JP2002539450A - 代謝表現型決定のためのｅｌｉｓａキット - Google Patents
代謝表現型決定のためのｅｌｉｓａキットInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は臨床実験室における日常的な基準で使用できる、ＣＹＰ１Ａ２、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ−１（ＮＡＴ−１）、ＣＹＰ２Ｐ６、ＣＹＰ２Ｅ１およびＣＹＰ３Ａ４を含む（これらに限定されるわけではない）代謝表現型の迅速な決定のための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に関している。ＥＬＩＳＡキットは医者にａ）テオフィリン、タモキシフェンおよびクロザピンのような薬剤の個別化治療、およびｂ）結腸直腸癌のような発癌物質誘導疾患に対する感受性の予測を可能にしている。臨床試験を受ける患者の数を減少させるため、最も応答しそうな適当な表現型を持つ患者を選択する。
Description
【０００１】発明の背景 （ａ）技術分野 本発明は以下の酵素、ＣＹＰ １Ａ２、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ−１
（ＮＡＴ−１）、ＣＹＰ ２Ｄ６、ＣＹＰ ２Ｅ１およびＣＹＰ ３Ａ４を含む
（しかし、これらに限定されるわけではない）代謝表現型の迅速な決定のための
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に関している。ＥＬＩＳＡキット使用
は臨床実験室における日常的な基準での使用、および医者にａ）これらの酵素に
より代謝される多数の薬剤の個別化した治療、ｂ）多くの癌を含む発癌物質誘導
疾患への感受性の予測、および最も応答しそうな適した表現型により患者を選択
することにより臨床試験を受けている患者の数を減少させることを可能にするこ
とが含まれるが、これらに限定されるわけではない。 （ｂ）従来の技術 ヒトに投与される大多数の薬剤（または非生体物質）について、それらの運命
はより毒性の少ないおよび親油性の形に肝臓で代謝され、続いて尿中に排泄され
ることである。それらの代謝には連続して働く２つの系が含まれている：酸化反
応を触媒し、およびミクロソーム分画に局在している少なくとも２０の酵素を含
むチトクロームＰ４５０系、および少なくとも５つの酵素を含む抱合系。薬剤代
謝の速度は、各々の系内の酵素多形性の存在のため個人間および人種間で異なっ
ている。２つまたは３つの表現型が区別できる：不十分な代謝体（ＰＭ）、高度
な代謝体（ＥＭ）および超高度な代謝体（ＵＥＭ）。表現型の知識は以下のよう
な理由で臨床的に有用である： ａ） 表現型は化学的、植物、疾患および癌における毒性に関連している。 ｂ） 個人に基づいた薬剤投与計画を医者が処方することを可能にする。 ｃ） 治療薬剤の設計における理論的根拠を提供する。
（ＮＡＴ−１）、ＣＹＰ ２Ｄ６、ＣＹＰ ２Ｅ１およびＣＹＰ ３Ａ４を含む
（しかし、これらに限定されるわけではない）代謝表現型の迅速な決定のための
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に関している。ＥＬＩＳＡキット使用
は臨床実験室における日常的な基準での使用、および医者にａ）これらの酵素に
より代謝される多数の薬剤の個別化した治療、ｂ）多くの癌を含む発癌物質誘導
疾患への感受性の予測、および最も応答しそうな適した表現型により患者を選択
することにより臨床試験を受けている患者の数を減少させることを可能にするこ
とが含まれるが、これらに限定されるわけではない。 （ｂ）従来の技術 ヒトに投与される大多数の薬剤（または非生体物質）について、それらの運命
はより毒性の少ないおよび親油性の形に肝臓で代謝され、続いて尿中に排泄され
ることである。それらの代謝には連続して働く２つの系が含まれている：酸化反
応を触媒し、およびミクロソーム分画に局在している少なくとも２０の酵素を含
むチトクロームＰ４５０系、および少なくとも５つの酵素を含む抱合系。薬剤代
謝の速度は、各々の系内の酵素多形性の存在のため個人間および人種間で異なっ
ている。２つまたは３つの表現型が区別できる：不十分な代謝体（ＰＭ）、高度
な代謝体（ＥＭ）および超高度な代謝体（ＵＥＭ）。表現型の知識は以下のよう
な理由で臨床的に有用である： ａ） 表現型は化学的、植物、疾患および癌における毒性に関連している。 ｂ） 個人に基づいた薬剤投与計画を医者が処方することを可能にする。 ｃ） 治療薬剤の設計における理論的根拠を提供する。
【０００２】 現在、表現型は臨床実験室では容易に利用できないような高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）またはキャピラリー電気泳動（ＣＥ）法を使用することに
よる、尿試料中の薬剤またはプローブ薬剤の代謝産物のモル比測定で決定される
。
ラフィー（ＨＰＬＣ）またはキャピラリー電気泳動（ＣＥ）法を使用することに
よる、尿試料中の薬剤またはプローブ薬剤の代謝産物のモル比測定で決定される
。
【０００３】特許の代謝酵素により代謝された薬剤 酵素ＮＡＴ−１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１およびＣＹＰ３
Ａ４は多数の薬剤の代謝に関与している。表１には代謝される広範な薬物療法お
よび関与する酵素が掲げられている。これらには喘息（テオフィリン）、マラリ
ア（ダプソン）、乳癌（タモキシフェン）、心血管疾患（プロカイニミド）、臓
器移植（シクロスポリン）、鎮痛剤（アセトアミノフェン、コデイン）、一般麻
酔薬（リドカイン）および穏和安定薬（バリウム）のような共通の投薬を含む種
々の疾患に使用される薬剤が含まれている。スクリーニングがこれらの酵素に応
用できる広範な薬物療法は、迅速な表現型スクリーニングは患者処置の結果およ
び安全性を決める可能性および影響力を持つことを示している。表１ ＣＭＰＤにより表現型分類された非生体物質酵素により代謝される薬剤
Ａ４は多数の薬剤の代謝に関与している。表１には代謝される広範な薬物療法お
よび関与する酵素が掲げられている。これらには喘息（テオフィリン）、マラリ
ア（ダプソン）、乳癌（タモキシフェン）、心血管疾患（プロカイニミド）、臓
器移植（シクロスポリン）、鎮痛剤（アセトアミノフェン、コデイン）、一般麻
酔薬（リドカイン）および穏和安定薬（バリウム）のような共通の投薬を含む種
々の疾患に使用される薬剤が含まれている。スクリーニングがこれらの酵素に応
用できる広範な薬物療法は、迅速な表現型スクリーニングは患者処置の結果およ
び安全性を決める可能性および影響力を持つことを示している。表１ ＣＭＰＤにより表現型分類された非生体物質酵素により代謝される薬剤
【０００４】
【表１】
【０００５】代謝酵素と改変された癌感受性の関連 代謝酵素は多くの発癌性化合物の代謝に関与している。従って、これらの酵素
活性の変化は多くの発癌物質の生物学的活性を変化させる。表２は該酵素により
代謝される非生体物質を掲げている。表２ 酵素およびそれらが代謝する発癌物質
活性の変化は多くの発癌物質の生物学的活性を変化させる。表２は該酵素により
代謝される非生体物質を掲げている。表２ 酵素およびそれらが代謝する発癌物質
【０００６】
【表２】
【０００７】癌に関連する代謝酵素表現型 癌発育に影響する因子は多因子的であり、ただ一つの因子を癌と関連づけるの
は困難である。しかしながら、現在の研究は異なった代謝表現型とある種の癌の
危険性増加を結び付けている。
は困難である。しかしながら、現在の研究は異なった代謝表現型とある種の癌の
危険性増加を結び付けている。
【０００８】 表３はこれらの酵素により表現型分類された代謝酵素および改変された表現型
が増加した感受性と結び付けられた癌を掲げている。表３ 癌発生と関連した非生体物質代謝酵素
が増加した感受性と結び付けられた癌を掲げている。表３ 癌発生と関連した非生体物質代謝酵素
【０００９】
【表３】
【００１０】ＮＡＴ１ ＮＡＴ１遺伝子は長い間単形性として分類されてきた。しかしながら、現在は
ＮＡＴ１は他のＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ２）と同様に多形性で
あることが示唆されている。ＮＡＴ１は遅いおよび速い代謝体の二つの表現型を
持っている（例えば、各々ＮＡＴ１*４ ｖｓ．ＮＡＴ１*１０遺伝子型）。ＮＡ
Ｔ１活性の測定は以下のような理由で臨床的に興味を持たれる。 多形性 ＮＡＴ１は多形性であり、二つの代謝表現型が区別できる：速いおよび遅い代
謝体。ＮＡＴ１はｐ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノサリチル酸およびダプソンを
含むいくつかの薬剤および食品成分を代謝する。
ＮＡＴ１は他のＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ２）と同様に多形性で
あることが示唆されている。ＮＡＴ１は遅いおよび速い代謝体の二つの表現型を
持っている（例えば、各々ＮＡＴ１*４ ｖｓ．ＮＡＴ１*１０遺伝子型）。ＮＡ
Ｔ１活性の測定は以下のような理由で臨床的に興味を持たれる。 多形性 ＮＡＴ１は多形性であり、二つの代謝表現型が区別できる：速いおよび遅い代
謝体。ＮＡＴ１はｐ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノサリチル酸およびダプソンを
含むいくつかの薬剤および食品成分を代謝する。
【００１１】 加えて、ＮＡＴ１は環境前発癌物質、特にジアミノベンジジン、Ｎ−ヒドロキ
シ−４−アミノビフェノール、ヘテロ環式芳香族アミン（ＭｅＩＱｘおよびＰｈ
ＩＰ）、を活性化する。一つの研究において、ＮＡＴ１*１０対立遺伝子を持つ
、よって速いＮ−アセチル化を起こす個体で直腸結腸癌の危険率が増加している
こと（ＯＲ＝１．９；ＣＩ＝１．２−３．２）が示されているが、別の研究では
膀胱癌の危険率が増加していることが示されている（ベンジジンを代謝）。 人種間相違 ＮＡＴ１の活性は与えられた集団により広く変化する。遅いおよび速いＮＡＴ
１表現型が区別されている。速い代謝表現型に関連するＮＡＴ１*１０遺伝子型
が三つの異なった人種集団でモニターされた、インド人、マレーシア人および中
国人。ＮＡＴ１*１０対立遺伝子の頻度は各々１７％、３９％および３０％であ
った。一方、遅い代謝体に関連するＮＡＴ１*４遺伝子型は同一の集団において
各々５０％、３０％および３５％の頻度を持っていた。従って、薬剤代謝研究に
おいては、各々の人種は多形性の証拠のため別々に研究しなければならず、およ
びそのアンチノードを一つの人種から他の人種へ外挿するべきではないことは道
理に合っている。 ダプソン 薬剤投与において表現型分類が必要な古典的な例はダプソンの場合である。ダ
プソンはマラリアの治療に使用され、ＡＩＤＳ患者におけるニューモシスティス
カリニ肺炎の治療について調べられている。副作用には発疹、貧血、メトヘモグ
ロビン血症、顆粒球減少症および肝臓不全が挙げられる。ダプソンはＮＡＴ１代
謝系により体から取り除かれる。遅いアセチル化とダプソンの副作用の増加の間
に相関が示されている（遅いおよび速いアセチル化体に対して各々４６％ｖｓ．
１７％）。これらの理由のため信頼できる表現型分類試験の効用は明白である。 個別化治療 多くの薬剤に対して個別化治療が可能なことがよく知られている（テオフィリ
ン、ジゴキシン、アミノグリコシダーゼ、ダプソンその他）。しかしながら、治
療の個別化は、薬剤表現型分類のために使用される方法が、費用がかかり、時間
がかかり、および臨床実験室では容易に利用できない専門的意見を必要とする高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を
含んでいるので、開発がなかなか進んでいない。
シ−４−アミノビフェノール、ヘテロ環式芳香族アミン（ＭｅＩＱｘおよびＰｈ
ＩＰ）、を活性化する。一つの研究において、ＮＡＴ１*１０対立遺伝子を持つ
、よって速いＮ−アセチル化を起こす個体で直腸結腸癌の危険率が増加している
こと（ＯＲ＝１．９；ＣＩ＝１．２−３．２）が示されているが、別の研究では
膀胱癌の危険率が増加していることが示されている（ベンジジンを代謝）。 人種間相違 ＮＡＴ１の活性は与えられた集団により広く変化する。遅いおよび速いＮＡＴ
１表現型が区別されている。速い代謝表現型に関連するＮＡＴ１*１０遺伝子型
が三つの異なった人種集団でモニターされた、インド人、マレーシア人および中
国人。ＮＡＴ１*１０対立遺伝子の頻度は各々１７％、３９％および３０％であ
った。一方、遅い代謝体に関連するＮＡＴ１*４遺伝子型は同一の集団において
各々５０％、３０％および３５％の頻度を持っていた。従って、薬剤代謝研究に
おいては、各々の人種は多形性の証拠のため別々に研究しなければならず、およ
びそのアンチノードを一つの人種から他の人種へ外挿するべきではないことは道
理に合っている。 ダプソン 薬剤投与において表現型分類が必要な古典的な例はダプソンの場合である。ダ
プソンはマラリアの治療に使用され、ＡＩＤＳ患者におけるニューモシスティス
カリニ肺炎の治療について調べられている。副作用には発疹、貧血、メトヘモグ
ロビン血症、顆粒球減少症および肝臓不全が挙げられる。ダプソンはＮＡＴ１代
謝系により体から取り除かれる。遅いアセチル化とダプソンの副作用の増加の間
に相関が示されている（遅いおよび速いアセチル化体に対して各々４６％ｖｓ．
１７％）。これらの理由のため信頼できる表現型分類試験の効用は明白である。 個別化治療 多くの薬剤に対して個別化治療が可能なことがよく知られている（テオフィリ
ン、ジゴキシン、アミノグリコシダーゼ、ダプソンその他）。しかしながら、治
療の個別化は、薬剤表現型分類のために使用される方法が、費用がかかり、時間
がかかり、および臨床実験室では容易に利用できない専門的意見を必要とする高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を
含んでいるので、開発がなかなか進んでいない。
【００１２】 広範囲の毒性の可能性のある薬剤に対する応答および副作用プロフィールを予
測するために、無毒の薬剤を使用して個体のＮＡＴ１表現型を決定するための方
法が強く求められているであろう。
測するために、無毒の薬剤を使用して個体のＮＡＴ１表現型を決定するための方
法が強く求められているであろう。
【００１３】 最少の訓練しかしていない技術者により、および複雑な装置を必要としない日
常的な基準で達成できるであろう、ＮＡＴ１表現型分類のための酵素結合免疫吸
着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを提供することが強く求められているであろう
。
常的な基準で達成できるであろう、ＮＡＴ１表現型分類のための酵素結合免疫吸
着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを提供することが強く求められているであろう
。
【００１４】 ダプソンのような薬剤の個別化治療を医者に可能にするであろう、酵素結合免
疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを提供することが強く求められているであ
ろう。ＣＹＰ１Ａ２ ＣＹＰ１Ａ２はヒト肝臓中の全ＣＹＰ４５０酵素の１５％を構成する。ＣＹＰ
１Ａ２活性の測定は以下の理由で臨床的に興味が持たれる： 多形性 ＣＹＰ１Ａ２は多形性であろうが、確固として確立することはなされていない
。三つの代謝的表現型が区別できる：速い、中程度および遅い代謝体。ＣＹＰ１
Ａ２はアセトアミノフェン、アンチピリン、１７β−エストラジオール、カフェ
イン、クロイプラミン、クロザピン、フルタミド（抗アンドロゲン）、イミプラ
ミン、パラセタモール、フェナセチン、タクリンおよびテオフィリンを含むいく
つかの薬剤および食品成分を代謝する。
疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを提供することが強く求められているであ
ろう。ＣＹＰ１Ａ２ ＣＹＰ１Ａ２はヒト肝臓中の全ＣＹＰ４５０酵素の１５％を構成する。ＣＹＰ
１Ａ２活性の測定は以下の理由で臨床的に興味が持たれる： 多形性 ＣＹＰ１Ａ２は多形性であろうが、確固として確立することはなされていない
。三つの代謝的表現型が区別できる：速い、中程度および遅い代謝体。ＣＹＰ１
Ａ２はアセトアミノフェン、アンチピリン、１７β−エストラジオール、カフェ
イン、クロイプラミン、クロザピン、フルタミド（抗アンドロゲン）、イミプラ
ミン、パラセタモール、フェナセチン、タクリンおよびテオフィリンを含むいく
つかの薬剤および食品成分を代謝する。
【００１５】 加えて、ＣＹＰ１Ａ２は環境前発癌物質、特にヘテロ環式アミンおよび芳香族
アミンを活性化する。一つの研究において、速いＮ−アセチル化を起こし、およ
び高いＣＹＰ１Ａ２活性を持つ個体で直腸結腸癌の危険率が増加している（１６
％の対照に対して３５％、ＯＲ＝２．７９（Ｐ＝０．００２））ことが示されて
いる。 誘導および阻害 ＣＹＰ１Ａ２はオメプラゾール、イアンソプラゾール、多芳香環炭化水素およ
びタバコの煙のような多くの薬剤および環境因子により誘導される。ＣＹＰ１Ａ
２は経口避妊薬、ケトコナゾール、α−ナフトフラボン、フルボキサミン（セロ
ニン取り込み阻害剤）、フラフィリンにより阻害される。 人種間相違 ＣＹＰ１Ａ２の活性は与えられた集団により大きく変化する（６０から７０倍
）。遅い、中程度および速いＣＹＰ１Ａ２表現型が区別されている。これら三つ
のＣＹＰ１Ａ２表現型の比率は人種間および国間で変化している：米国、アフリ
カ系アメリカ人、中国、日本、イタリアおよびオーストラリアにおける中程度の
％は各々５０、７０、６０、＞９５、６０および２０である。薬剤代謝研究にお
いては、各々の人種は多形性の証拠のため別々に研究しなければならず、および
そのアンチノードを一つの人種から他の人種へ外挿するべきではないことは道理
に合っている。 テオフィリン 薬剤投与において表現型分類が必要な古典的な例はテオフィリンの場合である
。テオフィリンは発疹の治療に使用される。しかしながら、テオフィリン毒性は
共通の臨床問題であり続けており、生命を脅かす心臓血管および神経学的毒性が
含まれている。テオフィリンはＣＹＰ１Ａ２代謝系により体から取り除かれる。
キノロン抗生物質またはセロトニン再吸収阻害剤によるＣＹＰ１Ａ２の阻害はテ
オフィリン毒性を生じるであろう。これらの理由のため信頼できる表現型分類試
験の効用は明白である。 個別化治療 多くの薬剤に対して個別化治療が可能なことがよく知られている（テオフィリ
ン、ジゴキシン、アミノグリコシダーゼ、その他）。しかしながら、治療の個別
化は、薬剤表現型分類のために使用される方法が、費用がかかり、時間がかかり
、および臨床実験室では容易に利用できない専門的意見を必要とする高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を含んでい
るので、開発がなかなか進んでいない。
アミンを活性化する。一つの研究において、速いＮ−アセチル化を起こし、およ
び高いＣＹＰ１Ａ２活性を持つ個体で直腸結腸癌の危険率が増加している（１６
％の対照に対して３５％、ＯＲ＝２．７９（Ｐ＝０．００２））ことが示されて
いる。 誘導および阻害 ＣＹＰ１Ａ２はオメプラゾール、イアンソプラゾール、多芳香環炭化水素およ
びタバコの煙のような多くの薬剤および環境因子により誘導される。ＣＹＰ１Ａ
２は経口避妊薬、ケトコナゾール、α−ナフトフラボン、フルボキサミン（セロ
ニン取り込み阻害剤）、フラフィリンにより阻害される。 人種間相違 ＣＹＰ１Ａ２の活性は与えられた集団により大きく変化する（６０から７０倍
）。遅い、中程度および速いＣＹＰ１Ａ２表現型が区別されている。これら三つ
のＣＹＰ１Ａ２表現型の比率は人種間および国間で変化している：米国、アフリ
カ系アメリカ人、中国、日本、イタリアおよびオーストラリアにおける中程度の
％は各々５０、７０、６０、＞９５、６０および２０である。薬剤代謝研究にお
いては、各々の人種は多形性の証拠のため別々に研究しなければならず、および
そのアンチノードを一つの人種から他の人種へ外挿するべきではないことは道理
に合っている。 テオフィリン 薬剤投与において表現型分類が必要な古典的な例はテオフィリンの場合である
。テオフィリンは発疹の治療に使用される。しかしながら、テオフィリン毒性は
共通の臨床問題であり続けており、生命を脅かす心臓血管および神経学的毒性が
含まれている。テオフィリンはＣＹＰ１Ａ２代謝系により体から取り除かれる。
キノロン抗生物質またはセロトニン再吸収阻害剤によるＣＹＰ１Ａ２の阻害はテ
オフィリン毒性を生じるであろう。これらの理由のため信頼できる表現型分類試
験の効用は明白である。 個別化治療 多くの薬剤に対して個別化治療が可能なことがよく知られている（テオフィリ
ン、ジゴキシン、アミノグリコシダーゼ、その他）。しかしながら、治療の個別
化は、薬剤表現型分類のために使用される方法が、費用がかかり、時間がかかり
、および臨床実験室では容易に利用できない専門的意見を必要とする高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を含んでい
るので、開発がなかなか進んでいない。
【００１６】 広範囲の毒性の可能性のある薬剤に対する応答および副作用プロフィールを予
測するために、無毒の薬剤を使用して個体のＣＹＰ１Ａ２表現型を決定するため
の方法が強く求められているであろう。
測するために、無毒の薬剤を使用して個体のＣＹＰ１Ａ２表現型を決定するため
の方法が強く求められているであろう。
【００１７】 最少の訓練しかしていない技術者により、および複雑な装置を必要としない日
常的な基準で達成できるであろう、ＣＹＰ１Ａ２表現型分類のための酵素結合免
疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを提供することが強く求められているであ
ろう。
常的な基準で達成できるであろう、ＣＹＰ１Ａ２表現型分類のための酵素結合免
疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを提供することが強く求められているであ
ろう。
【００１８】 テオフィリン、タモキシフェンまたはクロザピンのような薬剤の個別化治療を
医者に可能にするであろう、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを
提供することが強く求められているであろう。
医者に可能にするであろう、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを
提供することが強く求められているであろう。
【００１９】ＣＹＰ２Ｄ６ ＣＹＰ２Ｄ６はヒト肝臓中の全ＣＹＰ４５０酵素の１−３％を構成する。ＣＹ
Ｐ２Ｄ６活性の測定は以下の理由で臨床的に興味が持たれる： 多形性 ＣＹＰ２Ｄ６はヒトにおいて多形性発現が示された最初のＰ４５０酵素である
。三つの代謝的表現型が区別可能である：不十分な（ＰＭ）、高度な（ＥＭ）お
よび超高度な（ＵＥＭ）表現型。ＣＹＰ２Ｄ６は下記のものを含む広範囲の薬剤
および食品成分を代謝する： 向精神薬： アミフラミン、アミトリプチリン、クロミプラミン、クロザピン、デシプラミン
、ハロペリドール、イミプラミン、マプロチリン、メトキシフェナミン、ミナプ
リン、ノルトリプチリン、パロキセチン、ペルフェナジン、レモキシプリド、チ
オリダジン、トモキセチン、トリフロペリドール、ズクロペンチキソール 心臓血管薬： ブフラロール、デブリソキン、エンカイニド、フレカイニド、グアノキサン、イ
ンドラミン、メトプロロール、メキシレチン、ｎ−プロピルアジマリン、プロパ
フェノン、プロプラノロール、スパルテイン、チモロール、ベラパミール その他の薬剤： クロロプロパミド、コデイン、デキストロメトルファン、メタアンフェタミン、
ペルヘキシレン、フェンフォルミン。
Ｐ２Ｄ６活性の測定は以下の理由で臨床的に興味が持たれる： 多形性 ＣＹＰ２Ｄ６はヒトにおいて多形性発現が示された最初のＰ４５０酵素である
。三つの代謝的表現型が区別可能である：不十分な（ＰＭ）、高度な（ＥＭ）お
よび超高度な（ＵＥＭ）表現型。ＣＹＰ２Ｄ６は下記のものを含む広範囲の薬剤
および食品成分を代謝する： 向精神薬： アミフラミン、アミトリプチリン、クロミプラミン、クロザピン、デシプラミン
、ハロペリドール、イミプラミン、マプロチリン、メトキシフェナミン、ミナプ
リン、ノルトリプチリン、パロキセチン、ペルフェナジン、レモキシプリド、チ
オリダジン、トモキセチン、トリフロペリドール、ズクロペンチキソール 心臓血管薬： ブフラロール、デブリソキン、エンカイニド、フレカイニド、グアノキサン、イ
ンドラミン、メトプロロール、メキシレチン、ｎ−プロピルアジマリン、プロパ
フェノン、プロプラノロール、スパルテイン、チモロール、ベラパミール その他の薬剤： クロロプロパミド、コデイン、デキストロメトルファン、メタアンフェタミン、
ペルヘキシレン、フェンフォルミン。
【００２０】 加えて、ＣＹＰ２Ｄ６は多くの発癌物質の代謝に関与しているが、未だに主代
謝体としては報告されていない。一つの研究において、速いＣＹＰ２Ｄ６代謝体
を持ち、遅いＮ−アセチル化体を持つ個体で肝細胞癌の危険率が増加している（
ＯＲ＝２．６；９５％ ＣＩ＝１．６−４）ことが示されている。 誘導および阻害 ＣＹＰ２Ｄ６はキニジンによりインビトロで、およびウイルスプロテアーゼ阻
害剤ならびにＤ−およびＬ−フェンフルラミドのような食欲抑制薬により阻害さ
れる。 人種間相違 ＣＹＰ２Ｄ６の活性は与えられた集団により大きく変化する。ＣＹＰ２Ｄ６の
不十分な（ＰＭ）、高度な（ＥＭ）および超高度な（ＵＥＭ）表現型が区別され
ている。ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子は常染色体劣性形質として遺伝され、白色欧州人お
よび北アメリカ人の９０および１０％を各々高度な（ＥＭ）および不十分な（Ｐ
Ｍ）代謝体表現型に分別する。別の研究において、異なった人種集団におけるＰ
Ｍのパーセントが観察されており、白色北アメリカ人および欧州人は５−１０％
、黒色アメリカ人は１．８％、タイ原住民は１．２％、中国人は１％、マレー原
住民集団では２．１％のＰＭが存在したが、日本人集団ではＰＭ表現型は全く存
在しなかった。
謝体としては報告されていない。一つの研究において、速いＣＹＰ２Ｄ６代謝体
を持ち、遅いＮ−アセチル化体を持つ個体で肝細胞癌の危険率が増加している（
ＯＲ＝２．６；９５％ ＣＩ＝１．６−４）ことが示されている。 誘導および阻害 ＣＹＰ２Ｄ６はキニジンによりインビトロで、およびウイルスプロテアーゼ阻
害剤ならびにＤ−およびＬ−フェンフルラミドのような食欲抑制薬により阻害さ
れる。 人種間相違 ＣＹＰ２Ｄ６の活性は与えられた集団により大きく変化する。ＣＹＰ２Ｄ６の
不十分な（ＰＭ）、高度な（ＥＭ）および超高度な（ＵＥＭ）表現型が区別され
ている。ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子は常染色体劣性形質として遺伝され、白色欧州人お
よび北アメリカ人の９０および１０％を各々高度な（ＥＭ）および不十分な（Ｐ
Ｍ）代謝体表現型に分別する。別の研究において、異なった人種集団におけるＰ
Ｍのパーセントが観察されており、白色北アメリカ人および欧州人は５−１０％
、黒色アメリカ人は１．８％、タイ原住民は１．２％、中国人は１％、マレー原
住民集団では２．１％のＰＭが存在したが、日本人集団ではＰＭ表現型は全く存
在しなかった。
【００２１】 薬剤代謝研究においては、各々の人種は多形性の証拠のため別々に研究しなけ
ればならず、およびそのアンチノードを一つの人種から他の人種へ外挿するべき
ではないことは道理に合っている。 デキストロメトルファン／抗うつ薬 薬剤投与において表現型分類が必要な例はデキストロメトルファンの場合であ
る。デキストロメトルファンは向精神効果を持つ非オピオイド鎮咳薬である。し
かしながら、０から６ｍｇ／ｋｇのデキストロメトルファン投与量範囲は個々の
患者の許容度に基づいている。デキストロメトルファンはＣＹＰ２Ｄ６代謝系を
経て活性化される。デキストロメトルファンは定性的および定量的に異なった客
観的および主観的影響を不十分なｖｓ．高度な代謝体で示している（平均動作＋
／− ＳＥ、ＥＭでの９５＋／−０．５％に対しＰＭでは８６＋／−６％；ｐ＜
０．０５）。
ればならず、およびそのアンチノードを一つの人種から他の人種へ外挿するべき
ではないことは道理に合っている。 デキストロメトルファン／抗うつ薬 薬剤投与において表現型分類が必要な例はデキストロメトルファンの場合であ
る。デキストロメトルファンは向精神効果を持つ非オピオイド鎮咳薬である。し
かしながら、０から６ｍｇ／ｋｇのデキストロメトルファン投与量範囲は個々の
患者の許容度に基づいている。デキストロメトルファンはＣＹＰ２Ｄ６代謝系を
経て活性化される。デキストロメトルファンは定性的および定量的に異なった客
観的および主観的影響を不十分なｖｓ．高度な代謝体で示している（平均動作＋
／− ＳＥ、ＥＭでの９５＋／−０．５％に対しＰＭでは８６＋／−６％；ｐ＜
０．０５）。
【００２２】 ＣＹＰ２Ｄ６表現型分類のための別の重要な薬剤は三環式抗うつ薬である。Ｃ
ＹＰ２Ｄ６のＰＭおよびＵＥＭ表現型の両方に副作用の危険性が存在する。これ
らの薬剤の標準投与量が与えられたＰＭ個体は、毒性血漿濃度を発生させ、口内
乾燥症、低血圧症、鎮静、震え、またある場合には生命を脅かす心臓毒性を含む
不愉快な副作用を導く可能性がある。逆に、これらの薬剤のＵＥＭ個体への投与
は、標準投与量では活性薬剤の血漿濃度ははるかに低いので、治療が失敗するで
あろう。これらの理由のため、信頼できる表現型分類試験の効用は明白である。 個別化治療 多くの薬剤に対して個別化治療が可能なことがよく知られている（テオフィリ
ン、ジゴキシン、アミノグリコシダーゼ、デキストロメトルファンその他）。し
かしながら、治療の個別化は、薬剤表現型分類のために使用される方法が、費用
がかかり、時間がかかり、および臨床実験室では容易に利用できない専門的意見
を必要とする高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはキャピラリー電気
泳動（ＣＥ）を含んでいるので、開発がなかなか進んでいない。
ＹＰ２Ｄ６のＰＭおよびＵＥＭ表現型の両方に副作用の危険性が存在する。これ
らの薬剤の標準投与量が与えられたＰＭ個体は、毒性血漿濃度を発生させ、口内
乾燥症、低血圧症、鎮静、震え、またある場合には生命を脅かす心臓毒性を含む
不愉快な副作用を導く可能性がある。逆に、これらの薬剤のＵＥＭ個体への投与
は、標準投与量では活性薬剤の血漿濃度ははるかに低いので、治療が失敗するで
あろう。これらの理由のため、信頼できる表現型分類試験の効用は明白である。 個別化治療 多くの薬剤に対して個別化治療が可能なことがよく知られている（テオフィリ
ン、ジゴキシン、アミノグリコシダーゼ、デキストロメトルファンその他）。し
かしながら、治療の個別化は、薬剤表現型分類のために使用される方法が、費用
がかかり、時間がかかり、および臨床実験室では容易に利用できない専門的意見
を必要とする高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはキャピラリー電気
泳動（ＣＥ）を含んでいるので、開発がなかなか進んでいない。
【００２３】 広範囲の毒性の可能性のある薬剤に対する応答および副作用プロフィールを予
測するために、無毒の薬剤を使用して個体のＣＹＰ２Ｄ６表現型を決定するため
の方法が強く求められているであろう。
測するために、無毒の薬剤を使用して個体のＣＹＰ２Ｄ６表現型を決定するため
の方法が強く求められているであろう。
【００２４】 最少の訓練しかしていない技術者により、および複雑な装置を必要としない日
常的な基準で達成できるであろう、ＣＹＰ２Ｄ６表現型分類のための酵素結合免
疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを提供することが強く求められているであ
ろう。
常的な基準で達成できるであろう、ＣＹＰ２Ｄ６表現型分類のための酵素結合免
疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを提供することが強く求められているであ
ろう。
【００２５】 デキストロメトルファン、クロザピンまたはベラパミルのような薬剤の個別化
治療を医者に可能にするであろう、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キ
ットを提供することが強く求められているであろう。
治療を医者に可能にするであろう、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キ
ットを提供することが強く求められているであろう。
【００２６】ＣＹＰ２Ｅ１ ＣＹＰ２Ｅ１はヒト肝臓中の全ＣＹＰ４５０酵素の約５％を構成する。ＣＹＰ
２Ｅ１活性の測定は以下の理由で臨床的に興味が持たれる： 多形性 ヒト集団中でＣＹＰ２Ｅ１遺伝子多形のいくつかの証拠が存在しているが、分
子機構はさらに特徴付けなければならない。研究で、ｃ１およびｃ２と称される
二つの対立遺伝子の存在が示されている。最初の研究はｃ２対立遺伝子のより高
いＣＹＰ２Ｅ１発現への関連の可能性を示している。
２Ｅ１活性の測定は以下の理由で臨床的に興味が持たれる： 多形性 ヒト集団中でＣＹＰ２Ｅ１遺伝子多形のいくつかの証拠が存在しているが、分
子機構はさらに特徴付けなければならない。研究で、ｃ１およびｃ２と称される
二つの対立遺伝子の存在が示されている。最初の研究はｃ２対立遺伝子のより高
いＣＹＰ２Ｅ１発現への関連の可能性を示している。
【００２７】 ＣＹＰ２Ｅ１はエタノール、アセトン、アセトアミノフェン、ニトロサミン、
ニトロソジメチルアミン、ｐ−ニトロフェノールを含むいくつかの薬剤および食
品成分を代謝する。
ニトロソジメチルアミン、ｐ−ニトロフェノールを含むいくつかの薬剤および食
品成分を代謝する。
【００２８】 加えて、ＣＹＰ２Ｅ１は環境前発癌物質、特にニトロソジメチルアミン、ニト
ロソピロリドン、ベンゼン、四塩化炭素、３−ヒドロキシピリジン（タバコ煙生
成物）を活性化する。一つの研究では、高いＣＹＰ２Ｅ１（ｃ２）活性を持つ個
体は胃癌の危険度が高いことが示されている（ＯＲ＝２３．６−２５．７）。 誘導および阻害 ＣＹＰ２Ｅ１は多くの薬剤およびタバコ煙のような環境因子により、ならびに
飢餓により、および管理されていない糖尿病で誘導される。ＣＹＰ２Ｅ１はクロ
ロメチアゾール、トランス−１，２−ジクロロエチレンにより、およびイソフラ
ボノイド ゲネステインおよびイクオールにより阻害される。 人種間相違 ＣＹＰ２Ｅ１表現型の比率は人種および国間で変化している：稀なｃ２対立遺
伝子の頻度はカフカス人で約４％および日本人で２０％であり、別の多形の研究
はカフカス人で約１０％および日本人で２５％の頻度を持つ稀なＣ対立遺伝子を
記載している。一つの研究において、日本人男性はカフカス人男性と比較してか
なり低いレベルのＣＹＰ２Ｅ１活性を持っていることが示されている。別の研究
において、白人（スペイン人）およびアジア人（中央アメリカインディアン）が
混血したニカラグア人集団は親集団と比較すると中間レベルのＣＹＰ１Ａ２対立
遺伝子突然変異を持っていることが示されている。従って、薬剤代謝研究におい
ては、各々の人種は多形性の証拠のため別々に研究しなければならず、およびそ
のアンチノードを一つの人種から他の人種へ外挿するべきではないことは道理に
合っている。 アセトアミノフェン 薬剤投与において表現型分類が必要な例はアセトアミノフェンの場合である。
アセトアミノフェンは広く使用されている鎮痛剤である。しかしながら、アセト
アミノフェンは低頻度で肝臓毒性を示す。肝臓毒性は、求核試薬へ結合できる反
応性代謝産物（Ｎ−アセチル−ｐ−ベンゾキノンイミン）へのＣＹＰ２Ｅ１を経
た転換によるものである。これらの理由のため、信頼できる表現型分類試験の効
用は明白である。 個別化治療 多くの薬剤に対して個別化治療が可能なことがよく知られている（テオフィリ
ン、ジゴキシン、アミノグリコシダーゼ、アセトアミノフェンその他）。しかし
ながら、治療の個別化は、薬剤表現型分類のために使用される方法が、費用がか
かり、時間がかかり、および臨床実験室では容易に利用できない専門的意見を必
要とする高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはキャピラリー電気泳動
（ＣＥ）を含んでいるので、開発がなかなか進んでいない。
ロソピロリドン、ベンゼン、四塩化炭素、３−ヒドロキシピリジン（タバコ煙生
成物）を活性化する。一つの研究では、高いＣＹＰ２Ｅ１（ｃ２）活性を持つ個
体は胃癌の危険度が高いことが示されている（ＯＲ＝２３．６−２５．７）。 誘導および阻害 ＣＹＰ２Ｅ１は多くの薬剤およびタバコ煙のような環境因子により、ならびに
飢餓により、および管理されていない糖尿病で誘導される。ＣＹＰ２Ｅ１はクロ
ロメチアゾール、トランス−１，２−ジクロロエチレンにより、およびイソフラ
ボノイド ゲネステインおよびイクオールにより阻害される。 人種間相違 ＣＹＰ２Ｅ１表現型の比率は人種および国間で変化している：稀なｃ２対立遺
伝子の頻度はカフカス人で約４％および日本人で２０％であり、別の多形の研究
はカフカス人で約１０％および日本人で２５％の頻度を持つ稀なＣ対立遺伝子を
記載している。一つの研究において、日本人男性はカフカス人男性と比較してか
なり低いレベルのＣＹＰ２Ｅ１活性を持っていることが示されている。別の研究
において、白人（スペイン人）およびアジア人（中央アメリカインディアン）が
混血したニカラグア人集団は親集団と比較すると中間レベルのＣＹＰ１Ａ２対立
遺伝子突然変異を持っていることが示されている。従って、薬剤代謝研究におい
ては、各々の人種は多形性の証拠のため別々に研究しなければならず、およびそ
のアンチノードを一つの人種から他の人種へ外挿するべきではないことは道理に
合っている。 アセトアミノフェン 薬剤投与において表現型分類が必要な例はアセトアミノフェンの場合である。
アセトアミノフェンは広く使用されている鎮痛剤である。しかしながら、アセト
アミノフェンは低頻度で肝臓毒性を示す。肝臓毒性は、求核試薬へ結合できる反
応性代謝産物（Ｎ−アセチル−ｐ−ベンゾキノンイミン）へのＣＹＰ２Ｅ１を経
た転換によるものである。これらの理由のため、信頼できる表現型分類試験の効
用は明白である。 個別化治療 多くの薬剤に対して個別化治療が可能なことがよく知られている（テオフィリ
ン、ジゴキシン、アミノグリコシダーゼ、アセトアミノフェンその他）。しかし
ながら、治療の個別化は、薬剤表現型分類のために使用される方法が、費用がか
かり、時間がかかり、および臨床実験室では容易に利用できない専門的意見を必
要とする高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはキャピラリー電気泳動
（ＣＥ）を含んでいるので、開発がなかなか進んでいない。
【００２９】 広範囲の毒性の可能性のある薬剤に対する応答および副作用プロフィールを予
測するために、無毒の薬剤を使用して個体のＣＹＰ２Ｅ１表現型を決定するため
の方法が強く求められているであろう。
測するために、無毒の薬剤を使用して個体のＣＹＰ２Ｅ１表現型を決定するため
の方法が強く求められているであろう。
【００３０】 最少の訓練しかしていない技術者により、および複雑な装置を必要としない日
常的な基準で達成できるであろう、ＣＹＰ２Ｅ１表現型分類のための酵素結合免
疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを提供することが強く求められているであ
ろう。
常的な基準で達成できるであろう、ＣＹＰ２Ｅ１表現型分類のための酵素結合免
疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを提供することが強く求められているであ
ろう。
【００３１】 アセトアミノフェンのような薬剤の個別化治療を医者に可能にするであろう、
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを提供することが強く求められ
ているであろう。
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを提供することが強く求められ
ているであろう。
【００３２】ＣＹＰ３Ａ４ ＣＹＰ３Ａファミリーはヒト肝臓中の全ＣＹＰ４５０酵素の約２５％を構成す
る。ＣＹＰ３Ａ４活性の測定は以下の理由で臨床的に興味が持たれる： 多形性 ヒト肝臓においてＣＹＰ３Ａ４アイソザイム発現の個人間の大きな程度の変異
が示されているが（＞２０倍）、この多形発現の遺伝子的基礎は現在まで同定さ
れていない。ＣＹＰ３Ａ４はベンゾジアゼピン、エリスロマイシン、デキストロ
メトルファン、ジヒドロピリジン、シクロスポリン、リドカイン、ミダゾタム、
ニフェジピン、テルフェナジン、シクロスポリンＡ含むいくつかの薬剤および食
品成分を代謝する。
る。ＣＹＰ３Ａ４活性の測定は以下の理由で臨床的に興味が持たれる： 多形性 ヒト肝臓においてＣＹＰ３Ａ４アイソザイム発現の個人間の大きな程度の変異
が示されているが（＞２０倍）、この多形発現の遺伝子的基礎は現在まで同定さ
れていない。ＣＹＰ３Ａ４はベンゾジアゼピン、エリスロマイシン、デキストロ
メトルファン、ジヒドロピリジン、シクロスポリン、リドカイン、ミダゾタム、
ニフェジピン、テルフェナジン、シクロスポリンＡ含むいくつかの薬剤および食
品成分を代謝する。
【００３３】 加えて、ＣＹＰ３Ａ４は環境前発癌物質、特にＮ’−ニトロソノルニコチン（
ＮＮＮ）、４−メチルニトロソアミノ−１−（３−ピリジル−１−ブタノン）（
ＮＮＫ）、５−メチルクリセン、４，４’−メチレン−ビス（２−クロロアニリ
ン）（タバコ煙生成物）を活性化する。 誘導および阻害 ＣＹＰ３Ａ４はデキサメタソン、フェノバルビタール、プリミドンおよび抗生
物質リファムピシンのような多くの薬剤で誘導される。逆に、ＣＹＰ３Ａ４はエ
リスロマイシン、グレープフルーツジュース、インジナビル、ケトコナゾール、
ミコナゾール、キニンおよびサキナビルにより阻害される。 シクロスポリン 薬剤投与において表現型分類が必要な例は臓器移植患者の処置におけるシクロ
スポリンの場合である。シクロスポリンは新規臓器が拒絶されるのを防ぐため、
移植後に投与される免疫抑制剤である。この薬剤の血漿濃度は決定的であり、高
レベルは腎毒性を導き、低レベルは臓器拒絶を導く。シクロスポリンはＣＹＰ３
Ａ４系を経て代謝される。いくつかの研究は有効でおよび安全なシクロスポリン
量の維持における、ＣＹＰ３Ａ４活性のモニタリングの重要性を指摘している。
これらの理由のため、信頼できる表現型分類試験の効用は明白である。 個別化治療 多くの薬剤に対して個別化治療が可能なことがよく知られている（テオフィリ
ン、ジゴキシン、アミノグリコシダーゼ、シクロスポリンその他）。しかしなが
ら、治療の個別化は、薬剤表現型分類のために使用される方法が、費用がかかり
、時間がかかり、および臨床実験室では容易に利用できない専門的意見を必要と
する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはキャピラリー電気泳動（Ｃ
Ｅ）を含んでいるので、開発がなかなか進んでいない。
ＮＮＮ）、４−メチルニトロソアミノ−１−（３−ピリジル−１−ブタノン）（
ＮＮＫ）、５−メチルクリセン、４，４’−メチレン−ビス（２−クロロアニリ
ン）（タバコ煙生成物）を活性化する。 誘導および阻害 ＣＹＰ３Ａ４はデキサメタソン、フェノバルビタール、プリミドンおよび抗生
物質リファムピシンのような多くの薬剤で誘導される。逆に、ＣＹＰ３Ａ４はエ
リスロマイシン、グレープフルーツジュース、インジナビル、ケトコナゾール、
ミコナゾール、キニンおよびサキナビルにより阻害される。 シクロスポリン 薬剤投与において表現型分類が必要な例は臓器移植患者の処置におけるシクロ
スポリンの場合である。シクロスポリンは新規臓器が拒絶されるのを防ぐため、
移植後に投与される免疫抑制剤である。この薬剤の血漿濃度は決定的であり、高
レベルは腎毒性を導き、低レベルは臓器拒絶を導く。シクロスポリンはＣＹＰ３
Ａ４系を経て代謝される。いくつかの研究は有効でおよび安全なシクロスポリン
量の維持における、ＣＹＰ３Ａ４活性のモニタリングの重要性を指摘している。
これらの理由のため、信頼できる表現型分類試験の効用は明白である。 個別化治療 多くの薬剤に対して個別化治療が可能なことがよく知られている（テオフィリ
ン、ジゴキシン、アミノグリコシダーゼ、シクロスポリンその他）。しかしなが
ら、治療の個別化は、薬剤表現型分類のために使用される方法が、費用がかかり
、時間がかかり、および臨床実験室では容易に利用できない専門的意見を必要と
する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはキャピラリー電気泳動（Ｃ
Ｅ）を含んでいるので、開発がなかなか進んでいない。
【００３４】 広範囲の毒性の可能性のある薬剤に対する応答および副作用プロフィールを予
測するために、無毒の薬剤を使用して個体のＣＹＰ３Ａ４表現型を決定するため
の方法が強く求められているであろう。
測するために、無毒の薬剤を使用して個体のＣＹＰ３Ａ４表現型を決定するため
の方法が強く求められているであろう。
【００３５】 最少の訓練しかしていない技術者により、および複雑な装置を必要としない日
常的な基準で達成できるであろう、ＣＹＰ３Ａ４表現型分類のための酵素結合免
疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを提供することが強く求められているであ
ろう。
常的な基準で達成できるであろう、ＣＹＰ３Ａ４表現型分類のための酵素結合免
疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを提供することが強く求められているであ
ろう。
【００３６】 シクロスポリンのような薬剤の個別化治療を医者に可能にするであろう、酵素
結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを提供することが強く求められてい
るであろう。
結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを提供することが強く求められてい
るであろう。
【００３７】発明の要約 本発明の一つの目的は、臨床実験室において日常的な基準で使用できる、代謝
酵素表現型の迅速な決定のための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キッ
トを提供することである。
酵素表現型の迅速な決定のための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キッ
トを提供することである。
【００３８】 本発明の別の目的は医者が ａ）これらの酵素により代謝される薬剤での治療を個別化する ｂ）種々の癌のような発癌物質誘導疾患への感受性を予測することを可能にする
ＥＬＩＳＡキットを提供することである。
ＥＬＩＳＡキットを提供することである。
【００３９】 本発明の別の目的は広範囲の毒性の可能性のある薬剤に対する応答および副作
用プロフィールを予測するために、無毒の薬剤を使用して個体の代謝酵素表現型
を決定するための方法を提供することである。
用プロフィールを予測するために、無毒の薬剤を使用して個体の代謝酵素表現型
を決定するための方法を提供することである。
【００４０】 ＥＬＩＳＡ表現型分類キットは個体の代謝酵素表現型のスペクトルを決定する
ために無毒のプローブ薬剤を使用するであろう。表４は提案された酵素の各々に
使用されるべきであるプローブ薬剤を掲げている。表４ 酵素およびプローブ薬剤
ために無毒のプローブ薬剤を使用するであろう。表４は提案された酵素の各々に
使用されるべきであるプローブ薬剤を掲げている。表４ 酵素およびプローブ薬剤
【００４１】
【表４】
【００４２】 これらの薬剤は表現型分類される個体により摂取され、個体の尿が摂取４時間
後に集められた。尿は本発明により開発されたＥＬＩＳＡ技術により分析される
であろう。尿試料は下記のプローブ薬剤誘導体についてモニターされ（図１−７
）、個体の表現型を明らかにするためにモル比が計算されるであろう。
後に集められた。尿は本発明により開発されたＥＬＩＳＡ技術により分析される
であろう。尿試料は下記のプローブ薬剤誘導体についてモニターされ（図１−７
）、個体の表現型を明らかにするためにモル比が計算されるであろう。
【００４３】 実施例ＩおよびＩＩにおいて、ＣＹＰ１Ａ２のためのプローブ薬剤誘導体およ
びＥＬＩＳＡ開発の詳細な説明が示されている。ＣＹＰ１Ａ２ ＥＬＩＳＡキッ
トの開発のために説明された材料および方法、および全体にわたる一般法はＮＡ
Ｔ１、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１およびＣＹＰ３Ａ４のための代謝的表現型Ｅ
ＬＩＳＡキットの開発に応用できる、および応用されるであろう。
びＥＬＩＳＡ開発の詳細な説明が示されている。ＣＹＰ１Ａ２ ＥＬＩＳＡキッ
トの開発のために説明された材料および方法、および全体にわたる一般法はＮＡ
Ｔ１、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１およびＣＹＰ３Ａ４のための代謝的表現型Ｅ
ＬＩＳＡキットの開発に応用できる、および応用されるであろう。
【００４４】発明の詳細な説明 異なったプローブ薬剤がＣＹＰ１Ａ２表現型を決定するために使用できる（カ
フェイン、テオフィリン）。本発明に従うと、適したプローブ薬剤にはカフェイ
ン、テオフィリンまたはアセトアミノフェンが含まれるが、これらに限定される
わけではない。
フェイン、テオフィリン）。本発明に従うと、適したプローブ薬剤にはカフェイ
ン、テオフィリンまたはアセトアミノフェンが含まれるが、これらに限定される
わけではない。
【００４５】 これらの中でもカフェインが好適なプローブである。カフェインは広く消費さ
れており、比較的安全である。従来の研究では、表現型は１，７−ジメチルキサ
ンチン（１，７ＤＭＸ）＋１，７−ジメチル尿酸（１，７ＤＭＵ）および１，３
，７−トリメチルキサンチン（１，３，７ＴＭＸ、カフェイン）の比から一般的
に決定されてきた。これらの研究においては、被検者にカフェイン含有物質が経
口投与され、標的代謝産物の尿濃度がＨＰＬＣにより決定される（Ｋｉｌｂａｎ
ｅ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅ
ｒ ４７：４７０−４７７；Ｔａｎｇ，Ｂ．−Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃ
ｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ ４９：６４８−６５７）またはＣＥ（
Ｍｅａｃｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ３：２０
５−２１８）。
れており、比較的安全である。従来の研究では、表現型は１，７−ジメチルキサ
ンチン（１，７ＤＭＸ）＋１，７−ジメチル尿酸（１，７ＤＭＵ）および１，３
，７−トリメチルキサンチン（１，３，７ＴＭＸ、カフェイン）の比から一般的
に決定されてきた。これらの研究においては、被検者にカフェイン含有物質が経
口投与され、標的代謝産物の尿濃度がＨＰＬＣにより決定される（Ｋｉｌｂａｎ
ｅ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅ
ｒ ４７：４７０−４７７；Ｔａｎｇ，Ｂ．−Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃ
ｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ ４９：６４８−６５７）またはＣＥ（
Ｍｅａｃｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ３：２０
５−２１８）。
【００４６】 キノロン抗生物質またはセロトニン摂取阻害剤によるＣＹＰ１Ａ２の阻害は、
テオフィリン毒性を生じる。これらの理由のため、信頼できる表現型分類試験の
効用は明白である。
テオフィリン毒性を生じる。これらの理由のため、信頼できる表現型分類試験の
効用は明白である。
【００４７】 酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は血漿および尿試料中の少量の薬剤
およびその他の抗原性化合物の決定に成功裡に応用されてきており、実施が簡単
である。我々は以前にプローブ薬剤としてカフェインを使用するＮ−アセチルト
ランスフェラーゼ（ＮＡＴ２）表現型分類のためのＥＬＩＳＡを開発した（Ｗｏ
ｎｇ，Ｐ．，Ｌｅｙｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ，Ｂ．，ａｎｄ Ｗａｉｎｅｒ，Ｉ．
Ｗ．（１９９５）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．１３：１０７９−
１０８６）。我々は続いてＮＡＴ２表現型分類のためのＥＬＩＳＡの有効性を試
験し証明した（Ｌｅｙｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｍｅ
ｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４０：Ａｂｓｔｒａｃｔ ３５６）。
ＮＡＴ２表現型分類のためのＥＬＩＳＡはＨＰＬＣおよびＣＥより実施が簡単で
ある。
およびその他の抗原性化合物の決定に成功裡に応用されてきており、実施が簡単
である。我々は以前にプローブ薬剤としてカフェインを使用するＮ−アセチルト
ランスフェラーゼ（ＮＡＴ２）表現型分類のためのＥＬＩＳＡを開発した（Ｗｏ
ｎｇ，Ｐ．，Ｌｅｙｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ，Ｂ．，ａｎｄ Ｗａｉｎｅｒ，Ｉ．
Ｗ．（１９９５）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．１３：１０７９−
１０８６）。我々は続いてＮＡＴ２表現型分類のためのＥＬＩＳＡの有効性を試
験し証明した（Ｌｅｙｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｍｅ
ｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４０：Ａｂｓｔｒａｃｔ ３５６）。
ＮＡＴ２表現型分類のためのＥＬＩＳＡはＨＰＬＣおよびＣＥより実施が簡単で
ある。
【００４８】 本発明に従うと、カフェイン消費後に集められた個体尿試料中のカフェインお
よび二つのカフェイン代謝産物（１，７−ジメチルキサンチン（１，７ＤＭＸ）
、１，７−ジメチル尿酸（１，７ＤＭＵ））のモル比を測定するために現在開発
された抗体が使用される。この比から個体のＣＹＰ１Ａ２表現型が決定される。
これらの抗体を使用して、この比を測定するための抗原酵素結合免疫吸着アッセ
イ（ＥＬＩＳＡ）が行われるであろう。本発明の抗体はカフェインおよび二つの
異なったカフェイン代謝体に対して高められたポリクローナルまたはモノクロー
ナルであろうし、それらはカフェインおよびこれらの代謝産物のモル比の測定を
可能にする。
よび二つのカフェイン代謝産物（１，７−ジメチルキサンチン（１，７ＤＭＸ）
、１，７−ジメチル尿酸（１，７ＤＭＵ））のモル比を測定するために現在開発
された抗体が使用される。この比から個体のＣＹＰ１Ａ２表現型が決定される。
これらの抗体を使用して、この比を測定するための抗原酵素結合免疫吸着アッセ
イ（ＥＬＩＳＡ）が行われるであろう。本発明の抗体はカフェインおよび二つの
異なったカフェイン代謝体に対して高められたポリクローナルまたはモノクロー
ナルであろうし、それらはカフェインおよびこれらの代謝産物のモル比の測定を
可能にする。
【００４９】 本発明に従うと、カフェイン代謝産物のモル比は以下のように個体のＣＹＰ１
Ａ２表現型を決定するための使用される： （１，７−ジメチルキサンチン（１，７ＤＭＸ）＋１，７−ジメチル尿酸（１，
７ＤＭＵ））／カフェイン ４および１２のモル比で遅い、中程度および速いＣＹＰ１Ａ２代謝体を区別す
る（Ｂｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ ２：１１６−１１７）。
Ａ２表現型を決定するための使用される： （１，７−ジメチルキサンチン（１，７ＤＭＸ）＋１，７−ジメチル尿酸（１，
７ＤＭＵ））／カフェイン ４および１２のモル比で遅い、中程度および速いＣＹＰ１Ａ２代謝体を区別す
る（Ｂｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ ２：１１６−１１７）。
【００５０】材料および方法 材料 Ｎ−アセチル−ｐ−アミノフェノール（アセトアミノフェン）、ジオキサン、
９８−１００％ガラス再蒸留ギ酸およびクロロギ酸イソブチルはＡ＆Ｃ Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．（Ｖｉｌｌｅ Ｓｔ−Ｌａｕｒｅｎ
ｔ，Ｑｕｅ．Ｃａｎａｄａ）から購入された；西洋ワサビペルオキシダーゼはＢ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅ．，Ｃａｎ
ａｄａ）から購入された；ＥＬＩＳＡプレート（９６−ウェル Ｅａｓｙ Ｗａ
ｓｈTM修飾平底、高結合；Ｃｏｒｎｉｎｇガラス製品，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，
ＵＳＡ）およびＦａｌｃｏｎ ９６−ウェル微量試験組織培養プレートｎｏ．３
０７２（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌ
ｉｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）はＦｉｓｈｅｒ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ， Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃ
ａｎａｄａ）から購入された；ヤギ抗ウサギＩｇＧへ結合されたアルカリ性ホス
ファターゼ、キーホール リンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）はＰｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋ ｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）からのもので
ある；無水酢酸、ＨＰＬＣ用アセトニトリル、ベンジルウレア、ウシ血清アルブ
ミン（カタログ番号Ａ−３８０３）、Ｎ−ブロモスクシンイミド、カフェイン代
謝体、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
溶液（ＥＤＡＣ）、４−ブロモ酪酸エチル、６−ブロモヘキサン酸エチル、シア
ノ酢酸メチル、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ3）、重水素化ジメチルスルホ
キシド（ｄ6）、重水（Ｄ2Ｏ）、１，４−ジアミノブタン、ジエタノールアミン
、ジメチルホルムアミド、ジメチル硫酸、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル、クロロ
ギ酸エチル、フロイントアジュバント（完全および不完全）、グルタルアルデヒ
ド（５０％ｖ／ｖ）、１−メチルキサンチン、ｐ−ニトロフェノールリン酸二ナ
トリウム塩、パラジウム（１０乾燥重量％活性炭）、ｏ−フェニレンジアミン塩
酸塩、ポリエチレンソルビタンモノラウラート（トウィーン２０）、ブタ皮膚ゼ
ラチン、プロテインＡ−セファロース４Ｂ、セファデックスTMＧ２５ファイン、
水素化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、テオフィリン、トリブチルアミン、
トウィーンTM２０はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓ
ｏｕｒｉ，ＵＳＡ）から購入された；シリカゲル粒子サイズ０．０４０−０．０
６３ｍｍ（２３０−４００メッシュ）ＡＳＴＭ Ｅｍｅｒｃｋ Ｄａｒｍｓｔａ
ｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ、はＶＷＲ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅ．，Ｃａｎａｄａ
）から購入された。ジオキサンは使用前に水素化カルシウムと４時間還流して脱
水し、蒸留した。他の試薬はＡＣＳ等級であった。
９８−１００％ガラス再蒸留ギ酸およびクロロギ酸イソブチルはＡ＆Ｃ Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．（Ｖｉｌｌｅ Ｓｔ−Ｌａｕｒｅｎ
ｔ，Ｑｕｅ．Ｃａｎａｄａ）から購入された；西洋ワサビペルオキシダーゼはＢ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅ．，Ｃａｎ
ａｄａ）から購入された；ＥＬＩＳＡプレート（９６−ウェル Ｅａｓｙ Ｗａ
ｓｈTM修飾平底、高結合；Ｃｏｒｎｉｎｇガラス製品，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，
ＵＳＡ）およびＦａｌｃｏｎ ９６−ウェル微量試験組織培養プレートｎｏ．３
０７２（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌ
ｉｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）はＦｉｓｈｅｒ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ， Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃ
ａｎａｄａ）から購入された；ヤギ抗ウサギＩｇＧへ結合されたアルカリ性ホス
ファターゼ、キーホール リンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）はＰｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋ ｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）からのもので
ある；無水酢酸、ＨＰＬＣ用アセトニトリル、ベンジルウレア、ウシ血清アルブ
ミン（カタログ番号Ａ−３８０３）、Ｎ−ブロモスクシンイミド、カフェイン代
謝体、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
溶液（ＥＤＡＣ）、４−ブロモ酪酸エチル、６−ブロモヘキサン酸エチル、シア
ノ酢酸メチル、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ3）、重水素化ジメチルスルホ
キシド（ｄ6）、重水（Ｄ2Ｏ）、１，４−ジアミノブタン、ジエタノールアミン
、ジメチルホルムアミド、ジメチル硫酸、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル、クロロ
ギ酸エチル、フロイントアジュバント（完全および不完全）、グルタルアルデヒ
ド（５０％ｖ／ｖ）、１−メチルキサンチン、ｐ−ニトロフェノールリン酸二ナ
トリウム塩、パラジウム（１０乾燥重量％活性炭）、ｏ−フェニレンジアミン塩
酸塩、ポリエチレンソルビタンモノラウラート（トウィーン２０）、ブタ皮膚ゼ
ラチン、プロテインＡ−セファロース４Ｂ、セファデックスTMＧ２５ファイン、
水素化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、テオフィリン、トリブチルアミン、
トウィーンTM２０はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓ
ｏｕｒｉ，ＵＳＡ）から購入された；シリカゲル粒子サイズ０．０４０−０．０
６３ｍｍ（２３０−４００メッシュ）ＡＳＴＭ Ｅｍｅｒｃｋ Ｄａｒｍｓｔａ
ｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ、はＶＷＲ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅ．，Ｃａｎａｄａ
）から購入された。ジオキサンは使用前に水素化カルシウムと４時間還流して脱
水し、蒸留した。他の試薬はＡＣＳ等級であった。
【００５１】 合成法 カフェイン、１，７−ジメチルキサンチン、１，７−ジメチル尿酸誘導体生成
のための合成経路は図８および図９に示されている。
のための合成経路は図８および図９に示されている。
【００５２】 ７−エトキシカルボキシペンチル−１，３−ジメチルキサンチン（ＩＩ）の合成 化合物ＩＩはＤａｌｙ ｅｔ．ａｌ．（Ｄａｌｙ，Ｊ．Ｗ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ
，Ｃ．，Ｓｈａｍｉｎ，Ｍ．（１９９１）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４２：３
０９−３２１）の方法と同様の方法により合成される。３２０ｍｇのテオフィリ
ン（Ｉ）（１．７８ミリモル）を７ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミドに溶解し、
２９０ｍｇの炭酸カリウム（２．１ミリモル）を反応混合物に加える。３５８μ
Ｌの６−ブロモヘキサン酸エチル（２．０２ミリモル）を徐々に加え、懸濁液は
６０℃で１４時間加熱する。炭酸カリウムを除去するために懸濁液を濾過する。
炭酸カリウムを少量のジメチルホルムアミドで洗浄後、回転エバポレーターおよ
び高真空ポンプを用いて減圧下で溶媒を蒸発させる。残渣をクロロホルムに溶解
し、溶液は硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4）で乾燥させる。溶媒を回転エバポレ
ーターを用いて減圧下で蒸発させる。４８０ｍｇの生成物（わずかに黄色の液体
、１．４９ミリモル）が得られ、８３．７％の収率に相当する。
，Ｃ．，Ｓｈａｍｉｎ，Ｍ．（１９９１）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４２：３
０９−３２１）の方法と同様の方法により合成される。３２０ｍｇのテオフィリ
ン（Ｉ）（１．７８ミリモル）を７ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミドに溶解し、
２９０ｍｇの炭酸カリウム（２．１ミリモル）を反応混合物に加える。３５８μ
Ｌの６−ブロモヘキサン酸エチル（２．０２ミリモル）を徐々に加え、懸濁液は
６０℃で１４時間加熱する。炭酸カリウムを除去するために懸濁液を濾過する。
炭酸カリウムを少量のジメチルホルムアミドで洗浄後、回転エバポレーターおよ
び高真空ポンプを用いて減圧下で溶媒を蒸発させる。残渣をクロロホルムに溶解
し、溶液は硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4）で乾燥させる。溶媒を回転エバポレ
ーターを用いて減圧下で蒸発させる。４８０ｍｇの生成物（わずかに黄色の液体
、１．４９ミリモル）が得られ、８３．７％の収率に相当する。
【００５３】 ７−カルボキシペンチル−１，３−ジメチルキサンチン（ＩＩＩ）の合成 化合物ＩＩＩは以下のように合成される。２２５ｍｇの化合物ＩＩ（０．７ミ
リモル）を７ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解する。４ｍＬの１０％ＮａＯＨ
溶液を加え、溶液を３０分間還流する（１００−１２５℃）。回転エバポレータ
ーおよび高真空ポンプを用いて減圧下で溶媒を蒸発させる。残渣を７ｍＬの水に
溶解し、溶液は６Ｎ ＨＣｌ溶液でｐＨ４の酸性とする。溶液を４℃に冷却する
と生成物が針状晶として結晶化する。結晶を１５ｍＬの半融ガラスロート（１０
−１５ＡＳＴＭ）を通して濾過し、乾燥する。１７５ｍｇの生成物（０．５９５
ミリモル）が得られ、８５％の収率に相当する。
リモル）を７ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解する。４ｍＬの１０％ＮａＯＨ
溶液を加え、溶液を３０分間還流する（１００−１２５℃）。回転エバポレータ
ーおよび高真空ポンプを用いて減圧下で溶媒を蒸発させる。残渣を７ｍＬの水に
溶解し、溶液は６Ｎ ＨＣｌ溶液でｐＨ４の酸性とする。溶液を４℃に冷却する
と生成物が針状晶として結晶化する。結晶を１５ｍＬの半融ガラスロート（１０
−１５ＡＳＴＭ）を通して濾過し、乾燥する。１７５ｍｇの生成物（０．５９５
ミリモル）が得られ、８５％の収率に相当する。
【００５４】 ７−エトキシカルボキシペンチル−１−メチルキサンチン（Ｖ）の合成 化合物Ｖは以下のように合成される。１１６ｍｇの１−メチルキサンチン（Ｉ
Ｖ）（０．７ミリモル）を４ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解する。１２９ｍ
ｇの炭酸カリウム（０．９３ミリモル）を加え、生じた溶液を撹拌する。１２５
μＬの６−ブロモヘキサン酸エチル（０．７ミリモル）の０．４ｍＬジメチルホ
ルムアミド溶液を３回に分けてゆっくり加える。反応混合物は５０℃で１．５時
間および６５℃で１時間加熱する。冷却後、懸濁液を濾過し、濾液は回転エバポ
レーターおよび高真空ポンプを用いて減圧下で蒸発させる。生成物は酢酸エチル
−ヘキサン溶液（９：１、ｖ／ｖ）を溶出液として用いるシリカゲルカラム（４
０ｘ１ｃｍ）のフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。
Ｖ）（０．７ミリモル）を４ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解する。１２９ｍ
ｇの炭酸カリウム（０．９３ミリモル）を加え、生じた溶液を撹拌する。１２５
μＬの６−ブロモヘキサン酸エチル（０．７ミリモル）の０．４ｍＬジメチルホ
ルムアミド溶液を３回に分けてゆっくり加える。反応混合物は５０℃で１．５時
間および６５℃で１時間加熱する。冷却後、懸濁液を濾過し、濾液は回転エバポ
レーターおよび高真空ポンプを用いて減圧下で蒸発させる。生成物は酢酸エチル
−ヘキサン溶液（９：１、ｖ／ｖ）を溶出液として用いるシリカゲルカラム（４
０ｘ１ｃｍ）のフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。
【００５５】 ７−カルボキシペンチル−１−メチルキサンチン（ＶＩ）の合成 化合物ＶＩは以下のように合成される。３１ｍｇの化合物Ｖ（０．１ミリモル
）を１ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、６６０μＬの１０％ＮａＯＨを加
える。得られた溶液は３０分間還流する（１００−１２０℃）。室温まで冷却後
、回転エバポレーターおよび高真空ポンプを用いて減圧下で溶媒を蒸発させる。
残渣を水に溶解し、溶液は６Ｎ ＨＣｌ溶液でｐＨ４の酸性とする。冷却後、溶
液から白色針状晶が得られ、それは濾過して乾燥させる。２３ｍｇの生成物（０
．０８２ミリモル）が得られ、８２％の収率に相当する。
）を１ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、６６０μＬの１０％ＮａＯＨを加
える。得られた溶液は３０分間還流する（１００−１２０℃）。室温まで冷却後
、回転エバポレーターおよび高真空ポンプを用いて減圧下で溶媒を蒸発させる。
残渣を水に溶解し、溶液は６Ｎ ＨＣｌ溶液でｐＨ４の酸性とする。冷却後、溶
液から白色針状晶が得られ、それは濾過して乾燥させる。２３ｍｇの生成物（０
．０８２ミリモル）が得られ、８２％の収率に相当する。
【００５６】 ６−アミノ−１−ベンジルウラシル（ＩＸ）の合成 化合物ＩＸは以下のようにＨｕｔｚｅｎｌａｕｂ ａｎｄ Ｐｆｅｉｄｅｒｅ
ｒ（Ｈｕｔｚｅｎｌａｕｂ，Ｗ．，ａｎｄ Ｐｆｅｉｄｅｒｅｒ，Ｗ．（１９７
９）Ｌｉｅｂｉｇｓ Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．１８４７−１８５４）の方法と同様の
方法により合成される。８．４６ｇのナトリウムメトキシド（１６０ミリモル）
を７１ｍＬのメタノールに溶解する。溶液を撹拌し、７．５５ｇのベンジル尿素
（５０ミリモル）および４．７１ｍＬのシアノ酢酸メチル（５３．４ミリモル）
を加える。懸濁液は６８−７０℃で５．５時間還流し、室温まで冷却する。濾過
後、回転エバポレーターを用いて減圧下でメタノールを蒸発させる。残渣を温か
い蒸留水に溶解し、氷酢酸でｐＨ３−４まで酸性化することにより生成物を沈殿
させる。室温で２時間（または一夜）後、懸濁液を半融ガラスロートを通して減
圧下で濾過する。生成物は水で洗浄して乾燥させる。収率は６２−６５％である
。
ｒ（Ｈｕｔｚｅｎｌａｕｂ，Ｗ．，ａｎｄ Ｐｆｅｉｄｅｒｅｒ，Ｗ．（１９７
９）Ｌｉｅｂｉｇｓ Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．１８４７−１８５４）の方法と同様の
方法により合成される。８．４６ｇのナトリウムメトキシド（１６０ミリモル）
を７１ｍＬのメタノールに溶解する。溶液を撹拌し、７．５５ｇのベンジル尿素
（５０ミリモル）および４．７１ｍＬのシアノ酢酸メチル（５３．４ミリモル）
を加える。懸濁液は６８−７０℃で５．５時間還流し、室温まで冷却する。濾過
後、回転エバポレーターを用いて減圧下でメタノールを蒸発させる。残渣を温か
い蒸留水に溶解し、氷酢酸でｐＨ３−４まで酸性化することにより生成物を沈殿
させる。室温で２時間（または一夜）後、懸濁液を半融ガラスロートを通して減
圧下で濾過する。生成物は水で洗浄して乾燥させる。収率は６２−６５％である
。
【００５７】 ６−アミノ−１−ベンジル−５−ブロモウラシル（Ｘ）の合成 化合物Ｘは以下のようにＨｕｔｚｅｎｌａｕｂ ａｎｄ Ｐｆｅｉｄｅｒｅｒ
（Ｈｕｔｚｅｎｌａｕｂ，Ｗ．，ａｎｄ Ｐｆｅｉｄｅｒｅｒ，Ｗ．（１９７９
）Ｌｉｅｂｉｇｓ Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．１８４７−１８５４）の方法と同様の方
法により合成される。３．２ｇの６−アミノ−１−ベンジルウラシル（１５．８
ミリモル）を１００℃で６０ｍＬの酢酸および３ｍＬの無水酢酸に溶解する。２
．８５ｇのＮ−ブロモスクシンイミド（１６ミリモル）を３０分以上かけて少量
ずつ加える。反応混合物は１時間撹拌し、室温まで冷却する。沈殿を濾過し、少
量の冷エタノールで洗浄して乾燥させる。３．３６ｇの白色結晶が得られ（１２
ミリモル）、７６％の収率に相当する。
（Ｈｕｔｚｅｎｌａｕｂ，Ｗ．，ａｎｄ Ｐｆｅｉｄｅｒｅｒ，Ｗ．（１９７９
）Ｌｉｅｂｉｇｓ Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．１８４７−１８５４）の方法と同様の方
法により合成される。３．２ｇの６−アミノ−１−ベンジルウラシル（１５．８
ミリモル）を１００℃で６０ｍＬの酢酸および３ｍＬの無水酢酸に溶解する。２
．８５ｇのＮ−ブロモスクシンイミド（１６ミリモル）を３０分以上かけて少量
ずつ加える。反応混合物は１時間撹拌し、室温まで冷却する。沈殿を濾過し、少
量の冷エタノールで洗浄して乾燥させる。３．３６ｇの白色結晶が得られ（１２
ミリモル）、７６％の収率に相当する。
【００５８】 ６−アミノ−１−ベンジル−５−［（Ｎ−４’−アミノブチル）−アミノ］ウラ
シル（ＸＩ）の合成 化合物ＸＩは以下のように合成される。３ｇの化合物Ｘ（１０．７１ミリモル
）を３０ｍＬの５０％１，４−ジアミノブタン（ｂｐ１５８−１６０℃；ｄ ０
．８７７）水溶液（ｖ／ｖ）に溶解し、溶液は室温で一夜撹拌する。溶液は回転
エバポレーターおよび高真空ポンプを用いて減圧下で蒸発させる。得られた油状
物は最少量の酢酸エチル−メタノール溶液（４：１；ｖ／ｖ）に溶解し、溶出液
として酢酸エチル−メタノール溶液を使用する半融ガラスロート（１５０ｍＬ）
に詰めたシリカゲルでの乾燥フラッシュクロマトグラフィーにより精製する。各
々の連続する分画において、溶媒の極性を増加させた、６０％酢酸エチル／４０
％メタノールから４５％酢酸エチル／５５％メタノール（ｖ／ｖ）へ。生成物は
淡黄色油状物として単離される。得られた精製生成物の量は１．６ｇ（６．１ミ
リモル）であり、５７％の収率に相当する。
シル（ＸＩ）の合成 化合物ＸＩは以下のように合成される。３ｇの化合物Ｘ（１０．７１ミリモル
）を３０ｍＬの５０％１，４−ジアミノブタン（ｂｐ１５８−１６０℃；ｄ ０
．８７７）水溶液（ｖ／ｖ）に溶解し、溶液は室温で一夜撹拌する。溶液は回転
エバポレーターおよび高真空ポンプを用いて減圧下で蒸発させる。得られた油状
物は最少量の酢酸エチル−メタノール溶液（４：１；ｖ／ｖ）に溶解し、溶出液
として酢酸エチル−メタノール溶液を使用する半融ガラスロート（１５０ｍＬ）
に詰めたシリカゲルでの乾燥フラッシュクロマトグラフィーにより精製する。各
々の連続する分画において、溶媒の極性を増加させた、６０％酢酸エチル／４０
％メタノールから４５％酢酸エチル／５５％メタノール（ｖ／ｖ）へ。生成物は
淡黄色油状物として単離される。得られた精製生成物の量は１．６ｇ（６．１ミ
リモル）であり、５７％の収率に相当する。
【００５９】 ６−アミノ−１−ベンジル−５−［Ｎ−４’−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−
アミノ］ウラシル（ＸＩＩ）の合成 化合物ＸＩＩは以下のように合成される。１．６３ｇの化合物ＸＩ（５．９ミ
リモル）を５．４ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨに溶解する。２７０ｍｇの炭酸水素ナト
リウム（３．２ミリモル）および２．７ｍＬの水を加える。５．４ｍＬのジ−ｔ
ｅｒｔ−ブチルジカーボナートのイソプロパノール溶液（１．８８ｇ（８．６１
ミリモル）を５．４ｍＬのイソプロパノールに溶解）を化合物ＸＩの溶液へ徐々
に加える。室温で３時間撹拌後、１３．４ｍＬの水を加え、未反応のジ−ｔｅｒ
ｔ−ブチルジカーボナートを２０ｍＬの石油エーテルで２回抽出する。反応混合
物のｐＨを１０％クエン酸溶液を加えることにより７に調整し、溶液を４０ｍＬ
の酢酸エチルで２回抽出する。有機層を硫酸ナトリウム（Ｎａ2ＳＯ4）で乾燥し
、回転エバポレーターを用いて減圧下で濃縮する。濃縮溶液への少量の軽石油エ
ーテルの添加により生成物が沈殿する。０．９９ｇの灰色がかった白色の結晶性
化合物ＸＩＩ（２．６２ミリモル）が得られ、４４％の収率に相当する。
アミノ］ウラシル（ＸＩＩ）の合成 化合物ＸＩＩは以下のように合成される。１．６３ｇの化合物ＸＩ（５．９ミ
リモル）を５．４ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨに溶解する。２７０ｍｇの炭酸水素ナト
リウム（３．２ミリモル）および２．７ｍＬの水を加える。５．４ｍＬのジ−ｔ
ｅｒｔ−ブチルジカーボナートのイソプロパノール溶液（１．８８ｇ（８．６１
ミリモル）を５．４ｍＬのイソプロパノールに溶解）を化合物ＸＩの溶液へ徐々
に加える。室温で３時間撹拌後、１３．４ｍＬの水を加え、未反応のジ−ｔｅｒ
ｔ−ブチルジカーボナートを２０ｍＬの石油エーテルで２回抽出する。反応混合
物のｐＨを１０％クエン酸溶液を加えることにより７に調整し、溶液を４０ｍＬ
の酢酸エチルで２回抽出する。有機層を硫酸ナトリウム（Ｎａ2ＳＯ4）で乾燥し
、回転エバポレーターを用いて減圧下で濃縮する。濃縮溶液への少量の軽石油エ
ーテルの添加により生成物が沈殿する。０．９９ｇの灰色がかった白色の結晶性
化合物ＸＩＩ（２．６２ミリモル）が得られ、４４％の収率に相当する。
【００６０】 ６−アミノ−１−ベンジル−５−［（Ｎ−４’−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
アミノブチル−Ｎ−エトキシカルボニル）−アミノ］ウラシル（ＸＩＩＩ）の合
成 化合物ＸＩＩＩは以下のように合成される。８０６ｍｇの化合物ＸＩＩ（２．
１４ミリモル）を７．５ｍＬの水に懸濁し、勢いよく撹拌する。０．５ｍＬのク
ロロギ酸エチル（５．２２ミリモル）を加える。３．７５ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨ
溶液を滴加し、得られた溶液は室温で２．５時間撹拌する。白色固体生成物を濾
過し、十分に水で洗浄して乾燥させる。７４１ｍｇの生成物が得られ（１．７７
ミリモル）、８２．７％の収率に相当する。
アミノブチル−Ｎ−エトキシカルボニル）−アミノ］ウラシル（ＸＩＩＩ）の合
成 化合物ＸＩＩＩは以下のように合成される。８０６ｍｇの化合物ＸＩＩ（２．
１４ミリモル）を７．５ｍＬの水に懸濁し、勢いよく撹拌する。０．５ｍＬのク
ロロギ酸エチル（５．２２ミリモル）を加える。３．７５ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨ
溶液を滴加し、得られた溶液は室温で２．５時間撹拌する。白色固体生成物を濾
過し、十分に水で洗浄して乾燥させる。７４１ｍｇの生成物が得られ（１．７７
ミリモル）、８２．７％の収率に相当する。
【００６１】 ６−アミノ−１−ベンジル−５−［（Ｎ−４’−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
アミノブチル−Ｎ−エトキシカルボニル）−アミノ］−３−メチルウラシル（Ｘ
ＩＶ）の合成 化合物ＸＩＶは以下のように合成される。７１２ｍｇの化合物ＸＩＩＩ（１．
７７ミリモル）を５．８ｍＬの水に懸濁する。２．３ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨ溶液
を加え、得られた溶液は激しく撹拌しながら４０℃で加熱する。０．２３ｍＬの
ジメチル硫酸（２．４３ミリモル）を徐々に加え、溶液は４０℃で１．５時間撹
拌する。反応間に形成された沈殿は濾過し、水で洗浄して乾燥させる。生成物は
沈殿から４％メタノール含有ジクロロメタン溶液を溶出液として使用するシリカ
ゲルカラム（４０ｘ１ｃｍ）でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製され
る。生成物は酢酸エチルから再結晶する。４９８ｍｇの化合物ＸＩＶ（１．１５
ミリモル）が得られ、６５％の収率に相当する。
アミノブチル−Ｎ−エトキシカルボニル）−アミノ］−３−メチルウラシル（Ｘ
ＩＶ）の合成 化合物ＸＩＶは以下のように合成される。７１２ｍｇの化合物ＸＩＩＩ（１．
７７ミリモル）を５．８ｍＬの水に懸濁する。２．３ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨ溶液
を加え、得られた溶液は激しく撹拌しながら４０℃で加熱する。０．２３ｍＬの
ジメチル硫酸（２．４３ミリモル）を徐々に加え、溶液は４０℃で１．５時間撹
拌する。反応間に形成された沈殿は濾過し、水で洗浄して乾燥させる。生成物は
沈殿から４％メタノール含有ジクロロメタン溶液を溶出液として使用するシリカ
ゲルカラム（４０ｘ１ｃｍ）でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製され
る。生成物は酢酸エチルから再結晶する。４９８ｍｇの化合物ＸＩＶ（１．１５
ミリモル）が得られ、６５％の収率に相当する。
【００６２】 ６−アミノ−５−［（Ｎ−４’−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノブチル−
Ｎ−エトキシカルボニル）−アミノ］−３−メチルウラシル（ＸＶ）の合成 化合物ＸＶは以下のように合成される。４４０ｍｇの化合物ＸＩＶ（１．０２
ミリモル）を１２ｍＬのメタノールに溶解し、２５２ｍｇのギ酸アンモニウム（
４ミリモル）と混合する。窒素雰囲気下で２４０ｍｇのパラジウム炭素（１０％
）を加える。接触水素化は室温で３時間実施される。濾過して触媒を除き、濾液
は回転エバポレーターおよび高真空ポンプを用いて減圧下で蒸発させる。３４１
ｍｇの生成物が得られ（０．９９ミリモル）、９７％の収率に相当する。
Ｎ−エトキシカルボニル）−アミノ］−３−メチルウラシル（ＸＶ）の合成 化合物ＸＶは以下のように合成される。４４０ｍｇの化合物ＸＩＶ（１．０２
ミリモル）を１２ｍＬのメタノールに溶解し、２５２ｍｇのギ酸アンモニウム（
４ミリモル）と混合する。窒素雰囲気下で２４０ｍｇのパラジウム炭素（１０％
）を加える。接触水素化は室温で３時間実施される。濾過して触媒を除き、濾液
は回転エバポレーターおよび高真空ポンプを用いて減圧下で蒸発させる。３４１
ｍｇの生成物が得られ（０．９９ミリモル）、９７％の収率に相当する。
【００６３】 ７−（４’−アミノブチル）−１−メチル尿酸（ＸＶＩ）の合成 化合物ＸＶＩは以下のように合成される。３００ｍｇの化合物ＸＶ（０．８７
５ミリモル）を４．５ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミドに溶解し、１４４ｍｇの
水素化ナトリウム（６ミリモル）と混合する。混合物は室温で２０分間および１
１０−１１５℃で３０分間撹拌する。色が暗い黄色へ徐々に変化する。冷後、６
．５ｍＬの水を加え、溶液を６Ｎ ＨＣｌ溶液でｐＨ０の酸性とする。回転エバ
ポレーターおよび高真空ポンプを用いて減圧下で溶媒を蒸発させ、粗生成物は酢
酸エチル−メタノール溶液（１：４、ｖ／ｖ）に溶解する。無機塩を濾過して除
き、黄色濾液は溶出液として酢酸エチル−メタノール（３：７、ｖ／ｖ）溶液を
使用するシリカゲルカラム（４０ｘ１ｃｍ）でのフラッシュクロマトグラフィー
により精製する。イソプロパノールによる残渣の滴定後、生成物が淡黄色固形物
として得られた。９８．９ｍｇの生成物が得られ（０．３９１ミリモル）、４５
％の収率に相当する。
５ミリモル）を４．５ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミドに溶解し、１４４ｍｇの
水素化ナトリウム（６ミリモル）と混合する。混合物は室温で２０分間および１
１０−１１５℃で３０分間撹拌する。色が暗い黄色へ徐々に変化する。冷後、６
．５ｍＬの水を加え、溶液を６Ｎ ＨＣｌ溶液でｐＨ０の酸性とする。回転エバ
ポレーターおよび高真空ポンプを用いて減圧下で溶媒を蒸発させ、粗生成物は酢
酸エチル−メタノール溶液（１：４、ｖ／ｖ）に溶解する。無機塩を濾過して除
き、黄色濾液は溶出液として酢酸エチル−メタノール（３：７、ｖ／ｖ）溶液を
使用するシリカゲルカラム（４０ｘ１ｃｍ）でのフラッシュクロマトグラフィー
により精製する。イソプロパノールによる残渣の滴定後、生成物が淡黄色固形物
として得られた。９８．９ｍｇの生成物が得られ（０．３９１ミリモル）、４５
％の収率に相当する。
【００６４】 ＮＭＲ分光法 合成物の1Ｈ ＮＭＲスペクトルは５００ＭＨｚ分光光度計を使用して得られ
た（Ｖａｒｉａｎ ＸＬ ５００ＭＨｚ，Ｖａｒｉａｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎ Ｆｅｒｎａｎｄｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）。
た（Ｖａｒｉａｎ ＸＬ ５００ＭＨｚ，Ｖａｒｉａｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎ Ｆｅｒｎａｎｄｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）。
【００６５】 ウシ血清アルブミンおよびキーホール リンペットヘモシニアンへのハプテンの
抱合 カフェイン−ＢＳＡ、１，７−ジメチルキサンチン−ＢＳＡ抱合体はＲｏｊｏ
ら（Ｒｏｊｏ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：９０４
−９１０）の方法と同様の方法により調製された。２５ｍＬのエーレンマイヤー
フラスコ中、１５ｍｇのＢＳＡを６ｍＬのカフェイン誘導体（または１，７−ジ
メチルキサンチン誘導体）溶液（１．２５μモル／ｍＬ水溶液）に溶解し、続い
て、１．４３ｍＬのＥＤＡＣ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ水溶液）を加えた。溶液は室
温で一夜撹拌し、室温で４８時間５００ｍＬの水に対して透析する（１日２回水
を交換して）。抱合体は０．５ｍＬずつ−２０℃で保存する。ジメチル尿酸抱合
体はＰｅｓｋａｒらの方法（Ｐｅｓｋａｒ（１９７２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．２６：１９１−１９５）により調製される。７．５ｍｇの１，７−ジメチ
ル尿酸（０．０３ミリモル）を５ｍＬの丸底フラスコに入れ、１ｍＬの０．１Ｍ
Ｎａ2ＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4緩衝液、ｐＨ７．０で溶解する。５００μＬの０．
０２１Ｍグルタルアルデヒド溶液（１０ ｍＬの水当たり４２．５μＬの５０％
グルタルアルデヒド（ｖ／ｖ））を撹拌溶液に加える。２時間撹拌後、１００μ
Ｌの１Ｍリジンの０．１Ｍ Ｎａ2ＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ７．０）溶
液を加える。溶液は１時間撹拌し、２５０ｍＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ
Ｎａ2ＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4緩衝液、ｐＨ７．０、に対し、１日当たり２−３回
緩衝液を交換しながら４８時間透析する。１，７−ジメチルキサンチン−ＢＳＡ
抱合体は０．５ｍＬずつ−２０℃で保存する。カフェイン−ＫＬＨおよび１，７
−ジメチルキサンチン−ＫＬＨ抱合体は以下のように調製する。２０ｍｇのＫＬ
Ｈ凍結乾燥粉末を２ｍＬの０．９Ｍ ＮａＣｌ溶液に溶解し、１００ｍＬに対し
て１０時間、２回液を交換して透析する。２５ｍＬのエーレンマイヤーフラスコ
中、１．１ｍＬのＫＬＨ溶液（約１０ｍｇ／ｍＬ）に０．８ｍＬのカフェイン誘
導体または１，７−ジメチルキサンチン誘導体（２．５μモル／ｍＬ ０．９Ｍ
ＮａＣｌ溶液）を加える。２ｍＬのＥＤＡＣ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ ０．９Ｍ
ＮａＣ１溶液）および１．８ｍＬの０．９Ｍ ＮａＣｌ溶液を誘導体溶液へ連
続的に加える。溶液は室温で一夜（２０時間）撹拌する。溶液は２５０ｍＬの０
．９Ｍ ＮａＣｌに対して４８時間、１日当たり２−３回液を交換して透析する
。カフェイン−ＫＬＨおよび１，７−ジメチルキサンチン−ＫＬＨ溶液は０．５
ｍＬずつ−２０℃で保存する。１，７−ジメチル尿酸−ＫＬＨ抱合体はＰｅｓｋ
ａｒらの方法（Ｐｅｓｋａｒ（１９７２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６：
１９１−１９５）と同様の方法により調製される。２０ｍｇのＫＬＨ凍結乾燥粉
末を２ｍＬの０．９Ｍ ＮａＣｌ溶液に溶解し、１００ｍＬに対して１０時間、
２回液を交換して透析する。７．３ｍｇの１，７−ジメチル尿酸（約０．０３ミ
リモル）を５ｍＬの丸底フラスコに入れ、１ｍＬのＫＬＨ溶液で溶解する。５０
０μＬの０．０２１Ｍグルタルアルデヒド溶液（１０ ｍＬの水当たり４２．５
μＬの５０％グルタルアルデヒド（ｖ／ｖ））を撹拌溶液に滴加する。２時間撹
拌後、１００μＬの１Ｍリジンの０．１Ｍ Ｎａ2ＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4緩衝液（
ｐＨ７．０）溶液を加える。溶液は１時間撹拌し、２５０ｍＬの０．９Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、５ｍＭ Ｎａ2ＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4緩衝液、ｐＨ７．０、に対し、１日当
たり２−３回緩衝液を交換しながら４８時間透析する。１，７−ジメチル尿酸−
ＫＬＨ抱合体は０．５ｍＬずつ−２０℃で保存する。
抱合 カフェイン−ＢＳＡ、１，７−ジメチルキサンチン−ＢＳＡ抱合体はＲｏｊｏ
ら（Ｒｏｊｏ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：９０４
−９１０）の方法と同様の方法により調製された。２５ｍＬのエーレンマイヤー
フラスコ中、１５ｍｇのＢＳＡを６ｍＬのカフェイン誘導体（または１，７−ジ
メチルキサンチン誘導体）溶液（１．２５μモル／ｍＬ水溶液）に溶解し、続い
て、１．４３ｍＬのＥＤＡＣ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ水溶液）を加えた。溶液は室
温で一夜撹拌し、室温で４８時間５００ｍＬの水に対して透析する（１日２回水
を交換して）。抱合体は０．５ｍＬずつ−２０℃で保存する。ジメチル尿酸抱合
体はＰｅｓｋａｒらの方法（Ｐｅｓｋａｒ（１９７２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．２６：１９１−１９５）により調製される。７．５ｍｇの１，７−ジメチ
ル尿酸（０．０３ミリモル）を５ｍＬの丸底フラスコに入れ、１ｍＬの０．１Ｍ
Ｎａ2ＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4緩衝液、ｐＨ７．０で溶解する。５００μＬの０．
０２１Ｍグルタルアルデヒド溶液（１０ ｍＬの水当たり４２．５μＬの５０％
グルタルアルデヒド（ｖ／ｖ））を撹拌溶液に加える。２時間撹拌後、１００μ
Ｌの１Ｍリジンの０．１Ｍ Ｎａ2ＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ７．０）溶
液を加える。溶液は１時間撹拌し、２５０ｍＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ
Ｎａ2ＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4緩衝液、ｐＨ７．０、に対し、１日当たり２−３回
緩衝液を交換しながら４８時間透析する。１，７−ジメチルキサンチン−ＢＳＡ
抱合体は０．５ｍＬずつ−２０℃で保存する。カフェイン−ＫＬＨおよび１，７
−ジメチルキサンチン−ＫＬＨ抱合体は以下のように調製する。２０ｍｇのＫＬ
Ｈ凍結乾燥粉末を２ｍＬの０．９Ｍ ＮａＣｌ溶液に溶解し、１００ｍＬに対し
て１０時間、２回液を交換して透析する。２５ｍＬのエーレンマイヤーフラスコ
中、１．１ｍＬのＫＬＨ溶液（約１０ｍｇ／ｍＬ）に０．８ｍＬのカフェイン誘
導体または１，７−ジメチルキサンチン誘導体（２．５μモル／ｍＬ ０．９Ｍ
ＮａＣｌ溶液）を加える。２ｍＬのＥＤＡＣ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ ０．９Ｍ
ＮａＣ１溶液）および１．８ｍＬの０．９Ｍ ＮａＣｌ溶液を誘導体溶液へ連
続的に加える。溶液は室温で一夜（２０時間）撹拌する。溶液は２５０ｍＬの０
．９Ｍ ＮａＣｌに対して４８時間、１日当たり２−３回液を交換して透析する
。カフェイン−ＫＬＨおよび１，７−ジメチルキサンチン−ＫＬＨ溶液は０．５
ｍＬずつ−２０℃で保存する。１，７−ジメチル尿酸−ＫＬＨ抱合体はＰｅｓｋ
ａｒらの方法（Ｐｅｓｋａｒ（１９７２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６：
１９１−１９５）と同様の方法により調製される。２０ｍｇのＫＬＨ凍結乾燥粉
末を２ｍＬの０．９Ｍ ＮａＣｌ溶液に溶解し、１００ｍＬに対して１０時間、
２回液を交換して透析する。７．３ｍｇの１，７−ジメチル尿酸（約０．０３ミ
リモル）を５ｍＬの丸底フラスコに入れ、１ｍＬのＫＬＨ溶液で溶解する。５０
０μＬの０．０２１Ｍグルタルアルデヒド溶液（１０ ｍＬの水当たり４２．５
μＬの５０％グルタルアルデヒド（ｖ／ｖ））を撹拌溶液に滴加する。２時間撹
拌後、１００μＬの１Ｍリジンの０．１Ｍ Ｎａ2ＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4緩衝液（
ｐＨ７．０）溶液を加える。溶液は１時間撹拌し、２５０ｍＬの０．９Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、５ｍＭ Ｎａ2ＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4緩衝液、ｐＨ７．０、に対し、１日当
たり２−３回緩衝液を交換しながら４８時間透析する。１，７−ジメチル尿酸−
ＫＬＨ抱合体は０．５ｍＬずつ−２０℃で保存する。
【００６６】 Ｌｏｗｒｙらの方法による蛋白質決定 （Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９５１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
，１９３：２６５−２７５） 溶液Ａ： ２ｇのＮａ2ＣＯ3を５０ｍＬの水に溶解、１０ｍＬの１０％ＳＤＳ および１０ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨ、水で１００ｍＬの容量に持って いく。新たに調製 溶液Ｂ： １％ ＮａＫ酒石酸塩 溶液Ｃ： １％ ＣｕＳＯ4．５Ｈ2０ 溶液Ｄ： １Ｎフェノール（新たに調製）：３ｍＬのフォリン−シオカルトフ ェ ノール試薬（２．０Ｎ）および３ｍＬ水 溶液Ｅ： ９８ｍＬの溶液Ａ、１ｍＬの溶液Ｂ、１ｍＬの溶液Ｃ、新たに調製 ＢＳＡ： １ｍｇ／ｍＬ。０．１０ｇウシ血清アルブミン （分画容量）／１００ｍＬ アッセイ 標準曲線 チューブ＃（１３ｘ１００ｍｍ） 溶液 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ＢＳＡ（μｌ） ０ １０ １５ ２０ ３０ ４０ ５０ 水（μｌ） ２００ １９０ １８５ １８０ １７０ １６０ １５０ 溶液Ｅ（ｍＬ） ２．０ ２．０ ２．０ ２．０ ２．０ ２．０ ２．０ ボルテックスし、室温で１０分間放置。 溶液Ｄ（μｌ） ２００ ２００ ２００ ２００ ２００ ２００ ２００ ボルテックスし、室温で１時間放置。 ブランクとして水を用い、７５０ｎｍで吸光度を読みとる。 未知試料 溶液Ｄ．Ｆa（三重に） チューブ＃（１３ｘ１００ｍｍ） 未知試料（μｌ） ｘ ｘ ｘ 水（μｌ） ｙ ｙ ｙ ｘ＋ｙ＝２００μｌ 溶液Ｆ（ｍＬ） ２．０ ２．０ ２．０ ボルテックスし、室温で１０分間放置。 溶液Ｄ（μｌ） ２００ ２００ ２００ ２００ ２００ ２００ ２００ ボルテックスし、室温で１時間放置。 ブランクとして水を用い、７５０ｎｍで吸光度を読みとる。 標準曲線を使用し、未知試料のＤ．Ｆ．（希釈比）を考えに入れて蛋白質濃度を
計算する。 ａ：Ｄ．Ｆ．（希釈比）：７５０ｎｍでの未知試料の吸光度が標準曲線の吸光度
の範囲にはいるようにしなければならない。
，１９３：２６５−２７５） 溶液Ａ： ２ｇのＮａ2ＣＯ3を５０ｍＬの水に溶解、１０ｍＬの１０％ＳＤＳ および１０ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨ、水で１００ｍＬの容量に持って いく。新たに調製 溶液Ｂ： １％ ＮａＫ酒石酸塩 溶液Ｃ： １％ ＣｕＳＯ4．５Ｈ2０ 溶液Ｄ： １Ｎフェノール（新たに調製）：３ｍＬのフォリン−シオカルトフ ェ ノール試薬（２．０Ｎ）および３ｍＬ水 溶液Ｅ： ９８ｍＬの溶液Ａ、１ｍＬの溶液Ｂ、１ｍＬの溶液Ｃ、新たに調製 ＢＳＡ： １ｍｇ／ｍＬ。０．１０ｇウシ血清アルブミン （分画容量）／１００ｍＬ アッセイ 標準曲線 チューブ＃（１３ｘ１００ｍｍ） 溶液 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ＢＳＡ（μｌ） ０ １０ １５ ２０ ３０ ４０ ５０ 水（μｌ） ２００ １９０ １８５ １８０ １７０ １６０ １５０ 溶液Ｅ（ｍＬ） ２．０ ２．０ ２．０ ２．０ ２．０ ２．０ ２．０ ボルテックスし、室温で１０分間放置。 溶液Ｄ（μｌ） ２００ ２００ ２００ ２００ ２００ ２００ ２００ ボルテックスし、室温で１時間放置。 ブランクとして水を用い、７５０ｎｍで吸光度を読みとる。 未知試料 溶液Ｄ．Ｆa（三重に） チューブ＃（１３ｘ１００ｍｍ） 未知試料（μｌ） ｘ ｘ ｘ 水（μｌ） ｙ ｙ ｙ ｘ＋ｙ＝２００μｌ 溶液Ｆ（ｍＬ） ２．０ ２．０ ２．０ ボルテックスし、室温で１０分間放置。 溶液Ｄ（μｌ） ２００ ２００ ２００ ２００ ２００ ２００ ２００ ボルテックスし、室温で１時間放置。 ブランクとして水を用い、７５０ｎｍで吸光度を読みとる。 標準曲線を使用し、未知試料のＤ．Ｆ．（希釈比）を考えに入れて蛋白質濃度を
計算する。 ａ：Ｄ．Ｆ．（希釈比）：７５０ｎｍでの未知試料の吸光度が標準曲線の吸光度
の範囲にはいるようにしなければならない。
【００６７】 ＫＬＨのｍｇ当たりに取り込まれたカフェイン、１，７−ＤＭＸまたは１，７−
ＤＭＵのモル数を決定する方法 この方法は大体の見積もりを与える。カップリングが期待されたように進行し
たかどうかを決定することが可能であるので有用である。 Ａ）溶液 −１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液 −１％ＳＤＳ溶液 −０．５または１ｍｇ／ｍＬのカフェイン−ＫＬＨ（または１，７−ＤＭＸ−Ｋ
ＬＨまたは１，７−ＤＭＵ−ＫＬＨ）の１％ＳＤＳ溶液（１ｍＬ） −０．５または１ｍｇ／ｍＬのＫＬＨの１％ＳＤＳ溶液 Ｂ）方法 −カフェイン−ＫＬＨ抱合体（または１，７−ＤＭＸ−ＫＬＨまたは１，７−Ｄ
ＭＵ−ＫＬＨ）の吸光度を、１％ＳＤＳ溶液をブランクとしてカフェイン（また
は１，７−ＤＭＸまたは１，７−ＤＭＵ）の極大吸収の波長で測定する −ＫＬＨ溶液の吸光度をカフェイン（または１，７−ＤＭＸまたは１，７−ＤＭ
Ｕ）の極大吸収波長で測定する −式：
ＤＭＵのモル数を決定する方法 この方法は大体の見積もりを与える。カップリングが期待されたように進行し
たかどうかを決定することが可能であるので有用である。 Ａ）溶液 −１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液 −１％ＳＤＳ溶液 −０．５または１ｍｇ／ｍＬのカフェイン−ＫＬＨ（または１，７−ＤＭＸ−Ｋ
ＬＨまたは１，７−ＤＭＵ−ＫＬＨ）の１％ＳＤＳ溶液（１ｍＬ） −０．５または１ｍｇ／ｍＬのＫＬＨの１％ＳＤＳ溶液 Ｂ）方法 −カフェイン−ＫＬＨ抱合体（または１，７−ＤＭＸ−ＫＬＨまたは１，７−Ｄ
ＭＵ−ＫＬＨ）の吸光度を、１％ＳＤＳ溶液をブランクとしてカフェイン（また
は１，７−ＤＭＸまたは１，７−ＤＭＵ）の極大吸収の波長で測定する −ＫＬＨ溶液の吸光度をカフェイン（または１，７−ＤＭＸまたは１，７−ＤＭ
Ｕ）の極大吸収波長で測定する −式：
【００６８】
【式１】
【００６９】 （式中、ｙはＫＬＨｍｇ当たりのカフェインのモル数であり；ελmax（カフェ
イン）は極大吸収波長におけるカフェインのモル吸光係数である）に従って、Ｋ
ＬＨｍｇ当たりに取り込まれたカフェイン（または１，７−ＤＭＸまたは１，７
−ＤＭＵ）のモル数を計算する。
イン）は極大吸収波長におけるカフェインのモル吸光係数である）に従って、Ｋ
ＬＨｍｇ当たりに取り込まれたカフェイン（または１，７−ＤＭＸまたは１，７
−ＤＭＵ）のモル数を計算する。
【００７０】 西洋ワサビペルオキシダーゼへのハプテンのカップリング カフェインおよび１，７−ジメチルキサンチン誘導体および１，７−ジメチル
尿酸誘導体（無水コハク酸でスクシニル化後）が以下の方法により西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ（ＨＲＰ）へ抱合された。５ｍＬの丸底フラスコに０．１２ミリ
モルの誘導体を入れる。塩化カルシウムで新しく乾燥させた５００μＬのジオキ
サンをピペットで加えた。懸濁液を撹拌し、砕いた氷を用いて水浴で１０℃に冷
却する。３１μＬのクロロギ酸イソブチル（０．２４ミリモル）（最近封を切っ
たかまたは購入したもの）および１１４μＬのトリブチルアミン（０．４７ミリ
モル）をピペットで加えた。１０℃で３０分間撹拌する。撹拌している間に、１
３ｍｇの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を２ｍＬの水に溶解し、溶液を
砕いた氷上で４℃に冷却する。３０分撹拌した後、１００μＬの１Ｎ ＮａＯＨ
溶液（新しく調製したもの）を４℃でＨＲＰ溶液へ加え、アルカリ性ＨＲＰ溶液
を５ｍＬフラスコへ一度に注ぐ。懸濁液は１０−１２℃で４時間撹拌する。０．
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化および溶出するセファデッ
クスＧ−２５TMファインカラム（１．６ｘ３０ｃｍ）での濾過によりＨＲＰ抱合
体から遊離誘導体を分離する。１．０−１．２ｍＬの分画を手操作またはフラク
ションコレクターで集める。溶出の間、二つのバンドが観察されるであろう：Ｈ
ＲＰ抱合体およびＨＲＰ抱合体の後ろの淡黄色バンド。ＨＲＰ抱合体バンドは分
画１１−１６の間に溶出した。ＨＲＰ抱合体を含んでいる分画をスクリューキャ
ップを持つ１５ｍＬの組織培養容器にプールする。一部を希釈して（通常５０μ
Ｌ＋６５０μＬ緩衝液）ＨＲＰ抱合体濃度を４０３ｎｍで決定する。 ［ＨＲＰ抱合体］（ｍｇ／ｍＬ）＝Ａ403ｘ０．４ｘＤ．Ｆ． ３２０および２２０ｎｍ間の紫外吸収スペクトル（ＵＶ）を記録する。カフェ
イン−ＨＲＰ、１，７−ＤＭＸ−ＨＲＰおよび１，７−ＤＭＵ−ＨＲＰ抱合体に
よる２８０ｎｍ、２８０ｎｍおよび２９０ｎｍでの追加の吸収ピークの存在は、
カップリングが期待されたように進行したという指標である。前記の測定後、カ
フェイン−ＨＲＰ、１，７−ＤＭＸ−ＨＲＰまたは１，７−ＤＭＵ−ＨＲＰ抱合
体溶液ｍＬ当たり、５μＬの４％チオメルサル溶液を加える。抱合体は４℃で保
存する。
尿酸誘導体（無水コハク酸でスクシニル化後）が以下の方法により西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ（ＨＲＰ）へ抱合された。５ｍＬの丸底フラスコに０．１２ミリ
モルの誘導体を入れる。塩化カルシウムで新しく乾燥させた５００μＬのジオキ
サンをピペットで加えた。懸濁液を撹拌し、砕いた氷を用いて水浴で１０℃に冷
却する。３１μＬのクロロギ酸イソブチル（０．２４ミリモル）（最近封を切っ
たかまたは購入したもの）および１１４μＬのトリブチルアミン（０．４７ミリ
モル）をピペットで加えた。１０℃で３０分間撹拌する。撹拌している間に、１
３ｍｇの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を２ｍＬの水に溶解し、溶液を
砕いた氷上で４℃に冷却する。３０分撹拌した後、１００μＬの１Ｎ ＮａＯＨ
溶液（新しく調製したもの）を４℃でＨＲＰ溶液へ加え、アルカリ性ＨＲＰ溶液
を５ｍＬフラスコへ一度に注ぐ。懸濁液は１０−１２℃で４時間撹拌する。０．
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化および溶出するセファデッ
クスＧ−２５TMファインカラム（１．６ｘ３０ｃｍ）での濾過によりＨＲＰ抱合
体から遊離誘導体を分離する。１．０−１．２ｍＬの分画を手操作またはフラク
ションコレクターで集める。溶出の間、二つのバンドが観察されるであろう：Ｈ
ＲＰ抱合体およびＨＲＰ抱合体の後ろの淡黄色バンド。ＨＲＰ抱合体バンドは分
画１１−１６の間に溶出した。ＨＲＰ抱合体を含んでいる分画をスクリューキャ
ップを持つ１５ｍＬの組織培養容器にプールする。一部を希釈して（通常５０μ
Ｌ＋６５０μＬ緩衝液）ＨＲＰ抱合体濃度を４０３ｎｍで決定する。 ［ＨＲＰ抱合体］（ｍｇ／ｍＬ）＝Ａ403ｘ０．４ｘＤ．Ｆ． ３２０および２２０ｎｍ間の紫外吸収スペクトル（ＵＶ）を記録する。カフェ
イン−ＨＲＰ、１，７−ＤＭＸ−ＨＲＰおよび１，７−ＤＭＵ−ＨＲＰ抱合体に
よる２８０ｎｍ、２８０ｎｍおよび２９０ｎｍでの追加の吸収ピークの存在は、
カップリングが期待されたように進行したという指標である。前記の測定後、カ
フェイン−ＨＲＰ、１，７−ＤＭＸ−ＨＲＰまたは１，７−ＤＭＵ−ＨＲＰ抱合
体溶液ｍＬ当たり、５μＬの４％チオメルサル溶液を加える。抱合体は４℃で保
存する。
【００７１】 抗体生成 ６匹の成熟メスニュージーランドホワイト系ウサギ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖ
ｅｒ Ｃａｎａｄａ，Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｑｕｅ．，Ｃａｎａｄａ）が抗
体生成に使用された。この研究に用いられたプロトコールはカナダ動物保護評議
会のガイドラインに従ってＭｃＧｉｌｌ大学動物保護委員会により承認されてい
る。２４０μｇのＫＬＨ抱合抗原を含んでいる等張塩溶液（０．６ｍＬ）を０．
６ｍＬの完全フロイントアジュバントで乳化した。ウサギ当たり０．５ｍＬの乳
剤（１００μｇの抗原）を筋肉内または皮下に注射された。ウサギは続いて不完
全フロイントアジュバントで乳化した５０μｇの抗原を用い３週間の間隔で追加
免疫された。追加免疫して１０−１４日後、耳の静脈穿刺により真空チューブ内
へ凝固阻止薬なしで血液を集め、４℃に保った。凝固後、４℃で遠心分離し、０
．００１％の最終濃度になるように抗血清へアジ化ナトリウムを加えた（１ｍＬ
の抗血清当たり１％アジ化ナトリウム溶液を１μＬ）。抗血清は０．５ｍＬに分
けて−２０℃で保存した。
ｅｒ Ｃａｎａｄａ，Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｑｕｅ．，Ｃａｎａｄａ）が抗
体生成に使用された。この研究に用いられたプロトコールはカナダ動物保護評議
会のガイドラインに従ってＭｃＧｉｌｌ大学動物保護委員会により承認されてい
る。２４０μｇのＫＬＨ抱合抗原を含んでいる等張塩溶液（０．６ｍＬ）を０．
６ｍＬの完全フロイントアジュバントで乳化した。ウサギ当たり０．５ｍＬの乳
剤（１００μｇの抗原）を筋肉内または皮下に注射された。ウサギは続いて不完
全フロイントアジュバントで乳化した５０μｇの抗原を用い３週間の間隔で追加
免疫された。追加免疫して１０−１４日後、耳の静脈穿刺により真空チューブ内
へ凝固阻止薬なしで血液を集め、４℃に保った。凝固後、４℃で遠心分離し、０
．００１％の最終濃度になるように抗血清へアジ化ナトリウムを加えた（１ｍＬ
の抗血清当たり１％アジ化ナトリウム溶液を１μＬ）。抗血清は０．５ｍＬに分
けて−２０℃で保存した。
【００７２】 抗血清力価 マイクロタイタープレートのウェルを１０μｇｍＬ-1のウシ血清アルブミン−
カフェイン（または１，７−ジメチルキサンチン、１，７−ジメチル尿酸）抱合
体（１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６）を用いて４℃にて一夜被覆
した（１５０μＬ／ウェル）。それらはＮｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ Ｗａｓｈ １
２ ａｕｔｏｃｌａｖａｂｌｅを使用してＴＰＢＳ（０．０５％トウィーン２０
を含んでいるリン酸緩衝液）で３回洗浄した。非占有部位は、１５０μＬ／ウェ
ルの０．０５％ブタゼラチン含有ＴＰＢＳとの室温での２時間のインキュベーシ
ョンによりブロックされた。ウェルをＴＰＢＳで３回洗浄し、ＴＰＢＳに希釈し
た１５０μＬの抗血清を加えた。室温で２時間後、ウェルをＴＰＢＳで３回洗浄
し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳに希釈した１００μＬのヤギ抗ウサギＩｇＧｓ−アル
カリ性ホスファターゼ抱合体を加えた。室温で１時間後、ウェルをＴＰＢＳで３
回、水で３回洗浄した。次にウェルにＭｇＣｌ2（０．５ｍＭ）およびｐ−ニト
ロフェノールホスフェート（３．８５ｍＭ）を含んでいる１５０μＬのジエタノ
ールアミン緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ９．８）溶液を加えた。室温で３０分後、マ
イクロプレートリーダーで４０５ｎｍの吸光度を読みとった。抗体力価は１単位
（１ａｕ）吸光度を変化させるのに必要とされる希釈として定義される。
カフェイン（または１，７−ジメチルキサンチン、１，７−ジメチル尿酸）抱合
体（１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６）を用いて４℃にて一夜被覆
した（１５０μＬ／ウェル）。それらはＮｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ Ｗａｓｈ １
２ ａｕｔｏｃｌａｖａｂｌｅを使用してＴＰＢＳ（０．０５％トウィーン２０
を含んでいるリン酸緩衝液）で３回洗浄した。非占有部位は、１５０μＬ／ウェ
ルの０．０５％ブタゼラチン含有ＴＰＢＳとの室温での２時間のインキュベーシ
ョンによりブロックされた。ウェルをＴＰＢＳで３回洗浄し、ＴＰＢＳに希釈し
た１５０μＬの抗血清を加えた。室温で２時間後、ウェルをＴＰＢＳで３回洗浄
し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳに希釈した１００μＬのヤギ抗ウサギＩｇＧｓ−アル
カリ性ホスファターゼ抱合体を加えた。室温で１時間後、ウェルをＴＰＢＳで３
回、水で３回洗浄した。次にウェルにＭｇＣｌ2（０．５ｍＭ）およびｐ−ニト
ロフェノールホスフェート（３．８５ｍＭ）を含んでいる１５０μＬのジエタノ
ールアミン緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ９．８）溶液を加えた。室温で３０分後、マ
イクロプレートリーダーで４０５ｎｍの吸光度を読みとった。抗体力価は１単位
（１ａｕ）吸光度を変化させるのに必要とされる希釈として定義される。
【００７３】 ＩｇＧ抗体の単離 ＫＬＨ抱合体に対するウサギＩｇＧ抗体は以下のように、プロテインＡ−セフ
ァロース４Ｂカラムでのアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。
０．９ｘ１５ｃｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａクロマトグラフィーカラムに１ｍＬの容
量までロテインＡ−セファロース４Ｂ懸濁液を詰めた。カラムは０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌを含んでいる０．０１Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ８．
０）（ＰＢＳ）で十分に洗浄し、続いて３−４ｍＬの０．１Ｍクエン酸三ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ３．０）で洗浄した。カラムは次にＰＢＳで十分に洗浄した。
１ｍＬのウサギ抗血清を１ｍＬのＰＢＳで希釈し、得られた溶液はゆっくりとカ
ラムに加えた。カラムを１５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍクエン酸三ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出した。２．２ｍＬの三つの分画が、０．８ｍＬ
の１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を含んでいる目盛りのついた１５ｍ
Ｌのチューブに集められた。精製されたウサギＩｇＧ抗体は、０．０１％アジ化
ナトリウム存在下、４℃で保存された。
ァロース４Ｂカラムでのアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。
０．９ｘ１５ｃｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａクロマトグラフィーカラムに１ｍＬの容
量までロテインＡ−セファロース４Ｂ懸濁液を詰めた。カラムは０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌを含んでいる０．０１Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ８．
０）（ＰＢＳ）で十分に洗浄し、続いて３−４ｍＬの０．１Ｍクエン酸三ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ３．０）で洗浄した。カラムは次にＰＢＳで十分に洗浄した。
１ｍＬのウサギ抗血清を１ｍＬのＰＢＳで希釈し、得られた溶液はゆっくりとカ
ラムに加えた。カラムを１５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍクエン酸三ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出した。２．２ｍＬの三つの分画が、０．８ｍＬ
の１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を含んでいる目盛りのついた１５ｍ
Ｌのチューブに集められた。精製されたウサギＩｇＧ抗体は、０．０１％アジ化
ナトリウム存在下、４℃で保存された。
【００７４】 競合的抗原ＥＬＩＳＡ 添加物を含まない緩衝液および水は０．４５μＭミリポアフィルターを通して
１週間は維持されたが、ただし基質緩衝液は新しく調製された。ＢＳＡ、抗体、
トウィーンTM２０および西洋ワサビペルオキシダーゼは使用直前に緩衝液および
水に加えられた。尿試料は通常一カップのコーヒー（カップ当たり約１００ｍｇ
のカフェインを含んでいるインスタントまたは焙煎されたコーヒー）を飲んで４
時間後に集められ、１ｍＬずつ１．５ｍＬのマイクロチューブに−２０℃で保存
した。ＥＬＩＳＡのためには、マイクロタイタープレートのウェル中で３ｘ１０ -6 Ｍより低いカフェイン、１，７−ＤＭＸおよび１，７−ＤＭＵ濃度を与えるよ
うに、尿試料を等張リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５（３１０ｍｏｓＭ）、
で希釈する。ＥＬＩＳＡプレートのウェルはＮｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ Ｗａｓｈ
１２洗浄機で洗浄した。６．６μｇ ｍｌ-1の単離されたＩｇＧ抗体を含む１
６ｍＬの溶液を１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で調製し、この
溶液の１５０μＬを８チャンネルピペット（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｔｒａｎｓｆ
ｅｒｐｅｔｔｅTM−８ ５０−２００μＬ）およびＢｒｉｎｋｍａｎｎからの２
００μＬ Ｆｌｅｘチップを使用してマイクロタイタープレートの各々のウェル
に加えた。２０時間、４℃にてウェルを抗体でコーティングした後、ウェルを０
．０５％トウィーンＴＭ２０を含んでいる等張リン酸ナトリウム緩衝液（ＩＰＢ
Ｔ）で３回洗浄し、プレートを逆にして液体をペーパータオルに吸収させること
により適当に水を排出した。１％ＢＳＡを含んでいるＩＰＢＴ溶液を３０ｍＬ調
製し、この溶液の１５０μＬを８チャンネルピペット（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｔ
ｒａｎｓｆｅｒｐｅｔｔｅTM−８ ５０−２００μＬ）および２００μＬイエロ
ーチップ（Ｐ２００ Ｇｉｌｓｏｎ Ｐｉｐｅｔｍａｎ用のＳａｒｓｔｅｄｔイ
エローチップ）を使用して各々のウェルに加えた。室温で３時間後、ウェルをＩ
ＰＢＴ溶液で３回洗浄し、排水した。カフェイン、１，７−ＤＭＸおよび１，７
−ＤＭＵ決定のための４００μＬの試料をＳａｒｓｔｅｄｔイエローチップおよ
びＰ２００ Ｇｉｌｓｏｎ Ｐｉｐｅｔｍａｎを使用して１．５ｍＬのマイクロ
チューブに加えた。ＳａｒｓｔｅｄｔイエローチップおよびＰ２００ Ｇｉｌｓ
ｏｎ Ｐｉｐｅｔｍａｎを使用して各々の試料の２００μＬを図１０に示したよ
うなパターンに従って、Ｆａｌｃｏｎ９６ウェルマイクロテスト組織培養プレー
トに二重に加える。８チャンネルピペット（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｔｒａｎｓｆ
ｅｒｐｅｔｔｅTM−８ ５０−２００μＬ）を使用し、および８チャンネルピペ
ットのチップ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎからの２００μＬ Ｆｌｅｘチップ）へ変更
し、各々の列に、１５０μＬの試料を抗体で被覆した９６−ウェルＥＬＩＳＡマ
イクロタイタープレートの対応したウェルへ移す。試料添加後、マイクロタイタ
ープレートを覆い、室温で２時間放置する。プレートを放置している間に、過酸
化水素およびｏ−フェニレンジアミン塩酸塩を含まない基質緩衝液（２５ｍＭク
エン酸および５０ｍＭリン酸ナトリウム二塩基緩衝液ｐＨ５．０）を調製する。
マイクロタイタープレートはＩＰＢＴ溶液で３回および０．０５％トウィーンTM で３回洗浄し、排水する。５０μＬの過酸化水素および４０ｍｇのｏ−フェニレ
ンジアミン塩酸塩を基質緩衝液に加える。１５０マイクロリットル（１５０μＬ
）の基質緩衝液を８チャンネルピペット（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｔｒａｎｓｆｅ
ｒｐｅｔｔｅTM−８ ５０−２００μＬ）および２００μＬ Ｆｌｅｘチップ（
Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ）を使用して各々のウェルに加える。マイクロタイタープレ
ートを覆い、室温で２５−３０分間振盪し、酵素反応は８チャンネルピペット（
Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ＴｒａｎｓｆｅｒｐｅｔｔｅTM−８ ５０−２００μＬ）
および２００μＬ Ｆｌｅｘチップ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ）を使用して５０μＬ
／ウェルの２．５Ｍ ＨＣｌを加えることにより停止させる。穏やかに３分間振
盪した後、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍの吸光度を読みとった。
１週間は維持されたが、ただし基質緩衝液は新しく調製された。ＢＳＡ、抗体、
トウィーンTM２０および西洋ワサビペルオキシダーゼは使用直前に緩衝液および
水に加えられた。尿試料は通常一カップのコーヒー（カップ当たり約１００ｍｇ
のカフェインを含んでいるインスタントまたは焙煎されたコーヒー）を飲んで４
時間後に集められ、１ｍＬずつ１．５ｍＬのマイクロチューブに−２０℃で保存
した。ＥＬＩＳＡのためには、マイクロタイタープレートのウェル中で３ｘ１０ -6 Ｍより低いカフェイン、１，７−ＤＭＸおよび１，７−ＤＭＵ濃度を与えるよ
うに、尿試料を等張リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５（３１０ｍｏｓＭ）、
で希釈する。ＥＬＩＳＡプレートのウェルはＮｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ Ｗａｓｈ
１２洗浄機で洗浄した。６．６μｇ ｍｌ-1の単離されたＩｇＧ抗体を含む１
６ｍＬの溶液を１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で調製し、この
溶液の１５０μＬを８チャンネルピペット（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｔｒａｎｓｆ
ｅｒｐｅｔｔｅTM−８ ５０−２００μＬ）およびＢｒｉｎｋｍａｎｎからの２
００μＬ Ｆｌｅｘチップを使用してマイクロタイタープレートの各々のウェル
に加えた。２０時間、４℃にてウェルを抗体でコーティングした後、ウェルを０
．０５％トウィーンＴＭ２０を含んでいる等張リン酸ナトリウム緩衝液（ＩＰＢ
Ｔ）で３回洗浄し、プレートを逆にして液体をペーパータオルに吸収させること
により適当に水を排出した。１％ＢＳＡを含んでいるＩＰＢＴ溶液を３０ｍＬ調
製し、この溶液の１５０μＬを８チャンネルピペット（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｔ
ｒａｎｓｆｅｒｐｅｔｔｅTM−８ ５０−２００μＬ）および２００μＬイエロ
ーチップ（Ｐ２００ Ｇｉｌｓｏｎ Ｐｉｐｅｔｍａｎ用のＳａｒｓｔｅｄｔイ
エローチップ）を使用して各々のウェルに加えた。室温で３時間後、ウェルをＩ
ＰＢＴ溶液で３回洗浄し、排水した。カフェイン、１，７−ＤＭＸおよび１，７
−ＤＭＵ決定のための４００μＬの試料をＳａｒｓｔｅｄｔイエローチップおよ
びＰ２００ Ｇｉｌｓｏｎ Ｐｉｐｅｔｍａｎを使用して１．５ｍＬのマイクロ
チューブに加えた。ＳａｒｓｔｅｄｔイエローチップおよびＰ２００ Ｇｉｌｓ
ｏｎ Ｐｉｐｅｔｍａｎを使用して各々の試料の２００μＬを図１０に示したよ
うなパターンに従って、Ｆａｌｃｏｎ９６ウェルマイクロテスト組織培養プレー
トに二重に加える。８チャンネルピペット（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｔｒａｎｓｆ
ｅｒｐｅｔｔｅTM−８ ５０−２００μＬ）を使用し、および８チャンネルピペ
ットのチップ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎからの２００μＬ Ｆｌｅｘチップ）へ変更
し、各々の列に、１５０μＬの試料を抗体で被覆した９６−ウェルＥＬＩＳＡマ
イクロタイタープレートの対応したウェルへ移す。試料添加後、マイクロタイタ
ープレートを覆い、室温で２時間放置する。プレートを放置している間に、過酸
化水素およびｏ−フェニレンジアミン塩酸塩を含まない基質緩衝液（２５ｍＭク
エン酸および５０ｍＭリン酸ナトリウム二塩基緩衝液ｐＨ５．０）を調製する。
マイクロタイタープレートはＩＰＢＴ溶液で３回および０．０５％トウィーンTM で３回洗浄し、排水する。５０μＬの過酸化水素および４０ｍｇのｏ−フェニレ
ンジアミン塩酸塩を基質緩衝液に加える。１５０マイクロリットル（１５０μＬ
）の基質緩衝液を８チャンネルピペット（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｔｒａｎｓｆｅ
ｒｐｅｔｔｅTM−８ ５０−２００μＬ）および２００μＬ Ｆｌｅｘチップ（
Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ）を使用して各々のウェルに加える。マイクロタイタープレ
ートを覆い、室温で２５−３０分間振盪し、酵素反応は８チャンネルピペット（
Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ＴｒａｎｓｆｅｒｐｅｔｔｅTM−８ ５０−２００μＬ）
および２００μＬ Ｆｌｅｘチップ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ）を使用して５０μＬ
／ウェルの２．５Ｍ ＨＣｌを加えることにより停止させる。穏やかに３分間振
盪した後、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍの吸光度を読みとった。
【００７５】 ＥＬＩＳＡのためのカフェイン、１，７−ＤＭＸおよび１，７−ジメチル尿酸溶
液の標準溶液 １００ｍＬのメスフラスコを用い、３１０ｍｏｓＭリン酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ７．５（ＩＰＢ）に６．００ｘ１０-4Ｍの濃度でカフェイン、１，７−ＤＭ
Ｘおよび１，７−ＤＭＵ保存溶液を１００ｍＬ調製する。完全に溶解するのを確
実にするため溶液を撹拌する。
液の標準溶液 １００ｍＬのメスフラスコを用い、３１０ｍｏｓＭリン酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ７．５（ＩＰＢ）に６．００ｘ１０-4Ｍの濃度でカフェイン、１，７−ＤＭ
Ｘおよび１，７−ＤＭＵ保存溶液を１００ｍＬ調製する。完全に溶解するのを確
実にするため溶液を撹拌する。
【００７６】 保存溶液は１ｍＬずつ−２０℃で保存する。 ＥＬＩＳＡを行う日、一つを融解し室温まで温める。 上記化合物の以下の標準溶液を調製する 標品＃ ［化合物］ 組成 １ ６．００ｘ１０-4Ｍ 保存溶液 ２ ２．００ｘ１０-4Ｍ ２００μＬＳ１＋４００μＬＩＰＢ ３ １．１２ｘ１０-4Ｍ ２００μＬＳ１＋８６８μＬＩＰＢ ４ ６．００ｘ１０-5Ｍ １００μＬＳ１＋９００μＬＩＰＢ ５ ３．５６ｘ１０-5Ｍ ６０μＬＳ１＋９５１μＬＩＰＢ ６ ２．００ｘ１０-5Ｍ １００μＬＳ２＋９００μＬＩＰＢ ７ １．１２ｘ１０-5Ｍ １００μＬＳ３＋９００μＬＩＰＢ ８ ６．００ｘ１０-6Ｍ １００μＬＳ４＋９００μＬＩＰＢ ９ ３．５６ｘ１０-6Ｍ １００μＬＳ５＋９００μＬＩＰＢ １０ ２．００ｘ１０-6Ｍ １００μＬＳ６＋９００μＬＩＰＢ １１ １．１２ｘ１０-6Ｍ １００μＬＳ７＋９００μＬＩＰＢ １２ ６．００ｘ１０-7Ｍ １００μＬＳ８＋９００μＬＩＰＢ １３ ３．５６ｘ１０-7Ｍ １００μＬＳ９＋９００μＬＩＰＢ １４ ２．００ｘ１０-7Ｍ １００μＬＳ１０＋９００μＬＩＰＢ １５ １．１２ｘ１０-7Ｍ １００μＬＳ１１＋９００μＬＩＰＢ １６ ６．００ｘ１０-8Ｍ １００μＬＳ１２＋９００μＬＩＰＢ １７ ３．５６ｘ１０-8Ｍ １００μＬＳ１３＋９００μＬＩＰＢ １８ ２．００ｘ１０-8Ｍ １００μＬＳ１４＋９００μＬＩＰＢ １９ ２．００ｘ１０-9Ｍ １００μＬＳ１５＋９００μＬＩＰＢ ２０ ２．００ｘ１０-10Ｍ １００μＬＳ１５＋９００μＬＩＰＢ ２１ ２．００ｘ１０-11Ｍ １００μＬＳ１５＋９００μＬＩＰＢ ２２ ２．００ｘ１０-12Ｍ １００μＬＳ１５＋９００μＬＩＰＢ ２３ ２．００ｘ１０-13Ｍ １００μＬＳ１５＋９００μＬＩＰＢ
【００７７】 抗体特異性 ＣＹＰ１Ａ２表現型分類のＥＬＩＳＡ測定の正確さを確実にするには、抗体は
その個々のカフェイン代謝産物に対する特異性を持っていなければならず、他の
誘導体は全く認識しないかまたはほとんど認識しない。その選択性を確かめるた
め、表５に掲げた化合物の標準溶液でＥＬＩＳＡが実施されるであろう。理想的
な抗体特異性の結果もまた表５に仮定されている。表５ カフェイン代謝産物および構造類似体に対するカフェイン−Ａｂ、１，７
−ＤＭＸ−Ａｂおよび１，７−ＤＭＵ−Ａｂの交差反応性
その個々のカフェイン代謝産物に対する特異性を持っていなければならず、他の
誘導体は全く認識しないかまたはほとんど認識しない。その選択性を確かめるた
め、表５に掲げた化合物の標準溶液でＥＬＩＳＡが実施されるであろう。理想的
な抗体特異性の結果もまた表５に仮定されている。表５ カフェイン代謝産物および構造類似体に対するカフェイン−Ａｂ、１，７
−ＤＭＸ−Ａｂおよび１，７−ＤＭＵ−Ａｂの交差反応性
【００７８】
【表５】
【００７９】 ａ、数字の０はＥＬＩＳＡで試験された最も高い濃度（５ｘ１０-3Ｍ）で阻害が
なかったかまたは４０％よりは高くなかったことを意味している；競合的抗原Ｅ
ＬＩＳＡでの５０％阻害に必要とされるカフェイン、１，７−ジメチルキサンチ
ンおよび１，７−ジメチル尿酸の濃度が決定されるであろう；ｂ、１，３−ジメ
チルキサンチン、テオフィリン；ｃ、１，７−ジメチルキサンチン、パラキサン
チン；ｄ、３，７−ジメチルキサンチン、テオブロミン；ｅ、ＡＡＵ、５−アセ
トアミド−６−アミノウラシル；ｆ、ＡＡＭＵ、５−アセトアミド−６−アミノ
−３−メチルウラシル；ｇ、ＡＡＤＭＵ、５−アセトアミド−６−アミノ−１，
３−ジメチルキサンチン。結果 ＥＬＩＳＡ、抗血清およびウサギ血清アルブミンに抱合された誘導体の寒天プ
レートでの二重免疫拡散後の強い沈殿ライン、および他のカフェイン誘導体との
低い交差反応性で決定されたように、３０，０００−１００，０００の抗体力価
のカフェイン、１，７−ＤＭＸおよび１，７−ＤＭＵに対する抗体の陽性作製が
観察できた。これらの結果は材料および方法と題して上記の節で説明したような
方法に従って、競合的抗原ＥＬＩＳＡ開発のための建設的な条件を構成している
。
なかったかまたは４０％よりは高くなかったことを意味している；競合的抗原Ｅ
ＬＩＳＡでの５０％阻害に必要とされるカフェイン、１，７−ジメチルキサンチ
ンおよび１，７−ジメチル尿酸の濃度が決定されるであろう；ｂ、１，３−ジメ
チルキサンチン、テオフィリン；ｃ、１，７−ジメチルキサンチン、パラキサン
チン；ｄ、３，７−ジメチルキサンチン、テオブロミン；ｅ、ＡＡＵ、５−アセ
トアミド−６−アミノウラシル；ｆ、ＡＡＭＵ、５−アセトアミド−６−アミノ
−３−メチルウラシル；ｇ、ＡＡＤＭＵ、５−アセトアミド−６−アミノ−１，
３−ジメチルキサンチン。結果 ＥＬＩＳＡ、抗血清およびウサギ血清アルブミンに抱合された誘導体の寒天プ
レートでの二重免疫拡散後の強い沈殿ライン、および他のカフェイン誘導体との
低い交差反応性で決定されたように、３０，０００−１００，０００の抗体力価
のカフェイン、１，７−ＤＭＸおよび１，７−ＤＭＵに対する抗体の陽性作製が
観察できた。これらの結果は材料および方法と題して上記の節で説明したような
方法に従って、競合的抗原ＥＬＩＳＡ開発のための建設的な条件を構成している
。
【００８０】 本発明の一つの態様に従うと、競合的抗原ＥＬＩＳＡがプローブ薬剤としてカ
フェインを使用するＣＹＰ１Ａ２表現型分類のために開発されるであろう。表現
型分類に使用されている現在の方法に反して、本アッセイは感度が良く、迅速で
あり、および臨床実験室で最少の訓練しかつんでいない技術者でも日常的な基準
で容易に実施できる。実施例ＩＩ ＥＬＩＳＡキットによる尿中のカフェイン、１，７−ジメチルキサンチン（１，
７−ＤＭＸ）および１，７−ジメチル尿酸（１，７−ＤＭＵ）の決定表６ ＥＬＩＳＡキットの内容および保存条件
フェインを使用するＣＹＰ１Ａ２表現型分類のために開発されるであろう。表現
型分類に使用されている現在の方法に反して、本アッセイは感度が良く、迅速で
あり、および臨床実験室で最少の訓練しかつんでいない技術者でも日常的な基準
で容易に実施できる。実施例ＩＩ ＥＬＩＳＡキットによる尿中のカフェイン、１，７−ジメチルキサンチン（１，
７−ＤＭＸ）および１，７−ジメチル尿酸（１，７−ＤＭＵ）の決定表６ ＥＬＩＳＡキットの内容および保存条件
【００８１】
【表６】
【００８２】 ＥＬＩＳＡによる［カフェイン］、［１，７−ＤＭＸ］および［１Ｘ］決定のた
めの尿試料の希釈 カフェイン、１，７−ＤＭＸおよび１，７−ＤＭＵの決定に必要とされる尿試
料の希釈は競合的抗原ＥＬＩＳＡの感度および尿試料中のカフェイン、１，７−
ＤＭＸおよび１，７−ＤＭＵ濃度の関数である。ＡＡＭＵおよび１Ｘがマイクロ
タイタープレートのウェル中で約３ｘ１０-6Ｍであるような因子で尿試料を希釈
することが示唆される。
めの尿試料の希釈 カフェイン、１，７−ＤＭＸおよび１，７−ＤＭＵの決定に必要とされる尿試
料の希釈は競合的抗原ＥＬＩＳＡの感度および尿試料中のカフェイン、１，７−
ＤＭＸおよび１，７−ＤＭＵ濃度の関数である。ＡＡＭＵおよび１Ｘがマイクロ
タイタープレートのウェル中で約３ｘ１０-6Ｍであるような因子で尿試料を希釈
することが示唆される。
【００８３】
【表７】
【００８４】 ａ：ピペッティング前に尿試料を含んでいるマイクロチューブをかき混ぜる。 希釈尿試料は−２０℃でマイクロチューブのためのボックスに保存。 緩衝液Ｂ：１本のバイアルＢの内容物を溶解／１００ｍＬ。
【００８５】 ＥＬＩＳＡによる希釈尿試料中の［カフェイン］、［１，７−ＤＭＸ］および［
１，７−ＤＭＵ］の決定 警告 基質は発癌性である。緩衝液Ｅ（基質緩衝液）を取り扱う場合は手術用手袋を
つけるべきである。各々の試料は二重に決定される。優秀なピペッティング技術
が必要とされる。この技術を習得した場合は、二重の吸収値は５％未満になるべ
きである。緩衝液Ｃ、Ｄ、Ｅは新しく調製される。緩衝液Ｅ−Ｈ2Ｏ2はマイクロ
タイタープレートのウェルへピペッティングする直前に調製される。 試料の調製： コンピューターで表８を作り、印刷する。この表は９６ウェルマイクロタイタ
ープレートの各々の内容物を示している。表８の対応するウェル位置に尿試料の
の名前（または番号）を入れる。各々の尿試料の希釈比（Ｄ．Ｆ．）を選び、表
８の対応する位置に記入する。緩衝液Ｂによる各々の尿試料の希釈を表８の対応
する位置に記入する：例えば、１００のＤ．Ｆ．（１００μＬの１０ｘ希釈尿試
料＋９００μＬ緩衝液Ｂ）、１００／９００を入れる。異なった希釈の調製試料
に対しては、前記”ＥＬＩＳＡによる．．．尿試料の希釈”を参照されたい。１
００マイクロチューブ用のスタイロフォーム支持台を使用して１．５ｍＬのマイ
クロチューブに異なった希釈の尿試料を準備する。コンピューターで表９を作り
、印刷する。スタイロフォーム支持台（１００マイクロチューブ）を使用し、表
９に示された順序で以下の４８マイクロチューブを準備する。表８ マイクロタイタープレート中のブランク、対照および尿試料の位置
１，７−ＤＭＵ］の決定 警告 基質は発癌性である。緩衝液Ｅ（基質緩衝液）を取り扱う場合は手術用手袋を
つけるべきである。各々の試料は二重に決定される。優秀なピペッティング技術
が必要とされる。この技術を習得した場合は、二重の吸収値は５％未満になるべ
きである。緩衝液Ｃ、Ｄ、Ｅは新しく調製される。緩衝液Ｅ−Ｈ2Ｏ2はマイクロ
タイタープレートのウェルへピペッティングする直前に調製される。 試料の調製： コンピューターで表８を作り、印刷する。この表は９６ウェルマイクロタイタ
ープレートの各々の内容物を示している。表８の対応するウェル位置に尿試料の
の名前（または番号）を入れる。各々の尿試料の希釈比（Ｄ．Ｆ．）を選び、表
８の対応する位置に記入する。緩衝液Ｂによる各々の尿試料の希釈を表８の対応
する位置に記入する：例えば、１００のＤ．Ｆ．（１００μＬの１０ｘ希釈尿試
料＋９００μＬ緩衝液Ｂ）、１００／９００を入れる。異なった希釈の調製試料
に対しては、前記”ＥＬＩＳＡによる．．．尿試料の希釈”を参照されたい。１
００マイクロチューブ用のスタイロフォーム支持台を使用して１．５ｍＬのマイ
クロチューブに異なった希釈の尿試料を準備する。コンピューターで表９を作り
、印刷する。スタイロフォーム支持台（１００マイクロチューブ）を使用し、表
９に示された順序で以下の４８マイクロチューブを準備する。表８ マイクロタイタープレート中のブランク、対照および尿試料の位置
【００８６】
【表８】
【００８７】表９ 異なったマイクロチューブの内容物
【００８８】
【表９】
【００８９】 溶液 緩衝液Ｃ：１本のバイアルＣの内容物を溶解／５０ｍＬ。 ２５ｍＬのトウィーンTM２０を加える。 緩衝液Ｃ：１本のバイアルＤの内容物を溶解／２５ｍＬ。
【００９０】 ２５ｍＬのトウィーンTM２０を加える。 ０．０５％トウィーンTM２０：５０ｍＬの水を含んでいる１００ｍＬのエーレン
マイヤーフラスコに２５ｍＬのトウィーンTM２０を加える。 ２．５Ｎ ＨＣｌ：４１．７５ｍＬの１２Ｎ ＨＣｌ／２００ｍＬ。２５０ｍＬ
ガラス瓶に保存。 カフェイン−ＨＲＰ抱合体：９ｍＬの緩衝液Ｃを１５ｍＬのガラス試験管に加え
る。９０μＬのカフェイン−ＨＲＰ保存溶液を加える。 １，７−ＤＭＸ−ＨＲＰ抱合体：９ｍＬの緩衝液Ｃを１５ｍＬのガラス試験管に
加える。９０μＬの１，７−ＤＭＸ−ＨＲＰ保存溶液を加える。 １，７−ＤＭＵ−ＨＲＰ抱合体：９ｍＬの緩衝液Ｃを１５ｍＬのガラス試験管に
加える。９０μＬの１，７−ＤＭＵ−ＨＲＰ保存溶液を加える。 緩衝液Ｅ−Ｈ2Ｏ2：１本のバイアルＥ−基質の内容物を溶解／５０ｍＬの水。２
５μＬの３０％Ｈ2Ｏ2溶液を加える（新たに調製）。表１０ カフェイン、１，７−ＤＭＸおよび１，７−ＤＭＵの標準溶液（緩衝液
Ｂで希釈）
マイヤーフラスコに２５ｍＬのトウィーンTM２０を加える。 ２．５Ｎ ＨＣｌ：４１．７５ｍＬの１２Ｎ ＨＣｌ／２００ｍＬ。２５０ｍＬ
ガラス瓶に保存。 カフェイン−ＨＲＰ抱合体：９ｍＬの緩衝液Ｃを１５ｍＬのガラス試験管に加え
る。９０μＬのカフェイン−ＨＲＰ保存溶液を加える。 １，７−ＤＭＸ−ＨＲＰ抱合体：９ｍＬの緩衝液Ｃを１５ｍＬのガラス試験管に
加える。９０μＬの１，７−ＤＭＸ−ＨＲＰ保存溶液を加える。 １，７−ＤＭＵ−ＨＲＰ抱合体：９ｍＬの緩衝液Ｃを１５ｍＬのガラス試験管に
加える。９０μＬの１，７−ＤＭＵ−ＨＲＰ保存溶液を加える。 緩衝液Ｅ−Ｈ2Ｏ2：１本のバイアルＥ−基質の内容物を溶解／５０ｍＬの水。２
５μＬの３０％Ｈ2Ｏ2溶液を加える（新たに調製）。表１０ カフェイン、１，７−ＤＭＸおよび１，７−ＤＭＵの標準溶液（緩衝液
Ｂで希釈）
【００９１】
【表１０】
【００９２】 ＥＬＩＳＡの条件 最後の列から出発して、カフェイン−ＨＲＰ（１，７−ＤＭＸ−ＨＲＰまたは
１，７−ＤＭＵ−ＨＲＰ）抱合体溶液の５０μＬをウェルに加える。ウェル＃９
６から出発して（表１１参照）、５０μＬの希釈尿試料（二重に）、標品、ブラ
ンクをマイクロピペット（０−２００μＬ）でウェルに加える。プレートを覆い
、数秒かき混ぜることにより穏やかに混合する。プレートを室温に３時間放置す
る。マイクロタイタープレート洗浄機を使用して１００μＬ／ウェルの緩衝液Ｃ
で３回洗浄する。１００μＬ／ウェルの０．０５％トウィーンTM２０で３回洗浄
する。１５０μＬ／ウェルの緩衝液Ｅ−Ｈ2Ｏ2（マイクロタイタープレートウェ
ルへピペッティングする直前に調製する）を加える。軌道を描く振盪機を使用し
て、室温にて２０−３０分間振盪する。２．５Ｎ ＨＣｌ溶液をウェル当たり５
０μＬ加える。軌道を描く振盪機を使用して、室温にて３分間振盪する。マイク
ロプレートリーダーを使用して４９０ｎｍでウェルの吸光度を読みとる。データ
シートを印刷し、適切に貼る。
１，７−ＤＭＵ−ＨＲＰ）抱合体溶液の５０μＬをウェルに加える。ウェル＃９
６から出発して（表１１参照）、５０μＬの希釈尿試料（二重に）、標品、ブラ
ンクをマイクロピペット（０−２００μＬ）でウェルに加える。プレートを覆い
、数秒かき混ぜることにより穏やかに混合する。プレートを室温に３時間放置す
る。マイクロタイタープレート洗浄機を使用して１００μＬ／ウェルの緩衝液Ｃ
で３回洗浄する。１００μＬ／ウェルの０．０５％トウィーンTM２０で３回洗浄
する。１５０μＬ／ウェルの緩衝液Ｅ−Ｈ2Ｏ2（マイクロタイタープレートウェ
ルへピペッティングする直前に調製する）を加える。軌道を描く振盪機を使用し
て、室温にて２０−３０分間振盪する。２．５Ｎ ＨＣｌ溶液をウェル当たり５
０μＬ加える。軌道を描く振盪機を使用して、室温にて３分間振盪する。マイク
ロプレートリーダーを使用して４９０ｎｍでウェルの吸光度を読みとる。データ
シートを印刷し、適切に貼る。
【００９３】 データからの尿試料中の［カフェイン］、［１，７−ＤＭＸ］および［１，７−
ＤＭＵ］の計算 コンピューターで表１１を描く。マイクロプレートリーダーのデータシートを
使用し、表１１にブランク、対照（遊離ハプテンは存在しない）、標品および試
料の平均吸光度を書き入れる。シグマ−プロット（または他のソフトウェアー）
を使用して、片対数プロットで検量線を描く。検量線から未知試料のマイクロタ
イターウェル中の［ＡＡＭＵ］（または［１Ｘ］）を見いだし、表１２にデータ
を記入する。希釈比を未知試料の［カフェイン］（［１，７−ＤＭＸ］または［
１，７−ＤＭＵ］）掛け、結果を表１２の対応するセルに記入する。表１１ マイクロタイタープレート中の試料の平均吸光度値
ＤＭＵ］の計算 コンピューターで表１１を描く。マイクロプレートリーダーのデータシートを
使用し、表１１にブランク、対照（遊離ハプテンは存在しない）、標品および試
料の平均吸光度を書き入れる。シグマ−プロット（または他のソフトウェアー）
を使用して、片対数プロットで検量線を描く。検量線から未知試料のマイクロタ
イターウェル中の［ＡＡＭＵ］（または［１Ｘ］）を見いだし、表１２にデータ
を記入する。希釈比を未知試料の［カフェイン］（［１，７−ＤＭＸ］または［
１，７−ＤＭＵ］）掛け、結果を表１２の対応するセルに記入する。表１１ マイクロタイタープレート中の試料の平均吸光度値
【００９４】
【表１１】
【００９５】表１２ 尿試料中のカフェイン、１，７−ＤＭＸおよび１，７−ＤＭＵ濃度
【００９６】
【表１２】
【００９７】表１３ 異なった緩衝液の組成
【００９８】
【表１３】
【００９９】 本発明をその特定の態様に関連して説明してきたが、さらなる変更が可能なこ
とおよび本出願は一般に本発明の原理に従った任意の本発明の変形、使用または
適用を包含することを意図していること、およびそのような本開示からの新展開
は、本発明が関与する技術の既知のまたは慣例による実施内にあるものとして、
および前に示した本質的特色を応用したものとして、および付随する特許請求の
範囲に従うものとして含まれることが理解されるであろう。
とおよび本出願は一般に本発明の原理に従った任意の本発明の変形、使用または
適用を包含することを意図していること、およびそのような本開示からの新展開
は、本発明が関与する技術の既知のまたは慣例による実施内にあるものとして、
および前に示した本質的特色を応用したものとして、および付随する特許請求の
範囲に従うものとして含まれることが理解されるであろう。
【図１】 図１はＥＬＩＳＡによるＮＡＴ１表現型分類のためのｐ−アミノサ
リチル酸誘導体を示している。
リチル酸誘導体を示している。
【図２】 図２はＥＬＩＳＡによるＣＹＰ１Ａ２表現型分類のためのカフェイ
ン誘導体を示している。
ン誘導体を示している。
【図３】 図３はＥＬＩＳＡによるＣＹＰ１Ａ２表現型分類のための１，７−
ジメチルキサンチン誘導体を示している。
ジメチルキサンチン誘導体を示している。
【図４】 図４はＥＬＩＳＡによるＣＹＰ１Ａ２表現型分類のための１，７−
ジメチル尿酸誘導体を示している。
ジメチル尿酸誘導体を示している。
【図５】 図５はＥＬＩＳＡによるＣＹＰ２Ｄ６表現型分類のためのデキスト
ロメトルファン誘導体を示している。
ロメトルファン誘導体を示している。
【図６】 図６はＥＬＩＳＡによるＣＹＰ２Ｅ１表現型分類のためのクロルゾ
キサゾン誘導体を示している。
キサゾン誘導体を示している。
【図７】 図７はＥＬＩＳＡによるＣＹＰ３Ａ４表現型分類のためのデキスト
ロメトルファン誘導体を示している。
ロメトルファン誘導体を示している。
【図８】 図８は本発明の一つの態様に従ったＣＹＰ１Ａ２表現型分類のため
のカフェインおよび１，７−ジメチルキサンチン誘導体生成のための合成経路を
示している。
のカフェインおよび１，７−ジメチルキサンチン誘導体生成のための合成経路を
示している。
【図９】 図９は本発明の一つの態様に従ったＣＹＰ１Ａ２表現型分類のため
のカフェインおよび１，７−ジメチル尿酸誘導体生成のための合成経路を示して
いる。
のカフェインおよび１，７−ジメチル尿酸誘導体生成のための合成経路を示して
いる。
【図１０】 図１０はＦａｌｃｏｎ９６−ウェルマイクロテスト組織培養プレ
ートにピペッティングされるべき試料のパターンを示している。
ートにピペッティングされるべき試料のパターンを示している。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年４月９日（２００１．４．９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ウォン，ピエール カナダ国ケベック アーシュ２イックス・ ２ベー４，モンレアル，エイルメ 3415， アパートメント ４
Claims (80)
- 【請求項１】 個体のＣＹＰ１Ａ２表現型を決定する方法であって、各々カ
フェインまたは異なったカフェイン代謝産物に特異的な少なくとも三つの抗体で
、カフェイン溶液を飲んだ後に該個体の生物学的試料中のカフェインおよびカフ
ェインの第一および第二の異なった代謝産物のモル比を測定することから成り、
ここで４のモル比は遅い中間体の指標であり、１２は速いＣＹＰ１Ａ２代謝体の
指標であり、および該モル比は該個体のＣＹＰ１Ａ２表現型の指標である、方法
。 - 【請求項２】 該第一のカフェイン代謝産物が１，７−ジメチルキサンチン
（１，７−ＤＭＸ）および図３に例示されたものから成る群より選択される；該
第二のカフェイン代謝産物が１，７−ジメチル尿酸（１，７−ＤＭＵ）および図
４に例示されたものから成る群より選択される；および該第三の代謝産物が１，
３，７−トリメチルキサンチン（カフェイン）および図２に例示されたものから
成る群より選択される請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 該生物学的試料が尿試料である請求項２に記載の方法。
- 【請求項４】 該個体の該決定されたＣＹＰ１Ａ２表現型が医者に発癌物質
誘導疾患への感受性を予測するおよび／または薬剤処置を個別化するのを可能に
する請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 ＣＹＰ１Ａ２表現型を決定するための競合的酵素結合免疫吸
着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法であって、カフェイン溶液を飲んだ後に個体の生物
学的試料中のカフェインまたは異なったカフェイン代謝産物のモル比を測定する
ために、各々それらに特異的な少なくとも三つの抗体を使用することから成り、
ここで４のモル比は遅い中間体の指標であり、１２は速いＣＹＰ１Ａ２代謝体の
指標であり、および該モル比は該個体のＣＹＰ１Ａ２表現型の指標である、ＥＬ
ＩＳＡ法。 - 【請求項６】 該第一のカフェイン代謝産物が１，７−ジメチルキサンチン
（１，７−ＤＭＸ）および図３に例示されたものから成る群より選択される；該
第二のカフェイン代謝産物が１，７−ジメチル尿酸（１，７−ＤＭＵ）および図
４に例示されたものから成る群より選択される；および該第三の代謝産物が１，
３，７−トリメチルキサンチン（カフェイン）および図２に例示されたものから
成る群より選択される、請求項５に記載のＥＬＩＳＡ法。 - 【請求項７】 該生物学的試料が尿試料である請求項６に記載のＥＬＩＳＡ
法。 - 【請求項８】 該個体の該決定されたＣＹＰ１Ａ２表現型が医者に発癌物質
誘導疾患への感受性を予測するおよび／または薬剤処置を個別化するのを可能に
する請求項７に記載のＥＬＩＳＡ法。 - 【請求項９】 ＣＹＰ１Ａ２表現型を決定するための競合的酵素結合免疫吸
着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットであって、カフェイン溶液を飲んだ後に個体の
生物学的試料中のそれらのモル比を測定するために、各々それらに特異的な少な
くとも三つの抗体を含み、ここで４のモル比は遅い中間体の指標であり、１２は
速いＣＹＰ１Ａ２代謝体の指標であり、および該モル比は該個体のＣＹＰ１Ａ２
表現型の指標である、キット。 - 【請求項１０】 さらに ａ）カフェインに特異的な第一の抗体で被覆されたプレート； ｂ）カフェインの第一の代謝産物に特異的な第二の抗体； ｃ）カフェインの第二の代謝産物に特異的な第三の抗体； ｄ）標準検量線が得られる既知量のカフェイン−西洋ワサビペルオキシダーゼ抱
合体； ｅ）標準検量線が得られる既知量の１，７−ジメチルキサンチン−西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ抱合体；および ｆ）標準検量線が得られる既知量の１，７−ジメチル尿酸−西洋ワサビペルオキ
シダーゼ抱合体を含む請求項９に記載の競合的ＥＬＩＳＡキット。 - 【請求項１１】 該特異的抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体
である請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】 該特異的抗体がポリクローナル抗体である請求項１に記載
の方法。 - 【請求項１３】 該特異的抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体
である請求項５に記載の競合的抗原酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。 - 【請求項１４】 該特異的抗体がポリクローナル抗体である請求項５に記載
の競合的抗原酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。 - 【請求項１５】 該特異的抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体
である請求項１０に記載の競合的ＥＬＩＳＡキット。 - 【請求項１６】 該特異的抗体がポリクローナル抗体である請求項１０に記
載の競合的ＥＬＩＳＡキット。 - 【請求項１７】 個体のＮＡＴ１表現型を決定する方法であって、各々ｐ−
アミノサリチル酸または異なったｐ−アミノサリチル酸代謝産物に特異的な少な
くとも２つの抗体で、ｐ−アミノサリチル酸を消費した後に個体の生物学的試料
中のｐ−アミノサリチル酸のモル比を測定することから成り、および該モル比は
該個体のＮＡＴ１表現型の指標である、方法。 - 【請求項１８】 第一のｐ−アミノサリチル酸代謝産物が４−オキソメチル
−アミノサリチル酸および図１に例示したものから成る群より選択され、ここで
ｐ−アミノサリチル酸が選択され図１に例示されている、請求項１７に記載の方
法。 - 【請求項１９】 該生物学的試料が尿試料である請求項１８に記載の方法。
- 【請求項２０】 該個体の該決定されたＮＡＴ１表現型が医者に発癌物質誘
導疾患への感受性を予測するおよび／または薬剤処置を個別化するのを可能にす
る請求項１９に記載の方法。 - 【請求項２１】 ＮＡＴ１表現型を決定するための競合的酵素結合免疫吸着
アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法であって、ｐ−アミノサリチル酸を消費した後に個体
の生物学的試料中のｐ−アミノサリチル酸またはｐ−アミノサリチル酸代謝産物
のモル比を測定するために、各々それらに特異的な少なくとも２つの抗体を使用
することから成り、および該モル比は該個体のＮＡＴ１表現型の指標である、Ｅ
ＬＩＳＡ法。 - 【請求項２２】 第一のｐ−アミノサリチル酸代謝産物が４−オキソメチル
−アミノサリチル酸および図１に例示したものから成る群より選択され、ここで
ｐ−アミノサリチル酸が選択され図１に例示されている、請求項２１に記載のＥ
ＬＩＳＡ法。 - 【請求項２３】 該生物学的試料が尿試料である請求項２２に記載のＥＬＩ
ＳＡ法。 - 【請求項２４】 該個体の該決定されたＮＡＴ１表現型が医者に発癌物質誘
導疾患への感受性を予測するおよび／または薬剤処置を個別化するのを可能にす
る請求項２３に記載のＥＬＩＳＡ法。 - 【請求項２５】 ＮＡＴ１表現型を決定するための競合的酵素結合免疫吸着
アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットであって、ｐ−アミノサリチル酸を消費した後に
個体の生物学的試料中のｐ−アミノサリチル酸またはｐ−アミノサリチル酸代謝
産物のモル比を測定するために、各々それらに特異的な少なくとも２つの抗体を
含み、および該モル比は該個体のＮＡＴ１表現型の指標である、キット。 - 【請求項２６】 さらに ａ）ｐ−アミノサリチル酸に特異的な第一の抗体で被覆されたプレート； ｂ）ｐ−アミノサリチル酸の第一の代謝産物に特異的な第二の抗体； ｃ）標準検量線が得られる既知量のｐ−アミノサリチル酸−西洋ワサビペルオキ
シダーゼ抱合体； ｄ）標準検量線が得られる既知量のｐ−アミノサリチル酸代謝産物−西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ抱合体を含む請求項２５に記載の競合的ＥＬＩＳＡキット。 - 【請求項２７】 該特異的抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体
である請求項１７に記載の方法。 - 【請求項２８】 該特異的抗体がポリクローナル抗体である請求項１７に記
載の方法。 - 【請求項２９】 該特異的抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体
である請求項２１に記載の競合的抗原酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
。 - 【請求項３０】 該特異的抗体がポリクローナル抗体である請求項２１に記
載の競合的抗原酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。 - 【請求項３１】 該特異的抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体
である請求項２６に記載の競合的ＥＬＩＳＡキット。 - 【請求項３２】 該特異的抗体がポリクローナル抗体である請求項２６に記
載の競合的ＥＬＩＳＡキット。 - 【請求項３３】 個体のＣＹＰ２Ｄ６表現型を決定する方法であって、各々
デキストロメトルファンまたは代謝産物に特異的な少なくとも２つの抗体で、デ
キストロメトルファンを消費した後に該個体の生物学的試料中の第一および第二
のデキストロメトルファンの異なった代謝産物のモル比を測定することから成り
、モル比＞１は遅い中間体の指標でありおよびモル比＜１は速いＣＹＰ２Ｄ６代
謝体の指標であり、および該モル比は該個体のＣＹＰ２Ｄ６表現型の指標である
、方法。 - 【請求項３４】 第一のデキストロメトルファン代謝産物が３−ヒドロキシ
−１７−メチルモルフィナンおよび図５に例示されたものから成る群より選択さ
れ、およびデキストロメトルファンが選択され、図５に例示されている、請求項
３３に記載の方法。 - 【請求項３５】 該生物学的試料が尿試料である請求項３４に記載の方法。
- 【請求項３６】 該個体の該決定されたＣＹＰ２Ｄ６表現型が医者に発癌物
質誘導疾患への感受性を予測するおよび／または薬剤処置を個別化するのを可能
にする請求項３５に記載の方法。 - 【請求項３７】 ＣＹＰ２Ｄ６表現型を決定するための競合的酵素結合免疫
吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法であって、デキストロメトルファンを消費した後
に個体の生物学的試料中のデキストロメトルファンまたはデキストロメトルファ
ン代謝産物のモル比を測定するために、各々それらに特異的な少なくとも２つの
抗体を使用することから成り、ここでモル比＞１は遅い指標でありおよびモル比
＜１は速いＣＹＰ２Ｄ６代謝体の指標であり、および該モル比は該個体のＣＹＰ
２Ｄ６表現型の指標である、ＥＬＩＳＡ法。 - 【請求項３８】 ３−ヒドロキシ−１７−メチルモルフィナンおよび図５に
例示されたものから成る群より選択され、デキストロメトルファンが選択され、
図５に例示されている、請求項３７に記載のＥＬＩＳＡ方法。 - 【請求項３９】 該生物学的試料が尿試料である請求項３８に記載のＥＬＩ
ＳＡ法。 - 【請求項４０】 該個体の該決定されたＣＹＰ２Ｄ６表現型が医者に発癌物
質誘導疾患への感受性を予測するおよび／または薬剤処置を個別化するのを可能
にする請求項３８に記載のＥＬＩＳＡ法。 - 【請求項４１】 ＣＹＰ２Ｄ６表現型を決定するための競合的酵素結合免疫
吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットであって、デキストロメトルファンを消費し
た後に個体の生物学的試料中のデキストロメトルファンの異なった代謝産物のモ
ル比を測定するために、各々それらに特異的な少なくとも２つの抗体を含み、こ
こでモル比＞１は遅い指標でありおよびモル比＜１は速いＣＹＰ２Ｄ６代謝体の
指標であり、および該モル比は該個体のＣＹＰ２Ｄ６表現型の指標である、キッ
ト。 - 【請求項４２】 さらに ａ）デキストロメトルファンに特異的な第一の抗体で被覆されたプレート； ｂ）デキストロメトルファンの第一の代謝産物に特異的な第二の抗体； ｃ）標準検量線が得られる既知量のデキストロメトルファン−西洋ワサビペルオ
キシダーゼ抱合体； ｄ）標準検量線が得られる既知量のデキストロメトルファン代謝産物−西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ抱合体を含む請求項４１に記載の競合的ＥＬＩＳＡキット。 - 【請求項４３】 該特異的抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体
である請求項３３に記載の方法。 - 【請求項４４】 該特異的抗体がポリクローナル抗体である請求項３３に記
載の方法。 - 【請求項４５】 該特異的抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体
である請求項３７に記載の競合的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。 - 【請求項４６】 該特異的抗体がポリクローナル抗体である請求項３７に記
載の競合的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。 - 【請求項４７】 該特異的抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体
である請求項４２に記載の競合的ＥＬＩＳＡキット。 - 【請求項４８】 該特異的抗体がポリクローナル抗体である請求項４２に記
載の競合的ＥＬＩＳＡキット。 - 【請求項４９】 個体のＣＹＰ２Ｅ１表現型を決定する方法であって、各々
クロルゾキサゾンの異なった代謝産物に特異的な少なくとも２つの抗体で、クロ
ルゾキサゾンを消費した後に該個体の生物学的試料中の第一および第二のクロル
ゾキサゾンの異なった代謝産物のモル比を測定することから成り、モル比は該個
体のＣＹＰ２Ｅ１表現型の指標である、方法。 - 【請求項５０】 第一のクロルゾキサゾン代謝産物が５−クロロ−６−ヒド
ロキシ−ベンゾオキサゾールおよび図６に例示されたものから成る群より選択さ
れ、ここでクロルゾキサゾンが選択され図６に例示されている、請求項４９に記
載の方法。 - 【請求項５１】 該生物学的試料が尿試料である請求項５０に記載の方法。
- 【請求項５２】 該個体の該決定されたＣＹＰ２Ｅ１表現型が医者に発癌物
質誘導疾患への感受性を予測するおよび／または薬剤処置を個別化するのを可能
にする請求項５１に記載の方法。 - 【請求項５３】 ＣＹＰ２Ｅ１表現型を決定するための競合的酵素結合免疫
吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットであって、クロルゾキサゾンを消費した後に
個体の生物学的試料中のクロルゾキサゾンの異なった代謝産物のモル比を測定す
るために、各々それらに特異的な少なくとも２つの抗体を含み、該モル比は該個
体のＣＹＰ２Ｅ１表現型の指標である、キット。 - 【請求項５４】 第一のクロルゾキサゾン代謝産物が５−クロロ−６−ヒド
ロキシ−ベンゾオキサゾールおよび図６に例示されたものから成る群より選択さ
れ、およびクロルゾキサゾンが選択され図６に例示されている、請求項５３に記
載のＥＬＩＳＡ法。 - 【請求項５５】 該生物学的試料が尿試料である請求項５３に記載のＥＬＩ
ＳＡ法。 - 【請求項５６】 該個体の該決定されたＣＹＰ２Ｅ１表現型が医者に発癌物
質誘導疾患への感受性を予測するおよび／または薬剤処置を個別化するのを可能
にする請求項５３に記載のＥＬＩＳＡ法。 - 【請求項５７】 ＣＹＰ２Ｅ１表現型を決定するための競合的酵素結合免疫
吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットであって、クロルゾキサゾンを消費した後に
個体の生物学的試料中のクロルゾキサゾンの異なった代謝産物のモル比を測定す
るために、各々それらに特異的な少なくとも２つの抗体を含み、該モル比は該個
体のＣＹＰ２Ｅ１表現型の指標である、キット。 - 【請求項５８】 さらに ａ）クロルゾキサゾンに特異的な第一の抗体で被覆されたプレート； ｂ）クロルゾキサゾンの第一の代謝産物に特異的な第二の抗体； ｃ）標準検量線が得られる既知量のクロルゾキサゾン−西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ抱合体； ｄ）標準検量線が得られる既知量のクロルゾキサゾン代謝産物−西洋ワサビペル
オキシダーゼ抱合体を含む請求項５７に記載の競合的ＥＬＩＳＡキット。 - 【請求項５９】 該特異的抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体
である請求項４９に記載の方法。 - 【請求項６０】 該特異的抗体がポリクローナル抗体である請求項４９に記
載の方法。 - 【請求項６１】 該特異的抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体
である請求項５３に記載の競合的抗原酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
。 - 【請求項６２】 該特異的抗体がポリクローナル抗体である請求項５３に記
載の競合的抗原酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。 - 【請求項６３】 該特異的抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体
である請求項５８に記載の競合的ＥＬＩＳＡキット。 - 【請求項６４】 該特異的抗体がポリクローナル抗体である請求項５８に記
載の競合的ＥＬＩＳＡキット。 - 【請求項６５】 個体のＣＹＰ３Ａ４表現型を決定する方法であって、各々
デキストロメトルファンまたはデキストロメトルファンの代謝産物に特異的な少
なくとも２つの抗体で、デキストロメトルファンを消費した後に該個体の生物学
的試料中のデキストロメトルファンの第一および第二の異なった代謝産物のモル
比を測定することから成り、該モル比は該個体のＣＹＰ３Ａ４表現型の指標であ
る、方法。 - 【請求項６６】 第一のデキストロメトルファン代謝産物が３−メトキシ−
モルフィナンおよび図７に例示されたものから成る群より選択され、およびデキ
ストロメトルファンが選択され図７に例示されている、請求項６５に記載の方法
。 - 【請求項６７】 該生物学的試料が尿試料である請求項６６に記載の方法。
- 【請求項６８】 該個体の該決定されたＣＹＰ３Ａ４表現型が医者に発癌物
質誘導疾患への感受性を予測するおよび／または薬剤処置を個別化するのを可能
にする請求項６７に記載の方法。 - 【請求項６９】 ＣＹＰ３Ａ４表現型を決定するための競合的酵素結合免疫
吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットであって、デキストロメトルファンを消費し
た後に個体の生物学的試料中のデキストロメトルファンの異なった代謝産物のモ
ル比を測定するために、各々それらに特異的な少なくとも２つの抗体を含み、該
モル比は該個体のＣＹＰ３Ａ４表現型の指標である、キット。 - 【請求項７０】 第一のデキストロメトルファン代謝産物が３−メトキシ−
モルフィナンおよび図７に例示されたものから成る群より選択され、およびデキ
ストロメトルファンが選択され図７に例示されている、請求項６９に記載のＥＬ
ＩＳＡ法。 - 【請求項７１】 該生物学的試料が尿試料である請求項６９に記載のＥＬＩ
ＳＡ法。 - 【請求項７２】 該個体の該決定されたＣＹＰ３Ａ４表現型が医者に発癌物
質誘導疾患への感受性を予測するおよび／または薬剤処置を個別化するのを可能
にする請求項６９に記載のＥＬＩＳＡ法。 - 【請求項７３】 ＣＹＰ３Ａ４表現型を決定するための競合的酵素結合免疫
吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットであって、デキストロメトルファンを消費し
た後に個体の生物学的試料中のデキストロメトルファンの異なった代謝産物のモ
ル比を測定するために、各々それらに特異的な少なくとも２つの抗体を含み、該
モル比は該個体のＣＹＰ３Ａ４表現型の指標である、キット。 - 【請求項７４】 さらに ａ）デキストロメトルファンに特異的な第一の抗体で被覆されたプレート； ｂ）デキストロメトルファンの第一の代謝産物に特異的な第二の抗体； ｃ）標準検量線が得られる既知量のデキストロメトルファン−西洋ワサビペルオ
キシダーゼ抱合体； ｄ）標準検量線が得られる既知量のデキストロメトルファン代謝産物−西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ抱合体を含む請求項７３に記載の競合的ＥＬＩＳＡキット。 - 【請求項７５】 該特異的抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体
である請求項６５に記載の方法。 - 【請求項７６】 該特異的抗体がポリクローナル抗体である請求項６５に記
載の方法。 - 【請求項７７】 該特異的抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体
である請求項６９に記載の競合的抗原酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
。 - 【請求項７８】 該特異的抗体がポリクローナル抗体である請求項６９に記
載の競合的抗原酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。 - 【請求項７９】 該特異的抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体
である請求項７４に記載の競合的ＥＬＩＳＡキット。 - 【請求項８０】 該特異的抗体がポリクローナル抗体である請求項７４に記
載の競合的ＥＬＩＳＡキット。
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-
2000
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