JP2003043046A - 乳癌判定用マーカー及び該マーカーを用いる乳癌の判定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】乳癌の進行度や発病の危険性を知るための判定
方法を提供し、また判定に使用するマーカーとなる物質
を提供することを目的とする。 【構成】内皮細胞特異的プロテインＣレセプター(ＥＰ
ＣＲ)を好適なマーカーとし、抗ＥＰＣＲ抗体を用いた
免疫学的検出方法を適用する。 【効果】細胞や核の形態の観察だけでは見逃す可能性の
ある乳癌細胞の検出、手術のリンパ節の廓清の程度を決
定する為のリンパ節における乳癌細胞の検出及び転移後
の同様な判定と治療に用いられ得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本願発明は癌の判定方法に関し、
詳細には、内皮細胞特異的プロテインＣレセプター(End
othelial Protein C Receptor：以下、ＥＰＣＲと称す
ることがある)を本態とする乳癌判定用マーカー及び該
マカーの存在を抗ＥＰＣＲ抗体を用いて検出する乳癌判
定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術並びに発明が解決しようとする課題】癌を
確定診断(判定)する場合、一般に病理診断が行われる。
その際、細胞及び核の形状等で診断するが、さらに免疫
染色により予後の推測に関わる情報が得られる。現在免
疫染色で乳癌細胞を高率に検出する抗原は見い出されて
いない。この事は手術後の残存した乳癌細胞及びリンパ
節等の転移における乳癌細胞の検出を困難としている。
また、血清中の腫瘍マーカーとして特異性の優れた腫瘍
マーカーはない。

【０００３】現在用いられている乳癌の腫瘍マーカーは
ＣＡＥ、ＣＡ１５−３、ＴＰＡ、ＢＣＡ２２５、ＮＣ
Ｃ−ＳＴ−４３９等であるが、原発性乳癌では１０％程
度の検出率であり、再発乳癌では５０％程度の発現であ
る(広岡保明等、臨床検査、ｖｏｌ.３９、ｐ.１１６３
−１１６７、１９９５)。従って、乳癌を特異的にしか
も高率に検出できる腫瘍マーカーが望まれている。

【０００４】

【課題を解決するための手段、構成】本願発明者らは、
上記課題を克服するために鋭意研究を重ねた結果、内皮
細胞特異的プロテインCレセプター(ＥＰＣＲ)が乳癌細
胞に発現すること、そして、ＥＰＣＲに対する抗体によ
る免疫染色により乳癌細胞が高率(９５％以上)に染色さ
れる事を見出し、本願発明を完成した。ＥＰＣＲは２３
８アミノ酸からなり、ＣＤ１／主要組織抗原複合体とホ
モロジーを持つ１型膜貫通型糖タンパク質である。当該
レセプターはプロテインＣまたは活性化プロテインＣ
(ＰＣ／ＡＰＣ)と高親和性を持ち、ＰＣのＧｌａドメイ
ンと結合し、機能的には膜上でのＰＣの活性化を促進す
る(Ｆｕｋｕｄｏｍｅ Ｋ.ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｂｉｏｌ.
Ｃｈｅｍ. ｖｏｌ.２６９,ｐ.２６４９６−２６４９１,
１９９４)。ＥＰＣＲは生体内では大血管の内皮細胞に
主に発現し、毛細血管では発現していない(Ｌａｓｚｉ
ｋ Ｚ. ｅｔ ａｌ., Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ, ｖｏｌ.
９６, ｐ.３６３３−３６４０,１９９７)。また、その
他の正常細胞の組織での発現は確認されていない。

【０００５】ＥＰＣＲが乳癌の組織に高率に発現してい
る事は、乳癌の確定診断(判定)や治療に高い有用性をも
たらす。細胞や核の形態の観察だけでは見逃す可能性の
ある癌細胞の検出、手術のリンパ節の廓清の程度を決定
する為のリンパ節における癌細胞の検出及び転移後の同
様な判定と治療に用いられ得る。

【０００６】なお、本願発明のＥＰＣＲとは内皮細胞上
に発現し、プロテインＣもしくは活性化プロテインＣに
結合するレセプターを意味する。文献等(Ｆｕｋｕｄｏ
ｍｅＫ. ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ｖｏ
ｌ.２６９,ｐ.２６４９６−２６４９１,１９９４)には
配列が示されているが、人種及び個人差からプロテイン
Ｃもしくは活性化プロテインＣに結合能を示すものであ
れば、配列もしくは発現部位からの制約を受けない。こ
れらの配列から発現してくる蛋白に結合能を有する抗体
もしくは蛋白の調製法に関して、後述の(ａ)−(ｒ)に何
ら制約を受けない。

【０００７】また、ＥＰＣＲは血中に於いてはｓＥＰＣ
Ｒが確認されており、これは、ＥＰＣＲの細胞外領域
(ｓｏｌｕｂｌｅ ＥＰＣＲ：ｓＥＰＣＲ)が発現してい
るものと考えられている(Ｋｕｒｏｓａｗａ Ｓ.ｅｔ ａ
ｌ., Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｉｎｖｅｓｔ., ｖｏｌ.１００,
ｐ.４１１−４１８,１９９７)。乳癌に於いて発現した
ＥＰＣＲが切断されたｓＥＰＣＲが血中に存在すれば、
血中の有効な腫瘍マーカーとなりうる。

【０００８】本願発明のＥＰＣＲ検出による乳癌の判定
方法の工程は、概略下記のとおりである。ＥＰＣＲまた
はｓＥＰＣＲに対する抗体を調製する。ここで、抗原は
前記範疇のＥＰＣＲまたはｓＥＰＣＲであれば特段の制
約はない。抗体は種々の方法で調製することができ、動
物種及びポリクローナル、モノクローナルの制約はな
い。抗体調製の好適な例は、遺伝子組換え由来のＥＰＣ
ＲまたはｓＥＰＣＲを抗原としてハイブリドーマ法に基
づいてモノクローナル抗体を調製する方法、または抗体
ファージライブラリー法によって選択した好適なファー
ジもしくは当該ファージが感染した微生物が産生するポ
リペプチドを利用する方法等が推奨される。

【０００９】本願発明で推奨される抗ＥＰＣＲ抗体の調
製方法は以下のとおりである。(１)(ａ)ＥＰＣＲをコー
ドし、哺乳動物由来の細胞で複製、転写及び翻訳されう
るＤＮＡ配列を含む組換えプラスミド発現ベクター、及
びラット由来細胞よりなる宿主−ベクター発現系を準備
し、形質転換、形質導入及びトランスフェクションから
なる群から選択される方法により、組換えプラスミド発
現ベクターをラット由来の細胞に導入する。ラットの尾
部に前記細胞を完全アジュバントと共に免疫する。免疫
したラットのリンパ節よりリンパ球を取り出し、もしく
は、(ｂ)ＥＰＣＲをコードし、哺乳動物由来の細胞で複
製、転写及び翻訳されうるＤＮＡ配列を含む組換えプラ
スミド発現ベクター、及び哺乳動物由来細胞よりなる宿
主−ベクター発現系を準備し、形質転換、形質導入及び
トランスフェクションからなる群から選択される方法に
より、組換えプラスミド発現ベクターを哺乳動物由来の
細胞に導入、培養しその上清を回収する。その上清より
ｓＥＰＣＲを各種クロマトグラフィー等で精製し、動物
に免疫し、数週間後にリンパ節もしくは脾臓を取り出し
リンパ球を回収する。そして、前記リンパ球と不死化し
た細胞とでハイブリドーマを形成し、ＥＰＣＲと反応す
る抗体を産生するハイブリドーマを選択する。そのハイ
ブリドーマを大量に培養して培養上清を調製する。もし
くはそのハイブリドーマを免疫不全マウスに移植し、腹
水を調製する。上清もしくは腹水より抗体を調製する。

【００１０】(２)ヒトの抗体ファージライブラリーを動
物細胞由来のｓＥＰＣＲを抗原としてスクリーニング
し、ｓＥＰＣＲと特異的に反応するファージを選択す
る。そのファージもしくはそのファージが感染した大腸
菌が産生するｓＥＰＣＲに結合する抗体のＶ領域を持つ
ポリペプチドもしくはタンパク質を精製する。

【００１１】得られた抗体を用いて乳癌の組織染色、も
しくは酵素免疫測定法(Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ａ
ｓｓａｙ)等免疫学的測定方法により血中のｓＥＰＣＲ
の定量を行なう。対象となる生物学的試料は各々組織切
片と血液である。組織染色では、抗ＥＰＣＲ抗体を組織
切片に対して反応させた後、ＨＲＰ(ｈｏｒｓｅｒａｄ
ｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ)等各種標識物質を結合し
た２次抗体を反応させ発色させる。発色の有無により乳
癌判定する。適用され得る免疫学的測定方法としては、
酵素免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロット
法、凝集法、免疫比濁法または免疫拡散法等が例示され
る。

【００１２】

【発明の効果】本願発明により、ＥＰＣＲとの結合能を
有する抗体を用いて組織染色もしくは血中のＥＰＣＲ
(ｓＥＰＣＲ)を検出することより、乳癌細胞の有無を知
ることができる。以下に実施例を挙げて本願発明を具体
的に説明するが、本願発明はこれらの例に何ら限定され
るものではない。

【００１３】

【実施例】実施例１ (モノクローナル抗体の作製)ＥＰＣＲの発現プラスミド
(ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＥＰＣＲ)(Ｆｕｋｕｄｏｍｅ Ｋ. ｅ
ｔ ａｌ., Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ｖｏｌ.２６９,
ｐ.２６４９６−２６４９１,１９９４)をｒａｔ３Ｙ１
繊維芽細胞にリン酸Ｃａ法(Ｇｒａｈａｍ ｅｔａｌ.,
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ, ｖｏｌ.５２, ｐ.４５６−４６７,)
により導入し、Ｇ４１８によりプラスミド導入細胞を選
択した。その発現細胞(ＲＥ−１)を完全アジュバントと
共に一匹のラット当たり５×１０７個を尾部に注入し
た。一週間後に鼡径部のリンパ節より細胞を採取し、マ
ウスのＳＰ２／０ミエローマ細胞(ＣＲＬ１５８１,ＡＴ
ＣＣ)とポリエチレングリコールと融合させた。そのハ
イブリドーマをＨＡＴ培地により選択した(Ｇａｌｆｒ
ｅ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ,ｖｏｌ.２６６, ｐ.５５
０−５５２)。その上清に於けるＥＰＣＲ結合抗体の有
無を調べる為に、ＥＰＣＲを発現する２９３細胞(ＣＲ
Ｌ１５７３,ＡＴＣＣ)がＲＥ−１と同様に作製された
(以下、ＳＥ−１)。

【００１４】ＥＰＣＲ発現細胞(ＳＥ−１)、１×１０５
と上清を１％ＢＳＡ Ｈａｎｋｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓ
ａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ(ＨＢＳＳ)中で室温で遮光し
て反応させた。洗浄後、ＦＩＴＣラベル抗ラット抗体を
反応させフローサイトメーター, ＦＡＣＳｃａｎ(Ｂｅ
ｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ)により解析した。その結
果染色された上清を陽性とした。さらにそれらの細胞を
限界希釈法により反応・解析を２サイクル行なって、陽
性細胞をクローニングした。クローニングされた陽性細
胞を免疫不全マウスに移植し、腹水を調製した。上清も
しくは腹水より、免疫アフィニティークロマトグラフィ
ーによって抗ＥＰＣＲ抗体を精製した。好適な抗体とし
てＲＣＲ−３７９が得られた。

【００１５】実施例２ (乳癌組織切片の免疫染色)組織標本は外科手術より得ら
れたものである。その乳癌のホルマリン固定組織もしく
はパラフィン包埋組織より４μｍの切片を作製した。そ
の切片を水素化硅素をコートしたスライドグラスの上で
切断し、キシレンで脱パラフィンを行ないエタノールで
再水和化を行なった。内在性のペルオキシダーゼ活性を
除去する為に１０分間０.３％過酸化水素を含むメタノ
ールでその切片を反応させた。抗原性を増強する為に煮
沸温度で１０ｍＭクエン酸バッファー(ｐＨ６.０)で１
５分間超音波処理を実施した。抗ＥＰＣＲ抗体であるＲ
ＣＲ−３７９を用いて１μｇ／ｍｌの濃度で室温一昼夜
組織切片に対して反応させた。その後の検出反応は、ビ
オチン化抗体及びｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘ
ｉｄａｓｅ標識アビジン−ビオチン複合体はＶｅｃｔａ
ｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ ｋｉｔ(Ｖｅｃｔｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ) に含まれている試薬を用い
てマニュアルに従って反応させた。発色は３,３'−ｄｉ
ａｍｉｎｏｂｅｎｔｉｄｉｎｅ(含０.００５％Ｈ２Ｏ２
／１０ｍＭ ＮａＮ３)により行なった。封入する前にヘ
マトキシリンエオジンで対比染色を行なった。

【００１６】乳癌患者の浸潤性乳管癌の切片に対して９
６％の高頻度に陽性の結果が得られた。しかし、腸管線
腫の切片では染色されなかった。その結果を図１に示
す。

【図面の簡単な説明】

【図１】本願発明の乳癌の判定方法を浸潤性乳管癌及び
腸管線腫の切片に適用し、乳癌特異的に判定可能である
ことを示す免疫染色図(浸潤性乳管癌切片(ａ,ｂ)、腸管
線腫切片(ｃ,ｄ))である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 内皮細胞特異的プロテインＣレセプター
   (Endothelial Protein C Receptor：以下、ＥＰＣＲと
   称することがある)を本態とする乳癌判定用マーカー。
2. 【請求項２】 生物学的試料中のＥＰＣＲの存否を確認
   し、該物質の存在により陽性と判断することを特徴とす
   る乳癌の判定方法。
3. 【請求項３】 生物学的試料中のＥＰＣＲの存否を確認
   するに当たり、抗ＥＰＣＲ抗体を用いた免疫学的検出方
   法を適用する請求項２記載の乳癌の判定方法。
4. 【請求項４】 前記免疫学的検出方法が免疫染色法であ
   る請求項３記載の乳癌の判定方法。