JP2002539800A

JP2002539800A - 転写活性のあるｄｎａ断片を製造する方法

Info

Publication number: JP2002539800A
Application number: JP2000606773A
Authority: JP
Inventors: リャン，シャオウ; エル．フェルグナー，フィリップ
Original assignee: ジーンセラピーシステムズインコーポレーテッド
Priority date: 1999-03-24
Filing date: 2000-03-23
Publication date: 2002-11-26
Also published as: AU4032300A; EP1163359A1; US20020037525A1; WO2000056914A1; EP1163359A4; US20060240469A1; US6280977B1

Abstract

(57)【要約】第１のＤＮＡ断片（Ｆ１）、第２のＤＮＡ断片（Ｆ２）、第１のプライマー（Ｐ１）、第２のプライマー（Ｐ２）、第３のプライマー（Ｐ３）及び第４のプライマー（Ｐ４）の存在下での前記ＤＮＡ分子のポリメラーゼ連鎖（ＰＣＲ）増幅を含む、転写活性のあるＤＮＡ分子を製造する方法であって、Ｆ１はプロモーター配列を含み、Ｆ２はターミネーター配列を含み、Ｐ１はＦ１の５’末端に相補的であり、Ｐ２はＦ２の５’末端に相補的であり、Ｐ３はＦ１の３’末端に相補的な第１の領域及び前記ＤＮＡ分子の５’末端に相補的な第２の領域を含み、Ｐ４はＦ２の３’末端に相補的な第１の領域及び前記ＤＮＡ分子の３’末端に相補的な第２の領域を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）（発明の分野）本発明は、転写活性のあるＤＮＡ断片を製造する方法に関する。更に具体的に
は、方法はネストプライマー（nested primer）、プロモーター配列及びターミ
ネーター配列を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ断片の合成
に関する。

【０００２】（関連技術の説明）ヒトゲノムの配列決定において過去数年に行われた莫大な進展に加えて、生物
医学的に重要なその他の生物の配列決定にも努力が払われてきた。例えば、Borr
elia burgdorferi（ライム病の原因）、クラミジア、ヘリコバクター・ピロリ（
Helicobacter pylori）及びMycobacterium tuberculosisiに関して完全なゲノム
配列が得られている。急速に発展した配列情報によって、遺伝子／分子レベルで
関連する生物に関する基礎生物学が明らかになり、種々の病原体に対する新規の
治療法又はワクチンを開発する莫大な機会が提供されている。

【０００３】しかしながら、この莫大な配列情報はまた、何万という候補遺伝子から関心の
ある遺伝子をスクリーニングし、同定するための更にはるかに効率的で合理的な
方法も要求している。遺伝子のスクリーニング及び同定に対する従来のアプロー
チは、ｃＤＮＡライブラリの製造、プラスミドベクター（発現ベクター）へのＤ
ＮＡ挿入によるサブクローニング、各ｃＤＮＡクローンとしての細菌由来のプラ
スミドＤＮＡの精製、及びコードされた遺伝子産生物の機能的分析のために動物
細胞又は組織へのトランスフェクションを必要とする。この方法は、定方向且つ
インフレームのクローニングができるようにｃＤＮＡ断片を製造するためにポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を更に使用することと併せて、未だに時間がかかり
、費用が嵩み、且つ自動化するのが困難である。

【０００４】本発明は、転写活性のあるＤＮＡ断片を製造する簡単で迅速な方法を提供する
。

【０００５】（発明の概要）本発明の１つの実施態様は、第１のＤＮＡ断片（Ｆ１）、第２のＤＮＡ断片（
Ｆ２）、第１のプライマー（Ｐ１）、第２のプライマー（Ｐ２）、第３のプライ
マー（Ｐ３）及び第４のプライマー（Ｐ４）の存在下での前記ＤＮＡ分子のポリ
メラーゼ連鎖（ＰＣＲ）増幅を含む、転写活性のあるＤＮＡ分子を製造する方法
であって、Ｆ１はプロモーター配列を含み、Ｆ２はターミネーター配列を含み、
Ｐ１はＦ１の５’末端に相補的であり、Ｐ２はＦ２の５’末端に相補的であり、
Ｐ３はＦ１の３’末端に相補的な第１の領域及び前記ＤＮＡ分子の５’末端に相
補的な第２の領域を含み、Ｐ４はＦ２の３’末端に相補的な第１の領域及び前記
ＤＮＡ分子の３’末端に相補的な第２の領域を含み、それによって前記ＰＣＲ増
幅により転写活性のあるＤＮＡ分子を製造する、転写活性のあるＤＮＡ分子を製
造する方法である。好ましくは、Ｆ１はサイトメガロウイルスのＩＥプロモータ
ーである。好ましい実施態様の1つでは、転写活性のあるＤＮＡ分子は、治療遺
伝子をコードする。方法は更に、ＰＣＲ増幅に先だって、Ｐ１及びＰ２の５’末
端にＰＮＡ尾部を付加する工程を含んでもよい。好ましくは、チミジン塩基は、
第３のプライマーＰ３、と第１のＤＮＡ断片Ｆ１の間の相補的な領域の直前に先
行する。好ましいもう１つの実施態様では、チミジン塩基は、第３のプライマー
Ｐ３、と第２のＤＮＡ断片Ｆ２の間の相補的な領域の直前に先行する。方法はま
た、前記ＰＣＲ増幅の後に前記転写活性のあるＤＮＡにＰＮＡクランプ（clamp
）を付加する工程を更に含んでもよい。好ましくは、方法は、ＰＣＲ増幅の前に
、リンカー（ＰＮＡクランプの尾部）を介してＰＮＡ分子をＰ１及びＰ２プライ
マーに付加する工程を更に含む。

【０００６】（好ましい実施態様の詳細な説明）本発明は、発現ベクターへのサブクローニング、および細菌からのプラスミド
ＤＮＡ精製の必要のない、従来のトランスフェクション技術によって容易に動物
細胞又は組織にトランスフェクションすることのできる、転写活性のあるＤＮＡ
断片を製造する簡単で迅速な方法を提供する。ネストオリゴヌクレオチド・プラ
イマー及び２つのＤＮＡ断片（１つは活性のある転写プロモーター配列を含み、
１つは塩基性転写ターミネーター成分を含む）を用いて、関心のあるいかなる遺
伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によっても、転写活性のあるＤＮＡ
断片が合成される。第１のプライマーはプロモーターを含むＤＮＡ配列に相補的
であり、第２のプライマーはターミネーターを含むＤＮＡ断片に相補的であり、
第３のプライマーは、プロモーター配列と関心のある遺伝子の一端の両方に相補
的であり、且つ第４のプライマーは、ターミネーター配列と関心のある遺伝子の
もう一方端の両方に相補的である。このようなプロモーター、遺伝子及びターミ
ネーターは図１に示されるように発現カセット内で連結されている。更に、図３
及び４に示されるように、ペプチド核酸（ＰＮＡ）配列及びＰＮＡクランプを組
み入れることによって、トランスフェクションの間及びその後、発現カセットを
含有する線状ＤＮＡの末端をエクソヌクレアーゼの消化から保護することができ
る。

【０００７】本明細書で使用するとき、用語「プロモーター」は、転写開始部位から上流に
延び、且つＰＮＡポリメラーゼの結合に関与するＤＮＡ配列である。プロモータ
ーは、一般に２００塩基対以上にわたり散在する転写因子に結合する数個の短い
（＜１０塩基対）配列成分を含有してもよい。一般的な上流の因子によって認識
される成分のみを含有するプロモーターは、通常、いかなる種類の細胞において
も転写される。かかるプロモーターは、構成成分として発現される細胞性遺伝子
（ハウスキーピング遺伝子と呼ばれることもある）の発現に関与する可能性があ
る。重金属イオン及びグルココルチコイドによって上方制御されるヒト・メタロ
チオネイン（金属結合性蛋白質）プロモーターのような特定の種類の細胞に限定
された組織特異的なプロモーターもある。

【０００８】本明細書で使用するとき、用語「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼに
より転写の終了がもたらされる転写配列の末端にあるＤＮＡ配列である。これは
、切断及びポリアデニル化によって生じる成熟３’末端の下流の不連続部位で起
きる。

【０００９】既知の配列と共に所望の遺伝子をも発現する、ヌクレアーゼに抵抗性で且つ転
写活性のある線状ＤＮＡ分子を迅速に製造するために本方法を使用することがで
きる。次いで、機能的解析、ワクチン接種及びその他の医薬的応用のために動物
細胞又は組織に線状ＤＮＡを送達することができる。本方法はまた、毒性及び安
定性のような細菌の増殖に関わる問題を回避している。また高速処理能力のスク
リーニング法として使用するために本方法を完全に自動化することができる。

【００１０】図１を参照すれば、オリゴヌクレオチド・プライマー、Ｐ１及びＰ２はそれぞ
れ、ＤＮＡ断片、Ｆ１及びＦ２の５’領域に相補的である。断片Ｆ１は転写プロ
モーター（黒っぽい領域）を含み、Ｆ２は転写ターミネーター（黒っぽい領域）
を含む。プライマーＰ３及びＰ４はそれぞれ、Ｆ１及びＦ２の３’末端、並びに
遺伝子Ｘを含有するＤＮＡ断片の別々の端に対して相補的である。図１は、遺伝
子Ｘを含むＤＮＡ鋳型にＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｆ１及びＦ２を加えた場合、
ＰＣＲを基にした本方法において形成される推定上の中間生成物及び最終産物を
示す。反応中生成される中間生成物の量を最小限にするために、反応混合物に存
在するプライマーＰ１及びＰ２の量が好ましくはＰ３、Ｐ４、Ｆ１及びＦ２の量
よりも少なくとも約１００倍多いことに注目すべきである。第１の中間体を生成
するために、Ｆ１及びＦ２のプロモーター配列及びターミネーター配列から遺伝
子Ｘに向かって増幅するプライマーＰ３及びＰ４が用いられ、その結果、このよ
うな配列の間で末端及び遺伝子Ｘ上にプロモーター配列及びターミネーター配列
を有する中間体を生じる。

【００１１】相補的なプロモーター配列及びターミネーター配列（黒っぽい領域）を介した
断片Ｆ１及びＦ２と第１の中間体とのハイブリッド形成によって第２の中間体が
形成され、続いてＰ３及びＰ４からのＰＣＲ増幅によって結果としてＦ１、Ｆ２
及び遺伝子Ｘ全体を含むＤＮＡ断片を生じる。

【００１２】反応の最終工程では、プライマーＰ１及びＰ２を用いた第２の中間体のＰＣＲ
増幅により、結果的に増幅された量の完全な転写活性のあるＤＮＡ断片を生じる
。

【００１３】すべての成分を1つに混合することによって本発明の方法を実行してもよい。
別の方法としては、２回の別々のＰＣＲ反応を行うことができる。第１の反応で
は、鋳型遺伝子、Ｐ３及びＰ４が最初に使用される。次いで、断片、Ｆ１及びＦ
２、加えてプライマーＰ１及びＰ２を含む第２のＰＣＲ反応のために、この反応
の産物を鋳型として使用する。

【００１４】上述したネストＰＣＲ法（nested PCR）を用いた最終産物の生成は、Ｐ３及び
Ｐ４とそれぞれ部分的に重なる領域との接合部におけるＦ１及びＦ２断片の配列
に依存する。このことは、少なくとも幾分かは、ＰＣＲプロトコールで一般に使
用されているＴａｑＤＮＡポリメラーゼによって合成されたＰＣＲ断片の３’
末端における余分なアデノシン塩基（Ａ）の付加によっている。これによって、
Ｐ３／Ｐ４によって製造されたＰＣＲ中間体と断片Ｆ１及びＦ２によって製造さ
れたＰＣＲ中間体の間のミスマッチを生じ得る。

【００１５】従って、好ましい実施態様では、ＰＣＲ中間体（Ｐ３プライマー）とＦ１、及
びＰ４／Ｆ２の間の重複は、チミジン塩基（Ｔ）が、断片Ｆ１及びＦ２（図２、
Ｆ１のみを示す）における重複領域の直前に先行するように設計される。この場
合、ＰＣＲ増幅中は、中間体の３’末端に「Ａ」塩基を更に付加することによっ
て、Ｆ１／Ｆ２とそれぞれのＰＣＲ中間体との重複は依然として完全に維持され
る。

【００１６】ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、デオキシリボースリン酸の主鎖の全体が、化学的
に完全に異なるが、しかし構造的には相同の２−アミノエチルグリシン単位を含
有するポリアミド（ペプチド）主鎖と交換されている核酸の類縁体である。高度
に負に荷電するＤＮＡとは異なって、ＰＮＡ主鎖は中性である。従って、ＰＮＡ
−ＤＮＡのハイブリッドにおける相補的な鎖間では、対応するＤＮＡ−ＤＮＡハ
イブリッドに比べて反発エネルギーがはるかに少なく、その結果はるかに安定性
が大きい。

【００１７】更に、３つの８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸単位を含有する柔軟な
ヘアピンリンカーにより接続された２つの同一のＰＮＡ配列を有する、ＰＮＡ「
クランプ」と呼ばれる分子が合成されている。相補的なホモプリン又はホモピリ
ミジンのＤＮＡ標的配列とＰＮＡクランプを混合すると、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮ
Ａの三重ハイブリッドを形成することができ、それは極めて安定である（Bentin
et al., Biochemistry 35: 8863-8869, 1996; Egholm et al., Nucleic Acids
Res., 23:217-222, 1995; Griffith et al., J. Am. Chem. Soc., 117:831-832,
1995）。配列特異的及び高親和性の二重及び三重のＰＮＡ結合は広く記載され
ている（Nielsen et al., Science, 254:1497-1500, 1991; Egholm et al., J.
Am. Chem. Soc., 114:9677-9678, 1992; Egholm et al., Nature, 365:566-568,
1993; Almarsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:9542-9546, 19
93; Demidov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92:2637-2641, 1995）
。それらは、ヌクレアーゼ及びプロテアーゼの消化に抵抗性であることも明らか
にされている（Demidov et al., Biochem. Pharm., 48:1010-1013, 1994）。

【００１８】代表的なＰＮＡクランプを図３及び図４に示す。このＰＮＡクランプ又は所望
のＤＮＡ配列を有するＰＮＡクランプは、Ｅｇｈｏｌｍら（上記）によって記載
されたように合成され、又はパーセプティブ・バイオシステムズ（マサチューセ
ッツ州、フレーミングハム）から入手可能である。図２及び図３に示された代表
的なＰＮＡクランプは、配列５’−ＴＣＴＣＴＣＴＣ−Ｏ−Ｏ−Ｏ−ＴＪＴＪＴ
ＪＴＪ（配列番号１）を有し、その際Ｊ（プセウドイソシトシン）はＣの類縁体
であり、「Ｏ」残基は、ＰＮＡの２つの領域を分ける８−アミノ−３，６−ジオ
キサオクタン酸リンカーである。

【００１９】上述されている転写活性のあるＰＣＲ断片の末端を保護するためのＰＮＡ尾部
、ＰＮＡクランプ及びＰＮＡ「クランプ尾部」の使用は、図３に説明されている
。図１に示されるように製造されたＰＣＲ断片の末端は、細胞又は組織にトラン
スフェクションされた後、エクソヌクレアーゼによって消化される傾向がある。
この分解を阻害する２つの戦略を図３及び図４に示す。図１では、ＰＮＡ尾部と
短いＤＮＡ配列（５’−ＧＡＴＣ−Ｏ−ＴＣＴＣＴＣＴＣ−３’；配列番号２）
が、プライマーＰ１及びＰ２の５’末端に付加され、それが標的配列５’−ＧＡ
ＧＡＧＡＧＡ−３’（配列番号：３）に結合する。これによってＰＣＲ中に反対
側の鎖の３’末端でＰＮＡ結合部位を生じる。ＰＮＡ尾部を含有するプライマー
は、公知の方法を用いて合成することができ、又はパーセプティブ・バイオシス
テムズから入手可能である。このようなＰＮＡ尾部は標的配列とハイブリッド形
成しないが、エクソヌクレアーゼの消化から５’末端を保護する。ＰＣＲ断片の
５’末端を保護するために、３’−ＰＮＡ保護ＰＣＲ断片にＰＮＡ分子を付加す
る。このＰＮＡ尾部は、ＰＣＲ断片の３’末端に相補的なＤＮＡ配列を含有して
おり、図２に示すようにそれに結合する。

【００２０】代わりのＰＮＡ保護アプローチが図４に示されている。この方法では、ＰＮＡ
クランプは１又はそれより多くの８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸リン
カーを介してプライマーＰ１及びＰ２に結合し、周知の方法によってＰＮＡ「ク
ランプ」の尾部を形成する。ＰＣＲ増幅の後、「クランプ尾部」はＰＣＲ断片の
３’末端に結合し、１又はそれより多くの８−アミノ−３，６−ジオキサオクタ
ン酸リンカーを介して５’末端に接続してＰＣＲ断片の３’及び５’末端を保護
する。

【００２１】本明細書では、ＣＭＶのＩＥプロモーター及び人工的な哺乳類の転写ターミネ
ーター成分を例示するが、いかなる真核細胞のプロモーター及びターミネーター
の使用も本発明の範囲内である。本発明で使用するのに適したプロモーターには
、例えば、ＳＶ４０、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、レトロウイルスの長末端
反復（ＬＴＲ）、筋肉クレアチンキナーゼのプロモーター、アクチンプロモータ
ー、延長因子プロモーター、合成プロモーター、組織特異的プロモーターなどが
挙げられる。適したターミネーター配列には、ＳＶ４０の転写ターミネーター、
ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）のターミネーター、合成ターミネーターなどが挙げ
られる。このようなプロモーター及びターミネーター配列は、市販されているプ
ラスミド及びｃＤＮＡ分子の制限酵素消化によって入手することができ、又は当
業者に良く知られた方法により自動ＤＮＡ合成機を用いて合成することができる
。

【００２２】本発明の方法を用いて、いかなる所望の遺伝子を増幅してもよいし、それを活
性のあるプロモーター配列及びターミネーター配列に結合させてもよい。好まし
い実施態様では、遺伝子は生物において存在しないか、又は減弱されたレベルで
存在する遺伝子産物をコードする。このような限定されない遺伝子産物の例は、
嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）、インスリン、ジストロフィン、イン
ターロイキン−２、インターロイキン−１２、エリスロポエチン、γ−インター
フェロン、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である
。

【００２３】本発明の転写活性のあるＰＣＲ断片により細胞又は組織へのトランスフェクシ
ョンを行うために、カルシウムリン酸沈殿、エレクトロポレーション及びＤＥＡ
Ｅ−デキストランを含む当業者に知られたいかなるトランスフェクション法を用
いてもよいが、陽イオン脂質が介在するトランスフェクションが好ましい。遺伝
子送達システムは、Ｆｅｌｇｎｅｒらによって記載されており（Hum. Gene Ther
., 8:511-512, 1997）、陽イオン脂質を基にした送達システム（リポプレックス
）、ポリカチオンを基にした送達システム（ポリプレックス）及びその組合せ（
リポポリプレックス）が挙げられる。陽イオン脂質は米国特許第４，８９７，３
５５号及び第５，４５９，１２７号に記載されている。

【００２４】実施例１転写活性のあるＰＣＲ断片の製造以下の成分を１００μｌの反応容量で混合する。初期遺伝子（ＩＥ）のプロモ
ーター／エンハンサーに隣接したヒト・サイトメガロウイルスに由来する高度に
転写能のある領域（−２４０〜＋６０）を含むＤＮＡ断片Ｆ１（４ｎｇ）、ＤＮ
Ａ断片Ｆ２（４ｎｇ）、人工的な哺乳類転写ターミネーター成分をコードする５
５塩基対のオリゴヌクレオチド（５’−ＣＡＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＣ
ＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＣＴＣＴＧＡＴＣＴＴＴＴＡＴＴＡＧＣＣＡＧＡＡＧ
Ｔ−３’；配列番号４）、４００ｎｇのプライマーＰ１（５’−ＴＣＴＣＴＣＴ
ＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧ−３’；配列番号５）、４００ｎｇのプライマ
ーＰ２（５’−ＴＣＡＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧ−３’；配列番号
６）、４ｎｇのプライマーＰ３及び４ｎｇのプライマーＰ４。Ｐ１及びＰ２プラ
イマーの配列はそれぞれ、断片Ｆ１の５’末端及び断片Ｆ２の５’末端に相当す
る（図１）。プライマーＰ３及びプライマーＰ４は関心のある遺伝子配列に基づ
いて設計される。このようなプライマーの３’部分は（約１０〜２０塩基対）、
増幅されるべき遺伝子の実際の配列によって決定されるが、Ｐ３の５’領域は、
Ｆ１の３’領域と重複するために以下の配列：５’−ＣＴＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣ
ＡＧＡ−３’（配列番号７）を含み、Ｐ４は、Ｆ２の３’領域と重複するために
配列：５’−ＴＴＡＴＴＡＧＣＣＡＧＡＡＧＴ−３’（配列番号８）を含む。

【００２５】ＰＣＲは以下のように実行される。９４℃にて３０秒間の変性、５５℃にて４
５秒間のアニーリング及び７２℃にて３分間の伸展を２５〜３０サイクル行う。
１％のアガロースゲル電気泳動によって最終産物のサイズを確認する。市販のＰ
ＣＲ洗浄キット（例えば、キアゲン）を用いて増幅されたＰＣＲ断片を洗浄して
、精製し、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）又はインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）に
て細胞又は組織へのトランスフェクションを行うのに使用することができる。

【００２６】実施例２標的遺伝子として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ７００塩基対）を用いた。Ｆ１
断片はＣＭＶの前早期発現遺伝子プロモーター（−５５０〜＋５０）の６００塩
基対断片であった。改変したウサギβグロビン遺伝子の転写ターミネーターを含
有する５０塩基対のオリゴヌクレオチドをプライマー２として用いた。Ｆ１と中
間体ＧＦＰのＰＣＲ断片との間の重複がチミジン塩基又はチミジン塩基以外に先
行されるようにこのようなプライマーの２つの異なった型を設計した。ＰＣＲの
後、実施例１に記載された条件に従って反応を行い、電気泳動によって生成物を
分析した。チミジン塩基がＦ１の重複領域に先行する場合、約１．４ｋｂのきれ
いな主たるＰＣＲ断片が製造され、ＣＭＶのプロモーター（Ｆ１）及び転写ター
ミネーターに隣接するＧＦＰコーディング領域を表していたが、チミジン以外の
塩基が重複領域に先行した場合、生成物は作られなかった。次いでネストＰＣＲ
によって製造された断片をＣｏｓ−７細胞へトランスフェクションを行い、蛍光
顕微鏡にてＧＦＰの発現をモニターした。結果は、ＰＣＲ断片でトランスフェク
ションを行った細胞と同一のＣＭＶプロモーターがＧＦＰ遺伝子の発現を操作し
ている高次コイルプラスミドＤＮＡでトランスフェクションを行った細胞との間
で、ＧＦＰを発現している細胞の強度と頻度はほぼ同じであることを示した。従
って、本発明の方法は、転写活性のあるＤＮＡ断片を生じた。

【００２７】本発明の特定の実施態様を詳細に説明したが、これらの実施態様は限定ではな
く例示であり、本発明の正当な範囲は次の特許請求の範囲で定義されることは当
業者には明らかであろう。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明の遺伝子増幅法の模式図である。オリゴヌクレオチド・プライマ
ーＰ１及びＰ２はそれぞれ、プロモーター配列（Ｆ１）の５’末端及びターミネ
ーター配列（Ｆ２）の３’末端と相補的である。Ｐ３及びＰ４は、遺伝子Ｘの反
対端に相補的な領域を含有するオリゴヌクレオチドプライマーである。更に、Ｐ
３及びＰ４は、Ｆ１の３’領域及びＦ２の５’領域に相補的である領域を含有す
る。過剰量のプライマーＰ１及びＰ２が、遺伝子Ｘと、又は遺伝子Ｘを含有する
ＤＮＡの混合物と、及びＦ１、Ｆ２、Ｐ３並びにＰ４と、又はＦ１、Ｆ２並びに
Ｐ３及びＰ４を用いたＰＣＲで増幅された遺伝子Ｘを含有するＤＮＡの混合物と
組み合わせられ、そしてＰＣＲによって、Ｆ１、Ｆ２及び遺伝子Ｘを含有する転
写活性のある線状ＤＮＡを生じる。

【図２】図２はＰＣＲ中間生成物（プライマーＰ３）と相補的な領域の直前に先行する
チミジン塩基を含有するＤＮＡ断片Ｆ１を示す模式図である。

【図３】図３は線状発現ＤＮＡ断片の末端を保護するためにペプチド核酸（ＰＮＡ）配
列及びＰＮＡクランプを使用することを示す模式図である。プライマー、Ｐ１及
びＰ２は、タンパク質分解及びエクソヌクレアーゼの分解に抵抗性であるＰＮＡ
尾部を含有する。得られた線状発現ＤＮＡ断片は、各５’末端にＰＮＡ尾部を含
有する。タンパク質分解及びエクソヌクレアーゼの分解に抵抗性であるＰＮＡの
「クランプ」を添加することによって３’末端もまた保護されている。

【図４】線状発現ＤＮＡ断片の５’末端を保護するためにＰＮＡ「クランプ」の尾部を
使用し、続いて３’末端を保護するためにＰＣＲ中にクランプを形成することを
示す模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者フェルグナー，フィリップエル．アメリカ合衆国カリフォルニア 92067 ランチョサンタフェピー．オー．ボックス 3392 ラスパロマス 5412 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA04 CA10 FA02 FA07 HA17 4B063 QA01 QQ42 QR08 QR42 QR62 QS25 QS34 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】第１のＤＮＡ断片（Ｆ１）、第２のＤＮＡ断片（Ｆ２）、第
１のプライマー（Ｐ１）、第２のプライマー（Ｐ２）、第３のプライマー（Ｐ３
）及び第４のプライマー（Ｐ４）の存在下での前記ＤＮＡ分子のポリメラーゼ連
鎖（ＰＣＲ）増幅を含む、転写活性のあるＤＮＡ分子を製造する方法であって、Ｆ１はプロモーター配列を含み、Ｆ２はターミネーター配列を含み、Ｐ１はＦ１の５’末端に相補的であり、Ｐ２はＦ２の５’末端に相補的であり、Ｐ３はＦ１の３’末端に相補的な第１の領域及び前記ＤＮＡ分子の５’末端に
相補的な第２の領域を含み、Ｐ４はＦ２の３’末端に相補的な第１の領域及び前記ＤＮＡ分子の３’末端に
相補的な第２の領域を含み、それによって前記ＰＣＲ増幅により転写活性のある
ＤＮＡ分子を製造する、転写活性のあるＤＮＡ分子を製造する方法。
【請求項２】Ｆ１がサイトメガロウイルスのＩＥプロモーターである請求
項１の方法。
【請求項３】転写活性のあるＤＮＡ分子が治療遺伝子をコードする請求項
１の方法。
【請求項４】前記ＰＣＲ増幅の前にＰ１及びＰ２の５’末端にＰＮＡの尾
部を付加する工程を更に含む請求項１の方法。
【請求項５】前記ＰＣＲ増幅の後に前記転写活性のあるＤＮＡ分子にＰＮ
Ａクランプを付加する工程を更に含む請求項１の方法。
【請求項６】前記ＰＣＲ増幅の前にプライマーＰ１及びＰ２にリンカー（
ＰＮＡのクランプ尾部）を介してＰＮＡ分子を付加する工程を更に含む請求項１
の方法。
【請求項７】前記第３のプライマーＰ３と前記第１のＤＮＡ断片Ｆ１との
間の相補的な領域の直前にチミジン塩基が先行する請求項１の方法。
【請求項８】前記第４のプライマーＰ４と前記第２のＤＮＡ断片Ｆ２との
間の相補的な領域の直前にチミジン塩基が先行する請求項１の方法。