまたはアンタ
ゴニストおよび医薬的に許容される担体または添加剤を
含有する。これに限定されるものではないが、これら担
体には食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリ
セリン、エタノール、およびこれらの組合せを含む。製
剤は投与形態に適合させるべきである。

【００９１】本発明はまた、本発明の医薬的組成物の成
分１種またはそれ以上を入れた容器１個またはそれ以上
を含む医薬的パックまたはキットを提供する。かかる容
器とともにヒトへの投与のための製品の製造、使用また
は販売に関わる機関による承認事項を反映する、医薬ま
たは生物学的製品の製造、使用または販売を統制する政
府機関により指示された型の注意書を添付することがで
きる。これに加えて、本発明のポリペプチドまたはアン
タゴニストは他種の医薬的化合物と共に使用しうる。

【００９２】この医薬的組成物は、たとえば局所、静脈
内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内の経路の
ような常法に従って投与されうる。ＩＬ−６ＳＶの量と
用量管理および対象への投与用量は、たとえば投与形
態、処置すべき病状の性質および処方する医者の判断の
ような、多数の因子に依存する。一般的に言えば、例え
ば少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重である医薬的有効量
であって、多くの場合は約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない
用量を毎日、好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／
ｋｇ体重の用量を毎日、投与経路、症状などに配慮しつ
つ投与する。

【００９３】本発明のＩＬ−６ＳＶポリペプチドおよび
ポリペプチドであるアンタゴニストはしばしば「遺伝子
治療法」とも呼ばれる本発明に従ったポリペプチドの生
体内発現によって使用しうる。例えば、患者からの細胞
を生体外でポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ＤＮＡまたはＲＮＡ）で処理し、次に処理した細胞を
そのポリペプチドで処理すべき患者に与える。このよう
な方法は当業界でよく知られている。例えば、本発明の
ポリペプチドをコードするＲＮＡを包含するレトロウイ
ルス粒子を使用して当業界で知られている操作によって
細胞を処理する。

【００９４】同様にして、例えば当業界で知られている
操作によって生体内でのポリペプチドの発現のために生
体内で細胞を処理する。当業界で知られているように、
本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロ
ウイルス粒子を産生する産生細胞を患者に投与して細胞
を生体内で処理し、そのポリペプチドを生体内で発現さ
せる。このような方法によって本発明のポリペプチドを
投与するためのこれらおよびその他の方法は当業者にと
って本発明の教示から明白になるはずである。例えば、
細胞を処理するための発現ビヒクルはレトロウイルス以
外のもの、例えば適当なビヒクルと結合した後に生体内
で細胞を処理するために使用しうるアデノウイルスな
ど、でありうる。

【００９５】前記レトロウイルスプラスミドベクターの
起源となしうるレトロウイルスは、これに限定するもの
ではないが、マウスのモロニー白血病ウイルス、脾臓壊
死ウイルス、ラウス肉腫ウイルスのようなレトロウイル
ス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血症ウイルス、テナ
ガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノ
ウイルス、骨髄増殖肉腫ウイルスおよび乳腺腫瘍ウイル
スを含む。態様の一つでは、レトロウイルスプラスミド
ベクターをマウスのモロニー白血病ウイルスから誘導す
る。

【００９６】このベクターはプロモーター１個またはそ
れ以上を含有する。採用しうる適当なプロモーターは、
これに限定するものではないが、レトロウイルスＬＴ
Ｒ；ＳＶ４０プロモーター；およびＭillerら、Ｂiotec
hniques、７巻、９号、９８０〜９９０頁（１９８９
年）に記載のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロ
モーター、またはその他のプロモーターのいずれか（た
とえば、これらに限定するものではないがヒストン、ｐ
ｏｌＩＩＩ、およびβ−アクチンプロモーターを含む真
核生物細胞プロモーターのような細胞プロモーター）を
包含する。採用しうるその他のウイルスプロモーター
は、これに限定するものではないが、アデノウイルスプ
ロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターお
よびＢ１９パルボウイルスプロモーターを包含する。適
切なプロモーターの選択は本明細書に包含されている教
示から当業者にとって明白となろう。

【００９７】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は適当なプロモーターの制御下にある。採用されうる
適当なプロモーターには、これに限定するものではない
が、アデノウイルス主要後期プロモーターのようなアデ
ノウイルスプロモーター；またはサイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）プロモーターのような異種プロモーター；呼
吸シンシチアルウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭ
Ｔプロモーター、メタロチオネインプロモーターのよう
な誘導プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブ
ミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロ
ブリンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプ
ロモーターのようなウイルスチミジンキナーゼプロモー
ター；レトロウイルスＬＴＲ（前記修飾レトロウイルス
ＬＴＲを含む）；β−アクチンプロモーター；およびヒ
ト成長ホルモンプロモーター；を含む。このプロモータ
ーは本ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する細胞
本来のプロモーターでもよい。

【００９８】レトロウイルスプラスミドベクターはパッ
ケージング細胞系列に形質導入して産生細胞系列を形成
するために使用される。これに限定するものではない
が、形質導入しうるパッケージング細胞の例は、ここに
参考として全体を引用するＭiller、ヒトの遺伝子治療
（Ｈuman Ｇene Ｔherapy）、第１巻：５〜１４頁（１
９９０年）に記載のある、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ
−２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１
９−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８
６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞系列を包含
する。このベクターは当業界で知られているいずれかの
手段によってパッケージング細胞に形質導入しうる。こ
のような手段は、これに限定するものではないが、電気
穿孔法、リポソームの使用、およびＣａＰＯ₄沈殿法を
包含する。別法の一つでは、レトロウイルスプラスミド
ベクターをリポソーム中に封入カプセル化するかまたは
脂質と結合し、次に宿主に投与する。

【００９９】プロデューサー細胞系列は本ポリペプチド
をコードする核酸配列を包含する感染レトロウイルスベ
クター粒子を生ずる。次にこのようなレトロウイルスベ
クター粒子を採用して真核生物細胞に試験管内または生
体内のいずれかで形質導入しうる。形質導入した真核生
物細胞は本ポリペプチドをコードする核酸配列を発現す
る。形質導入しうる真核生物細胞には、これに限定する
ものではないが、胎児幹細胞、胎児癌細胞、ならびに造
血幹細胞、肝細胞、繊維芽細胞、筋原細胞、ケラチノサ
イト、内皮細胞、および気管支上皮細胞を包含する。

【０１００】この発明はＩＬ−６ＳＶ遺伝子の診断薬と
しての使用にも関連する。ＩＬ−６ＳＶの突然変異型の
検出でＩＬ−６ＳＶの発現低下に由来する疾患またはこ
の疾患への感受性が診断できると思われる。

【０１０１】ヒトＩＬ−６ＳＶ遺伝子に突然変異のある
個人は種々の技術によりＤＮＡレベルで検出しうる。診
断のための核酸は血液、尿、唾液、組織生検および剖検
からのもののような患者の細胞から入手しうる。ゲノム
ＤＮＡは検出のために直接使用しうるが、または分析前
にＰＣＲ（Ｓaikiら、Ｎature、３２４巻：１６３〜１
６６頁（１９６６年））を使用することにより酵素的に
増幅もしうる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡはこの同じ目的の
ために使用することもできる。一例としてＩＬ−６ＳＶ
をコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを使用し
て、突然変異を同定し、分析することができる。例え
ば、欠失および挿入は正常な遺伝型と比較して増幅生産
物のサイズ変化によって検出できる。点突然変異は増幅
したＤＮＡを放射能標識ＩＬ−６ＳＶのＲＮＡあるいは
放射能標識ＩＬ−６ＳＶアンチセンスＤＮＡ配列とハイ
ブリダイズさせることにより同定できる。完全対合配列
はＲＮase Ａ消化または融点の相違によって誤対合二重
ラセンとは区別できる。

【０１０２】対照遺伝子と突然変異を持つ遺伝子との間
の配列の相違は直接的なＤＮＡ配列決定法により解明し
うる。これに加えて、クローニングしたＤＮＡ断片を特
定のＤＮＡ断片を検出するためのプローブとして採用し
うる。この方法の感受性はＰＣＲと組合せる時には大き
く強化される。例えば、配列決定用プライマーは二重鎖
ＰＣＲ生成物または修正ＰＣＲにより作成した単鎖鋳型
分子とともに使用する。配列決定は放射能標識されたヌ
クレオチドによる通常の操作法により、または螢光タグ
での自動配列決定操作法により実行する。

【０１０３】ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝子検査は、
変性剤の存在または不在下のゲル中におけるＤＮＡフラ
グメントの電気泳動的な移動度についての変化を検出す
ることによって達成されうる。小さな配列の欠失および
挿入は、高分解能ゲル電気泳動によって可視化できる。
異なる配列のＤＮＡフラグメントはそれらの特異的な溶
融または部分的溶融温度に従ってゲル中の異なる場所で
異なるＤＮＡフラグメントの移動性が妨げられる変性剤
ホルムアミド勾配ゲル上で識別しうる（たとえば、Ｍye
rsら、Ｓcience、２３０巻：１２４２頁（１９８５年）
参照）。

【０１０４】特定の位置における配列変化は、たとえば
ＲＮaseおよびＳ１保護等のヌクレアーゼ保護検定法ま
たは化学的切断法（たとえば、Ｃottonなど、ＰＮＡ
Ｓ、ＵＳＡ、８５巻：４３９７〜４４０１頁（１９８５
年））によっても解明しうる。

【０１０５】こうして特定のＤＮＡ配列の検出は、たと
えばハイブダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、化学的分
解、直接的ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用、（た
とえば、制限断片長多形（ＲＦＬＰ））およびゲノムＤ
ＮＡのサザンブロッティングのような方法によって達成
しうる。

【０１０６】より慣用なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列
決定法に加えて、突然変異は原位置における分析によっ
ても検出できる。

【０１０７】正常な対照組織試料と比較して該蛋白質の
過剰な発現で腫瘍形成の存在を検出できるので、本発明
は種々の組織内でのＩＬ−６ＳＶ蛋白質レベル変化の検
出についての診断的検定法にも関する。宿主から誘導し
た試料の中のＩＬ−６ＳＶ蛋白質のレベルを検出するた
めに使用する検定法は当業者にとってよく知られてお
り、放射免疫検定法、競合的結合検定法、ウエスタンブ
ロット分析および好ましくはＥＬＩＳＡ検定法を含む。
ＥＬＩＳＡ検定法では最初にＩＬ−６ＳＶ抗原に特異的
な抗体、好ましくはモノクローナル抗体、を調製する。
これに加え、このモノクローナル抗体に対するレポータ
ー抗体を調製する。このレポーター抗体にたとえば放射
能、螢光またはこの実施例ではセイヨウワサビペルオキ
シダーゼ酵素のような検出可能な試薬を付加する。宿主
から試料を取り、ポリスチレンディッシュなど、固体の
支持体上でインキュベーションして試料中の蛋白質を結
合する。次にディッシュのフリーの蛋白質結合部位を、
たとえば牛血清アルブミンのような、非特異的蛋白質と
インキュベーションして被覆する。次にモノクローナル
抗体をディッシュ中でインキュベーションして、その間
にポリスチレンディッシュに結合した全てのＩＬ−６Ｓ
Ｖ蛋白質にモノクローナル抗体を結合させる。非結合モ
ノクローナル抗体を全て緩衝液で洗い去る。セイヨウワ
サビのペルオキシダーゼに結合したレポーター抗体をデ
ィッシュ上に入れ、ＩＬ−６ＳＶに結合したモノクロー
ナル抗体にレポーター抗体を結合させる。次に非結合レ
ポーター抗体を洗い去る。次にペルオキシダーゼの基質
をディッシュに添加し、所定の時間内の呈色量を測定し
て所定容積の患者試料中に存在する蛋白質の量を標準曲
線と比較する。

【０１０８】競合的検定法も採用しうるが、そこではＩ
Ｌ−６ＳＶに特異的な抗体を固体支持体に結合させ、標
識ＩＬ−６ＳＶおよび宿主から誘導した試料を固体支持
体上に通し、固体の支持体に結合した標識の量を検出し
て、試料中のＩＬ−６ＳＶ量に関連付けできる。

【０１０９】本発明の配列は染色体確認用にも有用であ
る。この配列は個々のヒトの染色体上の特定の場所を特
異的に標的とし、そことハイブリダイズできる。その
上、最近は染色体上の特定の部位を同定することが求め
られている。現在では実際の配列データ（反復多形性）
に基づく少数の染色体標識試薬が染色体位置を標識する
ために入手可能である。本発明に従ってＤＮＡの染色体
地図を作成することはこれら配列と疾患に関する遺伝子
とを関連付けるための重要な第一段階である。

【０１１０】略述すれば、ｃＤＮＡからのＰＣＲプライ
マー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製することによ
って染色体上に配列地図を作成できる。ｃＤＮＡのコン
ピューター分析を使用してゲノムＤＮＡ中でエクソン１
個またはそれ以上にまたがっているために増幅過程を複
雑化することのないプライマーを迅速に選択する。次に
これらのプライマーを使用して個々のヒト染色体を含有
する体細胞ハイブリッドをＰＣＲスクリーニングする。
そのプライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブ
リッドのみが増幅された断片を与える。

【０１１１】体細胞ハイブリッドのＰＣＲ地図作成は特
定のＤＮＡを特定の染色体に割り当てる迅速な操作法で
ある。同様な様式で同じオリゴヌクレオチドプライマー
について本発明を使用すれば、特定の染色体からまたは
大きいゲノムクローンのプールからの一群のフラグメン
トによってサブローカリゼーションが達成できる。染色
体地図を作成するために同様に使用できるその他の地図
作成手法には原位置ハイブリダイゼーション、標識した
フロー分別染色体でのプレスクリーニング、および染色
体特異的なｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイ
ブリダイゼーションによるプレ選択を含む。

【０１１２】分裂の中期にある染色体の配列に対するｃ
ＤＮＡクローンの螢光原位置ハイブリッド形成（ＦＩＳ
Ｈ）は正確な染色体位置を一段階で提供するために使用
できる。この技術は５０から６０塩基位の短さのｃＤＮ
Ａについて使用できる。この技術の総説についてはＶer
maら、ヒトの染色体：基本技術便覧、Ｐergamon Ｐress
社、ニューヨーク（１９８８年）を参照。

【０１１３】配列の正確な染色体位置が決定すると、染
色体上の配列の物理的位置を遺伝子地図データに関連付
けできる。このようなデータは、例えばｖ．ＭcＫusick
の、ヒトにおけるメンデル遺伝（Ｊohns Ｈopkins大学
のＷelch Ｍedical Ｌibraryを経てオンラインで入手で
きる）に記載されている。次に同じ染色体領域に地図作
成された遺伝子と疾患との間の関係をリンケージ分析
（物理的に隣接する遺伝子の共遺伝）によって確認す
る。

【０１１４】次に罹患個体および非罹患個体の間のｃＤ
ＮＡまたはゲノム配列における相違を決定する必要があ
る。もし突然変異が罹患個体のいずれかまたは全てに観
察されるが、正常な個体にはいずれも観察されなけれ
ば、その突然変異はその疾患の原因であるらしいと思わ
れる。

【０１１５】現在の物理的地図作成および遺伝子地図決
定技術によれば、疾患に関連する染色体領域に局在する
ｃＤＮＡは潜在的原因遺伝子５０個から５００個の中の
１個であることができる。（これは１メガ塩基の地図作
成解析および遺伝子１個に２０ｋｂを仮定したものであ
る）。

【０１１６】ポリペプチド、そのフラグメントまたはそ
の他の誘導体またはアナログ、またはそれらを発現する
細胞をそれらに対する抗体を産生するための免疫原とし
て使用できる。これらの抗体は、例えばポリクローナル
またはモノクローナル抗体でよい。本発明はキメラ、単
鎖、およびヒト化抗体ならびにＦａｂフラグメント、ま
たはＦａｂ発現ライブラリーの生成物をも包含する。こ
のような抗体およびフラグメントの生産には当業界で知
られている種々の操作法を使用しうる。

【０１１７】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して作成される抗体は、そのポリペプチドの動物への直
接的な注射によって、またはそのポリペプチドの、好ま
しくはヒト以外の、動物への投与によって取得できる。
こうして得られた抗体を次にポリペプチド自体に結合す
る。この方法により、そのポリペプチドのフラグメント
のみをコードする配列でさえ、天然のポリペプチド全体
に結合する抗体を作成するために使用できる。次にこの
ような抗体を使用してそのポリペプチドを発現する組織
からそのポリペプチドを単離できる。

【０１１８】モノクローナル抗体の製造には連続細胞系
列培養により産生される抗体を提供する技術はいずれも
使用できる。この例には、ハイブリドーマ技術（Ｋohle
rとＭilstein、１９７５年、Ｎature、２５６巻：４９
５〜４９７頁）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリ
ドーマ技術（Ｋozborら、１９８３年、ＩmmunologyＴod
ay、４巻：７２頁）、およびヒトモノクローナル抗体を
産生するＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃoleら、１９
８５年、モノクローナル抗体および癌治療、Ａlan Ｒ．
Ｌiss社、７７〜９６頁）を包含する。

【０１１９】単鎖抗体の生産について記載された技術
（米国特許４９４６７７８号）は、本発明の免疫原性ポ
リペプチド生成物に対する単鎖抗体を生産するように適
応できる。

【０１２０】本発明はさらに下記の実施例に関連付けて
記載するが、しかしながら本発明はそのような実施例に
限定されるものではないことを理解すべきである。特段
の記載がない限り、全ての部または量は重量で表す。

【０１２１】下記の実施例に関する理解を促進するため
に、頻繁に出現する方法および／または用語のいくつか
を記載する。

【０１２２】「プラスミド」は小文字ｐを先行させ、お
よび／または大文字および／または数字を後続させるこ
とによって記述される。本明細書の出発プラスミドは商
業的に入手可能であるか、無限定的基準で公共的に入手
可能であるか、または公表されている操作法に従って入
手可能なプラスミドから構築できる。これに加えて記載
のものと均等なプラスミドは当業界で知られており、通
常の当業者には明白となろう。

【０１２３】ＤＮＡの「消化」はＤＮＡ中のある配列の
みに作用する制限酵素によるＤＮＡの触媒的な開裂を示
す。本明細書で使用する種々の制限酵素は商業的に入手
可能であって、それらの反応条件、補助因子、およびそ
の他の要件は通常の当業者に知られているように使用す
る。分析的な目的のためには、一般的には１μｇのプラ
スミドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素とと
もに約２０μＬの緩衝液中で使用する。プラスミド構築
のためのＤＮＡ断片を分離する目的のためには、一般的
には５から５０μｇのＤＮＡをさらに大きい容積中で２
０から２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に
対する適当な緩衝液および基質量は製造社が指定してい
る。通常は３７℃で約１時間のインキュベーション時間
が使用されるが、提供社の指示に従って変更しうる。消
化後、反応物を直接にポリアクリルアミドゲル上で電気
泳動して所望のフラグメントを単離する。

【０１２４】切断した断片のサイズ分離はＧoeddel，
Ｄ．らがＮucleic Ａcids Ｒes．、８巻：４０５７頁
（１９８０年）に記載の８％ポリアクリルアミドゲルを
用いて実行する。

【０１２５】「オリゴヌクレオチド」は化学的に合成さ
れたものであってもよい単鎖ポリデオキシヌクレオチド
または相補的な２本のポリデオキシヌクレオチド鎖のい
ずれかを示す。このような合成的なオリゴヌクレオチド
は５’−リン酸を持たず、ＡＴＰでキナーゼの存在下に
リン酸を添加しなければ他のオリゴヌクレオチドに連結
しない。合成的オリゴヌクレオチドは脱リン酸化してい
ないフラグメントには連結するであろう。

【０１２６】「連結」は２重鎖核酸フラグメント２本の
間でのホスホジエステル結合形成の工程を示す（Ｍania
tis，Ｔ．ら、前出、１４６頁）。特段の記載がない限
り、連結は既知の緩衝液および条件を使用して０.５μ
ｇの連結すべきＤＮＡフラグメントのおよそ当モル量に
対し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を１０単位
使用して達成しうる。

【０１２７】特段の記述がない限り、形質転換はＧraha
m，Ｆ．とＶan ｄer Ｅb，Ａ．、Ｖirology、５２巻：
４５６〜４５７頁（１９７３年）の方法に記載されてい
るようにして実行した。

【０１２８】

【実施例】実施例１ ＩＬ−６ＳＶの細菌での発現および精製 最初に、ＩＬ−６ＳＶをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣ
Ｃ＃７５６９７を、プロセッシングされたＩＬ−６ＳＶ
蛋白質（マイナスシグナルペプチド配列）の５’および
３’配列並びにＩＬ−６ＳＶ遺伝子の３’へのベクター
配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを
使用して増幅する。ＩＬ−６ＳＶに対応する別のヌクレ
オチドを５’および３’配列に各々に付加した。５’オ
リゴヌクレオチドプライマーは配列５’ＣＧＣＣＡＧＣ
ＣＡＴＧＧＴＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＴＴＣＣ
ＡＡＡＧＡＴＧＴＡＧＣＣＧＣＣＣＣＡＣ３’（配列番
号３）を持ち、ＮｃｏＩ制限酵素部位を含み、これに続
いてプロセッシングされた蛋白質コドンの推測上の末端
アミノ酸から出発するＩＬ−６ＳＶをコードする配列の
１５ヌクレオチドを持つ。３’配列である３’ＧＴＡＧ
ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＴＴＴＧＣＣＧＡＡＧＡＧＣ５’
（配列番号４）は、ＢｇｌＩＩ制限部位に相補的な配列
およびＩＬ−６ＳＶ蛋白質の１５ヌクレオチドおよびＩ
Ｌ−６ＳＶＤＮＡ挿入物の３’に位置するベクター配列
に相補的な配列を含む。制限酵素部位は細菌の発現ベク
ターｐＱＥ−６０（Ｑiagen社、Ｃhatsworth、ＣＡ、９
１３１１）上の制限酵素部位に対応する。ｐＱＥ−６０
は抗生物質耐性（Ａｍｐ^r）、細菌の複製起点（ｏｒ
ｉ）、ＩＰＴＧ−制御可能なプロモーターオペレーター
（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉ
ｓタグおよび制限酵素部位をコードする。次にｐＱＥ−
６０をＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩで消化した。増幅した
配列をｐＱＥ−６０に連結し、ヒスチジンタグおよびＲ
ＢＳをコードする配列と共に枠内に挿入した。次に連結
混合物を使用して、Ｓambrook，Ｊ．ら、分子クローニ
ング：実験室便覧（Ｍolecular Ｃloning，Ａ Ｌaborat
ory Ｍanual）、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress社
（１９８９年）中に記載された操作によって、商標Ｍ１
５／ｒｅｐ４の下にＱiagen社から入手できる大腸菌株
を形質転換した。Ｍ１５／ｒｅｐ４はプラスミドｐＲＥ
Ｐ４の多重コピーを含み、ｌａｃＩレプレッサーを発現
し、カナマイシン耐性（Ｋａｎ^r）も与える。形質転換
体をＬＢプレート上で成育する能力により同定し、アン
ピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラ
スミドＤＮＡを単離し、制限分析によって確認した。所
望の構築物を含むクローンをＡｍｐ（１００μｇ／ｍ
Ｌ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍＬ）の双方を添加した
ＬＢ培地中で液体培養によって一夜（Ｏ／Ｎ）培養し
た。Ｏ／Ｎ培養物を使用して１：１００から１：２５０
の比率の大量培養物に接種する。吸光度６００（Ｏ．
Ｄ．⁶⁰⁰）が０.４と０.６との間になるまで細胞を培養
した。次にＩＰＴＧ（「イソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド」）を最終濃度１ｍＭまで添加した。
ＩＰＴＧはｌａｃＩレプレッサーを不活化し、Ｐ／Ｏの
クリアリングを誘導して遺伝子発現を増大する。細胞を
さらに３から４時間培養した。次に細胞を遠心分離によ
って収集した。細胞ペレットをカオトロープ剤である６
モーラー−グアニジンＨＣｌ中で溶菌した。透明になっ
た後、６−Ｈｉｓタグを含有する蛋白質による強固な結
合をさせる条件下にニッケルキレートカラム上でクロマ
トグラフィーすることによって溶解したＩＬ−６ＳＶを
この溶液から精製した（Ｈochuli，Ｅ．ら、Ｊ．Ｃhrom
atography、４１１巻：１７７〜１８４頁（１９８４
年））。ＩＬ−６ＳＶ（９５％純度）を６モーラー−グ
アニジンＨＣｌ、ｐＨ５.０でカラムから溶離し、再生
の目的で３モーラー−グアニジンＨＣｌ、１００ｍＭ−
リン酸ナトリウム、１０ミリモーラー−グルタチオン
（還元型）および２ミリモーラー−グルタチオン（酸化
型）に調整した。この溶液中で１２時間インキュベーシ
ョンした後に、蛋白質を１０ミリモーラー−リン酸ナト
リウムに対して透析した。

【０１２９】実施例２ 遺伝子治療法による発現 繊維芽細胞を皮膚生検により被験者から採取する。得ら
れた組織を組織培養培地中に入れて小片に分割する。組
織の小さな塊を組織培養フラスコの濡れた表面に置き、
各フラスコに約１０片を入れる。フラスコを逆さまに
し、密栓し、室温に一夜放置する。室温で２４時間後
に、フラスコを逆さまにすると、組織の塊はフラスコの
底に付着したまま残り、これに新鮮な培地（たとえば、
１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシン添
加ＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次にこれを３７℃
で約１週間インキュベーションする。この時点で新鮮な
培地を加え、続いて数日毎に交換する。培養物中でさら
に２週間後、繊維芽細胞の単層が現れる。単層をトリプ
シン処理して大きいフラスコにスケールする。

【０１３０】マウスモロニー肉腫ウイルスの長末端反復
が隣接するｐＭＶ−７（Ｋirschmeier，Ｐ．Ｔ．ら、Ｄ
ＮＡ、７巻：２１９〜２５頁（１９８８年））をＥｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、続いてウシ小腸ホ
スファターゼで処理する。線状ベクターをアガロースゲ
ル上で分別し、ガラスビーズを使用して精製する。

【０１３１】５’および３’末端配列に各々対応するＰ
ＣＲプライマーを使用して本発明のポリペプチドをコー
ドするｃＤＮＡを増幅する。５’プライマーはＥｃｏＲ
Ｉ部位を含み、３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を
含む。マウスのモロニー肉腫ウイルス線状骨格およびＥ
ｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ断片の等量をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼの存在下に相互に添加する。得られる混合物をフ
ラグメント２個の連結に適する条件下に維持する。連結
混合物を使用して細菌ＨＢ１０１を形質転換し、次にこ
のベクターに目的の遺伝子が正しく挿入されたことを確
認する目的でこれをカナマイシン含有寒天上に塗布す
る。

【０１３２】両種性のｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２
パッケージング細胞を１０％牛血清（ＣＳ）、ペニシリ
ンおよびストレプトマイシンを添加したダルベッコの修
正イーグル培地（ＤＭＥＭ）の組織培養液中に密集密度
となるまで培養する。次に、遺伝子を含有するＭＳＶベ
クターを、培地中に添加してパッケージング細胞をこの
ベクターで形質導入する。これでパッケージング細胞
は、遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を産生する
（パッケージング細胞を、ここでプロデューサー細胞と
呼ぶ）。

【０１３３】形質導入したプロデューサー細胞に新鮮な
培地を添加し、続いて培地を密集成長したプロデューサ
ー細胞の１０ｃｍプレートから収集する。感染性ウイル
ス粒子を含む使用済培地をミリポアフィルターで濾過し
て剥離したプロデューサー細胞を除き、次にこの培地を
使用して繊維芽細胞を感染させる。培地を密集に至らな
い繊維芽細胞のプレートから除去し、迅速にプロデュー
サー細胞からの培地と交換する。この培地を除き、新鮮
な培地に置換する。もしウイルスの力価が高ければ、実
際上全ての繊維芽細胞が感染しており、選択は不要であ
る。もし力価が非常に低ければ、ｎｅｏまたはｈｉｓの
ような選択マーカーを持つレトロウイルスのベクターを
使用する必要がある。

【０１３４】次に処理した繊維芽細胞単独またはｃｙｔ
ｏｄｅｘ３マイクロキャリアーのビーズ上で密集成長ま
で成育させた後に宿主に注射する。これでこの繊維芽細
胞は蛋白質生成物を産生する。

【０１３５】前記教示に照らして本発明の無数の修正お
よび変化が可能であって、それ故、ここに添付する請求
項の範囲内にあり、本発明は特定的に記載したものと異
なるように実行しうる。

【０１３６】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：５０７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列

【表１】 配列番号：２ 配列の長さ：１６７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数： トポロジー：直鎖状 配列の種類： タンパク質 配列

【表２】 配列番号：３ 配列の長さ：５１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド 配列

【表３】 配列番号：４ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド 配列

【表４】

【図面の簡単な説明】

【図１】 成熟ＩＬ−６ＳＶポリペプチドをコードする
ｃＤＮＡ配列と、対応する推定アミノ酸配列を示す。ア
ミノ酸に対する標準の１文字の略号を全体にわたって使
用する。

【図２】 図１の続きである。成熟ＩＬ−６ＳＶポリペ
プチドをコードするｃＤＮＡ配列と、対応する推定アミ
ノ酸配列を示す。アミノ酸に対する標準の１文字の略号
を全体にわたって使用する。

【図３】 ＩＬ−６ＳＶとＩＬ−６とのアミノ酸レベル
での比較である。上段はＩＬ−６ＳＶであり、下段がＩ
Ｌ−６である。

【図４】 細菌での発現および精製後のＩＬ−６ＳＶの
ゲル電気泳動の結果を示す図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１４年６月１７日（２００２．６．１
７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/00 Ａ６１Ｐ 29/00 １０１ ４Ｃ０８４ 29/00 31/00 ４Ｈ０４５ １０１ 31/12 31/00 35/00 31/12 35/02 35/00 37/02 35/02 43/00 １１１ 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/54 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/54 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 スティーブン・エム・ルーベン アメリカ合衆国20832メリーランド州オル ニー、ヘリテイジ・ヒルズ・ドライブ 18528番 (72)発明者 ハオドン・リー アメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイ ザーズバーグ、ラトリッジ・ドライブ 11033番 (72)発明者 マーク・ディ・アダムス アメリカ合衆国20878メリーランド州ノー ス・ポトマック、ダフィーフ・ドライブ 15205番 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 FB03 4B024 AA01 AA11 BA26 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 HA11 4B063 QQ41 QQ79 QR16 QR77 QS36 QX07 4B064 AG03 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA90Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 AA07 AA13 AA16 BA01 BA02 BA08 BA22 DA18 DA58 MA52 MA56 MA59 MA66 NA14 ZA512 ZB072 ZB112 ZB152 ZB262 ZB312 ZB332 ZC352 ZC412 ZC542 4H045 AA10 AA20 AA30 CA40 DA02 EA20 EA50 FA74

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列番号２に示すポリペプチドを
   コードするポリヌクレオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌク
   レオチドに少なくとも７０％同一であり、（ａ）のポリ
   ヌクレオチドとハイブリダイズすることのできるポリヌ
   クレオチド；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌ
   クレオチドのポリヌクレオチドフラグメントから構成さ
   れる群から選択した構成員を含む単離されたポリヌクレ
   オチド。
2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
   １のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
   １のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡである
   請求項１のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列番号２のアミノ酸１番から１６７番
   までを包含するポリペプチドをコードする請求項２のポ
   リヌクレオチド。
6. 【請求項６】 配列番号１のヌクレオチド１番からヌク
   レオチド５０７番までを包含する請求項２のポリヌクレ
   オチド。
7. 【請求項７】 （ａ）ＡＴＣＣ受託番号７５６９７に含
   有されるＤＮＡによって発現されるアミノ酸配列を持つ
   成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｂ）ＡＴＣＣ受託番号７５６９７に含有されるＤＮＡ
   によって発現されるアミノ酸配列を持つポリペプチドを
   コードするポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとハイブ
   リダイズすることができ、（ａ）または（ｂ）のポリヌ
   クレオチドに対して少なくとも７０％同一であるポリヌ
   クレオチド； （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
   のポリヌクレオチドフラグメントから構成される群から
   選択した構成員を含む単離されたポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 請求項２のＤＮＡを含有するベクター。
9. 【請求項９】 請求項８のベクターで遺伝子的に処理し
   た宿主細胞。
10. 【請求項１０】 ＤＮＡがコードするポリペプチドを請
    求項９の宿主細胞から発現することを含むポリペプチド
    の製造法。
11. 【請求項１１】 請求項８のベクターで細胞を遺伝子的
    に処理することを含む、ポリペプチドを発現することの
    できる細胞の製造法。
12. 【請求項１２】 （ｉ）配列番号２の推定アミノ酸配列
    を持つポリペプチドおよびそのフラグメント、アナログ
    および誘導体；および（ｉｉ）ＡＴＣＣ受託番号７５６
    ９７のｃＤＮＡがコードするポリペプチドおよびそのフ
    ラグメント、アナログおよび誘導体から構成される群か
    ら選択したポリペプチド。
13. 【請求項１３】 ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸
    １番から１６７番までを含む請求項１２のポリペプチ
    ド。
14. 【請求項１４】 請求項１２のポリペプチドの活性化を
    阻害する化合物。
15. 【請求項１５】 治療的有効量の請求項１２のポリペプ
    チドを患者に投与することを含むＩＬ−６ＳＶを必要と
    する患者の処置法。
16. 【請求項１６】 治療的有効量のポリペプチドが、患者
    に該ポリペプチドをコードするＤＮＡを与えて生体内で
    該ポリペプチドを発現することにより、投与されるもの
    である請求項１５の方法。
17. 【請求項１７】 治療的有効量の請求項１４の化合物を
    患者に投与することを含むＩＬ−６ＳＶポリペプチドを
    阻害する必要のある患者の処置法。
18. 【請求項１８】 ポリペプチドをコードする核酸配列中
    に存在する突然変異を測定することを含む、請求項１２
    のポリペプチドの発現不足に関連する疾患または疾患へ
    の罹病性を診断する方法。
19. 【請求項１９】 宿主から誘導した試料中の請求項１２
    のポリペプチドの存在を分析することを含む診断法。
20. 【請求項２０】 表面にポリペプチドに対する受容体を
    発現する細胞（但し、この受容体は化合物とその受容体
    との結合に応答して検出可能なシグナルを発生すること
    のできる第二成分と関連するものである）を、分析的に
    検出可能な化合物と受容体に結合する条件下に接触させ
    ること；およびその化合物がその受容体に結合し、その
    受容体を阻害するかどうかをその化合物とその受容体と
    の相互作用から発生するシグナルの不在を検出すること
    によって決定することを含む請求項１２のポリペプチド
    に結合し、そのポリペプチドの活性化を阻害する化合物
    を同定する方法。
21. 【請求項２１】 表面にポリペプチドに対する受容体を
    発現する細胞（但し、この受容体は化合物とこの受容体
    との結合に応答して検出可能なシグナルを発生すること
    のできる第二成分と関連するものである）を、分析的に
    検出可能なＩＬ−６ＳＶポリペプチドおよび化合物と、
    受容体に結合する条件下に接触させること；および そ
    の化合物がその受容体に結合し、その受容体を阻害する
    かどうかを受容体に結合したＩＬ−６ＳＶの量を測定す
    ることによって決定することを含む請求項１２のポリペ
    プチドに結合し、そのポリペプチドの活性化を阻害する
    化合物を同定する方法。
22. 【請求項２２】 本願明細書に記載したいずれかの発
    明。