JP2002537846A - Ｈｅｒｖｌｔｒ配列に基づく、レトロウイルス発現ベクター - Google Patents
Ｈｅｒｖｌｔｒ配列に基づく、レトロウイルス発現ベクターInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、細胞特異的に調節可能なプロモーターを持つ、レトロウイルス発現ベクターに関する。例えば、該ベクターは、遺伝子治療の背景において、療法的価値がある遺伝子の細胞特異的発現に有用である可能性がある。本発明は、機能的なアセンブリで、少なくとも以下の要素：ａ）ベクターＲＮＡのパッケージングのためおよび異種ＤＮＡヌクレオチド配列にコードされるタンパク質またはペプチドの細胞特異的発現のためのＤＮＡ配列；ｂ）タンパク質またはペプチドをコードする、１つまたはそれ以上のＤＮＡヌクレオチド配列、ここで、細胞特異的発現のための前記ＤＮＡ配列は、ヒト内因性レトロウイルスＤＮＡヌクレオチド配列（ＨＥＲＶ）由来の細胞特異的調節可能プロモーター領域を含む、を含む、レトロウイルス発現ベクターを記載する。
Description
【０００１】 本発明は、細胞特異的に調節することが可能であるプロモーターを持つ、レト
ロウイルス発現ベクターに関する。該ベクターは、例えば、遺伝子治療に関連し
て、療法的価値がある遺伝子の細胞特異的発現に有用である。
ロウイルス発現ベクターに関する。該ベクターは、例えば、遺伝子治療に関連し
て、療法的価値がある遺伝子の細胞特異的発現に有用である。
【０００２】 レトロウイルスはＲＮＡウイルスであり、該ウイルス遺伝子は、一本鎖ＲＮＡ
分子にコードされる。細胞へのウイルスの進入後、ウイルスＲＮＡは、逆転写に
より、二本鎖ＤＮＡ分子に変換される。該ＤＮＡは核に進入し、そして細胞染色
体に組み込まれる。ウイルスＤＮＡの組込み型、いわゆるプロウイルスは、ウイ
ルス遺伝子発現のテンプレートに相当する。
分子にコードされる。細胞へのウイルスの進入後、ウイルスＲＮＡは、逆転写に
より、二本鎖ＤＮＡ分子に変換される。該ＤＮＡは核に進入し、そして細胞染色
体に組み込まれる。ウイルスＤＮＡの組込み型、いわゆるプロウイルスは、ウイ
ルス遺伝子発現のテンプレートに相当する。
【０００３】 細胞染色体へのウイルスゲノムの組込みは、ウイルス複製の必須の段階であり
、そしてウイルスにコードされる酵素に仲介される。ほとんど例外なく、感染細
胞の生存度は、細胞におけるレトロウイルスゲノムの存在、その遺伝子の発現お
よびウイルス粒子の形成にまったく、またはほとんど影響を受けないようである
。
、そしてウイルスにコードされる酵素に仲介される。ほとんど例外なく、感染細
胞の生存度は、細胞におけるレトロウイルスゲノムの存在、その遺伝子の発現お
よびウイルス粒子の形成にまったく、またはほとんど影響を受けないようである
。
【０００４】 レトロウイルス遺伝子導入は、機能する遺伝子、特に療法的に価値がある遺伝
子を、宿主細胞が増殖する能力に影響を与えることなく、細胞に導入するのに用
いられる。その複製様式のため、レトロウイルスは、こうした遺伝子導入に適し
ている。最も単純な態様において、ウイルス遺伝子の少なくとも部分を、目的の
遺伝子により置き換え、そして効率的なウイルス感染法を用いることにより、こ
の目的の遺伝子を標的細胞に導入する。
子を、宿主細胞が増殖する能力に影響を与えることなく、細胞に導入するのに用
いられる。その複製様式のため、レトロウイルスは、こうした遺伝子導入に適し
ている。最も単純な態様において、ウイルス遺伝子の少なくとも部分を、目的の
遺伝子により置き換え、そして効率的なウイルス感染法を用いることにより、こ
の目的の遺伝子を標的細胞に導入する。
【０００５】 レトロウイルスの感染は、高い効率で起こり、そしてレトロウイルスベクター
を修飾し、異種ＤＮＡを取り込むことが可能であり、そして宿主細胞ゲノムに安
定して組み込ませることが可能であるため、レトロウイルスベクターは遺伝子治
療に適している。近年、複数のレトロウイルスベクターが開発されてきており、
そして例として、Ｇｕｎｚｂｕｒｇら（１９９６）およびＲｏｂｂｉｎｓら（１
９９８）による概説を参照されたい。
を修飾し、異種ＤＮＡを取り込むことが可能であり、そして宿主細胞ゲノムに安
定して組み込ませることが可能であるため、レトロウイルスベクターは遺伝子治
療に適している。近年、複数のレトロウイルスベクターが開発されてきており、
そして例として、Ｇｕｎｚｂｕｒｇら（１９９６）およびＲｏｂｂｉｎｓら（１
９９８）による概説を参照されたい。
【０００６】 レトロウイルスベクターに関する可能な好ましい態様は、いわゆるＰｒｏＣｏ
ｎベクターであり、これは、ＷＯ ９６／０７７４８に最初に記載された。開示
のため、本文献を完全に参照されたい。
ｎベクターであり、これは、ＷＯ ９６／０７７４８に最初に記載された。開示
のため、本文献を完全に参照されたい。
【０００７】 ＰｒｏＣｏｎベクターは、異種プロモーター要素および所望による他の制御要
素をその３’ＬＴＲ中に有し、これは感染後、複製され、そして標的細胞におい
て５’ＬＴＲに転座し、そしてこれはマーカー遺伝子または療法遺伝子の発現を
調節することが可能である。これらの異種遺伝子は、プロモーターに直接連結し
ていないが、ベクター内部に挿入されている。
素をその３’ＬＴＲ中に有し、これは感染後、複製され、そして標的細胞におい
て５’ＬＴＲに転座し、そしてこれはマーカー遺伝子または療法遺伝子の発現を
調節することが可能である。これらの異種遺伝子は、プロモーターに直接連結し
ていないが、ベクター内部に挿入されている。
【０００８】 ＰｒｏＣｏｎベクターは、構造Ｕ３、Ｒ、Ｕ５を有する５’ＬＴＲ部分、およ
び少なくとも１つのコードおよび／または非コード配列、並びに、完全にまたは
部分的に欠失したＵ３部分を含んでおり、当該欠失Ｕ３部分はポリリンカー配列
に置き換えられており、Ｒ−Ｕ５部分が続く、３’ＬＴＲ領域を含む。
び少なくとも１つのコードおよび／または非コード配列、並びに、完全にまたは
部分的に欠失したＵ３部分を含んでおり、当該欠失Ｕ３部分はポリリンカー配列
に置き換えられており、Ｒ−Ｕ５部分が続く、３’ＬＴＲ領域を含む。
【０００９】 これらのベクターの増殖は、もはや発現ベクター自体からは合成されないウイ
ルスタンパク質を多量に産生するヘルパー細胞株により、行われる。しかし、ヘ
ルパー細胞株は、もはや複製適格ウイルスを産生することが不可能である。本細
胞株はまた、パッケージング細胞株とも称され、そして修飾レトロウイルスベク
ターをパッケージングすることが可能な遺伝子を持つ、少なくとも第二のプラス
ミドでトランスフェクションされた細胞株を含む。これに関し、本明細書に完全
に援用される、ＷＯ ９２／１０５６４を参照されたい。
ルスタンパク質を多量に産生するヘルパー細胞株により、行われる。しかし、ヘ
ルパー細胞株は、もはや複製適格ウイルスを産生することが不可能である。本細
胞株はまた、パッケージング細胞株とも称され、そして修飾レトロウイルスベク
ターをパッケージングすることが可能な遺伝子を持つ、少なくとも第二のプラス
ミドでトランスフェクションされた細胞株を含む。これに関し、本明細書に完全
に援用される、ＷＯ ９２／１０５６４を参照されたい。
【００１０】 修飾レトロウイルスをコードするＤＮＡ（発現ベクター）をパッケージング細
胞株にトランスフェクションする。これらの条件下で、挿入療法遺伝子またはマ
ーカー遺伝子を含む、修飾レトロウイルスゲノムは、それぞれ、転写され、そし
てレトロウイルス粒子（組換えウイルス粒子）にパッケージングされる。その後
、本組換えウイルスを標的細胞の感染に用いる；修飾レトロウイルスのゲノム、
すなわち発現ベクターは、標的細胞ゲノムに組み込まれ、本組込みは、それぞれ
マーカー遺伝子または療法遺伝子と共に起こる。本方式で生成される組換えウイ
ルス粒子に感染した細胞は、これらの細胞に他のウイルスタンパク質がまったく
存在しないため、新たなベクターウイルスを産生することが不可能である。宿主
細胞に組み込まれた、それぞれ、療法的価値がある遺伝子またはマーカー遺伝子
を含む発現ベクターのＤＮＡは、組込み型で細胞ＤＮＡに存在し、そして続いて
、細胞内で発現されることが可能である。
胞株にトランスフェクションする。これらの条件下で、挿入療法遺伝子またはマ
ーカー遺伝子を含む、修飾レトロウイルスゲノムは、それぞれ、転写され、そし
てレトロウイルス粒子（組換えウイルス粒子）にパッケージングされる。その後
、本組換えウイルスを標的細胞の感染に用いる；修飾レトロウイルスのゲノム、
すなわち発現ベクターは、標的細胞ゲノムに組み込まれ、本組込みは、それぞれ
マーカー遺伝子または療法遺伝子と共に起こる。本方式で生成される組換えウイ
ルス粒子に感染した細胞は、これらの細胞に他のウイルスタンパク質がまったく
存在しないため、新たなベクターウイルスを産生することが不可能である。宿主
細胞に組み込まれた、それぞれ、療法的価値がある遺伝子またはマーカー遺伝子
を含む発現ベクターのＤＮＡは、組込み型で細胞ＤＮＡに存在し、そして続いて
、細胞内で発現されることが可能である。
【００１１】 好ましくは、こうしたレトロウイルス発現ベクターにより発現が達成される療
法的価値がある遺伝子は、細胞および組織特異的方式で発現される。本目的のた
め、細胞特異的制御配列を、発現ベクターのＬＴＲ配列に導入する。例えば、こ
れらの細胞特異的制御配列は、細胞特異的調節可能プロモーター領域、細胞特異
的エンハンサー配列と共に、転写因子の結合部位を含む。プロモーターは、ＬＴ
ＲのＵ３部位に位置する。
法的価値がある遺伝子は、細胞および組織特異的方式で発現される。本目的のた
め、細胞特異的制御配列を、発現ベクターのＬＴＲ配列に導入する。例えば、こ
れらの細胞特異的制御配列は、細胞特異的調節可能プロモーター領域、細胞特異
的エンハンサー配列と共に、転写因子の結合部位を含む。プロモーターは、ＬＴ
ＲのＵ３部位に位置する。
【００１２】 ここでは、細胞性プロモーター配列または外因性レトロウイルスのプロモータ
ー配列を、レトロウイルスベクターに挿入する。 細胞性プロモーターは、しばしば、さらなるシグナル構造を必要とし、これは
、プロモーターから遠く離れて上流または下流に存在する可能性がある。したが
って、強い、組織特異的な細胞性プロモーター配列を単離し、そしてこれらをレ
トロウイルスベクターにクローニングするのは困難であることが常に見出されて
きている。外因性レトロウイルスのプロモーターは、レトロウイルスＬＴＲ内の
限られた領域に、すべての必要な制御領域を含み、そしてしたがって、組込み部
位の隣接するＤＮＡ配列とは本質的に独立に転写されることが可能であるという
利点を持つ。しかし、ひどく不利な点は、これらは強いが、組織特異的ではなく
、そして一般的にすべての細胞種で同等の強さで発現されることである。
ー配列を、レトロウイルスベクターに挿入する。 細胞性プロモーターは、しばしば、さらなるシグナル構造を必要とし、これは
、プロモーターから遠く離れて上流または下流に存在する可能性がある。したが
って、強い、組織特異的な細胞性プロモーター配列を単離し、そしてこれらをレ
トロウイルスベクターにクローニングするのは困難であることが常に見出されて
きている。外因性レトロウイルスのプロモーターは、レトロウイルスＬＴＲ内の
限られた領域に、すべての必要な制御領域を含み、そしてしたがって、組込み部
位の隣接するＤＮＡ配列とは本質的に独立に転写されることが可能であるという
利点を持つ。しかし、ひどく不利な点は、これらは強いが、組織特異的ではなく
、そして一般的にすべての細胞種で同等の強さで発現されることである。
【００１３】 したがって、本発明の目的は、転写に必要なすべてのシグナル構造を、Ｕ３お
よびＲ領域内の限られた領域に集中させる、レトロウイルスプロモーターの利点
を利用するが、同時に、それに関連する不利な点を避ける、新規レトロウイルス
発現ベクターを提供することである。
よびＲ領域内の限られた領域に集中させる、レトロウイルスプロモーターの利点
を利用するが、同時に、それに関連する不利な点を避ける、新規レトロウイルス
発現ベクターを提供することである。
【００１４】 本発明にしたがい、レトロウイルス発現ベクターに、ヒト内因性レトロウイル
スＤＮＡヌクレオチド配列（ＨＥＲＶ）由来の細胞特異的調節可能プロモーター
部分を挿入することにより、本目的を達成した。ヒト内因性レトロウイルスのこ
れらのプロモーター配列は、宿主細胞にすでに存在し、そして本発明にしたがい
、これらはマーカー遺伝子および療法的価値がある遺伝子の細胞特異的発現制御
に非常に適していることが見出されてきている。
スＤＮＡヌクレオチド配列（ＨＥＲＶ）由来の細胞特異的調節可能プロモーター
部分を挿入することにより、本目的を達成した。ヒト内因性レトロウイルスのこ
れらのプロモーター配列は、宿主細胞にすでに存在し、そして本発明にしたがい
、これらはマーカー遺伝子および療法的価値がある遺伝子の細胞特異的発現制御
に非常に適していることが見出されてきている。
【００１５】 内因性レトロウイルス（ＥＲＶ）は、生物のすべての細胞のゲノムに見出すこ
とが可能である。これらは、生殖系列を介し、垂直に移動し、そして環境に引き
起こされる条件により、再活性化することが可能である。ヒトゲノムの約２％は
、内因性レトロウイルスおよびレトロウイルス配列からなり、単独のＨＥＲＶ
ＬＴＲは、ゲノム当たり２０，０００−４０，０００コピーの量で存在する（表
１）（Ｌｅｉｂ−Ｍｏｓｃｈら、１９９３； Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、１９９４
； Ｐａｔｉｅｎｃｅら、１９９７）。
とが可能である。これらは、生殖系列を介し、垂直に移動し、そして環境に引き
起こされる条件により、再活性化することが可能である。ヒトゲノムの約２％は
、内因性レトロウイルスおよびレトロウイルス配列からなり、単独のＨＥＲＶ
ＬＴＲは、ゲノム当たり２０，０００−４０，０００コピーの量で存在する（表
１）（Ｌｅｉｂ−Ｍｏｓｃｈら、１９９３； Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、１９９４
； Ｐａｔｉｅｎｃｅら、１９９７）。
【００１６】
【表１】
【００１７】 ＨＥＲＶ配列は、霊長類ゲノムに、すでに３，０００−４，０００万年前に組
み込まれているため、進化の経過中、病原性配列の大部分は、それぞれ、突然変
異および再編成によりプロウイルスから除去され、または修飾され、もはや該生
物に不利ではなくなったと仮定することが可能である。動物ウイルス由来のベク
ターと比較して、こうした配列から構築したレトロウイルスベクターは、新たな
ウイルス配列をゲノムに導入しなくてよいという利点を有する。さらに、また、
ゲノムにすでに存在するＨＥＲＶ配列との組換えにより、他の種のレトロウイル
スをベクターとして用いた場合にそうである可能性があるように、新規レトロウ
イルスが発生する可能性がない。この理由のため、レトロウイルスベクターの構
築におけるこれらの配列の使用は、安全性リスクを最小限にすることが可能であ
る。さらに、ゲノムに含まれる相同領域は、染色体の特定の部位にレトロウイル
スベクターを組織特異的に組み込むのに利用することが可能である。
み込まれているため、進化の経過中、病原性配列の大部分は、それぞれ、突然変
異および再編成によりプロウイルスから除去され、または修飾され、もはや該生
物に不利ではなくなったと仮定することが可能である。動物ウイルス由来のベク
ターと比較して、こうした配列から構築したレトロウイルスベクターは、新たな
ウイルス配列をゲノムに導入しなくてよいという利点を有する。さらに、また、
ゲノムにすでに存在するＨＥＲＶ配列との組換えにより、他の種のレトロウイル
スをベクターとして用いた場合にそうである可能性があるように、新規レトロウ
イルスが発生する可能性がない。この理由のため、レトロウイルスベクターの構
築におけるこれらの配列の使用は、安全性リスクを最小限にすることが可能であ
る。さらに、ゲノムに含まれる相同領域は、染色体の特定の部位にレトロウイル
スベクターを組織特異的に組み込むのに利用することが可能である。
【００１８】 進化の経過中、ＨＥＲＶ要素は、いくつかの細胞機能を受け入れてきた。例え
ば、ＨＥＲＶ ＬＴＲのプロモーターおよびエンハンサー要素は、細胞性遺伝子
の転写調節に用いられる（Ｋａｔｏら、Ｆｅｕｃｈｔｅｒ−Ｍｕｒｔｈｙら、１
９９３； Ｄｉ Ｃｈｒｉｓｔｏｆａｎｏら、１９９５）。細胞性遺伝子の組織
特異的発現のためのＬＴＲ制御要素の使用の一例は、ヒトアミラーゼ遺伝子であ
る。本遺伝子は、ＨＥＲＶ−Ｅ要素のＬＴＲにより調節され、そしてこの方式で
、唾液腺のみで発現されるよう、特異的に制限されている（Ｔｉｎｇら、１９９
２）。さらに、Ｓｃｈｕｌｔｅおよび共同研究者ら（１９９６）は、プレイオト
ロフィン遺伝子の５’非翻訳領域への内因性レトロウイルスの挿入は、その栄養
膜特異的活性に責任があることを示している（Ｓｃｈｕｌｔｅら、１９９６）。
他の例では、ＨＥＲＶ ＬＴＲのポリＡシグナルはまた、細胞転写物をポリアデ
ニル化するのに利用される可能性がある（Ｍａｇｅｒ、１９８９； Ｇｏｏｄｃ
ｈｉｌｄら、１９９２）。
ば、ＨＥＲＶ ＬＴＲのプロモーターおよびエンハンサー要素は、細胞性遺伝子
の転写調節に用いられる（Ｋａｔｏら、Ｆｅｕｃｈｔｅｒ−Ｍｕｒｔｈｙら、１
９９３； Ｄｉ Ｃｈｒｉｓｔｏｆａｎｏら、１９９５）。細胞性遺伝子の組織
特異的発現のためのＬＴＲ制御要素の使用の一例は、ヒトアミラーゼ遺伝子であ
る。本遺伝子は、ＨＥＲＶ−Ｅ要素のＬＴＲにより調節され、そしてこの方式で
、唾液腺のみで発現されるよう、特異的に制限されている（Ｔｉｎｇら、１９９
２）。さらに、Ｓｃｈｕｌｔｅおよび共同研究者ら（１９９６）は、プレイオト
ロフィン遺伝子の５’非翻訳領域への内因性レトロウイルスの挿入は、その栄養
膜特異的活性に責任があることを示している（Ｓｃｈｕｌｔｅら、１９９６）。
他の例では、ＨＥＲＶ ＬＴＲのポリＡシグナルはまた、細胞転写物をポリアデ
ニル化するのに利用される可能性がある（Ｍａｇｅｒ、１９８９； Ｇｏｏｄｃ
ｈｉｌｄら、１９９２）。
【００１９】 レトロウイルスは、その転写活性を、組込み部位の周囲の領域から非常に独立
に維持する必要があるため、レトロウイルスプロモーターを使用する主な利点は
、上述のように、転写に必要なすべてのシグナル構造が、ＬＴＲのＵ３領域およ
びＲ領域内の限られた領域に局在するという事実にある。これらのＨＥＲＶプロ
モーターは、何百万年も、霊長類ゲノムに存続してきたため、進化の間、細胞性
プロモーターと類似の細胞種特異的方式で、活性であり、そしてしたがって、細
胞性およびレトロウイルスプロモーターの利点を組み合わせるよう、適応してき
ている。
に維持する必要があるため、レトロウイルスプロモーターを使用する主な利点は
、上述のように、転写に必要なすべてのシグナル構造が、ＬＴＲのＵ３領域およ
びＲ領域内の限られた領域に局在するという事実にある。これらのＨＥＲＶプロ
モーターは、何百万年も、霊長類ゲノムに存続してきたため、進化の間、細胞性
プロモーターと類似の細胞種特異的方式で、活性であり、そしてしたがって、細
胞性およびレトロウイルスプロモーターの利点を組み合わせるよう、適応してき
ている。
【００２０】 ＨＥＲＶは、古典的なＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターから開始して転写
される（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、１９９４）。本プロモーターは、ＬＴＲ領域内
に局在する。したがって、ＨＥＲＶ転写物は、プロウイルスの完全なコピーをま
ったく含まない。転写調節要素の損失を相殺するため、これらの要素は、逆転写
の機構を発展させてきた。これにより、要素の両側で失われた配列が再生され、
これにより次にＬＴＲが再生される。プロモーター配列に加え、ＨＥＲＶ ＬＴ
Ｒはまた、発現の組織特異性に責任がある、転写因子の複数の異なる結合部位（
Ｓｅｉｆａｒｔｈら、１９９８）を含む。
される（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、１９９４）。本プロモーターは、ＬＴＲ領域内
に局在する。したがって、ＨＥＲＶ転写物は、プロウイルスの完全なコピーをま
ったく含まない。転写調節要素の損失を相殺するため、これらの要素は、逆転写
の機構を発展させてきた。これにより、要素の両側で失われた配列が再生され、
これにより次にＬＴＲが再生される。プロモーター配列に加え、ＨＥＲＶ ＬＴ
Ｒはまた、発現の組織特異性に責任がある、転写因子の複数の異なる結合部位（
Ｓｅｉｆａｒｔｈら、１９９８）を含む。
【００２１】 ＨＥＲＶおよび外因性動物レトロウイルス、例えばＭＬＶまたはＭＭＴＶの間
には特定の構造類似性があるが、ＨＥＲＶ配列および特にＨＥＲＶプロモーター
は、レトロウイルス発現ベクターの開発の候補の可能性があるとは決してみなさ
れてこなかった。対照的に、現在まで、これらは、遺伝子治療の観点で、破壊的
要因としてのみみなされてきた（Ｐａｔｉｅｎｃｅら、１９９７）。配列相同性
のため、これらが、標的細胞内での組換えにより、療法ベクターに干渉する可能
性があることが懸念されてきていた。現在まで、実験によりこれらの懸念を確認
することは不可能であったが、非常に効率的なヒトパッケージング細胞株を開発
する際、潜在的に感染性であるＨＥＲＶ配列の同時パッケージングおよび偶然の
導入が起こる問題が生じた。したがって、発現されたＨＥＲＶ配列をＭＬＶに基
づくビリオンにパッケージングする可能性の詳細な研究が行われてきている。Ｐ
ａｔｉｅｎｃｅら（１９９８）は、ヒトパッケージング細胞株において、いくつ
かの異なるＨＥＲＶファミリー、例えばＨＥＲＶ−ＫおよびＨＥＲＶ−ＨのｍＲ
ＮＡ転写物を同定した。しかし、非常に感度の高いＲＴ−ＰＣＲ試験を用いてさ
え、これらの配列のいずれも、細胞に放出されたＭＬＶベクター粒子中に検出す
ることができなかった。
には特定の構造類似性があるが、ＨＥＲＶ配列および特にＨＥＲＶプロモーター
は、レトロウイルス発現ベクターの開発の候補の可能性があるとは決してみなさ
れてこなかった。対照的に、現在まで、これらは、遺伝子治療の観点で、破壊的
要因としてのみみなされてきた（Ｐａｔｉｅｎｃｅら、１９９７）。配列相同性
のため、これらが、標的細胞内での組換えにより、療法ベクターに干渉する可能
性があることが懸念されてきていた。現在まで、実験によりこれらの懸念を確認
することは不可能であったが、非常に効率的なヒトパッケージング細胞株を開発
する際、潜在的に感染性であるＨＥＲＶ配列の同時パッケージングおよび偶然の
導入が起こる問題が生じた。したがって、発現されたＨＥＲＶ配列をＭＬＶに基
づくビリオンにパッケージングする可能性の詳細な研究が行われてきている。Ｐ
ａｔｉｅｎｃｅら（１９９８）は、ヒトパッケージング細胞株において、いくつ
かの異なるＨＥＲＶファミリー、例えばＨＥＲＶ−ＫおよびＨＥＲＶ−ＨのｍＲ
ＮＡ転写物を同定した。しかし、非常に感度の高いＲＴ−ＰＣＲ試験を用いてさ
え、これらの配列のいずれも、細胞に放出されたＭＬＶベクター粒子中に検出す
ることができなかった。
【００２２】 これらの知見にしたがい、ＭＬＶパッケージング系におけるＨＥＲＶ配列の、
そしてしたがって、最終的にはまた、ＨＥＲＶに基づくベクターのパッケージン
グおよび導入は問題外のようであった。ＨＥＲＶ遺伝子は、ＭＬＶ遺伝子に関し
、５０−６５％の配列相同性を有するが、特にパッケージングおよび感染に必須
の領域、並びに特に５’ＬＴＲおよびｇａｇ領域の間に局在するパッケージング
シグナルと共にＬＴＲ自体は、対応するＭＬＶ配列に関し、検出可能な配列相同
性をまったく持たない。しかし、現在まで、十分な量でＨＥＲＶ粒子を産生する
細胞株は知られていないため、現在、効率的なＨＥＲＶパッケージング系もまた
、考えられない。
そしてしたがって、最終的にはまた、ＨＥＲＶに基づくベクターのパッケージン
グおよび導入は問題外のようであった。ＨＥＲＶ遺伝子は、ＭＬＶ遺伝子に関し
、５０−６５％の配列相同性を有するが、特にパッケージングおよび感染に必須
の領域、並びに特に５’ＬＴＲおよびｇａｇ領域の間に局在するパッケージング
シグナルと共にＬＴＲ自体は、対応するＭＬＶ配列に関し、検出可能な配列相同
性をまったく持たない。しかし、現在まで、十分な量でＨＥＲＶ粒子を産生する
細胞株は知られていないため、現在、効率的なＨＥＲＶパッケージング系もまた
、考えられない。
【００２３】 したがって、本発明は、機能的なアセンブリで、少なくとも以下の要素： ａ）ベクターＲＮＡのパッケージングのためおよび異種ＤＮＡヌクレオチド配列
にコードされるタンパク質またはペプチドの細胞特異的発現のためのＤＮＡ配列
； ｂ）タンパク質またはペプチドをコードする、１つまたはそれ以上の異種ＤＮＡ
ヌクレオチド配列（転写単位）、 ここで、細胞特異的発現のためのＤＮＡ配列は、ヒト内因性レトロウイルス、特
に前記ウイルスのＬＴＲ配列由来の細胞特異的調節可能プロモーター領域を含む
、 を含む、発現ベクターを提供することにより、異質の遺伝子（目的の遺伝子）の
細胞および組織特異的発現を調節するレトロウイルス発現ベクターの問題を解決
する。
にコードされるタンパク質またはペプチドの細胞特異的発現のためのＤＮＡ配列
； ｂ）タンパク質またはペプチドをコードする、１つまたはそれ以上の異種ＤＮＡ
ヌクレオチド配列（転写単位）、 ここで、細胞特異的発現のためのＤＮＡ配列は、ヒト内因性レトロウイルス、特
に前記ウイルスのＬＴＲ配列由来の細胞特異的調節可能プロモーター領域を含む
、 を含む、発現ベクターを提供することにより、異質の遺伝子（目的の遺伝子）の
細胞および組織特異的発現を調節するレトロウイルス発現ベクターの問題を解決
する。
【００２４】 ＨＥＲＶ配列のプロモーター領域は、ＨＥＲＶの全ＬＴＲ領域を含んでもよい
。しかし、本発明の別の態様において、プロモーター領域は、ＨＥＲＶ ＬＴＲ
のＵ３領域またはＲ−Ｕ３領域のみを含む。本発明の別の好ましい態様において
、これらの領域に加え、プロモーター領域はまた、５’ＬＴＲおよびｇａｇ遺伝
子の間の非翻訳領域も含む。本発明にしたがい、本領域はまた、それぞれ、タン
パク質またはペプチドの細胞特異的発現を調節する、すなわち、前記の細胞特異
的発現に、少なくとも寄与する、配列も含むことが見出されてきている。
。しかし、本発明の別の態様において、プロモーター領域は、ＨＥＲＶ ＬＴＲ
のＵ３領域またはＲ−Ｕ３領域のみを含む。本発明の別の好ましい態様において
、これらの領域に加え、プロモーター領域はまた、５’ＬＴＲおよびｇａｇ遺伝
子の間の非翻訳領域も含む。本発明にしたがい、本領域はまた、それぞれ、タン
パク質またはペプチドの細胞特異的発現を調節する、すなわち、前記の細胞特異
的発現に、少なくとも寄与する、配列も含むことが見出されてきている。
【００２５】 プロモーターは、対応する構造遺伝子の転写の開始に必要なＤＮＡの部分的領
域である。プロモーターは、転写開始部位、ＲＮＡポリメラーゼの認識および結
合部位を含む。プロモーターはまた、制御タンパク質が結合する可能性があり、
そしてそれにより、転写開始を特異的に調節する、他の配列も含んでもよい。こ
うしたタンパク質の例は、転写因子およびリプレッサーである。転写活性の前記
制御要素の例は、ＣＡＡＴボックス、ＧＣボックスおよびＴＡＴＡボックスであ
る。プロモーターはＩＩ型ポリメラーゼに認識される。
域である。プロモーターは、転写開始部位、ＲＮＡポリメラーゼの認識および結
合部位を含む。プロモーターはまた、制御タンパク質が結合する可能性があり、
そしてそれにより、転写開始を特異的に調節する、他の配列も含んでもよい。こ
うしたタンパク質の例は、転写因子およびリプレッサーである。転写活性の前記
制御要素の例は、ＣＡＡＴボックス、ＧＣボックスおよびＴＡＴＡボックスであ
る。プロモーターはＩＩ型ポリメラーゼに認識される。
【００２６】 ＨＥＲＶ由来の異質のタンパク質の細胞特異的発現のためのプロモーター領域
は、所望により、細胞特異的発現を促進する外因性レトロウイルス由来の他の配
列と組み合わせてもよい。さらに、細胞特異的発現を支持する細胞性遺伝子由来
の制御配列との組み合わせが考慮される。
は、所望により、細胞特異的発現を促進する外因性レトロウイルス由来の他の配
列と組み合わせてもよい。さらに、細胞特異的発現を支持する細胞性遺伝子由来
の制御配列との組み合わせが考慮される。
【００２７】 さらに、本発明のレトロウイルス発現ベクターは、少なくとも、パッケージン
グヘルパー細胞株により、ベクターをパッケージングするためのＤＮＡ配列を含
む。パッケージングのためのＤＮＡ配列は、５’ＬＴＲおよびｇａｇ遺伝子の間
に局在する。こうしたパッケージングシグナルは、いかなるレトロウイルスベク
ターにも存在し、そしてしたがって、当業者に知られる。パッケージングシグナ
ルの例は、Ｍａｎｎら、１９８５、およびＲｅｉｎ、１９９４と共に、それらの
文献に引用される文献に列挙される。本文献は、完全に本明細書に援用される。
グヘルパー細胞株により、ベクターをパッケージングするためのＤＮＡ配列を含
む。パッケージングのためのＤＮＡ配列は、５’ＬＴＲおよびｇａｇ遺伝子の間
に局在する。こうしたパッケージングシグナルは、いかなるレトロウイルスベク
ターにも存在し、そしてしたがって、当業者に知られる。パッケージングシグナ
ルの例は、Ｍａｎｎら、１９８５、およびＲｅｉｎ、１９９４と共に、それらの
文献に引用される文献に列挙される。本文献は、完全に本明細書に援用される。
【００２８】 本発明のレトロウイルス発現ベクターは、アミノ酸配列をコードする、１つま
たはそれ以上の転写単位を含む。アミノ酸配列はタンパク質またはペプチドを指
す。目的のタンパク質またはペプチドをコードするいかなる配列も、発現ベクタ
ーに挿入してもよい。例えば、こうしたタンパク質またはペプチドは、マーカー
遺伝子、療法的価値がある遺伝子、抗ウイルス機能を持つ遺伝子、抗腫瘍遺伝子
および/またはサイトカイン遺伝子にコードされてもよい。本リストは、いかな
る数まで続いてもよい。レトロウイルス発現ベクターに導入してもよい遺伝子は
、当業者に知られる。挿入される遺伝子の種類は、本発明のベクターの意図され
る使用に応じる。
たはそれ以上の転写単位を含む。アミノ酸配列はタンパク質またはペプチドを指
す。目的のタンパク質またはペプチドをコードするいかなる配列も、発現ベクタ
ーに挿入してもよい。例えば、こうしたタンパク質またはペプチドは、マーカー
遺伝子、療法的価値がある遺伝子、抗ウイルス機能を持つ遺伝子、抗腫瘍遺伝子
および/またはサイトカイン遺伝子にコードされてもよい。本リストは、いかな
る数まで続いてもよい。レトロウイルス発現ベクターに導入してもよい遺伝子は
、当業者に知られる。挿入される遺伝子の種類は、本発明のベクターの意図され
る使用に応じる。
【００２９】 例えば、疾患が特異的療法に影響を受けるようにするため、本発明のベクター
を遺伝子治療に使用し、標的細胞に異種ＤＮＡを導入してもよい。ベクターＤＮ
Ａを選択された標的細胞に導入し、異種ＤＮＡが標的細胞で発現され、そしてＤ
ＮＡにコードされる産物が産生されるようにする。これには、特に、標的細胞に
より産生されておらず、またはもはや産生されず、または十分な量で産生されず
、その結果、疾患状態が発展する、タンパク質の発現のための遺伝子が含まれる
。本発明は、天然に発生する、それぞれこうしたタンパク質またはペプチドだけ
でなく、望ましい影響、例えば、より高い酵素活性、ウイルスの結合部位の遮断
、自殺遺伝子による腫瘍細胞の破壊などを達成する方式で修飾されているものを
含む。
を遺伝子治療に使用し、標的細胞に異種ＤＮＡを導入してもよい。ベクターＤＮ
Ａを選択された標的細胞に導入し、異種ＤＮＡが標的細胞で発現され、そしてＤ
ＮＡにコードされる産物が産生されるようにする。これには、特に、標的細胞に
より産生されておらず、またはもはや産生されず、または十分な量で産生されず
、その結果、疾患状態が発展する、タンパク質の発現のための遺伝子が含まれる
。本発明は、天然に発生する、それぞれこうしたタンパク質またはペプチドだけ
でなく、望ましい影響、例えば、より高い酵素活性、ウイルスの結合部位の遮断
、自殺遺伝子による腫瘍細胞の破壊などを達成する方式で修飾されているものを
含む。
【００３０】 一般的に、タンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡヌクレオチド配列は
、それぞれ、タンパク質またはペプチドが発現される細胞が、通常、ｉｎ ｖｉ
ｖｏで産生しない、ＲＮＡおよびタンパク質をコードする異種ＤＮＡである。こ
れはまた、異質のＤＮＡと称してもよい。これはいかなるタンパク質、例えば酵
素、ホルモン、および抗体も含む。したがって、本発明に提供されるレトロウイ
ルス発現ベクターを設計し、ヒト細胞において、目的のタンパク質を発現する。
、それぞれ、タンパク質またはペプチドが発現される細胞が、通常、ｉｎ ｖｉ
ｖｏで産生しない、ＲＮＡおよびタンパク質をコードする異種ＤＮＡである。こ
れはまた、異質のＤＮＡと称してもよい。これはいかなるタンパク質、例えば酵
素、ホルモン、および抗体も含む。したがって、本発明に提供されるレトロウイ
ルス発現ベクターを設計し、ヒト細胞において、目的のタンパク質を発現する。
【００３１】 本発明にしたがって使用されるプロモーター領域は、既知のＨＥＲＶファミリ
ー由来のＨＥＲＶ配列より選択される。これらの例は、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＨＥＲＶ
−Ｈ、ＨＥＲＶ−Ｅ、ＨＥＲＶ−Ｌ、ＨＥＲＶ−Ｔ、ＨＥＲＶ−Ｒ、ＨＥＲＶ−
Ｉ、ＨＥＲＶ−Ｐ、ＥＲＶ９、ＨＥＲＶ−Ｗである。
ー由来のＨＥＲＶ配列より選択される。これらの例は、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＨＥＲＶ
−Ｈ、ＨＥＲＶ−Ｅ、ＨＥＲＶ−Ｌ、ＨＥＲＶ−Ｔ、ＨＥＲＶ−Ｒ、ＨＥＲＶ−
Ｉ、ＨＥＲＶ−Ｐ、ＥＲＶ９、ＨＥＲＶ−Ｗである。
【００３２】 現在未知であり、そして細胞特異的配列を制御するプロモーター配列を発見す
るため、他の、現在未知のＨＥＲＶファミリーをスクリーニングすることも可能
であると理解すべきである。
るため、他の、現在未知のＨＥＲＶファミリーをスクリーニングすることも可能
であると理解すべきである。
【００３３】 タンパク質およびペプチドの組織特異的発現に使用してもよい、本発明にした
がったＨＥＲＶ由来の好ましいＬＴＲ配列は、付属文書に開示される。これらは
レトロウイルス発現ベクターに導入し、本発明にしたがって、目的を達成しても
よい。しかし、それ自体知られる方法により、ベクターに挿入される配列を可能
な限り小さく維持する、これらのＬＴＲの部分のみを選択することも可能である
ことを理解すべきである。有用な断片は、多様な欠失突然変異体を用い、選択し
てもよい。さらに、組織特異的発現の効率を増加させ、そして望ましい機能に適
応させるため、これらのＬＴＲ配列の他の変異、例えばいくつかのヌクレオチド
の点突然変異、挿入、付加、置換などもまた可能である。
がったＨＥＲＶ由来の好ましいＬＴＲ配列は、付属文書に開示される。これらは
レトロウイルス発現ベクターに導入し、本発明にしたがって、目的を達成しても
よい。しかし、それ自体知られる方法により、ベクターに挿入される配列を可能
な限り小さく維持する、これらのＬＴＲの部分のみを選択することも可能である
ことを理解すべきである。有用な断片は、多様な欠失突然変異体を用い、選択し
てもよい。さらに、組織特異的発現の効率を増加させ、そして望ましい機能に適
応させるため、これらのＬＴＲ配列の他の変異、例えばいくつかのヌクレオチド
の点突然変異、挿入、付加、置換などもまた可能である。
【００３４】 本発明にしたがった好ましい態様において、はじめに記載されたＰｒｏＣｏｎ
ベクターが使用される。こうしたＰｒｏＣｏｎベクターは、構造Ｕ３−Ｒ−Ｕ５
を有する５’ＬＴＲ領域、タンパク質またはペプチドをコードする１つまたはそ
れ以上の配列および所望による非コード配列、並びに、部分的または完全に欠失
したＵ３領域を含んでおり、当該欠失Ｕ３部分は、少なくとも、本発明にしたが
って使用されるＨＥＲＶ−ＬＴＲ配列を含んでおり、Ｒ−Ｕ５領域が続く、３’
ＬＴＲ領域を含む。さらなる詳細は、例えば、ＷＯ９６／０７７４８およびＷＯ
９６／２８５６４に記載される。これらの文献は、本明細書に完全に援用される
。
ベクターが使用される。こうしたＰｒｏＣｏｎベクターは、構造Ｕ３−Ｒ−Ｕ５
を有する５’ＬＴＲ領域、タンパク質またはペプチドをコードする１つまたはそ
れ以上の配列および所望による非コード配列、並びに、部分的または完全に欠失
したＵ３領域を含んでおり、当該欠失Ｕ３部分は、少なくとも、本発明にしたが
って使用されるＨＥＲＶ−ＬＴＲ配列を含んでおり、Ｒ−Ｕ５領域が続く、３’
ＬＴＲ領域を含む。さらなる詳細は、例えば、ＷＯ９６／０７７４８およびＷＯ
９６／２８５６４に記載される。これらの文献は、本明細書に完全に援用される
。
【００３５】 本発明にしたがい、細胞特異的機能を有するプロモーター配列を突き止める戦
略が開発されてきている。本戦略は、以下の説明に、より詳細に記載される。原
則的に、細胞特異的方式で作用するＨＥＲＶ ＬＴＲを発見する他の方法もまた
、考慮されそして用いられてもよいことを理解しなければならない。したがって
、本発明は、以下の例に限定されない。
略が開発されてきている。本戦略は、以下の説明に、より詳細に記載される。原
則的に、細胞特異的方式で作用するＨＥＲＶ ＬＴＲを発見する他の方法もまた
、考慮されそして用いられてもよいことを理解しなければならない。したがって
、本発明は、以下の例に限定されない。
【００３６】 本発明にしたがったレトロウイルス発現ベクターは、パッケージング不全であ
り、すなわち、パッケージングヘルパー細胞株による補助なしには、ウイルス粒
子を産生することが不可能である。したがって、本発明はまた、本発明に記載さ
れるようなレトロウイルス発現ベクター、並びに少なくとも該レトロウイルス発
現ベクターのパッケージングタンパク質をコードするレトロウイルスまたは組換
えレトロウイルス構築物を含むパッケージング細胞株を含むレトロウイルスベク
ター系も含む。こうしたパッケージング細胞株は、それ自体知られ、そして記載
されてきている。例として、ネズミパッケージング細胞株ＰＡ３１７を参照され
たい（Ｓａｌｌｅｒら、１９９８）。
り、すなわち、パッケージングヘルパー細胞株による補助なしには、ウイルス粒
子を産生することが不可能である。したがって、本発明はまた、本発明に記載さ
れるようなレトロウイルス発現ベクター、並びに少なくとも該レトロウイルス発
現ベクターのパッケージングタンパク質をコードするレトロウイルスまたは組換
えレトロウイルス構築物を含むパッケージング細胞株を含むレトロウイルスベク
ター系も含む。こうしたパッケージング細胞株は、それ自体知られ、そして記載
されてきている。例として、ネズミパッケージング細胞株ＰＡ３１７を参照され
たい（Ｓａｌｌｅｒら、１９９８）。
【００３７】 以下、本発明は、一般的に記載され、その後、実施例に関し、説明されるであ
ろう。 本発明にしたがい、遺伝子治療用の組織特異的ベクターを開発するためのヒト
内因性レトロウイルスの適用可能性を調べた。本目的のため、まず、ＨＥＲＶ
ｐｏｌ転写の組織特異性を、「逆ドットブロット」法を用い、異なる細胞株、例
えばＴ細胞、角化細胞および乳癌細胞で調べた。本試験において、多様なＨＥＲ
Ｖファミリーの発現パターンは、一般的に細胞種に依存することが見出された。
異なる細胞株および組織から転写活性を持つＨＥＲＶ ＬＴＲを単離するため、
ｍＲＮＡ調製からＵ３／Ｒ領域を特異的に増幅するのに用いることが可能なプラ
イマーを開発した。単離ＬＴＲ配列と共に、すでに知られるＬＴＲの個々のメン
バーを発現ベクターに挿入した。レポータープラスミドの一過性トランスフェク
ション後、それぞれ、ルシフェラーゼ活性またはｅＧＦＰ蛍光を介し、ＬＴＲプ
ロモーターの活性を異なる細胞株で試験した。個々のＨＥＲＶ ＬＴＲのプロモ
ーター活性は、試験された細胞株に明確に依存して異なることが見出された。い
くつかの試験において、肺線維芽細胞（ＬＣＳ）で特に活性であることが見出さ
れた、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）および肝細胞から単離されたＨＥＲＶ
−Ｈ ＬＴＲのプロモーター領域を、２つのレトロウイルスプロモーター変換ベ
クター（ｐＬＥＳＮおよびｐＬＸ）に挿入し、パッケージング細胞株で試験し、
パッケージング効率を評価し、そして標的細胞の感染後、プロモーター変換の発
生に関し、試験した。ＦＡＣＳ解析を行い、標的細胞において転写活性を検出し
た。
ろう。 本発明にしたがい、遺伝子治療用の組織特異的ベクターを開発するためのヒト
内因性レトロウイルスの適用可能性を調べた。本目的のため、まず、ＨＥＲＶ
ｐｏｌ転写の組織特異性を、「逆ドットブロット」法を用い、異なる細胞株、例
えばＴ細胞、角化細胞および乳癌細胞で調べた。本試験において、多様なＨＥＲ
Ｖファミリーの発現パターンは、一般的に細胞種に依存することが見出された。
異なる細胞株および組織から転写活性を持つＨＥＲＶ ＬＴＲを単離するため、
ｍＲＮＡ調製からＵ３／Ｒ領域を特異的に増幅するのに用いることが可能なプラ
イマーを開発した。単離ＬＴＲ配列と共に、すでに知られるＬＴＲの個々のメン
バーを発現ベクターに挿入した。レポータープラスミドの一過性トランスフェク
ション後、それぞれ、ルシフェラーゼ活性またはｅＧＦＰ蛍光を介し、ＬＴＲプ
ロモーターの活性を異なる細胞株で試験した。個々のＨＥＲＶ ＬＴＲのプロモ
ーター活性は、試験された細胞株に明確に依存して異なることが見出された。い
くつかの試験において、肺線維芽細胞（ＬＣＳ）で特に活性であることが見出さ
れた、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）および肝細胞から単離されたＨＥＲＶ
−Ｈ ＬＴＲのプロモーター領域を、２つのレトロウイルスプロモーター変換ベ
クター（ｐＬＥＳＮおよびｐＬＸ）に挿入し、パッケージング細胞株で試験し、
パッケージング効率を評価し、そして標的細胞の感染後、プロモーター変換の発
生に関し、試験した。ＦＡＣＳ解析を行い、標的細胞において転写活性を検出し
た。
【００３８】 このように、組織特異的発現を仲介するＨＥＲＶプロモーター配列（Ｕ３／Ｒ
領域）を同定し、そして単離することが可能な方法が記載された。続いて、多様
なヒト細胞株において、一過性トランスフェクションアッセイで、これらの配列
の組織特異性およびプロモーター活性を試験した。最終的に、適切な配列を選択
し、プロモーター変換ベクター（ＰｒｏＣｏｎベクター）にクローニングし、そ
れにより、遺伝子治療用の組織特異的ベクターの構築に関する有用性を調べた。
本発明にしたがったレトロウイルス発現ベクターの調製は、それ自体知られる組
換え技術を用い、行う。こうした技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８
９、およびＰｅｒｂａｌ、１９８４に記載される。ＰｒｏＣｏｎベクターの構築
に関しては、関連文献のはじめにすでに言及されたＷＯ ９６／０７７４８を参
照されたい。
領域）を同定し、そして単離することが可能な方法が記載された。続いて、多様
なヒト細胞株において、一過性トランスフェクションアッセイで、これらの配列
の組織特異性およびプロモーター活性を試験した。最終的に、適切な配列を選択
し、プロモーター変換ベクター（ＰｒｏＣｏｎベクター）にクローニングし、そ
れにより、遺伝子治療用の組織特異的ベクターの構築に関する有用性を調べた。
本発明にしたがったレトロウイルス発現ベクターの調製は、それ自体知られる組
換え技術を用い、行う。こうした技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８
９、およびＰｅｒｂａｌ、１９８４に記載される。ＰｒｏＣｏｎベクターの構築
に関しては、関連文献のはじめにすでに言及されたＷＯ ９６／０７７４８を参
照されたい。
【００３９】 ３．結果 ３．１ 異なる細胞種におけるＨＥＲＶ転写の解析 異なる細胞におけるＨＥＲＶ転写を調べるため、最初の段階で、元来、末梢血
単核化細胞でＨＥＲＶ発現を検出するのに開発された方法（逆ドットブロットハ
イブリダイゼーション）（ＨｅｒｒｍａｎｎおよびＫａｌｄｅｎ、１９９４）を
使用した。本方法では、ヒトゲノムＤＮＡからクローニングされそして性質決定
されたＨＥＲＶ ｐｏｌ遺伝子断片を膜上に固定し、そして放射標識ＨＥＲＶ
ｐｏｌ遺伝子プローブとハイブリダイズさせた。ＲＴ ＰＣＲおよびレトロウイ
ルスｐｏｌ遺伝子の非常に保存された領域に相同な縮重オリゴヌクレオチドを用
い、プローブを異なる細胞のｍＲＮＡから増幅した（Ｓｈｉｈら、１９８９；
Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒら、１９９０）。本方法を用い、我々は、これまでに調べた
すべての細胞株で、特徴的なハイブリダイゼーションパターンを得、これは、Ｈ
ＥＲＶ要素の組織特異的発現を示す、最初の結果であった。
単核化細胞でＨＥＲＶ発現を検出するのに開発された方法（逆ドットブロットハ
イブリダイゼーション）（ＨｅｒｒｍａｎｎおよびＫａｌｄｅｎ、１９９４）を
使用した。本方法では、ヒトゲノムＤＮＡからクローニングされそして性質決定
されたＨＥＲＶ ｐｏｌ遺伝子断片を膜上に固定し、そして放射標識ＨＥＲＶ
ｐｏｌ遺伝子プローブとハイブリダイズさせた。ＲＴ ＰＣＲおよびレトロウイ
ルスｐｏｌ遺伝子の非常に保存された領域に相同な縮重オリゴヌクレオチドを用
い、プローブを異なる細胞のｍＲＮＡから増幅した（Ｓｈｉｈら、１９８９；
Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒら、１９９０）。本方法を用い、我々は、これまでに調べた
すべての細胞株で、特徴的なハイブリダイゼーションパターンを得、これは、Ｈ
ＥＲＶ要素の組織特異的発現を示す、最初の結果であった。
【００４０】 ３．２ 発現ＨＥＲＶのＬＴＲ Ｕ３領域の単離 レトロウイルスの組織特異的発現は、主にそのＵ３領域により、規定される。
本領域には、すべての制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、および多
様な細胞性転写因子の結合部位が局在する。この理由のため、ＲＴ ＰＣＲによ
り、異なる細胞株のｍＲＮＡからこれらのＨＥＲＶ配列を特異的に単離するのに
用いることが可能なプライマーを開発した（表２；図１）。本方式で、約３０の
異なるＨＥＲＶ ＬＴＲをクローニングした。ひとつには、プロモーター活性お
よび組織特異性に関し、これらの配列をレポータープラスミド中で試験した。
本領域には、すべての制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、および多
様な細胞性転写因子の結合部位が局在する。この理由のため、ＲＴ ＰＣＲによ
り、異なる細胞株のｍＲＮＡからこれらのＨＥＲＶ配列を特異的に単離するのに
用いることが可能なプライマーを開発した（表２；図１）。本方式で、約３０の
異なるＨＥＲＶ ＬＴＲをクローニングした。ひとつには、プロモーター活性お
よび組織特異性に関し、これらの配列をレポータープラスミド中で試験した。
【００４１】
【表２】
【００４２】 第一のアプローチでは、ＰＣＲのため、ポリｄＴプライマーをレトロウイルス
ＲＮＡのポリプリン伸長（ＰＰＴ）に相補的なプライマーと組み合わせた（図１
）。ＰＰＴ伸長は、ｅｎｖ遺伝子および３’ＬＴＲのＵ３領域の間の非翻訳領域
の保存部分である。レトロウイルスの逆転写中、ＰＰＴ領域は、プラス鎖合成の
ためのプライマー結合部位として用いられる（ＳｏｒｇｅおよびＨｕｇｈｅｓ、
１９８２）。
ＲＮＡのポリプリン伸長（ＰＰＴ）に相補的なプライマーと組み合わせた（図１
）。ＰＰＴ伸長は、ｅｎｖ遺伝子および３’ＬＴＲのＵ３領域の間の非翻訳領域
の保存部分である。レトロウイルスの逆転写中、ＰＰＴ領域は、プラス鎖合成の
ためのプライマー結合部位として用いられる（ＳｏｒｇｅおよびＨｕｇｈｅｓ、
１９８２）。
【００４３】 データベース解析により、異なるＨＥＲＶファミリーのＰＰＴ配列を同定し、
そしてその相同性を比較することにより、異なる群に分類した。個々の群のコン
センサス配列から、ＲＴ ＰＣＲのプライマーとして、オリゴヌクレオチドを合
成した。異なる細胞株からｍＲＮＡを調製した：上皮細胞（ＨｅＬａ、ＨａＣａ
Ｔ）、線維芽細胞（ＬＣ５）、Ｔ細胞（Ｈ９、ＨＵＴ７８）、リンパ芽球（ＣＭ
Ｌ）、神経膠腫細胞（８５ＨＧ６６、Ｕ３７３）、膵臓細胞（ＭｉａＰａＣａ２
、Ｐａｎｃ１）、肝細胞（Ｃｈａｎｇ肝臓）、および乳癌細胞株（Ｔ４７−Ｄ、
ＭＣＦ７）。さらに、多様なヒト組織（脳、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、胎盤
、骨格筋）のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）もまた、ＲＴ ＰＣＲ
で使用した。
そしてその相同性を比較することにより、異なる群に分類した。個々の群のコン
センサス配列から、ＲＴ ＰＣＲのプライマーとして、オリゴヌクレオチドを合
成した。異なる細胞株からｍＲＮＡを調製した：上皮細胞（ＨｅＬａ、ＨａＣａ
Ｔ）、線維芽細胞（ＬＣ５）、Ｔ細胞（Ｈ９、ＨＵＴ７８）、リンパ芽球（ＣＭ
Ｌ）、神経膠腫細胞（８５ＨＧ６６、Ｕ３７３）、膵臓細胞（ＭｉａＰａＣａ２
、Ｐａｎｃ１）、肝細胞（Ｃｈａｎｇ肝臓）、および乳癌細胞株（Ｔ４７−Ｄ、
ＭＣＦ７）。さらに、多様なヒト組織（脳、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、胎盤
、骨格筋）のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）もまた、ＲＴ ＰＣＲ
で使用した。
【００４４】 続いて、得た断片をクローニングし、配列決定し、そしてデータベース比較に
より、解析した。ＰＰＴおよびポリｄＴプライマーを用いて得たＰＣＲ断片中、
相同性比較により、２つのＬＴＲがＨＥＲＶ−ＨおよびＨＥＲＶ−Ｋのファミリ
ーに割り当てられた。これらのＰＣＲ試料中でポリｄＴプライマーを用いること
により、既知のレトロウイルスＬＴＲにいかなる相同性も示さず、そしてさらに
、いかなるプロモーター構造要素も含まない多くの配列を増幅した。この理由の
ため、ＨＥＲＶ−ＫおよびＨＥＲＶ−ＨファミリーのＵ３領域の保存領域から、
そしてＲ領域から、プライマー合成のため、他の配列を選択した（Ｍｏｌｄら、
１９９７）（図１、表１）。生じたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離した後
、ニトロセルロースフィルターにトランスファーし、そして異なるＨＥＲＶ Ｌ
ＴＲ（ＨＥＲＶ−Ｋ−ｐ１１６７、ＨＥＲＶ−Ｈ−Ｈ６、ＨＥＲＶ−Ｅ、ＨＥＲ
Ｖ−Ｌ）のＬＴＲ領域から準備したプローブとハイブリダイズした。その後、ハ
イブリダイズ断片をベクター（ｐＺＥＲＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニ
ングし、そして配列決定した。本方法を用い、表３に列挙したいくつかのＨＥＲ
Ｖ ＬＴＲを単離することが可能であった。
より、解析した。ＰＰＴおよびポリｄＴプライマーを用いて得たＰＣＲ断片中、
相同性比較により、２つのＬＴＲがＨＥＲＶ−ＨおよびＨＥＲＶ−Ｋのファミリ
ーに割り当てられた。これらのＰＣＲ試料中でポリｄＴプライマーを用いること
により、既知のレトロウイルスＬＴＲにいかなる相同性も示さず、そしてさらに
、いかなるプロモーター構造要素も含まない多くの配列を増幅した。この理由の
ため、ＨＥＲＶ−ＫおよびＨＥＲＶ−ＨファミリーのＵ３領域の保存領域から、
そしてＲ領域から、プライマー合成のため、他の配列を選択した（Ｍｏｌｄら、
１９９７）（図１、表１）。生じたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離した後
、ニトロセルロースフィルターにトランスファーし、そして異なるＨＥＲＶ Ｌ
ＴＲ（ＨＥＲＶ−Ｋ−ｐ１１６７、ＨＥＲＶ−Ｈ−Ｈ６、ＨＥＲＶ−Ｅ、ＨＥＲ
Ｖ−Ｌ）のＬＴＲ領域から準備したプローブとハイブリダイズした。その後、ハ
イブリダイズ断片をベクター（ｐＺＥＲＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニ
ングし、そして配列決定した。本方法を用い、表３に列挙したいくつかのＨＥＲ
Ｖ ＬＴＲを単離することが可能であった。
【００４５】
【表３】
【００４６】 ヒト脳および心臓組織から、並びにＴ４７−Ｄ細胞から単離したＨＥＲＶ−Ｋ
ＬＴＲは、ＨＥＲＶ−Ｋ１０の３’ＬＴＲに非常に強い配列相同性を示す。対
照的に、ＨＥＲＶ−Ｈ ＬＴＲは、はるかに高い配列変動を示した。ＨＥＲＶ−
Ｈ３１、ＨＥＲＶ−Ｈ３、ＨＥＲＶ−ＨＣＭ１、ＨＥＲＶ−ＨＣＭ４、ＨＥＲＶ
−ＨＭＰ２３は、Ｍａｇｅｒらに単離されたＨＥＲＶ−Ｈ６ ＬＴＲに相同であ
り、他のＨＥＲＶ−Ｈ配列はＡｎｄｅｒｓｓｅｎら（１９９７）に単離されたベ
ルベットモンキー（ｖｅｒｖｅｔ ｍｏｎｋｅｙ）、マーモセット（ｍａｒｍｏ
ｓｅｔ）およびヒト由来のＨＥＲＶ−Ｈ ＬＴＲに相同性を示す。Ｔ４７−Ｄ細
胞から単離されたＨＥＲＶ−Ｗ ＬＴＲは、クローンＣＬ６（Ｋｏｍｕｒｉａｎ
−Ｐｒａｄｅｌ、１９９８）のＬＴＲに関連する。
ＬＴＲは、ＨＥＲＶ−Ｋ１０の３’ＬＴＲに非常に強い配列相同性を示す。対
照的に、ＨＥＲＶ−Ｈ ＬＴＲは、はるかに高い配列変動を示した。ＨＥＲＶ−
Ｈ３１、ＨＥＲＶ−Ｈ３、ＨＥＲＶ−ＨＣＭ１、ＨＥＲＶ−ＨＣＭ４、ＨＥＲＶ
−ＨＭＰ２３は、Ｍａｇｅｒらに単離されたＨＥＲＶ−Ｈ６ ＬＴＲに相同であ
り、他のＨＥＲＶ−Ｈ配列はＡｎｄｅｒｓｓｅｎら（１９９７）に単離されたベ
ルベットモンキー（ｖｅｒｖｅｔ ｍｏｎｋｅｙ）、マーモセット（ｍａｒｍｏ
ｓｅｔ）およびヒト由来のＨＥＲＶ−Ｈ ＬＴＲに相同性を示す。Ｔ４７−Ｄ細
胞から単離されたＨＥＲＶ−Ｗ ＬＴＲは、クローンＣＬ６（Ｋｏｍｕｒｉａｎ
−Ｐｒａｄｅｌ、１９９８）のＬＴＲに関連する。
【００４７】 ３．３ 一過性ルシフェラーゼアッセイにおけるＨＥＲＶプロモーター発現 の解析 単離ＨＥＲＶ ＬＴＲのプロモーター活性および組織特異性の解析のため、こ
れらをまずルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐＢＬ、Ｂｕｔｚ，Ｋ．、Ｄ
ＫＦＺ、ハイデルベルグ）にクローニングした。本ベクターは、ｐＢＬＣＡＴ２
のＳＶ４０ポリＡシグナルに融合したフォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕ
ｓ ｐｙｒａｌｉｓ）のルシフェラーゼ遺伝子を含む（Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅ
ｒら、１９９１）。
れらをまずルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐＢＬ、Ｂｕｔｚ，Ｋ．、Ｄ
ＫＦＺ、ハイデルベルグ）にクローニングした。本ベクターは、ｐＢＬＣＡＴ２
のＳＶ４０ポリＡシグナルに融合したフォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕ
ｓ ｐｙｒａｌｉｓ）のルシフェラーゼ遺伝子を含む（Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅ
ｒら、１９９１）。
【００４８】 個々のベクター構築物を、異なる細胞株に一過的にトランスフェクションした
。４８時間後、Ｐｒｏｍｅｇａ社のルシフェラーゼアッセイキットを用い、細胞
溶解物由来のルシフェラーゼ活性を測定し、そしてそれぞれ、β−ガラクトシダ
ーゼ活性またはウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ活性に関し規準
化した後、相対ルシフェラーゼ活性として決定した。ＬＴＲプロモーター活性は
、上皮細胞（ＨｅＬａ、ＨａＣａＴ）、線維芽細胞（ＬＣ５）、Ｔ細胞（Ｈ９、
ＨＵＴ７８）、神経膠腫細胞（８５ＨＧ６６、Ｕ３７３）、肝細胞（Ｃｈａｎｇ
肝臓）、膵臓細胞（ＭｉａＰａＣａ２、Ｐａｎｃ１）、および乳癌細胞株（Ｔ４
７−Ｄ、ＭＣＦ７）で決定した。
。４８時間後、Ｐｒｏｍｅｇａ社のルシフェラーゼアッセイキットを用い、細胞
溶解物由来のルシフェラーゼ活性を測定し、そしてそれぞれ、β−ガラクトシダ
ーゼ活性またはウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ活性に関し規準
化した後、相対ルシフェラーゼ活性として決定した。ＬＴＲプロモーター活性は
、上皮細胞（ＨｅＬａ、ＨａＣａＴ）、線維芽細胞（ＬＣ５）、Ｔ細胞（Ｈ９、
ＨＵＴ７８）、神経膠腫細胞（８５ＨＧ６６、Ｕ３７３）、肝細胞（Ｃｈａｎｇ
肝臓）、膵臓細胞（ＭｉａＰａＣａ２、Ｐａｎｃ１）、および乳癌細胞株（Ｔ４
７−Ｄ、ＭＣＦ７）で決定した。
【００４９】 結果を図２ａ−２ｆに示す。これらの結果によると、試験したすべての内因性
ＬＴＲのうち、ＨＥＲＶ−Ｈ−Ｈ６ ＬＴＲが最も強いプロモーターを有する。
胎盤由来のＨＥＲＶ−Ｋ ＬＴＲは、ＨｅＬａ細胞で特に活性である。すべての
他の細胞株において、本ＬＴＲは、非常に弱い活性しか示さない。また、ＨｅＬ
ａ細胞において、ＨＥＲＶ−Ｋ−Ｔ４７−Ｄは、強い活性を示し、本ＬＴＲはま
た、ＨａＣａＴ細胞および膵臓細胞でも活性であった。ＨＥＲＶ−Ｌ ＬＴＲは
、肝細胞で強いプロモーター活性を有し、そしてＴ細胞および膵臓細胞で弱い活
性を有する。ＨＥＲＶ−Ｔ−Ｓ７１ＡおよびＨＥＲＶ−Ｅ ＬＴＲは、試験した
細胞株のいずれでも活性でなかった。また、現在まで、ＣＭＬ細胞において、Ｈ
ＥＲＶ ＬＴＲのすべてで、いかなる活性も観察できなかった。
ＬＴＲのうち、ＨＥＲＶ−Ｈ−Ｈ６ ＬＴＲが最も強いプロモーターを有する。
胎盤由来のＨＥＲＶ−Ｋ ＬＴＲは、ＨｅＬａ細胞で特に活性である。すべての
他の細胞株において、本ＬＴＲは、非常に弱い活性しか示さない。また、ＨｅＬ
ａ細胞において、ＨＥＲＶ−Ｋ−Ｔ４７−Ｄは、強い活性を示し、本ＬＴＲはま
た、ＨａＣａＴ細胞および膵臓細胞でも活性であった。ＨＥＲＶ−Ｌ ＬＴＲは
、肝細胞で強いプロモーター活性を有し、そしてＴ細胞および膵臓細胞で弱い活
性を有する。ＨＥＲＶ−Ｔ−Ｓ７１ＡおよびＨＥＲＶ−Ｅ ＬＴＲは、試験した
細胞株のいずれでも活性でなかった。また、現在まで、ＣＭＬ細胞において、Ｈ
ＥＲＶ ＬＴＲのすべてで、いかなる活性も観察できなかった。
【００５０】 クローニングされたＨＥＲＶ−Ｈ ＬＴＲのほとんどすべて（ＨＥＲＶ−Ｈ１
、ＨＥＲＶ−Ｈ８、ＨＥＲＶ−Ｈ１３、ＨＥＲＶ−Ｈ１９、ＨＥＲＶ−Ｈ Ｈ６
、表３）が８５ＨＧ６６細胞で活性であったが、ＨＥＲＶ−Ｈ１およびＨＥＲＶ
−Ｈ８が本細胞株で最高の活性を示した（データ未提示）。ＨＥＲＶ−Ｈ１９は
、ＨｅＬａ細胞で非常に活性であった。ＨＥＲＶ−ＨＣＭ１ ＬＴＲは、すべて
の細胞株で最高のプロモーター活性を示し、そして肺線維芽細胞（ＬＣ５）で特
に活性であった（図３）。
、ＨＥＲＶ−Ｈ８、ＨＥＲＶ−Ｈ１３、ＨＥＲＶ−Ｈ１９、ＨＥＲＶ−Ｈ Ｈ６
、表３）が８５ＨＧ６６細胞で活性であったが、ＨＥＲＶ−Ｈ１およびＨＥＲＶ
−Ｈ８が本細胞株で最高の活性を示した（データ未提示）。ＨＥＲＶ−Ｈ１９は
、ＨｅＬａ細胞で非常に活性であった。ＨＥＲＶ−ＨＣＭ１ ＬＴＲは、すべて
の細胞株で最高のプロモーター活性を示し、そして肺線維芽細胞（ＬＣ５）で特
に活性であった（図３）。
【００５１】 ３．４ ＨＥＲＶハイブリッドベクターの構築およびこれらのベクターにお けるＨＥＲＶプロモーター活性のモニター レトロウイルスベクターにおけるヒト内因性レトロウイルスＬＴＲ配列の機能
性を、２つの異なるプロモーター変換ベクター（ＰｒｏＣｏｎ）において、試験
した。本目的のため、ＭＬＶに基づく２つのベクター、ｐＬＥＳＮ−ＭＭＴＶ（
図７）およびｐＬＸ−ＭＭＴＶ（図８）を用い、ハイブリッドＨＥＲＶ／ＭＬＶ
ベクターを構築した。これらのベクターは、（プロモーター変換の前または後で
測定されるかに応じ、異なる量で）５’ＬＴＲから発現される，レポーター遺伝
子としてのＥＧＦＰ遺伝子と共にＳＶ４０プロモーターから発現されるネオマイ
シン遺伝子を含む。さらに、ベクターｐＬＸ−ＭＭＴＶは、さらなる分子性質決
定のため、プロウイルスを再クローニングするのを可能にする、原核複製起点を
含む。
性を、２つの異なるプロモーター変換ベクター（ＰｒｏＣｏｎ）において、試験
した。本目的のため、ＭＬＶに基づく２つのベクター、ｐＬＥＳＮ−ＭＭＴＶ（
図７）およびｐＬＸ−ＭＭＴＶ（図８）を用い、ハイブリッドＨＥＲＶ／ＭＬＶ
ベクターを構築した。これらのベクターは、（プロモーター変換の前または後で
測定されるかに応じ、異なる量で）５’ＬＴＲから発現される，レポーター遺伝
子としてのＥＧＦＰ遺伝子と共にＳＶ４０プロモーターから発現されるネオマイ
シン遺伝子を含む。さらに、ベクターｐＬＸ−ＭＭＴＶは、さらなる分子性質決
定のため、プロウイルスを再クローニングするのを可能にする、原核複製起点を
含む。
【００５２】 ＨＥＲＶハイブリッドベクターを構築するため、各場合で、ＭＭＴＶ ＬＴＲ
をＨＥＲＶ−ＨＣＭ１ ＬＴＲにより置き換えた（図７）。本目的のため、まず
、制限酵素ＭｌｕＩおよびＳａｃＩＩのためのさらなる配列を含む特異的プライ
マーを用い、ベクターｐＢＬ−ＨＥＲＶ−Ｈから、ＰＣＲにより、ＬＴＲを増幅
した。その後、これらの断片をその３’Ｕ３領域が欠失したベクターに挿入した
。パッケージング細胞株へのトランスフェクション後、まず、ＭＬＶプロモータ
ーからＥＧＦＰレポーター遺伝子を発現する（図９ａ）。標的細胞の感染および
標的細胞における逆転写酵素によるプロモーター変換の成功後、レポーター遺伝
子は、ＨＥＲＶ ＬＴＲの転写調節下に存在する。
をＨＥＲＶ−ＨＣＭ１ ＬＴＲにより置き換えた（図７）。本目的のため、まず
、制限酵素ＭｌｕＩおよびＳａｃＩＩのためのさらなる配列を含む特異的プライ
マーを用い、ベクターｐＢＬ−ＨＥＲＶ−Ｈから、ＰＣＲにより、ＬＴＲを増幅
した。その後、これらの断片をその３’Ｕ３領域が欠失したベクターに挿入した
。パッケージング細胞株へのトランスフェクション後、まず、ＭＬＶプロモータ
ーからＥＧＦＰレポーター遺伝子を発現する（図９ａ）。標的細胞の感染および
標的細胞における逆転写酵素によるプロモーター変換の成功後、レポーター遺伝
子は、ＨＥＲＶ ＬＴＲの転写調節下に存在する。
【００５３】 ＨＥＲＶハイブリッドベクター構築物ｐＬＥＳＮ−ＨＥＲＶ−Ｈ（図７）およ
びｐＬＸ−ＨＥＲＶ−Ｈ（図８）、並びに親ベクターｐＬＥＳＮ−ＭＭＴＶおよ
びｐＬＸ−ＭＭＴＶを両親和性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ）パッケージング細
胞株ＰＡ３１７にトランスフェクションした。その後、生じたレトロウイルスベ
クター粒子を、細胞株ＣｒｆＫおよびＬＣ５の感染に用いた。
びｐＬＸ−ＨＥＲＶ−Ｈ（図８）、並びに親ベクターｐＬＥＳＮ−ＭＭＴＶおよ
びｐＬＸ−ＭＭＴＶを両親和性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ）パッケージング細
胞株ＰＡ３１７にトランスフェクションした。その後、生じたレトロウイルスベ
クター粒子を、細胞株ＣｒｆＫおよびＬＣ５の感染に用いた。
【００５４】 感染細胞株をクローニングし、そしてベクター構築物の存在およびプロモータ
ー変換の発生に関し、選択された細胞性クローンを調べた。本目的のため、感染
および未感染細胞から染色体ＤＮＡを調製し、ＰＣＲにより解析した。ＭＬＶ
Ｕ３（Ｐ５）およびＲ（Ｐ２）領域と共に、ＨＥＲＶ−Ｈ領域（Ｐ１）からプラ
イマーを選択し、そしてＥＧＦＰ領域のプライマーと組み合わせ、ＰＣＲに用い
た（図９ａ）。ＰＣＲ産物をＨＥＲＶ−Ｈ特異的プローブとハイブリダイズした
（図９ｂ）。プライマーＰ１およびＰ３を用いて増幅した後、ｐＬＸ ＨＥＲＶ
−Ｈ粒子に感染したＤＮＡは、ＨＥＲＶ−Ｈプローブにハイブリダイズする１．
１ｋｂのＰＣＲ産物を生じた。ＭＬＶ Ｕ３特異的プライマー（Ｐ２／Ｐ３）を
用い、ｐＬＸおよびｐＬＸ ＨＥＲＶ−Ｈに感染した細胞のＤＮＡを増幅すると
、ＨＥＲＶ−Ｈプローブにハイブリダイゼーションを示さない、約９００ｂｐの
大きさを有するＰＣＲ産物が生じた。ＭＬＶ Ｒプライマー（Ｐ５／Ｐ３）を用
いた増幅からは、ＨＥＲＶ−ＨプローブにハイブリダイズするＰＣＲ産物は得ら
れなかった。これらの結果は、プロモーター変換が起こり、そして５’ＬＴＲの
ＭＬＶプロモーターが、ＨＥＲＶプロモーターに置き換えられていることを示す
。
ー変換の発生に関し、選択された細胞性クローンを調べた。本目的のため、感染
および未感染細胞から染色体ＤＮＡを調製し、ＰＣＲにより解析した。ＭＬＶ
Ｕ３（Ｐ５）およびＲ（Ｐ２）領域と共に、ＨＥＲＶ−Ｈ領域（Ｐ１）からプラ
イマーを選択し、そしてＥＧＦＰ領域のプライマーと組み合わせ、ＰＣＲに用い
た（図９ａ）。ＰＣＲ産物をＨＥＲＶ−Ｈ特異的プローブとハイブリダイズした
（図９ｂ）。プライマーＰ１およびＰ３を用いて増幅した後、ｐＬＸ ＨＥＲＶ
−Ｈ粒子に感染したＤＮＡは、ＨＥＲＶ−Ｈプローブにハイブリダイズする１．
１ｋｂのＰＣＲ産物を生じた。ＭＬＶ Ｕ３特異的プライマー（Ｐ２／Ｐ３）を
用い、ｐＬＸおよびｐＬＸ ＨＥＲＶ−Ｈに感染した細胞のＤＮＡを増幅すると
、ＨＥＲＶ−Ｈプローブにハイブリダイゼーションを示さない、約９００ｂｐの
大きさを有するＰＣＲ産物が生じた。ＭＬＶ Ｒプライマー（Ｐ５／Ｐ３）を用
いた増幅からは、ＨＥＲＶ−ＨプローブにハイブリダイズするＰＣＲ産物は得ら
れなかった。これらの結果は、プロモーター変換が起こり、そして５’ＬＴＲの
ＭＬＶプロモーターが、ＨＥＲＶプロモーターに置き換えられていることを示す
。
【００５５】 標的細胞ＤＮＡへの組込み後、レトロウイルスベクター中のＨＥＲＶ ＬＴＲ
プロモーター活性を、ＥＧＦＰ蛍光の測定を介し、ＦＡＣＳ解析により決定した
（図１０）。本目的のため、出発ベクターｐＬＸ−ＭＭＴＶの活性を、デキサメ
タゾンの誘導前および誘導後のＨＥＲＶベクターｐＬＸ−ＨＥＲＶ−Ｈ（Ｈ６）
のものと比較した。ＭＭＴＶ ＬＴＲを含むベクターは、デキサメタゾンにより
活性化することが可能である。ＨＥＲＶ ＬＴＲを含むベクターは、デキサメタ
ゾンにより活性化されないが、その活性は、デキサメタゾン刺激ＭＭＴＶハイブ
リッドベクターに比較し、１０の係数（ａ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ １０）でより
高い。
プロモーター活性を、ＥＧＦＰ蛍光の測定を介し、ＦＡＣＳ解析により決定した
（図１０）。本目的のため、出発ベクターｐＬＸ−ＭＭＴＶの活性を、デキサメ
タゾンの誘導前および誘導後のＨＥＲＶベクターｐＬＸ−ＨＥＲＶ−Ｈ（Ｈ６）
のものと比較した。ＭＭＴＶ ＬＴＲを含むベクターは、デキサメタゾンにより
活性化することが可能である。ＨＥＲＶ ＬＴＲを含むベクターは、デキサメタ
ゾンにより活性化されないが、その活性は、デキサメタゾン刺激ＭＭＴＶハイブ
リッドベクターに比較し、１０の係数（ａ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ １０）でより
高い。
【００５６】 ３．５ ＨＥＲＶ配列のプロモーター活性に対する、ＲおよびＵ５領域中の 制御領域の影響 どの配列領域が機能的なＨＥＲＶプロモーターに必要とされるか調べるため、
ＬＴＲ中、Ｕ３領域の外側に局在するさらなるＬＴＲ配列の影響をいくつかの例
で調べた。本目的のため、７つのＨＥＲＶ−Ｋ ＬＴＲ（ＨＥＲＶ−Ｋ−Ｔ４７
Ｄ、Ｌ５、Ｌ５０、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ４８、およびＬ２０／４９）のＵ３領域のル
シフェラーゼアッセイにおける活性を、対応するＵ３−Ｒ断片の活性に比較した
。驚くべきことに、異なるＲ領域は、非常に異なる方式で、Ｕ３領域中のプロモ
ーターに影響を与えることが可能であることが見出された。群１のＬＴＲ（Ｌ５
、Ｌ５０、Ｌ８、Ｌ９）では、Ｒ配列の存在は、試験したすべての細胞株でプロ
モーター活性に顕著な増加を生じた（図４ａ）。対照的に、群２にＬＴＲ（Ｌ２
０／Ｌ４９）では、ＨＥＲＶプロモーター活性は、Ｒ領域により減少する（図４
ｂ）。ＨＥＲＶ−Ｋ−Ｔ４７Ｄプロモーター（図５）およびＬ４８プロモーター
（未提示）は、それぞれのＲ配列に実質的に影響を受けない。興味深いことに、
ＨＥＲＶ−Ｋ−Ｔ４７Ｄ ＬＴＲ配列の場合、Ｕ３−Ｒ領域の下流に局在し、そ
してＵ５領域と共に３’非翻訳領域およびｇａｇ遺伝子の開始部分を含む領域は
、明らかに活性化効果を有する（図５）。
ＬＴＲ中、Ｕ３領域の外側に局在するさらなるＬＴＲ配列の影響をいくつかの例
で調べた。本目的のため、７つのＨＥＲＶ−Ｋ ＬＴＲ（ＨＥＲＶ−Ｋ−Ｔ４７
Ｄ、Ｌ５、Ｌ５０、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ４８、およびＬ２０／４９）のＵ３領域のル
シフェラーゼアッセイにおける活性を、対応するＵ３−Ｒ断片の活性に比較した
。驚くべきことに、異なるＲ領域は、非常に異なる方式で、Ｕ３領域中のプロモ
ーターに影響を与えることが可能であることが見出された。群１のＬＴＲ（Ｌ５
、Ｌ５０、Ｌ８、Ｌ９）では、Ｒ配列の存在は、試験したすべての細胞株でプロ
モーター活性に顕著な増加を生じた（図４ａ）。対照的に、群２にＬＴＲ（Ｌ２
０／Ｌ４９）では、ＨＥＲＶプロモーター活性は、Ｒ領域により減少する（図４
ｂ）。ＨＥＲＶ−Ｋ−Ｔ４７Ｄプロモーター（図５）およびＬ４８プロモーター
（未提示）は、それぞれのＲ配列に実質的に影響を受けない。興味深いことに、
ＨＥＲＶ−Ｋ−Ｔ４７Ｄ ＬＴＲ配列の場合、Ｕ３−Ｒ領域の下流に局在し、そ
してＵ５領域と共に３’非翻訳領域およびｇａｇ遺伝子の開始部分を含む領域は
、明らかに活性化効果を有する（図５）。
【００５７】 試験した、異なるＲ領域の配列解析により、群１のＬＴＲは、群２のＬＴＲの
Ｒ領域では失われている、Ｒ領域中の転写因子ＳＰ１の結合部位を有することが
明らかになった（図６）。対照的に、群２のＲ領域は、転写リプレッサーとして
作用する因子ＴＦＳ３の潜在的な結合部位を含む。これは、ＨＥＲＶプロモータ
ー活性が、さらなる制御領域、例えば転写因子結合部位、エンハンサー配列、ま
たは負の制御領域の挿入により、修飾される可能性があることを示す。参考文献
Ｒ領域では失われている、Ｒ領域中の転写因子ＳＰ１の結合部位を有することが
明らかになった（図６）。対照的に、群２のＲ領域は、転写リプレッサーとして
作用する因子ＴＦＳ３の潜在的な結合部位を含む。これは、ＨＥＲＶプロモータ
ー活性が、さらなる制御領域、例えば転写因子結合部位、エンハンサー配列、ま
たは負の制御領域の挿入により、修飾される可能性があることを示す。参考文献
【００５８】
【表４】
【００５９】
【００６０】
【００６１】
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１０月２９日（２００１．１０．２９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、転写されたＨＥＲＶ配列のＵ３／Ｒ領域単離のためのＲＴ ＰＣＲ戦
略を示す。
略を示す。
【図２】 図２ｇは、多様な細胞株における異なるＨＥＲＶ ＬＴＲの相対プロモーター
活性を示す。
活性を示す。
【図３】 図３ａは、細胞株に対してプロットした相対プロモーター活性を示す。図３ｂ
は、細胞株に対してプロットした相対プロモーター活性を示す。
は、細胞株に対してプロットした相対プロモーター活性を示す。
【図４】 図４は、ＬＴＲ−Ｒ領域が、ＨＥＲＶ−Ｋ−Ｔ４７Ｄ関連ＬＴＲのプロモータ
ー活性を調節したことを示す。図４Ａは、活性化、細胞株に対してプロットした
相対プロモーター活性を示す。図４Ｂは阻害、細胞株に対してプロットした相対
プロモーター活性を示す。
ー活性を調節したことを示す。図４Ａは、活性化、細胞株に対してプロットした
相対プロモーター活性を示す。図４Ｂは阻害、細胞株に対してプロットした相対
プロモーター活性を示す。
【図５】 図５は、ＬＴＲ−Ｒ下流の配列は、ＨＥＲＶ−Ｋ−Ｔ４７Ｄ関連ＬＴＲのプロ
モーター活性を調節するを示す。細胞株に対してプロットした相対プロモーター
活性。
モーター活性を調節するを示す。細胞株に対してプロットした相対プロモーター
活性。
【図６】 図６は、ＨＥＲＶ−Ｋ Ｔ４７Ｄ ＬＴＲのＲ領域中の制御領域を示す。
【図７】 図７は、レトロウイルスＰｒｏＣｏｎベクター、ｐＬＥＳＮ−ＭＭＴＶおよび
ｐＬＥＳＮ−ＨＥＲＶ−Ｈを示す。
ｐＬＥＳＮ−ＨＥＲＶ−Ｈを示す。
【図８】 図８は、レトロウイルスＰｒｏＣｏｎベクター、ｐＬＸ−ＭＭＴＶおよびｐＬ
Ｘ−ＨＥＲＶ−Ｈを示す。
Ｘ−ＨＥＲＶ−Ｈを示す。
【図９】 図９は、 ａ）ＰｒｏＣｏｎハイブリッドベクターのプロモーター変換 ｂ）ＨＥＲＶ−Ｈおよびｐｓｉプローブを用いたＰＣＲおよびハイブリダイゼ
ーションによる、正しいプロモーター変換の検出 を示す。
ーションによる、正しいプロモーター変換の検出 を示す。
【図１０】 図１０は、 ａ）２つのＰｒｏＣｏｎベクター、ｐＬＸ−ＭＭＴＶおよびｐＬＸ−ＨＥＲＶ
−Ｈの構成 ｂ）ＣｒｆＫ細胞感染後、ＭＭＴＶ ＬＴＲに比較した、ＨＥＲＶ−Ｈ ＬＴ
Ｒのプロモーター活性 を示す。
−Ｈの構成 ｂ）ＣｒｆＫ細胞感染後、ＭＭＴＶ ＬＴＲに比較した、ＨＥＲＶ−Ｈ ＬＴ
Ｒのプロモーター活性 を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ １１１ Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:93 7/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 7/00 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:93） (72)発明者 ライプ−メシュ，クリスティン ドイツ連邦共和国デー−80809 ミュンヘ ン，ナディシュトラーセ 23 (72)発明者 シェーン，ウルリーケ ドイツ連邦共和国デー−80335 ミュンヘ ン，ダハウアー・シュトラーセ 73 (72)発明者 バオスト，コリンナ ドイツ連邦共和国デー−69190 ヴァルド ルフ，シュロースヴェーク 30ア (72)発明者 サラー，ローベルト・ミヒャエル ドイツ連邦共和国デー−80636 ミュンヘ ン，ユタシュトラーセ 22 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA04 DA02 EA02 FA02 FA06 GA11 HA12 HA17 4B065 AA90X AA97X AA97Y AB01 AC14 BA02 BA25 CA24 CA44 4C084 AA13 NA14 ZB011 ZB211 ZB261 ZB331 4C087 AA01 AA02 AA03 BB65 CA12 NA14 ZB01 ZB21 ZB26 ZB33
Claims (20)
- 【請求項１】 機能的なアセンブリで、少なくとも以下の要素： ａ）ベクターＲＮＡのパッケージングのためおよび異種ＤＮＡヌクレオチド配列
にコードされるタンパク質またはペプチドの細胞特異的発現のためのＤＮＡ配列
； ｂ）タンパク質またはペプチドをコードする、１つまたはそれ以上のＤＮＡヌク
レオチド配列、 ここで、細胞特異的発現のための前記ＤＮＡ配列は、ヒト内因性レトロウイルス
ＤＮＡヌクレオチド配列（ＨＥＲＶ）由来の細胞特異的調節可能プロモーター領
域を含む、 を含む、レトロウイルス発現ベクター。 - 【請求項２】 細胞特異的発現のための前記ＤＮＡ配列が、ＨＥＲＶのＬ
ＴＲ領域、そして所望により、５’ＬＴＲおよびｇａｇ領域の間の非翻訳領域に
由来する、請求項１記載の発現ベクター。 【請求項２】 全ＬＴＲ領域、Ｕ３領域、またはＲおよびＵ３領域が、ヒ
ト内因性レトロウイルスヌクレオチド配列由来である、請求項１または２記載の
ベクター。 - 【請求項３】 １つまたはそれ以上のタンパク質またはペプチドをコード
する前記ヌクレオチド配列が、マーカー遺伝子、治療用遺伝子、抗ウイルス遺伝
子、抗腫瘍遺伝子、およびサイトカイン遺伝子からなる群の１つまたはそれ以上
の要素より選択される、先行する請求項の１つまたはそれ以上記載のベクター。 - 【請求項４】 前記の細胞特異的調節可能プロモーター領域が、細胞特異
的に発現される内因性ヒトレトロウイルスヌクレオチド配列のＬＴＲ領域由来で
ある、先行する請求項の１つまたはそれ以上記載のベクター。 - 【請求項５】 前記ヒト内因性レトロウイルス細胞特異的調節可能プロモ
ーター配列が、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＨＥＲＶ−Ｈ、ＨＥＲＶ−Ｅ、ＨＥＲＶ−Ｌ、Ｈ
ＥＲＶ−Ｔ、ＨＥＲＶ−Ｒ、ＨＥＲＶ−Ｉ、ＨＥＲＶ−Ｐ、ＥＲＶ９、ＨＥＲＶ
−Ｗからなる群のＨＥＲＶファミリーの１つまたはそれ以上のプロモーター配列
より選択される、先行する請求項の１つまたはそれ以上記載のベクター。 - 【請求項６】 前記プロモーター領域が、ＴＡＴＡボックスに加え、制御
タンパク質の認識および結合部位をさらに含む、先行する請求項の１つまたはそ
れ以上記載のベクター。 - 【請求項７】 制御タンパク質の前記認識および結合部位が、ＧＣボック
ス、ＣＡＡＴボックス、エンハンサー配列およびリプレッサー配列と共にホルモ
ン応答配列モチーフを含み、そして所望により、外因性レトロウイルスのＬＴＲ
領域由来および／または細胞性遺伝子由来の制御タンパク質のさらなる認識およ
び結合部位が含まれる、請求項７記載のベクター。 - 【請求項８】 前記ベクターが、構造Ｕ３−Ｒ−Ｕ５を有する５’ＬＴＲ
部分、コードおよび非コード配列より選択される、１つまたはそれ以上の配列、
並びに、部分的または完全に欠失したＵ３領域を含み、当該欠失Ｕ３部分はＨＥ
ＲＶ ＬＴＲ配列由来の細胞特異的調節可能プロモーター領域に置き換えられて
おり、Ｒ−Ｕ５領域が続く、３’ＬＴＲ部分を含む、プロモーター変換ベクター
である、先行する請求項の１つまたはそれ以上記載のベクター。 - 【請求項９】 先行する請求項の１つまたはそれ以上記載のレトロウイル
ス発現ベクターのｍＲＮＡまたはＲＮＡ。 - 【請求項１０】 先行する請求項の１つまたはそれ以上記載のレトロウイ
ルス発現ベクターを含む、原核細胞または真核細胞。 - 【請求項１１】 先行する請求項の１つまたはそれ以上記載のレトロウイ
ルス発現ベクターを組込み型で含む、真核細胞。 - 【請求項１２】 ヒト内因性レトロウイルスＤＮＡヌクレオチド配列由来
の細胞特異的調節可能プロモーター領域の、レトロウイルス発現ベクターにおい
て、好ましくはＰｒｏＣｏｎベクターにおいて、異質の（ｆｏｒｅｉｇｎ）遺伝
子発現を制御するための使用。 - 【請求項１３】 先行する請求項の１つまたはそれ以上記載の発現ベクタ
ーの、遺伝子治療において異質の遺伝子を発現するための、使用。 - 【請求項１４】 先行する請求項の１つまたはそれ以上記載の発現ベクタ
ーＤＮＡ由来のレトロウイルス発現ベクターＲＮＡを含む、ビリオン。 - 【請求項１５】 タンパク質またはペプチドをコードする、１つまたはそ
れ以上のヌクレオチド配列を導入するための、請求項１５記載のビリオンを調製
する方法であって、先行する請求項の１つまたはそれ以上記載の前記レトロウイ
ルス発現ベクターが、ビリオンが形成され、そしてパッケージング細胞株から放
出されるような条件下で、適切なパッケージング細胞株に導入される、前記方法
。 - 【請求項１６】 １つまたはそれ以上のタンパク質またはペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列を真核細胞に導入するための方法であって、タンパク質
またはペプチドをコードするヌクレオチド配列が、真核細胞の染色体ＤＮＡに挿
入されるような条件下で、前記細胞を請求項１５記載のビリオンによって感染さ
せる、前記方法。 - 【請求項１７】 真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項１７記載の方法
。 - 【請求項１８】 哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１８記載の方法
。 - 【請求項１９】 先行する請求項の１つまたはそれ以上記載のレトロウイ
ルス発現ベクター、並びにレトロウイルス発現ベクターのパッケージングタンパ
ク質をコードするレトロウイルスまたは組換えレトロウイルス構築物を少なくと
も１つ含むパッケージング細胞株を含む、レトロウイルスベクタ−系。 - 【請求項２０】 パッケージング細胞株が、レトロウイルス発現ベクター
にコードされないレトロウイルスタンパク質をコードする、レトロウイルスまた
は組換えレトロウイルス発現ベクターを含む、請求項２０記載のレトロウイルス
ベクター系。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19910650A DE19910650A1 (de) | 1999-03-10 | 1999-03-10 | Auf HERV-LTR-Sequenzen basierende retrovirale Expressionsvektoren |
| DE19910650.9 | 1999-03-10 | ||
| PCT/EP2000/002064 WO2000053789A2 (de) | 1999-03-10 | 2000-03-09 | Retrovirale expressionsvektoren auf der basis von herv-ltr-sequenzen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002537846A true JP2002537846A (ja) | 2002-11-12 |
Family
ID=7900460
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000603410A Pending JP2002537846A (ja) | 1999-03-10 | 2000-03-09 | Ｈｅｒｖｌｔｒ配列に基づく、レトロウイルス発現ベクター |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1144667A2 (ja) |
| JP (1) | JP2002537846A (ja) |
| DE (1) | DE19910650A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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- 2000-03-09 EP EP00918779A patent/EP1144667A2/de not_active Withdrawn
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