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JP2002539845A - 精神分裂病関連遺伝子、タンパク質およびバイアレリックマーカー - Google Patents

精神分裂病関連遺伝子、タンパク質およびバイアレリックマーカー

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Publication number
JP2002539845A
JP2002539845A JP2000608788A JP2000608788A JP2002539845A JP 2002539845 A JP2002539845 A JP 2002539845A JP 2000608788 A JP2000608788 A JP 2000608788A JP 2000608788 A JP2000608788 A JP 2000608788A JP 2002539845 A JP2002539845 A JP 2002539845A
Authority
JP
Japan
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biallelic marker
seq
polynucleotide
sequence
sbg1
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2000608788A
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English (en)
Inventor
コーヘン、ダニエル
ブルメンフェルド，マルタ
シュマコフ，イルヤ
ブーグレット，リディー
ビハイン，ベルナルド
エシォー，ローレント
Original Assignee
ジェンセット
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ジェンセット filed Critical ジェンセット
Publication of JP2002539845A publication Critical patent/JP2002539845A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトのsbg1、g34665、sbg2、g35017およびg35018遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、バイアレリックマーカーならびにヒト染色体13q31-q33バイアレリックマーカーに関する。また、本発明は、精神分裂病および双極性障害と、バイアレリックマーカーと、sbg1、g34665、sbg2、g35017およびg35018遺伝子およびヌクレオチド配列との間に確立された関連性にも関する。本発明によれば、精神分裂病、双極性障害および関連疾患の治療に有用な化合物を同定するための手段、前記疾患に対する個体の素因を判定するための手段、ならびに該疾患の診断および予後判定のための手段が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 (技術分野) 本発明は、ヒトのsbg1遺伝子、g34665遺伝子、sbg2遺伝子、g35017遺伝子およ
びg35018遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドバイアレリックマーカーおよ
びヒト染色体13q31-q33のバイアレリックマーカーに関する。また、本発明は、
精神分裂病および双極性障害、バイアレリックマーカー、sbg1遺伝子、g34665遺
伝子、sbg2遺伝子、g35017遺伝子およびg35018遺伝子、ヌクレオチド配列の間に
構築される関連性にも関する。本発明によれば、精神分裂病、双極性障害および
関連疾患の治療に有用な化合物を同定するための手段、前記疾患に対する個体の
素因を判定するための手段ならびに疾患の診断・予後判定手段が得られる。
【０００２】 (背景技術) 一般治験医および臨床治験医が利用できる技術的な設備全般の進歩によって、
健常な脳や神経系と疾患のある脳や神経系の機能について次第に高度な研究を行
うことが可能になっている。精神病性障害および神経変性疾患を含む中枢神経系
(CNS)の疾患に関与する神経化学的機序および遺伝的機序に関して、神経生物学
的および薬理学的な仮説が非常に多く提唱されている。しかしながら、CNS疾患
の病因は複雑でほとんど解明されておらず、その症状に重畳が認められる上に特
徴にも不明な点が多く、症状を判断するのが困難である。したがって、将来的な
治療計画や医薬品開発作業を一層高度化して多重遺伝子的な原因に目を向けなけ
ればならず、セグメント疾患個体群に対する新たなアッセイが必要である。これ
によってCNS疾患に羅患した患者に関する一層正確な診断・予後判定情報が得ら
れることになるであろう。
【０００３】 (CNS疾患の神経学的基礎) 全身でのシグナル伝達物質として機能するものに神経伝達物質がある。このた
め、神経伝達に影響をおよぼす疾患は深刻な結果につながりかねない。たとえば
、30年以上もの間、鬱状態などの多くの精神病性障害を説明する上で生物学的な
根拠となる最も有力な理論はモノアミン仮説であった。この理論では、3種類の
主な生体モノアミンすなわち、ドーパミン、ノルエピネフリンおよび/またはセ
ロトニンのうち1つが欠けることが鬱状態に何らかの形で影響しているのではな
いかとされている。
【０００４】 モノアミン仮説だけに限らず、非常に多くの議論から、単一の神経系だけにつ
いて検討するのではなく、脳の全体としての機能を考慮することに価値があると
思われることが多い。これに関連して、第2および第3のメッセンジャー系を含む
中枢のアミン作動系に対する特定の二元的作用の価値が浮彫にされてきている。
【０００５】 (CNS疾患の内分泌的な基礎) さらに、多くのCNS疾患の病理生理学には、主なモノアミン系すなわち、ドー
パミン、ノルエピネフリンおよびセロトニンでは完全に説明できない面があるこ
とは知られている。特に、CNS疾患には内分泌的な要因があるのは明らかである
。コルチコトロピン放出因子およびグルココルチコイドによる作用を始めとする
視床下部-下垂体-副腎(HPA)系が、CNS疾患の病理生理学において重要な役割を果
たしている。
【０００６】 視床下部-下垂体-副腎(HPA)系では、ホルモンの分泌を調節する階層の一番上
が視床下部である。視床下部は、脳の基底部で下垂体に作用するペプチド(アミ
ノ酸の短い鎖)を生成して放出し、下垂体によるさまざまなホルモンの血液中へ
の放出を刺激または抑制する。これらのホルモンには、成長ホルモン、甲状腺刺
激ホルモンおよび副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)などがあり、標的となる腺からの
他のホルモンの放出を制御している。下垂体ホルモンに応答して放出されるホル
モンは、神経系の外で機能するだけでなく下垂体や視床下部にもフィードバック
される。下垂体および視床下部では、これらのホルモンによって、過剰なホルモ
ン生合成を制限すべく機能する阻害信号が送達される。
【０００７】 (CNS疾患) 神経伝達物質およびホルモンの異常は、運動障害(たとえばパーキンソン病、
ハンチントン病、運動ニューロン病など)、気分障害(たとえば単極性鬱状態、双
極性障害、不安など)、知能が関与する疾患(たとえばアルツハイマー病、レビー
小体を伴う痴呆、精神分裂病など)と密接に結びついている。また、これらの系
は、昏睡、頭部損傷、脳梗塞、癲癇、アルコール依存症、特に幼児期に見られる
代謝が原因の精神遅滞状態などの他の多くの疾患とも密接に結びついている。
【０００８】 (複雑な形質の遺伝的解析) 最近まで、検出可能な形質にリンクした遺伝子の同定は主に連鎖解析と呼ばれ
る統計学的な方法に基づくものであった。連鎖解析では、一家系内で複数の世代
にわたって遺伝マーカーの伝達と特定の形質の伝達との間の相関を確立すること
を基本としている。連鎖解析では、羅患した個体を複数含む家系について研究す
るため、遺伝する形質を検出する上で有用である。この形質は、単一の遺伝子に
よって引き起こされることもあれば、極めて少数の遺伝子によって生じることも
ある。しかしながら、連鎖解析を複雑な遺伝的形質に適用するのは困難であるこ
とが分かっている。医学的に関連しているほとんどの形質は、メンデルの法則に
従った単一遺伝子病ではないためである。しかしながら、複雑性疾患は特定の家
系に集中することが多いことから、何らかの遺伝的要素が見出されるのではない
かと思われる。複雑な形質は複数の遺伝子による作用や環境的な要因が相まって
生じることが多い。このような複雑な形質としては、心臓疾患、高血圧、糖尿病
、癌および炎症性疾患などに対する感受性があげられる。薬物の薬効、応答およ
び耐性/毒性も、複雑性疾患として同様に遺伝的要素に関与する多因子形質であ
るとみなされる場合がある。いずれにしても情報性のある家系がない形質の研究
に連鎖解析を利用することはできない。さらに、浸透率が低いため、このような
複雑な形質が世代間で継承される場合もメンデルの法則に従った明確な区切りが
あるわけではない。このような疾患をマッピングしようと試みられてはいるが、
決定性に欠けることに悩まされ続けていることから、一層先進的な遺伝ツールが
必要であることが分かる。
【０００９】 疾患に対する感受性が高い人や治療に対して異なる応答をする人がいるのは何
故なのかを知るには、神経系および内分泌系における遺伝的なバリエーションに
ついて理解することが重要である。遺伝的多型を同定し、この多型が疾患の羅患
性や治療に対する応答性にどのように影響するかを解析してこれを予測するため
の方法が必要とされている。
【００１０】 神経系および内分泌系に関与している遺伝子は主な標的薬物であり、薬学的な
研究調査と密接に関連しているが、それでもこれらの遺伝子とその調節要素の配
列のバリエーションの程度および性質については限られた知識しか持っていない
。多型が同定されている場合でもバリエーションでの関連性はほとんど明らかに
なっていない。多重遺伝子的な形質または定量的な形質にどの遺伝子が関わって
いるのか判定する上で多型を遺伝マーカーとして利用できるのは間違いないので
あるが、このようなマーカーを開拓するのに適したマーカーや適した方法は未だ
見出されておらず、脳および神経系の疾患に関連した遺伝子についても解明され
ていない。
【００１１】 こうした目標を達成するための基本は、遺伝的な関連性解析を利用してこれら
の形質の羅患性を予想するマーカーを検出することである。近年、遺伝学および
分子生物学の分野における進歩によって、疾患につながる人間の遺伝子の形態ま
たはアレルを同定できるようになった。人間における疾患の原因となる遺伝的バ
リエーションのうち現在までに同定されているもののほとんどは、単一遺伝子病
のクラスに属するものである。名前から推測できるように、単一遺伝子病が発症
するか否かは単一の遺伝子のアレルによって決まるか、あるいは単一の遺伝子の
アレルによって大きく影響される。単一遺伝子病の原因となるアレルは、一般に
、これらのアレルを保因する個体にとって極めて有害な(かつ極めて浸透性が高
い)ものである。したがって、これらのアレルおよびその関連疾患は、若干の例
外を除いてヒトの個体群では極めて希なものとなることが多い。これとは対照的
に、医薬品に対する生理学的応答などの一般的な疾患形質および非疾患形質の大
半は、多くの複雑な要因の結果として現れてくる場合がある。こうした複雑な要
因には、環境への曝露(毒素、アレルゲン、感染因子、気候および外傷)ならびに
複数の遺伝的要因が含まれる場合がある。
【００１２】 関連性解析では、互いに血縁関係のない(少なくとも直接的な血縁関係はない)
個体からなる個体群に発生した染色体の分布を解析しようとしている。このタイ
プの研究は、一般的な形質の羅患性につながる遺伝的アレルが、その個体群で何
世代にもわたって受け継がれた染色体での昔からの変異イベントによって生じる
のだという仮定のもとになされている。このようなアレルに影響される形質が有
害なものである場合、その形質は問題のアレルを保因する個体のうちごく少数で
しか発現されないため、これらのアレルが普通に見られるようになるのは個体群
全体の一部になる可能性もある。アレルをじかに囲んでいるDNA領域以外では、
遺伝マーカーは組換えというプロセスによって形質羅患性アレルから切り離され
ていくことが多いため、このような「先祖代々の」染色体を同定するのは困難に
なる。羅患性アレルを囲んでいるDNAのフラグメント内に含まれる遺伝マーカー
の同一性は、アレルが発生した先祖代々の染色体から得られる同一性と同じにな
る。したがって、個体群の中に複雑な形質を発現する個体がある場合は、その個
体は形質を発現しない個体よりも高い頻度で羅患性アレル近辺に同一集合の遺伝
マーカーを持っている可能性がある。すなわち、これらのマーカーが形質との関
連性を示すことになるのである。
【００１３】 (精神分裂病) 精神分裂病は主な精神病性障害の中でも最も重篤で衰弱につながるもののひと
つである。精神分裂病は通常、思春期後期または成人した後の早い段階で始まり
、慢性化して身体障害になることも多い。この病気を発症する危険性に男女差は
ないが、ほとんどの男性は16歳から25歳の間に羅患するのに対して女性の場合は
症状が見られるのが25歳から30歳の間である。精神分裂病の人々は「陽性」症状
(妄想、幻覚、支離滅裂な思考および激越など)と「陰性」症状(気力または物事
に対する意欲の減退、社会生活からの引きこもり、無関心および感情鈍磨など)
の両方を経験することが多い。
【００１４】 世界人口の1%が精神分裂病に羅患している。世界中で推定4500万人が精神分裂
病であり、このうち3300万人以上は開発途上国にいるとみられている。この疾患
は、必要になる直接的および間接的な費用と病気に関連して社会的に非難される
という両方の面で、ときには何世代にもわたって患者の家族や親類にとって大き
な重圧となる。このような非難が原因で孤立して怠慢になることも多い。
【００１５】 さらに、精神分裂病はあらゆる精神衛生費の4分の1を占め、精神病院のベッド
3床に1床が精神分裂病患者のために使われている。ほとんどの精神分裂病患者は
決して仕事をすることができない。精神分裂病が社会に与えるコストは甚大であ
る。たとえば米国では、精神分裂病治療のための直接費は国民総生産の0.5%に近
いと推定されている。精神分裂病患者の標準化死亡比(SMR)は一般人口の場合と
比べて2〜4倍高いと推定されており、全体でみた推定寿命は一般人口の場合より
も20%短い。精神分裂病患者の間で最も一般的な死因は自殺(患者の10%)であるが
、これは一般人口の場合と比べて20倍の危険性である。心臓疾患および呼吸器や
消化器系の疾患での死亡も精神分裂病患者の間で増加している。
【００１６】 (双極性障害) 双極性障害は、重篤かつ潜在的な身体障害化作用のある比較的一般的な障害で
ある。患者の社会開発に対する重篤な作用だけでなく、双極性障害の患者間の自
殺完遂率が約15%と報告されている。
【００１７】 双極性障害は、鬱状態を含むことの多い興奮病相を特徴とする障害である。興
奮病相は躁状態または軽躁状態と呼ばれるもので、鬱状態が交互にまたはさまざ
まな混合状態で発生し、さまざまな重篤度でさまざまな期間にわたって発生する
可能性がある。双極性障害はさまざまな形態で存在し得るものである上にさまざ
まな症状を呈するため、双極性障害の分類は幅広い研究の焦点となり、結果とし
て双極性障害のサブタイプが定義され、以前であれば別の障害に羅患していると
された患者まで含む形に全体の概念が広がってきている。双極性障害は、特定の
臨床徴候、症状、治療および神経生物学的な特徴が一般の精神異常と共通してい
ることが多いため、いかに正確な診断を下すかが精神科医にとっての課題のひと
つになっている。さらに、双極性障害、さまざまな気分や精神障害の過程は事例
により大きく異なるため、長期間にわたって疾患を管理するための手段を得るに
は、疾患の特徴をできるだけ早期に特定することが重要なのである。
【００１８】 双極性障害は人口の約1.3%に見られ、精神科外来を受診する患者の気分障害の
約半数を占めると報告されている。双極性障害では、障害のタイプごとに性別に
よる違いが見られることが明らかになっている。たとえば、双極I型障害は男性
と女性で同じように認められるが、双極II型障害は女性に多いと報告されている
。双極性障害の発病年齢は一般に、13歳から19歳の時期であり、診断がなされる
のは一般に患者が20代の前半の頃である。また、双極性障害は、通常は医学的な
機能障害または神経学的な機能障害の結果として高齢者にも発生する。
【００１９】 双極性障害が社会に与えるコストは計り知れない。疾患に関連する躁状態は行
動に弊害を与え、精神病を引き起こし、時には入院に至る。この疾患は、必要に
なる直接的および間接的な費用と病気に関連して社会的に非難されるという両方
の面で、ときには何世代にもわたって患者の家族や親類にとって大きな重圧とな
る。このような非難が原因で孤立して怠慢になることも多い。さらに、年齢が若
ければ若いほど、教育や社会開発が中断されることによる影響は一層重大である
。
【００２０】 双極性障害に関するDSM-IV分類では躁状態または軽躁状態の程度と期間に応じ
て障害を4通りに区別し、一般身体疾患またはその治療によるものであることが
明白なものと物質の乱用によるものとを2通りに区別している。躁状態は、高揚
した、開放的な、または易怒的な気分ならびに注意散漫、衝動行為、活力増大、
誇大感、爽快感、競争心および多弁などによって認識される。躁状態の程度と期
間とに応じて定義される4通りの双極性障害のうち、DSM-IVには以下のものが含
まれる。 少なくとも1週間躁状態が認められる患者を含む双極I型障害。 躁状態よりも興奮した軽症状が認められ、1回のみの躁病エピソードが存在し
以前に大鬱病エピソードが存在しないことが特徴であり、少なくとも4日間軽躁
状態が認められる患者を含む双極II型障害。 双極II型障害の特徴が認められるが4日間の興奮病相の条件は満たさない患者
または大鬱病エピソードは存在しないが軽躁状態が認められる患者を含む、特定
不能の(NOS)双極性障害。 軽躁状態または大鬱状態の条件は満たさないが、2年の期間中一度に２か月を
越える期間症状がなかったことはない、非常に多くの躁病と鬱病とが認められる
患者を含む、気分循環性障害。
【００２１】 DSM-VIにて分類されている残りの2通りの双極性障害は、さまざまな一般身体
疾患およびその治療によることが明白であるまたはこれによって引き起こされた
障害ならびに、物質の乱用に伴うまたは関連した障害である。双極性障害を引き
起こし得る身体障害には一般に、内分泌障害および脳血管傷害が含まれ、双極性
障害を引き起こし得る医学的な治療にはグルココルチコイドおよび刺激物質の乱
用が含まれることが知られている。物資の使用または乱用に関連した障害は「躁
病様または混合性様の物質誘発性気分障害」と呼ばれている。
【００２２】 双極性障害の診断は極めて厄介な場合がある。特に問題の多い難点のひとつが
、混合状態で躁および気分変調または鬱が同時に認められるにもかかわらず、少
なくとも1週間、躁状態および大鬱状態として特定するのに必要な基準のすべて
を毎日満たすわけではないためDSM-IVの分類には当てはまらない患者がいるとい
う点である。また、患者が興奮エピソードと鬱病エピソードとを不規則な周期で
繰り返すことが多いため、病相の期間に基づいて患者をDSM-IVのグループに分類
することにも無理がある。特に、抗鬱剤を使用すると病相の「頻回化」が発生し
て疾患の経過が悪い方に変化する場合があることが報告されている。また、双極
性障害の患者、特に第III期躁状態として知られる状態にある患者には、双極性
障害患者のまとまりを欠く思考や行動が共通して見られることが診断を一層困難
なものとしている。さらに、精神科医は激越鬱状態と混合性躁状態とを鑑別しな
ければならない。大鬱状態の患者が(14日間またはそれ以上)激越状態を示し、結
果として双極性障害に近い特徴が認められることは珍しくない。問題をさらに複
雑にする要素として、双極性障害の患者では、物質、特にアルコールの乱用率が
例外的に高いことがあげられる。アルコール中毒患者での躁病有病率は低いが、
物質乱用者が興奮症状を見せる場合があることは良く知られている。したがって
、物質の乱用歴がある双極性障害患者を診断するのは困難なのである。
【００２３】 (治療) 現在のところ双極性障害または精神分裂病に対する治療法は存在しないため、
治療の目的は症状の重症度を可能な限り寛解点まで落とすことにある。症状が類
似していることから、精神分裂病および双極性障害の治療には同じ薬剤の中から
いくつか選んで使われることが多い。どちらの疾患も抗精神病薬および神経遮断
薬を用いて治療されることが多い。
【００２４】 精神分裂病では、たとえば、抗精神病薬が最も一般的かつ最も有効な治療薬で
ある。精神分裂病に対して一般に処方されている抗精神病薬には主に4種類ある
。第1に、クロルプロマジン(トラジン)に代表される神経遮断薬は、陽性(精神病
)症状を軽減し、その再発を防止することで、精神分裂病患者の治療に革命をも
たらしている。クロルプロマジンを投与された患者は精神病院から出てコミュニ
ティプログラムに参加したり自宅で生活したりすることが可能になっている。し
かしながら、これらの薬物はとても理想的なものとは言えない。患者の20%から3
0%前後は神経遮断薬に全く応答せず、他方ではいずれ病気が再発する患者もいる
。これらの薬物は、手足の硬直および震え、筋痙攣、異常な身体運動および噴門
無弛緩症(落ち着きがなくそわそわした状態)を始めとする重大な神経学的副作用
を伴うことから、神経遮断薬と名付けられた。これらの副作用は、多くの患者が
薬の摂取をあっさり拒否するほど厄介なものである。それ以外に、神経遮断薬を
服用しても精神分裂病のいわゆる陰性症状は改善されず、副作用によって症状が
悪化することすらある。このため、神経遮断薬は明らかに有効であるとはいえ、
短い期間で良好な応答が見られた患者ですら最終的に全身機能が悪化してしまう
ことがある。
【００２５】 標準的な神経遮断薬に欠点があることは十分知られているため、新たな治療薬
を模索する動きが活発化し、非定型神経遮断薬と呼ばれる新たな種類の薬物が登
場した。最初の非定型神経遮断薬であるクロザピンは、標準的な神経遮断薬には
応答しない患者の約3分の1で有効である。クロザピンは陽性症状だけでなく陰性
症状も軽減するか、あるいは少なくとも標準的な神経遮断薬を用いる場合よりは
陰性症状の悪化度が低いように見える。さらに、全身の機能に対して効果があり
、精神分裂病患者が自殺を図る機会を減らせる場合もある。この薬を使用しても
標準的な神経遮断薬の場合のような厄介な神経症状が生じることはなく、ホルモ
ンプロラクチンの血中濃度の上昇も認められない。ホルモンプロラクチンが過剰
になると、女性では月経不順や不妊症、男性ではインポテンツや乳房肥大が生じ
る場合がある。このため、クロザピンは標準的な神経遮断薬に対する耐性のない
多くの患者に利用されてきた。しかしながらクロザピンには重大な制約がある。
クロザピンは、無顆粒球症すなわち死に至ることもある白血球細胞の産生異常の
原因となり得ることから、かつて市場から回収されたものであった。無顆粒球症
は依然として慎重な監視と定期的な血液検査が必要な脅威であることに変わりは
ない。また、クロザピンは突発的な発作や他の体調不良の副作用(眠気、血圧低
下、流涎、寝小便、体重増加など)の原因になることもある。したがって、通常
は他の薬物に応答しない患者に限って処方される。
【００２６】 研究者らによって、クロザピンの短所がなく長所のみを持つ第3の種類の抗精
神病薬が開発された。これらの薬物のひとつがリスペリドン(リスパダール)であ
る。初期の研究では、陽性症状に対しては標準的な神経遮断薬と同程度に有効で
あり、陰性症状に対しては標準的な神経遮断薬よりも若干有効性が高いとされて
いる。神経学的な副作用はクロザピンよりも大きいが、標準的な神経遮断薬より
は少ない。しかしながらプロラクチン濃度が上昇する。現在のところ、リスペリ
ドンは広範囲にわたる精神病患者に処方されており、標準薬に応答しない患者に
対しては、より安全性が高いと思われることから多くの臨床医がクロザピンより
も前にリスペリドンを使う。もうひとつの新たな薬物が、標準薬と比して陽性症
状に対しては少なくとも同程度に有効であり、陰性症状に対しては有効性が高い
オランザピン(ジプレキサ)である。通常の臨床用量では神経学的な副作用は少な
く、プロラクチン濃度を大幅に上昇させることもない。クロザピンを使用する場
合に生じる無顆粒球症などの厄介な副作用はほとんど発生しないが、オランザピ
ンを服用している患者の中には鎮静症状や目眩がしたり、口渇の発症や体重増加
が認められたりする場合がある。希ではあるが、肝機能試験において一過性の異
常が見られることもある。
【００２７】 精神分裂病での成果に関する研究は通常、病院での治療研究に基づくものであ
り、精神分裂病患者の個体群を代表するものとは限らない。極端な場合の成果で
は、患者の20%はひとつの精神病エピソード後に完全に回復するように見えるが
、患者の14〜19%は寛解期のない慢性精神病を発症し、完全に回復することはな
い。一般に、5年目での臨床成果は3分の1の規則に沿っているように思われる。
すなわち、患者の約35%が思わしい成果を上げることのできなかったカテゴリ、3
6%が良好な成果の得られたカテゴリ、残りが中程度の成果が得られたカテゴリに
分類される。精神分裂病の予後は5年経過後もさらに悪化するようには思えない
。
【００２８】 理由の如何を問わず、精神分裂病の経過のうち早期にあたる時期にこの病気を
長期間治療せずにおくと、成果にマイナスの影響が出る場合があるのだというは
っきりとした証拠が増え続けている。しかしながら、この病気の第1エピソード
を経験している患者では薬物を使い始めるのが遅れることが多い。自分が病気で
あることを知らなかったり、助けを求めるのを躊躇したりする患者もいる。問題
が自然消滅することを家族が望んでいたり、患者に治療を受けるよう説得するこ
とができないこともある。診断結果が不確定である場合、副作用の可能性を考慮
して臨床医が抗精神病薬の処方を躊躇することもある。特に、疾患が最初に出現
した時点で、双極性躁鬱障害、重篤な鬱状態、薬物関連障害およびストレス関連
障害と精神分裂病とを鑑別するのは困難である。これらの疾患では最適な治療方
法が異なるため、障害の長期的な予後も治療開始時から異なるのである。
【００２９】 精神分裂病および双極性障害のどちらについても、精神分裂病の治療に用いら
れる周知の分子にはいずれも副作用があり、疾患症状に対してしか作用しない。
副作用を伴わず、精神分裂病および双極性障害の原因機序に関与している標的用
の新たな分子には大きな需要がある。したがって、これらの標的の発見および特
徴づけを容易にするツールが必要であり、有用なのである。
【００３０】 現在、精神分裂病および双極性障害は脳の疾患であるとみなされており、現状
を調査するにあたって生物学的な決定因子が重要視されている。精神分裂病の場
合、神経画像処理および神経病理学的研究から、精神分裂病患者の脳には異常が
あることが明らかにされている。こうした病理学的な変化のタイミングは明確で
はないが、脳の発達初期における欠陥であることが多い。また、精神分裂病にお
ける神経伝達物質異常についての仮説によれば、顕著な変化も起こっている。ド
ーパミン仮説というものもあるが、これは広範囲にわたって修正されてきており
、いまや最有力原因モデルとはみなされていない。
【００３１】 精神分裂病および双極性障害が特定の家系に集中すること、双子に認められる
徴候や養子についての研究結果、世界的にみた出現率に違いがないことなどから
、不可欠な原因、十分な原因または相互に作用する原因として環境的な危険因子
が多少なりとも関与しているとはいえ、精神分裂病および双極性障害が主に遺伝
的な状態であることが分かる。たとえば、一般人口では精神分裂病が発生するの
は全体の1%である。ところが、精神分裂病の祖父または祖母が1人いるだけで、
この病気にかかる危険性は約3%まで増加し、精神分裂病の父または母が1人いる
と約10%になる。両親とも精神分裂病である場合は、危険性は約40%になる。
【００３２】 このため、精神分裂病および双極性障害に関与する遺伝子を同定することには
大きな需要がある。これらの遺伝子について分かれば、研究者らは精神分裂病お
よび双極性障害の病因を解明することができ、単に症状を緩和するだけの医薬品
ではなく疾患の原因に向けられた医薬品を得られるかもしれないのである。
【００３３】 また、精神分裂病および双極性障害に対する羅患性を検出するための新たな方
法ならびに、疾患の発症を防止または経過観察するための新たな方法が極めて必
要とされている。診断ツールも極めて有用なものとなり得るであろう。特に、精
神分裂病を発症する危険性のある被検体を早期に識別することで、早期治療およ
び/または予防的な治療を施せるようになるかもしれない。さらに、薬物の最終
的な薬効ならびにこれに対する患者の最終的な耐性を正確に評価できれば、臨床
医が精神分裂病および双極性障害の治療計画の利益/危険比を高めることが可能
である。
【００３４】 (発明の開示) 本発明は、ヒト染色体13q31-q33座に位置するバイアレリックマーカーを含む
新規な多型の同定と、ヒト染色体13q31-q33座に位置する新規な精神分裂病関連
遺伝子の同定および特徴づけと、ヒト染色体13q31-q33座に位置するバイアレリ
ックマーカーのアレルと疾患との間の、ヒト被検体のパネルで確認および特徴付
けられた遺伝的関連性の識別とから派生したものである。本発明はさらに、精神
分裂病関連遺伝子配列を含む領域の精細な構造マップを提供するものである。
【００３５】 本発明は、sbg1、g34665、sbg2、g35017およびg35018タンパク質をコードする
新規なヒト遺伝子のゲノム配列を含む核酸分子、これにコードされるタンパク質
ならびにこれに対する抗体に関する。sbg1、g34665、sbg2、g35017およびg35018
ゲノム配列は、前記遺伝子の被転写部分の上流(5'末端)および下流(3'末端)に位
置する制御配列を含むものであってもよく、これらの制御配列も本発明の一部で
ある。また、本発明は、sbg1タンパク質とg35018タンパク質をコードするcDNA配
列についても扱う。
【００３６】 sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ゲノム配列またはcDNA配列と特異的
にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーも本発明
の一部であり、さらには前記プライマーおよびプローブを用いてのDNA増幅およ
び検出方法も含まれる。
【００３７】 本発明のさらに他の目的は、上述した核酸配列のうちいずれかを含む組換えベ
クター、特に、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018制御配列あるいは、sb
g1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質をコードする配列を含む組換
えベクターならびに細胞宿主および前記核酸配列または組換えベクターを含むト
ランスジェニック非ヒト動物からなるものである。
【００３８】 さらに、本発明は、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018遺伝子のバイア
レリックマーカーおよびその使用方法にも関するものである。これには、本発明
のバイアレリックマーカーの遺伝子型判定に用いられるプローブおよびプライマ
ーも含まれる。
【００３９】 本発明の一実施形態は、固相支持体に結合された本発明のポリヌクレオチドを
包含する。ポリヌクレオチドは、本願明細書に開示された配列を含むものであっ
てもよい。任意に、前記ポリヌクレオチドは、本願明細書に記載されたいずれか
のポリヌクレオチドを含む、当該ポリヌクレオチドからなる、または実質的に当
該ポリヌクレオチドからなるものであってもよい。任意に、前記判定を、ハイブ
リダイゼーションアッセイ、シークエンシングアッセイ、マイクロシークエンシ
ングアッセイまたは酵素ベースのミスマッチ検出アッセイにおいて実施してもよ
い。任意に、前記ポリヌクレオチドを、固相支持体、アレイまたはアドレス指定
可能なアレイに結合してもよい。任意に、前記ポリヌクレオチドを標識してもよ
い。
【００４０】 最後に、本発明は、sbg1、g34665、sbg2、g35017およびg35018ヌクレオチドお
よびポリヌクレオチドが疾患において果たす役割に基づいて、精神分裂病、双極
性障害または関連のCNS疾患の治療について物質をスクリーニングするための薬
物スクリーニングアッセイおよび方法に関する。本発明の一目的は、sbg1が疾患
において果たす役割に基づいて、マウス、霊長類、非ヒト霊長類の双極性障害ま
たは関連のCND疾患を含む精神分裂病の動物モデルについて扱っている。また、
本発明は、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018の発現を阻害する物質また
は分子のスクリーニング方法ならびに、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg350
18ポリペプチドと相互作用する物質または分子あるいはsbg1、g34665、sbg2、g3
5017またはg35018ポリペプチドの活性を調節する物質または分子のスクリーニン
グ方法に関するものである。
【００４１】 上述したように、本発明の特定の態様は、精神分裂病および双極性障害と、ヒ
ト染色体13q31-q33領域、特に、かかる領域の小領域(本願明細書ではこれを領域
Dと呼ぶ)に位置するバイアレリックマーカーのアレルとの間の遺伝的関連性を識
別することから派生したものである。本発明は、13q31-13q33座上のバイアレリ
ックマーカーのアレルと、クロルプロマジン、クロザピン、リスペリドン、オラ
ンザピン、セルチンドール、クエチアピンおよびジプラシドンなどの薬剤をはじ
めとして精神分裂病または双極性障害または精神分裂病症状または双極性障害症
状に作用する薬剤を投与することによって生じる副作用または利益のいずれかと
の間のさらなる遺伝的関連性を構築するための適切なツールを提供するものであ
る。
【００４２】 本発明は、13q31-13q33座上のバイアレリックマーカーのアレルと形質との間
のさらなる遺伝的関連性を構築するための適切なツールを提供するものである。
人間での精神分裂病および双極性障害に対する遺伝的羅患性を分子的に検出する
ための方法および生成物が得られる。これらの方法および生成物を、上記疾患の
診断、病期判定、予後判定および監視に使用することができる。こういったプロ
セスを治療法にさらに含むことも可能である。また、本発明は、薬物の使用や潜
在的な新薬候補のスクリーニングを最適化するための個々のストラテジーを含む
、好適な治療的解決法を効率的に設計および評価するものである。
【００４３】 本発明の詳細な説明および実施例において、他の実施形態について説明する。
【００４４】 (配列表に列挙した配列の簡単な説明) 配列番号1は、sbg1、g34665、sbg2、g35017およびg35018の各核酸配列を含む
約319kbのゲノムヌクレオチド配列と、ヒト染色体13q31-q33座に位置するバイア
レリックマーカーA1〜A360および多型A361〜A489とを含む。 配列番号2〜26は、sbg1遺伝子のcDNA配列を含む。 配列番号27〜35は、配列番号2〜26のcDNAによってコードされる、sbg1ポリペ
プチドのアミノ酸配列を含む。 配列番号36〜40は、g35018遺伝子のcDNA配列を含む。 配列番号41〜43は、g35018ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。 配列番号44〜53は、sbg1 cDNAを単離するのに用いられるプライマーを含む。 配列番号54〜111は、何種類かの霊長類由来のsbg1遺伝子のエキソンを含むゲ
ノムヌクレオチド配列を含む。 配列番号112〜229はそれぞれ、ヒト染色体13q31-q33座に位置するバイアレリ
ックマーカーA243〜A360を含む単位複製配列のヌクレオチド配列を含む。 配列番号230は、実施例2にてさらに説明する別のPU5'配列を含むプライマーを
含む。 配列番号231は、実施例2にてさらに説明する別のRP5'配列を含むプライマーを
含む。
【００４５】 配列表に関する規則によれば、配列表では以下のコードを使用して、配列内で
のバイアレリックマーカーの位置を示すと共に、多型塩基に存在する各アレルを
特定してある。配列中のコード「r」は、多型塩基の一方のアレルがグアニンで
他方のアレルがアデニンであることを示す。配列中のコード「y」は、多型塩基
の一方のアレルがチミンで他方のアレルがシトシンであることを示す。配列中の
コード「m」は、多型塩基の一方のアレルがアデニンで他方のアレルがシトシン
であることを示す。配列中のコード「k」は、多型塩基の一方のアレルがグアニ
ンで他方のアレルがチミンであることを示す。配列中のコード「s」は、多型塩
基の一方のアレルがグアニンで他方のアレルがシトシンであることを示す。配列
中のコード「w」は、多型塩基の一方のアレルがアデニンで他方のアレルがチミ
ンであることを示す。
【００４６】 (発明の詳細な説明) 現在の遺伝子マッピングで用いられている2つの主なストラテジーすなわち、
連鎖解析および関連性解析によって、精神分裂病のような特定の中枢神経系障害
などの特定の形質に関与している遺伝子を同定することができる。連鎖解析は複
数の羅患個体を含む家系を利用したもので、現在のところ単一遺伝子による遺伝
形質または複数遺伝子による遺伝形質の検出に有効である。一方、関連性解析は
形質陰性(T-)対照と比較して互いに血縁関係のない形質(T+)個体のマーカーアレ
ルの頻度を調べるもので、一般に多因子遺伝の検出に利用されている。
【００４７】 (第13番染色体上の候補領域(連鎖解析)) 遺伝的連関すなわち「連鎖」とは、減数分裂時の乗換えによって染色体上の隣
接する2つの配列のうちどちらに最小組換え(least recombinations)が含まれた
かについての解析に基づくものである。これを行うために、マイクロサテライト
マーカーのような染色体マーカーをゲノム上で正確に局在化した。遺伝的連関の
解析では、系統樹、疾患の伝達およびマーカーの伝達に基づいて、染色体マーカ
ーを用いて標的遺伝子で組換え率を算出する。すなわち、特定のマーカーの特定
のアレルが偶然に発生する頻度(組換えレベル0〜0.5)より高い頻度で疾患と共に
伝達される場合、対象となる標的遺伝子がマーカー近辺に見つかると推定するこ
とができる。
【００４８】 この手法を利用して、家族性癌の遺伝的素因のあるいくつかの遺伝子を局在化
することができた。遺伝的連関解析で使うことができるようにするには、疾患の
遺伝形態に羅患した家系が、一世代あたり(構成DNAの入手が可能である)数名の
羅患被検体と、最も良い状態としては多数の兄弟とを含む、「情報性」の基準を
満たすものでなければならない。
【００４９】 連鎖解析によってなされた観察によれば、精神分裂病の候補領域は染色体13q3
2座上にある(Blouin et al., 1998)。連鎖解析を適用したところ、明らかなメン
デル遺伝パターンを示す浸透率の高い単純な遺伝的形質をマッピングすることは
できたが、この方法にはさまざまな欠点がある。まず、連鎖解析には、検討対象
となる形質ごとに適した遺伝モデルの選択肢に対する信頼性の面で制約がある。
さらに、この方法を利用して得られる解像度には限度があり、連鎖解析によって
最初に同定された20Mbの一般的な領域を追加研究でさらに正確に分析する必要が
ある。また、連鎖解析は、同義遺伝子および/または環境的な要因の作用が様々
に組み合わさる状況などの複雑な遺伝形質に利用するのは困難であることが分か
っている。このような場合、こうした状況に連鎖解析を適用するのに必要な適切
な数の羅患家系を募集するのにかかる手間と費用が大きくなりすぎてしまう。最
後に、連鎖解析は情報性のある大きな家系がない場合の形質の研究には利用でき
ない。
【００５０】 本発明では、染色体13q31-q33座に位置するマーカーと形質、好ましくは精神
分裂病または双極性障害との間で連鎖解析によらずして関連性解析を実施するた
めの別の手段を開示する。
【００５１】 本願では、精神分裂病に関連したヒト染色体13q31-q33座に位置する別のバイ
アレリックマーカーを開示する。精神分裂病との関連性においてこれらのバイア
レリックマーカーを同定することで、精神分裂病を発症する素因に関与する遺伝
的決定因子を含む疑いのある染色体領域をさらに定義できるようになり、精神分
裂病を発症する素因に関連のある、本願明細書に開示する新規な遺伝子配列が同
定された。したがって、本発明は、ヒトの13q31-q33座に位置する新規なバイア
レリックマーカーと、ヒト13q31-q33座の小領域の約319kbのゲノムヌクレオチド
配列と、前記319kbのゲノム配列におけるバイアレリックマーカーおよびヌクレ
オチド欠失を含む多型と、を含む、13q31-q33座の包括的で精細な構造マップを
提供するものである。ヒト染色体13q31-q33座のバイアレリックマーカーおよび
ヌクレオチド配列と、領域Dにおいてヒト染色体13q31-q33座の小領域に位置する
多型および遺伝子配列が、以後のマッピング研究において遺伝的マーカーおよび
物理的マーカーとして有用である。本願明細書に開示する約319kbのゲノムヌク
レオチド配列は、その領域における欠失、置換および挿入の遺伝的解析または物
理的解析時の基準としても利用できるものである。さらに、配列情報から、その
領域において新規な遺伝子をさらに同定するためのリソースが得られる。また、
精神分裂病関連遺伝子を含む配列は、たとえば、推定遺伝子家系において他の遺
伝子の単離する、相同体を他の種から識別する、疾患を治療する目的の他、本願
明細書にて説明するような診断アッセイまたはスクリーニングアッセイ用のプロ
ーブおよびプライマーとして有用である。
【００５２】 これらの同定された多型は、精神分裂病および双極性障害に対する遺伝的羅患
性を高信頼度で検出するためのアッセイの設計に利用される。また、新規な薬物
または治療計画あるいは既存の薬物または治療計画での治療および副作用の可能
性について正確かつ効率的に評価を得るための薬物スクリーニングプロトコルの
設計にも利用できる。
【００５３】 (定義) 本願明細書において同義に用いられるものとして、「オリゴヌクレオチド」お
よび「ポリヌクレオチド」という用語は、2つ以上のヌクレオチドの一本鎖また
は二本鎖のいずれかで構成されるRNA配列、DNA配列またはRNA/DNAハイブリッド
配列を含む。本願明細書において、形容詞としての「ヌクレオチド」という用語
は、特に長さを限定せず一本鎖または二本鎖のRNA配列、DNA配列またはRNA/DNA
ハイブリッド配列を含む分子を示す。本願明細書では、「ヌクレオチド」という
用語を、分子を意味する個々のヌクレオチドまたは多種多様なヌクレオチド、あ
るいは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド内のヌクレオチドである場
合はプリンまたはピリミジン、リボースまたはデオキシリボース糖部分およびリ
ン酸基またはリン酸ジエステル連鎖を含む、大きな核酸分子に含まれる個々の単
位を示す名詞としても使用する。本願明細書では、「ヌクレオチド」という用語
を、(a)選択的結合基、(b)プリンに類似の形態、(c)ピリミジンに類似の形態、(
d)類似の糖類のうち少なくとも1つの修飾を含む「修飾ヌクレオチド」を包含す
るものとして使用するが、これには、類似の結合基、プリン、ピリミジンおよび
糖などのうち少なくとも1つを含むものも包含される(たとえば、国際特許出願公
開第WO95/04064号を参照のこと)。しかしながら、本発明のポリヌクレオチドは
、好ましくは50%より多くが従来のデオキシリボースヌクレオチド、最も好まし
くは90%より多くが従来のデオキシリボースヌクレオチドで構成される。本発明
のポリヌクレオチド配列は、合成、組換え、ex vivo生成またはこれらの組み合
わせの他、従来技術において周知の精製方法を用いるなど、周知のどのような方
法で調製したものであってもよい。
【００５４】 本願明細書では、他の核酸、含水炭素、脂質およびタンパク質(ポリヌクレオ
チドの合成に使用される酵素など)を含むがこれに限定されるものではない他の
化合物から分離された本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドベクタ
ー、あるいは線状ポリヌクレオチドから共有結合的に緊密なポリヌクレオチドを
分離することを示す上で、「精製された」という表現を使用する。ポリヌクレオ
チドは、試料の少なくとも約50%、好ましくは60〜75%が単一のポリヌクレオチド
配列およびコンホメーション(線状vs.共有結合的に緊密)を呈する限り、実質的
に純粋なものである。実質的に純粋なポリヌクレオチドは通常、約50%、好まし
くは60〜90%w/wの核酸試料を含み、より一般には純度が約95%、好ましくは約99%
を上回る。ポリヌクレオチドの純度または均一性は、試料のアガロースゲル電気
泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動などの従来技術において周知のさま
ざまな手段を適用し、次いでゲルの染色時に単一のポリヌクレオチドバンドを可
視化するなどの方法によって示すことのできるものである。特定の目的では、HP
LCまたは従来技術において周知の他の手段によって一層高い解像度を得ることが
できる。
【００５５】 「単離された」という表現で示す物質は、その本来あるべき環境(たとえば、
天然由来のものであれば自然環境)から外れたものでなければならない。たとえ
ば、生きた動物が持つ天然由来のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離さ
れたとは言わないが、同じポリヌクレオチドまたはDNAまたはポリペプチドを天
然系で共存しているいくつかの物質またはすべての物質から分離すると、これは
単離されたことになる。かかるポリヌクレオチドがベクターの一部である、およ
び/または、かかるポリヌクレオチドまたはポリペプチドが組成物の一部である
こともあるが、このような状態であっても、そのベクターや組成物が天然環境の
一部をなしているのでなければ、単離されているとする。
【００５６】 「プライマー」という用語は、標的ヌクレオチド配列と相補であり、標的ヌク
レオチド配列とハイブリダイズさせるのに使用される特定のオリゴヌクレオチド
配列を示す。プライマーは、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼまたは逆転写酵
素のいずれかが触媒するヌクレオチド重合の開始点として機能する。
【００５７】 「プローブ」という用語は、試料中に存在する特定のポリヌクレオチド配列の
同定に使用できる定義済の核酸セグメント(あるいは本願明細書において定義す
るポリヌクレオチドなどのヌクレオチド類似セグメント)であって、同定対象と
なる特定のポリヌクレオチド配列の相補配列であるヌクレオチド配列を有する前
記核酸セグメントを示す。
【００５８】 「形質」および「表現型」という用語は、本願明細書では同義に用いられ、生
物の可視的な性質、検出可能な性質またはこれ以外の場合であれば測定可能な性
質一切を意味するものであり、一例としては疾患の症状または疾患に対する羅患
性があげられる。本願明細書では、「形質」または「表現型」という用語は主に
、精神分裂病または双極性障害の症状またはこれに対する羅患性、あるいは、精
神分裂病または双極性障害に作用する薬剤に対する個体の応答または精神分裂病
または双極性障害に作用する薬剤に対する副作用の症状またはこれに対する羅患
性を意味するのに用いられる。
【００５９】 「アレル」という用語は、本願明細書では、ヌクレオチド配列の変異体を示す
。バイアレリック多型は2つの形態を有する。一般に、最初に同定されたアレル
が起始アレル、他方のアレルが選択的アレルとされる。複相生物は、アレル形態
がホモ接合性のこともあればヘテロ接合性のこともある。
【００６０】 「ヘテロ接合率」という用語は、本願明細書では、特定のアレルでヘテロ接合
的である個体が個体群で出現する率を示す。バイアレリックの系では、ヘテロ接
合率は平均で2Pa(1-Pa)に等しい。式中、Paは共通アレルの最小頻度を意味する
。遺伝研究に役立つものとするために、遺伝マーカーのヘテロ接合性を適当なレ
ベルに定め、無作為に選択した個人がヘテロ接合的になる確率が最も高くなるよ
うにする必要がある。
【００６１】 「遺伝子型」という用語は、本願明細書では、個体または試料中に存在するア
レルの同一性を示す。本発明の文脈では、遺伝子型は、個体または試料中に存在
するバイアレリックマーカーアレルのことを示すものであると好ましい。試料ま
たは個体のバイアレリックマーカーでの「遺伝子型を判定する」という表現は、
バイアレリックマーカーの部分で個体が保持している特定のヌクレオチドまたは
特定のアレルを判定することである。
【００６２】 「変異」という用語は、本願明細書では、異なるゲノムまたは個体間の頻度1%
未満のDNA配列の違いを示す。
【００６３】 「ハプロタイプ」という用語は、単一の染色体上の個体または試料中に存在す
るアレルの組み合わせを示す。本発明の文脈では、ハプロタイプは、特定の個体
において見出され、表現型に関連している場合があるバイアレリックマーカーア
レルの組み合わせを示すものであると好ましい。
【００６４】 「多型」という用語は、本願明細書では、異なるゲノムまたは個体間で2以上
の選択的ゲノム配列またはアレルが出現することを示す。「多型の」という表現
は、特定のゲノム配列の2以上の変異体が個体群に見出される可能性がある状態
を示す。「多型部位」は、バリエーションが発生する座である。多型は、1つま
たはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または挿入を含むものであってもよい
。単一ヌクレオチド多型は、単一塩基対の変化である。一般に、単一ヌクレオチ
ド多型は、多型部位で1つのヌクレオチドが別のヌクレオチドに置換されること
である。単一ヌクレオチドの欠失または単一ヌクレオチドの挿入も単一ヌクレオ
チド多型の原因である。本発明の文脈では、「単一ヌクレオチド多型」は、単一
ヌクレオチド置換を示すものであると好ましい。一般に、異なるゲノム間または
異なる個体間では、多型部位が2つの異なるヌクレオチドによって占有されるこ
とがある。
【００６５】 「バイアレリック多型」および「バイアレリックマーカー」という用語は、本
願明細書では同義のものとして用いられ、個体群に2つのアレルを極めて高い頻
度で有する単一ヌクレオチド多型、好ましくは単一ヌクレオチド多型を示す。「 バイアレリックマーカーアレル 」は、バイアレリックマーカー部位に存在するヌ
クレオチド変異体を示す。一般に、本発明によるバイアレリックマーカーの共通
性の少ないアレル頻度は1%を上回り、好ましくは頻度が10%を上回り、さらに好
ましくは頻度が少なくとも20%(すなわち、ヘテロ接合率は少なくとも0.32)、さ
らに一層好ましくは頻度が少なくとも30%(すなわち、ヘテロ接合率は少なくとも
0.42)であることが実証されている。共通性の少ないアレルの頻度が30%以上のバ
イアレリックマーカーを「高品質バイアレリックマーカー」とする。本発明の遺
伝子型判定法、ハプロタイプ判定法、関連性解析法および相互作用解析法はいず
れも、任意に、単独で高品質バイアレリックマーカーを用いて実施可能なもので
ある。
【００６６】 ポリヌクレオチドの中心に対するヌクレオチドの当該ポリヌクレオチド内での
位置は、本願明細書では以下の通りとする。ポリヌクレオチドに含まれるヌクレ
オチドの数が奇数である場合は、ポリヌクレオチドの3'末端および5'末端から等
距離にあるヌクレオチドをそのポリヌクレオチドの「中心に」あるとみなし、中
心のヌクレオチドに隣接するヌクレオチドまたは中心のヌクレオチド自体を「中 心から1ヌクレオチド以内 」とする。ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチド
の数が奇数であれば、たとえばポリヌクレオチドの中心にある5カ所のヌクレオ
チド位置はいずれも中心から2ヌクレオチド以内ということになる。ポリヌクレ
オチドに含まれるヌクレオチドの数が偶数である場合は、このポリヌクレオチド
には結合が含まれ、ポリヌクレオチドの中心のヌクレオチドは存在しない。した
がって、中心の2つのヌクレオチドのいずれも「中心から1ヌクレオチド以内」と
みなされ、ポリヌクレオチドの中心にある4つのヌクレオチドはいずれも「中心
から2ヌクレオチド以内」という具合になる。1つ以上のヌクレオチドの置換、挿
入または欠失が絡む多型の場合は、その多型の、置換、挿入または欠失されたポ
リヌクレオチドとポリヌクレオチドの3'末端からの距離と、その多型の、置換、
挿入または欠失されたポリヌクレオチドとポリヌクレオチドの5'末端からの距離
との差が、0ヌクレオチドまたは1ヌクレオチドの場合に、その多型、アレルまた
はバイアレリックマーカーがポリヌクレオチドの「中心にある」とする。この差
が0〜3の場合、その多型は「中心から1ヌクレオチド以内」であるとされる。差
が0〜5の場合、その多型は「中心から2ヌクレオチド以内」であるとされる。差
が0〜7であれば、その多型は「中心から3ヌクレオチド以内」という具合になる
。1つ以上のヌクレオチドの置換、挿入または欠失が絡む多型の場合は、その多
型の、置換、挿入または欠失されたポリヌクレオチドとポリヌクレオチドの3'末
端からの距離と、その多型の、置換、挿入または欠失されたポリヌクレオチドと
ポリヌクレオチドの5'末端からの距離との差が、0ヌクレオチドまたは1ヌクレオ
チドの場合に、その多型、アレルまたはバイアレリックマーカーがポリヌクレオ
チドの「中心にある」とする。この差が0〜3の場合、その多型は「中心から1ヌ
クレオチド以内」であるとされる。差が0〜5の場合、その多型は「中心から2ヌ
クレオチド以内」であるとされる。差が0〜7であれば、その多型は「中心から3
ヌクレオチド以内」という具合になる。
【００６７】 「上流」という用語は、本願明細書では、特異的な基準点からポリヌクレオチ
ドの5'末端に向かう位置を示す。
【００６８】 「塩基対の」および「Watson & Crick塩基対の」という表現は、本願明細書で
は同義に用いられ、二重らせん状のDNAにおいて見られるものと同様に、アデニ
ン残基が2つの水素結合によってチミン残基またはウラシル残基と結合し、シト
シン残基およびグアニン残基が3つの水素結合によって結合した、その配列の同
一性がゆえに、互いに水素結合可能なヌクレオチドを示す(Stryer, L., Biochem
istry, 4th edition, 1995を参照のこと)。
【００６９】 「相補的」または「その相補体」という用語は、本願明細書では、相補領域全
体を通してもう1つの特定のポリヌクレオチドとWatson & Crick塩基対を形成す
ることのできるポリヌクレオチドの配列を示す。この用語は、その配列のみに基
づいてポリヌクレオチドの対に適用されるものであり、2つのポリヌクレオチド
が事実上結合状態にある特定の集合に適用されるものではない。
【００７０】 「sbg1遺伝子」という用語は、本願明細書で使用するにあたり、ゲノムDNAの
未翻訳調節領域を含む、sbg1タンパク質をコードするゲノム配列、mRNA配列およ
びcDNA配列を包含する。
【００７１】 「g34665遺伝子」という用語は、本願明細書で使用するにあたり、ゲノムDNA
の未翻訳調節領域を含む、g34665タンパク質をコードするゲノム配列、mRNA配列
およびcDNA配列を包含する。
【００７２】 「sbg2遺伝子」という用語は、本願明細書で使用するにあたり、ゲノムDNAの
未翻訳調節領域を含む、sbg2タンパク質をコードするゲノム配列、mRNA配列およ
びcDNA配列を包含する。
【００７３】 「g35017遺伝子」という用語は、本願明細書で使用するにあたり、ゲノムDNA
の未翻訳調節領域を含む、g35017タンパク質をコードするゲノム配列、mRNA配列
およびcDNA配列を包含する。
【００７４】 「g35018遺伝子」という用語は、本願明細書で使用するにあたり、ゲノムDNA
の未翻訳調節領域を含む、g35018タンパク質をコードするゲノム配列、mRNA配列
およびcDNA配列を包含する。
【００７５】 本願明細書において、「13q31-q33関連バイアレリックマーカー」という用語
は、ヒト染色体13q31-q33領域に座乗するバイアレリックマーカーの集合を意味
する。13q31-q33関連バイアレリックマーカーという用語は、表6bに開示される
すべてのバイアレリックマーカーと、これらのマーカーと連鎖不平衡状態にある
バイアレリックマーカーと、表6cに開示されるすべてのバイアレリックマーカー
と、これらのマーカーと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーとを包含
する。本発明の好ましい染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカーアレルと
しては、表6bに列挙された各アレル単体または列挙されたアレルのあらゆる組み
合わせからなるグループとがあげられる。
【００７６】 本願明細書において、「領域Ｄ関連バイアレリックマーカー」は、本願明細書
では領域Dと呼ぶ染色体13q31-q33領域の小領域と連鎖不平衡状態にあるバイアレ
リックマーカー集合に関するものである。領域Ｄ関連バイアレリックマーカーと
いう用語は、表6bに記載のバイアレリックマーカーA1〜A242、A249〜A251、A257
〜A263、A269〜A270、A278、A285〜A299、A303〜A307、A324、A330、A334〜A335
、A346〜357およびA361〜A489と、マーカーA1〜A242、A249〜A251、A257〜A263
、A269〜A270、A278、A285〜A299、A303〜A307、A324、A330、A334〜A335、A346
〜357およびA361〜A489と連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーとを包
含する。
【００７７】 本願明細書において、「sbg1関連バイアレリックマーカー」という用語は、sb
g1遺伝子またはsbg1ヌクレオチド配列と連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマ
ーカー集合に関するものである。sbg1関連バイアレリックマーカーという用語は
、表6bに記載のバイアレリックマーカーA85〜A219と、これらのマーカーと連鎖
不平衡状態にあるバイアレリックマーカーとを包含する。
【００７８】 本願明細書において、「g34665関連バイアレリックマーカー」という用語は、
g34665遺伝子またはsbg1ヌクレオチド配列と連鎖不平衡状態にあるバイアレリッ
クマーカー集合を意味する。g34665関連バイアレリックマーカーという用語は、
表6bに開示のバイアレリックマーカーA230〜A236と、これらのマーカーと連鎖不
平衡状態にあるバイアレリックマーカーとを包含する。
【００７９】 本願明細書において、「sbg2関連バイアレリックマーカー」という用語は、sb
g2遺伝子またはsbg2ヌクレオチド配列と連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマ
ーカー集合を意味する。sbg2関連バイアレリックマーカーという用語は、表6bに
開示のバイアレリックマーカーA79〜A99と、これらのマーカーと連鎖不平衡状態
にあるバイアレリックマーカーとを包含する。
【００８０】 本願明細書において、「g35017関連バイアレリックマーカー」という用語は、
g35017遺伝子またはg35017ヌクレオチド配列と連鎖不平衡状態にあるバイアレリ
ックマーカー集合を意味する。g35017関連バイアレリックマーカーという用語は
、表6bに開示のバイアレリックマーカーA41と、このマーカーと連鎖不平衡状態
にあるバイアレリックマーカーとを包含する。
【００８１】 本願明細書において、「g35018関連バイアレリックマーカー」という用語は、
g35018遺伝子またはg35018ヌクレオチド配列と連鎖不平衡状態にあるバイアレリ
ックマーカー集合を意味する。g35018関連バイアレリックマーカーという用語は
、表6bに開示のバイアレリックマーカーA1〜A39と、このマーカーと連鎖不平衡
状態にあるバイアレリックマーカーとを包含する。
【００８２】 「ポリペプチド」という用語は、ポリマーの長さとは無関係にアミノ酸のポリ
マーを意味する。したがって、ポリペプチドの定義には、ペプチド、オリゴペプ
チドおよびタンパク質が含まれる。この用語はまた、ポリペプチドのprost発現
修飾に特異なものでもこれを除外するものでもなく、たとえば、グリコシル基、
アセチル基、リン酸基、脂質基などが共有結合的に付加されたポリペプチドもポ
リペプチドという用語に明示的に包含される。さらに、この定義には、1種また
はそれ以上のアミノ酸類似物(たとえば、非天然由来のアミノ酸、生物学的な独
立系における天然でのみ発生するアミノ酸、哺乳動物の系由来の修飾アミノ酸な
どを含む)を含有するポリペプチド、置換結合を有するポリペプチドの他、従来
技術において周知の天然由来および非天然由来の他の修飾も含まれる。
【００８３】 本願明細書では、核酸、脂質、含水炭素および他のタンパク質を含むがこれに
限定されるものではない他の化合物から分離された本発明のポリペプチドを示す
上で、「精製された」という表現を使用する。ポリペプチドは、試料の少なくと
も約50%、好ましくは60〜75%が単一のポリペプチド配列を呈する限り、実質的に
純粋なものである。実質的に純粋なポリペプチドは通常、約50%、好ましくは60
〜90%w/wのタンパク質試料を含み、より一般には純度が約95%、好ましくは約99%
を上回る。ポリペプチドの純度または均一性は、試料のアガロースゲル電気泳動
またはポリアクリルアミドゲル電気泳動などの従来技術において周知のさまざま
な手段を適用し、次いでゲルの染色時に単一のポリペプチドバンドを可視化する
などの方法によって示されている。特定の目的では、HPLCまたは従来技術におい
て周知の他の手段によって一層高い解像度を得ることができる。
【００８４】 本願明細書において、「非ヒト動物」という用語は、人間以外のあらゆる脊椎
動物および鳥類を示し、通常は哺乳動物、好ましくは霊長類、ブタ、ヤギ、ヒツ
ジ、ロバおよびウマなどの家畜動物、ウサギすなわちげっ歯類、さらに好ましく
はラットまたはマウスである。本願明細書において、「動物」という用語は、あ
らゆる脊椎動物、好ましくは哺乳動物の意味で用いられる。「動物」および「哺 乳動物 」のいずれの用語も、「非ヒト」という用語が明記されている場合を除き
、ヒトの被検体も明示的に含むものとする。
【００８５】 本願明細書において、「抗体」という用語は、ポリペプチド単体または少なく
とも1種の結合ドメインで構成される複数のポリペプチドの集合を意味する。こ
の場合、抗体結合ドメインは、抗体分子の可変ドメインの折り畳みで形成され、
内面形状および電荷の分布が抗原の抗原決定基の特徴と相補的な三次元結合空間
を形成する。これによって、抗原に対する免疫反応が可能になる。抗体としては
、結合ドメインを有する組換えタンパク質の他、Fab、Fab'、F(ab)2およびF(ab'
)2フラグメントをはじめとするフラグメントがあげられる。
【００８６】 本願明細書において、「抗原決定基」は、抗原抗体反応の特異性を決定する抗
原分子の一部であり、この場合はsbg1ポリペプチドである。「エピトープ」は、
ポリペプチドの抗原決定基を意味する。エピトープは、空間コンホメーションに
わずか3個のアミノ酸を含むことができるものであるが、これはエピトープ独特
の特徴である。通常、エピトープはこのようなアミノ酸少なくとも6個で構成さ
れ、一般にはこのようなアミノ酸少なくとも8〜10個で構成される。エピトープ
を構成しているアミノ酸の判定方法としては、x線結晶解析、二次元核磁気共鳴
の他、Geysen et al. 1984、国際特許出願公開第WO84/03564号および同第WO84/0
3506号に記載されているようなPepscan法などのエピトープマッピングがあげら
れる。
【００８７】 (変異体およびフラグメント) 本発明は、本願明細書にて説明するポリヌクレオチド、特に、配列番号1〜26
、36〜40および54〜229のヌクレオチド配列、特に本発明による1種またはそれ以
上のバイアレリックマーカーおよび/または他の多型を含む配列番号1〜26、36〜
40および54〜229のヌクレオチド配列の変異体およびフラグメントにも関するも
のである。
【００８８】 ポリヌクレオチドの変異体は、本願明細書で使用する用語として、基準ポリヌ
クレオチドとは異なるポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドの変異体は、
天然由来のバイアレリック変異体などの天然由来の変異体であっても、天然には
産生されないことが分かっている変異体であってもよい。上記のような非天然由
来のポリヌクレオチド変異体は、ポリヌクレオチド、細胞または有機体に適用さ
れる技術をはじめとする突然変異誘起技術によって作製できるものである。通常
は配列の違いには限度があるため、基準のヌクレオチド配列と変異体のヌクレオ
チド配列は全体的に見れば類似しており、多くの領域が同一である。
【００８９】 本発明によるポリヌクレオチドの変異体は、ヌクレオチド配列の配列番号1〜2
6、36〜40および54〜229からなる群から選択されるポリヌクレオチドまたはヌク
レオチドの配列番号1〜26、36〜40および54〜229からなる群から選択されるポリ
ヌクレオチドの連続した少なくとも8ヌクレオチドのポリヌクレオチドフラグメ
ントと少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列、ヌクレオチドの配列番号1〜
26、36〜40および54〜229からなる群から選択されるポリヌクレオチドあるいは
、長さが特定の配列番号と整合する限りにおいて、配列番号1〜26、36〜40およ
び54〜229のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドの連
続した少なくとも30、35、40、50、70、80、100、250、500、1000または2000ヌ
クレオチドのポリヌクレオチドフラグメントに対して、好ましくは少なくとも99
%同一、さらには少なくとも99.5%同一、一層好ましくは少なくとも99.8%同一で
あるヌクレオチド配列を含むがこれに限定されるものではない。
【００９０】 変異体のポリヌクレオチドに存在するヌクレオチドの変化がサイレントな場合
もあるが、これはそのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸には変化
がないことを意味する。しかしながら、ヌクレオチドが変化することで、基準配
列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸に置換、付加、欠失、融合およ
び切り詰めが生じることもある。置換、欠失または付加には、1つまたはそれ以
上のヌクレオチドが必要な場合がある。変異体もコード領域または非コード領域
の一方または両方で変化する場合がある。コード領域が変わると、保存的または
非保存的なアミノ酸置換、欠失または付加が生じ得る。
【００９１】 ポリヌクレオチドフラグメントは、特定のヌクレオチド配列、好ましくは、sb
g1ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列およびその変異体、あるいは、配列番号
1〜26、36〜40および54〜229のうちいずれかのポリヌクレオチド、バイアレリッ
クマーカーA1〜A360または多型A361〜A489またはそれらの相補体のうちの1つを
含むポリヌクレオチドと一部が完全に同一であるがすべてが同一であるわけでは
ない配列を含むポリヌクレオチドである。このようなフラグメントは、「自立状
態」すなわち、他のポリヌクレオチドの一部であったり他のポリヌクレオチドと
融合したものでなくてもよく、このフラグメントよりも大きな単一のポリヌクレ
オチドでその一部または領域をなすものであってもよい。特に、上記のフラグメ
ントのうちいくつかが、これよりも大きなポリヌクレオチド1つに存在していて
もよい。任意に、かかるフラグメントが、配列番号1〜26、36〜40および54〜229
のうちいずれかの少なくとも8、10、12、15、18、20、25、30、35、40、50、70
、80、100、250、500、1000または2000ヌクレオチド長の連続スパンを含む、当
該連続スパンからなる、または実質的に当該連続スパンからなるものであっても
よい。
【００９２】 (核酸間またはポリペプチド間の同一性) 「配列同一性率」および「相同率」という用語は、本願明細書ではポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドの比較結果を示すものとして同義に用いられ、比較ウ
ィンドウで最適な状態に整列された配列2つを比較することによって求められる
ものである。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィ
ンドウ内の部分には、2つの配列の最適なアライメントについての(付加や欠失を
含まない)基準配列と比較したときに、付加または欠失(すなわちギャップ)が含
まれる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認め
られる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数
を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に100を掛けて配列同一性
のパーセンテージを算出する。相同については、従来技術において周知のさまざ
まな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価
する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、TBLASTN、BLASTP、F
ASTA、TFASTAおよびCLUSTALW(Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 85(8):2444-2448、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(3):403
-410、Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680、Higgins
et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402、Altschul et al., 1990, J. M
ol. Biol. 215(3):403-410、Altschul et al., 1993, Nature Genetics 3:266-2
72)があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形
態では、従来技術において周知のBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)(
たとえば、Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2267-
2268、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410、Altschul et al.,
1993, Nature Genetics 3:266-272、Altschul et al., 1997, Nuc. Acids Res.
25:3389-3402を参照のこと)を用いてタンパク質配列および核酸配列の相同性を
評価する。特に、5つの専用BLASTプログラムを用いて以下の作業を実施する。 (1) BLASTPおよびBLAST3でアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データ
ベースと比較 (2) BLASTNでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベース
と比較 (3) BLASTXでヌクレオチドのクエリー配列(両方の鎖)を6つの読み枠で変換し
た概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較 (4) TBLASTNでタンパク質のクエリー配列を、6つの読み枠(両方の鎖)すべて
で変換したヌクレオチド配列データベースと比較 (5) TBLASTXでヌクレオチドのクエリ配列を6つの読み枠で変換したものを、6
つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較
【００９３】 BLASTプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ま
しくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被
検配列との間で、本願明細書では「ハイスコアセグメント対」と呼ぶ類似のセグ
メントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグ
メント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスに
よって同定(すなわち整列化)されると好ましい。好ましくは、使用するスコアリ
ングマトリックスはBLOSUM62マトリックスである(Gonnet et al., 1992, Scienc
e 256:1443-1445、Henikoff and Henikoff, 1993, Proteins 17:49-61)。このマ
トリックスほど好ましいものではないが、PAMまたはPAM250マトリックスも使用
できる(たとえば、Schwartz and Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detectin
g Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washi
ngton: National Biomedical Research Foundationを参照のこと)。BLASTプログ
ラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し
、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値
レベルを満たすセグメントを選択する。統計学的な有意性を求めるKarlinの式を
用いてハイスコアセグメント対の統計学的な有意性を評価すると好ましい(Karli
n and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2267-2268を参照のこ
と)。
【００９４】 このBLASTプログラムをデフォルトのパラメータで使用してもよいし、ユーザ
によって提供される変更パラメータで使用してもよい。
【００９５】 (ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件) 一例であり限定するものではないが、ストリンジェンシーの高い条件を用いて
行う手順は次の通りである。6×SSC、トリス-HCl(pH7.5)50mM、EDTA 1mM、0.02%
PVP、0.02%フィコール、0.02% BSAおよび変性サケ精子DNA 500μg/mlで構成さ
れる緩衝液にて、65℃で8時間から一晩かけて、DNAを含有するフィルタをプレハ
イブリダイゼーションする。好ましいハイブリダイゼーション温度である65℃に
て48時間、変性サケ精子DNA 100μg/mlと32P標識プローブ5〜20×106cpmとを含
むプレハイブリダイゼーション混合物中でフィルタをハイブリダイズさせる。続
いて、2×SSC、0.01% PVP、0.01%フィコールおよび0.01%BSAを含有する溶液中で
37℃で1時間、次いで0.1×SSCで50℃にて45分かけてフィルタを洗浄することが
できる。洗浄ステップの後、ハイブリダイズしたプローブをオートラジオグラフ
ィによって検出することが可能である。ストリンジェンシーが高く使用可能な他
の条件は当業者間で周知のものであり、Sambrook et al., 1989およびAusubel e
t al., 1989に引用されている。これらのハイブリダイゼーション条件は約20ヌ
クレオチド長の核酸分子に適している。上述したハイブリダイゼーション条件が
、当業者間で周知の技法によって、所望の核酸の長さに応じて調整されるのは言
うまでもない。好適なハイブリダイゼーション条件は、たとえば、Hames and Hi
ggins(1985)またはSambrook et al.(1989)の本に開示されている教示内容に沿っ
たものなどである。
【００９６】 (本発明のポリヌクレオチドのゲノム配列) 本発明は、sbg1、g34665、sbg2、g35017およびg35018遺伝子のゲノムＤＮＡ配
列ならびに、ヒト染色体13q31-q33領域、特に、本願明細書では領域Dと呼ぶその
小領域のDNA配列に関する。
【００９７】 本願明細書において言及するとおり、sbg2、g35017およびg35018のゲノム配列
は、配列番号1において5'から3'方向へのヌクレオチド位置で示されている。sbg
1およびg34665は逆方向すなわち、配列番号1に対して相補的な核酸鎖から転写さ
れる。したがって、sbg1およびg34665のゲノム配列は、配列番号1において3'か
ら5'方向へのヌクレオチド位置で示される。
【００９８】 本発明の好ましい核酸は、配列番号1のヌクレオチド位置31〜292651および292
844〜319608の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、9
0、100、150、200、500、1000または2000ヌクレオチドの連続スパンまたはそれ
らの相補体を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレ
オチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む。本発明の他の核酸は、配列番号11
2〜229の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、10
0、150、200、500、1000または2000ヌクレオチドの連続スパンを、前記連続スパ
ンの長さが配列番号と整合する限りにおいて含んでなる、単離されたポリヌクレ
オチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む。任
意に、前記スパンが、配列番号112〜114、115〜117、119、121、125〜145、147
〜150、159〜170および176〜229の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40
、50、60、70、80、90、100、150、200、500、1000または2000ヌクレオチドであ
ってもよい。
【００９９】 また、本発明には、配列番号1のヌクレオチド位置31〜292651および292844〜3
19608またはその相補配列またはそのフラグメントのヌクレオチド配列に対して
少なくとも70%、75%、80%、85%、90%または95%のヌクレオチド同一性を有するヌ
クレオチド配列を含む、精製されたポリヌクレオチド、単離されたポリヌクレオ
チドまたは組換えポリヌクレオチドも包含される。本発明の別の目的は、上記に
て定義したストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、配列番号1の少
なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、20
0、500、1000または2000ヌクレオチドの連続スパンまたはその相補配列またはそ
の変異体とハイブリダイズされる、精製された核酸、単離された核酸または組換
え核酸からなる。
【０１００】 本発明のもう1つの好ましい核酸は、配列番号1の少なくとも12、15、18、20、
25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100または200ヌクレオ
チドの連続スパンまたはそれらの相補体を含んでなる、単離されたポリヌクレオ
チド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、前
記連続スパンがバイアレリックマーカーを含む、単離されたポリヌクレオチド、
精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む。任意に、前
記連続スパンが、A1〜A69、A71〜A74、A76〜A94、A96〜A106、A108〜A112、A114
〜A177、A179〜A197、A199〜A222、A224〜A242からなる群から選択されるarバイ
アレリックマーカーを含むものであってもよい。任意に、バイアレリックマーカ
ーにアレル2が存在してもよい。このセクションで述べるポリヌクレオチドが、
どのようなサイズおよび配列の核酸フラグメントを構成してもよいことに注意さ
れたい。
【０１０１】 本発明の核酸のもう1つの特に好ましい集合は、長さが特定のヌクレオチド位
置の長さと整合する限りにおいて、配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25
、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500、1000または2000ヌク
レオチドの連続スパンまたはそれらの相補体を含んでなる、単離されたポリヌク
レオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって
、前記連続スパンが、以下の表1に列挙される配列番号1のpos1〜pos166で示され
るヌクレオチド位置の範囲のうちいずれか1つの少なくとも1、2、3、5または10
ヌクレオチド位置を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリ
ヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む。
【０１０２】
【表１】
【０１０３】 (sbg1、g34665、sbg2、g35017およびg35018の核酸配列) 本発明は、g34665、g34673、g34667、g35017およびg35018遺伝子およびヌクレ
オチド配列を包含する。
【０１０４】 (g34665) 一態様では、本発明は、配列番号1のヌクレオチド位置292653〜296047の配列
、これらの配列と相補的な配列ならびにそのフラグメントおよび変異体からなる
、実質的にこれらからなる、またはこれらを含む、g34665ゲノム配列に関するも
のである。これらのポリヌクレオチドは、精製されたポリヌクレオチド、単離さ
れたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであってもよい。
【０１０５】 本発明の特に好ましい核酸は、配列番号1のヌクレオチド位置292653〜292841
、295555〜296047または295580〜296047の少なくとも12、15、18、20、25、30、
35、40、50、60、70、80、90、100、150または200ヌクレオチドの連続スパンを
、前記スパンの長さがヌクレオチド位置範囲に整合する限りにおいて含んでなる
、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリ
ヌクレオチドを含む。本発明のさらに好ましい核酸は、配列番号1のヌクレオチ
ド位置292653〜292841、295555〜296047または295580〜296047の少なくとも12、
15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150または200ヌクレ
オチドの連続スパンまたはそれらの相補体を、前記スパンの長さがヌクレオチド
位置範囲に整合する限りにおいて含んでなる、単離されたポリヌクレオチド、精
製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、前記連続ス
パンがg34665関連バイアレリックマーカーを含む、単離されたポリヌクレオチド
、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む。任意に、
前記バイアレリックマーカーが、A230〜A236からなる群から選択されるものであ
ってもよい。このセクションで述べるポリヌクレオチドが、どのようなサイズお
よび配列の核酸フラグメントを構成してもよいことに注意されたい。
【０１０６】 また、本発明には、配列番号1のヌクレオチド位置290653〜292652、292653〜2
96047、292653〜292841、295555〜296047、295580〜296047および296048〜29804
8またはその相補配列またはそのフラグメントのヌクレオチド配列に対して少な
くとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%のヌクレオチド同一
性を有するヌクレオチド配列を含む、精製されたポリヌクレオチド、単離された
ポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドも包含される。配列番号1のヌ
クレオチド位置290652〜292652、292653〜296047、292653〜292841、295555〜29
6047、295580〜296047および296048〜298048に対するヌクレオチドの差異部分は
核酸全体にランダムに分布しているのが普通である。とはいえ、配列番号1のヌ
クレオチド配列に対するヌクレオチド差異部分が主に、エキソンに含まれるコー
ド配列の外に位置する核酸が好ましい。これらの核酸ならびにそのフラグメント
および変異体をオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブとして使用して、
被検試料においてg34665遺伝子のコピーの存在を検出してもよいし、あるいは、
g34665配列内の標的ヌクレオチド配列を増幅してもよい。
【０１０７】 本発明のもう1つの目的は、上記にて定義したストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件下で、配列番号1のヌクレオチド位置292653〜296047、292653
〜292841、295555〜296047、295980〜296047および296048〜298048またはその相
補配列またはその変異体のうちいずれかのg34665ヌクレオチド配列とハイブリダ
イズされる、精製された核酸、単離された核酸または組換え核酸からなる。
【０１０８】 g34665ゲノム核酸は少なくとも3つのエキソンを含む。配列番号1におけるエキ
ソンの位置を表2に詳細に示す。
【０１０９】
【表２】
【０１１０】 このように、本発明は、g34665遺伝子の3つのエキソンからなる群から選択さ
れるヌクレオチド配列またはこれと相補な配列を含む、精製されたポリヌクレオ
チド、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを企図するも
のである。また、本発明は、g34665遺伝子の2つのエキソンの組み合わせを含む
、精製された核酸、単離された核酸または組換え核酸についても扱う。
【０１１１】 イントロンB-Abは、エキソンBとエキソンAbとの間に位置するヌクレオチド配
列を意味するといった具合である。イントロンの位置を表2に詳細に示す。この
ように、本発明は、g34665遺伝子の2つのイントロンからなる群から選択される
ヌクレオチド配列またはこれと相補な配列を含む、精製されたポリヌクレオチド
、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを企図するもので
ある。
【０１１２】 このセクションには「g34665のゲノム配列」というタイトルを付したが、この
セクションで述べるポリヌクレオチドが、g34665のゲノム配列の片側またはこの
ようなゲノム配列2つ以上の間にフランキングして、任意のサイズおよび配列の
核酸フラグメントを構成していてもよいことに注意されたい。
【０１１３】 g34665ポリヌクレオチドまたは遺伝子はさらに、前記遺伝子またはエキソンを
含む領域の境界である非コード5'フランキング領域および非コード3'フランキン
グ領域の両方に制御配列を含むものであってもよい。
【０１１４】 5'調節領域および3'調節領域由来のポリヌクレオチドは、被検試料中において
配列番号1のg34665ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはそのフラグ
メントの少なくともコピーの存在を検出する上で有用なものである。本発明のエ
キソンを含む遺伝子の5'末端と3'末端に調節要素のあるポリヌクレオチドを有効
に利用して、興味の対象となる異種ポリヌクレオチドの転写翻訳活性を制御する
ことができる。
【０１１５】 配列番号1の生物学的に活性なg34665調節フラグメントまたは変異体を含む関
連のあるポリヌクレオチドを同定するための方法も本願明細書にて説明されてい
る。このように、本発明は、g34665の5'調節領域および3'調節領域からなる群か
ら選択されるポリヌクレオチドまたはこれと相補な配列またはその生物学的に活
性なフラグメントまたは変異体を含む、精製された核酸または単離された核酸に
も関するものである。
【０１１６】 (g35017) 一態様では、本発明は、配列番号1のヌクレオチド位置94124〜94964の配列、
これらの配列と相補的な配列ならびにそのフラグメントおよび変異体からなる、
実質的にこれらからなる、またはこれらを含む、g35017ゲノム配列に関するもの
である。これらのポリヌクレオチドは、精製されたポリヌクレオチド、単離され
たポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであってもよい。
【０１１７】 また、本発明には、配列番号1のヌクレオチド位置94124〜94964またはその相
補配列またはそのフラグメントのヌクレオチド配列に対して少なくとも70%、75%
、80%、85%、90%または95%のヌクレオチド同一性を有するヌクレオチド配列を含
む、精製されたポリヌクレオチド、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポ
リヌクレオチドも包含される。配列番号1のヌクレオチド位置94124〜94964に対
するヌクレオチドの差異部分は核酸全体にランダムに分布しているのが普通であ
る。とはいえ、配列番号1のヌクレオチド配列に対するヌクレオチド差異部分が
主に、エキソンに含まれるコード配列の外に位置する核酸が好ましい。これらの
核酸ならびにそのフラグメントおよび変異体をオリゴヌクレオチドプライマーま
たはプローブとして使用して、被検試料においてg35017遺伝子のコピーの存在を
検出してもよいし、あるいは、g35017配列内の標的ヌクレオチド配列を増幅して
もよい。
【０１１８】 本発明のもう1つの目的は、上記にて定義したストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件下で、配列番号1のヌクレオチド位置94124〜94964またはその
相補配列またはその変異体のうちいずれかのg35017ヌクレオチド配列とハイブリ
ダイズされる、精製された核酸、単離された核酸または組換え核酸からなる。
【０１１９】 本発明の特に好ましい核酸は、配列番号1のヌクレオチド位置94124〜94964の
少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、
200または500ヌクレオチドの連続スパンまたはそれらの相補体を含んでなる、単
離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌク
レオチドを含む。本発明の特に好ましい核酸は、配列番号1のヌクレオチド位置9
4124〜94964の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、9
0、100、150、200または500ヌクレオチドの連続スパンまたはそれらの相補体を
含んでなる、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは
組換えポリヌクレオチドであって、前記連続スパンがg35017関連バイアレリック
マーカーを含む、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドま
たは組換えポリヌクレオチドを含む。任意に、前記バイアレリックマーカーが、
表6bにおいてA41で示すバイアレリックマーカーであってもよい。このセクショ
ンで述べるポリヌクレオチドが、どのようなサイズおよび配列の核酸フラグメン
トを構成してもよいことに注意されたい。
【０１２０】 このセクションには「g35017のゲノム配列」というタイトルを付したが、この
セクションで述べるポリヌクレオチドが、g35017のゲノム配列の片側またはこの
ようなゲノム配列2つ以上の間にフランキングして、任意のサイズおよび配列の
核酸フラグメントを構成していてもよいことに注意されたい。
【０１２１】 g35017ポリヌクレオチドまたは遺伝子はさらに、前記遺伝子またはエキソンを
含む領域の境界である非コード5'フランキング領域および非コード3'フランキン
グ領域の両方に制御配列を含むものであってもよい。
【０１２２】 g35017の5'調節領域および3'調節領域由来のポリヌクレオチドは、被検試料中
において配列番号1のg35017ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはそ
のフラグメントの少なくともコピーの存在を検出する上で有用なものである。本
発明のエキソンを含む遺伝子の5'末端と3'末端に調節要素のあるポリヌクレオチ
ドを有効に利用して、興味の対象となる異種ポリヌクレオチドの転写翻訳活性を
制御することができる。
【０１２３】 配列番号1のg35017核酸配列の生物学的に活性な調節フラグメントまたは変異
体を含む関連のあるポリヌクレオチドを同定するための方法も本願明細書にて説
明されている。このように、本発明は、5'調節領域および3'調節領域からなる群
から選択されるポリヌクレオチドまたはこれと相補な配列またはその生物学的に
活性なフラグメントまたは変異体を含む、精製された核酸または単離された核酸
にも関するものである。一態様において、5'調節領域がヌクレオチド配列を含む
ものであってもよい。
【０１２４】 (g35018) 一態様では、本発明は、配列番号1のヌクレオチド位置1108〜65853の配列、こ
れらの配列と相補的な配列ならびにそのフラグメントおよび変異体からなる、実
質的にこれらからなる、またはこれらを含む、g35018ゲノム配列に関するもので
ある。これらのポリヌクレオチドは、精製されたポリヌクレオチド、単離された
ポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであってもよい。
【０１２５】 本発明の特に好ましい核酸は、配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25、3
0、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000ヌクレオチド
の連続スパンを、前記スパンがヌクレオチド位置範囲と整合する限りにおいて含
んでなる、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組
換えポリヌクレオチドであって、前記連続スパンが、配列番号1のヌクレオチド
位置1108〜65853、1108〜1289、14877〜14920、18778〜18862、25593〜25740、2
9388〜29502、29967〜30282、64666〜64812および65505〜65853のうち少なくと
も1、2、3、5または10またはそれらの相補体を含んでなる、単離されたポリヌク
レオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む。
本発明のさらに好ましい核酸は、配列番号1のヌクレオチド位置1108〜65853、11
08〜1289、14877〜14920、18778〜18862、25593〜25740、29388〜29502、29967
〜30282、64666〜64812または65505〜65853の少なくとも12、15、18、20、25、3
0、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000ヌクレオチド
の連続スパンまたはそれらの相補体を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド
、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、前記連
続スパンが、g35018関連バイアレリックマーカーを含む、単離されたポリヌクレ
オチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む。任
意に、前記バイアレリックマーカーが、A1〜A39からなる群から選択されるもの
であってもよい。このセクションで述べるポリヌクレオチドが、どのようなサイ
ズおよび配列の核酸フラグメントを構成してもよいことに注意されたい。
【０１２６】 また、本発明には、配列番号1のヌクレオチド位置31〜1107、1108〜65853、11
08〜1289、14877〜14920、18778〜18862、25593〜25740、29388〜29502、29967
〜30282、64666〜64812、65505〜65853および65854〜67854またはその相補配列
またはそのフラグメントのヌクレオチド配列に対して少なくとも70%、75%、80%
、85%、90%または95%のヌクレオチド同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
精製されたポリヌクレオチド、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌ
クレオチドも包含される。配列番号1のヌクレオチド位置31〜1107、1108〜65853
、1108〜1289、14877〜14920、18778〜18862、25593〜25740、29388〜29502、29
967〜30282、64666〜64812、65505〜65853および65854〜67854に対するヌクレオ
チドの差異部分は核酸全体にランダムに分布しているのが普通である。とはいえ
、配列番号1のヌクレオチド位置31〜1107、1108〜65853、1108〜1289、14877〜1
4920、18778〜18862、25593〜25740、29388〜29502、29967〜30282、64666〜648
12、65505〜65853および65854〜67854のヌクレオチド配列に対するヌクレオチド
差異部分が主に、エキソンに含まれるコード配列の外に位置する核酸が好ましい
。これらの核酸ならびにそのフラグメントおよび変異体をオリゴヌクレオチドプ
ライマーまたはプローブとして使用して、被検試料においてg35018遺伝子のコピ
ーの存在を検出してもよいし、あるいは、g35018配列内の標的ヌクレオチド配列
を増幅してもよい。
【０１２７】 本発明のもう1つの目的は、上記にて定義したストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件下で、配列番号1のヌクレオチド位置31〜1107、1108〜65853、
1108〜1289、14877〜14920、18778〜18862、25593〜25740、29388〜29502、2996
7〜30282、64666〜64812、65505〜65853および65854〜67854またはその相補配列
またはその変異体のうちいずれかのg35018ヌクレオチド配列とハイブリダイズさ
れる、精製された核酸、単離された核酸または組換え核酸からなる。
【０１２８】 本発明のさらに他の核酸は、配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25、30
、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000ヌクレオチドの
連続スパンを、前記スパンがヌクレオチド位置範囲と整合する限りにおいて含ん
でなる、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換
えポリヌクレオチドであって、前記連続スパンが、配列番号1のヌクレオチド位
置1255〜1289、29967〜30115、30225〜30282のうち少なくとも1、2、3、5または
10またはそれらの相補体を含むか、あるいは、前記スパンに対して少なくとも70
%、75%、80%、85%、90%または95%のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチ
ドおよび前記スパンとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを含んでなる、単
離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌク
レオチドを含む。
【０１２９】 g35018ゲノム核酸は少なくとも8つのエキソンを含む。配列番号1におけるエキ
ソンの位置を表3に詳細に示す。
【０１３０】
【表３】
【０１３１】 このように、本発明は、g35018遺伝子の8つのエキソンからなる群から選択さ
れるヌクレオチド配列またはこれと相補な配列を含む、精製されたポリヌクレオ
チド、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを企図するも
のである。また、本発明は、35018遺伝子の少なくとも2つのエキソンの組み合わ
せを含み、ポリヌクレオチドが前記核酸の5'末端から3'末端まで配列番号1と同
じ順序で核酸内に所在する、精製された核酸、単離された核酸または組換え核酸
についても扱う。
【０１３２】 イントロン1は、エキソン1とエキソン2との間に位置するヌクレオチド配列を
意味するといった具合である。イントロンの位置を表3に詳細に示す。このよう
に、本発明は、g35018遺伝子の7つのイントロンからなる群から選択されるヌク
レオチド配列またはこれと相補な配列を含む、精製されたポリヌクレオチド、単
離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを企図するものである
。
【０１３３】 このセクションには「g35018のゲノム配列」というタイトルを付したが、この
セクションで述べるポリヌクレオチドが、g35018のゲノム配列の片側またはこの
ようなゲノム配列2つ以上の間にフランキングして、任意のサイズおよび配列の
核酸フラグメントを構成していてもよいことに注意されたい。
【０１３４】 g35018ポリヌクレオチドまたは遺伝子はさらに、前記遺伝子またはエキソンを
含む領域の境界である非コード5'フランキング領域および非コード3'フランキン
グ領域の両方に制御配列を含むものであってもよい。
【０１３５】 5'調節領域および3'調節領域由来のポリヌクレオチドは、被検試料中において
配列番号1のg35018ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはそのフラグ
メントの少なくともコピーの存在を検出する上で有用なものである。本発明のエ
キソンを含む遺伝子の5'末端と3'末端に調節要素のあるポリヌクレオチドを有効
に利用して、興味の対象となる異種ポリヌクレオチドの転写翻訳活性を制御する
ことができる。
【０１３６】 配列番号1の生物学的に活性な調節フラグメントまたは変異体を含む関連のあ
るポリヌクレオチドを同定するための方法も本願明細書にて説明されている。こ
のように、本発明は、5'調節領域および3'調節領域からなる群から選択されるポ
リヌクレオチドまたはこれと相補な配列またはその生物学的に活性なフラグメン
トまたは変異体を含む、精製された核酸または単離された核酸にも関するもので
ある。
【０１３７】 一実施形態では、5'調節領域が、配列番号1のヌクレオチド位置31〜1107の少
なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、20
0、500または1000ヌクレオチドの連続スパンまたはそれらの相補体を含んでなる
、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリ
ヌクレオチドを含むものであってもよい。一実施形態では、3'調節領域が、配列
番号1のヌクレオチド位置65854〜67854の少なくとも12、15、18、20、25、30、3
5、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000ヌクレオチドの連
続スパンまたはそれらの相補体を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド、精
製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含むものであっても
よい。
【０１３８】 (sbg1ポリヌクレオチドのゲノム配列) 本発明の特に好ましい核酸は、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリ
ヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、配列番号1のヌクレオチ
ド位置213818〜243685の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、
70、80、90、100、150、200、500または1000ヌクレオチドの連続スパンまたはそ
れらの相補体を含む、実質的に当該連続スパンそれらの相補体からなる、または
当該連続スパンそれらの相補体からなる、単離されたポリヌクレオチド、精製さ
れたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む。配列番号1のヌク
レオチド位置213818〜243685またはその相補配列またはそのフラグメントに対す
るヌクレオチド同一性が少なくとも70、75、80、85、90または95%であるヌクレ
オチド配列を含む、精製されたポリヌクレオチド、単離されたポリヌクレオチド
または組換えポリヌクレオチドも包含される。本発明の核酸は、霊長類、非ヒト
霊長類、哺乳動物およびヒトのsbg1核酸を始めとして、あらゆるソース由来のsb
g1核酸を包含する。
【０１３９】 本発明のさらに好ましい核酸は、配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25
、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000ヌクレオチ
ドの連続スパンまたはそれらの相補体を含んでなる、単離されたポリヌクレオチ
ド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、前記
連続スパンが、sbg1関連バイアレリックマーカーを含む、単離されたポリヌクレ
オチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む。任
意に、前記バイアレリックマーカーが、A85〜A219からなる群から選択されるも
のであってもよい。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A85〜A94、A96〜A
106、A108〜A112、A114〜A177、A179〜A197およびA199〜A219からなる群から選
択されるものであってもよい。
【０１４０】 このセクションで述べるポリヌクレオチドが、どのようなサイズおよび配列の
核酸フラグメントを構成してもよいことに注意されたい。
【０１４１】 ヒトsbg1遺伝子は、本願明細書において、エキソンMS1、M1、M692、M862、MS2
、M1069、M1090、M1117、N、N2、Nbis、O、O1、O2、Obis、P、X、Q1、Q、Qbis、
RbisおよびRと呼ばれる少なくとも22種類のエキソンまたはエキソン形態から選
択されたエキソンを含む。このうち、以下のエキソンの集合に配列のオーバーラ
ップが含まれ、これがmRNAで同時に発生することはない。エキソンM1、M692、M8
62、MS2、M1090、M1069およびM1117。エキソンMS1、M1、M692およびM862。エキ
ソンNおよびN2。エキソンO1およびO2。エキソンQおよびQbis。エキソンRおよびR
bis。エキソンQおよびQ1。
【０１４２】 配列番号1におけるsbg1エキソンのヌクレオチド位置を表4に詳細に示す。sbg1
遺伝子のエキソン構造については図1にさらに示す。
【０１４３】
【表４】
【０１４４】 このように、本発明は、sbg1遺伝子のエキソンからなる群から選択されるヌク
レオチド配列またはこれと相補な配列を含む、精製されたポリヌクレオチド、単
離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを企図するものである
。好ましいのは、sbg1遺伝子のエキソンMS1、M1、M692、M862、MS2、M1069、M10
90、M1117、N、N2、Nbis、O、O1、O2、Obis、P、X、Q1、Q、Qbis、RおよびRbis
からなる群から選択される表4に列挙されるヌクレオチド位置範囲を有するエキ
ソンまたはその相補配列またはそのフラグメントまたは変異体を少なくとも1つ
含む、精製されたポリヌクレオチド、単離されたポリヌクレオチドまたは組換え
ポリヌクレオチドである。また、エキソンMS1、M1、M692、M862、MS2、M1069、M
1090、M1117、N、N2、Nbis、O、O1、O2、Obis、P、X、Q1、Q、Qbis、RおよびRbi
sからなる群から選択されるsbg1遺伝子のエキソン少なくとも2つの組み合わせを
含み、ポリヌクレオチドが配列番号1と同じ順序で核酸内に所在する、精製され
た核酸、単離された核酸または組換え核酸も本発明に包含される。
【０１４５】 本発明の特に好ましい核酸は、配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25、3
0、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100または200ヌクレオチド
の連続スパンを含んでなる、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌク
レオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、前記連続スパンが、配列番号
1のヌクレオチド位置213818〜215818、215819〜215941、215819〜215975、21666
1〜216952、216661〜217061、217027〜217061、229647〜229742、230408〜23072
1、231272〜231412、231787〜231880、231870〜231879、234174〜234321、23740
6〜237428、239719〜239807、239719〜239853、240528〜240569、240528〜24059
6、240528〜240617、240528〜240644、240528〜240824、240528〜240994、24052
8〜241685、240800〜240993および241686〜243685またはそれらの相補体のうち
少なくとも1、2、3、5または10を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド、精
製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む。
【０１４６】 本発明のもう1つの目的は、上記にて定義したストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件で、配列番号1のヌクレオチド位置213818〜243685、213818〜2
15818、215819〜215941、215819〜215975、216661〜216952、216661〜217061、2
17027〜217061、229647〜229742、230408〜230721、231272〜231412、231787〜2
31880、231870〜231879、234174〜234321、237406〜237428、239719〜239807、2
39719〜239853、240528〜240569、240528〜240596、240528〜240617、240528〜2
40644、240528〜240824、240528〜240994、240528〜241685、240800〜240993ま
たは241686〜243685のsbg1ヌクレオチド配列またはその相補配列またはその変異
体とハイブリダイズされる、精製された核酸、単離された核酸または組換え核酸
からなる。
【０１４７】 本発明はさらに、sbg1遺伝子のイントロンまたはこれと相補な配列からなる群
から選択されるヌクレオチド配列を含む、精製されたポリヌクレオチド、単離さ
れたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを企図するものである。
【０１４８】 他の実施形態では、本発明は、配列番号1のヌクレオチド位置215819〜241685
の配列、これと相補な配列ならびにそのフラグメントおよび変異体からなる、実
質的にこれからなる、またはこれを含む、sbg1遺伝子ならびにsbg1ゲノム配列を
包含する。
【０１４９】 また、本発明は、配列番号1のヌクレオチド位置213818〜215818、215819〜215
941、215819〜215975、216661〜216952、216661〜217061、217027〜217061、229
647〜229742、230408〜230721、231272〜231412、231787〜231880、231870〜231
879、234174〜234321、237406〜237428、239719〜239807、239719〜239853、240
528〜240569、240528〜240596、240528〜240617、240528〜240644、240528〜240
824、240528〜240994、240528〜241685、240800〜240993および241686〜243685
からなる群から選択される配列またはその相補配列またはそのフラグメントに対
して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%または95%のヌクレオチド同一性を有す
るsbg1のヌクレオチド配列を含む、精製されたポリヌクレオチド、単離されたポ
リヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドも包含する。配列番号1のヌクレ
オチド位置213818〜215818、215819〜215941、215819〜215975、216661〜216952
、216661〜217061、217027〜217061、229647〜229742、230408〜230721、231272
〜231412、231787〜231880、231870〜231879、234174〜234321、237406〜237428
、239719〜239807、239719〜239853、240528〜240569、240528〜240596、240528
〜240617、240528〜240644、240528〜240824、240528〜240994、240528〜241685
、240800〜240993および241686〜243685に対するヌクレオチドの差異部分は核酸
全体に分布しているのが普通である。
【０１５０】 これらの核酸ならびにそのフラグメントおよび変異体をオリゴヌクレオチドプ
ライマーまたはプローブとして使用して、被検試料においてsbg1核酸配列を含む
遺伝子のコピーの存在を検出してもよいし、あるいは、sbg1核酸配列内または隣
接している領域の標的ヌクレオチド配列を増幅してもよい。
【０１５１】 本発明の別の好ましい核酸は、配列番号1のヌクレオチド位置213818〜215818
、215819〜215941、215819〜215975、216661〜216952、216661〜217061、217027
〜217061、229647〜229742、230408〜230721、231272〜231412、231787〜231880
、231870〜231879、234174〜234321、237406〜237428、239719〜239807、239719
〜239853、240528〜240569、240528〜240596、240528〜240617、240528〜240644
、240528〜240824、240528〜240994、240528〜241685、240800〜240993、215819
〜241685および241686〜243685の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、
45、50、55、60、65、70、75、80、90、100または200ヌクレオチドの連続スパン
またはそれらの相補体を含んでなる、単離されたsbg1ポリヌクレオチド、精製さ
れたsbg1ポリヌクレオチドまたは組換えsbg1ポリヌクレオチドであって、前記連
続スパンが、少なくとも1つのバイアレリックマーカーを含む、単離されたsbg1
ポリヌクレオチド、精製されたsbg1ポリヌクレオチドまたは組換えsbg1ポリヌク
レオチドを含む。任意に、前記連続スパンが、sbg1関連バイアレリックマーカー
を含むものであってもよい。このセクションで述べるポリヌクレオチドが、どの
ようなサイズおよび配列の核酸フラグメントを構成してもよいことに注意された
い。前記バイアレリックマーカーには、オリジナルアレルまたは別のアレルのど
ちらが存在していてもよい。
【０１５２】 本発明のさらに他の核酸は、配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25、30
、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200または500ヌクレオチドの連続ス
パンを、前記スパンがヌクレオチド位置範囲と整合する限りにおいて含んでなる
、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリ
ヌクレオチドであって、前記連続スパンが、配列番号1のヌクレオチド位置21582
0〜215941、216661〜217009、230409〜290721、231272〜231411、234202〜23432
1、240528〜240567、240528〜240827および240528〜240996またはそれらの相補
体のうち少なくとも1、2、3、5または10を含むものならびに前記スパンに対して
少なくとも70%、75%、80%、85%、90%または95%のヌクレオチド同一性を有するポ
リヌクレオチドおよび前記スパンとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを含
むものである、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまた
は組換えポリヌクレオチドを含む。
【０１５３】 また、本発明は、配列番号27〜35のうちいずれか1つのアミノ酸配列またはそ
のペプチドフラグメントまたはその変異体を有するsbg1タンパク質をコードする
、精製または単離された核酸を含む。
【０１５４】 このセクションには「sbg1のゲノム配列」というタイトルを付したが、このセ
クションで述べるポリヌクレオチドが、sbg1のゲノム配列の片側またはこのよう
なゲノム配列2つ以上の間にフランキングして、任意のサイズおよび配列の核酸
フラグメントを構成していてもよいことに注意されたい。
【０１５５】 (Sbg1 cDNA配列) sbg1遺伝子が発現することで、いくつかのmRNA種が産生されることが明らかに
なっている。これらのmRNAに対応するいくつかのcDNA配列を配列番号2〜26で示
す。
【０１５６】 本発明は、配列番号2〜26、それらと相補的な配列、そのスプライス変異体な
らびにアレル変異体およびそのフラグメントからなる群から選択されるヌクレオ
チド配列を含む精製された核酸、単離された核酸または組換え核酸を包含する。
さらに、本発明の好ましいポリヌクレオチドは、配列番号2〜26からなる群から
選択されるヌクレオチド配列からなる、実質的にこれからなるまたはこれを含む
、精製された、単離されたまたは組換えsbg1 cDNAを含む。本発明の特に好まし
い核酸は、配列番号2〜26からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なく
とも8、12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、75、80、100、200また
は500ヌクレオチドの連続スパンまたはそれらの相補体を、前記連続スパンの長
さが配列番号の長さと整合する限りにおいて含んでなる、単離されたポリヌクレ
オチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む。
【０１５７】 このセクションで述べるポリヌクレオチドが、どのようなサイズおよび配列の
核酸フラグメントを構成してもよいことに注意されたい。 本発明は、配列番号2〜26からなる群から選択されるポリヌクレオチド〜に対
して少なくとも70%、80%、85%、90%または95%のヌクレオチド同一性を有し、配
列番号2〜26からなる群から選択されるポリヌクレオチドまたはそれらと相補な
配列またはその生物学的に活性なフラグメントに対して99%のヌクレオチド同一
性を有すると都合が良く、99.5%のヌクレオチド同一性を有すると好ましく、99.
8%のヌクレオチド同一性を有すると最も好ましいポリヌクレオチドを含む、精製
または単離された核酸にも関するものである。
【０１５８】 本発明のもう1つの目的は、本願明細書にて定義したストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件下で、配列番号2〜26からなる群から選択されるポリヌ
クレオチドまたはこれと相補な配列またはその変異体またはその生物学的に活性
なフラグメントとハイブリダイズされるポリヌクレオチドを含む、精製された核
酸、単離された核酸または組換え核酸に関するものである。
【０１５９】 配列番号2〜26のsbg1 cDNA形態について、以下の表5aでさらに説明する。表5a
に示されているのは、5'UTR、読み枠(ORF)、3'UTRおよびポリAシグナルのそれぞ
れの配列番号での位置である。また、各配列番号のcDNA形態を含むsbg1エキソン
も示してある。
【０１６０】
【表５】
【０１６１】 上記にて列挙した特定のsbg1 cDNAをさまざまな組織由来のRNAから単離するの
に用いられるプライマーを以下の表5bにあげておく。エキソンMS1、M862、M1090
、M1117およびMS2ならびにエキソンPおよびRの核酸配列にハイブリダイズさせる
べく設計されたプライマーによって、いくつかのプライマー集合について複数の
cDNA形態をクローニングすることができる。使用するプライマーを配列番号44〜
53に列挙する。
【０１６２】 sbg1のmRNA形態は組織によって異なることが見出された。表5cにsbg1 mRNA形
態を列挙し、この形態各々についてさまざまな組織からクローニングしたcDNA形
態、観察された組織1つあたりのクローン数およびクローンの相対比率をあげて
おく。
【０１６３】 また、本願発明者らは、さまざまな組織から得られるものとしてcDNA配列のさ
らに他のバリエーションも同定し、コンセンサスsbg1ゲノムヌクレオチド配列と
比較した。cDNAのクローニング元になった組織については、11〜60の番号を付し
てプールされた個体から得た。また、配列番号2のsbg1 cDNA配列上のヌクレオチ
ド位置それぞれについて、変異体の同一性、配列番号2のヌクレオチド配列のバ
リエーションのヌクレオチド位置および特定の配列を有する試料数を以下の表5d
にあげておく。配列番号2のcDNAにおけるヌクレオチド配列のバリエーションの
結果として、(本願明細書にて説明する)対応のsbg1ポリペプチド配列にアミノ酸
の変化が生じた場合は、このアミノ酸の変化も表5dに示してある。
【０１６４】 これらの変異体は希な多型を示すこともあれば、組織特異的なRNA編集の結果
のこともある。あるいは、バリエーションの中には、発現の組織特異性が厳密で
あり、遺伝子構造のバリエーションが少ない、sbg1関連遺伝子またはsbg1関連遺
伝子の小さなファミリ1種またはそれ以上にヒトゲノムが存在することによって
生じるものもある。本願出願人らは、これらの遺伝子のエキソン-イントロン構
造が同一である場合の事例について、後者の仮説を検証したところ、少なくとも
エキソンMおよびNのバリエーションは関連のある遺伝子が存在することによって
生じるわけではないことが明らかになった。
【０１６５】 このため、本発明は、以下の表5dに列挙するようなヌクレオチド置換少なくと
も1つを含む変異体sbg1ポリヌクレオチドも包含する。表5dに示すようなヌクレ
オチドおよびアミノ酸のバリエーションは、配列番号2のヌクレオチド配列に関
して示されているものであり、エキソンM862、N、O、QbisおよびRに見られるバ
リエーションを特定している。本発明は、精製されたポリヌクレオチド、単離さ
れたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドならびにこれによってコー
ドされるポリペプチドであって、ポリヌクレオチドが、配列番号2の少なくとも8
、12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、100、150または200
ヌクレオチドの連続スパンまたはそれらの相補体を含み、前記連続スパンが、表
5dに示すヌクレオチド配列バリエーションをさらに含む、精製されたポリヌクレ
オチド、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドならびにこ
れによってコードされるポリペプチドを包含する。
【０１６６】 本発明は、sbg1タンパク質またはそのペプチドフラグメントまたは変異体をコ
ードする、精製または単離されたsbg1 cDNAを含む。一実施形態では、sbg1タン
パク質をコードする精製または単離された核酸は、配列番号27〜35またはペプチ
ドフラグメントまたはその変異体のいずれかのアミノ酸配列を有する。
【０１６７】 本発明の好ましい核酸には、配列番号2〜26からなる群から選択されるヌクレ
オチド配列の少なくとも8、12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、75
、80、100、200または500ヌクレオチドの連続スパンまたはそれらの相補体を含
む、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポ
リヌクレオチドであって、前記スパンが、本発明のsbg1関連バイアレリックマー
カーを含む、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは
組換えポリヌクレオチドも含まれる。本発明のバイアレリックマーカーから選択
したいくつかのバイアレリックマーカーのsbg1 cDNA配列およびポリペプチド配
列における位置を以下の表5eにあげておく。前記連続スパンは、表5eに列挙され
るバイアレリックマーカーからなる群から選択されるバイアレリックマーカーを
含むものであってもよい。任意に、前記バイアレリックマーカーが、表5eに列挙
するようなsbg1 cDNA形態に位置するバイアレリックマーカーからなる群から選
択されるものであってもよい。任意に、前記バイアレリックマーカーが、表5eに
列挙するようなsbg1コード配列に位置するバイアレリックマーカーからなる群か
ら選択されるものであってもよい。
【０１６８】 ノーザンブロットによってsbg1 mRNAの発現をさらに確認した。sbg1遺伝子の
エキソンOに対応するプローブを用いて、sbg1 mRNAに対応するバンドを検出した
。
【０１６９】 このセクションには「sbg1 cDNA配列」というタイトルを付したが、このセク
ションで述べるポリヌクレオチドが、sbg1のゲノム配列の片側またはこのような
ゲノム配列2つ以上の間にフランキングして、任意のサイズおよび配列の核酸フ
ラグメントを構成していてもよいことに注意されたい。
【０１７０】
【表６】
【０１７１】
【表７】
【０１７２】
【表８】
【０１７３】
【表９】
【０１７４】 (sbg1コード領域) sbg1読み枠が、配列番号2〜26からなる群から選択されるcDNA配列の対応するm
RNAに含まれている。有効なsbg1コード配列(CDS)は、配列番号27〜35の少なくと
も4アミノ酸、好ましくは6アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも8または10ア
ミノ酸、一層好ましくは少なくとも12、15、20、25、30、40、50または100アミ
ノ酸の連続スパンを含むポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチ
ド、精製されたポリヌクレオチドおよび組換えポリヌクレオチドを包含するいく
つかの実施形態において、上述したような複数の形態を含むものであってもよい
。有効なsbg1コード配列(CDS)は、上記の表5aに示すような配列番号2〜26の停止
コドンの末端ヌクレオチドとATGコドンの第1のヌクレオチドとの間の領域を含む
ものであってもよい。
【０１７５】 sbg1遺伝子のコード配列を含む上記にて開示したポリヌクレオチドを適当な発
現シグナルの制御下におけば、このポリヌクレオチドを所望の宿主細胞または所
望の宿主生物で発現させることができる。発現シグナルは、本発明のsbg1遺伝子
の調節領域に含まれる発現シグナルであってもよいし、一方、外因性調節核酸配
列であってもよい。適当な発現シグナル下におくことで、このようなポリヌクレ
オチドをその発現および/または増幅用のベクターに挿入することもできる。
【０１７６】 (sbg1の制御配列) 上述したように、sbg1遺伝子のゲノム配列は、この遺伝子のエキソンを含むsb
g1コード領域の境界をなす5'フランキング非コード領域と3'フランキング非コー
ド領域の両方に制御配列を含む。
【０１７７】 一態様において、sbg1遺伝子の3'制御配列は、配列番号1のヌクレオチド配列
の位置213818のヌクレオチドと位置215818のヌクレオチドとの間に局在する配列
を含むものであってもよい。一態様において、sbg1遺伝子の5'制御配列は、配列
番号1の特定形態のエキソンMの5'末端とヌクレオチド位置243685との間に局在す
る配列を含むものであってもよい。
【０１７８】 5'調節領域および3'調節領域由来のポリヌクレオチドは、配列番号1のsbg1ヌ
クレオチド配列、またはそのフラグメントの少なくともコピーの被検試料中にお
ける存在を検出する上で有用なものである。
【０１７９】 sbg1に含まれる5'調節領域のプロモーター活性を後述するようにして評価する
ことができる。
【０１８０】 sbg1調節領域の関連の生物学的に活性なポリヌクレオチドフラグメントまたは
変異体を同定するにあたり、当業者であれば、配列番号1のsbg1配列の生物学的
に活性なポリヌクレオチドフラグメントまたは変異体の制御下におかれると発現
が検出されるマーカー遺伝子(すなわち、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼなど)を有する組換えベクターを使用するこ
とについて説明したSambrook et al.(1989)を参照することであろう。sbg1遺伝
子の第1エキソン上流に位置するゲノム配列を、クロンテック社から入手可能なp
SEAP-Basic、pSEAP-Enhancer、pβgal-Basic、pβgal-EnhancerまたはpEGFP-1プ
ロモーターレポーターベクターなどの適当なプロモーターレポーターベクター、
あるいは、pGL2-basicまたはpGL3-basicプロモーターレスルシフェラーゼレポー
ター遺伝子ベクター(いずれもプロメガ社)にクローニングすることができる。簡
単に説明すると、これらのプロモーターレポーターベクターは各々複数のクロー
ニング部位を含み、これらのクローニング部位は、分泌後のアルカリホスファタ
ーゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼまたは緑色蛍光タンパク質などの容
易にアッセイ可能なタンパク質をコードするレポーター遺伝子の上流に位置する
。sbg1コード領域上流の配列をレポーター遺伝子上流のクローニング部位に両方
の向きで挿入し、適当な宿主細胞に導入する。レポータータンパク質のレベルを
アッセイし、クローニング部位に挿入物がないベクターでのレベルと比較する。
挿入物を含むベクターの発現レベルが対照ベクターよりも高いことから、挿入物
にプロモーターが存在することが分かる。必要であれば、エンハンサーを含むベ
クターに上流の配列をクローニングし、弱いプロモーター配列での転写レベルを
増大させてもよい。発現レベルが挿入物のないベクターで観察されたレベルを有
意に上回ることから、挿入された上流配列にプロモーター配列が存在することが
分かる。
【０１８１】 エキソヌクレアーゼIIIまたは適当な制限エンドヌクレアーゼでの消化などの
従来の手法を用いて上流DNAに入れ子状態の5'および/または3'欠失を構築するこ
とによって、上流のゲノムDNA内のプロモーター配列をさらに定義することがで
きる。たとえば、Coles et al.(1998)によって説明されているように、上記のよ
うにして得られる欠失フラグメントをプロモーターレポーターベクターに挿入し
、欠失によってプロモーター活性が低減または消失したか否かを判断することが
できる。このようにしてプロモーターの境界を定義することができる。必要であ
れば、部位定方向突然変異誘発またはリンカースキャニングによってプロモータ
ー内の個々の潜在的な調節部位を同定し、プロモーター内の潜在的な転写因子結
合部位を個々にまたは組み合わせで消失させてもよい。これらの変異種が転写レ
ベルに対しておよぼす影響については、プロモーターレポーターベクターのクロ
ーニング部位に変異種を挿入することで判断することができる。このタイプのア
ッセイは当業者間で周知であり、国際特許出願公開第WO97/17359号、米国特許第
5,374,544号、欧州特許第582 796号、米国特許第5,698,389号、同第5,643,746号
、同第5,502,176号および同第5,266,488号に記載されている。
【０１８２】 異なるタイプの細胞および組織でsbg1プロモーターに作用的に結合する検出可
能なポリヌクレオチドの発現レベルに基づいて、sbg1遺伝子のプロモーターの強
度と特異性を評価することができる。検出可能なポリヌクレオチドは、あらかじ
め定義されたオリゴヌクレオチドプローブと特異的にハイブリダイズされるポリ
ヌクレオチドか、sbg1ポリペプチドまたはそのフラグメントまたはその変異体を
含む、検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドのいずれであっても
よい。このタイプのアッセイは当業者間で周知であり、米国特許第5,502,176号
および同第5,266,488号に記載されている。これらの方法のうちいくつかについ
て、以下において詳細に説明する。
【０１８３】 sbg1コード領域の5'末端と3'末端に調節要素のあるポリヌクレオチドを有効に
利用して、興味の対象となる異種ポリヌクレオチドの転写翻訳活性を制御するこ
とができる。
【０１８４】 したがって、本発明は、sbg1の5'および3'調節領域からなる群から選択される
ポリヌクレオチドまたはこれと相補な配列またはその生物学的に活性なフラグメ
ントまたはその変異体を含む、精製または単離された核酸にも関するものである
。一態様において、「3'調節領域」は、配列番号1の位置213818と215818との間
に位置するヌクレオチド配列を含むものであってもよい。一態様において、「5'
調節領域」は、配列番号1のエキソンMの特定変異体の5'末端とヌクレオチド位置
243685との間に位置するヌクレオチド配列を含むものであってもよい。特定形態
のエキソンMの5'末端は、配列番号1のヌクレオチド位置240569、241596、240617
、240644、240824、240994、241685および240993からなる群から選択されるもの
であってもよい。好ましい態様では、5'調節領域は、配列番号1のヌクレオチド
位置241686〜243685のヌクレオチドを含む。
【０１８５】 また、本発明は、5'調節領域および3'調節領域からなる群から選択されるポリ
ヌクレオチドに対するヌクレオチド同一性が少なくとも95%であり、5'調節領域
および3'調節領域からなる群から選択されるポリヌクレオチドまたはこれと相補
な配列またはその変異体またはその生物学的に活性なフラグメントに対するヌク
レオチド同一性が99%であると都合がよく、ヌクレオチド同一性が99.5%であると
好ましく、ヌクレオチド同一性が99.8%であると最も好ましいポリヌクレオチド
を含む、精製または単離された核酸にも関するものである。
【０１８６】 本発明のもう1つの目的は、本願明細書にて定義するストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件下で、sbg1の5'調節領域および3'調節領域のヌクレオチ
ド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドまたはこれと相補な配列また
はその変異体またはその生物学的に活性なフラグメントとハイブリダイズされる
ポリヌクレオチドを含む、精製された核酸、単離された核酸または組換え核酸か
らなる。
【０１８７】 5'調節領域の好ましいフラグメントは、約1500または1000ヌクレオチド長、好
ましくは約500ヌクレオチド長、さらに好ましくは約400ヌクレオチド長、一層好
ましくは300ヌクレオチド長、最も好ましくは約200ヌクレオチド長である。
【０１８８】 3'調節領域の核酸の好ましいフラグメントは、少なくとも50、100、150、200
、300または400塩基長である。
【０１８９】 配列番号1の「生物学的に活性な」sbg1ポリヌクレオチド誘導体は、組換え細
胞宿主で組換えポリペプチドまたは組換えポリヌクレオチドを発現するための調
節領域として機能するポリヌクレオチドのフラグメントを有するまたは選択的に
このフラグメントからなる前記ポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチド
は、エンハンサーまたはリプレッサーとして機能できる。
【０１９０】 本発明の目的で、核酸またはポリヌクレオチドは、前記調節ポリヌクレオチド
が転写翻訳調節情報を持つ核酸配列を含み、このような配列が所望のポリペプチ
ドまたは所望のポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列と「作用的に結
合」している場合に、組換えポリペプチドまたは組換えポリヌクレオチドを発現
するための調節領域として「機能する」。
【０１９１】 本発明の調節ポリヌクレオチドは、たとえばSambrook et al.(1989)に記載さ
れているように、適当な制限酵素を用いて切断することで、配列番号1のヌクレ
オチド配列のいずれからでも調製可能なものである。また、Bal31(Wabiko et al
., 1986)などのエキソヌクレアーゼ酵素で配列番号1を消化して上記の調節ポリ
ヌクレオチドを調製することも可能である。さらに、本願明細書の他の箇所で述
べるような核酸の化学合成によって調節ポリヌクレオチドを調製することもでき
る。
【０１９２】 本発明によるsbg1調節ポリヌクレオチドは、所望の宿主細胞または宿主生物で
のコード配列の発現に使用できる組換え発現ベクターの一部をなすものであって
もよい。本発明による組換え発現ベクターについては、本願明細書の他の部分で
説明してある。
【０１９３】 本発明の好ましい5'調節ポリヌクレオチドとしては、sbg1 cDNAの5'非翻訳領
域(5'-UTR)、あるいはその生物学的に活性なフラグメントまたは変異体があげら
れる。
【０１９４】 本発明の好ましい3'調節ポリヌクレオチドとしては、sbg1 cDNAの3'非翻訳領
域(3'-UTR)、あるいはその生物学的に活性なフラグメントまたは変異体があげら
れる。
【０１９５】 本発明のさらに他の目的は、含む、精製または単離された核酸からなるもので
ある。 a) (i) sbg1 5'調節領域のポリヌクレオチドまたはその相補配列を含むヌク
レオチド配列と、 (ii) sbg1 5'調節領域またはその相補配列のヌクレオチド配列に対するヌク
レオチド同一性が少なくとも95%であるポリヌクレオチドを含むヌクレオチド配
列と、 (iii) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、sbg1 5'調節領
域のヌクレオチド配列またはその相補配列とハイブリダイズされるポリヌクレオ
チドを含むヌクレオチド配列と、 (iv) (i)、(ii)および(iii)のポリヌクレオチドの生物学的に活性なフラグメ
ントまたは変異体と、 からなる群から選択される調節ヌクレオチド配列を含む核酸と、 b) 上記の(a)にて定義した核酸に作用的に結合された、所望のポリペプチド
または興味の対象である核酸をコードするポリヌクレオチドと、 c) 任意に、3'調節ポリヌクレオチド、好ましくはsbg1遺伝子の3'調節ポリヌ
クレオチドを含む核酸と、
【０１９６】 上記にて定義した核酸の特定の実施形態では、前記核酸が、sbg1 cDNAの5'非
翻訳領域(5'-UTR)あるいはその生物学的に活性なフラグメントまたは変異体を含
む。
【０１９７】 上記にて定義した核酸の第2の特定の実施形態では、前記核酸が、sbg1 cDNAの
3'非翻訳領域(3'-UTR)あるいはその生物学的に活性なフラグメントまたは変異体
を含む。
【０１９８】 5'調節領域の調節ポリヌクレオチドまたはその生物学的に活性なフラグメント
または変異体を、所望のポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードするポリ
ヌクレオチドの5'末端に作用的に結合させる。
【０１９９】 3'調節領域の調節ポリヌクレオチド、またはその生物学的に活性なフラグメン
トまたは変異体を、所望のポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードするポ
リヌクレオチドの3'末端に作用的に結合させると都合がよい。
【０２００】 上述した核酸によってコードされる所望のポリペプチドは、さまざまな性質ま
たは由来のものでよく、原核生物または真核生物由来のタンパク質もこれに包含
される。sbg1調節領域の制御下で発現されるポリペプチドとしては、バクテリア
抗原、菌抗原またはウイルス抗原があげられる。また、「ハウスキーピング」タ
ンパク質のような細胞内タンパク質などの真核生物タンパク質、レセプターなど
の膜結合タンパク質、サイトカインなどの内在性メディエーターのような分泌タ
ンパク質も包含される。所望のポリペプチドは、sbg1タンパク質、特に、配列番
号27〜35のアミノ酸配列のタンパク質またはそのフラグメントまたは変異体であ
ってもよい。
【０２０１】 通常はRNA分子である上述したポリヌクレオチドによってコードされる所望の
核酸は、sbg1コード配列などの所望のコードポリヌクレオチドに対して相補なも
のであってもよいため、アンチセンスポリヌクレオチドとして有用である。
【０２０２】 このようなポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込み、宿主細胞また
は宿主生物で所望のポリペプチドまたは所望の核酸を発現させてもよい。本願明
細書にて説明するものなどのポリヌクレオチドを含む好適な組換えベクターは、
本願明細書の他の部分にて開示されている。
【０２０３】 (sbg2ポリヌクレオチドのゲノム配列) 本発明の特に好ましいsbg2核酸は、前記スパンの長さが前記ヌクレオチド位置
範囲と整合する限りにおいて、配列番号1のヌクレオチド位置201188〜216915、2
01188〜201234、214676〜214793、215702〜215746および216836〜216915の少な
くとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200
ヌクレオチドの連続スパンまたはそれらの相補体を、含んでなる、単離されたポ
リヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを
含む。
【０２０４】 このセクションで述べるポリヌクレオチドが、どのようなサイズおよび配列の
核酸フラグメントを構成してもよいことに注意されたい。
【０２０５】 ヒトsbg2遺伝子は、本願明細書ではエキソンS、T、UおよびVと呼ぶ少なくとも
4つのエキソンから選択されるエキソンを含む。配列番号1におけるsbg2エキソン
のヌクレオチド位置を以下の表5fに詳細に示す。
【０２０６】
【表１０】
【０２０７】 このように、本発明は、sbg2遺伝子のエキソンからなる群から選択されるヌク
レオチド配列またはこれと相補な配列を含む、精製されたポリヌクレオチド、単
離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを企図するものである
。好ましいのは、sbg2遺伝子のエキソンS、T、UおよびVからなる群から選択され
る、表5fに列挙したヌクレオチド位置範囲を有するエキソン少なくとも1つまた
はその相補配列またはそのフラグメントまたはその変異体を含む、精製されたポ
リヌクレオチド、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドで
ある。また、エキソンS、T、UおよびVからなる群から選択されるsbg2遺伝子のエ
キソン少なくとも2つの組み合わせを含み、ポリヌクレオチドが、配列番号1と同
じ相対順序で核酸内に所在する、精製された核酸、単離された核酸または組換え
核酸も本発明に包含される。
【０２０８】 本発明はさらに、sbg2遺伝子のイントロンからなる群から選択されるヌクレオ
チド配列またはそれらと相補な配列を含んでなる、精製されたポリヌクレオチド
、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを企図したもので
ある。イントロンの位置を表5fに詳細に示す。イントロンSは、エキソンSとエキ
ソンTとの間のヌクレオチド配列を意味するといった具合である。したがって、
本発明は、sbg2遺伝子の3つのイントロンからなる群から選択されるヌクレオチ
ド配列またはそれらと相補な配列を含んでなる、精製されたポリヌクレオチド、
単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを企図するものであ
る。
【０２０９】 また、本発明は、配列番号1のヌクレオチド位置201188〜216915、201188〜201
234、214676〜214793、215702〜215746および216836〜216915からなる群から選
択される配列またはその相補配列またはそのフラグメントに対するヌクレオチド
同一性が少なくとも70、75、80、85、90、95、98または99%であるsbg2のヌクレ
オチド配列を含む精製されたポリヌクレオチド、単離されたポリヌクレオチドま
たは組換えポリヌクレオチドを包含する。配列番号1のヌクレオチド位置201188
〜216915、201188〜201234、214676〜214793、215702〜215746および216836〜21
6915に関するヌクレオチド差は、核酸全体にほぼ無作為に分布したものであって
もよい。
【０２１０】 本発明のもう1つの目的は、本願明細書にて定義するストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件下で、配列番号1のヌクレオチド位置201188〜216915、2
01188〜201234、214676〜214793、215702〜215746および216836〜216915または
これと相補な配列またはその変異体またはその生物学的に活性なフラグメントか
らなる群から選択されるポリヌクレオチドとハイブリダイズされるポリヌクレオ
チドを含む、精製された核酸、単離された核酸または組換え核酸に関するもので
ある。
【０２１１】 本発明のさらに他の好ましい核酸は、配列番号1のヌクレオチド位置201188〜2
16915、201188〜201234、214676〜214793、215702〜215746および216836〜21691
5の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75
、80、90、100または200ヌクレオチドの連続スパンまたはそれらの相補体を含む
、単離されたsbg2ポリヌクレオチド、精製されたsbg2ポリヌクレオチドまたは組
換えsbg2ポリヌクレオチドであって、前記連続スパンがsbg2関連バイアレリック
マーカーを含む、単離されたsbg2ポリヌクレオチド、精製されたsbg2ポリヌクレ
オチドまたは組換えsbg2ポリヌクレオチドを含む。任意に、前記バイアレリック
マーカーが、A79〜A99からなる群から選択されるものであってもよい。このセク
ションで述べるポリヌクレオチドが、どのようなサイズおよび配列の核酸フラグ
メントを構成してもよいことに注意されたい。前記バイアレリックマーカーには
、オリジナルアレルまたは別のアレルのどちらが存在していてもよい。
【０２１２】 sbg2ポリヌクレオチドまたは遺伝子はさらに、前記遺伝子sまたはエキソンを
含む領域の境界をなす5'フランキング非コード領域と3'フランキング非コード領
域の両方に制御配列を含む。5'調節領域および3'調節領域由来のポリヌクレオチ
ドは、被検試料中において配列番号1のsbg2ヌクレオチド配列を含むヌクレオチ
ド配列またはそのフラグメントの少なくともコピーの存在を検出する上で有用な
ものである。本発明のエキソンを含む遺伝子の5'末端と3'末端に調節要素のある
ポリヌクレオチドを有効に利用して、興味の対象となる異種ポリヌクレオチドの
転写翻訳活性を制御することができる。
【０２１３】 このセクションには「sbg2 cDNA配列」というタイトルを付したが、このセク
ションで述べるポリヌクレオチドが、sbg2のゲノム配列の片側またはこのような
ゲノム配列2つ以上の間にフランキングして、任意のサイズおよび配列の核酸フ
ラグメントを構成していてもよいことに注意されたい。
【０２１４】 (ポリヌクレオチドコンストラクト) 本願明細書では、「ポリヌクレオチドコンストラクト」および「組換えポリヌ クレオチド 」という用語を同義なものとして使用する。この用語は、人為的に設
計され、もとの天然環境にある連続した核酸配列には見られない核酸配列を少な
くとも2つ有する、線状または環状の、精製または単離されたポリヌクレオチド
を示す。本発明は、本発明にて説明するポリヌクレオチドのうちいずれか1つを
含む組換えベクターを企図するものであることに注意されたい。
【０２１５】 (組換え細胞宿主およびトランスジェニック動物において、sbg1、g34665、sbg2
、g35017およびg35018の各核酸配列の時間的発現および空間的発現を指示できる
DNAコンストラクト) sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリヌクレオチドを含むヌクレオチ
ド配列によってコードされるタンパク質の合成がなされなくなることで生理面お
よび表現型の面でどのような結果が生じるのかについて研究するために、細胞レ
ベルと多細胞生物レベルの両方で、本発明は、sbg1、g34665、sbg2、g35017また
はg35018ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド配列の特定のアレルをコンディシ
ョナル発現できる、さらには、1つ以上の塩基が置換、欠失または付加された、s
bg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
の配列またはそのフラグメントのコピーをコンディショナル発現できるDNAコン
ストラクトおよび組換えベクターを包含する。これらの塩基置換、欠失または付
加は、エキソン、イントロンまたは制御配列のいずれか、特に、sbg1、g34665、
sbg2、g35017またはg35018ポリヌクレオチドの5'制御配列に位置していてもよい
。好ましい実施形態では、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリヌクレ
オチドを含むヌクレオチド配列はさらに、本発明のバイアレリックマーカーも含
んでいる。
【０２１６】 第1の好ましいDNAコンストラクトは、Gossen et al.(1992, 1995)およびFurth
et al.(1994)に記載されているように、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35
018ポリヌクレオチドの発現を制御するためにE. coli転移因子Tn110から得たテ
トラサイクリン耐性オペロンtetを主な構成要素とするものである。このようなD
NAコンストラクトは、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリヌクレオチ
ドの最小プロモーターまたは5'制御配列に融合されたTn10(tetop)から得られるt
etオペレーター配列を7つ有し、前記最小プロモーターまたは前記sbg1、g34665
、sbg2、g35017またはg35018の各ポリヌクレオチド制御配列は、センスオリゴヌ
クレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドかポリペプチド(sbg1、g3466
5、sbg2、g35017またはg35018ポリヌクレオチドコードポリペプチドまたはそれ
らのペプチドフラグメントを含む)のいずれかをコードする、興味の対象である
ポリヌクレオチドに作用的に結合されている。このDNAコンストラクトは、HCMVI
E1エンハンサー/プロモーターまたはMMTV-LTRなどのプロモーターによる制御下
で、同じ細胞が単純ヘルペスウイルスのウイルスタンパク質VP16の活性ドメイン
に融合した野生型(tTA)またはミュータント(rTA)レプレッサーのいずれかをコー
ドするヌクレオチド配列を含む場合に、興味の対象となるヌクレオチド配列のコ
ンディショナル発現系として機能する。特に、本発明の好ましいDNAコンストラ
クトは、tetオペレータ配列を含むポリヌクレオチドと、tTAレプレッサーまたは
rTAレプレッサーをコードする配列を含むポリヌクレオチドの両方を含む。
【０２１７】 特定の実施形態では、コンディショナル発現DNAコンストラクトが、ミュータ
ントテトラサイクリンレプレッサーrTAをコードする配列を含む。興味の対象と
なるポリヌクレオチドの発現は、テトラサイクリンの非存在下でサイレントであ
り、テトラサイクリンが存在すると誘起される。
【０２１８】 (相同的組換えを可能にするDNAコンストラクト:交換(replacement)ベクター) 第2の好ましいDNAコンストラクトは、5'末端から3'末端に、(a)sbg1ポリヌク
レオチドを含む第1のヌクレオチド配列と、(b)ネオマイシン耐性(neo)に対する
マーカーなどのポジティブ選択マーカー含むヌクレオチド配列と、(c)それぞれ
のsbg1ポリヌクレオチドを含み、第1のsbg1ポリヌクレオチド配列(a)よりも下流
のゲノム上に位置する第2のヌクレオチド配列と、を含む。また、上述したsbg1
配列の代わりに、g34665、sbg2、g35017またはg35018ヌクレオチド配列を用いて
同様の方法で調製されるDNAコンストラクトも包含される。
【０２１９】 好ましい実施形態では、このDNAコンストラクトは、ヌクレオチド配列(a)の上
流またはヌクレオチド配列(c)の下流に位置するネガティブ選択マーカーも含む
。好ましくは、ネガティブ選択マーカーは、チミジンキナーゼ(tk)遺伝子(Thoma
s et al., 1986)、ハイグロマイシンβ遺伝子(Te Riele et al., 1990)、hprt遺
伝子(Van der Lugt et al., 1991、Reid et al., 1990)またはジフテリア毒Aフ
ラグメント(Dt-A)遺伝子(Nada et al., 1993、Yagi et al. 1990)を含む。好ま
しくは、ポジティブ選択マーカーは、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018
タンパク質をコードする配列を中断するようにsbg1、g34665、sbg2、g35017また
はg35018ポリヌクレオチドのエキソンおよびエキソン配列内に位置する。これら
の交換ベクターについては、たとえば、Thomas et al.(1986, 1987)、Mansour e
t al.(1988)およびKoller et al.(1992)に記載されている。
【０２２０】 第1のヌクレオチド配列(a)および第2のヌクレオチド配列(c)は、g34665、sbg2
、g35017またはg35018ポリヌクレオチド制御配列、イントロン配列、エキソン配
列、あるいは制御配列および/またはイントロン配列および/またはエキソン配列
の両方を含む配列内に位置する。ヌクレオチド配列(a)および(c)のサイズは、1
〜50kb、好ましくは1〜10kb、さらに好ましくは2〜6kb、最も好ましくは2〜4kb
の範囲である。
【０２２１】 (相同的組換えを可能にするDNAコンストラクト:Cre-LoxP系) これらの新規なDNAコンストラクトでは、P1ファージの部位特異的組換え系を
利用している。P1ファージは、Creと呼ばれるリコンビナーゼを有する。このリ
コンビナーゼは、34の塩基対からなるloxP部位と特異的に相互作用する。loxP部
位は、8bpの保存配列で分離された13bpのパリンドローム配列2つで構成される(H
oess et al.、1986)。同一の配向を有する2つのloxP部位間のCre酵素による組換
えによって、DNAフラグメントに欠失が生じる。
【０２２２】 Cre-loxP系を相同的組換え法と併用することが、Gu et al.(1993, 1994)によ
って初めて説明された。簡単に言うと、ゲノムの標的位置に挿入する対象となる
問題のヌクレオチド配列が少なくとも2つのloxP部位を同一配向で有し、これら
の部位が組換えゲノムから切除すべきヌクレオチド配列の両末端に位置する。切
除現象を起こすには、組換え細胞宿主の核内にリコンビナーゼ(Cre)酵素がなけ
ればならない。リコンビナーゼ酵素は、(a)Araki et al.(1995)に記載されてい
るようにCre酵素を直接所望の細胞に接種するか、あるいはBaubonis et al.(199
3)に記載されているように酵素を細胞にリポフェクションすることによって、こ
の酵素を含む培地で組換え細胞宿主をインキュベートする方法、(b)組換え細胞
宿主で機能するプロモーター(任意に誘導性であってもよい)と作用的に結合され
たCreコード配列を含み、Gu et al.(1993)およびSauer et al.(1988)に記載され
ているようにして組換え細胞宿主に導入されるベクターと、細胞宿主とをトラン
スフェクトする方法、(c)組換え細胞宿主で機能するプロモーター(任意に誘導性
であってもよい)と作用的に結合されたCreコード配列を含み、Gu et al.(1994)
に記載されているようにランダム挿入現象または相同的組換え現象によって細胞
宿主のゲノムに挿入されるポリヌクレオチドを、細胞宿主のゲノムに導入する方
法のいずれかによって、所望のタイミングで得られるものである。
【０２２３】 具体的な実施形態では、選択可能なマーカーが同一配向のloxP部位によってフ
ランキングされるように相同的組換えによってsbg1、g34665、sbg2、g35017また
はg35018遺伝子配列に挿入される配列を有するベクターが構築され、Cre酵素で
の処理によって、選択可能なマーカーが除去され、相同的組換え現象によって挿
入されていた興味の対象であるsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリヌ
クレオチド配列を残すことが可能である。また、2つの選択可能なマーカーすな
わち、組換え現象を探索するためのポジティブ選択マーカーと、相同的組換え現
象を探索するためのネガティブ選択マーカーが必要である。Cre-loxP系で用いら
れるベクターおよび方法については、Zou et al.(1994)に記載されている。
【０２２４】 したがって、一態様において、本発明のさらに好ましいDNAコンストラクトは
、5'末端から3'末端に、(a)sbg1ポリヌクレオチドによって構成される第1のヌク
レオチド配列と、(b)ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを
含み、loxP部位などのリコンビナーゼによって認識される部位を定義する2つの
配列を同一配向でさらに有するヌクレオチド配列と、(c)sbg1ポリヌクレオチド
を含み、第1のsbg1ヌクレオチド配列(a)よりも下流のゲノムに位置する第2のヌ
クレオチド配列と、を含む。また、上述したsbg1配列の代わりに、34665、sbg2
、g35017またはg35018ヌクレオチド配列を用いて同様の方法で調製されるDNAコ
ンストラクトも包含される。
【０２２５】 loxP部位などのリコンビナーゼによって認識される部位を定義する配列は、ヌ
クレオチド配列(b)内でコンディショナル切除が探査されるヌクレオチド配列の
境界となる適当な位置にあるのが好ましい。具体的な実施形態では、相同的組換
え現象から所望の時間経過後に切除がなされるようにするために、2つのloxP部
位がポジティブ選択マーカー配列の両側に位置している。
【０２２６】 上述した第3のDNAコンストラクトを使用する方法の好ましい実施形態では、リ
コンビナーゼが認識する2つの部位、好ましくは2つのloxP部位で境界が定められ
ているポリヌクレオチドフラグメントが所望のタイミングで切除される。これは
、組換え宿主細胞のゲノム内に、プロモーター配列、好ましくは誘導性プロモー
ター、より好ましくは組織特異的プロモーター配列、最も好ましくはGu et al.(
1994)に記載されているような誘導性で組織特異的なプロモーター配列に作用的
に結合されたCre酵素をコードする配列が存在するためである。
【０２２７】 組換え細胞宿主のゲノム中にCre酵素が存在するのは、上述したようなloxP部
位を含む興味の対象であるsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリヌクレ
オチド由来の配列を持つ第1のトランスジェニック動物と、Gu et al.(1994)に記
載されているように適当なプロモーター配列に作用的に結合されたCreコード配
列を持つ第2のトランスジェニック動物の2種類のトランスジェニック動物が繁殖
した結果である可能性がある。
【０２２８】 AntonおよびGraham(1995)およびKanegae et al.(1995)に記載されているよう
に、Cre遺伝子を含むがゆえにCre酵素の移入に必要な細胞の感染または器官のin
vivo感染が可能なアデノウイルスベースのベクターを用いることで、Cre酵素発
現の空間時間制御を行うことができる。
【０２２９】 上述したDNAコンストラクトを使用して、本発明の所望のヌクレオチド配列、
好ましくはsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリヌクレオチド、最も好
ましくはsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリヌクレオチド配列の変化
したコピーを、標的ゲノムの予め定められた位置内に導入し、標的遺伝子の変化
したコピーを作出する(ノックアウト相同的組換え)か、あるいは標的遺伝子のコ
ピーを相同的組換え現象が可能な程度に十分に相同的な別のコピーと交換する(
ノックイン相同的組換え)ことができる。特定の実施形態では、上述したDNAコン
ストラクトを用いて、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリヌクレオチ
ドを導入することができる。
【０２３０】 (核アンチセンスDNAコンストラクト) 本発明のベクターを含む他の組成物に、対応する遺伝子の発現を阻害するアン
チセンスツールとして、配列番号.1のsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018
ポリヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドフラグメント、好ましくはsbg1遺伝
子の開始コドンを含むフラグメントを有する。本発明によるアンチセンスポリヌ
クレオチドを用いる好ましい方法は、Sczakiel et al.(1995)または国際特許出
願公開第WO95/2422号に説明されているような手順である。
【０２３１】 sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリヌクレオチドmRNAの5'末端と相
補であるポリヌクレオチド(15〜200bp長)からアンチセンスツールを選択すると
好ましい。一実施態様では、所望の標的遺伝子の異なる部分に対して相補である
異なるアンチセンスポリヌクレオチドの組み合わせを使用する。
【０２３２】 好ましくは、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、3'末端でポリ(A)な
しでRNAポリメラーゼII転写が行われるように自己切断リボザイム配列と交換し
た3'ポリアデニル化シグナルを有する。これらのアンチセンスポリヌクレオチド
は、Liu. et al.(1994)などに記載されているように、核からの搬出ができない
ものである。好ましい実施形態では、これらのsbg1、g34665、sbg2、g35017また
はg35018アンチセンスポリヌクレオチドは、Eckner et al.(1991)に記載されて
いる構造のように、切断された転写物を安定させて3'-5'末端加水分解(exonucle
olytic degradataion)しないようにするためのヒストンの幹-ループ構造をリボ
ザイムカセット内に含む。
【０２３３】 (オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー) 本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド配列、またはそれぞ
れのsbg1、g34665、sbg2、g35017およびg35018ポリヌクレオチドまたは遺伝子ま
たはフラグメント、相補体またはその変異体の少なくともコピーの被検試料中に
おける存在を検出する上で有用なものである。
【０２３４】 本発明の特に好ましいプローブおよびプライマーは、少なくとも12、15、18、
20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500、1000または20
00ヌクレオチドの連続スパンを、前記スパンが配列番号1のヌクレオチド位置範
囲と整合する限りにおいて含む、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリ
ヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、前記連続スパンが、配列
番号1のヌクレオチド位置すなわち、 (a) ヌクレオチド位置31〜292651および292844〜319608、 (b) 290653〜292652、292653〜296047、292653〜292841、295555〜296047、2
95580〜296047および296048〜298048、 (c) 94124〜94964、 (d) 31〜1107、1108〜65853、1108〜1289、14877〜14920、18778〜18862、25
593〜25740、29388〜29502、29967〜30282、64666〜64812、65505〜65853および
65854〜67854、 (e) 213818〜215818、215819〜215941、215819〜215975、216661〜216952、2
16661〜217061、217027〜217061、229647〜229742、230408〜230721、231272〜2
31412、231787〜231880、231870〜231879、234174〜234321、237406〜237428、2
39719〜239807、239719〜239853、240528〜240569、240528〜240596、240528〜2
40617、240528〜240644、240528〜240824、240528〜240994、240528〜241685、2
40800〜240993および241686〜243685、 (f) 201188〜216915、201188〜201234、214676〜214793、215702〜215746お
よび216836〜216915または (g) それらの相補配列またはフラグメント のうち少なくとも1、2、3、4、5、7または10を含んでなる、単離されたポリヌク
レオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む。
【０２３５】 また、本発明のプローブおよびプライマーは、配列番号1のヌクレオチド位置3
1〜292651および292844〜319608の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40
、50、60、70、80、90、100、150、200、500、1000または2000ヌクレオチドの連
続スパンに対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%または95%のヌクレオチド
同一性を有する単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまた
は組換えポリヌクレオチドを含む。また、本発明の好ましいプローブおよびプラ
イマーは、配列番号1のヌクレオチド位置すなわち、 (a) 290653〜292652、292653〜296047、292653〜292841、295555〜296047、2
95580〜296047および296048〜298048、 (b) 94124〜94964、 (c) 31〜1107、1108〜65853、1108〜1289、14877〜14920、18778〜18862、25
593〜25740、29388〜29502、29967〜30282、64666〜64812、65505〜65853および
65854〜67854、 (d) 213818〜215818、215819〜215941、215819〜215975、216661〜216952、2
16661〜217061、217027〜217061、229647〜229742、230408〜230721、231272〜2
31412、231787〜231880、231870〜231879、234174〜234321、237406〜237428、2
39719〜239807、239719〜239853、240528〜240569、240528〜240596、240528〜2
40617、240528〜240644、240528〜240824、240528〜240994、240528〜241685、2
40800〜240993および241686〜243685、 (e) 201188〜216915、201188〜201234、214676〜214793、215702〜215746お
よび216836〜216915または (f) それらの相補配列またはフラグメント からなる群から選択される少なくとも1つの配列に対して少なくとも70%、75%、8
0%、85%、90%または95%のヌクレオチド同一性を有する、sbg1、g34665、sbg2、g
35017またはg35018ヌクレオチド配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチ
ド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む。
【０２３６】 本発明のプローブおよびプライマーのもう1つの集合は、配列番号1の少なくと
も12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500
、1000または2000ヌクレオチドの連続スパンまたはそれらの相補体を含んでなる
、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリ
ヌクレオチドであって、前記連続スパンが、上記の表1にて列挙した、pos1〜pos
166で示される配列番号1のヌクレオチド位置の範囲のいずれか1つのうち少なく
とも1、2、3、5または10ヌクレオチド位置を含んでなる、単離されたポリヌクレ
オチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む。
【０２３７】 さらに、本発明は、上記にて定義したストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件下で、配列番号1のヌクレオチド位置31〜292651および292844〜319608
の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150
、200、500、1000または2000ヌクレオチドの連続スパンまたはその変異体または
これと相補な配列と特異的にハイブリダイズされることを特徴とする核酸プロー
ブにも関するものである。特に好ましいのは、上記にて定義したストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件下で、ヌクレオチド位置すなわち、 (a) 290653〜292652、292653〜296047、292653〜292841、295555〜296047、2
95580〜296047および296048〜298048、 (b) 94124〜94964、 (c) 31〜1107、1108〜65853、1108〜1289、14877〜14920、18778〜18862、25
593〜25740、29388〜29502、29967〜30282、64666〜64812、65505〜65853および
65854〜67854、 (d) 213818〜215818、215819〜215941、215819〜215975、216661〜216952、2
16661〜217061、217027〜217061、229647〜229742、230408〜230721、231272〜2
31412、231787〜231880、231870〜231879、234174〜234321、237406〜237428、2
39719〜239807、239719〜239853、240528〜240569、240528〜240596、240528〜2
40617、240528〜240644、240528〜240824、240528〜240994、240528〜241685、2
40800〜240993および241686〜243685、 (e) 201188〜216915、201188〜201234、214676〜214793、215702〜215746お
よび216836〜216915または (f) それらの相補配列またはフラグメント からなる群から選択される核酸と特異的にハイブリダイズされることを特徴とす
る核酸プローブである。
【０２３８】 安定したハイブリッドの形成は、DNAの融点(Tm)に左右される。Tmは、プライ
マー長またはプローブ長、溶液のイオン強度およびG+C含有量に左右される。プ
ライマーまたはプローブのG+C含有量が高くなればなるほど融点も高くなる。G:C
対は水素結合3つで保持されているが、A:T対には水素結合が2つしかないためで
ある。本発明のプローブのGC含量は一般に10〜75%、好ましくは35〜60%、より好
ましくは40〜55%の範囲である。
【０２３９】 本発明によるプローブまたはプライマーは、8〜2000ヌクレオチド長のもので
あればよく、あるいは、少なくとも12、15、18、20、25、35、40、50、60、70、
80、100、250、500、1000ヌクレオチド長が指定される。特に、これらのプロー
ブの長さは、8、10、15、20、あるいは30〜100ヌクレオチドの範囲とすることが
でき、好ましくは10〜50、さらに好ましくは15〜30ヌクレオチドの範囲とするこ
とができる。この範囲よりも短いプローブは標的核酸配列に対する特異性に欠け
ることが多く、一般に鋳型との間で十分に安定したハイブリッド複合体を形成す
るには温度を下げてやる必要がある。一方、上記の範囲よりも長いプローブは作
製に費用がかかり、まれに自家ハイブリダイズによってヘアピン構造が形成され
てしまう。特定のアッセイ条件下でのプライマーおよびプローブの最適な長さは
、当業者らが経験的に判断するものである。
【０２４０】 たとえば適切な配列のクローニングおよび制限の他、Narang et al.(1979)の
リン酸ジエステル法、Brown et al.(1979)のリン酸ジエステル法、Beaucage et
al.(1981)のジエチルホスホラミダイト法および欧州特許第0 707 592号に記載さ
れている固相支持体などの方法による直接的な化学合成による方法をはじめとす
る適当な何らかの方法を用いて、上記のプライマーおよびプローブを調製するこ
とができる。
【０２４１】 検出プローブは一般に、国際特許出願公開第WO92/20702号に開示されているペ
プチド核酸、米国特許第5,185,444号、同第5,034,506号および同第5,142,047号
に開示されているモルホリノ類似物などの核酸配列または未荷電の核酸類似物で
ある。プローブに別のdNTPが付加されることのないように、プローブを「非伸長
可能な」状態にしてもよい。類似物はそれ自体が非伸長可能であるため、ヒドロ
キシル基が伸長に関与できなくなるようにプローブの3'末端を修飾することで、
核酸プローブを非伸長可能にすることができる。たとえば、プローブの3'末端を
捕捉標識または検出標識で官能化し、ヒドロキシル基を消費するかブロックする
。あるいは、3'ヒドロキシル基を単純に切断、置換または修飾することも可能で
ある。1993年4月19日出願の米国特許出願第07/049,061号には、プローブを非伸
長可能にする目的で利用できる修飾について説明されている。
【０２４２】 必要であれば、本発明のポリヌクレオチドはいずれも、分光学的、光化学的、
生化学的、免疫化学的または化学的な手段によって検出可能な標識を取り込むこ
とで標識可能なものである。たとえば、有用な標識としては、放射性物質(32P、35 S、3H、125I)、蛍光染料(5-ブロモデソキシウリジン(5-bromodesoxyuridin)、
フルオレセイン、アセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニン)またはビオチン
があげられる。好ましくは、ポリヌクレオチドの3'末端および5'末端を修飾する
。核酸フラグメントの非放射性標識の一例が、フランス特許第FR-7810975号また
はUrdea et al(1988)またはSanchez-Pescador et al(1988)に記載されている。
また、本発明によるプローブは、シグナル増幅を可能にするという点で構造上の
特徴を有する場合がある。このような構造上の特徴としては、たとえば、Urdea
et al.によって1991に説明されたものや欧州特許第0 225 807号(Chiron)に記載
されているものなどの枝分れDNAプローブがあげられる。
【０２４３】 また、標識を使用してプライマーを捕捉し、プライマーまたは増幅DNAなどの
プライマー伸長産物のいずれかの固相支持体での固定化を容易にすることもでき
る。捕捉された標識はプライマーまたはプローブに結合するため、固相の試薬の
特異的結合メンバー(ビオチンおよびストレプトアビジン)との間で結合対を形成
する特異的結合メンバーとなり得る。したがって、ポリヌクレオチドまたはプロ
ーブに付した標識のタイプに応じて、標的DNAの捕捉または検出用に用いること
ができる。さらに、本願明細書において提供するポリヌクレオチド、プライマー
またはプローブは、それ自体が、捕捉標識として機能するものであることは理解
できよう。たとえば、固相試薬の結合メンバーが核酸配列である場合、プライマ
ーまたはプローブの相補部分を結合することでプライマーまたはプローブを固相
に固定化するように結合メンバーを選択することができる。ポリヌクレオチドプ
ローブ自体が結合メンバーとして機能する場合は、標的に対して相補的ではない
配列すなわち「尾」がプローブに含まれることは当業者であれば理解できよう。
ポリヌクレオチドプライマー自体が捕捉標識として機能する場合は、プライマー
の少なくとも一部が固相上で核酸と自由にハイブリダイズされる。DNA標識法は
当業者間で周知のものである。
【０２４４】 本発明のプローブはさまざまな目的に有用である。これらのプローブを、ゲノ
ムDNAに対するサザンハイブリダイゼーションに利用することが可能である。ま
た、プローブを用いてPCR増幅産物を検出することも可能である。さらに、他の
技法を利用して、配列番号1〜26、36〜40および54〜229のポリヌクレオチドまた
はsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリヌクレオチドまたは遺伝子また
はmRNAを含む配列におけるミスマッチの検出に利用することもできる。
【０２４５】 本発明のポリヌクレオチド、プライマーおよびプローブはいずれも、固相支持
体に適宜固定化することが可能なものである。固相支持体は当業者間で周知のも
のであり、反応トレーの穴の壁面、試験管、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、
ニトロセルロースストリップ、膜、ラテックス粒子などの微粒子、ヒツジ(また
は他の動物)の赤血球細胞、duracyteなどを含む。固相支持体は決定的なもので
はなく、当業者によって選択可能である。したがって、ラテックス粒子、微粒子
、磁気ビーズまたは非磁気ビーズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロタイタ
ーの穴の壁、ガラスチップまたはシリコンチップ、ヒツジ(または他の適した動
物)の赤血球細胞およびduracyteはいずれも、好適な例である。固相に核酸を固
定化するための好適な方法としては、イオン的相互作用、疎水的相互作用、共有
結合的相互作用などがあげられる。本願明細書では、「固相支持体」は不溶性ま
たは以後の反応によって不溶性にすることのできるあらゆる材料を意味する。捕
捉試薬を引きつけて固定化する固有の性能を基準に固相支持体を選択することが
可能である。あるいは、捕捉試薬を引きつけて固定化する機能を有する別の受容
体を固相に保定することができる。別の受容体としては、捕捉試薬自体または捕
捉試薬に共役結合される荷電物質と反対の電荷に荷電した荷電物質をあげること
ができる。さらに別の選択肢として、受容体分子は、固相支持体に固定化(結合)
され、特異的結合反応によって捕捉試薬を固定化する機能を有するものであれば
、どのような特異的結合メンバーであってもよい。受容体分子は、アッセイの実
行前またはアッセイの実行時に捕捉試薬の固相支持体材料への間接的な結合を可
能にするものである。このため、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性ま
たは非磁性金属、検査チューブのガラス表面またはシリコン表面、マイクロタイ
ターの穴、シート、ビーズ、微小粒子、チップ、ヒツジ(または他の適した動物)
の赤血球細胞、duracyteおよび当業者間で周知の他の構成などを固相とすること
ができる。本発明のポリヌクレオチドは、固相支持体にて個々にまたは少なくと
も2、5、8、10、12、15、20または25の本発明のポリヌクレオチドのグループで
単一の固相支持体に結合または固定化することが可能なものである。また、本発
明によるもの以外のポリヌクレオチドを1種またはそれ以上の本発明のポリヌク
レオチドと同一の固相支持体に結合してもよい。
【０２４６】 すなわち、本発明は、配列番号1〜26、36〜40および54〜229からなる群から選
択されるヌクレオチド配列、それらのフラグメントまたは変異体または相補配列
を有する核酸の試料中における存在の検出方法であって、 a) 配列番号1〜26、36〜40および54〜229のヌクレオチド配列からなる群から
選択される核酸に含まれるヌクレオチド配列、そのフラグメントまたは変異体ま
たは相補配列とハイブリダイズ可能な1つまたは複数の核酸プローブと、アッセ
イ対象となる試料とを接触させるステップと、 b) 試料中でプローブと核酸との間に生成されるハイブリッド錯体を検出する
ステップと、を含む検出方法についても扱う。
【０２４７】 本発明はさらに、試料中において、配列番号1〜26、36〜40および54〜229から
なる群から選択されるヌクレオチド配列、そのフラグメントまたは変異体または
相補配列を含む核酸の存在を検出するためのキットであって、 a) 配列番号1〜26、36〜40および54〜229のヌクレオチド配列からなる群から
選択される核酸に含まれるヌクレオチド配列、そのフラグメントまたは変異体ま
たは相補配列とハイブリダイズする可能な1つまたは複数の核酸プローブと、 b) 任意に、ハイブリダイゼーション反応を実施するのに必要な試薬と、 を含むキットに関する。
【０２４８】 この検出方法およびキットの第1の好ましい実施形態では、前記1つまたは複数
の核酸プローブを検出可能な分子で標識する。前記方法およびキットの第2の好
ましい実施形態では、前記1つまたは複数の核酸プローブが支持体に固定化され
たものである。第3の好ましい実施形態では、1つまたは複数の核酸プローブが、
P1〜P360およびそれらの相補配列、B1〜B229、C1〜C229、D1〜D360、E1〜E360の
ヌクレオチド配列からなる群から選択される配列か、A1〜A360からなる群から選
択されるバイアレリックマーカーまたはA361〜A489からなる群から選択される多
型またはそれらの相補体を含むヌクレオチド配列を含むものである。
【０２４９】 (オリゴヌクレオチドアレイ) 本発明の複数のオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを含む支持体を
、配列番号1のヌクレオチド配列、特に、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35
018ポリヌクレオチドあるいは、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリ
ヌクレオチドを含む遺伝子における標的配列の検出または増幅のいずれかに利用
することができる。さらに、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018核酸配列
のコード配列または非コード配列、あるいは、sbg1、g34665、sbg2、g35017また
はg35018核酸配列を含む遺伝子における変異の検出にも利用することができる。
【０２５０】 本願明細書に記載のポリヌクレオチドはいずれも、固相支持体上のオーバーラ
ップ領域内または無作為に選択した位置に結合されてもよい。あるいは、本発明
のポリヌクレオチドは、一定順序のアレイで結合されてもよい。この場合、各ポ
リヌクレオチドは、固相支持体上の他のいかなるポリヌクレオチドの結合部位と
も重複しない別の領域に付着される。好ましくは、別の位置を記録し、アッセイ
手順の一部としてアクセスできるように、このようなポリヌクレオチドの一定順
序のアレイを「アドレス調節可能な」ように設計する。アドレス指定可能なポリ
ヌクレオチドアレイは一般に、異なる既知の位置にある支持体の表面に結合する
複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む。各ポリヌクレオチド位置を正
確に知ることで、これらの「アドレス指定可能な」アレイがハイブリダイゼーシ
ョンアッセイにおいて特に有用なものとなる。当業者間で周知のアドレス指定可
能なアレイテクノロジーを本発明のポリヌクレオチドと併用することが可能であ
る。これらのポリヌクレオチドアレイの特定の一実施形態は、Genechips（登録
商標）として周知であり、米国特許第5,143,854号、国際特許出願公開第90/1507
0号および同第92/10092号にその概略が説明されている。これらのアレイは一般
に、機械的な合成方法または光指向性合成方法を用いて作製できる。これらの方
法では、フォトリソグラフィによる方法と固相オリゴヌクレオチド合成との組み
合わせを利用している(Fodor et al., 1991、本願明細書に援用)。オリゴヌクレ
オチドアレイの固相支持体への固定化は、一般に「Very Large Scale Immobiliz
ed Polymer Synthesis(VLSIPS（登録商標）)」と呼ばれるテクノロジーの開発に
よって可能になったものである。このテクノロジーでは一般に、チップの固体表
面上でプローブを高密度アレイ状に固定化する。VLSIPS（登録商標）テクノロジ
ーの一例は、米国特許第5,143,854号および同第5,412,087号ならびに国際特許出
願公開第WO90/15070号、同第WO92/10092号および同第WO95/11995号にあげられて
いる。これらの公報では、光指向性合成法などの手法によってオリゴヌクレオチ
ドアレイを形成する方法について説明されている。固相支持体に固定化されるヌ
クレオチドのアレイを提供することを目的とした設計ストラテジーでは、ハイブ
リダイゼーションパターンと配列情報を最大化しようという試みの中で、チップ
上でオリゴヌクレオチドアレイを順序付けて表示するための別のプレゼンテーシ
ョンストラテジーが開発された。このようなプレゼンテーションストラテジーの
一例が、国際特許出願公開第WO94/12305号、同第WO94/11530号、同第WO97/29212
号および同第WO97/31256号に開示されている。
【０２５１】 本発明のオリゴヌクレオチドアレイのもう１つの実施形態では、オリゴヌクレ
オチドプローブマトリックスを有効利用して、sbg1、g34665、sbg2、g35017また
はg35018ポリヌクレオチド(sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリヌク
レオチドを含む遺伝子、好ましくはsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポ
リヌクレオチド調節領域を含む)に発生する変異を検出することができる。この
特定の目的のために、既知の変異を持つ遺伝子とのハイブリッド形成が可能なヌ
クレオチド配列が含まれるように、(1つまたは複数のヌクレオチドの欠失、挿入
または置換のいずれかによって)プローブを特別に設計する。sbg1、g34665、sbg
2、g35017またはg35018ポリヌクレオチドにおける既知の変異とは、かかる変異
の同定に利用できるHuang et al.(1996)またはSamson et al.(1996)が用いた手
法によって同定済みの、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリヌクレオ
チドにおける変異を意味する。
【０２５２】 sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリヌクレオチドにおける変異の検
出に用いられるもう1つの手法に、高密度DNAアレイを使用するものがある。高密
度DNAアレイの単位要素を構成している各オリゴヌクレオチドプローブを、sbg1
、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリヌクレオチドの特定のサブシーケンス
に一致するように設計する。このように、標的遺伝子配列のサブシーケンスに対
して相補なオリゴヌクレオチドからなるアレイを用いて、野生型遺伝子配列と標
的配列との同一性を判断し、その量を測定し、sbg1、g34665、sbg2、g35017また
はg35018ポリヌクレオチドの標的配列と基準の野生型核酸配列との差を検出する
。このような設計のうちの1つに4Lタイル状アレイがあるが、このアレイは、4つ
一組のプローブ(A、C、G、T)で実現され、好ましくは15個のヌクレオチドオリゴ
マーで実現されるものである。4つのプローブの集合各々において、ミスマッチ
のあるプローブよりも完全な補体の方が強くハイブリダイズされる。したがって
、4Lのプローブを含むタイル状アレイすなわち、既知の野生型基準配列に含まれ
ている可能性のあるすべての変異を含む全プローブ集合で、長さLの核酸標的の
変異が探査される。標的配列に1塩基でも違いがあると、15merプローブ集合のタ
イル状アレイのハイブリッドシグナルが乱れる。結果として、変異位置をフラン
キングするシグナルすなわちプローブの「足跡」に特徴の損失ができることにな
る。この手法はChee et al.によって1996に説明されたものである。
【０２５３】 結果として、本発明は、プローブおよびプライマーとして上述したポリヌクレ
オチドを少なくとも1つ有する核酸分子のアレイに関する。好ましくは、本発明
は、プローブおよびプライマーとして上述したポリヌクレオチドを少なくとも2
つ有する核酸のアレイに関する。
【０２５４】 (sbg1、g34665、sbg2、g35017およびg35018タンパク質およびポリペプチドフラ
グメント) 「sbg1ポリペプチド」、「g34665ポリペプチド」、「sbg2ポリペプチド」、「 g35017ポリペプチド 」、「g35017ポリペプチド」という用語は、本願明細書にお
いて、本発明のsbg1、g34665、sbg2、g35017およびg35018ポリペプチドにそれぞ
れコードされるタンパク質およびポリペプチドをすべて包含するものである。本
発明のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドならびにこのようなポリペ
プチドを含む融合ポリペプチドも本発明の一部を構成する。本発明は、ヒト、哺
乳動物、霊長類、非ヒト霊長類由来のタンパク質を企図するものであり、配列番
号27〜35の配列からなる、実質的にかかる配列からなる、またはかかる配列を含
む、単離または精製されたsbg1タンパク質と、配列番号1のg34665、g35017およ
びsbg2ポリヌクレオチド配列によってコードされる、単離または精製されたg346
65、g35017およびsbg2タンパク質と、配列番号41〜43の配列からなる、実質的に
かかる配列からなる、またはかかる配列を含む、単離または精製されたg35018タ
ンパク質とを含む。 本発明のsbg1、g34665、sbg2、g35017およびg35018タンパク質は、ヒトsbg1、
g34665、sbg2、g35017およびg35018タンパク質それぞれのアミノ酸配列の天然に
発生する変異体も含むことに注意されたい。
【０２５５】 本発明は、配列番号27〜35および41〜43の少なくとも4アミノ酸、好ましくは
少なくとも6、さらに好ましくは少なくとも8〜10アミノ酸、一層好ましくは少な
くとも12、15、20、25、30、40、50または100アミノ酸の連続スパンを、前記ス
パンが特定の配列番号の長さと整合する限りにおいて含む、単離されたポリペプ
チド、精製されたポリペプチドおよび組換えポリペプチドを企図するものである
。他の好ましい実施形態では、アミノ酸の連続したストレッチが、sbg1、g34665
、sbg2、g35017およびg35018タンパク質配列におけるアミノ酸の欠失、付加、交
換または切断を始めとする、変異または機能的変異の部位を含む。
【０２５６】 また、本発明は、配列番号27〜35の少なくとも4アミノ酸、好ましくは少なく
とも6または少なくとも8〜10アミノ酸、一層好ましくは少なくとも12、15、20、
25、30、40、50または100アミノ酸の連続スパンを含む、単離されたsbg1ポリペ
プチド、精製されたsbg1ポリペプチドおよび組換えsbg1ポリペプチドであって、
前記連続スパンが表5eに示すアミノ酸バリエーションを含む、単離されたsbg1ポ
リペプチド、精製されたsbg1ポリペプチドおよび組換えsbg1ポリペプチドを企図
するものである。
【０２５７】 本願発明者らは、sbg1ポリペプチドおよび複数の特定のsbg1ペプチドにおける
潜在的な切断部位をさらに同定した。実施例7にさらに詳細に説明するように、s
bg1ペプチドをマウスに注射して行動の研究を行い、このペプチドをさらに試験
した。特に、配列番号29のポリペプチドは、アミノ酸62位から63位にプロテアー
ゼ切断部位を含み、配列番号30のポリペプチドは、アミノ酸63位から64位と110
位から111位にプロテアーゼ切断部位を含み、配列番号32のポリペプチドはアミ
ノ酸63位から64位にプロテアーゼ切断部位を含み、配列番号33のポリペプチドは
アミノ酸54位から55位と57位から58位にプロテアーゼ切断部位を含み、配列番号
34のポリペプチドはアミノ酸63位から64位と122位から123位にプロテアーゼ切断
部位を含み、配列番号35のポリペプチドはアミノ酸62位から63位と63位から64位
にプロテアーゼ切断部位を含む。さらに、配列番号30、32および34のsbg1ポリペ
プチドは、配列番号30のアミノ酸82位および104位、アミノ酸82位および106位お
よび配列番号32ならびに配列番号34のアミノ酸132位および142位に、ジスルフィ
ドブリッジを形成できると予想されているシステイン残基を含む。特に好ましい
実施形態では、本発明は、配列番号29のアミノ酸位置1〜63および64〜102、配列
番号30の1〜64、65〜111および112〜119、配列番号32の1〜64および65〜126、配
列番号34の1〜64、65〜123および124〜153、配列番号35の1〜61および65〜106か
らなる群から選択されるアミノ酸位置範囲の少なくとも4アミノ酸、好ましくは
少なくとも6または少なくとも8〜10アミノ酸、一層好ましくは少なくとも12また
は15アミノ酸の連続スパンを含んでなる、単離されたsbg1ペプチド、精製された
sbg1ペプチドおよび組換えsbg1ペプチドを含む。
【０２５８】 さらに、本発明は、配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40
、50、60、70、80、90、100、150、200または500ヌクレオチドの連続スパンから
なる、実質的にかかる連続スパンからなる、またはかかる連続スパンを含む(前
記スパンの長さがヌクレオチド位置範囲に整合する場合に限る)、sbg1、g34665
、sbg2、g35017およびg35018ポリヌクレオチドにそれぞれコードされる、単離さ
れたポリペプチドおよび組換えポリペプチドを含む、sbg1、g34665、sbg2、g350
17およびg35018ポリペプチドであって、前記連続スパンが、配列番号1のヌクレ
オチド位置すなわち、 (a) 290653〜292652、292653〜296047、292653〜292841、295555〜296047お
よび295580〜296047、 (b) 94144〜94964 (c) 1108〜65853、1108〜1289、14877〜14920、18778〜18862、25593〜25740
、29388〜29502、29967〜30282、64666〜64812および65505〜65853、 (d) 215819〜215941、215819〜215975、216661〜216952、216661〜217061、2
17027〜217061、229647〜229742、230408〜230721、231272〜231412、231787〜2
31880、231870〜231879、234174〜234321、237406〜237428、239719〜239807、2
39719〜239853、240528〜240569、240528〜240596、240528〜240617、240528〜2
40644、240528〜240824、240528〜240994、240528〜241685および240800〜24099
3、 (e) 201188〜216915、201188〜201234、214676〜214793、215702〜215746お
よび216836〜216915、またはそれらの相補体のうち、少なくとも1、2、3、4、5
、7または10を含んでなる、sbg1、g34665、sbg2、g35017およびg35018ポリペプ
チドを企図するものである。
【０２５９】 本発明はさらに、sbg1エキソンMS1、M1、M692、M862、MS2、M1069、M1090、M1
117、N、N2、Nbis、O、O1、O2、Obis、P、X、Q1、Q、Qbis、RおよびRbisからな
る群から選択される少なくとも1つのsbg1ヌクレオチド配列を含むsbg1ポリヌク
レオチドまたは遺伝子によってコードされる、単離されたポリペプチド、精製さ
れたポリペプチドおよび組換えポリペプチドを企図するものである。
【０２６０】 また、本発明は、配列番号27〜35および41〜43のアミノ酸配列またはそのフラ
グメントに対するアミノ酸同一性が少なくとも70、75、80、85、90、95、98また
は99%であるアミノ酸配列を含む、精製されたポリペプチド、単離されたポリペ
プチドまたは組換えポリペプチドを包含する。
【０２６１】 sbg1、g34665、sbg2、g35017およびg35018タンパク質は、ヒトまたは哺乳動物
の組織試料から単離されたものであるか、ヒトまたは哺乳動物遺伝子から発現さ
れたものであると好ましい。本発明のsbg1、g34665、sbg2、g35017およびg35018
ポリペプチドは、従来技術において周知の一般に用いられる発現方法によって生
成できる。所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを好都合な宿主に
適した発現ベクターに連結する。組換えポリペプチド、さらに一般的な系のうち
のいくつかのサマリー(summary)の形成には、真核生物宿主系と原核生物宿主系
の両方を使用する。次に、ポリペプチドを連結後の細胞または培地から単離し、
意図した用途に合う程度まで精製する。精製は、微分抽出、塩分画、クロマトグ
ラフィ、遠心などの従来技術において周知のいずれかの方法で行う。タンパク質
のさまざまな精製方法については、たとえば、Methods in Enzymologyを参照の
こと。
【０２６２】 また、短めのタンパク質フラグメントであれば、化学的な合成によって作出す
ることが可能である。あるいは、本発明のタンパク質をヒトまたは非ヒト動物の
細胞または組織から抽出する。タンパク質の精製方法は従来技術において周知で
あり、一例としては、洗浄剤またはカオトロピック剤を使用して粒子を破壊した
後、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、密度による
遠心沈降およびゲル電気泳動によってポリペプチドを微分抽出および分離するこ
とがあげられる。
【０２６３】 配列番号2〜26および36〜40のcDNA配列をそれぞれ含む、sbg1、g34665、sbg2
、g35017またはg35018 cDNAまたはそのフラグメントのうち適当なものを利用し
て、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質およびポリペプチドを
発現させる。発現対象となるsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク
質またはポリペプチドをコードする核酸を、従来のクローニング技術を用いて発
現ベクターでプロモーターに作用的に連結させる。発現ベクターへのsbg1、g346
65、sbg2、g35017またはg35018挿入物は、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg3
5018タンパク質それぞれの全コード配列を含むものであってもよいし、その一部
であってもよい。たとえば、sbg1またはg35018由来の挿入物が、配列番号27〜35
および41〜43のsbg1またはg35018タンパク質それぞれの連続した少なくとも10ア
ミノ酸を含むポリペプチドをコードしてもよい。
【０２６４】 発現ベクターは、従来技術において周知の哺乳動物、酵母、昆虫またはバクテ
リアの発現系であればどのようなものであってもよい。ジェネティクスインステ
ィテュート社(マサチューセッツ州Cambridge)、ストラタジーン社(カリフォルニ
ア州La Jolla)、プロメガ社(ウィスコンシン州Madison)およびインビトロゲン社
(カリフォルニア州San Diego)をはじめとするさまざまな提供業者から、市場販
売されているベクターおよび発現系を入手することができる。必要があれば、発
現を促進して正しいタンパク質折り畳みを容易にするために、Hatfield、et al.
の米国特許第5,082,767号に説明されているように発現ベクターを導入する特定
の発現生物に合わせて配列のコドンコンテキストおよびコドンペアリングを最適
化する。
【０２６５】 一実施形態では、cDNAのポリAシグナルによるsbg1、g34665、sbg2、g35017ま
たはg35018 cDNAの完全コード配列を発現ベクターでプロモーターに作用的に結
合させる。あるいは、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質の一
部をコードする核酸にメチオニンがなく、開始部位として機能する場合は、従来
の手法を利用して開始メチオニンを核酸の第1コドンの隣に導入することが可能
である。同様に、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018 cDNAから得た挿入
物にポリAシグナルがない場合は、BglIおよびSalI制限エンドヌクレアーゼ酵素
を用いてpSG5(ストラタジーン)からポリAシグナルを抜き、これを哺乳動物の発
現ベクターpXT1(ストラタジーン)に組み込むことで、上記の配列をコンストラク
トに付加することができる。pXT1は、Moloneyマウス白血病ウイルスから得られ
るLTRとgag遺伝子の一部とを含む。コンストラクトにおけるLTRの位置がゆえに
、安定したトランスフェクションを効率よく行うことができる。ベクターは、単
純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターおよび選択可能なネオマイ
シン遺伝子を含む。sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質または
その一部をコードする核酸を、本願明細書および配列番号1にて説明するようなs
bg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018遺伝子のエキソンのヌクレオチド配列
を含むバクテリアベクターからPCRによって得るか、あるいは、sbg1、g34665、s
bg2、g35017またはg35018タンパク質またはその一部をコードする配列がポリAシ
グナルに対して正しい位置にくるように注意を払いつつ、sbg1、g34665、sbg2、
g35017またはg35018核酸またはその一部に対して相補的であり、5'プライマーに
導入されたPst Iと、対応するcDNA 3'プライマーの5'末端に導入されたBglIIと
、について、制限エンドヌクレアーゼ配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー
を用いて、配列番号2〜26および36〜40の核酸を含むsbg1またはg35018 cDNAから
得る。このようにして生じるPCR反応によって得られる精製フラグメントをPstI
で消化し、エキソヌクレアーゼでブラントエンド化し、Bgl IIで消化し、精製し
てpXT1に連結し(この時点でポリAシグナルを含む)、BglIIで消化する。
【０２６６】 産物の説明部分で概説した条件下でリポフェクチン(ニューヨーク州Grand Isl
and、ライフテクノロジーズ社)を使用して、連結産物をマウスNIH 3T3細胞にト
ランスフェクトする。G418(ミズーリ州St. Louis、シグマ社)600ug/ml中にてト
ランスフェクト細胞の成長後にポジティブなトランスフェクタントを選択する。
【０２６７】 あるいは、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質またはその一
部をコードする核酸をpED6dpc2(マサチューセッツ州Cambridge、ジェネティクス
インスティテュート社)にクローニングする。このようにして得られるpED6dpc2
コンストラクトを、COS 1細胞などの適当な宿主細胞にトランスフェクトする。
メトトレキセート耐性細胞を選択し、エキスパンドする。
【０２６８】 上述した方法を用いて、検出可能な表現型またはその一部の原因であるミュー
タントsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質を発現させることも
できる。
【０２６９】 硫酸アンモニウム沈降や、サイズまたは電荷に応じたクロマトグラフィを用い
た分取など、従来の精製法を利用して、発現タンパク質を精製する。核酸挿入物
によってコードされたタンパク質を、標準的な免疫クロマトグラフィ法を用いて
精製してもよい。このような方法では、発現されたsbg1、g34665、sbg2、g35017
またはg35018タンパク質またはその一部を含有する細胞エキスなどの溶液を、sb
g1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質タンパク質またはその一部に
対する抗体を仕込んだカラムに入れ、これをクロマトグラフィのマトリックスに
取り付ける。発現タンパク質を免疫クロマトグラフィのカラムに結合させる。そ
の後、カラムを洗浄して非特異的に結合したタンパク質を除去する。特異的に結
合した発現タンパク質をカラムから分離し、標準的な手法を用いて回収する。
【０２７０】 sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質またはその一部の発現を
確認するために、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質またはそ
の一部をコードする挿入物を含む発現ベクターを含有する宿主細胞から発現した
タンパク質を、挿入物を含まない発現ベクターを含有する宿主細胞から発現した
タンパク質と比較することが可能である。挿入物を含む発現ベクターを含有する
細胞から得た試料には、挿入物を含まない発現ベクターを含有する細胞から得た
試料にはないバンドが存在することから、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg3
5018タンパク質またはその一部が発現されていることが分かる。通常、このバン
ドはsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質またはその一部に見ら
れる易動度を有する。しかしながら、このバンドの易動度は、グリコシル化、ユ
ビキチン結合または酵素切断などによる修飾の結果として生じるはずの移動性と
は異なる場合がある。
【０２７１】 発現されたsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質またはその一
部を特異的に認識できる抗体については後述する。
【０２７２】 抗体産生ができない場合は、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパ
ク質またはその一部をコードする核酸を、キメラポリペプチドを用いる精製スキ
ームで使用するように設計した発現ベクターに組み込む。このようなストラテジ
ーでは、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質またはその一部を
コードする核酸を、キメラのもう片方をコードする遺伝子とインフレームに挿入
する。キメラのもう片方は、β-グロビンまたはニッケル結合ポリペプチドコー
ド化配列である。このようにして、β-グロビンまたはニッケルに対する抗体を
有するクロマトグラフィのマトリックスを用いてキメラタンパク質を精製する。
プロテアーゼ切断部位をβ-グロビン遺伝子またはニッケル結合ポリペプチドとs
bg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質またはその一部との間で操
作する。これによって、キメラの2つのポリペプチドがプロテアーゼで消化され
て互いに分離する。
【０２７３】 β-グロビンキメラタンパク質の生成に有用な発現ベクターの1つに、pSG5(ス
トラタジーン)があげられる。これは、ウサギβ-グロビンをコードするものであ
る。ウサギβ-グロビン遺伝子のイントロンIIによって、発現転写物のスプライ
シングが容易になり、コンストラクトに組み込まれたポリアデニル化シグナルに
よって発現のレベルが増大する。これらの手法は分子生物分野の当業者間で周知
のものである。標準的な方法は、Davis et al.(1986)などの方法テキストにおい
て公開されている。さらに、ストラタジーン社、ライフテクノロジーズ社または
プロメガ社からの多くの方法を利用できる。また、In vitro Express（登録商標
）翻訳キット(ストラタジーン)などのin vitro翻訳系を用いてコンストラクトか
らポリペプチドを生成してもよい。
【０２７４】 (本発明のsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリペプチドを結合する抗
体) ヒト、マウスまたは哺乳動物のいずれかのsbg1、g34665、sbg2、g35017または
g35018ポリペプチドまたは全タンパク質を用いて、sbg1、g34665、sbg2、g35017
およびg35018タンパク質またはそのフラグメントに対する特異的結合能を持つ抗
体を作出することができる。
【０２７５】 sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質に特異的に結合する抗体
組成物として機能するには、ELISAやRIA、他の抗体ベースの結合実験において、
全長sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質の結合親和性の方が、
あらゆる全長タンパク質の結合親和性よりも、少なくとも5%、10%、15%、20%、2
5%、50%あるいは100%高くなければならない。sbg1、g34665、sbg2、g35017また
はg35018の変異体タンパク質に特異的に結合する抗体組成物として機能するには
、ELISAやRIA、他の抗体ベースの結合実験において、全長sbg1、g34665、sbg2、
g35017またはg35018の変異体タンパク質の結合親和性の方が、sbg1、g34665、sb
g2、g35017またはg35018の基準全長タンパク質の結合親和性よりも、少なくとも
5%、10%、15%、20%、25%、50%あるいは100%高くなければならない。
【０２７６】 本発明の一抗体組成物は、配列番号27〜35および41〜43のsbg1またはg35018タ
ンパク質とそれぞれ特異的に結合できるまたは特異的にする。本発明の他の抗体
組成物は、sbg1、sbg2またはg35018タンパク質変異体と特異的に結合できるまた
は特異的にする。任意に、前記sbg1タンパク質変異体が、表5dまたは表5eに示す
天然の変異体であってもよい。
【０２７７】 一実施形態では、本発明は、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリペ
プチドの少なくとも6アミノ酸、好ましくは少なくとも8〜10アミノ酸、一層好ま
しくは少なくとも12、15、20、25、30、40、50または100アミノ酸の連続スパン
を含むエピトープ含有ポリペプチドと選択的に結合できるまたは選択的に結合す
るポリクローナルまたはモノクローナルの抗体組成物に関する。
【０２７８】 また、本発明は、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018の変異タンパク質
のエピトープを含む、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018の変異タンパク
質またはそのフラグメントまたはその変異体と特異的に結合できる精製または単
離された抗体に関する。もう1つの好ましい実施形態では、本発明は、sbg1、g34
665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質の連続した少なくとも10アミノ酸を
含み、かつ、形質誘発変異によってコード可能なアミノ酸のうち少なくとも1つ
を含むポリペプチドと結合できる抗体に関する。
【０２７９】 好ましい実施形態では、本発明は、配列番号27〜35および41〜43のうちいずれ
かの少なくとも6アミノ酸、好ましくは少なくとも8〜10アミノ酸、一層好ましく
は少なくとも12、15、20、25、30、40、50または100アミノ酸の連続スパンを含
むポリペプチドを抗体の製造時に使用することに関する。
【０２８０】 抗体の調製には、抗体が結合すると望ましいものとは異なる種のsbg1、g34665
、sbg2、g35017またはg35018を発現する、野生型またはトランスジェニックの非
ヒト動物、特に、非ヒト哺乳類および非ヒト霊長類と、sbg1、g34665、sbg2、g3
5017またはg35018を発現しない動物(すなわち本願明細書で説明するsbg1、g3466
5、sbg2、g35017またはg35018ノックアウト動物)が特に有用である。sbg1、g346
65、sbg2、g35017またはg35018ノックアウト動物は、sbg1、g34665、sbg2、g350
17またはg35018タンパク質の曝露領域の全体または大半を外来抗原として認識し
、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018エピトープのアレイが拡がった抗体
を産生する。さらに、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質のい
ずれか1つに対する特異的結合を得る上で、アミノ酸を10〜30しか含まない小さ
目のポリペプチドが有用なこともある。また、抗原配列と類似のsbg1、g34665、
sbg2、g35017またはg35018の種を産生する動物の体液性免疫系は、動物の天然sb
g1、g34665、sbg2、g35017またはg35018種と抗原配列との違いを優先的に認識し
、抗原配列における独特な部位に対する抗体を産生する。このような手法は、sb
g1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質のうちいずれか1つに特異的
に結合する抗体を得る上で特に有用である。
【０２８１】 いずれかのプロトコルに従って調製した抗体調製物は、生物学的試料中の抗原
産生物質の濃度を判定する定量的なイムノアッセイにおいて有用なものである。
また、これらの調製物は、生物学的試料中の抗原の存在を半定量的あるいは定性
的に同定するのにも用いられる。
【０２８２】 さらに、タンパク質を発現する細胞を殺す目的あるいは体内のタンパク質濃度
を落とす目的で治療用組成物に抗体を使用してもよい。一実施形態では、本発明
は、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018を特異的に認識できる抗体を、精
神分裂病または双極性障害の治療に使用することを含む。
【０２８３】 従来技術において周知の放射性標識、蛍光標識または酵素標識のうちいずれか
1つによって本発明の抗体を標識してもよい。
【０２８４】 したがって、本発明は、本発明によるsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018
ポリペプチドの存在を生物学的試料において特異的に検出するための方法であっ
て、 a) 生物学的試料と、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリペプチド
またはそのペプチドフラグメントまたは変異体を特異的に結合するポリクローナ
ル抗体またはモノクローナル抗体と、を接触させるステップと、 b) 形成された抗原抗体複合体を検出するステップと、を含む方法にも関する
ものである。
【０２８５】 また、本発明は、本発明によるsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリ
ペプチドの存在を生物学的試料においてin vitroで検出するための診断用キット
であって、 a) sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリペプチドまたはそのペプチ
ドフラグメントまたは変異体を特異的に結合し、任意に標識された、ポリクロー
ナル抗体またはモノクローナル抗体と、 b) 任意に標識を有するか、あるいは、特に、上述したモノクローナル抗体ま
たはポリクローナル抗体が自己標識されない場合に、標識された試薬によって自
己を認識可能である、形成された抗原抗体複合体の検出を可能にする試薬と、を
含むキットにも関するものである。
【０２８６】 (本発明のバイアレリックマーカー) (本発明のバイアレリックマーカーの利点) 本発明のバイアレリックマーカーには、RFLP(制限酵素断片長多型)マーカーお
よびVNTR(タンデムリピートの繰り返し数)マーカーなどの他の遺伝マーカーには
ない多くの重要な利点がある。
【０２８７】 第1系統のマーカーはRFLPであったが、これは制限酵素断片の長さの違いを検
出するマーカーの一種である。しかしながら、RFLPの同定およびタイプ判別に用
いられる方法では、材料や手間、時間の無駄が比較的多い。第2系統の遺伝マー
カーはVNTRであったが、これはミニサテライトまたはマイクロサテライトのいず
れかに分類できる。ミニサテライトは5〜50bpを単位として繰り返されるタンデ
ムリピートのDNA配列であり、ヒト染色体の0.1〜20kb長の範囲の領域に沿って分
布している。ミニサテライトには考え得るアレルが多く存在するため、ミニサテ
ライトが持つ情報性は極めて高い。サザンブロットによってミニサテライトの違
いを解析し、被検個体から採取した試料に含まれるタンデムリピートの数を確認
する。しかしながら、サザンブロッティング法でタイプ判別ができる潜在的VNTR
はわずか104しかない。さらに、多数を開発およびアッセイしようとすると、RFL
PマーカーとVNTRマーカーのいずれもコスト高かつ時間のかかるものである。
【０２８８】 単一ヌクレオチド多型またはバイアレリックマーカーをRFLPおよびVNTRと同じ
ように使用して、いくつかの利点を得ることができる。単一ヌクレオチド多型は
、ヒトゲノム中に高密度で存在し、最も頻度の高いタイプの変異を示す。推定で
107を上回る数の部位がヒトゲノムの3ラ109個の塩基対に沿って分散している。し たがって、単一ヌクレオチド多型はRFLPマーカーまたはVNTRマーカーよりも高い
頻度かつ高い均一性で発生するのであるが、これは、かかるマーカーが興味の対
象となる遺伝座に極めて近いところで見つかる可能性が極めて大きいことを意味
している。単一ヌクレオチド多型はVNTRマーカーと比べると可変性に欠けるが、
突然変異という点ではVNTRマーカーよりも安定している。
【０２８９】 さらに、本発明のバイアレリックマーカーなど、特徴付け済の異なる形態の単
一ヌクレオチド多型は容易に識別できることが多いため、定法でタイプ判別をす
ることができる。バイアレリックマーカーには単一ヌクレオチドベースのアレル
が含まれており、共通のアレルは2つしかないため、並列性の高い検出と自動ス
コアリングを行うことができる。本発明のバイアレリックマーカーによれば、多
数の個体について遺伝子型を高速かつ高スループットで得られる可能性がある。
【０２９０】 バイアレリックマーカーは、ゲノム中に高密度で含まれており、十分に情報性
があり、多数をアッセイすることが可能である。これらの利点が組み合わさるこ
とで、バイアレリックマーカーがゲノム研究において極めて価値のあるものとな
る。バイアレリックマーカーは、家系での連鎖解析やアレル共有法、個体群での
連鎖不平衡解析、症例-対照個体群の関連性解析などに利用できるものである。
本発明の重要な態様は、バイアレリックマーカーを用いることで、関連性解析を
行って複雑な形質に関与している遺伝子を同定できるという点にある。関連性解
析では、血縁のない症例個体群と対照個体群の頻度を解析するものであり、一般
に多因子性の形質または散発性の形質の検出に用いられる。関連性解析は個体群
全体に対して実施できるものであり、羅患家系に含まれる関連した個体で実施す
る解析(連鎖解析)に限定されるものではない。異なる遺伝子のバイアレリックマ
ーカーを、疾病や治療に対する応答との直接的な関連性に関して並列にスクリー
ニングすることができる。このような多遺伝子法を使用すると、特定の表現型や
医薬品応答、散発性形質または複雑な遺伝的病因が絡む疾病状態に複数の遺伝因
子がどのような相乗効果をおよぼすか検討する上で必要な統計力になるため、多
遺伝子法はさまざまなヒトゲノム解析での強力なツールである。
【０２９１】 (多型、バイアレリックマーカーおよびそれらを含むポリヌクレオチド) (本発明のポリヌクレオチド) 一態様において、本発明は、精神分裂病と関連したバイアレリックマーカーに
関する。本発明は、染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカーと、領域Ｄ関
連バイアレリックマーカーと、sbg1関連バイアレリックマーカーと、g34665関連
バイアレリックマーカーと、sbg2関連バイアレリックマーカーと、g35017関連バ
イアレリックマーカーと、g35018関連バイアレリックマーカーとを含む。マーカ
ーおよび多型を本願明細書では主に、A1、A2、A3といった具合に示してある。本
発明の多型およびバイアレリックマーカーは、表6bでA1〜A360として示すバイア
レリックマーカーを含む。本発明の多型も表6cでA361〜A489として示す多型を含
む。また、本発明のバイアレリックマーカーと連鎖不平衡状態にあるバイアレリ
ックマーカーも含まれる。
【０２９２】 領域Dで示す小領域(D1、D2、D3およびD4で示す小領域を含む)ならびに領域Eお
よび領域Gと呼ぶ隣接した領域にある染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカ
ーの詳細を後述すると共に表6bおよび表6cにも示す。染色体13q31-q33座の領域D
、GおよびEを図2にも示す。領域D3およびD4に位置するバイアレリックマーカーA
1〜A242および361〜489について、対応する配列番号、選択的マーカーの表示お
よび配列番号内での配列の特徴の位置を表6bおよび6cに示す。表6bおよび表6cで
A243〜A360として示す群に入るさらに他のバイアレリックマーカーが、領域D1、
D2、GおよびEに位置している。領域GおよびEでのバイアレリックマーカーの相対
位置を下記の表5gにおいてさらに詳細に示し、領域D1およびD2でのバイアレリッ
クマーカーの相対位置を下記の表5hにおいてさらに詳細に示す。
【０２９３】
【表１１】
【０２９４】
【表１２】
【０２９５】 本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1〜26、36〜40および54〜229ならびに
それらと相補な配列(「それらの相補体」)から選択される配列のヌクレオチドの
連続スパンからなる、実質的にかかる連続スパンからなる、またはかかる連続ス
パンを含むものであってもよい。「連続スパン」は、その連続スパンの長さが特
定の配列番号の長さに整合する限りにおいて、少なくとも8、10、12、15、18、2
0、25、35、40、50、70、80、100、250、500、1000または2000ヌクレオチド長の
ものであってもよい。
【０２９６】 本発明は、本発明の方法においてプライマーおよびプローブとして用いるため
のポリヌクレオチドを包含する。これらのポリヌクレオチドは、配列番号1〜26
、36〜40および54〜229ならびにそれらと相補な配列(「それらの相補体」)から
選択される配列のヌクレオチドの連続スパンからなる、実質的にかかる連続スパ
ンからなる、またはかかる連続スパンを含むものであってもよい。「連続スパン
」は、その連続スパンの長さが特定の配列番号の長さに整合する限りにおいて、
少なくとも8、10、12、15、18、20、25、35、40、50、70、80、100、250、500、
1000または2000ヌクレオチド長のものであってもよい。本発明のポリヌクレオチ
ドは、配列表に列挙した多型塩基を取り囲む正確なフランキング配列を有するも
のに限定されるものではないことに注意されたい。むしろ、バイアレリックマー
カーやマーカーからの距離がさらに長い本発明の他の多型または本発明のプライ
マーまたはプローブを取り囲むフランキング配列を、意図した用途に合わせて任
意の度合いで伸長または短縮してもよく、本発明では特にこのような配列も企図
していることは理解できよう。配列番号1〜26、36〜40および54〜229のポリヌク
レオチドが意図した用途に合うどのような長さのものであってもよいことは理解
できよう。また、連続スパンの外にあるフランキング領域がヒトの被検体に実際
に起こる未変性フランキング配列と相同的である必要はない。ヌクレオチドの意
図した用途に合うヌクレオチド配列を加えることが特に企図される。連続スパン
は、任意に、前記配列に本発明のバイアレリックマーカーを含むものであっても
よい。このバイアレリックマーカーは概して一塩基位置に多型を含む。したがっ
て、各バイアレリックマーカーがポリヌクレオチド配列の2つの形態に対応する
ことになり、これらを互いに比較すると、ひとつの位置でのヌクレオチド修飾に
なる。通常、ヌクレオチド修飾では、一方のヌクレオチドが他方のヌクレオチド
に置換される必要がある。任意に、表6bに開示したバイアレリックマーカーのア
レル1またはアレル2を、本発明のバイアレリックマーカーに存在するものとして
特定してもよい。任意に、連続スパンは、1つのヌクレオチドの置換、欠失なら
びに複数ヌクレオチドの欠失をはじめとして、表6cに記載した多型位置にヌクレ
オチドを含むものであってもよい。表6cの多型がバイアレリックマーカーである
ことは確認されていないが、ほとんどがバイアレリックであると思われるため、
本願明細書ではこれについてもバイアレリックマーカーと呼ぶ。任意に、表6cに
示す多型のアレル1またはアレル2を、本発明の多型に存在するものとして特定し
てもよい。好ましいポリヌクレオチドは、配列番号1〜26、36〜40および54〜229
ならびにそれらと相補な配列から選択される配列のヌクレオチドの連続スパンか
らなる、実質的にかかる連続スパンからなる、またはかかる連続スパンを含むも
のであってもよい。「連続スパン」は、その連続スパンの長さが特定の配列番号
の長さに整合する限りにおいて、少なくとも8、10、12、15、18、20、25、35、4
0、50、70、80、100、250、500、1000または2000ヌクレオチド長のものであって
もよい。
【０２９７】 好ましいプローブまたはプライマーは、P1〜P360およびそれらの相補配列、B1
〜B229、C1〜C229、D1〜D360、E1〜E360からなる群から選択されるポリヌクレオ
チドを含んでなる核酸を含むものである。
【０２９８】 本発明は、ストリンジェンシーの高いまたは中程度の条件下で、配列番号1〜2
6、36〜40および54〜229のポリヌクレオチドならびにこれと相補的な配列とハイ
ブリダイズされるポリヌクレオチドにも関する。好ましくは、かかるポリヌクレ
オチドは、少なくとも20、25、35、40、50、70、80、100、250、500、1000また
は2000ヌクレオチド長(その長さのポリヌクレオチドが特定の配列番号と整合す
る限り)である。好ましいポリヌクレオチドは本発明の多型を含む。任意に、表6
cに開示した多型のアレル1またはアレル2を、本発明の多型に存在するものとし
て特定してもよい。特に好ましいポリヌクレオチドは本発明のバイアレリックマ
ーカーを含む。任意に、表6bに開示したバイアレリックマーカーのアレル1また
はアレル2を、本発明のバイアレリックマーカーに存在するものとして特定して
もよい。ストリンジェンシーの高い条件については本願明細書にてさらに説明す
る。
【０２９９】 本願明細書にて開示した配列から、従来技術において周知のいずれかの方法の
ために本発明のプライマーを設計してもよい。好ましいプライマーの集合は、配
列番号1〜26、36〜40および54〜229のうちいずれかの配列に対して同一性を持つ
連続スパンの3'末端が、プライマーの3'末端に存在するように作られたものであ
る。このような配置によって、プライマーの3'末端を選択した核酸配列とのハイ
ブリダイズが可能になり、プライマーの増幅反応効率または配列決定反応効率が
劇的に高くなる。好ましいプライマーの集合において、連続スパンは表6aに示し
た配列のうちの1つに見出される。本発明のバイアレリックマーカーまたは他の
多型が連続スパンの3'末端に位置し、この連続スパンがプライマーの3'末端に存
在するように、アレル特異的プライマーを設計してもよい。このようなアレル特
異的プライマーは、前記マーカーに存在する2つのアレルのうち一方を含む核酸
試料と併用する限りにおいて、増幅反応または配列決定反応を選択的に刺激しや
すいものである。本発明のプライマーの3'末端は、前記配列における本発明のバ
イアレリックマーカー内またはそれよりも少なくとも2、4、6、8、10、12、15、
18、20、25、50、100、250、500または1000ヌクレオチド上流あるいは、配列決
定、増幅における意図した用途に適した他の任意の位置または新規な配列または
マーカーの位置に所在してもよい。3'末端が本発明のバイアレリックマーカーよ
りも1ヌクレオチド上流にあるプライマーは、マイクロシークエンシングアッセ
イにおいて特に有用である。好ましいマイクロシークエンシング用プライマーを
表6dに示す。
【０３００】 本願明細書にて開示した配列から、従来技術において周知のいずれかの方法の
ために本発明のプローブを設計してもよく、特に、本願明細書に開示の特定の配
列またはマーカーが存在する場合の試験が可能な方法に対して設計することがで
きる。どのような特定のアッセイ条件の組み合わせであってもバイアレリックマ
ーカーまたは他の多型の一方のアレルとは選択的に結合するが、他方のアレルに
は結合しないような好ましいプローブの集合を、周知の方法で、本発明のハイブ
リダイゼーションアッセイにおいて使用すべく設計してもよい。好ましいハイブ
リダイゼーションプローブは、長さの範囲が8、10、12、15、18または20〜25、3
5、40、50、60、70または80ヌクレオチドであるか、あるいは12、15、18、20、2
5、35、40または50ヌクレオチド長のものとして特定でき、前記配列に本発明の
バイアレリックマーカーまたは他の多型を含む連続スパンからなる、実質的にか
かる連続スパンからなる、またはかかる連続スパンを含むものであってもよい。
好ましい実施形態では、表6bまたは表6cに開示されたアレル1またはアレル2のい
ずれかをバイアレリックマーカー部位に存在するものとして特定することができ
る。もう1つの好ましい実施形態では、前記バイアレリックマーカーは、ハイブ
リダイゼーションプローブの中心から6、5、4、3、2または1ヌクレオチド以内ま
たは前記プローブの中心にあってもよい。
【０３０１】 一実施形態では、本発明は、配列番号1〜26、36〜40および54〜229のうちいず
れか1つの8〜50およびそれらの相補体のうちいずれか１つのヌクレオチドの連続
スパンを含む、かかる連続スパンからなるまたは実質的にかかる連続スパンから
なる、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドおよび組換え
ポリヌクレオチドであって、前記スパンが、本発明の多型、染色体13q31-q33関
連バイアレリックマーカー、領域Ｄ関連バイアレリックマーカーまたはsbg1関連
バイアレリックマーカー、g34665関連バイアレリックマーカー、sbg2関連バイア
レリックマーカー、g35017関連バイアレリックマーカーまたはg35018関連バイア
レリックマーカーを前記配列に含み、任意に、前記多型、染色体13q31-q33関連
バイアレリックマーカー、領域Ｄ関連バイアレリックマーカーまたはsbg1関連バ
イアレリックマーカー、g34665関連バイアレリックマーカー、sbg2関連バイアレ
リックマーカー、g35017関連バイアレリックマーカーまたはg35018関連バイアレ
リックマーカーが、A1〜A489およびそれらの相補体または任意にそれらと連鎖不
平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択され、任意に、前記
染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカー、領域Ｄ関連バイアレリックマー
カーまたはsbg1関連バイアレリックマーカー、g34665関連バイアレリックマーカ
ー、sbg2関連バイアレリックマーカー、g35017関連バイアレリックマーカーまた
はg35018関連バイアレリックマーカーが、A1〜A69、A71〜A74、A76〜A94、A96〜
A106、A108〜A112、A114〜A177、A179〜A197、A199〜A222、A224〜A246、A250、
A251、A253、A255、A259、A266、A268〜A232、A328〜489からなる群から選択さ
れ、任意に、前記染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカー、領域Ｄ関連バ
イアレリックマーカー、sbg1関連バイアレリックマーカー、g34665関連バイアレ
リックマーカー、sbg2関連バイアレリックマーカー、g35017関連バイアレリック
マーカーまたはg35018関連バイアレリックマーカーが、A1〜A69、A71〜A74、A76
〜A94、A96〜A106、A108〜A112、A114〜A177、A179〜A197、A199〜A222、A224〜
A242および361〜489およびそれらの相補体または任意にそれらと連鎖不平衡状態
にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択され、任意に、前記染色体13
q31-q33関連バイアレリックマーカー、領域Ｄ関連バイアレリックマーカーまた
はsbg1関連バイアレリックマーカー、g34665関連バイアレリックマーカー、sbg2
関連バイアレリックマーカー、g35017関連バイアレリックマーカーまたはg35018
関連バイアレリックマーカーが、A1〜A69、A71〜A74、A76〜A94、A96〜A106、A1
08〜A112、A114〜A177、A179〜A197、A199〜A222、A224〜A242、A250〜A251、A2
59、A269〜A270、A278、A285〜A299、A303〜A307、A330、A334〜A335およびA346
〜357および361〜489およびそれらの相補体または任意にそれらと連鎖不平衡状
態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択され、任意に、前記連続ス
パンが18〜35ヌクレオチド長であり、前記バイアレリックマーカーが前記ポリヌ
クレオチドの中心から4ヌクレオチド以内にあり、任意に、前記ポリヌクレオチ
ドが前記連続スパンからなり、前記連続スパンが25ヌクレオチド長であり、前記
バイアレリックマーカーが前記ポリヌクレオチドの中心にあり、任意に、前記連
続スパンの3'末端が前記ポリヌクレオチドの3'末端に存在し、任意に、前記連続
スパンの3'末端が前記ポリヌクレオチドの3'末端に位置し、前記バイアレリック
マーカーが前記ポリヌクレオチドの3'末端に存在する、単離されたポリヌクレオ
チド、精製されたポリヌクレオチドおよび組換えポリヌクレオチドを包含する。
好ましい実施形態において、前記プローブは、配列P1〜P360およびそれらと相補
な配列から選択される配列を含む、かかる配列からなる、または実質的にかかる
配列からなる。
【０３０２】 もう１つの実施形態では、本発明は、配列番号1〜26、36〜40および54〜229の
うちいずれか1つの8〜50およびそれらの相補体のうちいずれか１つのヌクレオチ
ドの連続スパンを含む、かかる連続スパンからなるまたは実質的にかかる連続ス
パンからなる、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドおよ
び組換えポリヌクレオチドであって、前記連続スパンの3'末端が前記ポリヌクレ
オチドの3'末端に位置し、かつ、前記ポリヌクレオチドの3'末端が、前記配列中
、本発明の多型、染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカー、領域Ｄ関連バ
イアレリックマーカーまたはsbg1関連バイアレリックマーカー、g34665関連バイ
アレリックマーカー、sbg2関連バイアレリックマーカー、g35017関連バイアレリ
ックマーカーまたはg35018関連バイアレリックマーカーの上流20ヌクレオチド以
内に位置し、任意に、前記染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカー、領域
Ｄ関連バイアレリックマーカーまたはsbg1関連バイアレリックマーカー、g34665
関連バイアレリックマーカー、sbg2関連バイアレリックマーカー、g35017関連バ
イアレリックマーカーまたはg35018関連バイアレリックマーカーが、A1〜A489お
よびそれらの相補体または任意にそれらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリック
マーカーからなる群から選択され、任意に、前記染色体13q31-q33関連バイアレ
リックマーカー、領域Ｄ関連バイアレリックマーカーまたはsbg1関連バイアレリ
ックマーカー、g34665関連バイアレリックマーカー、sbg2関連バイアレリックマ
ーカー、g35017関連バイアレリックマーカーまたはg35018関連バイアレリックマ
ーカーが、A1〜A69、A71〜A74、A76〜A94、A96〜A106、A108〜A112、A114〜A177
、A179〜A197、A199〜A222、A224〜A246、A250、A251、A253、A255、A259、A266
、A268〜A232、A328〜A360および361〜489およびそれらの相補体または任意にそ
れらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択され、
任意に、前記染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカー、領域Ｄ関連バイア
レリックマーカーまたはsbg1関連バイアレリックマーカー、g34665関連バイアレ
リックマーカー、sbg2関連バイアレリックマーカー、g35017関連バイアレリック
マーカーまたはg35018関連バイアレリックマーカーが、A1〜A69、A71〜A74、A76
〜A94、A96〜A106、A108〜A112、A114〜A177、A179〜A197、A199〜A222、A224〜
A242および361〜489からなる群から選択され、任意に、前記染色体13q31-q33関
連バイアレリックマーカー、領域Ｄ関連バイアレリックマーカーまたはsbg1関連
バイアレリックマーカー、g34665関連バイアレリックマーカー、sbg2関連バイア
レリックマーカー、g35017関連バイアレリックマーカーまたはg35018関連バイア
レリックマーカーがからなる群から選択され、任意に、前記染色体13q31-q33関
連バイアレリックマーカー、領域Ｄ関連バイアレリックマーカーまたはsbg1関連
バイアレリックマーカー、g34665関連バイアレリックマーカー、sbg2関連バイア
レリックマーカー、g35017関連バイアレリックマーカーまたはg35018関連バイア
レリックマーカーが、A1〜A69、A71〜A74、A76〜A94、A96〜A106、A108〜A112、
A114〜A177、A179〜A197、A199〜A222、A224〜A242、A250〜A251、A259、A269〜
A270、A278、A285〜A299、A303〜A307、A330、A334〜A335、A346〜357および361
〜489およびそれらの相補体または任意にそれらと連鎖不平衡状態にあるバイア
レリックマーカーからなる群から選択され、任意に、前記ポリヌクレオチドの3'
末端が、前記染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカー、領域Ｄ関連バイア
レリックマーカーまたはsbg1関連バイアレリックマーカー、g34665関連バイアレ
リックマーカー、sbg2関連バイアレリックマーカー、g35017関連バイアレリック
マーカーまたはg35018関連バイアレリックマーカーの1ヌクレオチド上流に位置
し、任意に、前記ポリヌクレオチドが、配列D1〜D360およびE1〜E360から選択さ
れる配列を含む、かかる配列からなる、または実質的にかかる配列からなる。
【０３０３】 さらに他の実施形態では、本発明は、配列B1〜B229およびC1〜C229から選択さ
れる配列を含む、かかる配列からなる、または実質的にかかる配列からなる、単
離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌク
レオチドを包含する。
【０３０４】 別の実施形態において、本発明は、ハイブリダイゼーションアッセイ、シーク
エンシングアッセイおよび酵素ベースのミスマッチ検出アッセイにおいて、配列
番号1〜26、36〜40および54〜229のいずれかまたはそれらの相補体の染色体13q3
1-q33関連バイアレリックマーカー、領域Ｄ関連バイアレリックマーカーまたはs
bg1関連バイアレリックマーカー、g34665関連バイアレリックマーカー、sbg2関
連バイアレリックマーカー、g35017関連バイアレリックマーカーまたはg35018関
連バイアレリックマーカーでのヌクレオチドの同一性の判定に用いられるポリヌ
クレオチドならびに、本発明の多型、染色体13q31-q33関連バイアレリックマー
カー、領域Ｄ関連バイアレリックマーカーまたはsbg1関連バイアレリックマーカ
ー、g34665関連バイアレリックマーカー、sbg2関連バイアレリックマーカー、g3
5017関連バイアレリックマーカーまたはg35018関連バイアレリックマーカーを、
配列番号1〜26、36〜40および54〜229のいずれかまたはそれらの相補体に含むヌ
クレオチドセグメントの増幅に用いられるポリヌクレオチドであって、任意に、
前記染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカー、領域Ｄ関連バイアレリック
マーカーまたはsbg1関連バイアレリックマーカー、g34665関連バイアレリックマ
ーカー、sbg2関連バイアレリックマーカー、g35017関連バイアレリックマーカー
またはg35018関連バイアレリックマーカーが、A1〜A489およびそれらの相補体ま
たは任意にそれらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群か
ら選択され、任意に、前記染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカー、領域
Ｄ関連バイアレリックマーカーまたはsbg1関連バイアレリックマーカー、g34665
関連バイアレリックマーカー、sbg2関連バイアレリックマーカー、g35017関連バ
イアレリックマーカーまたはg35018関連バイアレリックマーカーが、A1〜A69、A
71〜A74、A76〜A94、A96〜A106、A108〜A112、A114〜A177、A179〜A197、A199〜
A222、A224〜A246、A250、A251、A253、A255、A259、A266、A268〜A232、A328〜
A360および361〜489およびそれらの相補体または任意にそれらと連鎖不平衡状態
にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択され、任意に、染色体13q31-
q33関連バイアレリックマーカー、領域Ｄ関連バイアレリックマーカーまたはsbg
1関連バイアレリックマーカー、g34665関連バイアレリックマーカー、sbg2関連
バイアレリックマーカー、g35017関連バイアレリックマーカーまたはg35018関連
バイアレリックマーカーが、A1〜A69、A71〜A74、A76〜A94、A96〜A106、A108〜
A112、A114〜A177、A179〜A197、A199〜A222、A224〜A242、A250〜A251、A259、
A269〜A270、A278、A285〜A299、A303〜A307、A330、A334〜A335およびA346〜35
7および361〜489およびそれらの相補体または任意にそれらと連鎖不平衡状態に
あるバイアレリックマーカーからなる群から選択され、任意に、染色体13q31-q3
3関連バイアレリックマーカー、領域Ｄ関連バイアレリックマーカーまたはsbg1
関連バイアレリックマーカー、g34665関連バイアレリックマーカー、sbg2関連バ
イアレリックマーカー、g35017関連バイアレリックマーカーまたはg35018関連バ
イアレリックマーカーが、A1〜A69、A71〜A74、A76〜A94、A96〜A106、A108〜A1
12、A114〜A177、A179〜A197、A199〜A222、A224〜A242および361〜489およびそ
れらの相補体または任意にそれらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカ
ーからなる群から選択される、ポリヌクレオチドを包含する。
【０３０５】 これらのアレイは一般に、機械的な合成方法または光指向性合成方法を用いて
作製できる。これらの方法では、フォトリソグラフィによる方法と固相オリゴヌ
クレオチド合成との組み合わせを利用している(Fodor et al., Science, 251:76
7-777, 1991)。オリゴヌクレオチドアレイの固相支持体への固定化は、一般に「
Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis(VLSIPS（登録商標）)」と呼
ばれるテクノロジーの開発によって可能になったものである。このテクノロジー
では一般に、チップの固体表面上でプローブを高密度アレイ状に固定化する。VL
SIPS（登録商標）テクノロジーの一例は、米国特許第5,143,854号および同第5,4
12,087号ならびに国際特許出願公開第WO90/15070号、同第WO92/10092号および同
第WO95/11995号にあげられている。これらの公報では、光指向性合成法などの手
法によってオリゴヌクレオチドアレイを形成する方法について説明されている。
固相支持体に固定化されるヌクレオチドのアレイを提供することを目的とした設
計ストラテジーでは、ハイブリダイゼーションパターンと配列情報を最大化しよ
うという試みの中で、チップ上でオリゴヌクレオチドアレイを順序付けて表示す
るための別のプレゼンテーションストラテジーが開発された。このようなプレゼ
ンテーションストラテジーの一例が、国際特許出願公開第WO94/12305号、同第WO
94/11530号、同第WO97/29212号および同第WO97/31256号に開示されている。
【０３０６】 オリゴヌクレオチドアレイは、本発明のバイアレリックマーカーのアレル1種
またはそれ以上が試料に含まれるか否かを判定するために、配列番号1〜26、36
〜40および54〜229からなる群から選択される配列と、連続した少なくとも8、10
、12、15、18、20、25、35、40、50、70、80、100、250、500、1000または2000
ヌクレオチドで構成される、それらと相補な配列またはそのフラグメント(その
長さのフラグメントが特定の配列番号と整合する限り)とのうち少なくとも1つを
含むことができる。オリゴヌクレオチドアレイはまた、表6bのバイアレリックマ
ーカーまたは表6cの多型のアレル1種またはそれ以上を増幅するために、配列番
号1〜26、36〜40および54〜229からなる群から選択される配列と、連続した少な
くとも8、10、12、15、18、20、25、35、40、50、70、80、100、250、500、1000
または2000ヌクレオチドで構成される、それらと相補な配列またはそのフラグメ
ント(その長さのフラグメントが特定の配列番号と整合する限り)とのうち少なく
とも1つを含むことができる。他の実施形態では、アレイは、マイクロシークエ
ンシング解析を実施し、本発明のバイアレリックマーカーのアレル1種またはそ
れ以上が試料に含まれるか否かを判定するために、配列番号1〜26、36〜40およ
び54〜229からなる群から選択される配列と、連続した少なくとも8、10、12、15
、18、20、25、35、40、50、70、80、100、250、500、1000または2000ヌクレオ
チドで構成される、それらと相補な配列またはそのフラグメント(その長さのフ
ラグメントが特定の配列番号と整合する限り)とのうち少なくとも1つを含むこと
ができる。さらに他の実施形態では、オリゴヌクレオチドアレイは、オリゴヌク
レオチドアレイは、本発明の多型およびバイアレリックマーカーのアレル1種ま
たはそれ以上が試料に含まれるか否かを判定するために、配列番号1〜26、36〜4
0および54〜229からなる群から選択される配列と、少なくとも8、10、12、15、1
8、20、25、35、40、50、70、80、100、250、500、1000または2000ヌクレオチド
長で構成される、それらと相補な配列またはそのフラグメント(その長さのフラ
グメントが特定の配列番号と整合する限り)とのうち少なくとも1つを含むことが
できる。
【０３０７】 本発明のさらに他の目的は、P1〜P360、B1〜B229、C1〜C229、D1〜D360、E1〜
E360からなる群から選択される配列のうち少なくとも1つ、または、連続した少
なくとも8、10、12、15、18、20、25、30または40ヌクレオチドで構成される、
それらと相補な配列またはそのフラグメントか、または、A1〜A489からなる群か
ら選択されるバイアレリックマーカー少なくとも1、2、3、4、5、10、20を含む
配列またはそれらの相補体のうち少なくとも1つのいずれかを含む、核酸配列の
アレイに関する。また、本発明は、P1〜P360、B1〜B229、C1〜C229、D1〜D360、
E1〜E360からなる群から選択される配列のうち少なくとも1、2、3、4、5、10、2
0または連続した少なくとも8ヌクレオチドで構成される、それらと相補な配列ま
たはそのフラグメント、または、A1〜A360またはそれらの相補体からなる群から
選択されるバイアレリックマーカーを含む配列少なくとも2つを含む核酸配列の
アレイに関する。
【０３０８】 また、本発明は、本発明のポリヌクレオチド1種またはそれ以上を含み、任意
に、必要な試薬の一部または全部と、本発明のバイアレリックマーカーのヌクレ
オチドの同一性を判定することによって被検被検体を遺伝子型判定するための指
示書と、を含む、診断用キットを包含するものである。このキットに含まれるポ
リヌクレオチドは、任意に、固相支持体に結合されていてもよく、あるいは、ポ
リヌクレオチドのアレイの一部であるかまたはアドレス指定可能なアレイであっ
てもよい。このキットでは、シークエンシングアッセイ法、マイクロシークエン
シングアッセイ法、ハイブリダイゼーションアッセイ法または酵素ベースのミス
マッチ検出アッセイを含むがこれに限定されるものではない、従来技術で周知の
いずれかの方法で、マーカー位置におけるヌクレオチドの同一性を判定すること
ができる。任意に、かかるキットは、精神分裂病に対する被検体の素因または精
神分裂病に作用する薬剤に対する考え得る応答または精神分裂病に作用する薬剤
よる副作用が生じる可能性に鑑みて判定結果をスコアリングするための指示書を
含むものであってもよい。
【０３０９】 最後に、本発明のいずれの実施形態においても、バイアレリックマーカーは、
任意に、 (a) sbg1関連マーカーA85〜A219からなる群から選択されるバイアレリックマ
ーカー、あるいは一層好ましくは、sbg1関連マーカーA85〜A94、A96〜A106、A10
8〜A112、A114〜A177、A179〜A197およびA199〜A219からなる群から選択される
バイアレリックマーカー、 (b) g34665関連マーカーA230〜A236からなる群から選択されるバイアレリッ
クマーカー、 (c) sbg2関連マーカーA79〜A99からなる群から選択されるバイアレリックマ
ーカー、 (d) g35017関連マーカーA41、 (e) g35018関連マーカーA1〜A39からなる群から選択されるバイアレリックマ
ーカー、 (f) A239、A227、A198、A228、A223、A107、A218、A270、A75、A62、A65およ
びA70からなる群から選択されるバイアレリックマーカー、 (g) A48、A60、A61、A62、A65、A70、A75、A76、A80、A107、A108、A198、A2
18、A221、A223、A227、A228、A239、A285、A286、A287、A288、A290、A292、A2
93、A295,A299およびA304からなる群から選択されるバイアレリックマーカー、 (h) A304、A307、A305、A298、A292、A293、A291、A287、A286、A288、A289
、A290、99-A295 A299、A241、A239、A228、A227、A223、A221、A218、A198、A1
78、99-24649/186 A108、A107、A80、A75、A70、A65およびA62からなる群から選
択されるバイアレリックマーカーおよび/または (i) A304、A307、A305、A298、A292、A293、A291、A287、A286、A288、A289
、A290、A295、A299、A241、A239、A228、A227、A223、A221、A218、A198、A178
、A108、A107、A80、A76、A75、A70、A65、A62、A61、A60、A48からなる群から
選択されるバイアレリックマーカーを含むものであってもよい。
【０３１０】 任意に、本願明細書にて説明するいずれの実施形態においても、領域D関連バ
イアレリックマーカーまたは染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカーは、A
1〜A69、A71〜A74、A76〜A94、A96〜A106、A108〜A112、A114〜A177、A179〜A19
7、A199〜A222、A224〜A242、A250〜A251、A259、A269〜A270、A278、A285〜A29
9、A303〜A307、A330、A334〜A335、A346〜357および361〜489からなる群から選
択されるものであってもよい。任意に、本願明細書にて説明するいずれの実施形
態においても、染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカーは、A1〜A69、A71
〜A74、A76〜A94、A96〜A106、A108〜A112、A114〜A177、A179〜A197、A199〜A2
22、A224〜A246、A250、A251、A253、A255、A259、A266、A268〜A232およびA328
〜A489からなる群から選択されるものであってもよい。前記領域Ｄ関連バイアレ
リックマーカーまたは染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカーの集合はそ
れぞれ、前記バイアレリックマーカーを少なくとも1、2、3、4、5、10、20、40
、50、100または200を含むものであってもよい。
【０３１１】 任意に、本願明細書にて説明する方法のいずれの構成も、A70、A75、A95、A10
7、A113、A178、A198、A223、A247〜A249、A252、A254、A256〜A258、A260〜A26
5、A267、A324〜A328からなる群から選択されるバイアレリックマーカー少なく
とも1、2、3、4、5、10、20またはすべてのバイアレリックマーカーを具体的に
除外してもよいものである。
【０３１２】 さらに、本発明のいずれの実施形態においても、染色体13q31-q33関連バイア
レリックマーカー、領域Ｄ関連バイアレリックマーカーまたはsbg1関連バイアレ
リックマーカー、g34665関連バイアレリックマーカー、sbg2関連バイアレリック
マーカー、g35017関連バイアレリックマーカーまたはg35018関連バイアレリック
マーカーの集合は、前記バイアレリックマーカーを少なくとも1、2、3、4、5、1
0、20、40、50、100または200含むものであってもよい。
【０３１３】 (バイアレリックマーカーの新規な同定方法) ゲノムフラグメントを単一ヌクレオチド多型についてスクリーニングする際に
は、オリゴヌクレオチドプローブとのディファレンシャルハイブリダイゼーショ
ン、ゲル電気泳動で測定される易動度の変化の検出または増幅した核酸の直接配
列決定など、さまざまな方法のうちどれを使用してもよい。バイアレリックマー
カーを同定するための好ましい方法は、血縁のない適当数の個体に由来するゲノ
ムDNAフラグメントの比較配列決定を必要とするものである。
【０３１４】 第1の実施形態では、血縁のない個体から得たDNA試料を一緒にプールし、続い
て興味の対象となるゲノムDNAを増幅して配列決定する。このようにして得られ
たヌクレオチド配列を解析し、有意な多型を同定する。この方法の大きな利点の
1つは、DNA試料をプールすることで、実施しなければならないDNA増幅反応と配
列決定反応の回数が実質的に減ることにつながるという事実にある。さらに、こ
の方法は非常に感受性の高いものであるため、この方法で得られるバイアレリッ
クマーカーでは、関連性解析を行う際に有用となる共通性の乏しいアレルが十分
な頻度を示すのが普通である。通常、この方法によって同定されるバイアレリッ
クマーカーの共通性の乏しいアレルの頻度は少なくとも10%である。
【０３１５】 第2の実施形態では、DNA試料のプールを設けず、増幅と配列決定を個別に行う
。この方法は、候補遺伝子内での関連性解析を行うためにバイアレリックマーカ
ーの同定が必要な場合に用いると好ましいことが多い。好ましくは、プロモータ
ー領域またはエキソン領域などの極めて関係の深い遺伝子領域を、バイアレリッ
クマーカーについてスクリーニングする。この方法で得られるバイアレリックマ
ーカーの方が、関連性解析を行うための情報性という点で劣ることがある。たと
えば、頻度の低いアレルの頻度が約10%未満になることもあり得るのである。し
かしながら、かかるバイアレリックマーカーは関連性解析を行う上では十分に情
報性のあるものであるため、このような情報性の低いバイアレリックマーカーを
本発明のゲノム関連性解析に含めると、場合によっては原因変異を直接同定でき
ることがあるが、浸透度次第では珍しい変異である可能性が残ることも理解でき
よう。
【０３１６】 以下、本発明のバイアレリックマーカーを同定するために本願発明者らが使用
した好ましい方法の様々なパラメーターについて説明する。
【０３１７】 (ゲノムDNA試料) 本発明のバイアレリックマーカーを作出する上でのソースとなるゲノムDNA試
料は、民族性のバックグラウンドが明らかになっている異種起源の個体群に対応
する、血縁のない個体から得たものであると好ましい。DNA試料を得る個体の数
は、好ましくは約10〜約1000、一層好ましくは約50〜約200の範囲で実質的に変
えることができる。通常、特定の個体群の多型性に十分な多様性を持たせ、でき
るだけ多くのマーカーを同定し、かつ統計的に有意な結果を生成するためには、
少なくとも約100個体からDNA試料を収集する。
【０３１８】 解析対象となるゲノムDNAのソースに関して言えば、特に制限なくどのような
被検試料でも用いることが可能である。これらの被検試料としては、本願明細書
において説明する本発明の方法によって試験可能な生物学的試料があげられる。
また、全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液の他、呼吸器、腸管および泌
尿生殖器、涙、唾液、乳、白血球、骨髄腫などでのさまざまな外分泌液、細胞培
養の上澄み液などの生物学的な流体、腫瘍組織および非腫瘍組織、リンパ節組織
を含む固定組織標本、骨髄吸引液および固定細胞標本などのヒトおよび動物の体
液もあげられる。本発明に使用されるゲノムDNAの好ましいソースは、各ドナー
の辺縁末梢静脈血から採取したものである。ゲノムDNAを生物学的試料から調製
する手法は当業者間で周知である。好ましい実施形態を実施例1で詳細に説明す
る。当業者であれば、プールしたDNA試料またはプールしていないDNA試料のどち
らかを選択して増幅できる。
【０３１９】 (DNA増幅) DNA増幅方法を用いることで、ゲノムDNA試料でのバイアレリックマーカーの同
定を容易にすることができる。増幅ステップのためにDNA試料をプールしても、
プールせずにおいてもよい。DNA増幅手法は当業者間で周知である。バイアレリ
ックマーカーを有するDNAフラグメントを増幅するためのさまざまな方法につい
ては、以下においてさらに詳細に説明する。PCRテクノロジーは、新しいバイア
レリックマーカーの同定に使用される好ましい増幅手法である。
【０３２０】 第1の実施形態では、本願発明者らが生成したゲノム配列情報を使用して、バ
イアレリックマーカーを同定する。上述したBACクローンの挿入物などのゲノムD
NAフラグメントを配列決定し、500bpのフラグメントを増幅するためのプライマ
ーの設計に利用する。これらの500bpのフラグメントをゲノムDNAから増幅し、バ
イアレリックマーカーでスキャンする。OSPソフトウェア(Hillier L. and Green
P., 1991)を用いてプライマーを設計してもよい。いずれのプライマーも、配列
決定用プライマーとして機能する共通のオリゴヌクレオチド尾を特定の標的塩基
の上流に含むものであってもよい。当業者であれば、こうした目的で利用できる
プライマー伸長物に馴染みがあるであろう。
【０３２１】 本発明のもう１つの実施形態では、バイアレリックマーカーの直接スクリーニ
ングを可能にする公共のデータベースで候補遺伝子のゲノム配列を利用できる。
候補遺伝子をコードするゲノム配列の増幅に有用な好ましいプライマーとしては
、遺伝子のプロモーター、エキソンおよびスプライス部位に的が絞られる。遺伝
子のこうした機能領域に存在するバイアレリックマーカーの方が原因変異となる
確率は高い。
【０３２２】 (増幅したゲノムDNAの配列決定と一塩基多型の同定) 次に、上述したようにして生成した増幅産物の配列を、当業者が容易に利用で
きる周知の適当な方法で決定する。ジデオキシ媒介法(Sanger法)またはMaxam-Gi
lbert法のいずれかを用いたDNAの配列決定方法は当業者間で周知である。かかる
方法は、たとえば、Maniatis et al.(Molecular Cloning, A Laboratory Manual
, Cold Spring Harbor Press, Second Edition, 1989)に開示されている。他の
方法としては、Chee et al.(Science 274, 610, 1996)に記載されているような
高密度DNAプローブ配列へのハイブリダイゼーションがあげられる。
【０３２３】 好ましくは、染料プライマーサイクルシークエンシングプロトコルを使用して
、増幅したDNAで自動ジデオキシターミネーターでの配列決定反応を行う。配列
決定反応での反応産物を配列決定用ゲルに仕込み、ゲル画像解析によって配列を
求める。多型探査は、同一の位置に異なる塩基が発生することで泳動パターンの
ピークに重畳が見られることを利用して行われる。各ジデオキシターミネーター
には異なる蛍光分子で標識がしてあるため、バイアレリック部位に対応する2つ
のピークが配列上の同一位置にある2つの異なるヌクレオチドに対応する別の色
として現れる。しかしながら、2つのピークが存在するのは自然放射によるノイ
ズが原因のアーチファクトの可能性もある。このようなアーチファクトを排除す
るために、2つのDNA鎖を配列決定し、ピークとの比較を実施する。多型配列とし
て登録されるためには、両方の鎖で多型が検出される必要がある。
【０３２４】 上記の手順を用いることでバイアレリックマーカーを含む増幅産物の同定が可
能になる。アレル頻度が分かっているプールを配列決定して確認したところ、10
0個体で構成されるプールを配列決定して検出されるバイアレリック多型頻度の
検出限界はマイナーアレルで約0.1である。しかしながら、プーリング法によっ
て検出されたバイアレリック多型のうち90%を超える多型では、マイナーアレル
の頻度が 0.25を上回っている。したがって、この方法で選択したバイアレリッ
クマーカーの頻度は、マイナーアレルで少なくとも0.1、メジャーアレルで 0.9
未満である。好ましくはマイナーアレルで少なくとも0.2、メジャーアレルで 0.
8未満、さらに好ましくはマイナーアレルで少なくとも0.3、メジャーアレルで 0
.7未満であり、ヘテロ接合率は0.18を上回る値、好ましくは0.32を上回る値、さ
らに好ましくは 0.42を上回る値である。
【０３２５】 別の実施形態では、バイアレリックマーカーが個々のDNA試料の配列決定によ
って検出され、このようなバイアレリックマーカーのマイナーアレルの頻度は0.
1未満であってもよい。
【０３２６】 (本発明によるバイアレリックマーカーの確認) 個体群に両方のアレルが存在することを確認して、遺伝マーカーとしての多型
の有用性を評価する。バイアレリックマーカーの確認は、本発明の方法で個体の
グループの遺伝子型を判定し、両方のアレルが存在することを示して行う。アレ
ルの遺伝子型判定に使うものとしては、マイクロシークエンシングが好ましい方
法である。遺伝子型判定ステップによる確認は、グループの各個体から採取した
個体試料ごとに行ってもよいし、2つ以上の個体から採取した試料のプールにつ
いて遺伝子型を判定して行ってもよい。問題のアレルに対して個体がヘテロ接合
的なものである場合には、1個体でグループを形成することもできる。好ましく
は、1つのグループに少なくとも3個体が含まれるようにし、さらに好ましくは1
つのグループに5個体または6個体が含まれるようにする。これによって、1回の
確認試験で試験対象となるバイアレリックマーカー2つ以上を確認できることが
多いためである。しかしながら、確認試験を行う対象が小さなグループの場合、
サンプリングエラーが原因で被検個体のいずれにも2つのアレルがなかった場合
に、偽の負の結果となってしまうことがある。したがって、配列内の特定の位置
に真のバイアレリックマーカーがあることを示す場合よりも、特定の最初の結果
がアーチファクトであるということを示す上で確認プロセスの有用性が落ちてし
まう。本発明の遺伝子型判定法、ハプロタイプ判定法、関連性解析法および相互
作用解析法はいずれも、任意に、有用性が確認できたバイアレリックマーカーを
用いて単独で実施できるものである。
【０３２７】 (本発明によるバイアレリックマーカーの頻度の評価) バイアレリックマーカー部位における最小共通アレルの頻度を決定することに
より、有効なバイアレリックマーカーの遺伝マーカーとしての有用性をさらに評
価する。最小共通アレルの決定は、本発明の方法で個体のグループの遺伝子型を
判定し、両方のアレルが存在することを示して行う。遺伝子型判定ステップによ
る頻度判断は、グループの各個体から採取した個体試料ごとに行ってもよいし、
2つ以上の個体から採取した試料のプールについて遺伝子型を判定して行っても
よい。このグループの大きさは、全体が個体群を代表できるだけのものでなけれ
ばならない。好ましくは、このグループには少なくとも20個体が含まれ、さらに
好ましくはグループには少なくとも50個体が含まれ、最も好ましくはグループに
は少なくとも100個体が含まれる。もちろん、グループが大きくなればなるほど
サンプリングエラーが減るため、頻度決定の精度も高くなる。共通性の少ないア
レルの頻度が30%以上のバイアレリックマーカーを「高品質バイアレリックマー
カー」とする。本発明の遺伝子型判定法、ハプロタイプ判定法、関連性解析法お
よび相互作用解析法はいずれも、任意に、高品質バイアレリックマーカーを用い
て単独で実施できるものである。
【０３２８】 本発明のもう1つの実施形態は、13q31-q33関連バイアレリックマーカーについ
て前記個体群からの個体の遺伝子型を判定し、前記個体群における前記バイアレ
リックマーカーの比例表示を決定することを含む、個体群におけるアレル頻度の
推定方法を含むものである。また、個体群におけるアレル頻度の推定方法は、本
願明細書で開示したいずれかの限定事項のある方法あるいは単独または組み合わ
せでの方法を包含する。任意に、前記13q31-q33関連バイアレリックマーカーは
、配列番号1〜26、36〜40および54〜229およびそれらの相補体からなる群から個
々にまたは組み合わせで選択される配列に含まれるものであってもよい。任意に
、前記13q31-q33関連バイアレリックマーカーは、表6bまたは表6cに示すバイア
レリックマーカーから選択されるものであってもよい。任意に、個体群における
バイアレリックマーカーアレルの頻度の判定が、前記個体群の各個体のゲノムに
存在する前記バイアレリックマーカーの両方のコピーについてヌクレオチドの同
一性を判定し、その個体群について前記13q31-q33関連バイアレリックマーカー
における前記ヌクレオチドの比例表現を算出することによって達成されるもので
あってもよい。任意に、個体群におけるバイアレリックマーカーアレルの頻度の
判定が、前記個体群の特定数の個体または各個体から採取した生物学的試料のプ
ールに遺伝子型判定を行い、前記ヌクレオチドの比例量を算出して全体と比較し
てなされるものであってもよい。
【０３２９】 (バイアレリックマーカーでの個体の遺伝子型判定方法) 本発明の1種またはそれ以上のバイアレリックマーカーでの遺伝子型を生物学
的試料で判定するための方法が得られる。これらの方法はいずれも、in vitroに
て行うことのできるものである。かかる遺伝子型判定方法は、従来技術において
周知の手法で本発明のバイアレリックマーカーでのヌクレオチドの同一性を判断
することを含む。これらの方法には、関連性解析時の遺伝子型判定症例-対照個
体群での用途の他、特定の形質に関連していることが知られているバイアレリッ
クマーカーのアレルを検出する状況で用途がある。いずれの場合も、個体のゲノ
ム中に含まれるバイアレリックマーカーの両方のコピーを判断し、個体が特定の
アレルについてホモ接合性であるかヘテロ接合性であるかを判断することができ
る。
【０３３０】 これらの遺伝子型判定方法は、単一の個体またはプールしたDNA試料から得た
核酸試料で行うことができる。
【０３３１】 バイアレリックマーカーの同定について上述した方法と同様の方法を用いて、
あるいは後述するような他の遺伝子型判定方法を用いて、遺伝子型判定を行うこ
とができる。好ましい実施形態では、異なる個体から採取して増幅したゲノムフ
ラグメントの配列同士を比較し、新しいバイアレリックマーカーを同定するが、
診断や関連性解析での用途で既知のバイアレリックマーカーの遺伝子型を判定す
る場合はマイクロシークエンシングを使用する。
【０３３２】 本発明のもう1つの実施形態は、13q31-q33関連バイアレリックマーカーのヌク
レオチドの同一性を判定することを含む、生物学的試料の遺伝子型判定方法を包
含する。また、本発明による遺伝子型判定方法は、本願明細書で開示したいずれ
かの限定事項のある方法あるいは単独または組み合わせでの方法を包含する。任
意に、前記13q31-q33関連バイアレリックマーカーは、配列番号1〜26、36〜40お
よび54〜229およびそれらの相補体からなる群から個々にまたは組み合わせで選
択される配列に含まれるものであってもよい。任意に、前記13q31-q33関連バイ
アレリックマーカーは、表6bまたは表6cに示すバイアレリックマーカーから個々
にまたは組み合わせで選択されるものであってもよい。任意に、前記方法はさら
に、前記バイアレリックマーカーの第2のヌクレオチドの同一性を判定すること(
前記第1のヌクレオチドおよび第2のヌクレオチドが(Watson & Crick塩基対形成
によって)互いに塩基対をなしていない)を含むものであってもよい。任意に、前
記生物学的試料が単一の個体または被検体に由来するものであってもよい。任意
に、前記方法がin vitroで実施されるものであってもよい。任意に、前記バイア
レリックマーカーが、前記個体のゲノムに存在する前記バイアレリックマーカー
の両方のコピーについて判定されるものであってもよい。任意に、前記生物学的
試料が複数の被検体または個体に由来するものであってもよい。任意に、前記方
法がさらに、前記判定するステップの前に、バイアレリックマーカーを含む前記
配列の一部を増幅することを含むものであってもよい。任意に、前記増幅を、置
換の起始(origin)と前記一部とを宿主細胞に含む組換えベクターのPCR、LCRまた
は置換によって行ってもよい。任意に、前記判定を、ハイブリダイゼーションア
ッセイ、シークエンシングアッセイ、マイクロシークエンシングアッセイまたは
酵素ベースのミスマッチ検出アッセイによって行っても良い。
【０３３３】 (遺伝子型判定対象DNAのソース) 所望の特異核酸配列を含んでいることが明らかであるか、あるいはその疑いが
認められるのであれば、精製状態または非精製状態のどのような核酸ソースでも
起始核酸として使用できる。本願明細書にて説明するように、細胞、組織、体液
などからDNAまたはRNAを抽出すればよい。本発明の遺伝子型判定方法に用いられ
る核酸はどのような哺乳動物ソース由来のものであってもよいものではあるが、
核酸試料を採取する被検体および個体は一般にヒトであると理解される。
【０３３４】 (バイアレリックマーカーを有するDNAフラグメントの増幅) 本発明によるバイアレリックマーカーを1種またはそれ以上含むヌクレオチド
セグメントを増幅するための方法およびポリヌクレオチドが得られる。バイアレ
リックマーカーを有するDNAフラグメントの増幅は、さまざまな方法や目的で利
用されるものであり、遺伝子型判定に限定されるものではないことは理解できよ
う。ただし、すべてではないとはいえ多くの遺伝子型判定法では、興味の対象と
なっているバイアレリックマーカーを有するDNA領域をあらかじめ増幅しておく
必要がある。このような方法によって、バイアレリックマーカーにわたっている
か、あるいはこれに対して遠位または近位にある部位と配列を含む配列の濃度ま
たは総数が明らかに増す。診断アッセイでも本発明のバイアレリックマーカーを
持つDNAセグメントの増幅に依存する場合がある。
【０３３５】 DNAの増幅は、確立されたPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法、あるいはこれに手を
加えて開発または変更したものなど、従来技術において周知のいずれかの方法で
行えばよい。本願明細書において使用可能な増幅法としては、欧州特許出願公開
第EP A 320 308号および同第EP A 439 182号に記載されているようなリガーゼ連
鎖反応(LCR)、Gap LCR(Wolcott, M.J.)、Guatelli J.C. et al.(1990)およびCom
pton J.(1991)に記載されている、いわゆる「NASBA」または「3SR」技術、欧州
特許出願公開第4544 610号に記載されているようなQ-β増幅、Walker et al.(19
96)およびEP A 684 315に記載されているようなSDA法、国際特許出願公開第WO93
22461号に記載されているような標的媒介増幅があげられるが、これに限定され
るものではない。
【０３３６】 LCRおよびGap LCRは、指数機能的増幅手法であり、いずれもDNA分子にアニー
ルされた隣接プライマーを結合するDNAリガーゼに依存している。リガーゼ連鎖
反応(LCR)ではプローブ対を使用するが、これには一次(第1および第2)プローブ2
本と二次(第3および第4)プローブ2本が含まれている。プローブはすべて標的に
対してモル過剰な状態で使用される。第1のプローブは標的鎖の第1のセグメント
とハイブリダイズされ、第2のプローブは標的鎖の第2のセグメントとハイブリダ
イズされる。第1のセグメントと第2のセグメントが連続しているため、一次プロ
ーブは5'ホスフェート-3'ヒドロキシルの関係で互いに当接し、リガーゼは2本の
プローブと共有結合的に融合すなわち連結して融合産物となることができる。ま
た、第3の(二次)プローブは第1のプローブの一部にハイブリダイズすることが可
能であり、第4の(二次)プローブは同様の当接方法で第2のプローブの一部にハイ
ブリダイスすることができる。もちろん、標的が最初に二本鎖である場合は、二
次プローブも第1の例で標的補体にハイブリダイズされる。一次プローブの連結
鎖がいったん標的鎖から分離されると、その後は第3および第4のプローブとハイ
ブリダイズされるが、これを連結して相補的な二次結合産物が得られる。連結産
物は機能的に標的またはその相補体に相当するものだということを理解するのは
重要なことである。ハイブリダイゼーションと連結のサイクルを繰り返すことで
、標的配列を増幅することができる。複合的なLCR法については、すでに説明が
なされている(WO9320227)。Gap LCR(GLCR)は、プローブ同士が隣接しているので
はなく、2〜3塩基分だけ離れたLCRである。
【０３３７】 mRNAの増幅について見ると、mRNAをcDNAに逆転写し、続いてポリメラーゼ連鎖
反応(RT-PCR)を行うこと、米国特許第5,322,770号に記載されているように両方
のステップに1つの酵素を用いること、あるいはMarshall R.L. et al.(1994)に
記載されているように非対称Gap LCR(RT-AGLCR)を使用することは、いずれも本
発明の範囲内である。AGLCRはGLCRに手を加えてRNAの増幅を可能にしたものであ
る。
【０３３８】 本願明細書にて説明するように、これらの増幅方法の中には、単一ヌクレオチ
ド多型の検出に特に適しており、標的配列の増幅と多型ヌクレオチドの同定を同
時に行うことのできるものがある。.
【０３３９】 PCRテクノロジーは、本発明で用いられる好ましい増幅手法である。さまざま
なPCR法が当業者間で周知である。PCRテクノロジーについては、Molecular Clon
ing to Genetic Engineering White, B.A. Ed.(1997)および「PCR Methods and
Applications」というタイトルの刊行物(1991, Cold Spring Harbor Laboratory
Press)を参照のこと。これらのPCR手順の各々で、増幅対象となる核酸配列の片
側のPCRプライマーを、dNTPおよびTaqポリメラーゼ、PfuポリメラーゼまたはVen
tポリメラーゼなどの熱安定性ポリメラーゼと共に、適宜調製した核酸試料に付
加する。試料中の核酸を変性させ、PCRプライマーを試料中の相補核酸配列に特
異的にハイブリダイズさせる。ハイブリダイズ後のプライマーを伸長させる。そ
の後、修飾、ハイブリダイゼーションおよび伸長をもう1サイクル開始する。こ
のサイクルを複数回繰り返し、プライマー部位間に核酸配列のある増幅フラグメ
ントを作出する。PCRについては、米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号お
よび同第4,965,188号をはじめとするいくつかの特許にも説明されている。
【０３４０】 プライマーは、適当な方法で調製可能なものである。たとえば、Narang S.A.
et al.のリン酸ジエステル法(1979)、Brown E.L. et al.のリン酸ジエステル法(
1979)、Beaucage et al.のジエチルホスホラミダイト法(1981)およびEP 0 707 5
92に記載されている固相支持体法などの方法による直接化学合成があげられる。
【０３４１】 いくつかの実施形態では、本発明によって、本発明のバイアレリックマーカー
1種またはそれ以上を有するDNAフラグメントを増幅するためのプライマーが得ら
れる。列挙したプライマーはごく一例であり、1つまたはそれ以上の本発明のバ
イアレリックマーカーを含む増幅産物を産生する他のどのようなプライマー集合
でもよいことは理解できよう。
【０３４２】 増幅対象となるセグメントの長さはプライマー間の間隔によって決まる。本発
明の文脈では、バイアレリックマーカーを持つ増幅セグメントは大きさが少なく
とも約25bp〜35kbpであることができる。25〜3000bpの増幅フラグメントが一般
的であり、50〜1000bpのフラグメントが好ましく、100〜600bpのフラグメントが
極めて好ましい。バイアレリックマーカーに対する増幅プライマーは、マーカー
を持つDNAフラグメントの特異的な増幅が可能なものであればどのようなもので
あってもよいことは理解できよう。「オリゴヌクレオチドプローブおよびプライ
マー」というセクションで説明したように、増幅プライマーを標識または固相に
固定化してもよい。
【０３４３】 (DNA試料のバイアレリックマーカーでの遺伝子型判定方法) 従来技術において周知の適当な方法を用いて、バイアレリックマーカー部位に
存在するヌクレオチドを同定することができる。検出対象となるバイアレリック
マーカーアレルが同定され、本発明において具体的に明記されているため、この
検出は、当業者であればさまざまな手法のうち適当なものを用いて実施できる単
純なものである。多くの遺伝子型判定方法では、興味の対象となっているバイア
レリックマーカーを持つDNA領域をあらかじめ増幅しておく必要がある。現時点
では標的またはシグナルを増幅するのが好ましいが、増幅を必要としない超高感
受性の方法も本遺伝子型判定方法に包含される。バイアレリック多型の検出に利
用することのできる当業者間で周知の方法としては、従来のドットブロット解析
、Orita et al.(1989)に記載されている一本鎖立体構造多型解析(SSCP)、変性剤
濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)、ヘテロ二重鎖解析、ミスマッチ切断検出、Sheffi
eld, V.C. et al.(1991)、White et al.(1992)、Grompe, M. et al.(1989)およ
びGrompe, M.(1993)に記載されている他の従来の手法があげられる。特定の多型
部位に存在するヌクレオチドの同一性を判定するためのもう1つの方法に、米国
特許第4,656,127に記載されているような特別なエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレ
オチド誘導体を用いるものがある。
【０３４４】 好ましい方法では、シークエンシングアッセイ、酵素を用いたスマッチ検出ア
ッセイまたはハイブリダイゼーションアッセイによって、バイアレリックマーカ
ー部位に存在するヌクレオチドの同一性を直接判定する。いくつかの好ましい方
法について以下に述べる。極めて好ましい方法はマイクロシークエンシング法で
ある。「シークエンシングアッセイ」という用語は、本願明細書では、二重鎖プ
ライマー/鋳型錯体のポリメラーゼ伸長を意味し、従来の配列決定とマイクロシ
ークエンシングの両方を含むものとする。
【０３４５】 1)シークエンシングアッセイ 配列決定法によって多型部位に存在するヌクレオチドを判定することができる
。好ましい実施形態では、配列決定の前に上述したようにしてDNA試料をPCR増幅
する。DNA配列決定法については、本願明細書にて説明するとおりである。好ま
しくは、染料プライマーサイクルの配列決定用プロトコルを使用して、増幅した
DNAで自動ジデオキシターミネーターでの配列決定反応を行う。配列解析によっ
て、バイアレリックマーカー部位に存在する塩基を同定することができる。
【０３４６】 2)マイクロシークエンシングアッセイ マイクロシークエンシング法では、単一ヌクレオチドプライマー伸長反応によ
って、一方の荒アレルに特有の標的DNAの多型部位にあるヌクレオチドを検出す
る。この方法は、標的核酸の興味の対象となっている多型塩基のすぐ上流でハイ
ブリダイズされる適切なマイクロシークエンシングプライマーを必要とするもの
である。ポリメラーゼを使用して、多型部位の選択されたヌクレオチドと相補な
1つのシングルddNTP(鎖ターミネーター)でプライマーの3'末端を特異的に伸長す
る。次に、組み込まれたヌクレオチドの同一性を適当な方法で判定する。
【０３４７】 一般に、マイクロシークエンシング反応は蛍光ddNTPを用いて行われ、伸長さ
れたマイクロシークエンシングプライマーをABI 377配列決定装置での泳動によ
って解析し、EP 412 883に記載されているようにして取り込まれたヌクレオチド
の同一性を判定する。あるいは、キャピラリー泳動を用いてさらに多数の検定を
同時に行うようにすることもできる。本発明の文脈で使用可能な一般的なマイク
ロシークエンシング手順の一例を実施例4に示す。
【０３４８】 さまざまな方法を利用して、マイクロシークエンシングプライマーに付加され
たヌクレオチドを検出することが可能である。ChenおよびKwok(1997)ならびにCh
en et al.(1997)に、蛍光共鳴エネルギー移動を利用した均一相検出方法が説明
されている。この方法では、多型部位を有する増幅ゲノムDNAフラグメントを、
アレル染料標識ジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートおよび修飾Taqポ
リメラーゼの存在下、5'-フルオレセイン標識プライマーでインキュベートする
。鋳型に存在するアレルに特異な染料ターミネーターによって、染料標識プライ
マーを1塩基分だけ伸長する。遺伝子型判定反応の終了時、反応混合物における2
種類の染料の蛍光強度を、分離または精製などの処理を行わずに直接解析する。
これらのステップはいずれも同一のチューブで行うことができるものであり、蛍
光の変化をリアルタイムに監視できる。あるいは、MALDI-TOF質量スペクトロメ
トリによって伸展したプライマーを解析してもよい。マイクロシークエンシング
プライマーに加わった質量によって多型部位の塩基を同定する(Haff L.A. and S
mirnov I.P., 1997を参照のこと)。
【０３４９】 確立されたマイクロシークエンシング法あるいはこれに手を加えて開発または
変更したものによって、マイクロシークエンシングを行ってもよい。他の選択肢
としては、いくつかの固相マイクロシークエンシング法があげられる。プライマ
ーまたは標的分子を固相支持体に固定化または捕捉する生体外(heterogenous)検
定で行うこと以外、基本的なマイクロシークエンシングプロトコルは先に説明し
たものと同じである。プライマーの分離と末端ヌクレオチドの付加解析を容易に
するために、オリゴヌクレオチドを固相支持体に結合させるか、親和分離とポリ
メラーゼ伸長とが可能な方法で修飾する。合成オリゴヌクレオチドの5'末端およ
び内部ヌクレオチドをさまざまな方法で修飾し、ビオチン化などの異なる親和分
離法を可能にすることができる。単一の親和性基をオリゴヌクレオチド上で使用
する場合、取り込まれたターミネーターのリジェント(regent)からオリゴヌクレ
オチドを分離することができる。これによって、物理的な分別またはサイズによ
る分別が必要なくなる。2つ以上の親和基を使用すれば、2つ以上のオリゴヌクレ
オチドをターミネーター試薬から分離して同時に解析することができる。これに
よって、1回の伸長反応で複数の核酸種または一層多くの核酸配列情報を解析す
ることができる。親和基は必ずしも初回刺激オリゴヌクレオチド上にある必要は
なく、鋳型上にあってもよい。たとえば、ビオチン標識DNAとストレプトアビジ
ン被覆マイクロ滴定ウェルまたはアビジン被覆ポリスチレン粒子との相互作用を
利用して固定化を行うことができる。同様に、オリゴヌクレオチドまたは鋳型を
高密度状で固相支持体に結合させてもよい。このような固相マイクロシークエン
シング反応では、取り込まれたddNTPを放射線標識する(Syvanen, 1994)か、ある
いはフルオレセインと結合させる(Livak and Hainer, 1994)ことができる。放射
線標識ddNTPの検出は、シンチレーションベースの手法で行うことができる。フ
ルオレセイン結合ddNTPの検出は、アルカリホスファターゼと抱合した抗蛍光抗
体の結合後、色素生産性基質(p-ニトロフェニルホスフェートなど)と共にインキ
ュベートすることを基本としている。考え得る他のレポーター検出対としては、
ジニトロフェニル(DNP)に結合したddNTPと抗DNPアルカリホスファターゼ抱合体(
Harju et al. 1993)またはo-フェニレンジアミンを基質として用いたビオチン標
識ddNTPと西洋わさびペルオキシダーゼ抱合ストレプトアビジン(WO92/15712)が
あげられる。さらに他の固相マイクロシークエンシング手順として、Nyren et a
l.(1993)は、enzymatic luminometric inorganic pyrophosphate detection ass
ay(ELIDA)でDNAポリメラーゼ活性を検出することに依存した方法を示した。
【０３５０】 Pastinen et al.(1997)は、固相ミニシークエンシング原理をオリゴヌクレオ
チドアレイフォーマットに適用する単一ヌクレオチド多型の複合検出方法につい
て説明している。固相支持体(DNAチップ)に結合したDNAプローブの高密度アレイ
については本願明細書にて説明する。
【０３５１】 一態様では、本発明によって、ポリヌクレオチドと、マイクロシークエンシン
グアッセイを行うことによって本発明のバイアレリックマーカー1種またはそれ
以上の遺伝子型を判定する方法が得られる。好ましいマイクロシークエンシング
プライマーとしては、表6dに特徴を示したものがあげられる。表6dに列挙するマ
イクロシークエンシングプライマーはごく一例であり、多型ヌクレオチドのすぐ
隣に3'末端があるどのようなプライマーでも使用できることは理解できよう。同
様に、マイクロシークエンシング解析が、どのようなバイアレリックマーカーま
たは本発明のバイアレリックマーカーの組み合わせに対して実行してもよいもの
であることも理解できよう。本発明の一態様は、バイアレリックマーカー部位で
のヌクレオチドの同一性を判断するため、表6dに列挙するマイクロシークエンシ
ングプライマー、あるいは、少なくとも8、少なくとも12、少なくとも15または
少なくとも20の連続したヌクレオチドからなる、かかるプライマーのフラグメン
トであって、対応するバイアレリックマーカーのすぐ上流に3'末端を有するフラ
グメントのうち1つまたはそれ以上を含む固相支持体である。
【０３５２】 3)ポリメラーゼおよびリガーゼを利用したミスマッチ検出アッセイ 一態様では、本発明によれば、ポリヌクレオチドと、ポリメラーゼおよび/ま
たはリガーゼに基づくミスマッチ検出アッセイによって、生物学的試料で本発明
の1種またはそれ以上のバイアレリックマーカーのアレルを判定する方法とが得
られる。これらのアッセイは、ポリメラーゼおよびリガーゼの特異性を利用した
ものである。重合反応では、増幅プライマーの3'末端の正しい塩基対形成という
点で特に厳密であり、標的DNA配列にハイブリダイズされた2つのオリゴヌクレオ
チドの結合は、ライゲーション部位付近、特に3'末端でのミスマッチに対して極
めて感受性が高い。「酵素ベースのミスマッチ検出アッセイ」という用語は、本
願明細書において、リガーゼおよびポリメラーゼの特異性に基づいてバイアレリ
ックマーカーのアレルの判定方法を意味する語として使用する。好ましい方法に
ついては後述する。本発明のバイアレリックマーカーを含むDNAフラグメントを
増幅するための方法については、本願明細書にてさらに説明する。
【０３５３】 (アレル特異的増幅) アレル特異的増幅すなわち選択的なストラテジーによって、バイアレリックマ
ーカーの2つのアレルを区別し、一方のアレルだけを増幅することができる。こ
れは、多型塩基を一方の増幅プライマーの3'末端に所在させることによって達成
される。プライマーの3'末端からの伸長がゆえに、この位置近辺でのミスマッチ
は増幅に阻害的な悪影響を及ぼす。したがって、適切な増幅条件下で、これらの
プライマーはそれらの相補アレルでのみ増幅を指示する。適切なアレル特異的プ
ライマーおよびこれに対応するアッセイ条件の設計方法については当業者間で周
知である。
【０３５４】 (ライゲーション/増幅を利用した方法) 「オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ」(OLA)では、標的分子の一本
鎖の当接配列にハイブリダイズできるように設計された2つのオリゴヌクレオチ
ドを利用する。一方のオリゴヌクレオチドをビオチン標識し、他方を検出可能な
状態で標識する。正確な相補配列が標的分子中に見つかった場合は、末端が当接
して捕捉および検出が可能なライゲーション基質が得られるようにオリゴヌクレ
オチドをハイブリダイズさせる。OLAは、バイアレリックマーカーを検出でき、N
ickerson D.A. et al.(1990)に説明されているPCR法と有利に併用されるこの方
法では、PCRを用いて標的DNAの指数的な増幅を行い、これをOLAを用いて検出す
る。
【０３５５】 バイアレリックマーカーの検出に特に適している他の方法としては、本願明細
書にて説明するLCR(リガーゼ連鎖反応)およびGap LCR(GLCR)があげられる。上述
したように、LCRでは2対のプローブを用いて特異的標的を指数関数的に増幅する
。各オリゴヌクレオチド対の配列を選択し、これらの対が標的の同一鎖の当接配
列とハイブリダイズできるようにする。かかるハイブリダイゼーションによって
、鋳型依存性リガーゼの基質が形成される。本発明によれば、バイアレリックマ
ーカー部位の同一鎖の近位配列と遠位配列とを有するオリゴヌクレオチドを用い
てLCRを実施することができる。一実施形態では、どちらのオリゴヌクレオチド
を設計してバイアレリックマーカー部位を持たせてもよい。かかる実施形態では
、オリゴヌクレオチド上のバイアレリックマーカーと相補な特異的ヌクレオチド
が標的分子に含まれているかまたは欠けている場合にオリゴヌクレオチドが連結
されるように反応条件を選択する。別の実施形態では、WO90/01069に記載されて
いるように、オリゴヌクレオチドにはバイアレリックマーカーを持たせず、標的
分子とハイブリダイズさせたときに「間隙」が形成されるようにする。この間隙
に相補dNTPまたは別のオリゴヌクレオチド対を「満たす」(DNAポリメラーゼによ
って媒介)。このように、各サイクルの終了時、各一本鎖には次のサイクルの間
に標的として機能できる補体があり、所望の配列の指数関数的なアレル特異的増
幅が達成される。
【０３５６】 核酸分子のあらかじめ選択された部位でのヌクレオチドの同一性を判定するた
めのもう1つの方法に、リガーゼ/ポリメラーゼ媒介遺伝的Bit Analysis（登録商
標）がある(WO95/21271)。この方法は、あらかじめ選択された部位に存在するヌ
クレオチドと相補なヌクレオシド三リン酸をプライマー分子の終端に組み入れ、
第2のオリゴヌクレオチドと連結させるものである。反応の固相に付加された特
異的ラベルの検出または溶液での検出によって反応を監視する。
【０３５７】 4)ハイブリダイゼーションアッセイ法 バイアレリックマーカー部位に存在するヌクレオチドの同一性を判定するため
の好ましい方法は、核酸ハイブリダイゼーションを利用するものである。かかる
反応で都合良く用いることのできるハイブリダイゼーションプローブには、本願
明細書で定義するプローブを含むと好ましい。サザンハイブリダイゼーション、
ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーションおよ
び固相ハイブリダイゼーションなど、どのようなハイブリダイゼーションアッセ
イを用いてもよい(Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manua
l, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 1989を参照のこと)。
【０３５８】 ハイブリダイゼーションとは、相補的な塩基対によって2本の一本鎖核酸が二
本鎖構造に形成されることを意味する。ハイブリダイゼーションは、正確に相補
関係にある核酸鎖間またはミスマッチのマイナーな領域を含む核酸鎖間で起こり
得る。一方の形式のバイアレリックマーカーとハイブリダイズされ、他方とはハ
イブリダイズされずに、異なるアレル型を区別することのできる特異的プローブ
を設計することができる。アレル特異的プローブは対で用いられることが多く、
対の一方が起始アレルを含む標的配列とマッチし、他方が選択的アレルを含む標
的配列と完全にマッチする。ハイブリダイゼーション条件は、アレル間のハイブ
リダイゼーション強度に有意な差が認められる程度にストリンジェントなもので
なければならず、好ましくは本質的にバイナリ応答を呈し、これによってプロー
ブが一方のアレルとハイブリダイズされる。ストリンジェントな配列特異的ハイ
ブリダイゼーション条件の下で、プローブは正確に相補関係にある標的配列との
みハイブリダイズされるが、このような条件は従来技術において周知である(Sam
brook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Second Edition, C
old Spring Harbor Press, N.Y., 1989)。ストリンジェントな条件は配列依存で
あり、環境によって異なるものである。通常、ストリンジェントな条件は、規定
のイオン強度およびpHでの特定の配列の融点(Tm)よりも約5℃低い温度に選択さ
れる。一例であり限定するものではないが、ストリンジェンシーの高い条件を用
いて行われる手順は次の通りである。6×SSC、トリス-HCl(pH7.5)50mM、EDTA 1m
M、0.02% PVP、0.02%フィコール、0.02% BSAおよび変性サケ精子DNA 500μg/ml
で構成される緩衝液にて、65℃で8時間から一晩かけて、DNAを含有するフィルタ
をプレハイブリダイゼーションする。好ましいハイブリダイゼーション温度であ
る65℃にて48時間、変性サケ精子DNA 100μg/mlと32P標識プローブ5〜20×106cp
mとを含むプレハイブリダイゼーション混合物中でフィルタをハイブリダイズさ
せる。あるいは、SSC緩衝液(1×SSCが0.15M NaClおよび0.05 M Naクエン酸塩に
相当)の存在下、65℃でハイブリダイゼーションステップを行うことができる。
続いて、2×SSC、0.01% PVP、0.01%フィコールおよびBSA 0.01%を含有する溶液
中で37℃で1時間、次いで0.1×SSCで50℃にて45分かけてフィルタを洗浄するこ
とができる。あるいは、2×SSCと0.1% SDSまたは0.5×SSCと0.1% SDSまたは0.1
×SSCと0.1% SDSを含有する溶液で68℃にて15分の間隔でフィルタを洗浄するこ
とができる。洗浄ステップの後、ハイブリダイズしたプローブをオートラジオグ
ラフィによって検出することが可能である。一例であり限定するものではないが
、ストリンジェンシーが中程度の手順は以下の通りである。DNAを含むフィルタ
をプレハイブリダイズし、次いで5×SSC緩衝液と標識プローブとの存在下、60℃
の温度にてハイブリダイズさせる。続いて、2×SSCを含有する溶液で50℃にてフ
ィルタを洗浄すると、ハイブリダイズさせたプローブをオートラジオグラフィで
検出可能である。ストリンジェンシーが高いまたは中程度の他の使用条件は当業
者間で周知のものであり、Sambrook et al.(Molecular Cloning - A Laboratory
Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 1989)およびAusu
bel et al.(Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Asso
ciates and Wiley Interscience, N.Y., 1989)に記載されている。
【０３５９】 かかるハイブリダイゼーションは溶液中で行うことができるものではあるが、
固相ハイブリダイゼーションアッセイを利用すると好ましい。ハイブリッド反応
の前に本発明のバイアレリックマーカーを含む標的DNAを増幅してもよい。プロ
ーブと標的DNAとの間に形成される安定したハイブリッド二重鎖の有無を検出す
ることによって、試料中の特異的アレルの存在を検出する。ハイブリッド二重鎖
の検出は、さまざまな方法で行うことができる。標的またはプローブに結合する
検出可能な標識を利用し、ハイブリッド二重鎖の検出を可能にするさまざまな検
出アッセイ形式が周知である。一般に、ハイブリダイゼーション二重鎖をハイブ
リダイズされなかった核酸から分離し、二重鎖に結合した標識を検出する。当業
者であれば、洗浄ステップを取り入れて余分な標的DNAまたはプローブなどを洗
い流してもよいことは理解できよう。プライマーおよびプローブに存在する標識
を用いてハイブリッドを検出するには、標準的な異質アッセイ形式が適している
。
【０３６０】 最近開発された2種類のアッセイでは、分離または洗浄を必要とせずにハイブ
リッドベースのアレルを区別できる(Landegren U. et al., 1998を参照のこと)
。TaqManアッセイでは、累積する増幅産物に特異的にアニールされたDNAプロー
ブを消化する。蛍光エネルギー移動によって相互作用するドナーアクセプタ染料
対でTaqManプローブを標識する。増幅時に進行中のポリメラーゼによってTaqMan
プローブが切断されると、消光アクセプタ染料からドナー染料が解離し、ドナー
蛍光が大幅に増大する。2つのアレル変異体を検出するのに必要なすべての試薬
を反応の最初に組み合わせ、結果をリアルタイムで監視することができる(Livak
et al., 1995を参照のこと)。選択的均質ハイブリダイゼーションを利用した手
順では、分子的な指標がアレルの区別に用いられる。分子的な指標は、均質溶液
中での特異的核酸の存在を示すヘアピン形のオリゴヌクレオチドプローブである
。標的に結合すると、内部的に消光するフルオロフォアを保持する立体配置的な
再編成が起こる(Tyagi et al., 1998)。
【０３６１】 アレル特異的プローブへのハイブリダイゼーションを検定することによって、
特定の試料中でのバイアレリックマーカーアレルの有無を検出することができる
。
【０３６２】 「ハイブリダイゼーションアッセイ」にはアレイ形式の高スループット並列ハ
イブリダイゼーションが特に包含され、これについては後述する。
【０３６３】 (オリゴヌクレオチドのアドレス指定可能なアレイに対するハイブリダイゼーシ
ョン) オリゴヌクレオチド配列に基づくハイブリダイゼーションアッセイでは、完全
にマッチする標的配列変異体とミスマッチ変異体とに対する短いオリゴヌクレオ
チドのハイブリダイゼーション安定性の違いを利用している。オリゴヌクレオチ
ドプローブの高密度アレイが選択された位置で固相(チップ)に付着した基本的な
構造によって、多型情報に効率的にアクセスできる。各DNAチップには、格子状
のパターンに配置され、ダイム硬貨程度の大きさまで小型化された個々の合成DN
Aプローブを数千から数百万含むことができる。
【０３６４】 チップテクノロジーは、すでにさまざまな事例に応用されて成功をおさめてい
る。たとえば、突然変異のスクリーニングが、BRCA1遺伝子、S. cerevisiaeミュ
ータント株およびHIV-1ウイルスのプロテアーゼ遺伝子でなされる(Hacia et al.
1996、Shoemaker et al. 1996、Kozal et al. 1996)。カスタマイズベースで、
Affymetrix(GeneChip（登録商標）)、Hyseq(HyChip and HyGnostics)およびProt
ogene Laboratoriesなどで、バイアレリック多型検出用のさまざまな形態のチッ
プを作製することができる。
【０３６５】 一般に、これらの方法では、標的配列に多型性のマーカーが含まれる個体から
得た標的核酸配列セグメントと相補関係にあるオリゴヌクレオチドプローブの配
列を利用している。EP785280には、単一のヌクレオチド多型検出用のタイリング
(tiling)ストラテジーについて記載されている。簡単に説明すると、このアレイ
は一般に、多数の特異的多型について「タイル張り」してもよい。「タイリング
」という用語は一般に、興味の対象となっている標的配列に相補な配列と、この
配列のあらかじめ選択されたバリエーション(1カ所またはそれ以上の特定の位置
でモノマーの基本集合のメンバすなわちヌクレオチド1つまたはそれ以上で置換
されているなど)で構成される、規定されたオリゴヌクレオチドプローブの集合
の合成を意味する。タイリングストラテジーはさらに、PCT国際特許出願公開第W
O95/11995号に記載されている。特定の態様では、多数の同定された特異的両ア
レルマーカー配列でアレイをタイル張りする。特に、アレイにタイル張りをして
、それぞれが特定のバイアレリックマーカーまたはバイアレリックマーカーの集
合に特異な多数の検出ブロックが含まれるようにする。たとえば、検出ブロック
をタイル張りして多数のプローブが含まれるようにし、これらのプローブが特定
の多型を含む配列セグメントにまたがるようにしてもよい。各アレルに対して相
補関係にあるプローブが必ず得られるようにするために、バイアレリックマーカ
ーで異なる対のプローブを合成する。多型塩基で異なるプローブだけでなく、一
置換プローブも検出ブロックの中にタイル張りされるのが普通である。これらの
一置換プローブは、多型自体の部分に塩基を有し、かつ多型からいずれかの方向
に一定数まで塩基を有する。これが残りのヌクレオチド(A、T、G、C、Uから選択
される)で置換されている。一般に、タイル張りされた検出ブロック内のプロー
ブには、バイアレリックマーカーから5塩基離れたところまでの配列位置の置換
基が含まれる。一置換プローブによって、タイル張りされたアレイの内部が制御
され、実際のハイブリダイゼーションと人為的なクロスハイブリダイゼーション
とを区別できる。標的配列とのハイブリダイゼーションおよびアレイの洗浄が終
了したら、このアレイを走査してアレイ上での位置を判定し、この位置に標的配
列をハイブリダイズさせる。次に、走査後のアレイから得られるハイブリダイゼ
ーションデータを解析し、バイアレリックマーカーのアレルのうち試料中に存在
するもの(1つまたは複数)を特定する。ハイブリダイゼーションおよび走査は、
国際特許出願公開第WO92/10092号および同第WO95/11995号、さらに米国特許第5,
424,186号に記載されているようにして行われる。
【０３６６】 このように、いくつかの実施形態では、チップは、約15ヌクレオチド長のフラ
グメントの核酸配列のアレイを含むものであってもよい。さらに他の実施形態で
は、チップは、配列番号1〜26、36〜40および54〜229と、連続した少なくとも約
8ヌクレオチド、好ましくは10、15、20、一層好ましくは連続した25、30、40、4
7または50ヌクレオチドで構成される、それらと相補な配列またはそのフラグメ
ントと、からなる群から選択される配列少なくとも1つを含むアレイを含むもの
であってもよい。いくつかの実施形態では、チップは、本発明のポリヌクレオチ
ド少なくとも2、3、4、5、6、7、8またはそれ以上のアレイを含むものであって
もよい。固相支持体と固相支持体に結合した本発明のポリヌクレオチドについて
は、「オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー」のセクションでさらに詳
細に説明する。
【０３６７】 5)統合系 多型の解析に使用できるもう1つの技術にマルチコンポーネント統合系があげ
られる。この系では、PCRおよびキャピラリー電気泳動反応などのプロセスを単
一機能の装置で簡略化かつ区分化する。かかる手法の模範例が、PCR増幅とキャ
ピラリー電気泳動とをチップに統合することについて説明した米国特許第5,589,
136号に開示されている。
【０３６８】 主にマイクロ流体系を使用する場合に統合系の使用を考慮することができる。
これらの系は、ガラス、ケイ素、石英またはプラスチックウェーハ上に設計され
たマイクロチャネルのパターンがマイクロチップ内に含まれたものである。試料
の動きを、マイクロチップの異なるエリアで印加される電力、電気浸透的または
流体静動力によって制御し、機能的な顕微値を得ると共に稼働部材なしでポンプ
移動させる。電圧を変えることでマイクロ加工されたチャネル間での流体の流れ
を制御する。バイアレリックマーカーの遺伝子型を判定するために、核酸増幅、
マイクロシークエンシング、毛細管電気泳動、蛍光検出などのレーザー誘導検出
方法に、マイクロ流体系を組み合わせてもよい。
【０３６９】 (本発明のバイアレリックマーカーを用いた遺伝的解析の方法) 複雑な形質の遺伝的解析にはいくつかの方法が利用できる(LanderおよびSchor
k, 1994を参照のこと)。家系解析を用いて1つの座と推定形質座との間の同時分
離について証拠を探査する連鎖手法と、アレルと形質または形質誘発アレルとの
間の統計的に有意な関連性について証拠を探査する関連性手法の2つの主な方法
を利用して、疾病感受性遺伝子の探査を行う(Khoury J. et al., 1993)。概して
、本発明のバイアレリックマーカーは、遺伝子型と表現型との間の統計的に有意
な相関を示すための従来技術において周知のどのような方法においても用途があ
る。バイアレリックマーカーをパラメトリックな連鎖解析法とノンパラメトリッ
クな連鎖解析法に利用できる。好ましくは、本発明のバイアレリックマーカーを
使用して、関連性解析によって検出可能な形質に関連のある遺伝子を同定する。
この方法では、羅患家系を使用する必要がなく、複雑で散発性の形質に関連のあ
る遺伝子でも同定できる。
【０３７０】 本発明のバイアレリックマーカーを用いた遺伝的解析は、どのような規模で行
ってもよい。本発明のバイアレリックマーカーのセット全体または本発明のバイ
アレリックマーカーのサブセットを使用することができる。いくつかの実施形態
では、本発明の1つまたは複数の候補遺伝子に対応するバイアレリックマーカー
のサブセットを利用してもよい。あるいは、特定の染色体セグメントに局在する
本発明のバイアレリックマーカーのサブセットを利用してもよい。さらに、本発
明のバイアレリックマーカーを含む遺伝マーカーセットを用いることもできる。
述したように、本発明のバイアレリックマーカーが、ヒトゲノムの完全または部
分的な遺伝地図に含まれる場合がある。これらの異なる用途は、本発明および請
求の範囲において特に考慮されているものである。
【０３７１】 (連鎖解析) 連鎖解析では、一家系内で複数の世代にわたって遺伝マーカーの伝達と特異的
な形質の伝達との間の相関を確立することを基本としている。したがって、連鎖
解析の目的は、系図において興味の対象となる形質と同時分離を見せるマーカー
座を検出することにある。
【０３７２】 (パラメトリックな方法) 連続した世代からデータを入手できる場合、対になった座での連鎖の度合いを
研究することができる。組換え画分を推定することで、遺伝地図上で座を順序付
け、そこに配置することができる。遺伝マーカーである座を用いて、遺伝地図を
確立し、次いでマーカーと形質との間の連鎖の強さを計算し、これらの形質に影
響するマーカーおよび遺伝子の相対位置を示すことができる(Weir, B.S., 1996)
。連鎖解析の伝統的な方法は、オッズ比の対数値(lod)のスコアリング(Morton N
.E., 1955、Ott J, 1991を参照のこと)である。lodスコアを算出するには、その
疾病の遺伝機序が詳細に分かっている必要がある(パラメトリックな方法)。一般
に、連鎖解析で同定される候補領域の長さは2〜20Mbである。上述したようにし
て候補領域を特定した後、さらに別のマーカーを用いて組換え個体の解析を行う
ことで、候補領域を正確に把握することができる。連鎖解析研究では一般に、最
大5,000のマイクロサテライトマーカーを使用するため、連鎖解析の理論解像度
はどんなに良くても平均約600kb程度に限られてしまう。
【０３７３】 明確なメンデル遺伝パターンを示し、浸透度(すなわち、アレルαの形質ポジ
ティブ保因者の数と個体群におけるα保因者の総数の比)の高い単純な遺伝形質
のマッピングには、連鎖解析が効果的に利用されている。しかしながら、パラメ
トリックな連鎖解析にはさまざまな欠点がつきまとう。まず、検討対象となる形
質ごとに適した遺伝モデルを選ぶ上での信頼性が制約となる。さらに、上述した
ように、連鎖解析を使用して得られる解像度には限りがあり、連鎖解析によって
最初に同定された2Mb〜20Mbの典型的な領域を追加研究でさらに正確に分析する
必要がある。また、パラメトリックな連鎖解析法は、同義遺伝子および/または
環境因子がさまざまに作用する遺伝形質などの複雑な遺伝形質に適用するのは困
難であることが分かっている。これらの因子をlodスコア解析で適切な状態にモ
デル化するのは極めて困難である。このような場合、Risch, N.およびMerikanga
s,K.によって最近発表された(1996)ように、こうした状況に連鎖解析を適用でき
るだけの数の羅患家系を集めるのに労力と費用がかかりすぎてしまう。
【０３７４】 (ノンパラメトリックな方法) いわゆるノンパラメトリックな連鎖解析方法の利点は、疾病の遺伝機序が詳細
に分かっている必要がないという点にあり、この方法は複雑な形質の解析で一層
有用なものとなることが多い。ノンパラメトリックな方法では、羅患した親族が
偶然とは思えないほどの高い確率で染色体領域の同一のコピーを継承することを
示し、この領域の遺伝パターンがランダムなメンデル分離とは一致しないことを
実証しようとしている。羅患した親族は、たとえ浸透度が不完全なポリジーン遺
伝であったとしても過剰な「アレル共有」を示すはずである。ノンパラメトリッ
クな連鎖解析では、同質的である(IBS)アレルの数または同祖的である(IBD)アレ
ルの数によって、2つの個体のマーカー座における一致度を測定することができ
る。羅患した兄弟姉妹ペアの解析は周知の特殊な事例であり、これらの方法の最
も単純な形である。
【０３７５】 本発明のバイアレリックマーカーは、パラメトリックな連鎖解析とノンパラメ
トリックな連鎖解析のいずれにも使用できる。好ましくは、複雑な形質に関与し
ている遺伝子のマッピングが可能なノンパラメトリックな方法にバイアレリック
マーカーを使用するとよい。本発明のバイアレリックマーカーをIBD法とIBS法の
両方に使用して、複雑な形質に影響している遺伝子をマッピングすることもでき
る。かかる解析では、バイアレリックマーカーの高い密度を有効に利用し、いく
つかの隣接するバイアレリックマーカー座をプールして複数のアレルマーカーで
達成される有効性を得ることができる(Zhao et al., 1998)。
【０３７６】 しかしながら、パラメトリックな連鎖解析法とノンパラメトリックな連鎖解析
法のいずれも羅患した親族を解析するため、薬剤応答性の遺伝的解析または治療
に対する副作用の解析においては、値に限度が生じることが多い。このタイプの
解析では家族性の症例を利用できないため、こうした事例で使用するのは非実現
的である。事実、同一の時期に同一の医薬品に曝露された2以上の個体を1家系か
ら得られる尤度は極端に低い。
【０３７７】 (個体群関連性解析) 本発明は、本発明のバイアレリックマーカーを用いて、検出可能な形質に関連
のある候補遺伝子集合の中から1つまたは複数の遺伝子を同定するための方法を
含む。一実施形態では、本発明は、バイアレリックマーカーアレルまたはバイア
レリックマーカーハプロタイプと形質との関連性を検出するための方法を含む。
さらに、本発明は、本発明のバイアレリックマーカーアレルとの連鎖不平衡をア
レルに引き起こす形質を同定するための方法を含む。
【０３７８】 上述したように、選択的な方法を利用して関連性解析すなわち、ゲノムレベル
での関連性解析、候補領域の関連性解析および候補遺伝子の関連性解析を行うこ
とができる。候補領域解析では、形質のバイオロジーに関する情報がいくらかで
も入手可能である場合に、特定の形質に関する遺伝子と遺伝子多型を明らかに手
っ取り早く得ることができる。さらに、ゲノムレベルでの関連性解析を行うため
に、本発明のバイアレリックマーカーをヒトゲノムの遺伝マーカーの適当な地図
に取り入れてもよい。米国仮特許出願第60/082,614号に、バイアレリックマーカ
ーの高密度地図を作製するための方法が記載されている。ゲノムの特異的候補領
域(特異的染色体または特異的染色体セグメントなど)を示す適当な地図に、本発
明のバイアレリックマーカーをさらに取り入れてもよい。
【０３７９】 上述したように、関連性解析は一般的な個体群の中で行うことができるもので
あり、羅患した家系での血縁個体についての研究に限られるわけではない。関連
性解析は、散発性の形質または多因子性の形質を解析できる極めて価値ある手法
である。さらに、関連性解析では、連鎖解析よりも数段精細に形質誘発アレルを
マッピングできる精細マッピングのための強力な方法が得られる。系図に基づく
研究は、形質誘発アレルの所在を狭めてしまうにすぎない。したがって、本発明
のバイアレリックマーカーを用いる関連性解析法を用いて、連鎖解析法によって
同定された候補領域における形質誘発アレルの所在を正確に判定できる。本発明
のバイアレリックマーカーを利用して、関与している遺伝子を同定することが可
能であり、このような用途は特に本発明および請求の範囲に企図されるものであ
る。
【０３８０】 1) バイアレリックマーカーアレルまたはバイアレリックマーカーハプロタイ
プの個体群での頻度の判定 本発明のもう1つの実施形態は、個体群においてバイアレリックマーカーの集
合についてハプロタイプの頻度を推定するための方法であって、a)少なくとも1
つの13q31-q33関連バイアレリックマーカーについて前記個体群に含まれる各個
体の遺伝子型を判定するステップと、b)ゲノム中に存在する前記第2のバイアレ
リックマーカーの両方のコピーについて前記第2のバイアレリックマーカーでの
ヌクレオチドの同一性を判定することによって、第2のバイアレリックマーカー
について前記個体群に含まれる各個体の遺伝子型を判定するステップと、c)ステ
ップa)およびb)において特定されたヌクレオチドの同一性にハプロタイプ決定法
を適用し、前記頻度の推定値を得るステップと、を含む方法を包含する。また、
本発明のハプロタイプの頻度の推定方法は、本願明細書で開示したいずれかの限
定事項のある方法あるいは単独または組み合わせでの方法を包含する。任意に、
前記ハプロタイプ決定法が、非対称PCR増幅、特定アレルの二重PCR増幅、クラー
ク法または期待値最大化アルゴリズムからなる群から選択されるものであっても
よい。任意に、前記第2のバイアレリックマーカーが、配列番号1〜26、36〜40お
よび54〜229およびそれらの相補体からなる群から選択される配列に含まれる13q
31-q33関連バイアレリックマーカーであってもよい。任意に、前記13q31-q33関
連バイアレリックマーカーが、表6bおよび表6cに示すバイアレリックマーカーか
ら個々にまたは組み合わせで選択されるものであってもよい。任意に、配列番号
1〜26、36〜40および54〜229の配列の各々に含まれるバイアレリックマーカーに
おけるヌクレオチドの同一性が、ステップa)およびb)において判定されるもので
あってもよい。
【０３８１】 (関連性解析は、座の間でのアレルのセットについて、頻度の関係を探索するも
のである) (個体群におけるアレル頻度の判定) 「バイアレリックマーカーでの個体の遺伝子型判定方法」という見出しの部分
で上述した方法のうちいずれか1つ、あるいは、このような目的に適した任意の
遺伝子型判定方法を用いて、個体群におけるバイアレリックマーカーのアレル頻
度を判断することができる。プールした試料または個々の試料について、個体群
のバイアレリックマーカーアレルの頻度を判定できる。必要な遺伝子型判定数を
減らす方法の1つに、標本プールを使用することがあげられる。標本プールを使
用する上で主な妨げとなるものに、プールを構築する際における正確なDNAレベ
ルを判定するための精度と再現性に関することがある。個々の標本を遺伝子型判
定すれば、感受性、再現性および精度が高くなるため、本発明における好ましい
方法でもある。好ましくは、各個体を個別に遺伝子型判定し、単純な遺伝子カウ
ントを適用して、特定の個体群でのバイアレリックマーカーのアレルまたは遺伝
子型の頻度を判定する。
【０３８２】 (個体群でのハプロタイプ頻度の判定) 2つ以上の座で複相個体がヘテロ接合する場合、ハプロタイプの配偶子相は分
からない。家系における系統学的な情報を用いて配偶子相を推論できることもあ
る(Perlin et al., 1994)。系統学的な情報が得られない場合は、別のストラテ
ジーを使ってもよい。1つの可能性として、多発性部位ヘテロ接合的な複相体を
解析から除外し、ホモ接合体と単一部位ヘテロ接合体の個体のみを保持するよう
にしてもよいが、この方法では、試料構成の偏りと低頻度ハプロタイプの過小評
価が生じる可能性がある。もう1つの可能性としては、非対称性PCR増幅(Newton
et al., 1989、Wu et al., 1989を参照のこと)または限界希釈によって1本の染
色体を単離し、次いでPCR増幅する(Ruano et al., 1990を参照のこと)などの方
法で、1本の染色体を独立に研究することができる。さらに、十分に近い関係の
バイアレリックマーカーを得るために、特異的アレルの二重PCRによって試料を
ハプロタイプ判定してもよい(Sarkar, G.およびSommer S.S., 1991)。これらの
方法は、技術的に複雑である、追加コストがかかる、大規模で一般化できない、
あるいは偏りが出る可能性があるなどの理由で、完全に満足のいくものというわ
けではない。こうした問題を解決するために、PCR増幅したDNA遺伝子型の相を推
論するClark A.G.(1990)が導入したアルゴリズムを使用してもよい。簡単に説明
すると、この原理では、曖昧さのない個体である完全ホモ接合体と単一部位ヘテ
ロ接合体を調べることで、標本中に存在するハプロタイプの予備リストを埋める
。次に、同一試料に含まれる他の個体で前に認識したハプロタイプが出現する可
能性をスクリーニングする。結果がポジティブであったものについては、すべて
の個体の相情報が解明されるか、あるいは未解明として定められるかのいずれか
になるまで、すでに認識されたハプロタイプのリストに相補ハプロタイプを追加
する。この方法では、二重ヘテロ接合性の個体各々に単一のハプロタイプを割り
当てるが、これらの個体に2つ以上のヘテロ接合部位がある場合には複数のハプ
ロタイプもあり得る。あるいは、ハプロタイプを各個体に割り当てずに個体群に
おいてハプロタイプ頻度を推定する方法を利用することもできる。好ましくは、
ハーディワインベルグ比を推測してハプロタイプ頻度の最大尤度推定値が得られ
る最尤推定(EM)アルゴリズム(Dempster J.R. et al., 1977)に基づく方法(無作
為交配)を使用する(Excoffier L.およびSlatkin M., 1995を参照のこと)。EMア
ルゴリズムは、データが曖昧であるおよび/または不完全である場合に有用な繰
り返し最尤推定法を汎用化したものである。EMアルゴリズムを用いてヘテロ接合
体をハプロタイプに分ける。ハプロタイプ推定については、「統計学的方法」と
いう見出しの部分でさらに説明する。個体群におけるハプロタイプの頻度の判断
または推定には、従来技術において周知の他のどのような方法を用いてもよい。
【０３８３】 2) 連鎖不平衡解析 連鎖不平衡は、2つ以上の座におけるアレルの非ランダムな関連性であり、疾
患の形質に関与する遺伝子をマッピングする上での強力なツールとなる(Ajioka
R.S. et al., 1997を参照のこと)。バイアレリックマーカーは、ヒトゲノム中で
密に配置され、他の遺伝マーカー(RFLPマーカーまたはVNTRマーカーなど)よりも
多くの数で遺伝子型判定可能であるため、連鎖不平衡に基づく遺伝的解析におい
ては特に有用なものである。本発明のバイアレリックマーカーは、従来技術にお
いて周知のどのような連鎖不平衡解析法にも利用できる。
【０３８４】 簡単に説明すると、病因変異を最初に個体群に導入する(新しく発生させた変
異または変異保因者からの移植による)際には、1本の染色体に含まれ、被結合マ
ーカーの単一の「背景」または「先祖代々の」ハプロタイプに所在するようにし
ておくことが必須である。結果として、これらのマーカーと病因変異との間には
完全な不平衡ができあがる。このとき、病因変異は特異的マーカーセットアレル
の存在下に限って認められる。以後の世代では、病因変異とマーカー多型との間
に組換えが起こり、不平衡は次第に消失する。この消失のペースは組換え頻度の
関数になるため、病因遺伝子から離れた位置にあるマーカーよりも病因遺伝子に
最も近い位置にあるマーカーの方で明らかに高い不平衡のレベルが認められるこ
とになる。組換えによって途切れてしまわない限り、「先祖代々の」ハプロタイ
プおよび異なる座にあるマーカーアレル間の連鎖不平衡を系図と個体群の両方か
ら追跡することができる。連鎖不平衡は通常、1つの座における特定のアレルと
他の座における別の特定のアレルとの間の関連性として現れてくる。
【０３８５】 病因座とマーカー座との間の不平衡を示すパターンまたは曲線には、病因座に
対応する部分に極大が認められると思われる。したがって、病因アレルとこれに
近い位置で結合された遺伝マーカーとの間の連鎖不平衡の量から、病因遺伝子の
位置に関する価値ある情報が得られる場合がある。病因座に関する精細マッピン
グでは、研究対象とした領域内のマーカー間に存在する連鎖不平衡のパターンに
ついて知ることが大切である。上述したように、連鎖不平衡の解析によって得ら
れるマッピング解像度は、連鎖解析によって得られる解像度よりもかなり高い。
連鎖不平衡解析と併用したバイアレリックマーカーの密度の高さから、精細マッ
ピング用の強力なツールが得られる。「統計的手法」という見出しの部分で、連
鎖不平衡を算出するための別の方法についても説明する。
【０３８６】 3) 個体群ベースの形質-マーカー関連性の症例対照解析 上述したように、特異的アレル対は同一染色体上の異なる座に偶然に発生する
わけではなく、偶然との違いが連鎖不平衡と呼ばれる。関連性解析は個体群頻度
に的をあてており、連鎖不平衡の現象に頼っている。特定の遺伝子における特異
的アレルが特定の形質Tの発生に直接的に関与している場合は、その頻度は羅患
（形質陽性）個体群の方が形質陰性個体群または無作為個体群よりも統計的に高
くなる。連鎖不平衡が存在する結果、形質誘発アレルを持つハプロタイプに存在
する他のすべてのアレルの頻度も、形質陰性個体やランダムな対照例よりも形質
陽性個体での方が高くなる。したがって、形質誘発アレルと連鎖不平衡状態にあ
る任意のアレル(特にバイアレリックマーカーアレル)と形質との間の関連性が分
かれば、そこから特定の領域に形質関連遺伝子が存在するかどうかを十分に推測
することができる。バイアレリックマーカーで症例対照個体群の遺伝子型を判定
し、狭い範囲に絞って形質誘発アレルの所在を特定することができる。形質に関
連した特定の1つのマーカーと連鎖不平衡状態にあるマーカーは、いずれも形質
に関連することになる。連鎖不平衡によって、考えられるあらゆる機能的多型を
スクリーニングする方法に代わる手段として症例対照個体群での限られた数の遺
伝的多型(特にバイアレリックマーカー)の相対頻度を解析し、形質誘発アレルを
見出すことが可能になる。関連性解析では、無相関症例対照個体群でのマーカー
アレルの頻度を比較し、複雑な形質を詳細に解析する強力なツールが得られる。
【０３８７】 症例対照個体群(組み入れ基準) 個体群ベースの関連性解析では、家系での継承とは無関係であるが、特定の遺
伝マーカーまたはマーカーの集合の有病率を症例対照個体群で比較する。これは
、血縁のない症例(未羅患または形質陽性)個体と血縁のない対照(未羅患または
形質陰性または無作為)個体とを比較することに基づく症例対照研究である。こ
の対照群は、未羅患個体または形質陰性個体で構成されると好ましい。また、対
照群は、種族的に症例個体群と一致すると好ましい。さらに、対照群は、研究対
象となる形質についての既知の主な混乱要因が症例個体群と一致する(たとえば
、年齢に依存する形質の場合は年齢が一致する)ものであると好ましい。理想的
には、2つの試料の個体を疾患の状態だけが異なると思われる形でペアにする。
以下において、「形質陽性個体群」、「症例個体群」および「羅患個体群」とい
う用語を同義のものとして使用する。
【０３８８】 関連性解析を用いた複雑な形質の詳細な解析において重要なステップは、症例
対照個体群の選択である(Lander and Schork, 1994を参照のこと)。症例対照個
体群の選択時の主なステップは、特定の形質または表現型を臨床的に定義するこ
とである。形質陽性表現型の群と形質陰性表現型の群に入れる個体を慎重に選択
すれば、本願明細書において提案する関連性による方法でどのような遺伝的形質
でも解析することができる。臨床表現型、発病年齢、家族歴および重症度の4つ
の基準を用いるとよいことが多い。連続的形質または定量的形質(たとえば血圧
など)の選択手順としては、解析対象の形質の表現型分布の両端で個体を選択し
、形質陽性個体群と形質陰性個体群に、表現型に重複のない個体が含まれるよう
にする。症例対照個体群は、表現型的にみて一様な個体群を含むと好ましい。形
質陽性個体群および形質陰性個体群は、各々が解析対象の個体群全体の1〜98%、
好ましくは1〜80%、より好ましくは1〜50%、さらに好ましくは1〜30%、最も好ま
しくは1〜20%であり、重複のない表現型を示す個体から選択される、表現型的に
みて一様な個体の個体群を含む。2つの形質表現型の違いが明確になればなるほ
ど、バイアレリックマーカーで関連性を検出できる確率が高くなる。劇的に異な
るが比較的均一な表現型を選択すると、研究対象となる個体群のサンプルサイズ
が十分に有意であるという前提で、関連性解析において効率的な比較を行うこと
ができ、遺伝レベルでの著しい差異を検出できる可能性もある。
【０３８９】 好ましい実施形態では、50〜300の形質陽性個体、好ましくは約100個体からな
る第1の群は、その表現型に基づいて募集される。これらの研究には、ほぼ同数
の形質陰性個体も取り入れる。
【０３９０】 本発明では、組み入れ基準の一般的な例に精神分裂病による羅患を含む。
【０３９１】 (関連性解析) 候補遺伝子を含む領域由来のバイアレリックマーカーを用いて関連性解析を行
うための汎用的なストラテジーは、個体を2つのグループ(症例対照個体群)に分
けてスキャンし、両方のグループに含まれる本発明のバイアレリックマーカーの
アレル頻度を計測して統計的に比較することである。
【０３９２】 解析したバイアレリックマーカーのうち少なくとも1つまたはそれ以上で形質
との間の統計的に有意な関連性が特定された場合、関連アレルが形質を誘発する
直接の原因である(すなわち、関連アレルが形質誘発アレルである)か、あるいは
関連アレルが形質誘発アレルとの間で連鎖不平衡状態にあるという仮説を立てる
ことができる。このうち、後者の方が可能性としては高い。通常、遺伝子の機能
に鑑みた関連アレルの特異的な特徴から、関連アレルと形質との関連性に関して
別の見通し(原因性または連鎖不平衡)が立つのが普通である。遺伝子内の関連ア
レルは形質誘発アレルではない可能性が最も高いが、実際の形質誘発アレルとの
間で連鎖不平衡状態にあるということが、何らかの証拠によって示された場合、
関連マーカー付近の配列決定によって、形質誘発アレルを見出すことができる可
能性がある。
【０３９３】 本発明のもう1つの実施形態は、a)本発明のハプロタイプ頻度推定方法に従っ
て、形質陽性個体群における少なくとも1種のハプロタイプの頻度を推定するス
テップと、b)本発明のハプロタイプ頻度推定方法に従って、対照個体群における
前記ハプロタイプの頻度を推定するステップと、c)前記ハプロタイプと前記表現
型との間に統計的に有意な関連性が存在するか否かを判定するステップと、を含
む、ハプロタイプと表現型との間の関連性の検出方法を包含する。また、本発明
のハプロタイプと表現型との間の関連性の検出方法は、本願明細書で開示したい
ずれかの限定事項のある方法あるいは単独または組み合わせでの方法を包含する
。任意に、前記13q31-q33関連バイアレリックマーカーが、配列番号1〜26、36〜
40および54〜229およびそれらの相補体からなる群から個々にまたは組み合わせ
で選択される配列に含まれるものであってもよい。任意に、前記13q31-q33関連
バイアレリックマーカーが、表6bまたは表6cに示すバイアレリックマーカーから
選択されるものであってもよい。任意に、前記対照個体群が形質陰性個体群また
は無作為個体群であってもよい。任意に、前記表現型が、精神分裂病に関与する
疾患、精神分裂病に作用する薬剤に対する応答または精神分裂病に作用する薬剤
に対する副作用であってもよい。
【０３９４】 (ハプロタイプ解析) 上述したように、突然変異または転移のいずれかによって病因アレルを持つ染
色体が最初に個体群に現れたとき、突然変異遺伝子は必ず、被結合マーカーのセ
ットを持つ染色体すなわち先祖のハプロタイプ上にある。このハプロタイプを複
数の個体群にわたって追跡し、特定の形質との統計的な関連性を解析することが
できる。個別に行う(アレルごとの)関連性解析を、ハプロタイプ解析とも呼ばれ
る多点関連性解析で補足することによって、関連性解析の統計的な効果が大きく
なる。このように、ハプロタイプ関連性解析によって、先祖のキャリアハプロタ
イプの頻度とタイプを定義することができる。ハプロタイプ解析は、個々のマー
カーでの解析の統計的な力を高めるという点で重要なものである。
【０３９５】 ハプロタイプ頻度解析の第1ステージでは、同定された本発明のバイアレリッ
クマーカーのさまざまな組み合わせに基づいて考え得るハプロタイプの頻度を判
定する。次に、このハプロタイプ頻度を形質陽性個体と対照個体の異なる個体群
と比較する。統計的に有意な結果を得るのにこの解析で使わなければならない形
質陽性個体の数は通常、30〜300の範囲であり、好ましい個体数は50〜150の範囲
である。同じことが解析に使う未羅患個体(または無作為対照個体)にもあてはま
る。最初の解析の結果から、症例対照個体群でのハプロタイプ頻度が得られ、評
価した各ハプロタイプ頻度について、オッズ比が算出される。統計的に有意な関
連性が見出されると、解析対象の形質で影響された特定のハプロタイプを有する
個体について、相対リスクを概算することができる。
【０３９６】 (相互作用解析) 本発明のバイアレリックマーカーを用いて、ポリジーンの相互作用によって生
じる検出可能な形質に関連のあるバイアレリックマーカーのパターンを特定する
ことができる。未結合座に位置するアレル間の遺伝的相互作用の解析を行うため
には、本願明細書に記載の手法を用いた個体の遺伝子型判定が必要となる。選択
したバイアレリックマーカーセットに関して適切な統計的有意性をもってなされ
るアレル相互作用解析はハプロタイプ解析とみなすことができる。相互解析は、
第1の座についての特定のハプロタイプを基準として症例対照個体群を層別化し
、各亜個体群で第2の座との間のハプロタイプ解析を実施することを含む。
【０３９７】 関連性解析に用いる統計的手法については本願明細書にてさらに説明する。
【０３９８】 4) 関連性が存在する中での連鎖の試験 本発明のバイアレリックマーカーをTDT(伝播不平衡テスト)にさらに使用して
もよい。連鎖および関連性を対象としたTDT法はいずれも個体群の層別化に影響
されることはない。TDTに必要なのは、羅患個体とその両親に関するデータか、
両親ではなく未羅患の兄弟姉妹から得たデータである(Spielmann S. et al., 19
93、Schaid D.J. et al., 1996、Spielmann S. and Ewens W.J., 1998を参照の
こと)。このような併用試験では一般に、別々に解析したときに発生するような
擬-正誤差を減らすことができる。
【０３９９】 (統計的手法) 一般に、形質および遺伝子型のいずれかを試験して統計的に有意な相関性を示
すための従来技術において周知の方法であれば、どのような方法でも利用できる
。
【０４００】 1) 連鎖解析での方法 一般に、形質および遺伝子型のいずれかを試験して統計的に有意な相関性を示
すための従来技術において周知の方法であれば、どのような方法でも利用できる
。
【０４０１】 2) 個体群でのハプロタイプ頻度の推定方法 上述したように、遺伝子型をスコアリングしても、ヘテロ接合体を区別できな
いことは珍しくないため、ハプロタイプ頻度の推論は決して容易ではない。配偶
子フェーズが分からない場合、多座の遺伝子型データからハプロタイプ頻度を推
定することができる。当業者間で周知の適当な方法を用いてハプロタイプ頻度を
推定することができる(Lange K., 1997、Weir, B.S., 1996を参照のこと)。期待
値最大化(EM)アルゴリズムを用いて、最尤ハプロタイプ頻度を算出すると好まし
い(Dempster et al., 1977、Excoffier L. and Slatkin M., 1995を参照のこと)
。この手順は、配偶子のフェーズが不明である場合に多座の遺伝子型データから
ハプロタイプ頻度の期待値最大化値を得ることを意図した繰り返しのプロセスで
ある。ハプロタイプ推定は通常、EM-HAPLOプログラム(Hawley M.E. et al., 199
4)またはArlequinプログラム(Schneider et al., 1997)などを使用して、EMアル
ゴリズムを応用することによって行われる。EMアルゴリズムは、繰り返し期待値
最大化法を汎用化した方法であるが、これを以下に簡単に説明する。
【０４０２】 本願明細書の以下の部分では、フェーズが不明な多座の遺伝子型を表現型とし
、フェーズが分かっている多座の遺伝子型を遺伝子型とする。血縁のない個体N
個からなる標本をK個のマーカーについてタイプ分けする。観察するデータはフ
ェーズが不明のK座表現型であり、これをF種類の表現型に分類できるものとする
。考えられる基礎ハプロタイプがH個あるとする(Kがバイアレリックマーカーの
場合、H=2K)。
【０４０３】 表現型jについて遺伝子型cjがあり得ると仮定する。よって、以下の式が得ら
れる。
【数１】 式中、Pjは表現型jの確率、hkおよびhlは遺伝子型iを構成する2つのハプロタ
イプである。ハーディワインベルグ平衡に基づいて、pr(hk,hl)は次のようにな
る。
【数２】 EMアルゴリズムの連続したステップは次のように説明できる。
【０４０４】 ハプロタイプ頻度のofの初期値(initial values of the of haplotypes frequ
encies)、P1 (0),P2 (0),......PH (0)から開始して、これらの初期値から遺伝子型
頻度を推定(推測ステップ)し、もう一組のハプロタイプ頻度(最大化ステップ)す
なわち、P1 (0),P2 (0),......PH (0)を推定する。ハプロタイプ頻度のセットの変
化が極めて小さくなるまで上記の2つのステップを繰り返す。
【０４０５】 停止基準は、2回の繰り返しでハプロタイプ頻度間に見られる差が最大でも10- 7 未満になった時点とすることができる。所望の推定精度でこれらの値を調節す
ることができる。詳細に説明すると、特定のs回目の繰り返しの時点で、推測ス
テップで以下の式から遺伝子型頻度を算出する。
【数３】
【０４０６】 この場合、表現型jに遺伝子型iが発生し、hkおよびhlが遺伝子型iを構成する
。それぞれの確率は、上記の式1および2から導き出される。
【０４０７】 次に、最大化ステップでは、特定の遺伝子型についてもう一組のハプロタイプ
頻度を推定するだけである。この方法は、遺伝子カウント法(Smith, 1957)とし
て周知である。
【数４】 式中、δitは遺伝子型iにおけるハプロタイプtの数を示す指標変数である。この
指標変数の値は、0、1または2である。
【０４０８】 最終的に得られる推定値が期待値最大化値になるようにするためには、出発値
がいくつか必要である。得られた推定値を比較し、推定値間に差がある場合は最
尤度につながる推定値の方を保持する。
【０４０９】 3) マーカー間の連鎖不平衡算出方法 さまざまな方法を用いて任意の2つの遺伝位置間の連鎖不平衡を算出すること
ができる。実用上、個体群から得たハプロタイプデータに統計的な関連性試験を
適用して連鎖不平衡を求める。マーカーMiにアレル(ai/bi)を有し、マーカーMj
にアレル(aj/bj)を有する本発明のバイアレリックマーカー(Mi, Mj)を少なくと
も1つ含む任意のバイアレリックマーカー対間の連鎖不平衡を、Piazzaの式によ
ってアレルの組み合わせ(ai, aj; ai, bj; bi, ajおよびbi, bj)それぞれについ
て算出することができる。 Δaiaj=ルートθ4-ルート(θ4+θ3)(θ4+θ2)、式中、 θ4= - - = Miにアレルaiがなく、Mjにアレルajがない遺伝子型の頻度、 θ3= - + = Miにアレルaiがなく、Mjにアレルajがある遺伝子型の頻度、 θ2= + - = Miにアレルaiがあり、Mjにアレルajがある遺伝子型の頻度、Weir(We
ir B.S.、1996)によって説明されているようなδ(複合連鎖不平衡係数)に対する
期待値最大化(MLE)法に基づいて、アレルの組み合わせ(ai, aj; ai, bj; bi, aj およびbi, bj)それぞれについてバイアレリックマーカー対(Mi, Mj)間の連鎖不
平衡(LD)を算出することもできる。複合連鎖不平衡に対するMLEは次のとおりで
ある。 Daiaj=(2n1 + n2 + n3 + n4/2)/N 2(pr(ai).pr(aj)) (式中、n1=Σ表現型(ai/ai, aj/aj)、n2=Σ表現型(ai/ai, aj/bj)、n3=Σ表現型
(ai/bi, aj/aj)、n4=Σ表現型(ai/bi, aj/bj)、Nは試料中の個体の数である。)
ハプロタイプデータがなく遺伝子型データしか利用できない場合でも、この式に
よってアレル間の連鎖不平衡を推定することができる。
【０４１０】 マーカー間の連鎖不平衡を算出するためのもう1つの手段は以下のとおりであ
る。ハーディワインベルグ平衡を満たす一対のバイアレリックマーカーマーカー
Mi(ai/bi)およびMj(aj/bj)について、上述した方法で特定の個体群から4つの可
能なハプロタイプ頻度を推定することができる。
【０４１１】 aiとajとの間の配偶子不平衡の推定は、単に、
【数５】 である。式中、pr(ai)はアレルaiの確率であり、pr(aj)はアレルajの確率である
。また、pr(haplotype(ai, aj))は、上記の式3において推定されるとおりである
。
【０４１２】 一対のバイアレリックマーカーでは、MiとMjとの間の関連性を説明するのに必
要な不平衡値は1つのみである。 次に、上記の値に対する正規化値を次のようにして算出する。 D'aiaj = Daiaj / max(-pr(ai).pr(aj),-pr(bi).pr(bj)) (Daiaj<0) D'aiaj = Daiaj / max(pr(bi).pr(aj), pr(ai).pr(bj)) (Daiaj>0) 本願の開示範囲を超える実験等を実施せずとも他のLD方法を使用可能なことは当
業者であれば容易に理解できよう。
【０４１３】 適当なヘテロ接合率を持つ一組のバイアレリックマーカーでの連鎖不平衡を求
めるには、50〜1000の血縁のない個体、好ましくは75〜200、より好ましくは100
前後の血縁のない個体を遺伝子型判定すればよい。
【０４１４】 4) 関連性試験 表現型と遺伝子型、ここではバイアレリックマーカーにおけるアレルまたはか
かるアレルを構成するハプロタイプでのアレルの相関の統計学的な有意性を判断
する方法を従来技術において周知の統計学的試験によって判断できるが、この場
合は統計学的な有意性の許容閾値が必要である。特定の方法および有意性閾値の
利用方法は当業者間で周知のものである。
【０４１５】 症例個体群と対照個体群とにおけるバイアレリックマーカーアレルの頻度を判
断し、これらの頻度を統計学的な試験結果と比較して関連性を試験し、研究対象
のバイアレリックマーカーアレルと形質との相関を表す頻度に何らかの統計学的
な有意差が認められるか否かを判断する。同様に、症例個体群と対照個体群にお
いて、特定のバイアレリックマーカー集合について考え得るあらゆるハプロタイ
プの頻度を推定してハプロタイプ解析を行い、これらの頻度を統計学的な試験結
果と比較して研究対象の表現型(形質)とハプロタイプとの間に統計学的に有意な
相関が認められるか否かを判断する。遺伝子型と表現型との間の統計学的に有意
な関連性を調べるための試験に有用な統計学的なツールを用いてもよい。好まし
くは、ここで用いる統計学的試験は自由度1のカイ二乗試験である。p値を算出す
る(p値は、観察された値以上の統計値が偶然に発生する確率を示す)。
【０４１６】 (統計学的有意性) 好ましい実施形態では、別の診断試験用の前向きなものとしてか、あるいは早
期の予防的治療用の予備的な起始点としての診断上の有意性、バイアレリックマ
ーカー関連性に関係のあるp値が、単発のバイアレリックマーカー解析では好ま
しくは約1×10-2以下、さらに好ましくは約1×10-4以下であり、複数のマーカー
を利用するハプロタイプ解析では、約1×10-3以下、さらに好ましくは1×10-6以
下、最も好ましくは約1×10-8以下である。これらの値は、マーカーが1つであろ
うと複数のマーカーを併用したものであろうと、どのような関連性解析にも応用
できるものと思われる。
【０４１７】 当業者であれば、上述した値の範囲を起始点として使用し、本発明のバイアレ
リックマーカーを用いた関連性解析を行うことができる。この場合、本発明のバ
イアレリックマーカーと精神分裂病に関与する疾患との間の有意な関連性を証明
し、診断や薬剤スクリーニングの目的で利用することができる。
【０４１８】 (表現型並べ替え検定) 上述した第1段階でのハプロタイプ解析の統計的有意性を確認するために、症
例対照個体から得た遺伝子型判定データをプールし、形質表現型に関して無作為
化して、さらに別の解析を行うとよい場合がある。個々の遺伝子型判定データを
2つのグループに無作為に割り当てる。このとき、各グループには第1段階で得ら
れたデータの蓄積に用いた症例対照個体群から同数ずつの個体が含まれるように
する。第2のステージでのハプロタイプ解析は、これらの人為的なグループ、好
ましくは第1段階での解析のハプロタイプに含まれていたマーカーのうち相対危
険度係数が最も高かったマーカーについて行うと好ましい。この実験を少なくと
も100〜10000回繰り返す。このように繰り返し行うことで、有意なp値レベルで
得られるハプロタイプの比率を求めることができる。
【０４１９】 (統計的関連性の評価) 偽陽性の問題に対処するために、同一の症例対照個体群について無作為に定め
たゲノム領域で同様の解析を行ってもよい。発明の名称「Methods, Software An
d Apparati For Identifying Genomic Regions Harboring A Gene Associated W
ith A Detectable Trait(検出可能な形質に関連のある遺伝子を持つゲノム領域
を同定するための方法、ソフトウェアおよび装置)」である米国仮特許出願に記
載されているようにして、無作為に定めた領域と候補領域で得られる結果を比較
する。
【０４２０】 5) 危険因子の評定 危険因子(遺伝疫学では、危険因子はマーカー座における特定のアレルまたは
ハプロタイプの有無である)と疾患との間の関連性は、オッズ比(OR)および相対
危険度(RR)によって測定される。P(R+)がRを持った個体で疾患が発症する可能性
、P(R-)が危険因子のない個体での確率である場合、相対危険度は2つの確率の比
にすぎない。すなわち、 RR= P(R+)/P(R-) 症例対照研究では、サンプリング設計であるために相対危険度の直接的な基準を
得ることができない。しかしながら、オッズ比から出現率の低い疾患の相対危険
度に良く近似した値を得ることができる。この値は次のように算出できる。
【数６】 （ここで、F+は症例で危険因子に曝露される頻度であり、F-は対照例で危険因
子に曝露される頻度である。F+および０-は、研究のアレル頻度またはハプロタ
イプ頻度を使用して算出され、基本となる遺伝モデル(優性、劣性、相加など)に
よって変わるものである。） 特定の危険因子の形質を示す個体群における個体の割合について説明する、寄与
危険度(AR)をさらに推定することができる。この測定は、疾患病因論および危険
因子の公衆衛生的な影響に関する特異的因子の役割の定量化する上で重要である
。この測定の公衆衛生との関係は、興味の対象となる曝露がなければ防止可能な
個体群における疾患症例の割合を推定することにある。ARは次のように定められ
る。 AR = PE(RR-1)/(PE(RR-1)+1) ARはバイアレリックマーカーアレルまたはバイアレリックマーカーハプロタイプ
に起因する危険である。PEは、研究の対象となる形質の個体群全体における出現
率が比較的低い場合、オッズ比で近似できる相対的危険度である。RRは、解析の
対象となる形質の個体群全体における出現率が比較的低い場合、オッズ比で近似
できる相対的危険度である。
【０４２１】 ARはバイアレリックマーカーアレルまたはバイアレリックマーカーハプロタイ
プに起因する危険である。PEは、研究の対象となる形質の個体群全体における出
現率が比較的低い場合、オッズ比で近似できる相対的危険度である。RRは、解析
の対象となる形質の個体群全体における出現率が比較的低い場合、オッズ比で近
似できる相対的危険度である。
【０４２２】 (本発明のバイアレリックマーカーと精神分裂病との関連性) 本発明の文脈において、領域Dバイアレリックマーカーを含む染色体13q31-q33
関連バイアレリックマーカーと精神分裂病および双極性障害との関連性を構築し
た。さまざまな個体群およびそのスクリーニング試料を用いて、染色体13q31-q3
3領域およびその領域Dに分布した異なるバイアレリックマーカー集合を利用して
、いくつかの関連性解析を実施した。これらの関連性解析およびその結果の詳細
については本願明細書の実施例5a乃至5eにて説明する。
【０４２３】 この情報は極めて価値のあるものである。精神分裂病に対する潜在的な遺伝的
素因について知っていれば、たとえこの素因が絶対的なものでなかったとしても
、極めて有意な形で精神分裂病を効率的に治療し、新たな治療薬および診断ツー
ルを開発しやすくなる。
【０４２４】 (本発明のバイアレリックマーカーと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマー
カーの同定) 第1のバイアレリックマーカーを興味の対象となるゲノムの領域で同定後、本
発明の教示内容を使用する当業者の医師であれば、この第1のマーカーと連鎖不
平衡状態にある別のバイアレリックマーカーを容易に同定することができる。上
述したように、形質に関連した第1のマーカーと連鎖不平衡状態にあるマーカー
はいずれも形質に関連することになる。したがって、特定のバイアレリックマー
カーと形質の間で関連性が実証された後は、この形質に関連した別のバイアレリ
ックマーカーを見出すことが、特にこの領域のバイアレリックマーカーの密度を
増加させるために非常に興味深いこととなる。形質との相関が最も高い1つのマ
ーカーまたは複数のマーカーのセット付近で原因遺伝子または突然変異が見出さ
れるであろう。
【０４２５】 特定のマーカーとの連鎖不平衡状態にある別のマーカーの同定には、(a)複数
の個体から得た第1のバイアレリックマーカーを有するゲノムフラグメントを増
幅するステップと、(b)前記第1のバイアレリックマーカーを持つゲノム領域で第
2のバイアレリックマーカーを同定するステップと、(c)前記第1のバイアレリッ
クマーカーと第2のバイアレリックマーカーとの間の連鎖不平衡解析を実施する
ステップと、(d)前記第2のバイアレリックマーカーを前記第1のマーカーと連鎖
不平衡状態にあるとして選択するステップと、を含む。ステップ(b)と(c)のサブ
コンビネーションも企図される。
【０４２６】 バイアレリックマーカーの同定および連鎖不平衡解析の指示方法については本
願明細書にて開示されており、本願の範囲を超える実験を行うことなく当業者ら
が実施可能なものである。したがって、本発明は、本発明の特定のバイアレリッ
クマーカーと連鎖不平衡状態にあり、特定の形質との関連性という点で同様の特
徴を呈すると思われるバイアレリックマーカーおよび他の多型にも関する。好ま
しい実施形態では、本発明は、特定のバイアレリックマーカーと連鎖不平衡状態
にあるバイアレリックマーカーに関する。
【０４２７】 (機能的変異の同定) 本発明のバイアレリックマーカーで陽性の関連性を確認した後、選択した数の
形質陽性個体と形質陰性個体の配列を比較することによって、関連した候補遺伝
子配列の変異をスキャニングすることができる。好ましい実施形態では、遺伝子
のエキソンおよびスプライス部位、プロモーターおよび他の調節領域などの機能
領域の変異をスキャニングする。好ましくは、形質と関連するであろうことが示
されるハプロタイプを有するものが形質陽性個体であり、形質と関連したハプロ
タイプまたはアレルを持たないものが形質陰性個体である。変異検出手順はバイ
アレリック部位の同定で用いたものと本質的には同じである。
【０４２８】 このような変異の検出に用いられる方法は通常、(a)形質陽性患者および形質
陰性対照例のDNA試料から得た形質に関連のあるバイアレリックマーカー1つまた
はバイアレリックマーカーのグループを含む候補DNA配列の領域を増幅するステ
ップと、(b)増幅した領域を配列決定するステップと、(c)形質陽性患者のDNA配
列と形質陰性対照例のDNA配列とを比較するステップと、(d)形質陽性患者に特異
な変異を判断するステップと、を含む。ステップ(b)と(c)のサブコンビネーショ
ンも企図される。
【０４２９】 次に、本願明細書に記載するものなどの適当な遺伝子型判定手順によって、好
ましくは個々の試験フォーマットについて述べる部分で後述するようなマイクロ
シークエンシング法を使用して、症例と対照の大きな個体群をスクリーニングす
ることによって候補多型を立証すると好ましい。多型は、それが症例および対照
において予想した関連性に匹敵する頻度で現れる場合に候補変異であるとみなさ
れる。
【０４３０】 本願明細書にて説明するいずれかの遺伝子型判定法を用いて羅患個体および未
羅患個体の一層大きな個体群をスクリーニングすることによって、精神分裂病に
対する素因に関与していると疑われるsbg1核酸配列の候補多型および変異を確認
することが可能である。好ましくは、マイクロシークエンシング法を利用する。
かかる多型は、検出可能な表現型との間に統計的に有意な相関が認められる場合
に候補の「形質誘発」変異であるとみなされる。
【０４３１】 (遺伝診断法での本発明のバイアレリックマーカー) 本発明のバイアレリックマーカーおよび他の多型を利用して、特異的な遺伝子
型の結果として検出可能な形質を発現する個体または遺伝子型がゆえに後に検出
可能な形質が発生する危険性のある個体を特定できる診断試験を開発することが
できる。本診断法を用いて解析する形質は、精神分裂病に対する素因、検出可能
な症状の発病年齢、精神分裂病治療に対する有益な応答またはこれに関連した副
作用を含む、どのような検出可能な形質であってもよい。かかる診断は、精神分
裂病の監視、予後判定および/または予防または治療を行う上で有用なものとな
り得る。
【０４３２】 本発明による診断手法では、被検者が検出可能な形質が発生する危険度増大に
関連のある遺伝子型を有するか否か、あるいは特定の突然変異の結果として個体
に検出可能な形質が認められるか否かを、ファミリ研究、単精子DNA解析または
体細胞ハイブリッドなど、ハプロタイピングについての個体染色体の解析が可能
な方法をはじめとして、さまざまな方法を利用して判断することができる。
【０４３３】 この診断法は、ヒト染色体13q31-q33領域内、任意に領域D小領域内および任意
にsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018核酸配列内に存在する特定アレルの
検出に関するものである。特に、本発明は、配列番号1〜26、36〜40および54〜2
29のヌクレオチド配列あるいは、多型塩基を含むそのフラグメントまたはその相
補配列の少なくとも1つを含む核酸の検出に関する。
【０４３４】 これらの方法では、個体から核酸試料を採取し、特定のヒト染色体13q31-q33
領域、領域D、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018関連多型または変異(形
質誘発アレル)を持っていることで形質発症の危険性があるか否か、あるいは個
体がその形質を発現していることを示すアレル少なくとも1つまたはバイアレリ
ックマーカーハプロタイプ少なくとも1つが核酸試料に含まれているか否かを判
断する必要がある。
【０４３５】 好ましくは、かかる診断法では、個体から核酸試料を入手し、「DNA試料のバ
イアレリックマーカーでの遺伝子型判定方法」にて上述した方法でこの試料の遺
伝子型を判定する。この診断は単一のバイアレリックマーカーに基づくものであ
ってもバイアレリックマーカーのグループに基づくものであってもよい。
【０４３６】 これらの方法ではそれぞれ、被検体から核酸試料を得た上で、本発明のバイア
レリックマーカー1種またはそれ以上のバイアレリックマーカーパターンを判定
する。
【０４３７】 一実施形態では、核酸試料についてPCR増幅を行い、検出可能な表現型に関連
のある多型が同定された領域を増幅する。増幅産物を配列決定し、検出可能な表
現型に関連したヒト染色体13q31-q33領域、領域D、sbg1、g34665、sbg2、g35017
またはg35018関連多型1種またはそれ以上を個体が有しているか否かを判定する
。増幅産物の生成に利用するプライマーは、表6aに列挙するプライマーを含むも
のであってもよい。あるいは、上述したようにして核酸試料のマイクロシークエ
ンシング反応を行い、ヒト染色体13q31-q33領域、領域D、sbg1、g34665、sbg2、
g35017またはg35018関連バイアレリックマーカーにおける変異または多型によっ
て生じる検出可能な表現型と関連したヒト染色体13q31-q33領域関連多型1種また
はそれ以上を個体が有しているか否かを判定する。マイクロシークエンシング反
応で利用するプライマーとしては、6dに列挙したプライマーがあげられる。もう
1つの実施形態では、検出可能な表現型に関連のあるヒト染色体13q31-q33領域、
領域D、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018関連アレル1種またはそれ以上
と特異的にハイブリダイズされる1種またはそれ以上のアレル特異的オリゴヌク
レオチドと核酸試料とを接触させる。ハイブリダイゼーションアッセイで使用す
るプローブは、表6cに列挙されるプローブを含むものであってもよい。もう1つ
の実施形態では、増幅反応時にアレル特異的オリゴヌクレオチドと併用する場合
、増幅産物産生能を持つ第2のオリゴヌクレオチドと核酸試料とを接触させる。
増幅反応時に増幅反応が存在するということは、その個体が検出可能な表現型に
関連のあるヒト染色体13q31-q33領域、領域D、sbg1、g34665、sbg2、g35017また
はg35018関連アレル1種またはそれ以上を有していることを示す。
【０４３８】 好ましい実施形態では、A1〜A69、A71〜A74、A76〜A94、A96〜A106、A108〜A1
12、A114〜A177、A179〜A197、A199〜A222、A224〜A246、A250、A251、A253、A2
55、A259、A266、A268〜A232、A328〜A360およびA361〜A489およびそれらの相補
体からなる群から選択される少なくとも1つのバイアレリックマーカーに存在す
るヌクレオチド同一性を判定し、検出可能な形質が精神分裂病である。診断用キ
ットは本発明のいずれかのポリヌクレオチドを含む。
【０４３９】 特定の環境では、この診断法を用いて予防治療を開始したり、有意なハプロタ
イプを持っている個体で、マイナーな症候群などの危険な症状を予測できるとい
う点で、この診断法は極めて価値のあるもなのである。
【０４４０】 薬物に対する応答または薬物に対する副作用を解析して予測する診断法を利用
して、個体を特定の薬物で治療すべきか否かを判断してもよい。たとえば、個体
が特定の薬物での治療にポジティブな応答を示す尤度が診断から明らかになれば
、その個体にかかる薬物を投与することができる。逆に、個体が特定の薬物での
治療にネガティブな応答を示す可能性が診断から明らかになれば、別の治療計画
を検討することができる。ネガティブな応答は、有効な応答が認められないか、
あるいは中毒性の副作用が見られる状況として定義できる。
【０４４１】 本発明のマーカーには、臨床薬治験という別の用途もある。精神分裂病に作用
する薬剤に対する応答または精神分裂病に作用する薬剤に対する副作用を示す1
種またはそれ以上のマーカーを、上述した方法によって同定することができる。
次に、かかる作用薬を用いた治験の被検者になりそうな個体をスクリーニングし
、薬剤に対して良好な応答を見せる可能性が最も高い個体を特定し、同時に副作
用が認められそうな個体を排除することができる。このようにして、ポジティブ
な応答が見られそうにない個体が試験に含まれることで測定精度を落とすことな
く、かつ、安全面で望ましくない問題を生じる危険性も伴わずに、薬剤に対して
ポジティブな応答をする個体でかかる薬剤による治療の有効性を測定すればよい
。
【０４４２】 (精神病性疾患の予防、診断および治療) 本発明の一態様は、精神病性疾患、特に精神分裂病および双極性障害を治療す
るための製剤に関する。本発明は、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018に
作用する薬物を企図するものである。
【０４４３】 好ましい実施形態において、本発明の薬物は、sbg1経路に作用することによっ
て直接または間接的にsbg1に作用する。たとえば、この薬物は、調節することが
でき、一層好ましくは細胞または特定の組織に生じるsbg1活性レベルを落とすか
、またはsbg1タンパク質の活性を増大または低下させることができる。いくつか
の実施形態では、本発明は、薬物の調製または製造時にsbg1発現またはsbg1タン
パク質活性を増大または低減できる化合物を使用することを含む。好ましくは、
前記化合物を、精神病性疾患の治療に利用(好ましくは精神分裂病または双極性
障害の治療に利用)する。好ましくは、前記化合物はsbg1またはsbg1受容体と結
合することによって直接作用するものである。
【０４４４】 このような薬物は、sbg1と類似の化合物、配列番号27〜35からなる群から選択
される配列に対する相同性が少なくとも25%であるアミノ酸配列を含む化合物、
配列番号27〜35からなる群から選択される配列に対する相同性が少なくとも50%
であるアミノ酸配列を含む化合物、配列番号27〜35からなる群から選択される配
列に対する相同性が少なくとも80%であるアミノ酸配列を含む化合物の活性を増
大または低減させる場合がある。
【０４４５】 個体においてこれらの化合物の活性を増大または低減させる薬物を利用して、
上記にて「徴候」セクションで説明したように、精神病性疾患に羅患した個体ま
たは精神病性疾患にかかりやすい個体における症状を軽減または妨害することが
できる。
【０４４６】 あるいは、遺伝子療法を用いて同定されたsbg1調節化合物をコードする遺伝子
を発現させることによって、sbg1活性を増大または低下させることができる。遺
伝子療法に適したベクターおよびプロモーターの例は上述したとおりである。sb
g1ペプチド、これに関連したsbg1受容体またはタンパク質ならびにそれらのタン
パク質のフラグメントと結合する抗体を調製することによって、sbg1活性を増大
または低下させることができる。かかる抗体は、sbg1とこれに関連したsbg1受容
体またはタンパク質との間の相互作用を調節することができる。抗体およびこれ
を得るための方法について本願明細書にてさらに説明する。
【０４４７】 上述したように、本発明は、精神病性疾患治療用の化合物を同定するための細
胞アッセイを提供するものである。このアッセイは、sbg1発現、sbg1タンパク質
活性の測定値を検出すること、あるいは、他の好適な精神分裂病、双極性障害ま
たは関連の精神病性疾患終末点を判定することに基づくものである。精神病性疾
患を治療するための化合物としては、野生型sbg1タンパク質の活性を阻害できる
誘導体タンパク質またはペプチドがあげられる。これは、野生型sbg1タンパク質
に対するその結合能を判定することによって同定できるものである。化合物には
、コンビナトリアルケミストリーベースの技法などの当業者間で周知のさまざま
な合成法を用いて得られる抗体および小分子および薬物も含む。
【０４４８】 本発明はさらに、本発明のタンパク質のg34665、sbg2、g35017またはg35018核
酸のうちいずれかを類似の方法にて用いて、疾患を予防、治療および診断するた
めの前記方法を包含する。
【０４４９】 (素因を診断または検出する方法におけるsbg1) 精神分裂病および双極性障害に羅患した個体または精神分裂病および双極性障
害にかかりやすい個体では、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018の発現レ
ベルが異常になる場合がある。sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018の血漿
や体液、体組織での活性レベルが増大または減少している個体は、精神分裂病、
双極性障害またはさまざまな潜在的に関連のある精神医学状態が発症する危険性
が高いことがある。本発明の一態様は、精神障害の診断と統計マニュアル第4版(
DSM-IV)の分類に従って定義される、精神分裂病、双極性障害または他の精神障
害、気分障害、自閉症、物質依存症またはアルコール中毒、精神遅滞または他の
精神病性疾患(認知障害、不安障害、摂食障害、衝動調節障害および人格障害を
含む)に羅患する危険性が個体にあるか否か、あるいは、現在羅患しているか否
かを判定するための方法であって、血漿や体液、体組織での個体のsbg1活性レベ
ルが異常であるか否かを判定することを含む方法である。血漿や体液、体組織に
おけるsbg1または類似の化合物の濃度については、さまざまな方法を利用して判
定することができる。特に、ELISA、ウェスタンブロットまたはタンパク質電気
泳動を用いて、この濃度を判定することができる。
【０４５０】 (遺伝診断法での本発明のバイアレリックマーカー) 本発明のバイアレリックマーカーおよび他の多型を利用して、特異的な遺伝子
型の結果として検出可能な形質を発現する個体または遺伝子型がゆえに後に検出
可能な形質が発生する危険性のある個体を特定できる診断試験を開発することが
できる。精神分裂病に対する素因または双極性障害、検出可能な症状の発病年齢
、精神分裂病または双極性障害の治療に対する有益な応答またはこれに関連した
副作用を含む検出可能な形質の診断に、本診断法を用いて解析される形質を利用
してもよい。かかる診断は、精神分裂病または双極性障害の監視、予後判定およ
び/または予防または治療を行う上で有用なものとなり得る。
【０４５１】 本発明による診断手法では、被検者が検出可能な形質が発生する危険度増大に
関連のある遺伝子型を有するか否か、あるいは特定の突然変異の結果として個体
に検出可能な形質が認められるか否かを、ファミリ研究、単精子DNA解析または
体細胞ハイブリッドなど、ハプロタイピングについての個体染色体の解析が可能
な方法をはじめとして、さまざまな方法を利用して判断することができる。
【０４５２】 この診断法は、ヒト染色体13q31-q33領域内、任意に領域D小領域内および任意
にsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018核酸配列内に存在する特定アレルの
検出に関するものである。特に、本発明は、配列番号1〜26、36〜40および54〜2
29のヌクレオチド配列あるいは、多型塩基を含むそのフラグメントまたはその相
補配列の少なくとも1つを含む核酸の検出に関する。
【０４５３】 これらの方法は、個体から核酸試料を採取し、特定のヒト染色体13q31-q33領
域関連多型または変異(形質誘発アレル)を持っていることで、形質発症の危険性
があるか否か、あるいは個体がその形質を発現していることを示すアレル少なく
とも1つのまたはバイアレリックマーカーハプロタイプ少なくとも1つが核酸試料
に含まれているか否かを判定する必要がある。
【０４５４】 好ましくは、かかる診断法では、個体から核酸試料を入手し、「DNA試料のバ
イアレリックマーカーでの遺伝子型判定方法」にて上述した方法でこの試料の遺
伝子型を判定する。この診断は単一のバイアレリックマーカーに基づくものであ
ってもバイアレリックマーカーのグループに基づくものであってもよい。
【０４５５】 これらの方法ではそれぞれ、被検体から核酸試料を得た上で、本発明のバイア
レリックマーカー1種またはそれ以上のバイアレリックマーカーパターンを判定
する。
【０４５６】 一実施形態では、核酸試料についてPCR増幅を行い、検出可能な表現型に関連
のある多型が同定された領域を増幅する。増幅産物を配列決定し、検出可能な表
現型に関連したヒト染色体13q31-q33領域、領域D、sbg1、g34665、sbg2、g35017
またはg35018関連多型1種またはそれ以上を個体が有しているか否かを判定する
。増幅産物の生成に利用するプライマーは、表6aに列挙するプライマーを含むも
のであってもよい。あるいは、上述したようにして核酸試料のマイクロシークエ
ンシング反応を行い、ヒト染色体13q31-q33領域における変異または多型によっ
て生じる検出可能な表現型と関連したヒト染色体13q31-q33領域、領域D、sbg1、
g34665、sbg2、g35017またはg35018関連多型1種またはそれ以上を個体が有して
いるか否かを判定する。マイクロシークエンシング反応で利用するプライマーと
しては、表6dに列挙したプライマーがあげられる。もう1つの実施形態では、検
出可能な表現型に関連のあるヒト染色体13q31-q33領域、領域D、sbg1、g34665、
sbg2、g35017またはg35018関連アレル1種またはそれ以上と特異的にハイブリダ
イズされる1種またはそれ以上のアレル特異的オリゴヌクレオチドと核酸試料と
を接触させる。ハイブリダイゼーションアッセイで使用するプローブは、6bに列
挙されるプローブを含むものであってもよい。もう1つの実施形態では、増幅反
応時にアレル特異的オリゴヌクレオチドと併用する場合、増幅産物産生能を持つ
第2のオリゴヌクレオチドと核酸試料とを接触させる。増幅反応時に増幅反応が
存在するということは、その個体が検出可能な表現型に関連のあるヒト染色体13
q31-q33領域、領域D、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018関連アレル1種
またはそれ以上を有していることを示す。好ましい実施形態では、検出可能な形
質が精神分裂病または双極性障害である。診断用キットは本発明のポリヌクレオ
チドのうちいずれかを含む。
【０４５７】 特定の環境では、この診断法を用いて予防治療を開始したり、有意なハプロタ
イプを持っている個体で、マイナーな症候群などの危険な症状を予測できるとい
う点で、この診断法は極めて価値のあるもなのである。
【０４５８】 薬物に対する応答または薬物に対する副作用を解析して予測する診断法を利用
して、個体を特定の薬物で治療すべきか否かを判断してもよい。たとえば、個体
が特定の薬物での治療にポジティブな応答を示す尤度が診断から明らかになれば
、その個体にかかる薬物を投与することができる。逆に、個体が特定の薬物での
治療にネガティブな応答を示す可能性が診断から明らかになれば、別の治療計画
を検討することができる。ネガティブな応答は、有効な応答が認められないか、
あるいは中毒性の副作用が見られる状況として定義できる。
【０４５９】 本発明のマーカーには、臨床薬治験という別の用途もある。精神分裂病に作用
する薬剤に対する応答または精神分裂病に作用する薬剤に対する副作用を示す1
種またはそれ以上のマーカーを、上述した方法によって同定することができる。
次に、かかる作用薬を用いた治験の被検者になりそうな個体をスクリーニングし
、薬剤に対して良好な応答を見せる可能性が最も高い個体を特定し、同時に副作
用が認められそうな個体を排除することができる。このようにして、ポジティブ
な応答が見られそうにない個体が試験に含まれることで測定精度を落とすことな
く、かつ、安全面で望ましくない問題を生じる危険性も伴わずに、薬剤に対して
ポジティブな応答をする個体でかかる薬剤による治療の有効性を測定すればよい
。
【０４６０】 (バイアレリックマーカーを用いての疾患の予防と治療) 主に自殺の危険性があるがゆえに、精神分裂病、双極性障害ならびに他の精神
病性疾患に対する個体の羅患性を検出することは非常に重要である。したがって
、本発明は、 精神分裂病または双極性障害と関連した、ヒト染色体13q31-q33領域のバイア
レリックマーカー1つまたはバイアレリックマーカーのグループのアレル、好ま
しくは領域Ｄ関連マーカーのアレル、一層好ましくは、sbg1、g34665、sbg2、g3
5017またはg35018関連マーカーのアレルがDNAに含まれる個体を選択するステッ
プと、 精神分裂病または双極性障害に関する症状の出現(および任意に発症)の点で前
記個体を経過観察するステップと、 精神分裂病または双極性障害に作用するか、あるいは、その症状に作用する治
療薬を、疾患の適切な病期にて前記個体に投与するステップと、を含む、精神分
裂病または双極性障害またはその関連障害を治療するための方法に関するもので
ある。
【０４６１】 本発明のもう1つの実施形態は、 精神分裂病または双極性障害と関連した、ヒト染色体13q31-q33領域のバイア
レリックマーカー1つまたはバイアレリックマーカーのグループのアレル、好ま
しくは領域Ｄ関連マーカーのアレル、一層好ましくは、sbg1、g34665、sbg2、g3
5017またはg35018関連マーカーのアレルがDNAに含まれる個体を選択するステッ
プと、 精神分裂病または双極性障害に関する症状の出現(および任意に発症)の点で前
記個体を経過観察するステップと、 精神分裂病または双極性障害の予防治療薬を前記個体に投与するステップと、
を含む、精神分裂病または双極性障害を治療するための方法を含む。
【０４６２】 さらに他の実施形態では、本発明は、 精神分裂病または双極性障害と関連した、ヒト染色体13q31-q33のバイアレリ
ックマーカー1つまたはバイアレリックマーカーのグループのアレル、好ましく
は領域Ｄ関連マーカーのアレル、一層好ましくは、sbg1、g34665、sbg2、g35017
またはg35018関連マーカーのアレルがDNAに含まれる個体を選択するステップと
、 精神分裂病または双極性障害の予防治療薬を前記個体に投与するステップと、 精神分裂病または双極性障害症状の前記個体での出現および発症の点で前記個
体を経過観察するステップと、任意に、 精神分裂病または双極性障害に作用するか、あるいは、その症状に作用する治
療薬を、疾患の適切な病期にて前記個体に投与するステップと、を含む、精神分
裂病または双極性障害またはその関連障害を治療するための方法に関するもので
ある。
【０４６３】 疾患に羅患した個体の治療過程を判断するために、本発明は、 精神分裂病または双極性障害あるいはその症状の危険性と関連した、ヒト染色
体13q31-q33領域のバイアレリックマーカー1つまたはバイアレリックマーカーの
グループのアレル、好ましくは領域Ｄ関連マーカーのアレル、好ましくは、sbg1
、g34665、sbg2、g35017またはg35018関連マーカーのアレルがDNAに含まれる、
精神分裂病または双極性障害に羅患した個体を選択するステップと、 精神分裂病または双極性障害に作用するか、あるいは、その症状に作用する治
療薬を前記個体に投与するステップと、を含む、精神分裂病または双極性障害を
治療するための方法にも関する。
【０４６４】 また、本発明は、個体の選択された個体群において精神分裂病または双極性障
害を治療するための方法に関する。この方法は、 精神分裂病または双極性障害あるいはその症状に作用する薬物を有効量で用い
ての治療に対するポジティブな応答と関連した、ヒト染色体13q31-q33領域の1つ
または複数のバイアレリックマーカーのアレル、好ましくは領域Ｄ関連マーカー
のアレル、一層好ましくは、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018関連マー
カーのアレルがDNAに含まれる および/または前記薬物を用いての治療に対するネガティブな応答と関連した
、ヒト染色体13q31-q33領域のバイアレリックマーカー1つまたはバイアレリック
マーカーのグループのアレル、好ましくは領域Ｄ関連マーカーのアレル、一層好
ましくは、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018関連マーカーのアレルがDN
Aに含まれていない、精神分裂病または双極性障害に羅患した個体を選択するス
テップと、 有効量の前記薬物を好適な間隔で前記選択された個体に投与するステップと、
を含む。
【０４６５】 本発明の文脈では、薬物に対する「ポジティブな応答」を、疾患に関連する症
状が緩和される状態と定義することができる。本発明の文脈では、薬物に対する
「ネガティブな応答」を、薬剤投与後の観察で薬剤に対するポジティブな応答に
欠ける状態、あるいは症状や副作用の軽減が認められない状態と定義することが
できる。
【０４６６】 本発明は、薬物を用いての治療に対して被検体がポジティブに応答する可能性
が高いか否かを判定する方法に関する。この方法は、前記薬物に対してポジティ
ブに応答する個体からなる第1の個体群と、前記薬物に対してネガティブに応答
する個体からなる第2の個体群と、を識別することを含む。前記薬物に対するポ
ジティブな応答に関連のある第1の個体群で1つまたはそれ以上のバイアレリック
マーカーを同定するか、あるいは前記薬物に対するネガティブな応答に関連のあ
る第2の個体群で1つまたはそれ以上のバイアレリックマーカーを同定する。バイ
アレリックマーカーの同定には、本願明細書にて説明する方法を利用してもよい
。
【０４６７】 続いて、解析対象の被検体からDNA試料を採取する。このDNA試料を解析し、そ
の薬物を用いての治療に対するポジティブな応答に関連のあるバイアレリックマ
ーカー1種またはそれ以上のアレルおよび/またはこの薬物での治療に対するネガ
ティブな応答に関連のあるバイアレリックマーカー1種またはそれ以上のアレル
が含まれているか否かを判断する。
【０４６８】 いくつかの実施形態では、薬物に対するポジティブな応答に関連のあるバイア
レリックマーカー1種またはそれ以上のアレルがDNA試料に含まれている場合およ
び/または薬物での治療に対するネガティブな応答に関連のあるバイアレリック
マーカーのアレル1つまたはそれ以上がDNA試料に含まれていない場合に、臨床試
験で被検者に薬物を投与することができる。好ましい実施形態では、薬物が精神
分裂病または双極性障害に作用する薬物である。
【０４６９】 本発明の方法を利用して、薬物に対して良好な応答を示す可能性のある個体か
らなる個体群について薬効の評価を行ってもよい。
【０４７０】 本発明のもう1つの態様は、被検体からDNA試料を採取し、薬物に対するポジテ
ィブな応答に関連したバイアレリックマーカー1種またはそれ以上のアレルがDNA
試料に含まれているか否かおよび/または薬物に対するネガティブな応答に関連
したバイアレリックマーカー1種またはそれ以上のアレルがDNA試料に含まれてい
るか否かを判定し、薬物に対するポジティブな応答に関連したバイアレリックマ
ーカー1種またはそれ以上のアレルがDNA試料に含まれている場合および/または
薬物に対するネガティブな応答に関連したバイアレリックマーカー1種またはそ
れ以上のアレルがDNA試料に含まれていない場合に、この薬物を被検体に投与す
ることを含む、薬物使用方法である。
【０４７１】 また、本発明は、薬物、好ましくは精神分裂病または双極性障害またはその症
状に作用する薬物の臨床試験方法にも関する。この方法は、 薬物、好ましくは精神分裂病または双極性障害またはその症状に作用すると思
われる薬物を個体の異種個体群に投与するステップと、 前記薬物に対してポジティブに応答する個体からなる第1の個体群と、前記薬
物に対してネガティブに応答する個体からなる第2の個体群と、を識別するステ
ップと、 前記第1の個体群において、前記薬物に対するポジティブな応答に関連のある
バイアレリックマーカーを同定するステップと、 前記薬物に対するポジティブな応答に関連のあるバイアレリックマーカーがDN
Aに含まれる個体を選択するステップと、 前記薬物を前記個体に投与するステップと、を含む。
【０４７２】 薬物を使用する方法、薬物の臨床試験を行う方法、薬物を用いての治療に被検
体がポジティブに応答する可能性が高いか否かを判定する方法をはじめとして、
精神分裂病および双極性障害を予防、診断および治療するための方法いずれにお
いても、前記バイアレリックマーカーは任意に、 (a) バイアレリックマーカーA1〜A489からなる群から選択されるバイアレリ
ックマーカー、 (b) バイアレリックマーカーA1〜A69、A71〜A74、A76〜A94、A96〜A106、A10
8〜A112、A114〜A177、A179〜A197、A199〜A222、A224〜A242、A250〜A251、A25
9、A269〜A270、A278、A285〜A295、A303〜A307、A330、A334〜A335およびA346
〜357からなる群から選択されるバイアレリックマーカー、 (c) バイアレリックマーカーA1〜A69、A71〜A74、A76〜A94、A96〜A106、A10
8〜A112、A114〜A177、A179〜A197、A199〜A222、A224〜A246、A250、A251、A25
3、A255、A259、A266、A268〜A232およびA328〜A489からなる群から選択される
バイアレリックマーカー、 (d) sbg1関連マーカーA85〜A219からなる群から選択されるバイアレリックマ
ーカーまたは一層好ましくはsbg1関連マーカーA85〜A94、A96〜A106、A108〜A11
2、A114〜A177、A179〜A197およびA199〜A219からなる群から選択されるバイア
レリックマーカー、 (e) g34665関連マーカーA230〜A236からなる群から選択されるバイアレリッ
クマーカー、 (f) sbg2関連マーカーA79〜A99からなる群から選択されるバイアレリックマ
ーカー、 (g) g35017関連バイアレリックマーカーA41、 (h) g35018関連マーカーA1〜A39からなる群から選択されるバイアレリックマ
ーカー、 (i) A239、A227、A198、A228、A223、A107、A218、A270、A75、A62、A65およ
びA70からなる群から選択されるバイアレリックマーカー、 (j) A48、A60、A61、A62、A65、A70、A75、A76、A80、A107、A108、A198、A2
18、A221、A223、A227、A228、A239、A285、A286、A287、A288、A290、A292、A2
93、A295,A299およびA304からなる群から選択されるバイアレリックマーカー、 (k) A304、A307、A305、A298、A292、A293、A291、A287、A286、A288、A289
、A290、99- A295 A299. A241、A239、A228、A227、A223、A221、A218、A198、A
178、99-24649/186 A108、A107、A80、A75、A70、A65およびA62からなる群から
選択されるバイアレリックマーカーおよび/または (l) A304、A307、A305、A298、A292、A293、A291、A287、A286、A288、A289
、A290、A295 A299、A241、A239、A228、A227、A223、A221、A218、A198、A178
、A108、A107、A80、A76、A75、A70、A65、A62、A61、A60 A48からなる群から選
択されるバイアレリックマーカー を含むものであってもよい。
【０４７３】 このような方法は、望ましくない副作用を引き起こす場合があるおよび/また
はこの薬剤が通常投与される患者個体群の一部に効果がない場合がある、薬剤の
投与に起因する効果/危険比を増加させるのに非常に有用であると考えられる。
【０４７４】 個体が精神分裂病または双極性障害に羅患していると診断された場合、選択試
験を実施し、治療に対するポジティブな応答、あるいは、副作用または無応答を
含んでもよい治療に対するネガティブな応答に関連したバイアレリックマーカー
1つまたはバイアレリックマーカーのグループのアレルが個体のDNAに含まれてい
るか否かを判断する。
【０４７５】 上述した検査方法によって本発明の方法を用いた治療の対象とする患者を選択
することができる。選択対象となる個体は、治療に対するネガティブな応答に関
連のあるバイアレリックマーカー1つまたはバイアレリックマーカーのグループ
のアレルがDNAに含まれていない個体であると好ましい。特定の薬物に対する無
応答または副作用についての個体の遺伝素因に関して知ることで、臨床医が精神
分裂病または双極性障害またはその症状に対する適切な医薬品に治療の方向を向
けることができる。
【０４７６】 患者の遺伝素因を判断したら、臨床医は、ネガティブな応答、特に副作用が全
く報告されていない、あるいは報告されてはいるがわずかである適当な治療法を
選ぶことができる。 本発明のバイアレリックマーカーは、精神分裂病および双極性障害との間で関
連性を示している。しかしながら、本発明はまた、関連疾患、特に関連のCND疾
患を防止、診断、管理および治療する方法において本発明のバイアレリックマー
カーを用いる、本願明細書にて説明する予防方法、診断方法、予後判定方法およ
び治療方法のいずれをも含むものである。一例として、関連障害には、精神障害
の診断と統計マニュアル第4版(DSM-IV)の分類に従って定義される、精神障害、
気分障害、自閉症、物質依存症およびアルコール中毒、精神遅滞および他の精神
病性疾患(認知障害、不安障害、摂食障害、衝動調節障害および人格障害を含む)
があげられる。
【０４７７】 (組換えベクター) 本願明細書では、二本鎖または一本鎖で、環状または線状であり、細胞宿主あ
るいは単細胞の宿主生物または多細胞の宿主生物に転写する対象として探査され
る興味の対象となるポリヌクレオチドを少なくとも1つ有するDNAまたはRNA分子
を示すのに「ベクター」という用語を用いる。
【０４７８】 本発明は、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018核酸配列由来のポリヌク
レオチドを有する組換えベクターのファミリを包含する。したがって、本発明は
さらに、 (a) 配列番号1のヌクレオチド位置215819〜215941、215819〜215975、216661
〜216952、216661〜217061、217027〜217061、229647〜229742、230408〜230721
、231272〜231412、231787〜231880、231870〜231879、234174〜234321、237406
〜237428、239719〜239807、239719〜239853、240528〜240569、240528〜240596
、240528〜240617、240528〜240644、240528〜240824、240528〜240994、240528
〜241685および240800〜240993のうちいずれかの核酸、配列番号2〜26および配
列番号54〜111の霊長類のsbg1 DNAおよびそれらの相補体に含まれるsbg1ゲノムD
NAまたはcDNA、 (b) 配列番号1のヌクレオチド位置292653〜292841、295555〜296047および29
5580〜296047のうちいずれかの核酸ならびにそれらの相補体に含まれるg34665ゲ
ノムDNAまたはcDNA、 (c) 配列番号1のヌクレオチド位置201188〜201234、214676〜214793、215702
〜215746および216836〜216915のうちいずれかの核酸ならびにそれらの相補体に
含まれるsbg2ゲノムDNAまたはcDNA、 (d) 配列番号1のヌクレオチド位置94124〜94964のうちいずれかの核酸ならび
にそれらの相補体に含まれるg35017ゲノムDNAまたはcDNA、 (e) 配列番号1のヌクレオチド位置1108〜1289、14877〜14920、18778〜18862
、25593〜25740、29388〜29502、29967〜30282、64666〜64812および65505〜658
53のうちいずれかの核酸ならびにそれらの相補体に含まれるg35018ゲノムDNAま
たはcDNA、 を含んでなる、組換えベクターを含む。
【０４７９】 一般に、本発明の組換えベクターは、上記にて定義したような任意のsbg1、g3
4665、sbg2、g35017またはg35018プライマーまたはプローブならびに本願明細書
にて説明するポリヌクレオチドのうちいずれを有するものであってもよい。
【０４８０】 第1の好ましい実施形態では、本発明の組換えベクターを使用して、本発明のs
bg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ゲノム配列またはcDNA由来で適当な細
胞宿主に挿入したポリヌクレオチドを増幅する。このポリヌクレオチドは、組換
えベクターが複製されるごとに増幅される。
【０４８１】 本発明による組換えベクターの第2の好ましい実施形態は、本発明の調節ポリ
ヌクレオチドまたはコード核酸のいずれか一方または両方を含む発現ベクターを
含むものである。特定の実施形態では、発現ベクターを用いてsbg1、g34665、sb
g2、g35017またはg35018ポリペプチドを発現させ、これを精製したり、たとえば
、リガンドスクリーニングアッセイで利用、あるいはsbg1、g34665、sbg2、g350
17またはg35018タンパク質に対する特異的な抗体を産生するための免疫原として
利用することができる。他の実施形態では、発現ベクターを用いてトランスジェ
ニック動物を作出したり、発現ベクターを遺伝子治療に利用したりする。発現を
起こさせるには、ベクターに適当なシグナルを与えてやる必要がある。前記シグ
ナルとしては、宿主細胞で興味の対象となる遺伝子の発現を促進するウイルスソ
ースおよび哺乳動物ソースの両方から得られるエンハンサー/プロモーターなど
のさまざまな調節要素があげられる。本発明の発現ベクターには一般に、産物を
発現する永久的で安定した細胞クローンを作出するための主要な薬剤選択マーカ
ーが含まれている。これらのベクターは、ポリペプチドの発現と薬剤選択マーカ
ーの発現とを結びつける要素だからである。
【０４８２】 特に、本発明は、それぞれのsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018調節ポ
リヌクレオチドの制御配列の制御下、あるいは、外因性制御配列の制御下で、sb
g1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質またはその変異体またはフラ
グメントをコードする核酸を含む発現ベクターに関するものである。
【０４８３】 また、本発明は、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018 cDNA配列の発現
に有用な組換え発現ベクターに関する。
【０４８４】 ヒト染色体13q31-33-関連バイアレリックマーカー、好ましくは領域Ｄ関連バ
イアレリックマーカー、あるいは、一層好ましくはsbg1関連バイアレリックマー
カー、g34665関連バイアレリックマーカー、sbg2関連バイアレリックマーカー、
g35017関連バイアレリックマーカーまたはg35018関連バイアレリックマーカーを
含む核酸を有する組換えベクターは、本発明の一部である。好ましい実施形態で
は、前記バイアレリックマーカーが、A1〜A489およびそれらの相補体からなる群
から選択されるものであってもよい。
【０４８５】 本発明のベクターで見つけることのできる要素のうちのいくつかについて、下
記のセクションで一層詳細に説明する。
【０４８６】 1. 本発明の発現ベクターの一般的な特徴 本発明による組換えベクターは、染色体性、非染色体性、半合成および合成DN
Aからなるものであってもよい、YAC(酵母人工染色体)、BAC(バクテリア人工染色
体)、ファージ、ファージミド、コスミド、プラスミドまたは線状DNA分子ですら
も含むが、これに限定されるものではない。かかる組換えベクターは、以下に示
すものの組み合わせを含む転写単位を有するものであってもよい。 (1) 遺伝子発現において調節的な役割を有する遺伝因子または要素、たとえ
ばプロモーターまたはエンハンサーなど。エンハンサーはDNAのシス調節要素で
あり、通常は長さ約10〜300bpでプロモーターに作用して転写量を増す。 (2) mRNAに転写され、最終的にはポリペプチドに翻訳される構造配列または
コード配列。前記構造配列またはコード配列は、(1)で述べた調節要素と作用的
に結合している。 (3) 適当な転写開始配列および転写終結配列。酵母または真核生物の発現系
で使用することを意図した構造単位は、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外
分泌を可能にするリーダー配列を含むものであると好ましい。あるいは、リーダ
ー配列または輸送配列のない状態で組換えタンパク質を発現させる場合、Ｎ末端
残基を含むものであってもよい。この残基を後に組換えタンパク質から切断し、
あるいは切断せずに、最終産物を得るようにしてもよい。
【０４８７】 一般に、組換え発現ベクターには、複製開始点、宿主細胞の形質転換を可能に
する選択可能なマーカー、下流の構造配列の転写を指図するための高度に発現さ
れた遺伝子に由来するプロモーターが含まれる。翻訳開始配列および翻訳終結配
列、好ましくは翻訳されたタンパク質の分泌を指示できるリーダー配列と共に、
適当な相で異種構造配列を細胞周辺腔あるいは細胞外培地にアセンブルする。所
望の配列を哺乳動物の宿主細胞で形質転換および発現するようにベクターを調節
した特定の実施形態では、好ましいベクターに、所望の宿主での複製開始点、好
適なプロモーターおよびエンハンサー、さらには必要なリボソーム結合部位、ポ
リアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、
5'フランキング非転写配列が含まれることになる。SV40起源などSV40ウイルスゲ
ノム由来のDNA配列、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位および
ポリアデニル化部位を用いて所望の非転写遺伝因子を得るようにしてもよい。
【０４８８】 宿主生物における在来遺伝子の発現あるいは生物学的に不活性なsbg1、g34665
、sbg2、g35017またはg35018タンパク質の産生に関係のある遺伝的な欠点を補正
する上で、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリペプチドまたはそのフ
ラグメントまたはその変異体をin vivoで発現させると有益なことがある。
【０４８９】 したがって、本発明はさらに、主に、治療対象となる患者の体内に適切な遺伝
物質を導入することによって、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリペ
プチドをin vivoで産生するために設計された組換え発現ベクターも含む。好ま
しい実施形態では、前記遺伝物質が、 (a) 配列番号1のヌクレオチド位置215819〜215941、215819〜215975、216661
〜216952、216661〜217061、217027〜217061、229647〜229742、230408〜230721
、231272〜231412、231787〜231880、231870〜231879、234174〜234321、237406
〜237428、239719〜239807、239719〜239853、240528〜240569、240528〜240596
、240528〜240617、240528〜240644、240528〜240824、240528〜240994、240528
〜241685および240800〜240993のうちいずれかの核酸、配列番号2〜26および配
列番号54〜111の霊長類のsbg1 DNAおよびそれらの相補体に含まれるsbg1ゲノムD
NAまたはcDNA、 (b) 配列番号1のヌクレオチド位置292653〜292841、295555〜296047および29
5580〜296047のうちいずれかの核酸ならびにそれらの相補体に含まれるg34665ゲ
ノムDNAまたはcDNA、 (c) 配列番号1のヌクレオチド位置201188〜201234、214676〜214793、215702
〜215746および216836〜216915のうちいずれかの核酸ならびにそれらの相補体に
含まれるsbg2ゲノムDNAまたはcDNA、 (d) 配列番号1のヌクレオチド位置94124〜94964のうちいずれかの核酸ならび
にそれらの相補体に含まれるg35017ゲノムDNAまたはcDNAおよび (e) 配列番号1のヌクレオチド位置1108〜1289、14877〜14920、18778〜18862
、25593〜25740、29388〜29502、29967〜30282、64666〜64812および65505〜658
53のうちいずれかの核酸ならびにそれらの相補体に含まれるg35018ゲノムDNAま
たはcDNA、 からなるヌクレオチド位置範囲からなる群から選択されるヌクレオチド配列少な
くとも1つを含む。
【０４９０】 この遺伝物質をあらかじめ生物から抽出した抽出した細胞にin vitroで導入し
、続いて修飾された細胞を前記生物で適当な組織にin vivoにて直接再導入して
もよい。
【０４９１】 2. 調節要素 (プロモーター) 異種遺伝子が発現される細胞宿主を考慮して、本発明による発現ベクターで使
用する好適なプロモーター領域を選択する。興味の対象となる核酸配列の発現制
御用のプロモーターが標的細胞で核酸の発現を指示できるのであれば、どのプロ
モーターを使うかは重要ではない。したがって、ヒトの細胞が標的である場合は
、ヒトまたはウイルスのプロモーターなどのヒトの細胞で発現可能なプロモータ
ーに隣接し、このプロモーターの制御下にある核酸コード領域の位置決めをする
と好ましい。
【０４９２】 適切なプロモーターは、発現を制御する対象となる核酸や発現対象となるコー
ド配列を含む在来ポリヌクレオチドに内在し得る核酸とは異種のものであっても
よい。また、プロモーターは一般に、コンストラクトプロモーター/コード配列
が挿入された組換えベクター配列とは異種のものである。
【０４９３】 たとえばCAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクター、さらに好
ましくはpKK232-8およびpCM7ベクターなどを使用して、所望の遺伝子から任意に
プロモーター領域を選択することができる。
【０４９４】 好ましいバクテリアプロモーターは、LacI、LacZ、T3またはT7バクテリオファ
ージRNAポリメラーゼプロモーター、gpt、λPR、PLおよびtrpプロモーター(EP 0
036776)、ポリヘドリンプロモーター、あるいはバキュロウイルス由来のp10タン
パク質プロモーター(Kit Novagen)(Smith et al., 1983、O'Reilly et al., 199
2)、λPRプロモーターまたはtrcプロモーターである。
【０４９５】 真核生物のプロモーターとしては、CMV前初期プロモーター、HSVチミジンキナ
ーゼ、初期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、マウスメタロチオ
ネイン-Lがあげられる。好都合なベクターおよびプロモーターの選択方法につい
ては当業者の知識の範囲内である。
【０４９６】 プロモーターの選択についても遺伝子工学分野の当業者であればなし得ること
である。たとえば、Sambrook et al.(1989)の本やFuller et al.(1996)によって
説明されている手順を参照すればよい。
【０４９７】 (他の調節要素) 遺伝子転写物を適宜ポリアデニル化するにはポリアデニル化シグナルを入れる
必要が生じるのが普通である。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明を正し
く実施する上で重要なことではないと思われる。また、かかる配列のうちヒト成
長ホルモンおよびSV40ポリアデニル化シグナルなどの任意のものを利用できる。
さらに、ターミネーターも発現カセットの要素として考えられる。これらの要素
は、メッセージレベルを高め、カセットから他の配列へのリードスルーを最小限
にするよう機能するものである。
【０４９８】 このベクターは、上述したような適切なDNA配列を含み、一層好ましくはsbg1
遺伝子調節ポリヌクレオチドすなわち、 (a) 配列番号1のヌクレオチド位置215819〜215941、215819〜215975、216661
〜216952、216661〜217061、217027〜217061、229647〜229742、230408〜230721
、231272〜231412、231787〜231880、231870〜231879、234174〜234321、237406
〜237428、239719〜239807、239719〜239853、240528〜240569、240528〜240596
、240528〜240617、240528〜240644、240528〜240824、240528〜240994、240528
〜241685および240800〜240993のうちいずれかの核酸、配列番号2〜26および霊
長類のsbg1 DNAまたは配列番号54〜111およびそれらの相補体に含まれるsbg1ゲ
ノムDNAまたはcDNA、 (b) 配列番号1のヌクレオチド位置292653〜292841、295555〜296047および29
5580〜296047のうちいずれかの核酸ならびにそれらの相補体に含まれるg34665ゲ
ノムDNAまたはcDNA、 (c) 配列番号1のヌクレオチド位置201188〜201234、214676〜214793、215702
〜215746および216836〜216915のうちいずれかの核酸ならびにそれらの相補体に
含まれるsbg2ゲノムDNAまたはcDNA、 (d) 配列番号1のヌクレオチド位置94124〜94964のうちいずれかの核酸ならび
にそれらの相補体に含まれるg35017ゲノムDNAまたはcDNA、 (e) 配列番号1のヌクレオチド位置1108〜1289、14877〜14920、18778〜18862
、25593〜25740、29388〜29502、29967〜30282、64666〜64812および65505〜658
53のうちいずれかの核酸ならびにそれらの相補体に含まれるg35018ゲノムDNAま
たはcDNA、 からなるヌクレオチド配列範囲の群から選択されるヌクレオチド配列少なくとも
1つを含む、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを含む。
【０４９９】 3. 選択可能なマーカー このようなマーカーは、発現コンストラクトを含む細胞の容易な同定を可能に
する細胞を同定可能な状態で変化させるものである。形質転換した宿主細胞の選
択用の選択可能なマーカー遺伝子は、真核生物の細胞培養物ではジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ耐性またはネオマイシン耐性であり、S.cerevisiaeまたはテトラサイ
クリンにはTRP1、E.coliではリファンピシン耐性またはアンピシリン耐性、放線
菌ではレバンサッカラーゼであると好ましい。後者のマーカーはネガティブ選択
マーカーである。
【０５００】 4. 好ましいベクター (バクテリアベクター) 代表的ではあるが限定するものではない一例として、バクテリアで使用するの
に有用な発現ベクターには、遺伝因子pBR322(ATCC 37017)を有する業務販売され
ているプラスミドに由来する複製物のバクテリア起源および選択可能なマーカー
があげられる。かかる業務用ベクターとしては、たとえば、pKK223-3(スウェー
デンUppsalaのファルマシア社)GEM1(米国ウィスコンシン州Madisonのプロメガバ
イオテク社)があげられる。
【０５０１】 当業者間では好適なベクターが他にも多数知られており、業務販売されている
が、これには次にあげるバクテリアベクターなどがある。pQE70、pQE60、pQE-9(
キアゲン)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A
、pNH16A、pNH18A、pNH46A(ストラタジーン)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、p
DR540、pRIT5(ファルマシア)；pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(ストラタジ
ーン)；pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(ファルマシア)；pQE-30(QIAエクスプレス)。
【０５０２】 (バクテリオファージベクター) P1バクテリオファージベクターには、約80〜約100kbの範囲の大きな挿入物が
含まれていることがある。
【０５０３】 p158またはp158/neo8などのP1バクテリオファージベクターの作出については
、Sternberg(1992, 1994)に非常によく説明されている。40kbを上回る大きなポ
リヌクレオチドを挿入するために、sbg1ポリヌクレオチド配列を含む組換えP1ク
ローンを設計することができる(Linton et al., 1993)。遺伝子組換え実験用のP
1 DNA作出用としては、McCormick et al.,(1994)に記載されているプロトコルが
好ましいプロトコルである。簡単に説明すると、P1プラスミドを有するE.coli(
好ましくは菌株NS3529)をカナマイシン25μg/ml含有の適当なブイヨン培地で終
夜増殖する。Qiagen Plasmid Maxikit(キアゲン社、米国カリフォルニア州Chats
worth)を使用して、メーカーの取扱説明書に従ってアルカリ法でE.coliからP1 D
NAを調製する。キットに含まれている洗浄溶出緩衝液を用いて、Qiagen-tip 500
の2本のカラムで溶菌液からP1 DNAを精製する。次に、フェノール/クロロホルム
抽出を行い、さらに70%エタノールでDNAを沈降させる。TE(トリス-HCl 10mM、pH
7.4、EDTA 1mM)にてDNAを可溶化した後、DNA濃度を分光光度法によって評価す
る。
【０５０４】 トランスジェニック動物(一般にはトランスジェニックマウス)でsbg1ポリヌク
レオチド配列を含むP1クローンを発現させることが最終目的である場合、P1ポリ
リンカー内の稀切断部位(rare-cutting site)(SfiI、NotIまたはSalI)でP1 DNA
を切断するなどの方法で、P1 DNAフラグメントからベクター配列を除去すると望
ましい。DNAを単離する目的ではじめて報告された(Schedl et al., 1993a、Pete
rson et al.,1993)方法と同様の方法を用いて、パルスフィールドアガロースゲ
ルでP1挿入物をベクター配列から精製する。この段階で、必要であればMillipor
e Ultrafree-MC Filter Unit(ミリポア社、米国マサチューセッツ州Bedford、限
界分子量30,000)にて上記のようにして得られた精製挿入物DNAを濃縮し、NaCl 1
00mM、スペルミン30μM、スペルミジン70μMを含有するマイクロインジェクショ
ン緩衝液(トリス-HCl 10mM、pH7.4、EDTA 250μM)に対して、マイクロダイアリ
シス(microdyalisis)膜(VS型、0.025μM、ミリポア社)で透析することができる
。1%アガロース(Sea Kem GTG; FMC Bio-products)パルスフィールドゲルでの泳
動と臭化エチジウム染色によって精製P1 DNA挿入物の完全さを評価した。
【０５０５】 (バキュロウイルスベクター) 配列番号1のポリヌクレオチドでコードされるsbg1ポリペプチドまたはそのフ
ラグメントまたはその変異体の発現に適したベクターが、昆虫細胞および昆虫株
化細胞系で増殖可能なバキュロウイルスベクターである。特定の適した宿主ベク
ター系に、Spodoptera frugiperda由来のSF9株化細胞(ATCC No. CRL 1711)をト
ランスフェクトするのに用いられるpVL1392/1393バキュロウイルス伝達ベクター
(Pharmingen)がある。
【０５０６】 配列番号1によってコードされるsbg1ポリペプチドまたはそのフラグメントま
たは変異体のバキュロウイルス発現系での発現に適した他のベクターとしては、
Chai et al.(1993)、Vlasak et al.(1983)およびLenhard et al.(1996)によって
説明されているものがあげられる。
【０５０７】 (ウイルスベクター) 特定の一実施形態では、アデノウイルスからベクターを得る。本発明による好
ましいアデノウイルスベクターは、FeldmanおよびSteg(1996)またはOhno et al.
(1994)によって説明されているものである。本発明の特定の実施形態による別の
好ましい組換えアデノウイルスに、ヒトアデノウイルス2型または5型(Ad 2また
はAd 5)または動物起源のアデノウイルスがある(フランス特許出願第FR-93.0595
4号)。
【０５０８】 レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターも一般に、外因性
ポリヌクレオチドを特にヒトを含む哺乳動物にin vivoで伝達する上で利用でき
る組換え遺伝子移入系であるとされている。これらのベクターによって、遺伝子
を効率よく細胞に移入し、伝達された核酸を宿主の染色体DNAに安定して取り込
むことができる。
【０５０９】 本発明のレトロウイルスによるin vitroまたはin vitroでの遺伝子移入ビーク
ルの調製または構築用として特に好ましいレトロウイルスとしては、Mink-Cell
Focus Inducingウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルスおよびラウ
ス肉腫ウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスがあげられる。特に好
ましいマウス白血病ウイルスとしては、4070Aウイルスおよび1504Aウイルス、Ab
elson(ATCC No VR-999)、Friend(ATCC No VR-245)、Gross(ATCC No VR-590)、Ra
uscher(ATCC No VR-998)およびMoloneyマウス白血病ウイルス(ATCC No VR-190、
国際特許出願公開第WO94/24298号)があげられる。特に好ましいRous Sarcoma Vi
ruses include Bryan high titer(ATCC Nos VR-334、VR-657、VR-726、VR-659お
よびVR-728)。他の好ましいレトロウイルスベクターに、Roth et al.(1996)、国
際特許出願公開第WO93/25234号、同第WO94/06920号、Roux et al., 1989、Julan
et al., 1992およびNeda et al., 1991に記載されているものがある。
【０５１０】 本発明で考慮しているさらに他のウイルスベクター系にアデノ随伴ウイルス(A
AV)がある。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製および生産的なライフサイク
ルを得るためのヘルパーウイルスとして、アデノウイルスまたはヘルペスウイル
スなどの別のウイルスを必要とする天然由来の欠損性ウイルスである。(Muzyczk
a et al., 1992)。また、これは自己のDNAを非分割細胞に組み込み、安定した組
み込みの頻度を高くすることのできる限られたウイルスのうちの1つである。(Fl
otte et al., 1992、Samulski et al., 1989、McLaughlin et al., 1989)。AAV
の持つ有利な特徴の1つは、形質転換細胞に対する一次細胞の形質導入効率が落
ちることで得られるものである。
【０５１１】 (BACベクター) 大きなゲノムDNAフラグメント(100〜300kb)をE.coliに安定して維持するため
に、バクテリア人工染色体(BAC)クローニング系(Shizuya et al., 1992)を開発
した。好ましいBACベクターは、Kim et al.(1996)に記載されているpBeloBAC11
ベクターを含むものである。ベクターのBam HI部位またはHind III部位への連結
を可能にする酵素で部分消化済のサイズ選択ゲノムDNAを用いて、上記のベクタ
ーでBACライブラリを作製する。これらのクローニング部位をフランキングする
のは、RNA転写またはPCR法による末端プローブの作出に使用可能なT7およびSP6
RNAポリメラーゼ転写開始部位である。E.coliでのBACライブラリの作製後、宿主
細胞から超らせん円(circle)としてBAC DNAを精製する。サイズ判定とBACのレシ
ピエント細胞への導入前に、これらの円形分子を線状にする。2つのNot I部位に
よってクローニング部位をフランキングし、クローニングしたセグメントをNot
Iでの消化によってベクターから切除できるようにする。あるいは、独特のcosN
部位で切断を行う市販の酵素λ-Terminaseを用いるBACベクター処理によって、p
BeloBAC11ベクターに含まれるDNA挿入物を直線化してもよいが、この切断法を用
いて得られるのは挿入物DNAとBAC配列の両方を含む完全長BACクローンである。
【０５１２】 5. 組換えベクターの移入 本発明のポリヌクレオチドコンストラクトおよびポリヌクレオチドコンストラ
クトを発現させるためには、これらのコンストラクトを細胞に移入しなければな
らない。この移入は、実験室での株化細胞の形質転換手順などでin vitroにて実
施してもよいし、あるいは特定の疾患状態の治療などでin vivoまたはex vivoで
実施してもよい。
【０５１３】 1つの機序が、発現コンストラクトを感染性のウイルス粒子に包埋するウイル
ス感染である。
【０５１４】 本発明では、ポリヌクレオチドを哺乳動物の培養細胞に伝達するための非ウイ
ルス的な方法もいくつか考慮している。これらの方法としては、リン酸カルシウ
ム沈澱反応(Graham et al., 1973、Chen et al., 1987)、DEAE-デキストラン(Go
pal、1985)、電気穿孔(Tur-Kaspa et al., 1986、Potter et al., 1984)、指向
性マイクロインジェクション(Harland et al., 1985)、DNA担持リポソーム(Nico
lau et al., 1982、Fraley et al., 1979)、受容体媒介トランスフェクション(W
u and Wu, 1987、1988)があげられるが、これに限定されるものではない。これ
らの手法の中には、in vivoまたはex vivoでの用途にうまく適合させられるもの
もある。
【０５１５】 発現ポリヌクレオチドを細胞に移入した後、これをレシピエント細胞のゲノム
に安定して組み入れることができる。この組み入れは、相同的組換え(遺伝子交
換)によって同族位置および配向で行ってもよいし、あるいは無作為に非特異的
な位置に統合(遺伝子増強)してもよい。さらに別の実施形態では、DNA別個のエ
ピゾーム型セグメントとして核酸を細胞で安定して維持することができる。この
ような核酸セグメントすなわち「エピゾーム」は、宿主細胞のサイクルとは独立
した、あるいはこれと同期した維持と複製ができる程度に配列をコードする。
【０５１６】 タンパク質またはペプチドをin vivoにて脊椎動物の細胞に移入する方法につ
いての特定の一実施形態は、興味の対象となるポリペプチドを作用的にコードす
る、生理学的に許容可能なキャリアと未変性ポリヌクレオチドとを有する調製物
を細胞を有する組織の間質空間に導入し、これによって未変性ポリヌクレオチド
を細胞の内部に取り込んで生理学的な効果を持たせるステップを含む。これは特
にin vitroでの伝達に適用可能であるが、in vivoでも同様に適用できる。
【０５１７】 「未変性」ポリヌクレオチドを含む、in vitroおよびin vivoで使用される組
成物については、国際特許出願公開第WO90/11092号(Vical Inc.)および同第WO95
/11307号(Institut Pasteur, INSERM, Universite d'Ottawa)ならびにTacson et
al.(1996)およびHuygen et al.(1996)による文献に記載されている。
【０５１８】 本発明のさらに他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドコンストラクト
を含む本発明の未変性ポリヌクレオチド細胞へのの伝達を、粒子衝突(biolistic
)で行う。前記粒子は、Klein et al.(1987)によって説明されているように、細
胞膜を穿孔して細胞を死滅させずに細胞に入り込むことができるように高い速度
まで加速されたDNA被覆微粒子である。
【０５１９】 さらに他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドをリポソームに包埋する
(Ghosh and Bacchawat, 1991、Wong et al., 1980、Nicolau et al., 1987)。
【０５２０】 特定の実施形態において、本発明によれば、本願明細書に記載のsbg1、g34665
、sbg2、g35017およびg35018タンパク質またはポリペプチドのin vivo産生用の
組成物が得られる。この組成物は、このポリペプチドを作用的にコードする未変
性ポリヌクレオチドを生理学的に許容されるキャリアの溶液中に含み、組織に導
入して組織の細胞に前記タンパク質またはポリペプチドを発現させるのに適して
いる。
【０５２１】 所望の宿主生物に注入するベクターの量は、注入部位によってさまざまである
。表示用量としては、ベクター0.1〜100μgの範囲で動物の体、好ましくはマウ
スの体などの哺乳動物の体に注入する。
【０５２２】 本発明によるベクターの別の実施形態では、宿主細胞、好ましくは処理対象と
なる動物から事前に採取した宿主細胞、さらに好ましくは筋細胞などの体細胞に
in vitroにてベクターを導入することができる。以後のステップで、所望のabg1
ポリペプチドまたはその所望のフラグメントをコードするベクターで形質転換し
た細胞を動物の体に再導入し、体内の組換えタンパク質を局所的または体全体に
移入する。
【０５２３】 (細胞宿主) 本発明の別の目的は、本願明細書に記載のポリヌクレオチドのうちの1つで形
質転換した宿主細胞またはこれに感染させた宿主細胞を含み、より正確には、配
列番号1〜26、36〜40および54〜229からなる群から選択されるsbg1ポリヌクレオ
チドまたはそのフラグメントまたはその変異体を含んでなる、ポリヌクレオチド
を含む。上述したものなどの組換えベクターで形質転換された(原核細胞)宿主細
胞またはこれに感染させた(真核細胞)宿主細胞があげられる。
【０５２４】 大まかに言うと、本発明の組換え宿主細胞は、本願明細書に記載のポリヌクレ
オチドまたは組換えベクターのうち任意のものを含む。
【０５２５】 本発明の発現ベクター用のレシピエントとして用いる好ましい宿主細胞は次の
とおりである。 a) 原核生物宿主細胞: 大腸菌(Escherichia coli)株(I.E.DH5-α菌株)、枯
草菌(Bacillus subtilis)、サルモネラ菌(Salmonella typhimurium)の他、シュ
ードモナス(Pseudomonas)、ストレプトマイセス(Streptomyces)およびスタフィ
ロコッカス(Staphylococcus)などの種から得られる菌株。 b) HeLa細胞(ATCC No. CCL2、No. CCL2.1、No. CCL2.2)、Cv 1細胞(ATCC No. CCL70)、COS細胞(ATCC No. CRL1650、No. CRL1651)、Sf-9細胞(ATCC NNo. CRL1
711)、C127細胞(ATCC No. CRL-1804)、3T3(ATCC No. CRL-6361)、CHO(ATCC No.
CCL-61)、ヒト腎293(ATCC No. 45504、No. CRL-1573)およびBHK(ECACC No. 8410
0501、No. 84111301)。 c) 他の哺乳動物の宿主細胞。 動物細胞のゲノムにおけるsbg1核酸相当物を本発明によるsbg1ポリヌクレオチ
ドと置換し、sbg1、g34665、sbg2、g35017およびg35018遺伝子のヒトをはじめと
する哺乳動物の細胞での発現を不完全にすることができる。このような遺伝的な
変化は、上述した特異的DNAコンストラクトを用いる相同的組換え現象によって
生み出すことのできるものである。
【０５２６】 使用できる宿主細胞の1種にマウス接合体などの哺乳動物接合体がある。たと
えば、NaCl 100mM、スペルミン30μM、スペルミジン70μMを含有する、トリス-H
Cl 10mM、pH 7.4、EDTA 250μM中、BAC挿入物であれば1ng/ml、P1バクテリオフ
ァージ挿入物であれば3ng/μlからの濃度範囲にあらかじめ調節した精製DNA分子
などの、興味の対象となっている精製DNA分子をマウス接合体に微量注射する。
微量注射するDNAの大きさが大きい場合、Schedl et al.(1993b)に記載されてい
るように、ポリアミンを用いて塩濃度を高くし、DNAが機械的に破壊されてしま
うのを防止することができる。
【０５２７】 本願明細書で説明したDNAコンストラクトをはじめとする本発明のポリヌクレ
オチドのうちいずれかを、胚性幹細胞(ES)、好ましくはマウスのES細胞に導入す
る。着床前胚盤胞の内部細胞塊の多分化能を持つ未分化細胞からES細胞株を得る
。好ましいES細胞株としては、ES-E14TG2a(ATCC No. CRL-1821)、ES-D3(ATCC No
. CRL1934およびNo. CRL-11632)、YS001(ATCC No. CRL-11776)、36.5(ATCC No.
CRL-11116)があげられる。ES細胞を未分化状態に維持するために、胚性表現型を
保存する適当なシグナルを提供し、かつES細胞接着のマトリックスとして機能す
る成長抑制支持細胞の存在下でこれを培養する。好ましい支持細胞は、実質的に
どのようなマウス菌株でも13〜14日目の胚組織から樹立される一次胚線維芽であ
り、これをAbbondanzo et al.(1993)に記載されているようにして培養中で保持
し、Robertson(1987)に記載されているようにして輻射によって成長を抑制する
か、あるいはPease and Williams(1990)に記載されているように抑制濃度のLIF
を用いることで成長を抑制する。
【０５２８】 宿主細胞中のコンストラクトを従来の方法で利用して、組換え配列にコードさ
れた遺伝子産物を得ることができる。
【０５２９】 宿主を適宜形質転換して増殖させて適切な細胞密度にした後、温度シフトまた
は化学誘導などの適切な手段によって、選択したプロモーターを誘発し、細胞を
さらに培養する。
【０５３０】 一般に、細胞を遠心分離によって回収し、物理的または化学的な手段で破壊し
、得られる粗エキスを以後の精製用に保持する。
【０５３１】 凍結融解サイクルの繰り返し、超音波処理、機械的な破壊または細胞溶解剤を
使用するなどの都合の良い方法によって、タンパク質の発現に使用される微生物
細胞を破壊することができる。かかる方法は当業者間で周知のものである。
【０５３２】 (トランスジェニック動物) 本願明細書では、「トランスジェニック動物」または「宿主動物」という用語
を、本発明の核酸のうち1つが含まれるようゲノムを遺伝的および人工的に操作
した動物を示すものとして用いる。好ましい動物は、非ヒト哺乳動物であり、本
発明による核酸の挿入によってゲノムを人工的かつ遺伝的に変化させたMus(マウ
スなど)、Rattus(ラットなど)およびOryctogalus(ウサギなど)から選択される属
に分類されるものが含まれる。一実施形態では、本発明は、ノックアウトベクタ
ーでの相同組換えによって破壊された本発明の組換えベクターまたはsbg1、g346
65、sbg2、g35017またはg35018遺伝子を有する動物および非ヒト宿主哺乳動物を
包含する。また、本発明は、ノックアウトベクターでの相同組換えによって破壊
された本発明の組換えベクターまたはsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018
遺伝子を含む非ヒト霊長類を包含する。
【０５３３】 本発明のトランスジェニック動物はいずれも、その複数の細胞の中に、クロー
ニングによって得られた組換えDNA配列または合成DNA配列、特に、sbg1、g34665
、sbg2、g35017またはg35018ポリヌクレオチドまたは本願明細書にて説明するも
のなどのアンチセンスポリヌクレオチドをコードするDNA配列を含む、精製され
た核酸または単離された核酸のうちの1つである。
【０５３４】 大まかに言うと、本発明によるトランスジェニック動物は、本発明で説明する
ポリヌクレオチド、組換えベクターおよび細胞宿主のうちいずれを含むものであ
ってもよい。
【０５３５】 第1の好ましい実施形態では、これらのトランスジェニック動物は、細胞の分
化に関係のあるさまざまな病理の研究、特に、sbg1、g34665、sbg2、g35017また
はg35018のそれぞれの未変性タンパク質あるいはsbg1、g34665、sbg2、g35017ま
たはg35018のそれぞれの変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドの1つま
たは複数のコピーをゲノム内に挿入したトランスジェニック動物に関する研究を
行う上での良好な実験モデルとなり得る。
【０５３６】 第2の好ましい実施形態では、これらのトランスジェニック動物が、調節ポリ
ヌクレオチドの制御下で、興味の対象となっている所望のポリペプチドを発現さ
せ、興味の対象となっているタンパク質の合成において高い収率をあげ、任意に
かかるタンパク質を組織特異的に発現させることができる。
【０５３７】 本発明のトランスジェニック動物は、当業者間で周知の従来の手法で設計でき
るものである。トランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウスの作出
方法の詳細については、1989年10月10日発行の米国特許第4,873,191号,1995年11
月7日発行の米国特許第5,464,764号および1998年8月4日発行の米国特許第5,789,
215号に記載されている。
【０５３８】 本発明のトランスジェニック動物は、ゲノムに外因性遺伝子物質が組み込まれ
た動物を生み出す手順を応用することによって作出される。この手順では、本願
明細書に記載したようなsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリヌクレオ
チドまたはアンチセンスポリヌクレオチドをコードするDNA配列のうち、いずれ
かをコードする遺伝物質またはその一部を採取する必要がある。
【０５３９】 本発明の組換えポリヌクレオチドを胚性細胞またはES幹細胞株に挿入する。こ
の挿入は、Thomas et al.(1987)に記載されているように、エレクトロポレーシ
ョンで行うのが好ましい。エレクトロポレーションの対象となる細胞をスクリー
ニング(たとえば選択可能なマーカーによる選択、PCR解析またはサザンブロット
解析など)し、好ましくは相同的組換え現象によってゲノムに外因性の組換えポ
リヌクレオチドが組み込まれたポジティブ細胞を見出す。本発明で利用できるポ
ジティブ-ネガティブ選択手順の一例は、Mansour et al.(1988)に説明されてい
る。
【０５４０】 次に、Bradley(1987)に記載されているように、ポジティブ細胞を単離し、ク
ローニングし、3.5日胚のマウス胚盤胞に注入する。次に、胚盤胞をメスの宿主
動物に挿入し、妊娠満期まで成長させる。
【０５４１】 あるいは、Wood et al.(1993)またはNagy et al.(1993)に記載されているよう
に、2.5日胚、8〜16細胞期(桑実胚)の時点でポジティブES細胞を胚と接触させる
。内部移行中のES細胞は、生殖細胞系を生み出す細胞を含む胚盤胞を迅速にコロ
ニー化する。
【０５４２】 メスの宿主の子孫を試験し、どの動物がトランスジェニックであるか(たとえ
ば、どの動物が外因性DNA配列を有し、どの動物が野生型なのか)を判断する。
【０５４３】 このため、本発明は、本発明による核酸、組換え発現ベクターまたは組換え宿
主細胞を含むトランスジェニック動物にも関するものである。
【０５４４】 (本発明のトランスジェニック動物由来の組換え株化細胞) 本発明のさらに他の目的は、本願明細書において説明するトランスジェニック
動物から得られる組換え宿主細胞を含む。一実施形態では、本発明は、本発明の
組換えベクターまたはノックアウトベクターを用いた相同的組換えによって破壊
された、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018核酸配列を含む遺伝子を含む
非ヒト宿主哺乳動物および動物由来の細胞を包含する。
【０５４５】 Chou(1989)およびShay et al.(1991)に記載されているようにして、たとえばS
V40ラージT抗原などのonc-geneを発現するベクターでの一次細胞培養物のトラン
スフェクションなどによって、本発明によるトランスジェニック動物のいずれか
の組織から得られる細胞から組換え細胞系をin vitroにて樹立する。
【０５４６】 (精神分裂病および双極性障害の治療用化合物を同定するためのアッセイ) 本発明によれば、CNS疾患を治療、特に、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg
35018によって媒介されるCNS疾患の症状を軽減する被検化合物の機能を知るのに
利用できるアッセイが得られる。好ましい実施形態では、sbg1、g34665、sbg2、
g35017またはg35018によって媒介される精神分裂病または双極性障害の症状を軽
減する機能について化合物を試験した。また、特に、精神障害の診断と統計マニ
ュアル第4版(DSM-IV)の分類に従って定義される、精神障害、気分障害、自閉症
、物質依存症およびアルコール中毒、精神遅滞および他の精神病性疾患(認知障
害、不安障害、摂食障害、衝動調節障害および人格障害を含む)を含む障害を治
療する機能について化合物を試験してもよい。
【０５４７】 また、本発明は、精神分裂病、双極性障害および関連障害の細胞および動物(
霊長類およびマウスを含む)モデルを提供するものである。
【０５４８】 一態様では、sbg1活性に影響する化合物を同定するための非細胞ベースのアッ
セイ、細胞ベースのアッセイおよび動物ベースのアッセイが得られる。sbg1活性
はどのような機序によっても影響され得る。特定の実施形態では、sbg1遺伝子発
現またはsbg1遺伝子産物の活性を調節することでsbg1活性に影響をおよぼすこと
ができる。
【０５４９】 本方法によって、直接または間接的にsbg1活性に影響する化合物の同定が可能
になる。したがって、本発明の非細胞ベースのアッセイ、細胞ベースアッセイの
および動物アッセイを、sbg1自体ではなくsbg1経路の要素に作用する化合物の同
定にも利用できる。同定後は、精神分裂病、双極性障害および関連障害に関与す
るsbg1および他の遺伝子産物を調節するための治療薬としてこれらの化合物を用
いることが可能である。
【０５５０】 （細胞ベースのアッセイと非細胞ベースのアッセイ） 一態様では、組換え細胞または非組換え細胞を用いた細胞ベースのアッセイを
利用して、sbg1活性を調節する化合物を同定することができる。
【０５５１】 一態様において、本発明の細胞ベースのアッセイは、(a)精神分裂病または双
極性障害に関連した終末点を軽減するのに十分な濃度および時間で、細胞を被検
化合物に曝露し、(b)sbg1活性の細胞内でのレベルを判定することを含む、精神
分裂病または双極性障害の治療用の被検化合物を同定するための方法を包含する
。sbg1活性は、たとえば、mRNA転写物レベル、sbg1ペプチド発現、局在位置また
はタンパク質活性について細胞をアッセイすることで測定可能なものである。好
ましくは、被検化合物は、精神分裂病、双極性障害または関連障害の症状を軽減
できる化合物またはその症状を軽減できると思われる化合物である。sbg1活性を
調節することができる被検化合物を、薬物の開発用に選択してもよい。かかる細
胞ベースのアッセイについては、本願明細書の「sbg1、g34665、sbg2、g35017お
よびg35018遺伝子の発現を調節するリガンドのスクリーニング方法」というセク
ションでさらに説明してある。
【０５５２】 もう1つの態様では、本発明の細胞ベースのアッセイは、(a)精神分裂病関連ま
たは双極性障害関連終末点を生じるのに十分なsbg1活性のレベルに細胞を曝露し
、(b)前記細胞を被検化合物に曝露することを含む、精神分裂病または双極性障
害の治療用化合物の同定方法を包含する。このようにすることで、被検化合物を
、前記精神分裂病関連または双極性障害関連終末点を軽減する機能に応じて選択
することが可能である。sbg1活性は、sbg1ヌクレオチド配列を含むベクターを提
供すること、sbg1発現を増大できる化合物で前記細胞を処理すること、sbg1ペプ
チドで前記細胞を処理することを含むがこれに限定されるものではない、好適な
方法によって得られるものである。好ましくは、配列番号27〜35の少なくとも4
アミノ酸の連続スパンを含むsbg1ペプチドで前記細胞を処理する。最も好ましく
は、実施例7にて説明するように、前記sbg1ペプチドが配列番号34のアミノ酸位
置124〜153を含む。好ましくは、被検化合物は、精神分裂病、双極性障害または
関連障害の症状を軽減できる化合物または軽減できると思われる化合物である。
あるいは、被検化合物は、終末点の精神分裂病、双極性障害または関連障害を悪
化させると思われるものである。精神分裂病、双極性障害または関連障害の検出
可能な症状または終末点を軽減できる被検化合物を薬物の開発用に選択すること
ができる。
【０５５３】 もう１つの実施形態では、本発明は、sbgペプチドが細胞表面に結合するか否
かを判定し、精神分裂病、双極性障害および関連障害の治療用にsbg1受容体と相
互作用する化合物を同定するためのsbg1に対する細胞ベースのアッセイと非細胞
ベースのアッセイとを提供するものである。かかる一実施形態において、sbg1ポ
リヌクレオチドまたはそのフラグメントを、本願明細書にて記載したような発現
ベクターにクローニングする。このタンパク質を、サイズクロマトグラフィ、電
荷クロマトグラフィ(charge chromatography)、免疫クロマトグラフィまたは当
業者に馴染みのある他の技法で精製する。精製後、当業者間で周知の技法を用い
てタンパク質を標識する。標識タンパク質を、さまざまな臓器または組織由来の
細胞または細胞系と共にインキュベートし、細胞表面に存在する受容体にタンパ
ク質を結合させる。インキュベーション後、細胞を洗浄し、非特異的に結合した
タンパク質を除去する。オートラジオグラフィによって標識タンパク質を検出す
る。あるいは、未標識タンパク質を細胞と共にインキュベートし、これに結合さ
せた蛍光分子などの検出可能な標識を有する抗体を用いて検出してもよい。さま
ざまな量の未標識タンパク質を標識タンパク質と一緒にインキュベートする競合
解析を行うことで、細胞表面結合の特異性を解析することができる。競合的な未
標識タンパク質の量が増えるにつれて、細胞表面に結合した標識タンパク質の量
は減少する。対照例として、いくつかの結合反応では、標識タンパク質とは無関
係のさまざまな量の未標識タンパク質を併用する。無関係の未標識タンパク質の
量が増える結合反応では、細胞表面に結合した標識タンパク質の量が減少しない
ことから、核酸でコードされるタンパク質が細胞表面に特異的に結合しているこ
とが分かる。
【０５５４】 もう１つの実施形態では、本発明は、上述した細胞ベースの結合アッセイの場
合と同様にsbg1ポリペプチドを調製して精製する非細胞ベースの結合アッセイを
含む。精製後、タンパク質を標識し、任意の臓器、組織、あるいは、興味の対象
である臓器または組織の組み合わせから得た所望の細胞由来の細胞膜抽出物また
は単離物と共にインキュベートして、sbg1ポリペプチドが膜上に存在する受容体
に結合できるようにする。インキュベーション後、膜を洗浄して非特異的に結合
したタンパク質を除去する。標識されたタンパク質をオートラジオグラフィによ
って検出することができる。さまざまな量の被検化合物を標識されたタンパク質
と共にインキュベートする競合解析を実施して、sbg1の膜結合特異性を解析して
もよい。被検ポリペプチドを含む所望の被検化合物であれば、どのような化合物
を細胞と共にインキュベートしてもよい。抗体が結合した検出可能な標識を有す
る抗体を用いて被検化合物を検出してもよい。競合的な被検化合物の量が増える
につれて、細胞表面に結合した標識sbg1ポリペプチドの量は減少する。対照例と
して、いくつかの結合反応では、標識タンパク質とは無関係のさまざまな量の未
標識タンパク質または被検化合物とは無関係の化合物を併用する。細胞膜へのsb
g1結合量を低減できる被検化合物を治療化合物候補として選択してもよい。
【０５５５】 細胞ベースのアッセイおよび非細胞ベースのアッセイの好ましい実施形態では
、前記sbg1ペプチドが配列番号27〜35の少なくとも4アミノ酸の連続スパンを含
み、最も好ましくは前記sbg1ペプチドが配列番号34のアミノ酸位置124〜153を含
む。
【０５５６】 前記細胞ベースのアッセイは、好適な起源の細胞を含むものでよい。特に好ま
しい細胞は、ヒト細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞およびマウス細胞である
。非ヒト霊長類細胞を用いる場合、sbg1は、ヌクレオチド配列を含むものであっ
てもよく、あるいは、配列番号54〜111の霊長類の核酸配列によるヌクレオチド
配列またはこれと相補な配列またはそのフラグメントによってコードされるもの
であってもよい。
【０５５７】 （動物モデルベースのアッセイ） 非ヒト動物ベースのアッセイを用いてsbg1活性を調節する化合物を同定しても
よい。本発明は、ヒトまたは別の形態のsbg1遺伝子を含有する動物をはじめとす
る非トランスジェニック動物またはトランスジェニック動物を含む適した動物モ
デルおよび動物ベースのアッセイを包含する。
【０５５８】 したがって、本発明は、sbg1活性を直接または間接的に調節できる被検化合物
を用いて、精神分裂病または双極性障害または症状に羅患した動物を治療するこ
とを含む。
【０５５９】 一態様において、本発明の動物ベースのアッセイは、(a)精神分裂病または双
極性障害に関連した終末点を軽減するのに十分な濃度および時間で、動物を被検
化合物に曝露し、(b)前記動物における該当サイトでのsbg1活性のレベルを判定
することを含む、精神分裂病または双極性障害の治療用の被検化合物を同定する
ための方法を包含する。sbg1活性については、好適な細胞、組織または部位のい
ずれかにおいて測定することが可能である。好ましくは、被検化合物は、精神分
裂病、双極性障害または関連障害の症状を軽減できる化合物またはその症状を軽
減できると思われる化合物である。任意に、前記被検化合物は、sbg1活性を調節
できる化合物またはこれを調節できると思われる化合物である。sbg1活性を調節
することができる被検化合物を、薬物の開発用に選択してもよい。
【０５６０】 もう1つの態様では、本発明の動物ベースのアッセイは、(a)精神分裂病関連ま
たは双極性障害関連症状または終末点を生じるのに十分なsbg1活性のレベルに動
物を曝露し、(b)前記動物を被検化合物に曝露することを含む、精神分裂病また
は双極性障害の治療用化合物の同定方法を包含する。このようにすることで、被
検化合物を、前記精神分裂病関連または双極性障害関連終末点を軽減する機能に
応じて選択することが可能である。sbg1活性は、sbg1ヌクレオチド配列を含むベ
クターを提供すること、sbg1発現を増大できる化合物で前記動物を処理すること
、sbg1ペプチドで前記細胞を処理することを含むがこれに限定されるものではな
い、好適な方法によって得られるものである。好ましくは、配列番号27〜35の少
なくとも4アミノ酸の連続スパンを含むsbg1ペプチドで前記動物を処理する。最
も好ましくは、実施例7にて説明するように、前記sbg1ペプチドが配列番号34の
アミノ酸位置124〜153を含む。好ましくは、被検化合物は、精神分裂病、双極性
障害または関連障害の症状を軽減できる化合物または軽減できると思われる化合
物である。あるいは、被検化合物は、精神分裂病、双極性障害または関連障害の
症状を悪化させると思われるものである。精神分裂病、双極性障害または関連障
害の検出可能な症状または終末点を軽減できる被検化合物を薬物の開発用に選択
することができる。
【０５６１】 どのような好適な動物を用いてもよい。好ましくは、前記動物は、霊長類、非
ヒト霊長類、哺乳動物またはマウスである。
【０５６２】 一実施形態では、sbg1ペプチドでマウスを処理し、被検化合物に曝露し、常同
行動を観察することで精神分裂病、双極性障害または関連障害を示す症状を評価
する。他の実施形態では、ホームケージ観察、神経学的評価、ストレスによる低
体温症、強制水泳、PTZ突発的発作、運動活性、尾懸垂、高架式十字迷路、新規
な目的認識、音刺激驚愕反応、温熱痛、Y字迷路および代謝チャンバ試験(metabo
lic chamber test)(Psychogenics Inc.で利用可能なPsychoscreen（登録商標）
試験)からなる群から選択される試験少なくとも1つを実施することによって、前
記症状を評価する。Crawley et al, Horm. Behav. 31(3):197-211(1997)、Crawl
ey, Brain Res 835(1):18-26(1999)などで他の試験が知られている。
【０５６３】 一例として、本願発明者らはsbg1ペプチドをマウスに注射して試験した。本願
明細書にて実施例7で説明するようにして、配列番号34のアミノ酸位置124〜153
を含むsbg1ペプチドを成体マウスに腹膜注射した。観察時、sbg1ペプチドを注射
したマウスでは、実験時間の経過に伴って運動頻度の減少が認められた。図18は
、3つの時間点(5分、10分および15分)における平均運動数を観察の最後の時間帯
(30分、35分、40分および45分)における1分あたりの平均運動数と比較したもの(
図の左上パネル)を示している。sbg1ペプチドによって常同行動が増えたが、こ
の結果は観察の最後の時間帯で最も顕著であった。常同行動の開始時はさまざま
であったため、観察を行った時間全体を通しての常同行動の平均としてのデータ
を得るようにした。
【０５６４】 また、本願発明者らは、sbg1遺伝子がいくつかの非ヒト霊長類にも存在するの
だと判断した。本発明の動物モデルおよび薬物スクリーニングアッセイの好まし
い実施形態では、非ヒト霊長類をsbg1ペプチドで処理し、被検化合物に曝露させ
る。ここで、前記sbg1ペプチドは、配列番号54〜111の霊長類の核酸配列または
これと相補な配列またはそのフラグメントに従ってヌクレオチド配列によってコ
ードされる。
【０５６５】 本発明のスクリーニング法に用いる好適な被検化合物はどのようなものであっ
てもよい。本発明の方法によってスクリーニングできる化合物の一例としては、
有機または無機の小分子、ポリヌクレオチドのランダムライブラリおよび指向性
(directed)ライブラリから得られるポリヌクレオチドをはじめとする核酸、ペプ
チドのランダムライブラリおよび指向性ライブラリ由来のペプチド、可溶性ペプ
チド、融合ペプチドおよびホスホペプチドをはじめとするペプチド、ポリクロー
ナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および抗イディオタイ
プ抗体ならびに一本鎖抗体をはじめとする抗体、FAb、F(ab')2およびFAb発現ラ
イブラリフラグメントおよびそのエピトープ結合フラグメントがあげられる。特
定の態様では、精神分裂病、双極性障害または関連障害の症状または終末点を軽
減または悪化させることのできる化合物には、一例として、抗精神病薬全般、神
経遮断薬、非定型神経遮断薬、抗鬱剤、抗不安薬、ノルアドレナリン作動性アゴ
ニストおよびアンタゴニスト、ドーパミンアゴニストおよびアンタゴニスト、セ
ロトニン再取込み阻害薬、ベンゾジアゼピンが含まれる。
【０５６６】 (sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリペプチドと相互作用する物質の
スクリーニング方法) 本発明の目的で、リガンドとは、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タ
ンパク質またはそのフラグメントまたは変異体のうちのひとつと結合できるタン
パク質、ペプチド、抗体または他の合成化学化合物などの分子、あるいは、sbg1
、g34665、sbg2、g35017またはg35018をコードするポリヌクレオチドまたはその
フラグメントまたはその変異体の発現を調節するためのかかる分子を意味する。
【０５６７】 本発明によるリガンドスクリーニング法では、sbg1、g34665、sbg2、g35017ま
たはg35018タンパク質の推定上のリガンドとして試験される生物学的試料または
定義された分子を、本願明細書にて上述したようなsbg1、g34665、sbg2、g35017
またはg35018の対応する精製タンパク質(たとえば組換え細胞宿主によって産生
される対応する精製組換えsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質
など)と接触させ、このタンパク質と推定上の被検リガンド分子との複合体を形
成する。
【０５６８】 一例として、配列番号27〜35および41〜43の少なくとも4アミノ酸、好ましく
は少なくとも6または好ましくは少なくとも8〜10アミノ酸、一層好ましくは少な
くとも12、15、20、25、30、40、50または100アミノ酸の連続スパンを含む、sbg
1、g34665、sbg2、g35017およびg35018タンパク質またはフラグメントと、コン
ビナトリアルケミストリー法によって生成された分子などの小分子または薬物と
の相互作用について研究するために、Wang et al.(1997)によって説明されてい
るHPLC法と微小透析とを併用したものや、Bush et al.(1997)によって説明され
ているアフィニティキャピラリー電気泳動法を利用することができる。
【０５６９】 さらに他の方法では、配列番号27〜35および41〜43の少なくとも4アミノ酸、
好ましくは少なくとも6または好ましくは少なくとも8〜10アミノ酸、一層好まし
くは少なくとも12、15、20、25、30、40、50または100アミノ酸の連続スパンを
含む、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質またはフラグメント
と相互作用するペプチド、薬物、脂肪酸、リポタンパク質または小分子を、以下
のようなアッセイを用いて同定することができる。結合を試験する対象となる分
子を、蛍光タグ、放射性タグまたは酵素タグなどの検出可能な標識で標識し、特
異的な結合が可能な条件下で、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018の固定
化したタンパク質またはそのフラグメントと接触させて配置する。非特異的に結
合した分子を除去した後、適切な手段を用いて結合分子を検出する。
【０５７０】 本発明のもう1つの目的は、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリペ
プチドと相互作用する候補物質をスクリーニングするための方法およびキットを
含む。
【０５７１】 本発明は、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質または一フラ
グメントまたはその変異体と相互作用する、興味の対象である物質をスクリーニ
ングするための方法に関するものである。sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg3
5018タンパク質またはそのフラグメントまたはその変異体と共有結合または非共
有結合する機能に応じて、これらの物質または分子をin vitroおよびin vivoの
いずれにおいても有効利用することができる。
【０５７２】 in vitroでは、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質の、好ま
しくは生物学的試料である試料中における存在を識別するための検出手段として
前記相互作用分子を利用することができる。 候補物質のスクリーニング方法は、 a) 配列番号27〜35および41〜43の少なくとも4アミノ酸、好ましくは少なく
とも6アミノ酸、一層好ましくは少なくとも8〜10アミノ酸、一層好ましくは少な
くとも12、15、20、25、30、40、50または100アミノ酸の連続スパンを含む、sbg
1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質またはフラグメントを含む、
実質的にかかるタンパク質またはフラグメントからなる、またはかかるタンパク
質またはフラグメントからなるポリペプチドを提供するステップと、 b) 候補物質を得るステップと、 c) 前記ポリペプチドを前記候補物質と接触させるステップと、 d) 前記ポリペプチドと前記候補物質との間で形成される複合体を検出するス
テップと、を含む。
【０５７３】 本発明はさらに、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリペプチドと相
互作用する候補物質のスクリーニング用のキットであって、 a) 配列番号27〜35および41〜43のアミノ酸配列からなる群から選択されるア
ミノ酸配列、あるいは、配列番号27〜35および41〜43の少なくとも4アミノ酸、
好ましくは少なくとも6アミノ酸、一層好ましくは少なくとも8〜10アミノ酸およ
び一層好ましくは少なくとも12、15、20、25、30、40、50または100アミノ酸の
連続スパンを含むペプチドフラグメントを有するsbg1、g34665、sbg2、g35017ま
たはg35018タンパク質と、 b) 任意に、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質またはその
ペプチドフラグメントまたはその変異体と候補物質との間に形成される複合体を
検出するのに有用な手段と、を含むキットに関するものである。
【０５７４】 上述したキットの好ましい実施形態では、検出手段が、sbg1、g34665、sbg2、
g35017またはg35018タンパク質またはそのペプチドフラグメントまたはその変異
体用のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む。
【０５７５】 さまざまな候補物質または分子を、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018
ポリペプチドとの相互作用についてアッセイすることが可能である。これらの物
質または分子としては、ポリペプチドなどの生物由来の天然または合成の有機化
合物または分子を含むがこれに限定されるものではない。候補物質または分子が
ポリペプチドを含む場合、このポリペプチドは、ファージベースのランダムペプ
チドライブラリに属するファージをクローニングして得られる発現産物であって
もよく、あるいは、ポリペプチドは、2ハイブリッドスクリーニングアッセイを
実施するのに適したベクターにおいてクローニングされたcDNAライブラリから得
られる発現産物であってもよい。
【０５７６】 また、本発明は、上述したスクリーニング法を実施する上で有用なキットにも
関する。好ましくは、かかるキットは、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg350
18ポリペプチドまたはそのフラグメントまたはその変異体と、任意に、sbg1、g3
4665、sbg2、g35017またはg35018ポリペプチドまたはそのフラグメントまたは変
異体と候補物質との間に形成される複合体を検出するのに有用な手段とを含む。
好ましい実施形態では、検出手段は、対応するsbg1、g34665、sbg2、g35017また
はg35018ポリペプチドまたはそのフラグメントまたはその変異体用のモノクロー
ナル抗体またはポリクローナル抗体を含む。
【０５７７】 （A. ランダムペプチドライブラリから得られる候補リガンド） スクリーニング法の特定の実施形態において、ファージベクター(Parmley and
Smith, 1988)に含まているDNA挿入物の発現産物が推定リガンドである。具体的
には、ランダムペプチドファージライブラリを使用する。無作為のDNA挿入物で8
〜20アミノ酸長のペプチドをコードする(Oldenburg K.R. et al., 1992、Valado
n P., et al., 1996、Lucas A.H., 1994、Westerink M.A.J., 1995、Felici F.
et al., 1991)。この特定の実施形態によれば、固定化したsbg1、g34665、sbg2
、g35017またはg35018タンパク質に結合されるタンパク質を発現する組換えファ
ージを保存し、次いで、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質と
組換えファージとの間に形成される錯体をsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg3
5018タンパク質用のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体によって免疫
沈降させてもよい。
【０５７８】 組換えファージでリガンドライブラリを構築した後、ファージ個体群を固定化
したsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質と接触させる。次に、
錯体調製物を洗浄し、非特異的に結合した組換えファージを除去する。その後、
sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質に特異的に結合するファー
ジを緩衝剤(酸性pH)によって溶出するか、抗sbg1、g34665、sbg2、g35017または
g35018ハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体によって免疫沈殿
し、次いでこのファージ個体群を細菌(たとえばE. coli)の過剰感染によって増
幅する。選択ステップを数回、好ましくは2〜4回繰り返し、さらに特異性の高い
組換えファージクローンを選択するようにしてもよい。最終ステップは、感染し
た細菌での発現と単離、他の宿主ベクター系でのファージ挿入物の発現、あるい
は選択した組換えファージを含む挿入物の配列決定などによって、選択された組
換えファージクローンによって産生されるペプチドを特徴付けることを含む。
【０５７９】 （B. 拮抗実験によって得られる候補リガンド） あるいは、配列番号27〜35および41〜43の少なくとも4アミノ酸、好ましくは
少なくとも6アミノ酸、一層好ましくは少なくとも8〜10アミノ酸および一層好ま
しくは少なくとも12、15、20、25、30、40、50または100アミノ酸の連続スパン
を含む、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質またはフラグメン
トに結合する、ペプチド、薬物または小分子を拮抗実験で同定してもよい。この
ようなアッセイでは、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質また
はフラグメントをプラスチック板などの表面に固定化する。検出可能に標識した
周知のsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質リガンドの存在下で
、固定化したsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質またはそのフ
ラグメントに、ペプチド、薬物または小分子を相当量接触させる。たとえば、蛍
光タグ、放射性タグ、酵素タグなどで、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg350
18リガンドを検出可能に標識してもよい。被検分子の存在下で結合された、検出
可能に標識された周知のリガンドの量を測定することによって、被検分子のsbg1
、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質またはそのフラグメントに結合
する能力を判定する。被検分子が存在するとsbg1、g34665、sbg2、g35017または
g35018タンパク質またはそのフラグメントに結合する周知のリガンドの量が減っ
たことから、被検分子がsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質ま
たはそのフラグメントと結合できることが分かる。
【０５８０】 （C. アフィニティクロマトグラフィによって得られる候補リガンド） sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質またはそのフラグメント
を仕込んだアフィニティカラムを使用して、配列番号27〜35および41〜43の少な
くとも4アミノ酸、好ましくは少なくとも6アミノ酸、一層好ましくは少なくとも
8〜10アミノ酸および一層好ましくは少なくとも12、15、20、25、30、40、50ま
たは100アミノ酸の連続スパンを含む、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg3501
8タンパク質またはフラグメントと相互作用するタンパク質または他の分子を見
出すことができる。アガロース、Affi Gel(R)や当業者間で周知の他の基質など
の好適なカラム基質への化学的結合などの従来の手法を用いて、sbg1、g34665、
sbg2、g35017またはg35018タンパク質またはそのフラグメントをカラムに固定す
ることができる。この方法のいくつかの実施形態では、アフィニティーカラムに
キメラタンパク質を含み、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質
またはそのフラグメントがグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)と融合してい
るものがある。細胞タンパク質または上述したような発現タンパク質のプールの
混合物をアフィニティーカラムに適用する。Ramunsen et al.(1997)に記載され
ているようにして、カラムに結合したsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018
タンパク質またはそのフラグメントと相互作用するタンパク質または他の分子を
単離し、2D泳動ゲルで解析することができる。あるいは、アフィニティーカラム
に残ったタンパク質を泳動主体の方法によって精製し、配列決定する。これと同
一の方法を用いて、抗体を単離し、ファージディスプレイ産物をスクリーニング
し、あるいはファージディスプレイ法によるヒト抗体をスクリーニングすること
ができる。
【０５８１】 （D. 光学バイオセンサ法によって得られる候補リガンド） Edwards and Leatherbarrow(1997)やSzabo et al.(1995)に記載されているよ
うな光学バイオセンサを用いて、配列番号27〜35および41〜43の少なくとも4ア
ミノ酸、好ましくは少なくとも6アミノ酸、一層好ましくは少なくとも8〜10アミ
ノ酸および一層好ましくは少なくとも12、15、20、25、30、40、50または100ア
ミノ酸の連続スパンを含む、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク
質またはフラグメントと相互作用するタンパク質をスクリーニングすることがで
きる。この手法を用いることで、標識した分子を使わずにリアルタイムで分子間
の相互作用を検出することができる。この手法は、表面プラズモン共鳴(SPR)現
象を利用したものである。簡単に説明すると、試験対象の候補リガンド分子を表
面(カルボキシメチルデキストラン基質など)に結合させる。被検試料を含んでい
ない表面の側に向けて光線を照射すると、この光線は前記表面によって反映され
る。SPR現象によって、角度と波長が特定の関係になると反射光の強度が落ちる
。候補リガンド分子が結合することが原因で、その表面での屈折率の変化が生じ
る(この変化はSPR信号の変化として検出される)。sbg1、g34665、sbg2、g35017
またはg35018タンパク質またはそのフラグメントと相互作用できる候補リガンド
分子または物質のスクリーニングのために、sbg1、g34665、sbg2、g35017または
g35018タンパク質またはそのフラグメントを表面に固定化する。この表面は細胞
の1つの側を含み、アッセイ対象の候補分子はここを通過して流動する。sbg1、g
34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質またはそのフラグメントへの候補
分子の結合は、SPR信号の変化として検出される。試験される候補分子は、タン
パク質、ペプチド、糖質、脂質または組合せ化学によって生成される小さな分子
などであればよい。この手法はさらに、真核生物細胞または裸核細胞を固定化す
ること、あるいは、それらの表面で内因的または組換え的に発現されるsbg1、g3
4665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質を呈するベシクルによって実施でき
る。
【０５８２】 この方法の主要な利点は、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク
質と相互作用するsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質と分子と
の間の関連度を判定できることにある。したがって、強い会合定数または逆に弱
い会合定数によって、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質また
はそのフラグメントと相互作用するリガンド分子を特異的に選択することが可能
である。
【０５８３】 （E. 2ハイブリッドスクリーニングアッセイによって得られる候補リガンド） 酵母2ハイブリッド系を設計し、in vivoでのタンパク質-タンパク質相互作用
について検討(Fields and Song, 1989)し、酵母Gal4タンパク質のDNA結合ドメイ
ンに対する餌タンパク質の融合を利用する。この手法は、米国特許第5,667,973
号および同第5,283,173号(Fields et al.)にも記載されている。
【０５８４】 2ハイブリッドアッセイによるライブラリースクリーニングの一般的な手順は
、Harper et al.(1993)またはCho et al.(1998)、あるいはFromont-Racine et a
l.(1997)によって説明されているようにして行うことができる。
【０５８５】 餌タンパク質またはポリペプチドは、配列番号27〜35および41〜43の少なくと
も4アミノ酸、好ましくは少なくとも6アミノ酸、一層好ましくは少なくとも8〜1
0アミノ酸および一層好ましくは少なくとも12、15、20、25、30、40、50または1
00アミノ酸の連続スパンを含む、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリ
ペプチドまたはフラグメントを含む、実質的にかかるポリペプチドまたはフラグ
メントからなる、またはかかるポリペプチドまたはフラグメントからなるもので
ある。
【０５８６】 正確には、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ポリペプチドまたはその
フラグメントまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列を、GAL4タンパク
質のDNA結合ドメインをコードするポリヌクレオチドに融合させ、融合ヌクレオ
チド配列をたとえばpAS2またはpM3などの好適な発現ベクターに挿入する。
【０５８７】 次に、GAL4タンパク質の転写ドメインをコードするベクターでヌクレオチド配
列にヒトcDNA挿入物が融合するように、特別に設計したベクターでヒトcDNAライ
ブラリを構築する。好ましくは、使用するベクターはpACTベクターである。ヒト
cDNAライブラリのヌクレオチド挿入物によってコードされるポリペプチドを「pr
ay」ポリペプチドとする。
【０５８８】 第3のベクターが、転写活性化ドメインとDNA結合ドメインの両方を含む完全Ga
l4タンパク質の結合に影響する調節配列の制御下におかれるβガラクトシダーゼ
遺伝子またはCAT遺伝子などの検出可能なマーカー遺伝子を含んでいる。たとえ
ば、ベクターpG5ECを使用できる。
【０５８９】 2種類の酵母菌株も使用する。2種類の酵母菌株の一例としては、次のものがあ
げられるがこれに限定されるものではない。 Y190、その表現型は(MATa、Leu2-3、112 ura3-12、trp1-901、his3-D200、ade
2-101、gal4Dgal180D URA3 GAL-LacZ、LYS GAL-HIS3、cyhr')、 Y187、その表現型は(MATa gal4 gal80 his3 trp1-901 ade2-101 ura3-52 leu2
-3、-112 URA3 GAL-lacZmet-)、であり、これらはY190の逆交配型である。
【０５９０】 簡単に説明すると、pAS2/ sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018を20μg
と、pA-cDNAライブラリ20μgを酵母菌株Y190に同時形質転換する。トランスフォ
ーマントを選択し、ヒスチジン、ロイシンおよびトリプトファンを含まないがヒ
スチジン合成インヒビター3-AT(50mM)を含有する最少培地で成長させる。フィル
タリフトアッセイによって、βガラクトシダーゼでポジティブコロニーをスクリ
ーニングする。次に、ヒスチジン、ロイシンを含まないがトリプトファンとシク
ロヘキシミド(10mg/ml)を含むプレートでダブルポジティブコロニー(His+、beta
-gal+)を成長させ、pACT-cDNAライブラリプラスミドのpAS2/PCTA-1プラスミドbu
保存損失を選択する。このようにして得られるY190菌株を、Harper et. al.(199
3)およびBram et al.(1993)に記載されているようにして、シクロフィリンB、ラ
ミンまたはSNF1、Gal4融合物などのPCTA-1または無関係の対照タンパク質を発現
するY187菌株と交配させ、フィルタリフトアッセイによってβガラクトシダーゼ
についてスクリーニングする。対照のGal4融合物と交配させた後のβgalである
酵母クローンを擬陽性とみなす。
【０５９１】 本発明による2ハイブリッド法の他の実施形態では、sbg1、g34665、sbg2、g35
017またはg35018またはそのフラグメントと細胞性タンパク質との間の相互作用
を、Matchmaker Two Hybrid System 2(カタログNo. K1604-1、クロンテック社)
を使用して評価することができる。Matchmaker Two Hybrid System 2(カタログN
o. K1604-1、クロンテック社)に添付のマニュアルに説明されているように、sbg
1、g34665、sbg2、g35017およびg35018タンパク質またはそのフラグメントをコ
ードする核酸を、酵母の転写活性因子GAL4のDNA結合ドメインをコードするDNAと
同一フレーム内にくるように発現ベクターに挿入する。所望のcDNA、好ましくは
ヒトcDNAを、GAL4の活性化ドメインをコードするDNAと同一フレームにくるよう
に第2の発現ベクターに挿入する。2つの発現プラスミドを酵母へ形質転換し、各
発現ベクターでの選択可能なマーカーの発現と、HIS3遺伝子のGAL4依存性発現の
みを選択的に行う選択培地プレートに上記の酵母を蒔く。ヒスチジンを含まない
培地で成長できるトランスフェクタントをGAL4依存性lacZ発現についてスクリー
ニングする。ヒスチジン選択とlacZアッセイのいずれにおいても陽性である細胞
では、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質と最初に選択された
cDNA挿入物によってコードされるタンパク質またはペプチドとが相互作用する。
【０５９２】 (sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018遺伝子の制御配列と相互作用する物
質のスクリーニング方法) 本発明は、プロモーター配列またはエンハンサー配列など、sbg1、g34665、sb
g2、g35017またはg35018遺伝子の制御配列と相互作用できる物質または分子のス
クリーニング方法にも関するものである。
【０５９３】 sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018遺伝子の制御配列と相互作用できる
タンパク質をコードする核酸、特に、5'調節領域および3'調節領域のポリヌクレ
オチドまたはそのフラグメントまたはその変異体、好ましくは本発明のバイアレ
リックマーカーのうちいずれか1つを含む変異体からなる群から選択されるヌク
レオチド配列を、クロンテック社から入手可能なMatchmaker One-Hybrid System
キット(カタログNo. K1603-1)に付随のマニュアルに記載されているものなどの
ワンハイブリッドシステムを使用して同定することができる。簡単に説明すると
、標的ヌクレオチド配列を選択可能なレポーター配列の上流にクローニングし、
得られるDNAコンストラクトを酵母ゲノム(Saccharomyces cerevisiae)に組み込
む。次に、制御配列に結合するよう候補タンパク質をコードするcDNAとGAL4など
の酵母転写因子の活性化因子ドメインをコードする配列との融合分子からなるラ
イブラリでゲノムにレポーター配列を含む酵母細胞を形質転換する。この組換え
酵母細胞を培養ブロスに蒔き、レポーター配列を発現する細胞を選択する。この
ようにして選択した組換え酵母細胞には、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg3
5018遺伝子の標的制御配列と結合できる融合タンパク質が含まれる。次に、融合
タンパク質をコードするcDNAの配列決定を行い、これをin vitroにて発現ベクタ
ーまたは転写ベクターにクローニングすることができる。ゲルリターデーション
アッセイまたはDNAse保護アッセイなどの当業者間で周知の手法によって、コー
ドされたポリペプチドのsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018遺伝子の標的
制御配列への結合を確認できる。
【０５９４】 FriedおよびCrothers(1981)、GarnerおよびRevzin(1981)およびDentおよびLat
chman(1993)によって説明されているように、sbg1、g34665、sbg2、g35017また
はg35018遺伝子の制御配列と相互作用できる候補分子をスクリーニングすべくゲ
ルリターデーションアッセイを独立に行ってもよい。これらの手法は、タンパク
質に結合したDNAフラグメントが未結合の同一のDNAフラグメントよりもゆっくり
と移動する原理に基づくものである。簡単に説明すると、標的ヌクレオチド配列
を標識する。次に、標識した標的ヌクレオチド配列を、転写因子を含む細胞から
の全核抽出物または試験対象となる異なる候補分子のいずれかと接触させる。ゲ
ル電気泳動またはキャピラリー電気泳動後にsbg1、g34665、sbg2、g35017または
g35018遺伝子の標的制御配列と候補分子または転写因子との間の相互作用を、、
移動速度の差に基づいて検出する。
【０５９５】 (sbg1、g34665、sbg2、g35017およびg35018遺伝子の発現を調節するリガンドの
スクリーニング方法) 本発明の他の主題は、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質の
発現を変調させる分子のスクリーニング方法である。このようなスクリーニング
方法は、 a) sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質またはその変異体ま
たはフラグメントをコードするヌクレオチド配列で、その自己のプロモーターの
制御下でトランスフェクトした原核生物細胞または真核生物細胞を培養するステ
ップと、 b) 培養細胞と被検分子とを接触させるステップと、 c) sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質またはその変異体ま
たはフラグメントの発現を定量化するステップと、を含む。
【０５９６】 一実施形態では、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質または
その変異体またはフラグメントをコードするヌクレオチド配列が、sbg1、g34665
、sbg2、g35017またはg35018関連バイアレリックマーカーのうち少なくとも1つ
のアレルを含む。
【０５９７】 当業者間で周知のDNA組換え手法を用いて、DNA配列をコードするsbg1、g34665
、sbg2、g35017またはg35018タンパク質をそのプロモーター配列の下流で発現ベ
クターに挿入する。一例として、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018遺伝
子のプロモーター配列が5'調節領域の核酸に含まれる。
【０５９８】 sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質の発現の定量化は、mRNA
レベルあるいはタンパク質レベルで実現できる場合がある。後者の場合、ポリク
ローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用し、ELISAあるいはRIAアッセイな
どで産生されたsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質の量を定量
化することができる。
【０５９９】 好ましい実施形態では、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018 mRNAの定
量化は、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018に特異なプライマーの対を使
用して、培養したsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018-トランスフェクト
宿主細胞の全mRNAの逆転写によって得られたcDNAの定量的PCR増幅によって実現
される。
【０６００】 また、本発明は、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018遺伝子の発現レベ
ルを増大または反対に低減させることのできる物質または分子のスクリーニング
方法にも関するものである。かかる方法によって、当業者は、sbg1、g34665、sb
g2、g35017またはg35018遺伝子の発現レベルに調節作用をもたらす物質を選択す
ることができ、これが疾患に羅患した患者を治療するための製剤組成物に含まれ
る活性成分として有用なものとなり得る。
【０６０１】 したがって、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018遺伝子の発現を調節し
た候補物質または分子のスクリーニング方法も本発明の一部であり、この方法は
、 検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドの上流に位置する5'調節
領域のヌクレオチド配列またはその生物学的に活性なフラグメントまたはその変
異体を含む核酸を含む組換え細胞宿主を提供するステップと、 候補物質を得るステップと、 候補物質の、検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現レベ
ルを調節する機能を判定するステップと、を含む。
【０６０２】 さらに他の実施形態では、5'調節領域のヌクレオチド配列またはその生物学的
に活性なフラグメントまたはその変異体を含む核酸が、配列番号2〜26のsbg1 cD
NAの5'UTR領域または配列番号36〜40のg35018 cDNA、あるいはその生物学的に活
性なフラグメントまたはその変異体のうちの1つを含む。
【０６０３】 検出可能なタンパク質をコードする好ましいポリヌクレオチドとしては、βガ
ラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)およびクロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ(CAT)をコードするポリヌクレオチドがあげられる。
【０６０４】 また、本発明は、上述したスクリーニング方法を実施するのに有用なキットに
も関する。好ましくは、かかるキットは、検出可能なタンパク質またはsbg1、g3
4665、sbg2、g35017またはg35018タンパク質またはそのフラグメントまたはその
変異体をコードするポリヌクレオチドの上流に位置し、かかるポリヌクレオチド
に作用的に結合された、5'調節領域のヌクレオチド配列またはその生物学的に活
性なフラグメントまたはその変異体の発現を可能にする組換えベクターを含む。
【０６０５】 sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018遺伝子の発現を変調する候補物質ま
たは分子をスクリーニングする方法のもう１つの実施形態では、前記方法が、 a) sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018 cDNAの5'UTR配列、好ましくは
配列番号2〜26または36〜40のsbg1またはg35018 cDNAの5'UTR配列、あるいは、
検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作用的に結合された、そ
の生物学的に活性なフラグメントまたはその変異体のうち1つを含む核酸を含む
組換え宿主細胞を提供するステップと、 b) 候補物質を得るステップと、 c) 候補物質が検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現レ
ベルを変調させる機能を判定するステップと、を含む。
【０６０６】 上述したスクリーニング方法の具体的な実施形態では、sbg1、g34665、sbg2、
g35017またはg35018 cDNAの5'UTR配列、好ましくは配列番号2〜26または36〜40
のsbg1またはg35018 cDNAの5'UTR配列からなる群から選択されるヌクレオチド配
列またはその生物学的に活性なフラグメントまたは変異体のうちの1つを含む核
酸が、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018 5'UTR配列に鑑みると内因性の
ものであるプロモーター配列を含む。
【０６０７】 上述したスクリーニング方法の他の具体的な実施形態では、sbg1、g34665、sb
g2、g35017またはg35018 cDNAの5'UTR配列からなる群から選択されるヌクレオチ
ド配列またはその生物学的に活性なフラグメントまたは変異体のうちの1つを含
む核酸が、本願明細書に定義するsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018 5'U
TR配列に鑑みると外因性のものであるプロモーター配列を含む。
【０６０８】 さらに他の好ましい実施形態では、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018
cDNAの5'-UTR配列またはその生物学的に活性なフラグメントを含む核酸が、sbg
1関連バイアレリックマーカーを含む。
【０６０９】 本発明はさらに、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018遺伝子の発現を調
節する候補物質をスクリーニングするためのキットであって、前記キットが、配
列番号2〜26または36〜40のsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018 cDNAの5'
UTR配列またはその生物学的に活性なフラグメントまたは変異体のうちの1つを含
む核酸を有する組換えベクターを含み、5'UTR配列またはその生物学的に活性な
フラグメントまたは変異体が、検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオ
チドと作用的に結合されている、キットも含むものである。
【０６１０】 上述したスクリーニング方法の実施に有用である好適な組換えベクターの設計
については、本発明の好ましい組換えベクターが詳細に説明されている本願明細
書のセクションにて触れるものとする。
【０６１１】 国際特許出願公開第WO97/05277号に記載されているように、長いプローブを用
いて溶液ハイブリダイゼーションを行い、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg3
5018の発現レベルおよびパターンを解析することができる。簡単に説明すると、
上述したsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018 cDNAまたはsbg1、g34665、s
bg2、g35017およびg35018ゲノムDNAまたはそのフラグメントを、バクテリオファ
ージ(T3、T7またはSP6)RNAポリメラーゼプロモーターのすぐ下流のクローニング
部位に挿入し、アンチセンスRNAを作出する。好ましくは、このsbg1、g34665、s
bg2、g35017およびg35018挿入物は、ゲノムDNA配列またはcDNA配列のうち少なく
とも100以上の連続したヌクレオチドを含むものである。プラスミドを直線化し
、修飾リボヌクレオチド(すなわち、ビオチン-UTPおよびDIG-UTP)を含むリボヌ
クレオチドの存在下、転写を行う。過剰な二重標識RNAを興味の対象となる細胞
または組織から採取したmRNAと溶液中でハイブリダイズさせる。このハイブリダ
イゼーションは、標準的なストリンジェントな条件下(80%ホルムアミド、0.4M N
aCl緩衝液中、pH7〜8にて40〜50℃で16時間)で行う。ハイブリダイズされなかっ
たプローブを、一本鎖RNA特異なリボヌクレアーゼ(すなわち、RNase CL3、T1、P
hy M、U2またはA)で消化して除去する。ビオチン-UTP修飾が存在することで、ス
トレプトアビジン被覆したマイクロタイタープレート上でハイブリッドを捕捉で
きる。DIG修飾が存在することで、アルカリホスファターゼに結合した抗DIG抗体
を使用するELISAによってハイブリッドを検出して定量化できる。 sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018遺伝子発現の定量解析を、アレイを
用いて行ってもよい。本願明細書において、本願明細書において、アレイという
用語は、これとハイブリダイズできるmRNAの発現を特異的に検出できるだけの十
分な長さの複数の核酸で構成される、一次元、二次元または多次元の集合体を意
味する。たとえば、このアレイは、発現レベルを評価したい遺伝子由来の複数の
核酸を含むものであってもよい。このアレイには、sbg1、g34665、sbg2、g35017
およびg35018ゲノムDNA、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018 cDNA配列ま
たはこれと相補な配列またはそのフラグメント、特に少なくとも1つの本発明の
バイアレリックマーカーを有する配列を含んでもよい。好ましくは、このフラグ
メントは少なくとも15ヌクレオチド長である。他の実施形態では、このフラグメ
ントは少なくとも25ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、フラグメ
ントは少なくとも50ヌクレオチド長である。より好ましくは、このフラグメント
は少なくとも100ヌクレオチド長である。もう1つの好ましい実施形態では、フラ
グメントは100ヌクレオチド長よりも長いものである。いくつかの実施形態では
、フラグメントは500ヌクレオチド長よりも長いものであってもよい。
【０６１２】 たとえば、Schena et al.(1995および1996)によって説明されているように、c
DNAマイクロアレイを用いて、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018遺伝子
発現の定量解析を行うことができる。完全長sbg1、g34665、sbg2、g35017または
g35018 cDNAまたはそのフラグメントをPCR増幅し、高速の装置を用いてシリル化
顕微鏡スライドガラス上で96穴マイクロタイタープレートからアレイ化する。プ
リントされたアレイを湿ったチャンバ内でインキュベートし、アレイの要素を再
水和させ、0.2%SDSで1分間を1回と、水で1分間を2回、水素化ホウ素ナトリウム
溶液中で5分間を1回のサイクルで洗浄する。このアレイを95℃で2分間、水中に
沈め、0.2%SDSに移して1分おき、2回水洗し、空気乾燥させて25℃で暗所に保管
する。
【０６１３】 細胞または組織のmRNAを単離するか、あるいは市販されているものを入手し、
逆転写のサイクルを1回行ってプローブを調製する。このプローブを14ラ14mmのカ バーガラス下で60℃にて6〜12時間で1cm2のマイクロアレイとハイブリダイズさ
せる。このアレイをストリンジェンシーの低い洗浄用緩衝液(1ラSSC/0.2%SDS)中 にて25℃で5分間洗浄した後、ストリンジェンシーの高い洗浄用緩衝液(0.1ラSSC/ 0.2%SDS)中にて室温で10分間洗浄する。独自に用意したフィルタセットを用いた 蛍光レーザー走査装置によって、0.1ラSSC中でアレイをスキャンする。独立した2 つのハイブリダイゼーションの比の平均を取ることによって、正確な分化発現(d
ifferential expression)測定値を得る。
【０６１４】 Pietu et al.(1996)によって説明されているように、cDNA配列の完全長sbg1、
g34665、sbg2、g35017またはg35018 cDNAまたはそのフラグメントを用いてsbg1
、g34665、sbg2、g35017またはg35018遺伝子発現の定量解析を行ってもよい。完
全長sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018 cDNAまたはそのフラグメントをP
CR増幅し、膜に接種する。次に、さまざまな組織または細胞由来のmRNAを放射性
ヌクレオチドで標識する。ハイブリダイゼーションと制御した条件下での洗浄後
、ホスホイメージングまたはオートラジオグラフィによって、ハイブリダイズさ
れたmRNAを検出する。実験を2回重複して行った後、分化的に発現されたmRNAの
定量解析を行う。
【０６１５】 あるいは、Lockhart et al.(1996)およびSosnowsky et al.(1997)によって説
明されているように、高密度ヌクレオチド配列を利用して、sbg1、g34665、sbg2
、g35017またはg35018ゲノムDNA、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018 cD
NAまたはそのフラグメントを用いた発現解析を行うこともできる。sbg1、g34665
、sbg2、g35017またはg35018ゲノムDNA配列、sbg1、g34665、sbg2、g35017また
はg35018 cDNA配列、特に少なくとも1つの本発明のバイアレリックマーカーを有
する配列あるいはこれと相補な配列からヌクレオチド15〜50個で構成されるオリ
ゴヌクレオチドをチップ上で直接合成する(Lockhart et al., 上掲)か、あるい
は合成後にチップにアドレス指定する(Sosnowski et al., 上掲)。好ましくは、
オリゴヌクレオチドは約20ヌクレオチド長のものである。
【０６１６】 ビオチン、ジゴキシゲニンまたは蛍光染料などの適当な化合物で標識したsbg1
、g34665、sbg2、g35017またはg35018 cDNAプローブを適当なmRNA集団から合成
した後、平均サイズ50〜100ヌクレオチドにランダムに断片化する。次いで、前
記プローブをチップとハイブリダイズさせる。上記Lockhart et al.によって説
明されているように洗浄し、異なる電界を印加(Sosnowsky et al., 1997)した後
、染料または標識化合物を検出して定量化する。ハイブリダイゼーションを2回
重複して行う。異なるcDNA試料で同一の標的オリゴヌクレオチドについてcDNAプ
ローブからのシグナル強度を比較解析することで、sbg1、g34665、sbg2、g35017
またはg35018 mRNAが分化的に発現していることが分かる。
【０６１７】 (sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018遺伝子の発現を阻害するための方法) 本発明による他の治療用組成物には、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg350
18の核配列のオリゴヌクレオチドフラグメントが対応するsbg1、g34665、sbg2、
g35017またはg35018遺伝子の発現を阻害するアンチセンスツールまたは三重らせ
んツールとして都合よく含まれる。sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018の
核配列の好ましいフラグメントには、本発明のバイアレリックマーカーのうち少
なくとも1つのアレルが含まれる。
【０６１８】 (アンチセンスによる方法) 本発明によるアンチセンスポリヌクレオチドを用いた好ましい方法は、Sczaki
el et al.(1995)によって説明されている手順である。
【０６１９】 sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018 mRNAの5'末端と相補であるポリヌ
クレオチド(15〜200bp長)からアンチセンスツールを選択すると好ましい。他の
実施形態では、所望の標的遺伝子の異なる部分に対して相補である異なるアンチ
センスポリヌクレオチドの組み合わせを使用する。
【０６２０】 本発明による好ましいアンチセンスポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンATG
またはスプライシングドナーまたはアクセプター部位のいずれかを含むsbg1、g3
4665、sbg2、g35017またはg35018のmRNAsの配列に対して相補なものである。
【０６２１】 アンチセンス核酸は、二重鎖でのsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018 m
RNAの発現を抑制するのに十分な安定性を持つ細胞内二重鎖が形成されるだけの
長さと融点を持つものでなければならない。遺伝子治療に利用するのに適したア
ンチセンス核酸の設計ストラテジーについては、Green et al.(1986)およびIzan
t and Weintraub(1984)に開示されている。
【０６２２】 いくつかのストラテジーでは、細胞で正常に転写されるものとは逆の鎖が転写
されるように、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018コード領域の配向をプ
ロモーターとは逆にすることによって、アンチセンス分子を得る。転写物の生成
にT7またはSP6ポリメラーゼを用いるものなどのin vitro転写系を用いてアンチ
センス分子を転写することができる。もう1つの方法は、アンチセンス配列を持
つDNAを好適な発現ベクターでプロモーターに作用的に結合させることによって
、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018アンチセンス核酸をin vivoにて転
写するものである。
【０６２３】 あるいは、好適なアンチセンスストラテジーが、国際特許出願公開第WO94/230
26号、同第WO95/04141号、同第WO92/18522号および欧州特許出願公開第EP 0 572
287 A2号において、Rossi et al.(1991)によって説明されている。
【０６２４】 本発明にしたがって使用されるアンチセンステクノロジーに代わるものとして
、自己の相補ポリヌクレオチド尾によって標的配列と結合し、対応するRNAの標
的部位を加水分解することによってこれを切断するリボザイム(すなわち「ハン
マーヘッドリボザイム」を使用することがあげられる。簡単に説明すると、ハン
マーヘッドリボザイムの単純なサイクルは、(1)相補アンチセンス配列による標
的RNAへの配列特異的な結合、(2)標的鎖の切断可能なモチーフの部位特異的な加
水分解、(3)他の触媒サイクルを生む切断産物の放出からなる。特に、長鎖アン
チセンスポリヌクレオチド(少なくとも30塩基長)またはリボザイムを長いアンチ
センス腕と併用すると好都合である。これらのアンチセンスリボザイムを親油基
に共有結合させるか、あるいは都合のよいベクターとしてリポソームを使用する
ことで、好ましいアンチセンスリボザイム用の好ましい送達系が達成される。本
発明による好ましいアンチセンスリボザイムは、Sczakiel et al.(1995)によっ
て説明されているようにして調製される。
【０６２５】 (三重らせんによる方法) sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ゲノムDNAを、細胞内での三重らせ
ん形成を主体にしたsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018遺伝子発現の抑制
に使用してもよい。
【０６２６】 三重らせんオリゴヌクレオチドを用いてゲノムからの転写を抑制する。これら
のオリゴヌクレオチドが特定の遺伝子と関連している場合に、細胞活性の変化を
研究する上で特に有用である。
【０６２７】 同様に、sbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ゲノムDNAの一部を用いて
、細胞内でのsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018転写の効果を研究するこ
とができる。従来、三重らせんでのストラテジーにはホモプリン配列が最も有用
であるとされてきた。しかしながら、ホモピリミジン配列でも遺伝子発現を抑制
することができる。このようなホモピリミジンオリゴヌクレオチドは、ホモプリ
ン:ホモピリミジン配列の主溝に結合する。このため、sbg1、g34665、sbg2、g35
017またはg35018ゲノムDNAから得られる配列はどちらのタイプも本発明の範囲に
包含される。
【０６２８】 三重らせんによる方法を用いて遺伝子療法ストラテジーを実施するために、sb
g1、g34665、sbg2、g35017またはg35018ゲノムDNAの配列をスキャンし、10merか
ら20merのホモピリミジンまたはホモプリンの伸展を同定する。これを三重らせ
ん主体のストラテジーに利用してsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018の発
現を抑制することができる。ホモピリミジンまたはホモプリンの候補伸展の同定
後、候補配列を含むオリゴヌクレオチドを、sbg1、g34665、sbg2、g35017または
g35018遺伝子を発現する組織培養細胞にさまざまな量で導入することによって、
そのsbg1、g34665、sbg2、g35017またはg35018発現抑制効率を評価する。
【０６２９】 リン酸カルシウム沈降法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、
リポソーム媒介トランスフェクション法または天然状態での取り込みなどを含む
がこれに限定されるものはない、当業者間で周知のさまざまな方法を利用して、
細胞にオリゴヌクレオチドを導入することができる。
【０６３０】 ノーザンブロット、RNase保護アッセイ、PCR法を主体としたストラテジーなど
の手法を用いて、処理済細胞の細胞機能またはsbg1、g34665、sbg2、g35017また
はg35018発現の低下を監視し、オリゴヌクレオチドで処理した細胞でのsbg1、g3
4665、sbg2、g35017またはg35018遺伝子の転写レベルをモニタリングする。
【０６３１】 次に、アンチセンスによる方法で上述したような方法を用いて、アンチセンス
による方法で行ったin vitroでの結果に基づいて投与量を算出し、この投与量で
組織培養細胞での遺伝子発現の抑制に効果的なオリゴヌクレオチドをin vivo導
入してもよい。
【０６３２】 いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド単位の天然(β)アノマーの代わ
りにαアノマーを用いてオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を高めることが
できる。さらに、臭化エチジウムなどのインターカレート剤をαオリゴヌクレオ
チドの3'末端に付加し、三重らせんを安定させることも可能である。三重らせん
形成に適したオリゴヌクレオチドの生成方法については、Griffin et al.(1989)
を参照のこと。
【０６３３】 (薬剤組成物および製剤) (sbg1調節化合物) 本願明細書に開示する方法を利用して、sbg1活性をin vitroおよびin vivoに
て選択的に調節する化合物を同定することができる。本発明の方法によって同定
される化合物としては、たとえば、sbg1ペプチドに対する結合特異性を持つ抗体
があげられる。また、精神分裂病または双極性障害と関連した、sbg1による活性
および関連する生理学的な状態の調節に、sbg1相当物も有用な場合があると思わ
れる。概して、中枢神経系障害におけるsbg1の役割をもとにした本発明のアッセ
イ法を利用して、本発明のアッセイカスケードに介在できる化合物を同定するこ
とができると思われる。
【０６３４】 (徴候) 以上、sbg1と精神分裂病および双極性障害との関連性について説明してきたが
、sbg1が関与する徴候としては、さまざまな中枢神経系障害をあげることができ
る。神経系障害は、複雑な遺伝的ベースを持ち、特定の症状が共通して認められ
る場合も多いと考えられる。特に、本願明細書にて説明するとおり、徴候として
は、精神障害の診断と統計マニュアル第4版(DSM-IV)の分類に従って定義される
、精神障害、気分障害、自閉症、物質依存症およびアルコール中毒、精神遅滞お
よび他の精神病性疾患(認知障害、不安障害、摂食障害、衝動調節障害および人
格障害を含む)があげられる。
【０６３５】 (製剤および投与経路) 本発明の方法を用いて同定される化合物を、単独あるいは好適なキャリアまた
は賦形剤と混合した薬剤組成物として、精神分裂病または双極性障害関連障害を
治療または軽減するのに有効な治療有効量で、人間の患者をはじめとする哺乳動
物に投与することが可能である。治療有効量はさらに、本願明細書にて説明する
方法で判定した場合の症状の緩和につながるだけの十分な化合物量も意味する。
治療有効量は、連続した定期使用または投与に適した量であると好ましい。本願
の化合物を調合および投与するための技法については、「Remington's Pharmace
utical Sciences」Mack Publishing Co., Easton, PAの最新版に記載されている
。
【０６３６】 (投与経路) 好適な投与経路としては、経口投与、直腸投与、経粘膜投与または腸管投与、
非経口送達(筋肉内注射、皮下注射、髄内注射ならびにくも膜下腔内注射、直接
脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射または眼内注射を含む)があ
げられる。中枢神経系疾患を治療するための化合物の特に有用な投与方法として
は、長期間にわたって化合物を送達する装置の外科的な埋込移植があげられる。
本発明による薬物の徐放製剤が特に企図される。
【０６３７】 (組成物/処方) 本発明に従って利用される薬剤組成物および薬物については、賦形剤と助剤と
を含む生理学的に許容されるキャリア1種またはそれ以上を用いて、従来の方法
で処方することができる。適切な製剤はどの投与経路を選択するかによって異な
る。
【０６３８】 注射用であれば、好ましくはハンクス液、リンゲル液などの生理学的に相溶な
緩衝液、あるいは、ホスフェート緩衝液または炭酸水素緩衝液などの生理食塩水
緩衝液に溶解して、本発明の薬剤を水溶液として処方することができる。経粘膜
投与用であれば、浸透される障壁に適した浸透剤を製剤に利用する。このような
浸透剤は従来技術において一般に知られている。
【０６３９】 経口的に利用可能な製剤としては、ゼラチン製のプッシュフィット(push-fit)
カプセルならびに、グリセロールまたはソルビトールなどの可塑化剤とゼラチン
製とで作られた密封ソフトカプセルがあげられる。プッシュフィットカプセルに
は、ラクトースなどのフィラー、デンプンなどのバインダおよび/またはタルク
やステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、さらに任意に安定化剤の混合物とし
て活性成分を含有させることが可能である。ソフトカプセルの場合は、脂肪油、
流動パラフィンまたは流動ポリエチレングリコールなどの好適な液体に活性化合
物を溶解または懸濁させる。また、安定化剤を添加してもよい。経口投与用の製
剤はいずれも、かかる投与に適した用量でなければならない。
【０６４０】 舌下投与用では、従来の方法で処方するタブレットまたは薬用ドロップ状の組
成物にすることができる。
【０６４１】 吸入による投与の場合、二酸化炭素などの好適な気体状噴霧剤を用いて、本発
明に従って用いられる化合物を加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾル
スプレーとして適宜送達する。加圧エアロゾルの場合、計量した量を送達するた
めのバルブを設けて用量単位を求める。吸入器または通気器で用いられるゼラチ
ンなどのカプセルおよびカートリッジに、かかる化合物とラクトースまたはスタ
ーチなどの好適な粉末ベースとを混合した粉末混合物を入れるようにしてもよい
。
【０６４２】 大量瞬時投与または連続輸液などの注入方法による腸管投与用の化合物を処方
してもよい。注射用製剤は、保存剤を添加したアンプルまたは多用量容器などの
単位剤形の形であってもよい。この組成物は、水性ビヒクルを用いての懸濁液、
溶液またはエマルジョンなどの形態であってもよく、懸濁剤、安定化剤および/
または分散剤などの処方剤を含むものであってもよい。
【０６４３】 非経口投与用の製剤としては、活性化合物を水溶性形態にした水溶液があげら
れる。カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストラ
ンなどの懸濁液の粘度を増す物質を水性懸濁液に含有させてもよい。任意に、好
適な安定化剤や化合物の可溶性を高める薬剤などを懸濁液に含有させ、極めて高
濃度の製剤を得られるようにしてもよい。
【０６４４】 あるいは、使用前にパイロジェンを含有しない滅菌水などの好適なビヒクルを
用いて組成する場合であれば、活性成分が粉末または凍結乾燥させた状態であっ
てもよい。
【０６４５】 上述した製剤に加えて、化合物を持効性製剤として組成してもよい。このよう
に長期にわたって作用する製剤は、埋込み移植(皮下埋込または筋肉内埋込など)
または筋肉内注射によって投与できるものである。したがって、たとえば、この
化合物を(たとえば許容可能な油に分散させたエマルジョンとして)好適なポリマ
ー材料または疎水性材料またはイオン交換樹脂を利用したり、難溶性塩などの難
溶性誘導体として処方してもよい。
【０６４６】 さらに、治療薬を含有する固体状疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの
徐放系を用いて化合物を送達してもよい。さまざまな徐放材料が構築されており
、当業者間で周知である。徐放カプセルは、その化学的な性質に応じて、数週間
から最大100日を上回る期間にわたって化合物を放出する。
【０６４７】 治療薬の化学的な性質および生物学的な安定性に応じて、タンパク質を安定化
させるための別のストラテジーを利用してもよい。
【０６４８】 この薬剤組成物は、好適な固体またはゲル相キャリアまたは賦形剤を含むもの
であってもよい。かかるキャリアまたは賦形剤の一例としては、炭酸カルシウム
、リン酸ホスフェート、さまざまな糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン
の他、ポリエチレングリコールなどのポリマーがあげられるが、これに限定され
るものではない。
【０６４９】 (有効量) 本発明で使用するのに適した薬剤組成物としては、意図した用途を達成するの
に合った有効量で活性成分が含有された組成物があげられる。具体的には、治療
有効量とは、治療対象となる被検体での症状の発症を妨害または既存の症状を軽
減するのに有効な量を意味する。有効量については、特に、本願明細書における
詳細な開示内容に鑑みて当業者間らが容易に求め得るものである。
【０６５０】 本発明の方法で用いる化合物のいずれについても、最初は細胞培養アッセイに
よって治療的有効量を推測し、続いて動物モデルにその用量を処方することが可
能である。こうした情報を利用して、人間に合った用量を一層正確に判定するこ
とが可能である。
【０６５１】 治療有効量とは、患者の症状を軽減できる化合物量を意味する。かかる化合物
の毒性および治療効率については、たとえばLD50(被検個体群の50%致死量)およ
びED50(個体群の50%有効量)を求めるための薬学分野で標準的な方法で細胞培養
物または実験動物にて求めることが可能である。毒性と治療効果との間の用量比
が治療係数であり、これはLD50とED50との比として表される。治療係数の高い化
合物が好ましい。
【０６５２】 人間で使用する用量の範囲を明確にする際に、上記の細胞培養アッセイおよび
動物研究によって得られるデータを利用することが可能である。かかる化合物の
用量は、毒性がほとんどないか全くない、LD50を含む循環濃度の範囲内にあるの
が好ましい。この範囲内であれば、利用する剤形やどの投与経路を用いるかに応
じて用量を変えてもよい。厳密な処方内容と投与経路、用量については、患者の
状態に鑑みて各医師による選択が可能である(たとえば、Fingl et al., 1975, "
The Pharmacological Basis Therapeutics", Ch.1を参照のこと)。
【０６５３】 (コンピュータ関係の実施形態) 本願明細書において、「本発明の核酸コード」という用語は、 a) 配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、8
0、90、100、150、200、500、1000または2000ヌクレオチドの連続スパンおよび
それらの相補体であって、前記連続スパンが、配列番号1のヌクレオチド位置31
〜292651および292844〜319608の少なくとも1つを含むものと、 b) 長さが特定の配列番号と整合する限りにおいて、配列番号54〜229のうち
いずれかの少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、
100、150、200、500、1000または2000ヌクレオチドの連続スパンおよびそれらの
相補体と、 c) 長さが特定の配列番号と整合する限りにおいて、配列番号2〜26、36〜40
の少なくとも8、12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、7
5、80、90、100または200ヌクレオチドの連続スパンまたはそれらの相補体と、 d) 配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、55、6
0、65、70、75、80、90または100ヌクレオチドの連続スパンまたはそれらの相補
体であって、前記連続スパンが、配列番号1のヌクレオチド位置として、 (i) 292653〜296047、292653〜292841、295555〜296047および295580〜29604
7、 (ii) 31〜1107、1108〜65853、1108〜1289、14877〜14920、18778〜18862、2
5593〜25740、29388〜29502、29967〜30282、64666〜64812、65505〜65853およ
び65854〜67854、 (iii) 94124〜94964、 (iv) 213818〜215818、215819〜215941、215819〜215975、216661〜216952、
216661〜217061、217027〜217061、229647〜229742、230408〜230721、231272〜
231412、231787〜231880、231870〜231879、234174〜234321、237406〜237428、
239719〜239807、239719〜239853、240528〜240569、240528〜240596、240528〜
240617、240528〜240644、240528〜240824、240528〜240994、240528〜241685、
240800〜240993および241686〜243685、 (v) 201188〜216915、201188〜201234、214676〜214793、215702〜215746お
よび216836〜216915 のうち少なくとも1つを含むものと、 e) A1〜A489からなる群から選択されるバイアレリックマーカーを含む、a)、
b)、c)またはd)の連続スパンと、 f) 配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、8
0、90、100、150、200、500、1000または2000ヌクレオチドの連続スパンまたは
それらの相補体であって、前記連続スパンが、下記の表1に列挙される配列番号1
のpos1〜pos166で示されるヌクレオチド位置の範囲のうちいずれか1つの少なく
とも1、2、3、5または10ヌクレオチド位置を含むものと、 g) 配列番号2〜26、36〜42、44〜48および52〜269のうちいずれかの少なくと
も12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500
、1000または2000ヌクレオチドの連続スパンおよびそれらの相補体であって、前
記スパンが、染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカー、領域Ｄ関連バイア
レリックマーカー、sbg1関連バイアレリックマーカー、g34665関連バイアレリッ
クマーカー、sbg2関連バイアレリックマーカー、g35017関連バイアレリックマー
カーまたはg35018関連バイアレリックマーカーを含むものと、 h) 配列番号2〜26、36〜40および54〜229のうちいずれかの少なくとも12、15
、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500、1000ま
たは2000ヌクレオチドの連続スパンおよびそれらの相補体であって、前記スパン
が、染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカー、領域Ｄ関連バイアレリック
マーカー、sbg1関連バイアレリックマーカー、g34665関連バイアレリックマーカ
ー、sbg2関連バイアレリックマーカー、g35017関連バイアレリックマーカーまた
はg35018関連バイアレリックマーカー(別のアレルが前記バイアレリックマーカ
ーに存在する)を含むものと、 i) 配列番号1のうちいずれかの少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40
、50、60、70、80、90、100、150、200、500、1000または2000ヌクレオチドの連
続スパンおよびそれらの相補体であって、前記スパンが、A1〜A69、A71〜A74、A
76〜A94、A96〜A106、A108〜A112、A114〜A177、A179〜A197、A199〜A222、A224
〜A242および361〜A489からなる群から選択される多型を含むものと、のうちい
ずれか1つを含む、実質的にこれからなる、またはこれからなる、ヌクレオチド
配列を包含する。
【０６５４】 また、「本発明の核酸コード」はさらに、配列番号1〜26、36〜40および54〜2
29の特定の配列と長さが整合する限りにおいて、少なくとも30、35、40、50、60
、70、80、90、100、150、200、500、1000または2000ヌクレオチドの連続スパン
に対して相同的であるヌクレオチド配列およびそれらの相補体を包含する。「本
発明の核酸コード」はまた、配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25、30、3
5、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90または100ヌクレオチドの連続スパ
ンまたはそれらの相補体に対して相同的であるヌクレオチド配列であって、前記
連続スパンが、配列番号1のヌクレオチド位置すなわち、 (i) 292653〜296047、292653〜292841、295555〜296047および295580〜29604
7、 (ii) 31〜1107、1108〜65853、1108〜1289、14877〜14920、18778〜18862、2
5593〜25740、29388〜29502、29967〜30282、64666〜64812、65505〜65853およ
び65854〜67854、 (iii) 94124〜94964、 (iv) 213818〜215818、215819〜215941、215819〜215975、216661〜216952、
216661〜217061、217027〜217061、229647〜229742、230408〜230721、231272〜
231412、231787〜231880、231870〜231879、234174〜234321、237406〜237428、
239719〜239807、239719〜239853、240528〜240569、240528〜240596、240528〜
240617、240528〜240644、240528〜240824、240528〜240994、240528〜241685、
240800〜240993および241686〜243685、 (v) 201188〜216915、201188〜201234、214676〜214793、215702〜215746お
よび216836〜216915のうち少なくとも1つを含むヌクレオチド配列を包含する。
【０６５５】 相同配列とは、これらの連続スパンに対して少なくとも99%、98%、97%、96%、
95%、90%、85%、80%または75%相同性である配列を意味する。相同については、B
LAST2Nをデフォルトのパラメーターで使用したり、いずれかのパラメーターを変
更して使用するなど、本願明細書に記載のいずれかの方法で判断できる。相同配
列には、本発明の核酸コードのチミンの代わりにウリジンがあるRNA配列を含ん
でもよい。本発明の核酸コードが、伝統的な一符号形式(Stryer, Lubert. Bioch
emistry, 第3版 W.H Freeman & Co., New Yorkの裏表紙の内側を参照のこと)ま
たは配列でのヌクレオチドの同一性を記録する他の任意の形式またはコードで表
現できることは理解できよう。
【０６５６】 本願明細書において、「配列番号27〜35および41〜43のポリペプチドコード」
という表現は、配列番号27〜35および41〜43のポリペプチド配列、配列番号27〜
35および41〜43のポリペプチドと相同なポリペプチド配列、あるいは、上記の配
列のうちいずれかのフラグメントを包含する。相同的ポリペプチド配列は、配列
番号27〜35および41〜43のポリペプチド配列のうちの1つと少なくとも99%、98%
、97%、96%、95%、90%、85%、80%または75%相同であるポリペプチド配列を意味
する。FASTAをデフォルトのパラメーターで使用したり、いずれかのパラメータ
ーを変更して使用するものをはじめとして、本願明細書にて説明したコンピュー
タプログラムおよびパラメータのいずれかを用いて、相同性を判定することがで
きる。本願明細書に記載のいずれかの方法を用いて、あるいは、上述したような
配列決定エラーの補正の結果として、相同配列を得ることができる。ポリペプチ
ドフラグメントは、配列番号27〜35および41〜43のポリペプチドの連続した少な
くとも4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100または150アミノ酸
を含む。好ましくは、このフラグメントは新規なフラグメントである。配列番号
27〜35および41〜43のポリペプチドコードについては、従来の一文字形式または
三文字形式(Stryer, Lubert. Biochemistry, 第3版 W.H Freeman & Co., New Yo
rkの裏表紙の内側を参照のこと)または配列におけるポリペプチドの相同性に関
する他の任意の形式で表現可能であることは理解できよう。
【０６５７】 配列番号1〜26、36〜40および54〜229の核酸コードおよび配列番号27〜35およ
び41〜43のポリペプチドコードは、コンピュータによる読み取りおよびアクセス
が可能な任意の媒体に格納、記録および操作が可能なものであることは、当業者
であれば理解できよう。本願明細書において、「記録された」および「格納され
た」という語は、コンピュータ媒体に情報を格納するプロセスを意味する。当業
者であれば、コンピュータ読み取り可能な媒体に情報を記録するための周知の方
法のうち任意のものを採用し、配列番号1〜26、36〜40および54〜229の核酸コー
ド1つまたはそれ以上、あるいは、配列番号27〜35および41〜43のポリペプチド
コード1つまたはそれ以上を有する実施形態を生成することが容易にできる。本
発明のもう1つの態様は、配列番号1〜26、36〜40および54〜229の核酸コードが
少なくとも2、5、10、15、20、25、30または50記録されたコンピュータ読取可能
な媒体である。本発明のもう1つの態様は、配列番号27〜35および41〜43のポリ
ペプチドコードが少なくとも2、5、10、15、20、25、30または50記録されたコン
ピュータ読取可能な媒体である。
【０６５８】 コンピュータ読取可能媒体としては、磁気的に読み取り可能な媒体、光学的に
読み取り可能な媒体、電子的に読み取り可能な媒体および磁気/光媒体があげら
れる。たとえば、コンピュータ読み取り可能な媒体としては、ハードディスク、
フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、CD-ROM、デジタル多用途ディス ク(DVD)、ランダムアクセスメモリ(RAM)またはリードオンリーメモリ(ROM)なら びに当業者間で周知の他の媒体などが利用できる。
【０６５９】 本発明の実施形態は、システムを含み、特に、本願明細書に記載された配列情
報を記録し、これを操作するコンピュータシステムを含む。コンピュータシステ
ム100の一例を図19にブロック図形式で示す。本願明細書において、「コンピュ
ータシステム」は、配列番号1〜26、36〜40および54〜229の核酸コードのヌクレ
オチド配列、配列番号27〜35および41〜43のポリペプチドコードのアミノ酸配列
の解析に使用される、ハードウェアコンポーネント、ソフトウェアコンポーネン
ト、データ記憶コンポーネントを意味する。一実施形態では、コンピュータシス
テム100は、Sun Enterprise 1000サーバー(カリフォルニア州パロアルト、サン
マイクロシステムズ)である。コンピュータシステム100は、配列データを処理し
、これにアクセスし、これを操作するためのプロセッサを備えるものであると好
ましい。プロセッサ105には、インテルから出ているPentium IIIの他、サン、モ
トローラ、コンパックまたはIBMから出ている同様のプロセッサなど、周知のど
のようなタイプの中央処理装置であっても利用することが可能である。
【０６６０】 コンピュータシステム100は、プロセッサ105と、データを格納するための1つ
またはそれ以上の内部データ記憶コンポーネント110と、データ記憶コンポーネ
ントに格納されたデータを検索するための1つまたはそれ以上のデータ検索デバ
イスとを備える汎用システムであると好ましい。当業者であれば、現在入手可能
なコンピュータシステムであればいずれも適したものであることを容易に理解で
きよう。
【０６６１】 特定の一実施形態では、コンピュータシステム100には、主記憶装置115(好ま
しくはRAMとして実装される)に接続されたバスに接続されたプロセッサ105、ハ
ードドライブおよび/またはデータが記録された他のコンピュータ読取可能媒体
などの、1つまたはそれ以上の内部データ記憶デバイス110が含まれる。いくつか
の実施形態では、コンピュータシステム100がさらに、内部データ記憶デバイス1
10に記憶されたデータを読み取るための1つまたはそれ以上のデータ検索デバイ
ス118を含む。
【０６６２】 データ検索デバイス118は、たとえば、フロッピーディスクドライブ、コンパ
クトディスクドライブ、磁気テープドライブなどであってもよい。いくつかの実
施形態では、内部データ記憶デバイス110が、フロッピーディスク、コンパクト
ディスク、磁気テープなどの、制御ロジックおよび/またはデータが記録された
コンピュータ読み取り可能なリムーバブルメディアである。コンピュータシステ
ム100は、データ検索デバイスに挿入された後でデータ記憶コンポーネントから
制御ロジックおよび/またはデータを読み取るための適当なソフトウェアを含む
かまたは適当なソフトウェアでプログラミングされたものであると都合がよいこ
とがある。
【０６６３】 コンピュータシステム100は、出力を表示してコンピュータのユーザに示すの
に用いられるディスプレー120を含む。また、コンピュータシステム100をネット
ワークまたはワイドエリアネットワーク内の他のコンピュータシステム125a〜c
とリンクさせ、コンピュータシステム100に対する中央アクセスを提供すること
も可能であることに注意されたい。
【０６６４】 配列番号1〜26、36〜40および54〜229の核酸コードのヌクレオチド配列、ある
いは配列番号27〜35および41〜43のポリペプチドコードのアミノ酸配列にアクセ
スしてこれを処理するためのソフトウェア(サーチツール、比較ツール、モデリ
ングツールなど)を実行時に主記憶装置115に常駐させておいてもよい。
【０６６５】 いくつかの実施形態では、コンピュータシステム100がさらに、コンピュータ
読取可能媒体に格納された上記の配列番号1〜26、36〜40および54〜229の核酸コ
ードまたは配列番号27〜35および41〜43のポリペプチドコードと、コンピュータ
読取可能媒体に格納された参照ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列とを比
較するための配列コンペアラを備えるものであってもよい。「配列コンペアラ」
は、コンピュータシステム100に実装され、ヌクレオチド配列またはポリペプチ
ド配列と、配列または構造がデータ記憶手段の中に格納された他のヌクレオチド
配列またはポリペプチド配列および/またはペプチド類、ペプチドを模倣した物
質および化学物質を含むがこれに限定されるものではない化合物とを比較する1
つまたはそれ以上のプログラムを意味する。たとえば、配列コンペアラは、コン
ピュータ読取可能媒体に記憶された配列番号1〜26、36〜40および54〜229の核酸
コードのヌクレオチド配列または配列番号27〜35および41〜43のポリペプチドコ
ードのアミノ酸配列と、コンピュータ読取可能媒体に記憶された参照配列とを比
較し、相同性、生物学的機能と関係のあるモチーフまたは構造的なモチーフを特
定するものであってもよい。本願特許明細書の他の部分で述べるさまざまな配列
コンペアラのプログラムは、特に本発明の態様で使用することを意図したもので
ある。
【０６６６】 図20は、新たな配列とデータベースに格納された配列との間の相同性レベルを
判定すべく、新たなヌクレオチド配列またはタンパク質配列と、配列のデータベ
ースとを比較するためのプロセス200の一実施形態を示す流れ図である。配列の
データベースは、コンピュータシステム100に記憶されたプライベートなデータ
ベースであっても、インターネット経由で利用できるGENBANKやPIR OR SWISSPRO
Tなどの公共データベースであってもよい。
【０６６７】 プロセス200は、開始状態201で開始された後、比較対象となる新たな配列をコ
ンピュータシステム100のメモリに記憶する状態202に移る。上述したように、メ
モリは、RAMまたは内部記憶デバイスをはじめとして、どのようなタイプのメモ
リであってもよい。
【０６６８】 プロセス200は、解析および比較を行うべく配列のデータベースを開く状態204
に移る。プロセス200は、データベースに記憶された第1の配列をコンピュータ上
のメモリに読み出す状態206に移る。続いて状態210で比較が実行され、第1の配
列が第2の配列と同一であるか否かが判定される。このステップは新たな配列と
データベース内の第1の配列との厳密な比較に限定されるものではない点に注意
することが重要である。2つのヌクレオチドまたはタンパク質配列が同一でない
場合であっても、これらの配列同士を比較するための周知の方法は当業者間で周
知である。たとえば、2つの被検配列間の相同性レベルを高めるために、一方の
配列にギャップを導入することが可能である。比較時にギャップまたは他の特徴
を配列に導入するか否かを制御するパラメータは一般に、コンピュータシステム
のユーザが入力するものである。
【０６６９】 状態210で2つの配列の比較を行った後、判断状態210では2つの配列が同一であ
るか否かの判定がなされる。もちろん、「同一」という用語は、完全に同一であ
る配列に限定されるものではない。ユーザが入力した相同性パラメータ内にある
配列はプロセス200では「同一である」とされる。
【０６７０】 2つの配列が同一であるという判定がなされると、プロセス200は、データベー
スから取得した配列名を表示してユーザに示す状態214に移る。この状態では、
名称の表示された配列は入力された相同性の制約を満たすものであることがユー
ザに通知される。格納された配列の名称をユーザに対して表示すると、プロセス
200は、データベース内に他の配列が残っているか否かを判定する判断状態218に
移る。データベース内に他に配列が残っていなければ、プロセス200は終了状態2
20で終了する。しかしながら、データベース内にまだ配列がある場合は、プロセ
ス200は、データベース内の次の配列にポインタを移動し、これを新たな配列と
比較できるようにする状態224に移る。このようにして、新たな配列を整列させ
、データベース内の各配列と比較する。
【０６７１】 判断状態212で配列が相同ではなかったという判定がなされると、プロセス200
は、データベース内の他の配列を比較に利用できるか否かを判定すべく、すぐに
判断状態218に移ることに注意されたい。
【０６７２】 したがって、本発明の一態様は、プロセッサと、配列番号1〜26、36〜40およ
び54〜229の核酸コードまたは配列番号27〜35および41〜43のポリペプチドコー
ドが格納されたデータ記憶デバイスと、配列番号1〜26、36〜40および54〜229の
核酸コードまたは配列番号27〜35および41〜43のポリペプチドコードと比較され
る参照ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が検索可能な状態で格納された
データ記憶デバイスと、比較を実行するための配列コンペアラとを備えるコンピ
ュータシステムである。配列コンペアラは、比較する配列同士の相同性レベルを
示すものであってもよいし、あるいは、上述した配列番号1〜26、36〜40および5
4〜229の核酸コードおよび配列番号27〜35および41〜43のポリペプチドコードの
構造的なモチーフを特定するものであってもよい。また、配列コンペアラは、こ
れらの核酸コードおよびポリペプチドコードと比較される配列における構造的な
モチーフを特定するものであってもよい。いくつかの実施形態では、配列番号1
〜26、36〜40および54〜229の核酸コードまたは配列番号27〜35および41〜43の
ポリペプチドコードの少なくとも2、5、10、15、20、25、30または50の配列をデ
ータ記憶デバイスに記憶することができる。
【０６７３】 本発明のもう1つの態様は、配列番号1〜26、36〜40および54〜229の核酸コー
ドと参照ヌクレオチド配列との相同性レベルを判断するための方法であって、相
同性レベルを判断するコンピュータプログラムを用いて核酸コードと参照ヌクレ
オチド配列とを読み取るステップと、コンピュータプログラムを使用して核酸コ
ードと参照ヌクレオチド配列との相同性を判断するステップと、を含む方法であ
る。このコンピュータプログラムは、相同性レベルを判定するためのさまざまな
コンピュータプログラムのうち任意のものであればよく、BLAST2Nをデフォルト
のパラメーターで使用したり、いずれかのパラメーターを変更して使用するもの
など、本願明細書に具体的に列挙するものを含む。この方法は、上述したコンピ
ュータシステムを用いて実現可能なものである。また、コンピュータプログラム
を用いて上述した配列番号1〜26、36〜40および54〜229の核酸コードを2、5、10
、15、20、25、30または50読み取り、核酸コードと参照ヌクレオチド配列との相
同性を判定して上記の方法を実施してもよい。
【０６７４】 図21は、2つの配列が相同であるか否かを判定するためのコンピュータにおけ
るプロセス250の一実施形態を示す流れ図である。プロセス250は、開始状態252
で開始された後、比較対象となる第1の配列をメモリに記憶する状態254に移る。
次に、比較対象の第2の配列が状態256でメモリに記憶される。その後、プロセス
250は、第1の配列の第1の文字を読み取る状態260、続いて第2の配列の第1の文字
を読み取る状態262に移る。配列がヌクレオチド配列である場合、この文字は通
常、A、T、C、GあるいはUのいずれか1つであることは理解できよう。配列がタン
パク質配列である場合、第1の配列と第2の配列とを容易に比較できるように、こ
れは単一文字アミノ酸コードとすべきものであろう。
【０６７５】 続いて、判定状態264において、これらの2つの文字が同一であるか否か判定さ
れる。同一である場合、プロセス250は、第1の配列および第2の配列の次の文字
を読み取る状態268に移る。続いて、次の文字が同一であるか否か判定される。
同一である場合、プロセス250は、2つの文字が異なるまでループ処理を継続する
。次の2文字が異なっているという判定がなされると、プロセス250は状態274に
移り、いずれかの配列に読み取るべき文字が他にあるか否か判定する。
【０６７６】 読み取るべき文字がない場合、プロセス250は、第1の配列と第2の配列との間
の相同性レベルを表示してユーザに示す状態276に移る。相同性レベルは、第1の
配列における配列の総数に対する同一配列間の文字の比率を算出して求められる
。したがって、最初の100ヌクレオチド配列のすべての文字が第2の配列のすべて
の文字と整列配置された場合、相同性レベルは100%となる。
【０６７７】 あるいは、コンピュータプログラムは、本発明の核酸コードのヌクレオチド配
列と参照ヌクレオチド配列とを比較し、1つまたはそれ以上の位置で配列番号1〜
26、36〜40および54〜229の核酸コードが参照ヌクレオチド配列と異なっている
か否かを判断するコンピュータプログラムであってもよい。任意に、かかるプロ
グラムは、参照ポリヌクレオチドの配列または配列番号1〜26、36〜40および54
〜229の核酸コードの配列に対する、挿入、欠失または置換されたヌクレオチド
の長さおよび同一性を記録する。一実施形態では、コンピュータプログラムは、
配列番号1〜26、36〜40および54〜229の核酸コードのヌクレオチド配列が、参照
ヌクレオチド配列に対するバイアレリックマーカーまたは単一ヌクレオチド多型
(SNP)を含むか否かを判断するプログラムであってもよい。これらの単一のヌク
レオチド多型は、一塩基置換、挿入、または欠失を有するものであってもよいが
、バイアレリックマーカーは、約1〜10の連続した塩基置換、挿入または欠失を
含むものであってもよい。
【０６７８】 本発明のもう1つの態様は、配列番号27〜35および41〜43のポリペプチドコー
ドと参照ポリペプチド配列との相同性レベルを判断するための方法であって、相
同性レベルを判断するコンピュータプログラムを用いて配列番号27〜35および41
〜43のポリペプチドコードと参照ポリペプチド配列とを読み取るステップと、コ
ンピュータプログラムを使用してポリペプチドコードと参照ポリペプチド配列と
の相同性を判断するステップと、を含む方法である。
【０６７９】 したがって、本発明のもう1つの態様は、配列番号1〜26、36〜40および54〜22
9の核酸コードが1つまたはそれ以上のヌクレオチドで参照ヌクレオチド配列と異
なっているか否かを判断するための方法であって、核酸配列同士の差を識別する
コンピュータプログラムを用いて核酸コードと参照ヌクレオチド配列とを読み取
るステップと、コンピュータプログラムを使用して、核酸コードと参照ヌクレオ
チド配列との差を識別するステップと、を含む方法である。いくつかの実施形態
では、コンピュータプログラムが、単一ヌクレオチド多型を同定するプログラム
である。この方法は、上述したコンピュータシステムおよび図21に示す方法で実
現可能なものである。また、コンピュータプログラムを用いて配列番号1〜26、3
6〜40および54〜229の核酸コード少なくとも2、5、10、15、20、25、30または50
と参照ヌクレオチド配列とを読み取り、コンピュータプログラムを使用して核酸
コードと参照ヌクレオチド配列との差を識別することによって上記の方法を実施
してもよい。
【０６８０】 他の実施形態では、コンピュータベースのシステムに、配列番号1〜26、36〜4
0および54〜229の核酸コードのヌクレオチド配列または配列番号27〜35および41
〜43のポリペプチドコードのアミノ酸配列の特徴を識別するためのアイデンティ
ファイアをさらに備えてもよい。
【０６８１】 「アイデンティファイア」は、上述した配列番号1〜26、36〜40および54〜229
の核酸コードのヌクレオチド配列または配列番号27〜35および41〜43のポリペプ
チドコードのアミノ酸配列の特定の特徴を識別する1つまたはそれ以上のプログ
ラムを意味する。一実施形態では、アイデンティファイアは、配列番号2〜26お
よび36〜40のcDNAコードの読み枠を識別するプログラムを含むものであってもよ
い。
【０６８２】 図22は、配列において特徴の存在を検出するアイデンティファイアプロセス30
0の一実施形態を示す流れ図である。プロセス300は開始状態302で開始され、特
徴について確認される最初の配列がコンピュータシステム100のメモリ115に記憶
される状態304に移る。その後、プロセス300は、配列の特徴データベースがオー
プンされる状態306に移る。このようなデータベースは、各特徴の名称に加えて
その特徴の属性のリストを含む。たとえば、特徴名は「開始コドン」とすること
ができ、属性は「ATG」となる。他の例として、特徴名「TAATAA Box」および特
徴属性「TAATAA」があげられる。このようなデータベースの一例が、ウィスコン
シン大学遺伝コンピュータグループ(www.gcg.com)によって作られている。
【０６８３】 特徴のデータベースが状態306で開かれた後、プロセス300は、第1の特徴がデ
ータベースから読み出される状態308に移る。その後、状態310において、第1の
特徴の属性と第1の配列とを比較する。次に、判定状態316において、特徴の属性
が第1の配列にあったか否か判定される。属性が見つかった場合、プロセス300は
、見つかった特徴の名称を表示してユーザに示す状態318に移る。
【０６８４】 その後、プロセス300は、移動の特徴がデータベースに存在するか否かを判定
する判定状態320に移る。それ以上特徴が存在しない場合、プロセス300は終了状
態324で終了する。しかしながら、他の特徴がデータベースに存在する場合は、
プロセス300は、状態326で次の配列の特徴を読み出し、状態310に戻って次の特
徴の属性と第1の配列とを比較する。
【０６８５】 判定状態316で特徴の属性が第1の配列に見つからなかった場合は、プロセス30
0は判定状態320に直接移り、データベースにまだ特徴が残っているか否かを判定
することに注意されたい。
【０６８６】 もう1つの実施形態では、アイデンティファイアは、配列番号27〜35および41
〜43のポリペプチドコードの三次元構造を決定する、分子モデリングプログラム
を含むものであってもよい。いくつかの実施形態では、分子モデリングプログラ
ムは、周知の三次元タンパク質構造の残基の構造環境を表すプロフィールに最も
近い標的配列を同定する(たとえば、1995年7月25日発行、Eisenberg et al.の米
国特許第5,436,850号を参照のこと)。他の手法では、特定ファミリのタンパク質
の周知の三次元構造を重畳し、そのファミリで構造的に保存された領域を定義す
る。このタンパク質モデリング手法でも相同タンパク質の周知の三次元構造を使
用し、配列番号4〜8のポリペプチドコードの構造に近いものを得ている。(たと
えば、1996年9月18日発行、Srinivasan, et al.の米国特許第5,557,535号を参照
のこと)。従来の相同性モデリング手法を定法で使用し、プロテアーゼおよび抗
体のモデルを構築した(Sowdhamini et al., Protein Engineering 10:207, 215(
1997))。興味の対象であるタンパク質と鋳型タンパク質との間の配列同一性が少
ない場合、比較による方法を用いて三次元のタンパク質モデルを開発することが
できる。場合によっては、タンパク質の配列相同性が極めて少ないにもかかわら
ず、これらのタンパク質が折り畳まれて同様の三次元構造になることもある。た
とえば、配列相同性は少ないが、多数のらせん状サイトカインの三次元構造が折
り畳まれて同様の三次元トポロジーになる。
【０６８７】 近年におけるThreading法の開発によって、標的と鋳型との間の構造的な関連
性が配列レベルでは検出できない場合に、同様の折り畳みパターンをさまざまな
状況で同定することができる。Multiple Sequence Threading(MST)を用いて折り
畳みを認識するハイブリッド法では、距離幾何学プログラムDRAGONを用いてThre
adingでの出力から構造同値を推論し、低解像度モデルを構築し、QUANTAなどの
分子モデリングパッケージを用いて全原子表現を構築する。
【０６８８】 この3ステップ法によれば、複数の整列配置配列の立体構造を同時に1つまたは
それ以上の3D構造で実施できる新規な折り畳み認識アルゴリズムMSTを用いて、
まず候補鋳型を同定する。第2のステップでは、MST出力から得られる構造当量を
残基間距離抑制値に変換し、これを二次構造予測で得られた補助情報と共に距離
幾何学プログラムDRAGONに供給する。このプログラムは、公平な方法で抑制値を
組み合わせ、多数の低解像度モデルコンホメーションをすみやかに生成する。第
3のステップでは、これらの低解像度モデルコンホメーションを全原子モデルに
変換し、分子モデリングパッケージQUANTAを用いてエネルギ最小化を行う(Aszod
i et al., Proteins:Structure, Function, and Genetics, Supplement 1:38-42
(1997)などを参照のこと)。
【０６８９】 分子モデリング解析の結果を合理的な医薬品設計手法に使用して、配列番号27
〜35および41〜43のポリペプチドコードの活性を変調する薬剤を同定することが
できる。
【０６９０】 したがって、本発明の他の態様は、配列番号1〜26、36〜40および54〜229の核
酸コードまたは配列番号27〜35および41〜43のポリペプチドコードの特徴の同定
方法であって、コード内の特徴を識別するコンピュータプログラムを使用して、
核酸コードまたはポリペプチドコードを読み出すステップと、核酸コードまたは
ポリペプチドコード内の特徴をコンピュータプログラムによって識別するステッ
プと、を含む。一実施形態では、コンピュータプログラムは、読み枠を同定する
コンピュータプログラムを含む。さらに他の実施形態では、コンピュータプログ
ラムは、ポリペプチド配列の構造モチーフを同定する。他の実施形態では、コン
ピュータプログラムは、分子モデリングプログラムを含む。コンピュータプログ
ラムを使用して、単一の配列または配列番号1〜26、36〜40および54〜229の核酸
コードまたは配列番号27〜35および41〜43のポリペプチドコード少なくとも2、5
、10、15、20、25、30または50を読み出し、コンピュータプログラムを使用して
、核酸コードまたはポリペプチドコードの特徴を識別することによって、上記の
方法を実施してもよい。
【０６９１】 配列番号1〜26、36〜40および54〜229の核酸コードまたは配列番号27〜35およ
び41〜43のポリペプチドコードについては、さまざまな形式でさまざまなデータ
処理装置プログラムに記憶して操作することが可能である。たとえば、配列番号
1〜26、36〜40および54〜229の核酸コードまたは配列番号27〜35および41〜43の
ポリペプチドコードを、MicrosoftWORDまたはWORDPERFECTなどのワードプロセッ
サ用のファイルとしてテキスト形式で記憶できる。あるいは、DB2、SYBASE、ORA
CLEなどの当業者間で周知のさまざまなデータベースプログラムでASCIIファイル
として記憶してもよい。また、配列コンペアラ、アイデンティファイア、あるい
は配列番号1〜26、36〜40および54〜229の核酸コードまたは配列番号27〜35およ
び41〜43のポリペプチドコードとの比較に用いられる参照ヌクレオチド配列また
はポリペプチド配列のソースとして、多くのコンピュータプログラムおよびデー
タベースを利用できる。以下、本発明を限定するものではないが、配列番号1〜2
6、36〜40および54〜229の核酸コードまたは配列番号27〜35および41〜43のポリ
ペプチドコードと併用するのに有用なプログラムおよびデータベースの参考とし
て一覧をあげておく。使用可能なプログラムおよびデータベースとしては、MacP
attern(EMBL)、DiscoveryBase(Molecular Applications Group)、GeneMine(Mole
cular Applications Group)、Look(Molecular Applications Group)、MacLook(M
olecular Applications Group)、BLAST and BLAST2(NCBI)、BLASTN and BLASTX(
Altschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403(1990))、FASTA(Pearson and Lipman,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444(1988))、FASTDB(Brutlag et al. Comp
. App. Biosci. 6:237-245, 1990)、Catalyst(Molecular Simulations Inc.)、C
atalyst/SHAPE(Molecular Simulations Inc.)、Cerius2.DBAccess(Molecular Si
mulations Inc.)、HypoGen(Molecular Simulations Inc.)、Insight II、(Molec
ular Simulations Inc.)、Discover(Molecular Simulations Inc.)、CHARMm(Mol
ecular Simulations Inc.)、Felix(Molecular Simulations Inc.)、DelPhi、(Mo
lecular Simulations Inc.)、QuanteMM、(Molecular Simulations Inc.)、Homol
ogy(Molecular Simulations Inc.)、Modeler(Molecular Simulations Inc.)、IS
IS(Molecular Simulations Inc.)、Quanta/Protein Design(Molecular Simulati
ons Inc.)、WebLab(Molecular Simulations Inc.)、WebLab Diversity Explorer
(Molecular Simulations Inc.)、Gene Explorer(Molecular Simulations Inc.)
、SeqFold(Molecular Simulations Inc.)、EMBL/Swissprotein Database、MDL A
vailable Chemicals Directory Database、MDL Drug Data Report Database、Co
mprehensive Medicinal Chemistry Database、Derwents's World Drug Index Da
tabase、BioByteMasterFile Database、Genbank Database、Genseqn Databaseが
あげられるが、これに限定されるものではない。本願明細書の開示内容から、当
業者であれば他の多くのプログラムおよびデータベースについても分かるであろ
う。
【０６９２】 上記のプログラムで検出可能なモチーフとしては、ロイシンジッパー、らせん
ターンらせんモチーフ、グリコシル化部位、ユビキチン結合部位、αらせんおよ
びβシートをコードする配列、コードされたタンパク質の分泌を指示するシグナ
ルペプチドをコードするシグナル配列、ホメオボックス、酸性伸展、酵素活性化
部位、基質結合部位および酵素切断部位などの転写調節に関与する配列があげら
れる。
【０６９３】 本願明細書全体を通して、さまざまな刊行物や特許公報、特許出願公開公報を
引用している。かかる刊行物や特許公報、公開特許明細書一切の開示内容全体を
本願の開示内容に援用し、本発明が属する技術分野の状況を一層明らかにする。
【０６９４】 （実施例） 本発明の方法のうちのいくつかを以下の実施例において説明する。これらの実
施例は一例にすぎず、本発明を限定するものではない。本願明細書において記載
する本発明には、その趣旨および範囲を逸脱することなくさまざまな修正および
変更を施すことが可能であり、かかる限定は添付の特許請求の範囲に記載されて
いる内容によってのみなされる。
【０６９５】 (実施例1) (バイアレリックマーカーの同定−DNA抽出) 血縁がなく健常なドナーを用いた。ドナーは異種個体群を代表するものとして
十分な多様性を呈していた。100名の個体からDNAを抽出し、バイアレリックマー
カーを検出するために試験を行った。
【０６９６】 各ドナーからEDTAの存在下で辺縁末梢静脈血30mlを採取した。2000rpmで10分
間遠心後に細胞(ペレット)を収集した。溶解液(最終容積50ml、トリス10mM、pH7
.6、MgCl2 5mM、NaCl 10mM)で赤血球を溶解した。溶解液中にペレットの懸濁液
を再懸濁させた後、上澄み中に残留している赤血球を除去するのに必要な回数だ
けこの溶液を遠心(10分間、2000rpm)した。
【０６９７】 白血球のペレットを以下の組成を有する溶解液3.7mlで42℃で終夜溶解した。 - 3ml TE 10-2(Tris-HCl 10mM、EDTA 2mM)/ NaCl 0 4 M - 200μl SDS 10% - 500μl K-プロテイナーゼ(TE 10-2 /NaCl 0.4M中にK-プロテイナーゼ2mg)
【０６９８】 タンパク質を抽出するために、1ml飽和NaCl(6M)(1/3.5v/v)を添加した。強く
撹拌した後、溶液を1000rpmで20分間遠心した。
【０６９９】 DNAを沈降させるために、100%エタノール2〜3容量を上記の上澄みに添加し、
この溶液を2000rpmで30分間遠心した。DNA溶液を70%エタノールで3回洗浄して塩
を除去し、2000rpmで20分間遠心した。ペレットを37℃で乾燥させ、TE 10-1を1m
lまたは水1mlの中に再懸濁させた。260nmODを測定することによって(1単位OD＝5
0μg/ml DNA)、DNA濃度を評価した。DNA溶液中にタンパク質が存在すると判断す
るために、OD 260/OD 280の比を求めた。後述する以後のステップではOD 260/OD
280比が1.8〜2の間にあるDNA沈降物のみを使用した。
【０７００】 各個体から得たDNAを等量ずつ混合してプールを作出した。
【０７０１】 (実施例2) (バイアレリックマーカーの同定: ゲノムDNAのPCRによる増幅) 先に得たDNAのプールについて、実施例1のDNA試料の特異的ゲノム配列を増幅
した。また、50個体の試料を同様に増幅した。 下記のプロトコルでPCRアッセイを行った。 最終容積 25μl DNA 2ng/μl MgCl2 2mM dNTP(各々) 200μM プライマー(各々) 2.9ng/μl Ampli Taq Gold DNAポリメラーゼ 0.05単位/μl PCR緩衝液(10×=0.1M TrisHCl pH8.3 0.5M KCl) 1×
【０７０２】 本願明細書に開示する配列番号1〜26、36〜40および54〜229のゲノムＤＮＡ配
列の配列情報と、OSPソフトウェア(Hillier & Green, 1991)とを用いて第1のプ
ライマーの対をそれぞれ設計した。この第1のプライマー対は約20ヌクレオチド
長であり、表6aの「配列番号ごとの増幅プライマーの位置範囲」欄および「配列
番号ごとの増幅プライマーの相補的位置範囲」欄に開示する配列を有するもので
あった。
【０７０３】
【表１３】
【０７０４】 好ましくは、プライマーは、配列決定に有用である、増幅対象の特異塩基の上
流に共通のオリゴヌクレオチドの尾を含むものであった。
【０７０５】 「配列番号ごとの増幅プライマーの位置範囲」欄のプライマーはさらに、PU 5
'配列:TGTAAAACGACGGCCAGT(配列番号126)を含んでいる。「配列番号ごとの増幅
プライマーの相補的位置範囲」欄のプライマーは、RP5'配列:CAGGAAACAGCTATGAC
C(配列番号127)を含んでいる。
【０７０６】 GENSET UFPS 24.1合成機において、ホスホラミダイト法によってこれらのプラ
イマーを合成した。
【０７０７】 Genius IIサーモサイクラーでDNA増幅を行った。95℃で10分間加熱した後、40
サイクルを実施した。各サイクルの構成は、95℃で30秒、54℃で1分、72℃で30
秒である。最終的な伸長のために、72℃で10分間で増幅を終了した。蛍光計およ
びインターカレート剤(分子プローブ)としてのPicogreenを用いて、96穴マイク
ロタイタープレート上で、どの程度の量の増幅産物が得られたのかを判断した。
【０７０８】 (実施例3) (多型の同定) a) 実施例2の増幅ゲノムDNAからのバイアレリックマーカーの同定 実施例2で得られた増幅DNAの配列決定をABI 377シークエンサで実施した。ダ
イターミネーターでのサイクル配列決定プロトコルを用いた自動ジデオキシター
ミネーター塩基配列決定反応によって、増幅産物の配列を判断した。配列決定反
応の産物を配列決定ゲルにかけ、ゲル画像委解析(ABI Prism DNA Sequencing An
alysisソフトウェア(バージョン2.1.2))を利用して配列を求めた。
【０７０９】 増幅フラグメントでのバイアレリックマーカーの有無を検出すべく、配列デー
タをさらに評価した。上述したように同一位置に異なる塩基が座位することで生
じる電気泳動パターンのピークの重畳の有無に基づいて多型探査を行った。 増幅のフラグメントで検出されたバイアレリックマーカーの局在位置は以下の
表6bに示すとおりである。
【０７１０】
【表１４】
【０７１１】 上記にて示したように、本発明の特定のバイアレリックマーカーは挿入または
欠失である。特に、上記の表6bにおけるヌクレオチドAGAT(A223、バイアレリッ
クマーカー8-111-301)の欠失は、AGATモチーフが1つだけ欠失している場合もあ
れば、AGATモチーフが2つ以上欠失している場合もある。したがって、このマー
カー(A223)もマイクロサテライトマーカーとして機能し得るものである。
【０７１２】 BMは「バイアレリックマーカー」を示す。all1およびall2はそれぞれ、バイア
レリックマーカーのアレル1およびアレル2を示す。
【０７１３】 b) オーバーラッピングBACから得たゲノムDNAを比較することによる多型の同
定 同一のDNAドナー試料由来の複数のBACから得られ、配列番号1のゲノムDNA領域
でオーバーラップしているゲノムDNAを配列決定した。このとき、ABI 377シーク
エンサで配列決定を実施した。ダイターミネーターでのサイクル配列決定プロト
コルを用いた自動ジデオキシターミネーター塩基配列決定反応によって、増幅産
物の配列を判断した。配列決定反応の産物を配列決定ゲルにかけ、ゲル画像委解
析(ABI Prism DNA Sequencing Analysisソフトウェア(バージョン2.1.2))を利用
して配列を求めた。
【０７１４】 配列番号1のオーバーラップしている領域から得た配列データを評価し、配列
多型の存在を検出した。これらの配列を比較することで、単一のヌクレオチド置
換および欠失ならびに複数のヌクレオチド欠失を含む配列多型を同定した。これ
らの多型の配列番号1内での局在位置を以下の表6cに示す。
【０７１５】
【表１５】
【０７１６】 (実施例4) (マイクロシークエンシングによる多型の確認) 実施例3aで同定したバイアレリックマーカーをさらに確認し、マイクロシーク
エンシングによってそれぞれの頻度を判断した。マイクロシークエンシングを実
施したのは実施例1で述べた各個体のDNA試料であった。
【０７１７】 バイアレリックマーカーの検出について上述したようにして、同一のプライマ
ーセットを使用し、PCRによって個体をゲノムDNAから増幅した(表6a)。
【０７１８】 マイクロシークエンシングで使用する好ましいプライマーは約19ヌクレオチド
長であり、考慮対象の多型塩基のすぐ上流でハイブリダイズされた。本発明によ
れば、表6dに列挙したとおりのプライマーをマイクロシークエンシングに利用す
る。
【０７１９】
【表１６】
【０７２０】 Mis 1およびMis 2はそれぞれ、本発明のヌクレオチド配列のコード鎖または非
コード鎖とハイブリダイズされたマイクロシークエンシングプライマーを示す。
【０７２１】 マイクロシークエンシング反応を次のようにして実施した。
【０７２２】 増幅産物の精製後、製造業者からの指示に従って、マイクロシークエンシング
オリゴヌクレオチド10pmolと、1 U Thermosequenase(アマシャムE79000G)と、Th
ermosequenase緩衝液(260mMトリスHCl pH 9.5、65mM MgCl2)1.25μlと、各被検
バイアレリックマーカーの多型部位でヌクレオチドと相補的な2種類の適切な蛍
光ddNTP(パーキンエルマー、ダイターミネーターセット401095)とを、最終容量2
0μlで添加することによってマイクロシークエンシング反応混合物を調製した。
94℃で4分間の後、Tetrad PTC-225サーモサイクラー(MJリサーチ)にて、55℃で1
5秒、72℃で5秒、94℃で10秒のPCRサイクルを20回実施した。続いて、取込まれ
なかったダイターミネーターをエタノール沈降によって除去した。最後に、試料
をホルムアミド-EDTA添加液に再懸濁させ、95℃で2分間加熱した後、ポリアクリ
ルアミド配列決定用ゲルに添加した。ABIプリズム377 DNAシークエンサーでデー
タを収集し、遺伝子SCANソフトウェア(パーキンエルマー)を用いて処理した。
【０７２３】 ゲル解析に続いて、各増幅フラグメントに存在するバイアレリックマーカーの
アレルの判定を可能にするソフトウェアでデータを自動的に処理した。
【０７２４】 このソフトウェアは、上記のマイクロシークエンシング法によって得られるシ
グナルの強度が、弱い、標準、飽和、あるいはシグナルが曖昧かといった要因を
評価するものである。また、このソフトウェアは著しいピーク(形状および高さ
の判定条件による)を特定する。有意なピークの中から、標的部位に対応するピ
ークをそれらの位置に基いて特定する。有意なピーク2つが同じ位置について検
出された場合、高さ比に基いて各試料を同型接合あるいはヘテロ接合のタイプと
して分類する。
【０７２５】 (実施例5a) (精神分裂病と本発明のバイアレリックマーカーとの間の関連性解析) (羅患個体および未羅患個体からのDNA試料の収集) A) 羅患個体群 試料についてはすべて、ケベック州のホスピタルセンターで1995年10月から19
97年4月にかけて行われた精神分裂病についての大規模な疫学的研究のなかで収
集した。コーカソイドのフランス人個体から個体群を構成し、研究の設計時には
症例患者とその一親等の近親(親または兄弟姉妹)2名とを確認した。
【０７２６】 全体として、以下の組み入れ基準に従って956名の精神分裂病症例を確認した
。 −精神科医による診断がなされたこと。 −一過性の躁鬱精神病または鬱障害に羅患した個体を除外するために、漸増時
前に少なくとも3年間診断がなされたこと。 −患者の先祖が少なくとも6世代にわたってケベック州に居住していたこと。 −近親者2名から血液試料を採取可能であること。 確認できた956例の精神分裂病症例のうち、以下の理由から834の個体を解析に
利用した。 −組み入れた個体症例については、DSM-IV(精神障害の診断と統計マニュアル
、第4版、1994年改訂、アメリカ精神医学会出版)に従って精神分裂病の診断を行
った。 −分裂情動性障害に羅患した個体から得られた試料を除外した。 −緊張型精神分裂病に羅患した個体も精神分裂病症例の個体群からは除外した
。 −鬱状態または気分障害に羅患した一親等の近親者1人または二親等の近親者
が2人以上いる個体も除外した。 −症状の発症前に重篤な頭部外傷や重篤なobstretical complications、脳炎
または髄膜炎の既往歴のある個体も除外した。 −癲癇に羅患している患者および鎮痙治療を受けている患者も精神分裂病症例
の個体群から除外した。
【０７２７】 発症年齢は組み入れ基準に含めずにおいた。
【０７２８】 B) 未羅患個体群 対照例の方は以下の累積基準(cumulative criteria)に基づいてそれぞれ確認
した。 −精神分裂病または他の精神病性障害に一切羅患していない個体であること。 −年齢35歳以上の個体であること。 −フランス系コーカソイド個体群に属する個体であること。 −血液試料の入手が可能な一親等の近親者が1人または2人いる個体であること
。
【０７２９】 可能な場合は症例の性別と対照とを比較した。
【０７３０】 C) 関連性解析用に選択した症例個体群および対照個体群 解析用に保持した未羅患個体群を241の個体で構成した。また、臨床研究の初
期試料を215の症例と214の対照とで構成した。対照は男性116例と女性98例、症
例は男性154例と女性64例であった。各対照について、一親等の近親者(父、母、
姉妹および兄弟)を研究に利用することができた。症例の性別と対照の性別とを
一致させるために、両親が精神分裂病または他の精神病に羅患していないことが
明らかな場合に可能な範囲で女性の対照と女性の対照の両親とを入れ替えた。こ
れによって、女性の対照27例がそれぞれの両親と入れ替えられ、結果として対照
試料のサイズは241個体となった。対照試料の内訳は以下の表7に詳細に示したと
おりである。
【０７３１】
【表１７】
【０７３２】 上記にて詳細に説明した個体群から個体を無作為に選択し、以下の表8に詳細
に示す個体群サイズで下記のような関連性データを得た。
【０７３３】
【表１８】
【０７３４】 症例個体群および対照個体群の両方が含まれるようにして、分かっている共通
の先祖がいない、互いに血縁関係のない個体からなる2つのグループを形成する
。さらに、精神分裂病または精神分裂障害の家族歴のない人々から対照個体群の
個体を選択した。
【０７３５】 (羅患個体および対照個体の遺伝子型判定) A) 遺伝子型判定の結果 関連性解析を行うための汎用的なストラテジーは、上述した個体群各々に含ま
れるすべての個体から得たDNA試料を個々にスキャンし、上述したバイアレリッ
クマーカー、特に、本発明のバイアレリックマーカーの、これらの個体群各々に
属する被検個体の複相ゲノム(diploid genome)でのアレル頻度を求めることであ
った。
【０７３６】 各個体から得たDNA試料に対してゲノムPCR処理を施し、これによって得られた
増幅フラグメントにマイクロシークエンシング反応を施して、各個体群(症例お
よび対照)における各バイアレリックマーカーのアレル頻度を判定した。上述し
たPCRおよびマイクロシークエンシングプライマーを使用して、上記の実施例1〜
3において詳細に説明したようにして、ゲノムPCRおよびマイクロシークエンシン
グを実施した。
【０７３７】 (1バイアレリックマーカー頻度解析) この解析に用いたバイアレリックマーカーの各アレルについて、未羅患個体群と
精神分裂病に羅患した個体群との間のバイアレリックマーカー頻度の差を算出し
、差の絶対値を求めた。特定のバイアレリックマーカー1つまたは特定のバイア
レリックマーカーの集合について、バイアレリックマーカー頻度の差が大きくな
ればなるほど、この特定のバイアレリックマーカー1つまたはバイアレリックマ
ーカの集合を有するゲノム領域と精神分裂病との関連性が深くなる。アレル頻度
は、ハプロタイプ解析に用いたマーカーがハーディワインベルグ比(任意交配)を
満たしているか否かを確認する上でも有用であった。
【０７３８】 上述した試料個体群を用いた場合の羅患個体群と未羅患個体群との間の染色体
13q31-q33領域におけるバイアレリックマーカーのアレル頻度を表9に示す。
【０７３９】
【表１９】
【０７４０】 本願明細書にて説明する関連性解析では、いくつかの個々のバイアレリックマ
ーカーが精神分裂病と有意に関連していることが分かった。特に、染色体13q31-
q33領域のバイアレリックマーカーのうちのいくつか(99-16038/118(A198)、99-1
5880/162(A218)、99-5919/215(A75)、99-15875/165(A228)、99-16032/292(A223)
)が、家族性の精神分裂病症例と散発性の精神分裂病症例の両方で精神分裂病と
の有意な関連性を示した。羅患個体群および未羅患個体群における個々のバイア
レリックマーカーのバイアレリックマーカー頻度の差の絶対値の有意性を図2に
示す。同図には、バイアレリックマーカー頻度差がp値で0.05に近いかこの値未
満であるバイアレリックマーカーがいくつかと、p値が0.01未満のバイアレリッ
クマーカー99-5919/215(A75)も含まれている。また、特定のバイアレリックマー
カーの物理的な順序についても図2に示す。これらの結果から、精神分裂病と個
々に関連したバイアレリックマーカーが有意な特定の領域すなわち、本願明細書
では領域Dと呼ぶ染色体13q31-q33領域の小領域に物理的に位置していることが分
かる。
【０７４１】 (ハプロタイプ頻度解析) マーカーの解析 上述した羅患個体群および対照個体群で、考え得る2、3および
4マーカーハプロタイプすべての頻度を推定することによって、染色体13q31-q33
関連バイアレリックマーカーと精神分裂病との関連性についてのハプロタイプ解
析を実施した。上述したように、期待値最大化(EM)アルゴリズム(Excoffier and
Slatkin, 1995)を適用し、EM-HAPLOプログラム(Hawley et al., 1994)を使用し
て、ハプロタイプを推定した。羅患個体群および対照個体群での推定ハプロタイ
プ頻度を、標準的なカイ二乗試験(自由度1)によって比較した。
【０７４２】 (精神分裂病症例におけるハプロタイプ関連性解析の結果) 染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカーを用いて行うハプロタイプ解析
の結果を図3に示す。特に、バイアレリックマーカー99-16047/115(A239)、99-16
033/244(A227)、99-16038/118(A198)、99-15875/165(A228)、99-16032/292(A223
)、99-5897/143(A107)、99-15880/162(A218)、99-16082/218(A270)、99-5919/21
5(A75)、99-7652/162(A62)、99-16100/147(A65)、99-5862/167(A70)を用いた場
合の最も有意なハプロタイプを図示してある。
【０７４３】 多数のバイアレリックマーカーハプロタイプが精神分裂病と有意に関連してい
ることが明らかになった。4つのバイアレリックマーカー(99-16038/118(A198)、
99-16082/218(A270)、(99-7652/162(A62)および99-16100/147(A65))からなる第1
の好ましいハプロタイプ(図3のHAP287)は、全症例および散発性症例の両方で精
神分裂病と極めて有意に関連している。図4は、このハプロタイプの特徴を示し
ている。このハプロタイプを用いると、全症例でｐ値3.1×10-7、オッズ比4.01
が得られ、散発性症例でｐ値3.9×10-6、オッズ比3.88が得られた。表現型並べ
替え検定を行ったところ、これらの結果の統計的有意性を確認することができた
。推定ハプロタイプ頻度は全症例で13.8%、散発性症例で13.5%、対照で3.8%であ
った。
【０７４４】 いくつかの他の有意なハプロタイプを図3に列挙してある。これには、2-マー
カーハプロタイプ、3-マーカーハプロタイプおよび4-マーカーハプロタイプがい
くつか含まれている。精神分裂病と極めて有意に関連していると思われるのは、
最も有意な2-マーカーハプロタイプ(バイアレリックマーカー99-15875/165(A228
)および99-5919/215(A75)からなるHAP1)と最も有意な3-マーカーハプロタイプ(
バイアレリックマーカー99-16038/118(A198)、99-16082/218(A270)および99-765
2/162(A218)からなるHAP67)である。
【０７４５】 精神分裂病と関連していると思われるさらに好ましい有意なハプロタイプとし
て、ｐ値が所望の閾値レベルを上回るハプロタイプがあげられる。図3に列挙し
たハプロタイプのうち、2-マーカーハプロタイプではｐ値1.0×10-2未満、3-マ
ーカーハプロタイプでは1.0×10-4未満、4-マーカーハプロタイプでは1.0×10-5 未満である。1(99-16047/115(A239))以外、図4に列挙したバイアレリックマーカ
ーはいずれもｐ値がこれらの閾値レベルを上回るハプロタイプに含まれる。図3
には、ｐ値が1.0×10-2〜1.2×10-3の範囲に入るいくつかの2-マーカーハプロタ
イプすなわちHAP1〜HAP8、ｐ値が1.3×10-5から1.0×10-4の範囲に入るいくつか
の3-マーカーハプロタイプすなわちHAP67〜HAP76、ｐ値が8.2×10-7から3.1×10-7 の範囲に入るいくつかの4-マーカーハプロタイプすなわちHAP287〜HAP291がそ
れぞれ示されている。図4は、2-マーカーハプロタイプ、3-マーカーハプロタイ
プおよび4-マーカーハプロタイプでそれぞれ、有意性閾値1.0×10-2、1.0×10-4 および1.0×10-5である、有意なハプロタイプに関与しているバイアレリックマ
ーカーを示している。
【０７４６】 いくつかの2-、3-および4-マーカーハプロタイプすなわち、HAP1、HAP8、HAP7
0、HAP71、HAP75、HAP76、HAP288、HAP290およびHAP291は、バイアレリックマー
カー99-5919/215(A75)アレルAを含んでいることが多かった。さらに、いくつか
の2-、3-および4-マーカーハプロタイプすわちHAP7、HAP67、HAP69、HAP75、HAP
287およびHAP288は、バイアレリックマーカー99-16038/118(A198)アレルGを含ん
でいることが多かった。
【０７４７】 (実施例5b) (精神分裂病と本発明のバイアレリックマーカーとの間の関連性解析) (羅患個体および未羅患個体からのDNA試料の収集) 上述したフランス系カナダ人個体群において本発明のバイアレリックマーカー
をさらに解析した。この解析のために、以下の表10に示すとおり、解析対象とし
た発端症例個体群には139個体を含み、対照個体群には141個体を含めた。
【０７４８】
【表２０】
【０７４９】 (羅患個体および対照個体の遺伝子型判定) A) 遺伝子型判定の結果 関連性解析を行うための汎用的なストラテジーは、上述した個体群各々に含ま
れるすべての個体から得たDNA試料を個々にスキャンし、上述したバイアレリッ
クマーカー、特に、本発明のバイアレリックマーカーの、これらの個体群各々に
属する被検個体の複相ゲノムでのアレル頻度を求めることであった。
【０７５０】 各個体から得たDNA試料に対してゲノムPCR処理を施し、これによって得られた
増幅フラグメントにマイクロシークエンシング反応を施して、各個体群(症例お
よび対照)における各バイアレリックマーカーのアレル頻度を判定した。上述し
たPCRおよびマイクロシークエンシングプライマーを使用して、上記の実施例1〜
3において詳細に説明したようにして、ゲノムPCRおよびマイクロシークエンシン
グを実施した。
【０７５１】 (1バイアレリックマーカー頻度解析) この解析に用いたバイアレリックマーカーの各アレルについて、未羅患個体群
と精神分裂病に羅患した個体群との間のバイアレリックマーカー頻度の差を算出
し、差の絶対値を求めた。いくつかの領域における羅患個体群と未羅患個体群と
の間のアレル頻度を上述した試料個体群を用いて表11に示し、さらに表10にも示
す。特定のバイアレリックマーカー1つまたは特定のバイアレリックマーカーの
集合について、バイアレリックマーカー頻度の差が大きくなればなるほど、この
特定のバイアレリックマーカー1つまたはバイアレリックマーカの集合を有する
ゲノム領域と精神分裂病との関連性が深くなる。アレル頻度は、ハプロタイプ解
析に用いたマーカーがハーディワインベルグ比(任意交配)を満たしているか否か
を確認する上でも有用であった。
【０７５２】
【表２１】
【０７５３】 (ハプロタイプ頻度解析) マーカーの解析 上述した羅患個体群および対照個体群で、考え得る2、3および
4マーカーハプロタイプすべての頻度を推定することによって、染色体13q31-q33
関連バイアレリックマーカーと精神分裂病との関連性についてのハプロタイプ解
析を実施した。上述したように、期待値最大化(EM)アルゴリズム(Excoffier and
Slatkin, 1995)を適用し、EM-HAPLOプログラム(Hawley et al., 1994)を使用し
て、ハプロタイプを推定した。羅患個体群および対照個体群での推定ハプロタイ
プ頻度を、標準的なカイ二乗試験(自由度1)によって比較した。
【０７５４】 (精神分裂病症例でのハプロタイプの関連性についての結果) ハプロタイプ解析によって、本発明のヌクレオチド配列と精神分裂病との関連
性を示す有意な結果が得られた。この有意な結果を図5および図6に示す。同図に
は、カイ二乗検定での検定値が最大値になるハプロタイプ頻度の内容(図中、参
照符号(1))、症例vs.対照で見た場合の特定のハプロタイプの頻度についての検
定値(図中、参照符号(2))、自由度1(ddl)でカイ二乗分布を行った場合のp値(図
中、参照符号(3))を含む。本発明の28の好ましいバイアレリックマーカーすなわ
ち、99-24656-260(A48)、99-24639-163(A60)、99-24634-108(A61)、99-7652-162
(A62)、99-16100-147(A65)、99-5862-167(A70)、99-5919-215(A75)、99-24658-4
10(A76)、99-24644-194(A80)、99-5897-143(A107)、99-24649-186(A108)、99-16
038-118(A198)、99-15880-162(A218)、99-25940-182(A221)、99-16032-292(A223
)、99-16033-244(A227)、99-15875-165(A228)、99-16047-115(A239)、99-25950-
121(A285)、99-25961-376(A286)、99-25965-399(A287)、99-25966-241(A288)、9
9-25969-200(A290)、99-25974-143(A292)、99-25977-311(A293)、99-25979-93(A
295)、99-25989-398(A299)および99-26150-276(A304)を用いて行ったハプロタイ
プ解析の結果を図5および図6に示す。また、ハプロタイプを含むバイアレリック
マーカーの物理的な順序も図5および図6に示す。
【０７５５】 図5は、配列番号1の約319kbの配列に位置するバイアレリックマーカーすなわ
ち、99-24656-260(A48)、99-24639-163(A60)、99-24634-108(A61)、99-7652-162
(A62)、99-16100-147(A65)、99-5862-167(A70)、99-5919-215(A75)、99-24658-4
10(A76)、99-24644-194(A80)、99-5897-143(A107)、99-24649-186(A108)、99-16
038-118(A198)、99-15880-162(A218)、99-25940-182(A221)、99-16032-292(A223
)、99-16033-244(A227)、99-15875-165(A228)および99-16047-115(A239)を用い
て行ったハプロタイプ解析の結果を示している。
【０７５６】 図6は、配列番号1の約319kbの配列に位置するバイアレリックマーカーならび
にヒト染色体13q31-q33座に位置する他のバイアレリックマーカーすなわち、199
-16038-118(A198)、99-15880-162(A218)、99-25940-182(A221)、99-16032-292(A
223)、99-16033-244(A227)、99-15875-165(A228)、99-16047-115(A239)、99-259
50-121(A285)、99-25961-376(A286)、99-25965-399(A287)、99-25966-241(A288)
、99-25969-200(A290)、99-25974-143(A292)、99-25977-311(A293)、99-25979-9
3(A295)、99-25989-398(A299)および99-26150-276(A304)を用いて行ったハプロ
タイプ解析の結果を示している。
【０７５７】 複数のバイアレリックマーカーハプロタイプが精神分裂病と有意に関連してい
ることが分かった。
【０７５８】 いずれも精神分裂病との間に極めて有意な関連性を示し、さまざまな2-マーカ
ーハプロタイプ、3-マーカーハプロタイプおよび4-マーカーハプロタイプを含む
、好ましいハプロタイプには、図6のハプロタイプ817、818および819、137、138
、1および2および図5のハプロタイプ970、154および1がある。ｐ値、オッズ比お
よび推定ハプロタイプ頻度についてもさらに図5および図6に示してある。特に、
バイアレリックマーカー99-5862-167(A70)および99-15875-165(A228)をなす図5
の2つのマーカーハプロタイプにおいて、p値7.8×10-5およびオッズ比1.61とい
う極めて有意な結果が得られた。4つのバイアレリックマーカー(99-16032-292(A
223)、99-25969-200(A290)、99-25977-311(A293)および99-25989-398(A299))を
なす図6のハプロタイプ818では、ｐ値3.1×10-7およびオッズ比9.08であった。
有意性が認められたもう1つの例が、4つのバイアレリックマーカー(99-16033-24
4(A227)、99-15875-165(A228)、99-25950-121(A285)および99-25979-93(A295))
をなす図6のハプロタイプ817であり、そのｐ値は2.4×10-7、オッズ比は100であ
った。表現型並べ替え検定によって、これらの結果の統計的有意性が確認された
。推定ハプロタイプ頻度は症例で10.5%、対照で0%であった。4つのバイアレリッ
クマーカー(99-5919-215(A75)、99-24658-410(A76)、99-15875-165(A228)および
99-16047-115(A239))をなす図5のハプロタイプ970では、ｐ値7.8×10-7およびオ
ッズ比2.41であった。表現型並べ替え検定によって、これらの結果の統計的有意
性が確認された。推定ハプロタイプ頻度は症例で25.7%、対照で12.5%であった。
【０７５９】 いくつかの2-マーカーハプロタイプ、3-マーカーハプロタイプおよび4-マーカ
ーハプロタイプをはじめとして、他の有意なハプロタイプをいくつか図5および
図6に列挙する。精神分裂病と極めて有意に関連していると思われるのは、最も
有意な2-マーカーハプロタイプ(上述した図5のハプロタイプ1など)と、最も有意
な3-マーカーハプロタイプ(バイアレリックマーカー(99-15875-165(A228)、99-1
6047-115(A239)および99-25950-121(A285)をなす図6のハプロタイプ137など)で
ある。
【０７６０】 精神分裂病と関連していると思われる、さらに好ましい他の有意なハプロタイ
プとしては、ｐ値が所望の閾値レベルを上回るハプロタイプがあげられる。図5
および図6に列挙したハプロタイプのｐ値はいずれも、2-マーカーハプロタイプ
で1.0×10-2未満、3-マーカーハプロタイプで1.0×10-4未満、4-マーカーハプロ
タイプで1.0×10-5未満である。図5および図6において、2-マーカーハプロタイ
プすなわち図5のハプロタイプ1〜9と図6のハプロタイプ1〜5ではｐ値が7.8×10- 5 から8.6×10-3の範囲、3-マーカーハプロタイプすなわち図5のハプロタイプ154
〜163と図6のハプロタイプ137〜141ではｐ値が3.9×10-6から1.1×10-4の範囲、
4-マーカーハプロタイプすなわち、図5のハプロタイプ970〜973と図6のハプロタ
イプ817〜836ではｐ値が2.4×10-7から7.3×10-6の範囲である。
【０７６１】 さらに、特に多数の有意な2-マーカーハプロタイプ、3-マーカーハプロタイプ
および4-マーカーハプロタイプは、バイアレリックマーカーA223、A76、A227、A
239、A286、A290、A299を含んでいることが多く、最も一般的にはA228(99-15875
-165)アレルTを含んでいた。
【０７６２】 コンピュータで100回繰り返した表現型並べ替え検定を行い、ハプロタイプ解
析で得られた結果の統計的有意性を評価した。このコンピュータシミュレーショ
ンでは、羅患個体および対照個体から得たデータをプールし、図5および図6にま
とめたデータを得るのに用いた症例対照個体群と同数の個体を含む2つのグルー
プに無作為に振り分けた。この人為的なグループで、精神病との関連性が最も高
かったハプロタイプに含まれるマーカーについてハプロタイプ解析を実施した。
この実験を100回繰り返し、結果を図5および図6の「並べ替え法によるハプロタ
イプ解析」欄に示す。特定のハプロタイプについてみると、これらの結果から、
得られる(シミュレートされる)p値のあるハプロタイプの数は100回の繰り返しで
特定のハプロタイプについて得られる数に相当することが分かる。図5および図6
に示す結果から、ハプロタイプと精神分裂病との関連性の統計的有意性が実証さ
れる。
【０７６３】 (実施例5c) (フランス系カナダ人から得た試料での精神分裂病と本発明のバイアレリックマ
ーカーとの間の関連性解析) (羅患個体および未羅患個体からのDNA試料の収集) 上述したようにしてフランス系カナダ人から得た試料で本発明のバイアレリッ
クマーカーの遺伝子型を判定し、領域Dの第1の部分および第2の部分と精神分裂
病との関連性を比較した。解析には、FH+の男性2例を用いなかったこと以外は上
述したものと同一の個体群を利用した。
【０７６４】 この研究で解析したバイアレリックマーカーには、染色体13q31-33領域の領域
Dに位置する本発明による34の好ましいバイアレリックマーカーが含まれる。す
なわち、解析には、領域Dの2つの位置のうちの第1の部分から得た、99-26150/27
6(A304)、99-26156/290(A307)、99-26153/44(A305)、99-25985/194(A298)、99-2
5974/143(A292)、99-25977/311(A293)、99-25972/317(A291)、99-25965/399(A28
7)、99-25961/376(A286)、99-25966/241(A288)、25967/57(A289)、99-25969/200
(A290)、99-25979/93(A295)および99-25989/398(A299)の14のバイアレリックマ
ーカーを利用した。また、領域Dの2つの位置のうちの第2の部分から得た、99-25
993/367(A241)、99-16047/115(A239)、99-15875/165(A228)、99-16033/244(A227
)、99-16032/292(A223)、99-25940/182(A221)、99-15880/162(A218)、99-16038/
118(A198)、99-15870/400(A178)、99-24649/186(A108)、99-5897/143(A107)、99
-24644/194(A80)、99-24658/410(A76)、99-5919/215(A75)、99-5862/167(A70)、
99-16100/147(A65)、99-7652/162(A62)、99-24634/108(A61)、99-24639/163(A60
)および99-24656/260(A48)の20のバイアレリックマーカーも解析に利用した。
【０７６５】 (精神分裂病症例における1バイアレリックマーカー関連性解析の結果) 1バイアレリックマーカー解析では有意な結果が得られ、本発明のヌクレオチ
ド配列と精神分裂病との間に関連性があることが分かった。この解析に用いたバ
イアレリックマーカーとしては、以下の表11に示す34のバイアレリックマーカー
の集合があげられた。このうち、14のバイアレリックマーカーが領域Dの2つの位
置のうちの第1の部分に位置し、20のバイアレリックマーカーが第2の部分に位置
していた。マーカーの分布を以下の表12に示す。表13にまとめたように、これら
のバイアレリックマーカーを用いての解析から、領域Dの第2の部分にある5つの
マーカーで精神分裂病との有意な関連性が示された。
【０７６６】
【表２２】
【０７６７】
【表２３】
【０７６８】 (ハプロタイプ頻度解析) マーカーの解析 上述した羅患個体群および対照個体群で、考え得る2、3および
4マーカーハプロタイプすべての頻度を推定することによって、染色体13q31-q33
関連バイアレリックマーカーと精神分裂病との関連性についてのハプロタイプ解
析を実施した。上述したように、期待値最大化(EM)アルゴリズム(Excoffier and
Slatkin, 1995)を適用し、EM-HAPLOプログラム(Hawley et al., 1994)を使用し
て、ハプロタイプを推定した。羅患個体群および対照個体群での推定ハプロタイ
プ頻度を、標準的なカイ二乗試験(自由度1)によって比較した。
【０７６９】 (精神分裂病症例でのハプロタイプの関連性についての結果) 本発明のヌクレオチド配列と精神分裂病との関連性を示す有意な結果がハプロ
タイプ解析でも得られた。
【０７７０】 本願発明者らは、ヒト染色体13q31-q33座の領域Dの小領域に位置するバイアレ
リックマーカーと疾患との極めて有意な関連性をすでに実証している。ハプロタ
イプ頻度のプロファイルを比較する総括的なLR検定と、2つのグループの各ハプ
ロタイプについてのハプロタイプ差に基づくHaplo-maxM検定とを利用して、図7
および図8に、領域Dの第1の部分および第2の位部分について解析した結果を示す
。これらの結果から、領域Dの第2の部分が精神分裂病と関連していることが分か
った。
【０７７１】 2バイアレリックマーカーと3バイアレリックマーカーとの組み合わせについて
、E-Mアルゴリズムを用いて算出したハプロタイプ頻度値に基づいてひとつの尤
度比検定値を得る。羅患個体および対照個体から得たデータをプールし、データ
を得るのに用いた症例対照個体群と同数の個体を含む2つのグループに無作為に
振り分ける並べ替え検定法を利用した。この人為的なグループで、精神病との関
連性が最も高かったハプロタイプに含まれるマーカーについてハプロタイプ解析
を実施した。この実験を100回繰り返した。特定のハプロタイプについてみると
、これらの結果から、得られる(シミュレートされる)p値のあるハプロタイプの
数は100回の繰り返しで特定のハプロタイプについて得られる数に相当すること
が分かる。
【０７７２】 図7は、領域Dの2つの部分におけるハプロタイプ頻度のLR検定値分布の比較結
果を示している。領域Dの第2の部分と精神分裂病との関連性を、2-マーカーコン
ビネーションと3-マーカーコンビネーションの両方を用いて示す。クラスカルウ
ォリスのランク検定による自由度r-1のカイ二乗検定値(rは比較した値集合の数)
を利用して、異なる領域でのLR検定値の分布を解析した。これらの結果から明ら
かなように、2マーカーコンビネーションでカイ二乗値(自由度1)が74.405、ｐ値
が1×10-10未満であり、3-マーカーコンビネーションではカイ二乗値(自由度1)
が228.72、ｐ値が1×10-10であることから、関連性が有意なものであることが分
かる。
【０７７３】 Haplo-maxM検定と呼ばれる、ハプロタイプ頻度の差に基づく別の関連性解析法
を、領域Dバイアレリックマーカーを用いて実施した。h個のハプロタイプを有す
るマーカーのコンビネーション1つあたり、ピアソンのカイ二乗統計(自由度1)に
よってハプロタイプ頻度の差h個を比較することができる。Haplo-max検定では、
症例と対照との間で正の検定値が最大になる差を選択する(希なハプロタイプ頻
度に基づく検定値すなわちハプロタイプの推定数が10未満を除外)。したがって
、マーカーのコンビネーション1つあたり1つのMax-M検定値が得られる。領域Dバ
イアレリックマーカーを用いて行うHaplo-maxM検定の結果を図8に示す。
【０７７４】 図8は、領域Dの2つの部分において2-マーカーコンビネーションと3-マーカー
コンビネーションの両方について得られたHaplo-maxM検定値の分布を示している
。これらの結果から、領域Dの第2の部分が精神分裂病と関連していることが分か
る。クラスカルウォリスのランク検定による自由度r-1のカイ二乗検定値(rは比
較した値集合の数)を利用して、2つの領域でのHaplo-maxM検定値を比較した結果
を解析した。これらの結果から明らかなように、2マーカーコンビネーションで
カイ二乗値(自由度1)が34.839、ｐ値が3.58×10-9未満であり、3-マーカーコン
ビネーションではカイ二乗値(自由度1)が13.773、ｐ値が2.6×10-4であることか
ら、関連性が有意なものであることが分かる。
【０７７５】 Haplo-maxM検定で得られる結果から、総括的なLR検定の結果から分かる関連性
がさらに裏付けられる。
【０７７６】 本発明のバイアレリックマーカーを用いての上述した関連性解析の結果を以下
の表13にさらにまとめておく。この表から、1バイアレリックマーカー解析とハ
プロタイプ解析の両方においてバイアレリックマーカーと精神分裂病との間に有
意な関連性があることが分かる。
【０７７７】
【表２４】
【０７７８】 (実施例5d) (双極性障害と本発明のバイアレリックマーカーとの間の関連性解析) (検定の設計の説明) 双極性障害症例で本発明のバイアレリックマーカーを解析した。上記の実施例
と同様に、単点解析および多点解析によって、本発明のマーカー、染色体13q33
座の領域D、特に、領域Dの小領域と双極性障害との有意な関連性が示された。
【０７７９】 A) 羅患個体群の説明 アルゼンチンのブエノスアイレス南部に位置する病院にて双極性障害について
の解析を行い、住民約400,000人が含まれると推定される個体群をなす試料をす
べて収集した。4人の医師が1994年および1995年に患者を評価した。解析を設計
するには、症例とその一親等の近親者(親または兄弟)を確認する必要があった。
514の個体を解析に利用できた。このグループは、51の異なる家系から得た158名
の被検体と356名の独立した被検体とで構成されていた。
【０７８０】 全体として、DSM-IV(精神障害の診断と統計マニュアル、第4版、1994年改訂、
アメリカ精神医学会出版)に規定された双極性障害の診断基準に基づいて双極性
障害の症例を確認した。
【０７８１】 コードした各症例について、性別、両親および祖父母の国籍、種族的出身、家
族構成、婚姻状態、社会経済水準、教育水準、専門性、雇用状態、receational
活動、精神病性症状の発病年齢、初回受診年齢、出産経験または妊娠経験、自殺
の試み、他の身体状態、神経学的な状態または神経学的状態の発生に対する治療
、家族における症状の既往歴、向精神薬を過去または現在使用しているか否か、
他の理由で入院または医学的な治療を受けているか、(a)DSM-IVに基づく診断お
よび(b)入院時に最初に見られた症状を含む入院の診断理由を考慮の対象とする
ことができた。
【０７８２】 解析には双極性障害の認められる226の症例を利用したが、このうち203例は単
独症例であった。このグループの内訳は、51の家系から得た症例が51例、その近
親者20例、単独症例155例であった。最初の単独症例155例のうち3例には家族関
係があることが明らかになり除外したが、単独症例の総数は203であった。
【０７８３】 双極性障害のタイプに基づいて症例を分類した。対象となった症例は双極I型
障害Iの個体115例(頻発型1例を含む)、双極II型障害の個体67例(頻発型1例を含
む)、未分類の双極性障害18例および情報の不足または矛盾により未分類のまま
とした3例であった。
【０７８４】 これらの203の単独症例で精神病の家族歴を調べた。症例のうち53例で一親等
の近親者(父、母、兄弟、姉妹または子)に(精神分裂病または双極性障害の特徴
のある)精神病が発生していることが分かった。
【０７８５】 B) 未羅患個体群の説明 精神医学上の症状が全く認められない症例または精神医学上の症状の家族歴の
ない症例201例を対照として解析に利用した。未羅患個体群の年齢、性別、種族
的出身も考慮の対象とした。
【０７８６】 C) 関連性解析用に選択した症例個体群および対照個体群 関連性解析を行うために、上記の全症例226例から選択した201の個体で構成し
た症例個体群を解析対象とし、上述した201の対照例から選択した198の個体で対
照個体群を構成した。
【０７８７】 以下の表14に詳細に示す個体群サイズで下記の実施例5dに示す関連性データを
得た。
【０７８８】
【表２５】
【０７８９】 症例個体群および対照個体群の両方が含まれるようにして、分かっている共通
の先祖がいない、互いに血縁関係のない個体からなる2つのグループを形成する
。
【０７９０】 (羅患個体および対照個体の遺伝子型判定) 汎用的なストラテジーは、上述した個体群各々に含まれるすべての個体から得
たDNA試料を個々にスキャンし、上述したバイアレリックマーカー、特に、本発
明のバイアレリックマーカーの、これらの個体群各々に属する被検個体の複相ゲ
ノムでのアレル頻度を求めることであった。
【０７９１】 各個体から得たDNA試料に対してゲノムPCR処理を施し、これによって得られた
増幅フラグメントにマイクロシークエンシング反応を施して、各個体群(症例お
よび対照)における各バイアレリックマーカーのアレル頻度を判定した。上述し
たPCRおよびマイクロシークエンシングプライマーを使用して、上記の実施例1〜
3において詳細に説明したようにして、ゲノムPCRおよびマイクロシークエンシン
グを実施した。
【０７９２】 (関連性解析) 染色体13q31-33領域の領域Dに位置する本発明の好ましいバイアレリックマー
カー30例を関連性解析に利用した。解析には、領域Dの2つの対象部分のうち最初
の方から得た、99-26150/276(A304)、99-26156/290(A307)、99-26153/44(A305)
、99-25985/194(A298)、99-25974/143(A292)、99-25977/311(A293)、99-25972/3
17(A291)、99-25965/399(A287)、99-25961/376(A286)、99-25966/241(A288)、25
967/57(A289)、99-25969/200(A290)、99-25979/93(A295)および99-25989/398(A2
99)の14のバイアレリックマーカーを利用した。また、領域Dの2つの部分のうち2
つ目から得た、99-25993/367(A241)、99-16047/115(A239)、99-15875/165(A228)
、99-16033/244(A227)、99-16032/292(A223)、99-25940/182(A221)、99-15880/1
62(A218)、99-16038/118(A198)、99-15870/400(A178)、99-24649/186(A108)、99
-5897/143(A107)、99-24644/194(A80)、99-5919/215(A75)、99-5862/167(A70)、
99-16100/147(A65)および99-7652/162(A62)の16のバイアレリックマーカーも解
析に利用した。
【０７９３】 A) 双極性障害症例における1バイアレリックマーカー関連性解析の結果 この解析に用いたバイアレリックマーカーの各アレルについて、未羅患個体群
と双極性障害に羅患した個体群との間のバイアレリックマーカー頻度の差を算出
し、差の絶対値を求めた。本解析に用いたバイアレリックマーカーとそのアレル
頻度を表15に示す。特定のバイアレリックマーカー1つまたは特定のバイアレリ
ックマーカーの集合について、バイアレリックマーカー頻度の差が大きくなれば
なるほど、この特定のバイアレリックマーカー1つまたはバイアレリックマーカ
の集合を有するゲノム領域と双極性障害との関連性が深くなる。アレル頻度は、
ハプロタイプ解析に用いたマーカーがハーディワインベルグ比(任意交配である
と仮定)を満たしているか否かを確認する上でも有用であった。
【０７９４】
【表２６】
【０７９５】 本願発明者らは、ヒト染色体13q31-33領域の領域Dの小領域に位置するバイア
レリックマーカーと疾患との間に有意な関連性があることをすでに実証している
。表15に示す30のバイアレリックマーカーで構成される集合を用いて、Dの第1の
半分に14のマーカー、Dの第2の半分に16のマーカーが含まれるようにした。
【０７９６】 また、表15には、ヒト染色体13q31-q33領域の領域Dにおけるバイアレリックマ
ーカーの物理的な順序も示してある。領域Dの第1および第2の対象部分上のバイ
アレリックマーカーの平均マーカー間距離は以下の表16に列挙するとおりであっ
た。
【０７９７】
【表２７】
【０７９８】 本発明のいくつかの領域Dバイアレリックマーカーを用いて解析を行ったとこ
ろ、領域Dの第2の部分が双極性障害と有意に関連していることが分かった。全症
例対照群から選択したコーカソイドの症例182例とコーカソイドの対照177例とを
含む上述した試料個体群を用いて、解析を実施した。
【０７９９】 特に、領域Dの第2の半分に位置するひとつのバイアレリックマーカーすなわち
99-15875/165(A228)で、5%を上回る有意性レベルで疾患との有意な関連性が示さ
れた(絶対対数(ｐ値)1.3に相当)。
【０８００】 B) 双極性障害の症例におけるハプロタイプ関連性解析の結果 上述した羅患個体群および対照個体群で、考え得る2、3および4マーカーハプ
ロタイプすべての頻度を推定することによって、染色体13q31-q33関連バイアレ
リックマーカーと双極性障害との関連性についてのハプロタイプ解析を実施した
。Nicholas Schorkによって修正された期待値最大化(EM)アルゴリズム(Excoffie
r and Slatkin, 1995)を適用してハプロタイプ頻度を推定した。
【０８０１】 ハプロタイプ解析では、本発明のヌクレオチド配列と双極性障害との関連性を
示す有意な結果が得られた。上述した試料個体群を用いて、全症例対照群から選
択したコーカソイドの症例182例とコーカソイドの対照177例とについて、図9A、
図9B、図10A、図10B、図11Aおよび図11Bに示すようなハプロタイプ解析を実施し
た。
【０８０２】 ハプロタイプ頻度のプロファイルを比較する総括的なLR検定と、2つのグルー
プでの各ハプロタイプのハプロタイプ頻度差に基づくHaplo-maxM検定とを利用し
て、図9A、図9B、図10A、図10B、図11Aおよび図11Bに、領域Dの第1の部分および
第2の位部分について比較した結果を示す。これらの結果から、領域Dの第2の部
分が双極性障害と関連していることが分かった。
【０８０３】 (a 総括的なLR検定の値) 2、3または4バイアレリックマーカーの特定の組み合わせに対して、E-Mアルゴ
リズムを用いて算出したハプロタイプ頻度に基づくひとつの尤度比検定(LR検定)
値を得ることができる。
【０８０４】 図9Aおよび図9Bは、領域Dの2つの部分におけるハプロタイプ頻度のLR検定値分
布を比較したものである。2-マーカーコンビネーションと3-マーカーコンビネー
ションのどちらを用いた場合にも領域Dの第2の部分と双極I型障害との関連性が
示される。クラスカルウォリスのランク検定を利用して、領域Dの2つの対象部分
におけるLR検定値の分布を比較した。この検定値は、(r-1)自由度(rは比較され
る集合の数)で比較される集合間に差がないという帰無仮説に基づく漸近カイ二
乗分布をなすものである。ここで、本願発明者らは、領域Dの2つの部分を比較す
るためr=2であり、漸近カイ二乗分布は自由度1である。図示のように、2マーカ
ーコンビネーションでカイ二乗値(自由度1)が46.62、ｐ値8.62×10-12であり、3
-マーカーコンビネーションではカイ二乗値(自由度1)が124.72、ｐ値が5.86×10-29 であることから、関連性が有意なものであることが分かる。
【０８０５】 (b Haplo-max検定値) Haplo-max検定と呼ばれる、ハプロタイプ頻度の差に基づく別の関連性解析法
を、領域Dバイアレリックマーカーを用いて実施した。Haplo-max検定では、症例
と対照との間で正の検定値(maxM)または負の検定値(maxS)が最大になる差を選択
する(希なハプロタイプ頻度に基づく検定値すなわちハプロタイプの推定数が10
未満を除外)。したがって、マーカーのコンビネーション1つあたりMax-M検定値
とMax-S検定値がひとつずつ得られることになる。
【０８０６】 図10Aおよび図10Bは、領域Dの2つの部分において2-マーカーコンビネーション
と3-マーカーコンビネーションの両方について得られたHaplo-maxM検定値の分布
を示している。これらの結果から、領域Dの第2の部分と双極性障害との間に関連
性があることが分かる。2つの領域におけるHaplo-maxM検定値の分布を比較した
ものを、クラスカルウォリスのランク検定による自由度1のカイ二乗検定値を用
いて解析した。これらの結果から明らかなように、2マーカーコンビネーション
でカイ二乗値(自由度1)が29.07、ｐ値が6.98×10-8であり、3-マーカーコンビネ
ーションではカイ二乗値が98.63、ｐ値が3.04×10-23であることから、関連性が
有意なものであることが分かる。
【０８０７】 図11Aおよび図11Bは、領域Dの2つの部分において2-マーカーコンビネーション
と3-マーカーコンビネーションすべてについて得られたHaplo-maxS検定値の分布
を示している。これらの結果から、領域Dの第2の部分と双極性障害との間に関連
性があることが分かる。2つの部分におけるHaplo-maxS検定値の分布を比較した
ものを、自由度1のクラスカルウォリスのランク検定を用いて解析した。これら
の結果から明らかなように、2マーカーコンビネーションでカイ二乗値(自由度1)
が34.6、ｐ値が4.05×10-9であり、3-マーカーコンビネーションではカイ二乗値
が98.31、ｐ値が3.58×10-23であることから、関連性が有意なものであることが
分かる。
【０８０８】 Haplo-maxM検定およびHaplo-maxS検定で得られた結果によって、総括的なLR検
定結果を用いて示された関連性がさらに裏付けられる。
【０８０９】 (実施例5e) (精神分裂病および双極性障害との関連性の確認(「スクリーニングII」)) フランス系カナダ人の精神分裂病者から得た試料とアルゼンチン人の双極性障
害の症例とを用いて上記にて得られた結果を、染色体13q31-q33領域の領域Dにわ
たるマーカーを用いて、さらに大きいスクリーニング試料および何種類かの個体
群において確認した。
【０８１０】 確認のための解析では、上述したフランス系カナダ人の精神分裂病者から得た
試料(Algene社)に加えて、米国人の精神分裂病者から得た試料、アルゼンチン人
の双極性障害者から得た試料(Labimo社)を、小領域D1〜D4と呼ぶ領域Dの小領域
において解析した。Algene(またはフランス系カナダ人)として示した精神分裂病
者試料と、Labimo試料(アルゼンチン人)として示した双極性障害試料は上述した
とおりである。米国人の精神分裂病者から得た試料を以下の表17に示す。
【０８１１】
【表２８】
【０８１２】 2種類の精神分裂病試料と1種類の双極性障害試料とについて、小領域D1〜D4を
カバーする32のSNPの集合(平均密度1 SNP/25kb)を遺伝子型判定した。遺伝子型
を判定した32のバイアレリックマーカーを以下の表18に示す。
【０８１３】
【表２９】
【０８１４】 3つの個体群各々について、単点および多点のバイアレリックマーカー解析に
基づく領域Dの各小領域における有意な検定値の数を症例および対照で比較した
。単点解析では、ヘテロ接合体の過剰とヘテロ接合体の不足(ハーディワインベ
ルグ不平衡係数)、バイアレリック関連性解析および遺伝子型関連性解析ならび
にロジスティック回帰解析の結果を比較した。多点解析では、症例と対照との間
のハプロタイプ頻度の差を調べ、正の最大差をMaxM、負の最大差をMaxSとして、
さらには総括的なLR検定で表した。MaxSおよびMaxMの結果が得られるHaploMax検
定および総括的なLR検定については周知であり、本願明細書では他の点から説明
する。図12乃至図17に示されるように、脚注(1)のある検定では、観察された分
布から評価し、実施した検定の回数に対して研究対象とした各小個体群ごとにD1
、D2、D3およびD4小領域を考慮して推論した有意性閾値を利用した。図12乃至図
17において脚注(2)のある検定では、有意性レベルが5%以上のものを有意な検定
値として定義した。
【０８１５】 本願発明者らは、バイアレリックマーカーが領域Dに位置する場合に精神分裂
病形質に対して3種類の個体から得た試料がいずれも有意な関連性を示すことか
ら、別の試料およびマーカーを用いて行った先の関連性解析の結果が裏付けられ
ることを見出した。さらに、本願発明者らは、3つの個体群のいずれにおいても
小領域D3での関連性が最も有意であることを見出した。したがって、精神分裂病
および双極性障害に関連する遺伝子がこの領域にある可能性が高い。本願明細書
にて説明するsbg1核酸配列およびg35030核酸配列は領域D3にある。
【０８１６】 上記の解析でマーカーを用いて得られる結果に加えて、表18に列挙した32のバ
イアレリックマーカーを用いて行う解析でも、新たに解析したバイアレリックマ
ーカーの単点解析で有意な結果が得られた。特に、マーカー99-25974-143(A292)
、99-25972-317(A291)、99-15870-400(A178)、99-24656-260(A48)で統計的に有
意なヘテロ接合体の過剰または不足が示された。
【０８１７】 （精神分裂病:Algene(フランス系カナダ人)） Algene社の試料を用いた解析によって、(1)解析用に選択した患者全体からな
るクラスター、(2)精神病の家族歴のある(FH+)症例のクラスター、(3)精神病の
家族歴のない(FH-)症例のクラスターを、Algene社の対照試料と比較した。また
、さらに比較を行うために、上述の実施例5bのスクリーニング試料から得た全症
例および全対照で領域Dおよび領域Dの小領域各々における有意な検定値の数を比
較し、図12の「第1のスクリーニング試料」欄に列挙する。上述したように、オ
リジナルのフランス系カナダ人(Algene)試料は、バイアレリックマーカーが領域
Dに位置する場合に、単点解析と多点解析の両方で精神分裂病形質に対して有意
な関連性を示す。さらに、これらの結果から、関連性があるのは明らかに小領域
D3のみに限られ、D2およびD4には至らないことが分かる。単点解析では、sbg1遺
伝子を含むバイアレリックマーカーの有意な濃度は家族性の症例でヘテロ接合体
の過剰を示した。sbg1周囲の13の(5/13)マーカーのうち5つがバイアレリック関
連性解析に有意なものであった。
【０８１８】 図12は、染色体13q31-q33領域に位置する領域D1、D2、D3およびD4を比較する
単点および多点のバイアレリックマーカー解析で得られた結果を示す。
【０８１９】 図13は、被検領域Dのスパン(すなわちD1、D2、D3およびD4)を広げて図12に示
す結果をまとめたものである。
【０８２０】 このように、図12および図13は、Algene社の試料で領域Dおよび精神分裂病に
有意な関連性があることを示している。さらに、これらの図面から、有意な検定
値の数と比率が、対照、FH+、FH-ならびに全症例のいずれでの比較でも一貫して
小領域D3で最高になるということが分かる。FH+およびFH-症例で小領域D3におけ
る有意な検定結果の数を比較する場合、精神病の家族歴のある症例で関連性が一
層顕著に観察されるということが図面から分かる。単点解析では多点解析の場合
よりもFH+症例での有意な検定値の数が多いであろうと思われた。
【０８２１】 また、図12および図13は、スクリーニング試料を大きくしても、大きくなった
領域Dと小領域D3の両方でAlgene社の試料に対する第1のスクリーニングで得られ
る小さ目の試料を用いる場合の結果が裏付けられることを示している。
【０８２２】 （精神分裂病: 米国人の精神分裂病患者から得た試料） フランス系カナダ人から得た試料の場合と同様に、本願発明者らは、米国人の
精神分裂病患者から得た試料の第1の小さめのスクリーニング試料で、領域D、具
体的には小領域D3が精神分裂病と有意に関連していることを見出した。領域Dを
カバーしているバイアレリックマーカーの集合を用いて米国人の精神分裂病個体
群でさらに解析を行うと、小領域D3と精神分裂病との関連性の統計的有意性が極
めて高いことが確認できる。
【０８２３】 解析用に選択した、米国人の精神分裂病患者から得た試料は、欧州系コーカソ
イド92例からなるものであった。無作為US対照188例で構成される対照を用いて
の第1の解析と、対照が上述したフランス系カナダ人から得た試料のうち241例の
対照からなる第2の解析の、2通りの解析を実施した。
【０８２４】 図14は、染色体13q31-q33領域に位置する領域D1、D2、D3およびD4を比較する
単点および多点のバイアレリックマーカー解析で得られた結果を示す。図15は、
被検領域Dのスパン(すなわちD1、D2、D3およびD4)を広げて図14に示す結果をま
とめたものである。
【０８２５】 図面から明らかなように、多点解析を考慮すれば、米国人の精神分裂病患者か
ら得た試料での解析から、小領域D2と精神分裂病との間に有意な関連性があるの
ではないかと思われる。しかしながら、D2領域で実施した検定数の方が少ないた
め、D2領域と精神分裂病との関連性は、精神分裂病と小領域D3との関連性に比べ
ると統計的有意性が低い。また、sbg1遺伝子に位置するひとつのマーカー(99-58
97/143)で家族性の精神分裂病症例における特に有意なヘテロ接合体過剰が認め
られた。
【０８２６】 概して、米国人の精神分裂病患者から得た試料の方がフランス系カナダ人の個
体群での場合より有意な検定値数が少なかった。フランス系カナダ人から得た試
料に比して、米国の精神分裂病者から得た試料の方がヘテロ接合性が高いことが
その一因かもしれない。フランス系カナダ人から得た試料のコーカソイドの対照
またはUS無作為対照のいずれかを用いて、米国人の精神分裂病患者から得た試料
を用いての解析を行った。
【０８２７】 （双極性障害: Labimo(アルゼンチン人)） フランス系カナダ人および米国人の精神分裂病患者から得た試料の場合と同様
に、本願発明者らは、アルゼンチンのLabimo社の試料で、領域D、具体的には小
領域D3が双極性障害と有意に関連していることを見出した。領域Dをカバーして
いるバイアレリックマーカーの一層広範囲にわたる集合を用いてさらに解析を行
うと、小領域D3と双極性障害との関連性の統計的有意性が極めて高いことが確認
できる。
【０８２８】 図16は、染色体13q31-q33領域に位置する領域D1、D2、D3およびD4を比較する
単点および多点のバイアレリックマーカー解析で得られた結果を示す。図17は、
被検領域Dのスパン(すなわちD1、D2、D3およびD4)を広げて図16に示す結果をま
とめたものである。Labimo社の試料ではD3で最も有意な関連性が得られているが
、D2にはバックグラウンドシグナルが若干認められた。有意な検定値の比率にこ
のような違いがあるのは、フランス系カナダ人から得た試料に比してLabimo社の
試料の方が相対的なヘテロ接合性が高いことによる可能性がある。
【０８２９】 すなわち、図16および図17には、Labimo社の試料で領域Dと双極性障害との間
に有意な関連性があることが示されている。
【０８３０】 図16に示されるように、双極I型障害および双極II型障害の症例についても別
途Labimo社の試料を解析した。双極I型障害および双極II型障害で得られる結果
を比較すると、双極I型障害の症例での場合の方が小領域D3と精神分裂病との関
連性が一層明確になる傾向が強かった。
【０８３１】 (実施例6) (sbg1タンパク質に対する抗体組成物の調製) sbg1タンパク質またはその一部をコードする発現ベクターを含むトランスフェ
クトした細胞または形質転換細胞から、実質的に純粋なタンパク質またはポリペ
プチドを単離する。たとえばAmiconフィルタ装置で濃縮するなどして、最終調製
物のタンパク質濃度を数μg/mlのレベルに調節する。この状態で、タンパク質に
対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を以下のようにして調製す
る。
【０８３２】 (A. ハイブリドーマ融解によるモノクローナル抗体産生) Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256:495(1975)の古典的な方法または
これから派生した方法によって、sbg1タンパク質またはその一部のエピトープに
対するモノクローナル抗体をマウスハイブリドーマから調製することができる。
Harlow, E., and D. Lane. 1988. Antibodies A Laboratory Manual. Cold Spri
ng Harbor Laboratory. pp. 53-242も参照のこと。
【０８３３】 簡単に説明すると、数週間の期間にわたって、数マイクログラムのsbg1タンパ
ク質またはその一部をマウスに繰り返し接種する。このマウスを屠殺し、脾臓の
抗体産生細胞を単離する。ポリエチレングリコールによって脾臓細胞をマウス骨
髄腫細胞と融合させ、アミノプテリンを含む選択培地(HAT培地)で系を成長させ
て過剰な未融合細胞を破壊する。融合が成功した細胞を稀釈し、稀釈アリコート
をマイクロタイタープレートのウェルに接種して培養成長を継続する。ウェルの
上澄み液中の抗体を、Engvall(1980)が初めて明らかにしたようなELISAなどのイ
ムノアッセイ法およびこれから派生した方法によって検出し、抗体産生クローン
を同定する。選択された陽性クローンを培養し、そのモノクローナル抗体産物を
収集して使用できるようにする。モノクローナル抗体を得るための詳細な手順に
ついては、Davis, L. et al. Basic Methods in Molecular Biology Elsevier,
New York. Section 21-2に記載されている。
【０８３４】 (B. 免疫化によるポリクローナル抗体産生) 適当な非ヒト動物をsbg1タンパク質またはその一部で免疫化することによって
、sbg1タンパク質またはその一部の異種起源のエピトープに対する抗体を含むポ
リクローナル抗血清を調製することができる。これは、免疫原性を高めるように
修飾してもよいし修飾せずにおくことも可能である。適当な非ヒト動物は、好ま
しくは非ヒト哺乳動物が選択され、通常、マウス、ラット、ウサギ、ヤギまたは
ウマである。あるいは、sbg1濃度を高めた未精製調製物を用いて抗体を作出する
こともできる。このようなタンパク質、フラグメントまたは調製物を、従来技術
において周知の適当なアジュバント(たとえば、水酸化アルミニウム、RIBIなど)
の存在下で非ヒト哺乳動物に導入する。また、タンパク質、フラグメントまたは
調製物を抗原性を高める作用薬で前処理してもよい。このような作用薬は従来技
術において周知であり、一例としては、メチル化ウシ血清アルブミン(mBSA)、ウ
シ血清アルブミン(BSA)、B型肝炎表面抗原およびキーホールリンペットヘモシア
ニン(KLH)などがあげられる。周知の手順に従って免疫化動物から得られる血清
を収集し、これを処理して試験する。血清に望ましくないエピトープに対するポ
リクローナル抗体が含まれている場合、免疫親和性クロマトグラフィによってポ
リクローナル抗体を精製してもよい。
【０８３５】 抗原と宿主種の両方に関係のある多くの要因が効果的なポリクローナル抗体産
生に影響する。また、接種部位および用量に対する宿主動物の応答性には差があ
り、抗原量が不適切な場合と過剰な場合はいずれも低力価抗血清が作出される。
少量(ngレベル)の抗原を複数の皮内部位に投与すると最も信頼性の高い結果が得
られるように思われる。ポリクローナル抗血清を作出して処理するための手法は
従来技術において周知である。たとえば、MayerおよびWalker(1987)などを参照
のこと。Vaitukaitis, J. et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 33:988-991(19
71)にはウサギでの効果的な免疫化プロトコルが記載されている。
【０８３６】 一定間隔で追加免疫注射を行い、たとえば濃度が分かっている抗原に対する寒
天での二重免疫核酸によって半定量的に測定した抗体力価が低下しはじめたとこ
ろで、抗血清を収集することができる。たとえば、Ouchterlony, O. et al.(197
3)などを参照のこと。この抗体のプラトー濃度は通常、血清(約12μM)の0.1〜0.
2mg/mlの範囲にある。Fisher, D., Chap. 42 in: Manual of Clinical Immunolo
gy, 2d Ed.(Rose and Friedman, Eds.) Amer. Soc. For Microbiol., Washingto
n, D.C.(1980)に記載されているようにして競合的結合曲線を作成し、抗血清の
抗原に対する親和性を判定する。
【０８３７】 モノクローナル抗体法またはポリクローナル抗体法のいずれかに沿って調製し
た抗体調製物は、生物学的試料中の抗原産生物質の濃度を判断する定量的なイム
ノアッセイにおいて有用なものである。また、これらの調製物は、生物学的試料
中の抗原の存在を半定量的あるいは定性的に同定するのにも用いられる。さらに
、タンパク質を発現する細胞を殺す目的あるいは体内のタンパク質濃度を落とす
目的で治療用組成物に抗体を使用してもよい。
【０８３８】 (実施例7) (sbg1ペプチドがマウスの挙動におよぼす影響についての研究) 動物: オスのC57BL6マウス成体(約6週齢) ペプチド: sbg1ペプチド NH2-QPLERMWTCNYNQQKDQSCNHKEITSTKAE-COOH 対照1:NH2-REAHKSETISSKLQKEKQIKKQ-COOH 対照2:NH2-MHMKTILGPRLGLGE-COOH プロトコル: 1. ペプチド50μgを200μl滅菌生理食塩水に溶解した溶液をマウスに腹腔内
注射する(n=4/ペプチド)。 2. 同胞仔の入っていない清潔な空のケージに小さな試験チューブラック(tes
t tube rack)のみを置いてマウスを入れる。このケージにプラスチックのシート
を被せ、写真撮影とビデオによる記録が可能なようにする。 3. 図示のようにt=5分からt=45分まで1分間の挙動を観察する。歩行運動また
は常同行動運動を1分間隔で可能な限りすべて記録した。歩行運動にはよじ登り
および立ち上がりを含み、常同行動運動には身繕いおよび引っ掻きを含む。実験
終了時、1匹ごとに運動数を合計した。 結果: 1. 図18に示すように、sbg1ペプチドを注射したマウスでは実験時間の経過に
ともなって運動頻度が落ちた。これを図18の左上のパネルに示す。このパネルで
、本願発明者らは、3回の異なる時間点(5分、10分および15分)における平均運動
数と観察の最後の時間帯(30分、35分、40分および45分)における1分あたりの平
均運動数とを比較している。また、sbg1ペプチドによって常同行動が増えたが、
この結果は観察の最後の時間帯で最も顕著であった。しかしながら、ステレオタ
イプ(stereotype)の開始時はさまざまであったため、本願発明者らは、観察を行
った時間全体を通しての常同行動の平均としてのデータを得るようにした。
【０８３９】 発行済特許、公開PCT出願、科学技術文献または本願明細書において引用する
他の刊行物一切の開示内容全体を本願明細書に援用する。
【０８４０】 以上、特定の好ましい実施形態について本発明を説明してきたが、本願明細書
の開示内容に鑑みて当業者であれば明白な他の実施形態も本発明の範囲に包含さ
れる。したがって、本発明の範囲は添付の請求の範囲によってのみ定義されるも
のと理解されたい。
【０８４１】 添付の配列表では以下の自由文字列を利用している。 Schizophrenia Associated Protein Biallelic marker regulatory region gene exon complement polymorphic base or allele deletion of basic protease cleavage site probe primer downstream upstream amplification sequencing oligonucleotide
【０８４２】 以下の参照文献は、本明細書中に参照によりそのまま組み込まれている。
【０８４３】 Abbondanzo S.J. et al. (1993) Methods in Enzymology, Academic Press, N
ewYork. pp. 803-823. Ajioka R.S. et al. (1997) Am. J. Hum. Genet.60:1439-1447. Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(3):403-410; Altschul et al., 1993, Nature Genetics 3:266-272 Altschul et al.,1997, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 Anton M. et al., 1995, J. Virol.,69: 4600-4606. Araki K et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. US A. 92(1):160-4. Ausubel et al. (1989)Current Protocols inMolecular Biology, Green Publi
shing Associates and Wiley Interscience,N.Y. Baubonis W. (1993) Nucleic Acids Res. 21(9):2025-9. Beaucage et al., Tetrahedron Lett 1981, 22: 1859-1862 Bradley A.,(1987) Production and analysis of chimaeric mice. In:E.J. R
obertson(Ed.), Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical ap
proach.IRL Press, Oxford, pp. 113. Brown EL, Belagaje R, Ryan MJ, KhoranaHG, Methods Enzymol 1979;68:109-15
1 Brutlag et al. Comp. App.Biosci. 6:237-245, 1990 Chai H. et al. (1993) Biotechnol. Appl.Biochem.18:259-273. Chee et al. (1996) Science. 274:610-614. Chen and Kwok Nucleic Acids Research 25:347-353 1997 Chen et al.(1987) Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752. Chen et al., 1987, Mol. Cell.Biol., 7: 2745-2752. Chou J.Y. (1989) Mol. Endocrinol.3:1511-1514. Clark A.G. (1990) Mol. Biol. Evol. 7:111-122. Coles et al. Hum. Mol. Genet., 7:791-800, 1998 Compton J. (1991)Nature. 350(6313):91-92. Davis et al., Basic Methods in MolecularBiology, ed., Elsevier Press, NY
, 1986 Dempster et al., (1977) J.R. Stat. Soc., 39B:1-38. Dent D.S. and Latchman D.S. (1993) TheDNA mobility shift assay. In: T
ranscription Factors: A PracticalApproach (Latchman DS, ed.) Oxford: IRL
Press. pp1-26. Eckner R. etal. (1991) EMBO J. 10:3513-3522. Excoffier L. and Slatkin M.(1995) Mol. Biol. Evol., 12(5): 921-927. Feldman and Steg, 1996,Medecine Sciences, synthese, 12:47-55 Flotte et al. (1992) Am. J.Respir. Cell Mol. Biol. 7:349-356. Fodor et al. (1991) Science251:767-777. Fraley et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.76:3348-3352. Fried M. and Crothers D.M. (1981) Nucleic Acids Res.9:6505-6525. Fuller S. A. et al. (1996) Immunology in CurrentProtocols in Molecula
r Biology, Ausubel et al.Eds, John Wiley & Sons,Inc., USA. Furth P.A. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci USA.91:9302-9306. Garner M.M. and Revzin A. (1981) Nucleic AcidsRes.9:3047-3060. Geysen H. Mario et al. 1984. Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 81:3998
-4002 Ghosh and Bacchawat (1991) Targeting ofliposomes to hepatocytes, IN: Liv
er Diseases, Targeted diagnosis andtherapy using specific rceptors and l
igands. Wu et al.Eds., MarcelDekeker, New York, pp. 87-104. Gonnet et al., 1992, Science256:1443-1445; Gopal (1985) Mol. Cell. Biol., 5:1188-1190. Gossen M. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.89:5547-5551. Gossen M. et al. (1995) Science. 268:1766-1769. Graham et al. (1973) Virology 52:456-457. Green et al. (1986)Ann. Rev. Biochem. 55:569-597. Griffin et al.(1989) Science.245:967-971. Grompe, M. (1993) Nature Genetics. 5:111-117. Grompe, M. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.86:5855-5892
. Gu H. et al. (1993) Cell 73:1155-1164. Guatelli J C et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 35:273-286. Hacia JG, Brody LC, Chee MS, Fodor SP, Collins FS, Nat Genet1996;14(4):4
41-447 Haff L. A. and Smirnov I. P. (1997) GenomeResearch, 7:378-388. Hames B.D. and Higgins S.J. (1985) NucleicAcid Hybridization: A Practi
cal Approach. Hames and Higgins Ed., IRLPress, Oxford. Harju L, Weber T, Alexandrova L, Lukin M, Ranki M,Jalanko A, Clin Chem 1
993;39(11Pt 1):2282-2287 Harland et al.(1985) J. Cell. Biol. 101:1094-1095. Hawley M.E. et al. (1994) Am.J. Phys. Anthropol. 18:104. Henikoff and Henikoff, 1993, Proteins17:49-61 Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402; Hillier L. and Green P. Methods Appl., 1991, 1: 124-8. Gu H. et al.(
1994) Science 265:103-106. Hoess et al. (1986) Nucleic AcidsRes. 14:2287-2300. Huang L. et al. (1996) Cancer Res56(5):1137-1141. Huygen et al. (1996) Nature Medicine.2(8):893-898. Izant J.G. and Weintraub H. (1984) Cell36(4):1007-1015. Julan et al. (1992) J. Gen. Virol. 73:3251-3255. Kanegae Y. et al., Nucl. Acids Res. 23:3816-3821. Karlin andAltschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2267-2268; Khoury J.et al. (1993) Fundamentals of Genetic Epidemiology, Oxford Uni
versityPress, NY. Kim U-J. et al. (1996) Genomics 34:213-218. Kleinet al. (1987) Nature. 327:70-73. Koller et al. (1992) Annu.Rev. Immunol. 10:705-730. Kozal MJ, Shah N, Shen N, Yang R,Fucini R, Merigan TC, Richman DD, Morri
s D, Hubbell E, Chee M, GingerasTR, Nat Med 1996;2(7):753-759 Landegren U. et al. (1998) GenomeResearch, 8:769-776. Lander and Schork, Science, 265, 2037-2048,1994 Lenhard T. et al. (1996) Gene. 169:187-190. Linton M.F. etal. (1993) J. Clin. Invest. 92:3029-3037. Liu Z. et al. (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 4528-4262. Livak et al.,Nature Genetics, 9:341-342, 1995 Livak KJ, Hainer JW, Hum Mutat1994;3(4):379-385 Lockhart et al.(1996) Nature Biotechnology14:1675-1680. Mansour S.L. et al. (1988) Nature. 336:348-352. Marshall R. L. et al. (1994) PCR Methods and Applications.4:80-84. McCormick et al. (1994) Genet. Anal. Tech. Appl.11:158-164. McLaughlin B.A. et al. (1996) Am. J. Hum. Genet.59:561-569. Morton N.E. (1955) Am. J. Hum. Genet. 7:277-318. Muzyczka et al. (1992) Curr. Topics in Micro. and Immunol.158:97-129.
Nada S. et al. (1993) Cell 73:1125-1135. NagyA. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 8424-8428. Narang SA, Hsiung HM, Brousseau R, Methods Enzymol 1979;68:90-98 Neda etal. (1991) J. Biol. Chem. 266:14143-14146. Newton et al. (1989)Nucleic Acids Res. 17:2503-2516. Nickerson D.A. et al. (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:8923
-8927. Nicolau et al.(1982) Biochim. Biophys. Acta. 721:185-190. Nyren P, Pettersson B,Uhlen M, Anal Biochem 1993;208(1):171-175 O'Reilly et al. (1992)Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manu
al. W. H. Freeman andCo., New York. Ohno et al. (1994) Science. 265:781-784. Orita etal. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.86: 2776-2770. Ott J.(1991) Analysis of Human Genetic Linkage. John Hopkins University
Press,Baltimore. Pastinen et al., Genome Research 1997; 7:606-614 Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448
; Pease S. and William R.S. (1990) Exp. Cell. Res. 190:09-211. Perlin et al. (1994) Am. J. Hum. Genet. 55:777-787. Peterson et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 7593-7597. Pietu et al.(1996) Genome Research.6:492-503. Potter et al. (1984) Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. 81(22):7161-7165.
Rayl et al., (1996) J. Bio.Chem, 271, 2225-2233. Reid L.H. et al. (1990) Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 87:4299-4303.
Risch, N. and Merikangas, K. (1996)Science. 273:1516-1517. Robertson E. (1987) "Embryo-Derived StemCell Lines." In: E.J. Roberts
on Ed. Teratocarcinomas And Embrionic Stem Cells: A Practical Approach.
IRL Press, Oxford, pp. 71. Rossiet al. (1991) Pharmacol. Ther. 50:245-254. Roth J.A. et al. (1996)Nature Medicine. 2(9):985-991. Roux et al. (1989) Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 86:9079-9083. Ruano et al. (1990) Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 87:6296-6300. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and T.Maniatis. (1989) Molecular Cloning:
A Laboratory Manual. 2ed. ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Ha
rbor, New York. Samson M, etal. (1996) Nature, 382(6593):722-725. Samulski et al. (1989) J.Virol. 63:3822-3828. Sanchez-Pescador R. (1988) J. Clin.Microbiol. 26(10):1934-1938. Sarkar, G. and Sommer S.S. (1991)Biotechniques. Sauer B. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 85:5166-5170.
Schaid D.J. et al. (1996) Genet. Epidemiol.13:423-450. Schedl A. et al. (1993a) Nature. 362:258-261. Schedl et al. (1993b) Nucleic Acids Res. 21:4783-4787. Schedl etal. (1993b) Nucleic Acids Res. 21:4783-4787. Schena et al. (1995)Science. 270:467-470. Schena et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 93(20):10614-1061
9. Schneider et al.(1997) Arlequin: ASoftware For Population Genetics Data
Analysis. University of Geneva. Schwartz and Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting DistanceRelatio
nships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington:National Bio
medical Research Foundation Sczakiel G. et al. (1995)Trends Microbiol. 3(6):213-217. Shay J.W. et al. (1991) Biochem.Biophys. Acta. 1072:1-7. Sheffield, V.C. et al. (1991) Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 49:699-
706. Shizuya et al. (1992) Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:8794-8797. Shoemaker DD, Lashkari DA,Morris D, Mittmann M, Davis RW, Nat Genet 1996
;14(4):450-456 Smith(1957) Ann. Hum. Genet. 21:254-276. Smith et al. (1983) Mol. Cell.Biol. 3:2156-2165. Sosnowski R.G. et al. (1997) Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 94:1119-
1123. Spielmann S. and Ewens W. J. (1998) Am. J.Hum. Genet. 62:450-458.
Spielmann S. et al. (1993) Am. J. Hum.Genet. 52:506-516. Sternberg N.L. (1992) Trends Genet. 8:1-16. Sternberg N.L. (1994) Mamm. Genome. 5:397-404. Syvanen AC, ClinChim Acta 1994;226(2):225-236 Tacson et al. (1996) NatureMedicine. 2(8):888-892. Te Riele et al. (1990) Nature.348:649-651. Terwilliger J.D. and Ott J. (1994) Handbook of HumanGenetic Linkage.
John Hopkins University Press, London. Thomas K.R.et al. (1986) Cell. 44:419-428. Thomas K.R. et al. (1987)Cell. 51:503-512. Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res.22(2):4673-4680; Tur-Kaspa et al. (1986) Mol. Cell. Biol.6:716-718. Tyagi et al. (1998) Nature Biotechnology. 16:49-53. Urdea M.S. (1988) Nucleic Acids Research. 11:4937-4957. UrdeaM.S. et al.(1991) Nucleic Acids Symp. Ser. 24:197-200. Van derLugt et al. (1991) Gene. 105:263-267. Vlasak R. et al. (1983)Eur. J. Biochem. 135:123-126. Wabiko et al. (1986)DNA.5(4):305-314. Walker et al. (1996) Clin. Chem. 42:9-13. Weir, B.S. (1996) Genetic data Analysis II: Methods for Discretepopulat
ion genetic Data, Sinauer Assoc., Inc., Sunderland, MA, U.S.A. White, M.B. et al. (1992) Genomics. 12:301-306. White, M.B. etal. (1997) Genomics. 12:301-306. Wong et al. (1980) Gene.10:87-94. Wood S.A. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.90:4582-4585.
Wu and Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432. Wu and Wu (1988) Biochemistry. 27:887-892. Wu et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:2757. Yagi T. et al. (1990) Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:9918-9922. Zhao et al. (1998) Am.J. Hum. Genet. 63:225-240. Zou Y. R. et al. (1994) Curr. Biol.4:1099-1103
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 sbg1遺伝子のエキソン構造を示す図である。
【図２】 散発性および家族性のフランス系カナダ人の精神分裂病症例およ
び対照例における本発明の染色体13q31-q33バイアレリックマーカーから選択し
たいくつかのバイアレリックマーカーのアレル頻度の統計的有意性を示す表であ
る。
【図３】 フランス系カナダ人の精神分裂病の全症例と本発明の染色体13q3
1-q33バイアレリックマーカーからなるハプロタイプとの間のハプロタイプ関連
性解析の結果を示す表である。
【図４】 本発明のバイアレリックマーカーから選択したいくつかのバイア
レリックマーカーが統計的に有意なハプロタイプにどのように関与しているかを
示す表である。
【図５】 フランス系カナダ人の精神分裂病症例と本発明の染色体13q31-q3
3バイアレリックマーカーからなるハプロタイプとの間のハプロタイプ関連性解
析の結果を示す表である。
【図６】 フランス系カナダ人の精神分裂病症例と本発明の染色体13q31-q3
3バイアレリックマーカーからなるハプロタイプとの間のハプロタイプ関連性解
析の結果を示す表である。
【図７】 図7Aおよび図7Bは、精神分裂病症例と本発明の領域Dバイアレリ
ックマーカーを含むハプロタイプとの間のハプロタイプ関連性解析(総括的なLR
検定での値の分布)の結果を示す図である。
【図８】 図8Aおよび図8Bは、精神分裂病症例と本発明の領域Dバイアレリ
ックマーカーを含むハプロタイプとの間のハプロタイプ関連性解析(HaplotMaxM
検定での値の分布)の結果を示す図である。
【図９】 図9Aおよび図9Bは、双極性障害症例と本発明の領域Dバイアレリ
ックマーカーを含むハプロタイプとの間のハプロタイプ関連性解析(総括的なLR
検定での値の分布)の結果を示す図である。
【図１０】 図10Aおよび図10Bは、双極性障害症例と本発明の領域Dバイア
レリックマーカーを含むハプロタイプとの間のハプロタイプ関連性解析(HaploMa
xM検定での値の分布)の結果を示す図である。
【図１１】 図11Aおよび図11Bは、双極性障害症例と本発明の領域Dバイア
レリックマーカーを含むハプロタイプとの間のハプロタイプ関連性解析(HaploMa
xS検定での値の分布)の結果を示す図である。
【図１２】 フランス系カナダ人から得た試料の領域Dの小領域D1〜D4にお
ける単点バイアレリックマーカー解析および多点バイアレリックマーカー解析で
の有意な解析結果数を比較した図である。
【図１３】 フランス系カナダ人から得た試料の領域Dにわたる単点バイア
レリックマーカー解析および多点バイアレリックマーカー解析での有意な解析結
果数をまとめた図である。
【図１４】 米国人の精神分裂病患者から得た試料の領域Dの小領域D1〜D4
における単点バイアレリックマーカー解析および多点バイアレリックマーカー解
析での有意な解析結果数を比較した図である。
【図１５】 米国人の精神分裂病患者から得た試料の領域Dにわたる単点バ
イアレリックマーカー解析および多点バイアレリックマーカー解析での有意な解
析結果数をまとめた図である。
【図１６】 アルゼンチン人の双極性障害患者から得た試料の領域Dの小領
域D1〜D4における単点バイアレリックマーカー解析および多点バイアレリックマ
ーカー解析での有意な解析結果数を比較した図である。
【図１７】 アルゼンチン人の双極性障害患者から得た試料の領域Dにわた
る単点バイアレリックマーカー解析および多点バイアレリックマーカー解析での
有意な解析結果数をまとめた図である。
【図１８】 sbg1ペプチドを注射することによってマウスの運動活性および
常同行動にどのような影響がおよぶかを示す図である。
【図１９】 コンピュータシステムの一例を示すブロック図である。
【図２０】 新規な配列とデータベース内の配列との間の相同性レベルを判
定すべく、新規なヌクレオチド配列またはタンパク質配列と配列のデータベース
とを比較するプロセス200の一実施形態を示す流れ図である。
【図２１】 コンピュータでにおいて2つの配列が相同的であるか否かを判
定するためのプロセス250の一実施形態を示す流れ図である。
【図２２】 配列内における特徴の存在を検出するためのアイデンティファ
イアプロセス300の一実施形態を示す流れ図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０６Ｆ 17/60 １２６Ｇ ５Ｂ０７５ Ｃ１２Ｑ 1/68 17/30 １７０Ｆ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０６Ｆ 17/60 １２６ 5/00 Ｂ // Ｇ０６Ｆ 17/30 １７０ 15/00 Ｆ (31)優先権主張番号 ６０／１３２，０６５ (32)優先日 平成11年４月30日(1999．4．30) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１４３，９２８ (32)優先日 平成11年７月14日(1999．7．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１４５，９１５ (32)優先日 平成11年７月27日(1999．7．27) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１４６，４５３ (32)優先日 平成11年７月29日(1999．7．29) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１４６，４５２ (32)優先日 平成11年７月29日(1999．7．29) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１６２，２８８ (32)優先日 平成11年10月28日(1999．10．28) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シュマコフ，イルヤ フランス国 エフ−77000 ヴォー−ル− ペニル，ル ド シェブレフェイ，196 (72)発明者 ブーグレット，リディー フランス国 エフ−92170 ヴァンヴェ， アベニュ ヴィクトール ヒューゴー， 108 (72)発明者 ビハイン，ベルナルド アメリカ合衆国 92024 カリフォルニア 州，エンシニタス，パシフィック ヴュー レーン 238 (72)発明者 エシォー，ローレント フランス国 エフ−75012 パリ，ル ド リュイリー，107 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA44 BA61 CA01 CA09 DA02 GA11 GA18 HA12 HA15 4B063 QA19 QQ02 QQ43 QQ58 QR08 QR32 QR55 QR62 QR84 QS25 QS34 QX01 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA13 4B065 AA90X AA93Y AB01 AC12 AC14 BA02 CA46 4H045 AA30 BA10 CA40 EA50 FA74 5B075 ND20 UU26

Claims (73)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号1のヌクレオチド位置範囲213818〜243685と、配列
    番号2〜26および44〜111と、それらの相補体と、からなる群から選択される少な
    くとも12ヌクレオチドの連続スパンを含む、単離されたポリヌクレオチド、精製
    されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 配列番号36〜40と、配列番号112〜229と、配列番号1のヌク
    レオチド位置範囲31〜292651および292844〜319608と、それらの相補体と、から
    なる群から選択される少なくとも12ヌクレオチドの連続スパンを含む、単離され
    たポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチ
    ド。
  3. 【請求項３】 配列番号1またはその相補体の前記連続スパンが、配列番号1
    の下記のヌクレオチド位置： (a) 292653〜296047、292653〜292841、295555〜296047および295580〜29604
    7、 (b) 31〜1107、1108〜65853、1108〜1289、14877〜14920、18778〜18862、25
    593〜25740、29388〜29502、29967〜30282、64666〜64812、65505〜65853および
    65854〜67854、 (c) 94124〜94964、 (d) 213818〜215818、215819〜215941、215819〜215975、216661〜216952、2
    16661〜217061、217027〜217061、229647〜229742、230408〜230721、231272〜2
    31412、231787〜231880、231870〜231879、234174〜234321、237406〜237428、2
    39719〜239807、239719〜239853、240528〜240569、240528〜240596、240528〜2
    40617、240528〜240644、240528〜240824、240528〜240994、240528〜241685、2
    40800〜240993および241686〜243685、 (e) 201188〜201234、214676〜214793、215702〜215746および216836〜21691
    5 のうち少なくとも1つを含んでなる、請求項2に記載の単離されたポリヌクレオチ
    ド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 前記スパンが、A1〜A69、A71〜A74、A76〜A94、A96〜A106、
    A108〜A112、A114〜A177、A179〜A197、A199〜A222、A224〜A246、A250、A251、
    A253、A255、A259、A266、A268〜A232およびA328〜A489からなる群から選択され
    るバイアレリックマーカーを含む、請求項1または2に記載の単離されたポリヌク
    レオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 請求項1〜４のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む
    組換えベクター。
  6. 【請求項６】 請求項5に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
  7. 【請求項７】 請求項5に記載の組換えベクターを含む非ヒト宿主動物また
    は哺乳動物。
  8. 【請求項８】 請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む
    ノックアウトベクターを用いた相同的組換えによって破壊されたsbg1遺伝子、g3
    4665遺伝子、sbg2遺伝子、g35018遺伝子またはg35017遺伝子を含む哺乳動物宿主
    細胞。
  9. 【請求項９】 請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む
    ノックアウトベクターを用いた相同的組換えによって破壊されたsbg1遺伝子、g3
    4665遺伝子、sbg2遺伝子、g35018遺伝子またはg35017遺伝子を含む非ヒト宿主哺
    乳動物。
  10. 【請求項１０】 A1〜A69、A71〜A74、A76〜A94、A96〜A106、A108〜A112、
    A114〜A177、A179〜A197、A199〜A222、A224〜A246、A250、A251、A253、A255、
    A259、A266、A268〜A232およびA328〜A489からなる群から選択されるバイアレリ
    ックマーカーのヌクレオチドの正体を判定するための、配列番号1〜26、36〜40
    および112〜229またはそれらの相補配列からなる群から選択される配列の少なく
    とも12ヌクレオチドの連続スパンを含むポリヌクレオチドの使用。
  11. 【請求項１１】 前記連続スパンの3'末端が前記ポリヌクレオチドの3'末端
    に位置し、前記ポリヌクレオチドの3'末端が前記配列中のバイアレリックマーカ
    ーの1ヌクレオチド上流に位置する、マイクロシークエンシングアッセイでの請
    求項10に記載のポリヌクレオチドの使用。
  12. 【請求項１２】 前記スパンがバイアレリックマーカーを含む、ハイブリダ
    イゼーションアッセイでの請求項10に記載のポリヌクレオチドの使用。
  13. 【請求項１３】 前記連続スパンの3'末端が前記ポリヌクレオチドの3'末端
    に位置し、前記バイアレリックマーカーが前記ポリヌクレオチドの3'末端に存在
    する、特異的増幅アッセイでの請求項10に記載のポリヌクレオチドの使用。
  14. 【請求項１４】 前記連続スパンの3'末端が前記ポリヌクレオチドの3'末端
    に位置する、シークエンシングアッセイでの請求項10に記載のポリヌクレオチド
    の使用。
  15. 【請求項１５】 前記ポリヌクレオチドが、実質的に、D1〜D69、D71〜D74
    、D76〜D94、D96〜D106、D108〜D112、D114〜D177、D179〜D197、D199〜D222、D
    224〜D246、D250、D251、D253、D255、D259、D266、D268〜D232およびD328〜D36
    0からなる群から選択される配列からなる、請求項11に記載のポリヌクレオチド
    。
  16. 【請求項１６】 実質的に、以下の配列：B1〜B229、C1〜C229およびB1〜B2
    29、C1〜C229およびP1〜P69、P71〜P74、P76〜P94、P96〜P106、P108〜P112、P1
    14〜P177、P179〜P197、P199〜P222、P224〜P246、P250、P251、P253、P255、P2
    59、P266、P268〜P232およびP328〜P360から選択される配列からなる、請求項2
    に記載のポリヌクレオチド。
  17. 【請求項１７】 A1〜A69、A71〜A74、A76〜A94、A96〜A106、A108〜A112、
    A114〜A177、A179〜A197、A199〜A222、A224〜A246、A250、A251、A253、A255、
    A259、A266、A268〜A232およびA328〜A489からなる群から選択されるバイアレリ
    ックマーカーを含むヌクレオチドセグメントを増幅するための、配列番号1〜26
    、36〜40および112〜229またはそれらの相補配列からなる群から選択される配列
    の少なくとも12ヌクレオチドの連続スパンを含むポリヌクレオチドの使用。。
  18. 【請求項１８】 固相支持体に結合された、請求項1〜4、15または16のいず
    れか1項に記載のポリヌクレオチド。
  19. 【請求項１９】 請求項18に記載のポリヌクレオチド少なくとも1個を含む
    ポリヌクレオチドのアレイ。
  20. 【請求項２０】 前記アレイがアドレス指定可能なものである、請求項19に
    記載のアレイ。
  21. 【請求項２１】 標識をさらに含む、請求項1〜4、15、16または18〜20のい
    ずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
  22. 【請求項２２】 生物学的試料において、A1〜A69、A71〜A74、A76〜A94、A
    96〜A106、A108〜A112、A114〜A177、A179〜A197、A199〜A222、A224〜A246、A2
    50、A251、A253、A255、A259、A266、A268〜A232およびA328〜A489またはそれら
    の相補体からなる群から選択されるバイアレリックマーカーのヌクレオチドの正
    体を判定することを含む、遺伝子型判定方法。
  23. 【請求項２３】 生物学的試料において領域Ｄ関連バイアレリックマーカー
    のヌクレオチドまたはその相補体の正体を判定することを含む、遺伝子型判定方
    法。
  24. 【請求項２４】 前記生物学的試料が単一の被検体に由来するものである、
    請求項22に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記生物学的試料が複数の被検体に由来するものである、
    請求項22に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記判定ステップの前に、バイアレリックマーカーを含む
    前記配列の一部を増幅するステップをさらに含む、請求項22に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記増幅をPCRによって行う、請求項26に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記判定をハイブリダイゼーションアッセイによって行う
    、請求項22に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記判定をシークエンシングアッセイによって行う、請求
    項22に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記判定をマイクロシークエンシングアッセイによって行
    う、請求項22に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記判定を酵素ベースのミスマッチ検出アッセイによって
    行う、請求項22に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 個体群におけるバイアレリックマーカーのアレル頻度を推
    定する方法であって、 a) 請求項22に記載の方法に従って、前記バイアレリックマーカーについて前
    記個体群に含まれる個体の遺伝子型を判定するステップと、 b) 前記個体群における前記バイアレリックマーカーの比例代表を決定するス
    テップと、を含む方法。
  33. 【請求項３３】 遺伝子型と形質との間の関連性を検出するための方法であ
    って、 a) 請求項32に記載の方法に従って、形質陽性個体群における少なくとも1つ
    のバイアレリックマーカーの頻度を決定するステップと、 b) 請求項32に記載の方法に従って、対照個体群における少なくとも1つのバ
    イアレリックマーカーの頻度を決定するステップと、 c) 前記遺伝子型と前記形質との間に統計的に有意な関連性があるか否かを判
    定するステップと、を含む方法。
  34. 【請求項３４】 個体群において一組のバイアレリックマーカーについてハ
    プロタイプ頻度を推定する方法であって、 a) 前記個体群における各個体について請求項22に記載の方法に従って少なく
    とも1つのバイアレリックマーカーの遺伝子型を判定するステップと、 b) 前記個体群の各個体のゲノムに存在する第2のバイアレリックマーカーの
    両コピーについて、前記第2のバイアレリックマーカーにおけるヌクレオチドの
    正体を判定することによって前記第2のバイアレリックマーカーの遺伝子型を判
    定するステップと、 c) ステップa)およびb)において特定されたヌクレオチドの正体にハプロタイ
    プ決定法を適用し、前記頻度の推定値を得るステップと、を含む方法。
  35. 【請求項３５】 前記ハプロタイプ決定法が、非対称PCR増幅、特定のアレ
    ルの二重PCR増幅、クラーク法または期待値最大化アルゴリズムからなる群から
    選択される、請求項34に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 ハプロタイプと形質との間の関連性を検出する方法であっ
    て、 a) 請求項34に記載の方法に従って、形質陽性個体群における少なくとも1つ
    のハプロタイプの頻度を推定するステップと、 b) 請求項34に記載の方法に従って、対照個体群における前記ハプロタイプの
    頻度を推定するステップと、 c) 前記ハプロタイプと前記形質との間に統計的に有意な関連性があるか否か
    を判定するステップと、を含む方法。
  37. 【請求項３７】 前記遺伝子型を判定するステップa)を、前記個体群の各個
    体について行う、請求項33に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記遺伝子型の判定を、前記個体群から得てプールした単
    一の生物学的試料について行う、請求項33に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 アレルと表現型との間の関連性を検出するための方法であ
    って、 a) 請求項32に記載の方法に従って、形質陽性個体群における少なくとも1つ
    のバイアレリックマーカーアレルの頻度を決定するステップと、 b) 請求項32に記載の方法に従って、対照個体群における前記バイアレリック
    マーカーアレルの頻度を決定するステップと、 c) 前記アレルと前記表現型との間に統計的に有意な関連性があるか否かを判
    定するステップと、を含む方法。
  40. 【請求項４０】 前記形質が精神分裂病または双極性障害である、請求項33
    または36に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記形質が、精神分裂病または双極性障害に対する素因、
    精神分裂病または双極性障害の早期発症、あるいは、精神分裂病もしくは双極性
    障害の治療に対する有益な応答または精神分裂病もしくは双極性障害の治療に関
    連した副作用である、請求項33または36に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記表現型が精神分裂病または双極性障害の症状である、
    請求項39に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記対照個体群が形質陰性個体群である、請求項33または
    36に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記症例対照個体群が無作為個体群である、請求項33また
    は36に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 個体に精神分裂病または双極性障害の危険性があるか否か
    を判定する方法であって、 a) 請求項22に記載の方法に従って、少なくとも1つのバイアレリックマーカ
    ーの遺伝子型を判定するステップと、 b) ステップa)で得られる結果と、精神分裂病または双極性障害発症の危険性
    とを相関させるステップと、を含む方法。
  46. 【請求項４６】 前記バイアレリックマーカーが、A1〜A69、A71〜A74、A76
    〜A94、A96〜A106、A108〜A112、A114〜A177、A179〜A197、A199〜A222、A224〜
    A242、A250〜A251、A259、A269〜A270、A278、A285〜A295、A303〜A307、A330、
    A334〜A335、A346〜357および361〜489およびそれらの相補体からなる群から選
    択される、請求項22、32〜34、36、39および45のいずれか1項に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 請求項1〜4、15、16または18〜20のいずれか1項に記載の
    ポリヌクレオチドを含む診断用キット。
  48. 【請求項４８】 配列番号2〜26および36〜40およびそのフラグメントまた
    は変異体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコード
    される、精製または単離された、sbg1ポリペプチドまたはg35018ポリペプチド。
  49. 【請求項４９】 配列番号27〜25および41〜43のうちいずれかの連続した少
    なくとも6アミノ酸残基を含む、精製または単離された、sbg1ポリペプチドまた
    はg35018ポリペプチド。
  50. 【請求項５０】 少なくとも1つのアミノ酸置換、付加または欠失を含む、
    請求項49に記載の精製または単離されたsbg1ポリペプチドまたはg35018ポリペプ
    チド。
  51. 【請求項５１】 実質的に、 配列番号29の1〜63および64〜102、配列番号30の1〜64、65〜111および112〜1
    19、配列番号32の1〜64および65〜126、配列番号34の1〜64、65〜123および124
    〜153および配列番号35の1〜61および65〜106からなる群から選択されるアミノ
    酸位置範囲からなる、精製または単離されたsbg1ペプチド。
  52. 【請求項５２】 a) sbg1ポリペプチドまたはg35018ポリペプチドをコード
    する核酸を含む請求項5に記載の組換えベクターを含む細胞宿主を提供するステ
    ップと、 b) 前記組換え細胞宿主によって産生されるsbg1ポリペプチドまたはg35018ポ
    リペプチドを回収するステップと、を含む、sbg1ポリペプチドまたはg35018ポリ
    ペプチドの生産方法。
  53. 【請求項５３】 組換え細胞宿主が請求項6に記載の組換え細胞宿主である
    、請求項52に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 請求項49〜51のいずれか1項に記載のポリペプチドに選択
    的に結合できる、単離または精製された抗体組成物。
  55. 【請求項５５】 生物学的試料において、sbg1ポリペプチドまたはg35018ポ
    リペプチドの存在を特異的に検出するための方法であって、 a) 生物学的試料と、請求項49〜51のいずれか1項に記載のsbg1ポリペプチド
    またはg35018ポリペプチドに対する抗体とを接触させるステップと、 b) 前記抗体と前記ポリペプチドとの間に形成される抗原抗体複合体を検出す
    るステップと、を含む方法。
  56. 【請求項５６】 生物学的試料において、sbg1ポリペプチドまたは35018ポ
    リペプチドの存在をin vitroにて検出するための診断用キットであって、 a) 請求項49〜51のいずれか1項に記載のsbg1ポリペプチドまたはg35018ポリ
    ペプチドまたはそのフラグメントに対する、任意に標識されたポリクローナル抗
    体またはモノクローナル抗体と、 b) 前記sbg1ポリペプチドまたはg35018ポリペプチドと抗体との間に形成され
    る抗原抗体複合体の検出を可能にする試薬と、を含む診断用キット。
  57. 【請求項５７】 a) 請求項49〜51のいずれか1項に記載のポリペプチドを
    提供するステップと、 b) 候補物質を得るステップと、 c) 前記ポリペプチドと前記候補物質とを接触させるステップと、 d) 前記ポリペプチドと前記候補物質との間に形成される複合体を検出するス
    テップと、を含む、候補物質のスクリーニング方法。
  58. 【請求項５８】 ステップd)において、形成される複合体を請求項63に記載
    のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の存在下でインキュベートする
    、請求項66に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 sbg1ポリペプチドまたはg35018ポリペプチドと相互作用す
    る候補物質をスクリーニングするためのキットであって、 a) 請求項49〜51のいずれか1項に記載のポリペプチドと、 b) 任意に、請求項54に記載のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体
    と、を含むキット。
  60. 【請求項６０】 a) 自己のプロモーターの制御下におかれた、sbg1タンパ
    ク質またはその変異体またはフラグメントをコードするヌクレオチド配列でトラ
    ンスフェクトした原核細胞または真核細胞を培養するステップと、 b) 培養した細胞と被検分子とを接触させるステップと、 c) sbg1タンパク質またはその変異体またはフラグメントの発現を定量化する
    ステップと、を含む、候補物質のスクリーニング方法。
  61. 【請求項６１】 (a) 精神分裂病または双極性障害に関連する症状または
    終末点を引き起こすのに十分なレベルのsbg1活性に動物を曝露するステップと、 (b) 前記動物を被検化合物に曝露するステップと、を含む、疾患治療用化合
    物を同定するための方法。
  62. 【請求項６２】 前記動物が非ヒト哺乳動物である、請求項61に記載の方法
    。
  63. 【請求項６３】 前記動物が非ヒト霊長類である、請求項61に記載の方法。
  64. 【請求項６４】 請求項49〜51のいずれか1項に記載のsbg1ポリペプチドで
    前記動物を処理する、請求項61に記載の方法。
  65. 【請求項６５】 a) 配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35
    、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500、1000または2000ヌクレオチド
    の連続スパンおよびそれらの相補体であって、前記連続スパンが、配列番号1の
    ヌクレオチド位置31〜292651および292844〜319608の少なくとも1つを含むもの
    と、 b) 長さが特定の配列番号と合致する程度までの、配列番号54〜229のうちい
    ずれかの少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、10
    0、150、200、500、1000または2000ヌクレオチドの連続スパンおよびそれらの相
    補体と、 c) 長さが特定の配列番号と合致する程度までの、配列番号2〜26、36〜40の
    少なくとも8、12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75
    、80、90、100または200ヌクレオチドの連続スパンまたはそれらの相補体と、 d) 配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、55、6
    0、65、70、75、80、90または100ヌクレオチドの連続スパンまたはそれらの相補
    体であって、前記連続スパンが、配列番号1の下記のヌクレオチド位置： (i) 292653〜296047、292653〜292841、295555〜296047および295580〜29604
    7、 (ii) 31〜1107、1108〜65853、1108〜1289、14877〜14920、18778〜18862、2
    5593〜25740、29388〜29502、29967〜30282、64666〜64812、65505〜65853およ
    び65854〜67854、 (iii) 94124〜94964、 (iv) 213818〜215818、215819〜215941、215819〜215975、216661〜216952、
    216661〜217061、217027〜217061、229647〜229742、230408〜230721、231272〜
    231412、231787〜231880、231870〜231879、234174〜234321、237406〜237428、
    239719〜239807、239719〜239853、240528〜240569、240528〜240596、240528〜
    240617、240528〜240644、240528〜240824、240528〜240994、240528〜241685、
    240800〜240993および241686〜243685、 (v) 201188〜216915、201188〜201234、214676〜214793、215702〜215746お
    よび216836〜216915 のうち少なくとも1つを含むものと、 e) A1〜A489からなる群から選択されるバイアレリックマーカーを含む、a)、
    b)、c)またはd)の連続スパンと、 f) 配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、8
    0、90、100、150、200、500、1000または2000ヌクレオチドの連続スパンまたは
    それらの相補体であって、前記連続スパンが、下記の表1に列挙される配列番号1
    のpos1〜pos166で示されるヌクレオチド位置の範囲のうちいずれか1つの少なく
    とも1、2、3、5または10ヌクレオチド位置を含むものと、 g) 配列番号2〜26、36〜40および54〜229のうちいずれかの少なくとも12、15
    、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500、1000ま
    たは2000ヌクレオチドの連続スパンおよびそれらの相補体であって、前記スパン
    が、染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカー、領域Ｄ関連バイアレリック
    マーカー、sbg1関連バイアレリックマーカー、g34665関連バイアレリックマーカ
    ー、sbg2関連バイアレリックマーカー、g35017関連バイアレリックマーカーまた
    はg35018関連バイアレリックマーカーを含むものと、 h) 配列番号2〜26、36〜40および54〜229のうちいずれかの少なくとも12、15
    、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500、1000ま
    たは2000ヌクレオチドの連続スパンおよびそれらの相補体であって、前記スパン
    が、染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカー、領域Ｄ関連バイアレリック
    マーカー、sbg1関連バイアレリックマーカー、g34665関連バイアレリックマーカ
    ー、sbg2関連バイアレリックマーカー、g35017関連バイアレリックマーカーまた
    はg35018関連バイアレリックマーカー(ただし、別のアレルが前記バイアレリッ
    クマーカーに存在するもの)を含むものと、 i) 配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、8
    0、90、100、150、200、500、1000または2000ヌクレオチドの連続スパンおよび
    それらの相補体であって、前記スパンが、A1〜A69、A71〜A74、A76〜A94、A96〜
    A106、A108〜A112、A114〜A177、A179〜A197、A199〜A222、A224〜A242および36
    1〜A489からなる群から選択される多型を含むものと、 j) a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)およびi)の連続スパンのいずれか1つに
    対して相補的であるヌクレオチド配列と、 のうちいずれか1つを含む核酸コードからなる群から選択される配列を記憶させ
    た、コンピュータ読み取り可能な媒体。
  66. 【請求項６６】 配列番号27〜35および41〜43からなる群から選択されるポ
    リペプチド配列の少なくとも6アミノ酸の連続スパンを含むポリペプチドコード
    からなる配列を記憶させた、コンピュータ読み取り可能な媒体。
  67. 【請求項６７】 プロセッサとデータ記憶デバイスとを備えるコンピュータ
    システムであって、前記データ記憶デバイスが請求項65または66に記載のコンピ
    ュータ読み取り可能な媒体を含む、コンピュータシステム。
  68. 【請求項６８】 配列コンペアラおよび基準配列を記憶させたデータ記憶デ
    バイスをさらに含む、請求項67に記載のコンピュータシステム。
  69. 【請求項６９】 前記配列コンペアラが多型を示すコンピュータプログラム
    を含む、請求項68に記載のコンピュータシステム。
  70. 【請求項７０】 前記配列の特徴を識別するアイデンティファイアをさらに
    備える、請求項68に記載のコンピュータシステム。
  71. 【請求項７１】 第1の配列と基準配列とを比較する方法であって、 a) 配列を比較するコンピュータプログラムを用いて、第1の配列および基準
    配列を読み取るステップと、 b) 前記コンピュータプログラムを用いて第1の配列と基準配列との差を確認
    するステップと、を含み、 前記第1の配列が、 (i) 配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、
    80、90、100、150、200、500、1000または2000ヌクレオチドの連続スパンおよび
    それらの相補体であって、前記連続スパンが、配列番号1のヌクレオチド位置31
    〜292651および292844〜319608のうち少なくとも1つを含むものと、 (ii) 長さが特定の配列番号と合致する程度までの、配列番号54〜229のうち
    いずれかの少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、
    100、150、200、500、1000または2000ヌクレオチドの連続スパンおよびそれらの
    相補体と、 (iii) 長さが特定の配列番号と合致する程度までの、配列番号2〜26、36〜40
    の少なくとも8、12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、7
    5、80、90、100または200ヌクレオチドの連続スパンまたはそれらの相補体と、 (iv) 配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、55
    、60、65、70、75、80、90または100ヌクレオチドの連続スパンまたはそれらの
    相補体であって、前記連続スパンが、配列番号1の下記のヌクレオチド位置： a) 292653〜296047、292653〜292841、295555〜296047および295580〜296047
    、 b) 31〜1107、1108〜65853、1108〜1289、14877〜14920、18778〜18862、255
    93〜25740、29388〜29502、29967〜30282、64666〜64812、65505〜65853および6
    5854〜67854、 c) 94124〜94964、 d) 213818〜215818、215819〜215941、215819〜215975、216661〜216952、21
    6661〜217061、217027〜217061、229647〜229742、230408〜230721、231272〜23
    1412、231787〜231880、231870〜231879、234174〜234321、237406〜237428、23
    9719〜239807、239719〜239853、240528〜240569、240528〜240596、240528〜24
    0617、240528〜240644、240528〜240824、240528〜240994、240528〜241685、24
    0800〜240993および241686〜243685、 e) 201188〜216915、201188〜201234、214676〜214793、215702〜215746およ
    び216836〜216915、 のうち少なくとも1つを含むものと、 (v) A1〜A489からなる群から選択されるバイアレリックマーカーを含む、(i)
    〜(iv)の連続スパンと、 (vi) 配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70
    、80、90、100、150、200、500、1000または2000ヌクレオチドの連続スパンまた
    はそれらの相補体であって、前記連続スパンが、表1に列挙される配列番号1のpo
    s1〜pos166で示されるヌクレオチド位置範囲のうちいずれか1つの少なくとも1、
    2、3、5または10ヌクレオチド位置を含むものと、 (vii) 配列番号2〜26、36〜40、54〜229のうちいずれかの少なくとも12、15
    、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500、1000ま
    たは2000ヌクレオチドの連続スパンおよびそれらの相補体であって、前記スパン
    が、染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカー、領域Ｄ関連バイアレリック
    マーカー、sbg1関連バイアレリックマーカー、g34665関連バイアレリックマーカ
    ー、sbg2関連バイアレリックマーカー、g35017関連バイアレリックマーカーまた
    はg35018関連バイアレリックマーカーを含むものと、 (viii) 配列番号2〜26、36〜40、54〜229のうちいずれか1つの少なくとも12
    、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500、10
    00または2000ヌクレオチドの連続スパンおよびそれらの相補体であって、前記ス
    パンが、染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカー、領域Ｄ関連バイアレリ
    ックマーカー、sbg1関連バイアレリックマーカー、g34665関連バイアレリックマ
    ーカー、sbg2関連バイアレリックマーカー、g35017関連バイアレリックマーカー
    またはg35018関連バイアレリックマーカー(ただし、別のアレルが前記バイアレ
    リックマーカーに存在するもの)を含むものと、 (ix) 配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70
    、80、90、100、150、200、500、1000または2000ヌクレオチドの連続スパンおよ
    びそれらの相補体であって、前記スパンが、A1〜A69、A71〜A74、A76〜A94、A96
    〜A106、A108〜A112、A114〜A177、A179〜A197、A199〜A222、A224〜A242および
    361〜A489からなる群から選択される多型を含むものと、 (x) (i)から(ix)の連続スパンのいずれか1つに対して相補的であるヌクレオ
    チド配列と、 のうちいずれか1つを含む核酸コードと、 (xi) 配列番号27〜35および41〜43からなる群から選択されるポリペプチド配
    列の少なくとも6アミノ酸の連続スパンを含むポリペプチドコードと、からなる
    群から選択される、前記方法。
  72. 【請求項７２】 第1の配列と基準配列との差を確認する前記ステップが、
    少なくとも1つの多型を識別することを含む、請求項71に記載の方法。
  73. 【請求項７３】 配列の特徴を識別する方法であって、 a) 配列の特徴を識別するコンピュータプログラムを用いて、前記配列を読み
    取るステップと、 b) 前記コンピュータプログラムを用いて前記配列の特徴を識別するステップ
    と、を含み、 前記配列が、 (i) 配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、
    80、90、100、150、200、500、1000または2000ヌクレオチドの連続スパンおよび
    それらの相補体であって、前記連続スパンが、配列番号1のヌクレオチド位置31
    〜292651および292844〜319608のうち少なくとも1つを含むものと、 (ii) 長さが特定の配列番号と合致する程度までの、配列番号54〜229のうち
    いずれかの少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、
    100、150、200、500、1000または2000ヌクレオチドの連続スパンおよびそれらの
    相補体と、 (iii) 長さが特定の配列番号と合致する程度までの、配列番号2〜26、36〜40
    の少なくとも8、12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、7
    5、80、90、100または200ヌクレオチドの連続スパンまたはそれらの相補体と、 (iv) 配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、55
    、60、65、70、75、80、90または100ヌクレオチドの連続スパンまたはそれらの
    相補体であって、前記連続スパンが、配列番号1の下記のヌクレオチド位置： a) 292653〜296047、292653〜292841、295555〜296047および295580〜296047
    、 b) 31〜1107、1108〜65853、1108〜1289、14877〜14920、18778〜18862、255
    93〜25740、29388〜29502、29967〜30282、64666〜64812、65505〜65853および6
    5854〜67854、 c) 94124〜94964、 d) 213818〜215818、215819〜215941、215819〜215975、216661〜216952、21
    6661〜217061、217027〜217061、229647〜229742、230408〜230721、231272〜23
    1412、231787〜231880、231870〜231879、234174〜234321、237406〜237428、23
    9719〜239807、239719〜239853、240528〜240569、240528〜240596、240528〜24
    0617、240528〜240644、240528〜240824、240528〜240994、240528〜241685、24
    0800〜240993および241686〜243685、 e) 201188〜216915、201188〜201234、214676〜214793、215702〜215746およ
    び216836〜216915、 のうち少なくとも1つを含むものと、 (v) A1〜A489からなる群から選択されるバイアレリックマーカーを含む、(i)
    〜(iv)の連続スパンと、 (vi) 配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70
    、80、90、100、150、200、500、1000または2000ヌクレオチドの連続スパンまた
    はそれらの相補体であって、前記連続スパンが、表1に列挙される配列番号1のpo
    s1〜pos166で示されるヌクレオチド位置範囲のうちいずれか1つの少なくとも1、
    2、3、5または10ヌクレオチド位置を含むものと、 (vii) 配列番号2〜26、36〜40、54〜229のうちいずれかの少なくとも12、15
    、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500、1000ま
    たは2000ヌクレオチドの連続スパンおよびそれらの相補体であって、前記スパン
    が、染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカー、領域Ｄ関連バイアレリック
    マーカー、sbg1関連バイアレリックマーカー、g34665関連バイアレリックマーカ
    ー、sbg2関連バイアレリックマーカー、g35017関連バイアレリックマーカーまた
    はg35018関連バイアレリックマーカーを含むものと、 (viii) 配列番号2〜26、36〜40、54〜229のうちいずれか1つの少なくとも12
    、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500、10
    00または2000ヌクレオチドの連続スパンおよびそれらの相補体であって、前記ス
    パンが、染色体13q31-q33関連バイアレリックマーカー、領域Ｄ関連バイアレリ
    ックマーカー、sbg1関連バイアレリックマーカー、g34665関連バイアレリックマ
    ーカー、sbg2関連バイアレリックマーカー、g35017関連バイアレリックマーカー
    またはg35018関連バイアレリックマーカー(ただし、別のアレルが前記バイアレ
    リックマーカーに存在するもの)を含むものと、 (ix) 配列番号1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70
    、80、90、100、150、200、500、1000または2000ヌクレオチドの連続スパンおよ
    びそれらの相補体であって、前記スパンが、A1〜A69、A71〜A74、A76〜A94、A96
    〜A106、A108〜A112、A114〜A177、A179〜A197、A199〜A222、A224〜A242および
    361〜A489からなる群から選択される多型を含むものと、 (x) (i)から(ix)の連続スパンのいずれか1つに対して相補的であるヌクレオ
    チド配列と、 のうちいずれか1つを含む核酸コードと、 (xi) 配列番号27〜35および41〜43からなる群から選択されるポリペプチド配
    列の少なくとも6アミノ酸の連続スパンを含むポリペプチドコードと、からなる
    群から選択される、前記方法。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA79927C2 (en) * 2000-12-05 2007-08-10 Serono Genetics Inst Sa Polynucleotide, coding a polypeptide of potential-depending portal ionic human channel (canion), polypeptyde, antibody, method for identification of candidate modulator of canion-polypeptyde, method for treatment of bipolar disorder or schizophrenia and use of an antibody for production of drugs for treatment of schizophrenia or bipolar disorder
AU2002247939B2 (en) * 2001-01-16 2007-01-25 Serono Genetics Institute S.A. Treatment of CNS disorders using D-amino acid oxidase and D-aspartate oxidase antagonists
JP2004528847A (ja) * 2001-04-24 2004-09-24 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー 精神分裂症の一塩基多型診断
JP2003038198A (ja) * 2001-07-27 2003-02-12 Univ Niigata 精神分裂病により発現量が変化する遺伝子を規定する核酸を解析する方法
US20060234221A1 (en) * 2001-12-12 2006-10-19 Genset S.A. Biallelic markers of d-amino acid oxidase and uses thereof
EP1495041A4 (en) * 2002-02-20 2006-02-01 Sirna Therapeutics Inc INHIBITION OF GENE EXPRESSION OF G72 AND D-AMINO ACID OXIDASE (DAAO) INDUCED BY RNA INTERFERENCE USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (NASI)
JP2005522519A (ja) * 2002-04-05 2005-07-28 ユニヴァーシティ コート オブ ザ ユニヴァーシティ オブ エディンバラ 精神分裂病関連遺伝子
AU2003291720A1 (en) * 2002-11-01 2004-06-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for diagnosing and treating mood disorders
US8415298B2 (en) 2004-06-21 2013-04-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Of Stanford Administration of FGF2 for treamtent of anxiety

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5965427A (en) * 1996-01-26 1999-10-12 Genelabs Technologies, Inc. Human RAD50 gene and methods of use thereof
WO1998020165A2 (en) * 1996-11-06 1998-05-14 Whitehead Institute For Biomedical Research Biallelic markers
AU6117799A (en) * 1998-10-13 2000-05-01 Genset Genes, proteins and biallelic markers related to central nervous system disease

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