JP2002537843A

JP2002537843A - 発現

Info

Publication number: JP2002537843A
Application number: JP2000603406A
Authority: JP
Inventors: エルブ、ジャン‐クレマン、コスト; ジョナサン、ヘンリー、エリス
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1999-03-11
Filing date: 2000-03-09
Publication date: 2002-11-12
Also published as: WO2000053785A3; US7351818B2; WO2000053785A2; GB9905498D0; EP1159437A2; AU3809500A; US7034142B1; US20050266488A1

Abstract

(57)【要約】熱ショック応答に関連した非翻訳領域を、熱ショックと通常必ずしも関連していないポリペプチドの高効率の翻訳を得ることができる。これは非常に改良された発現系の開発を可能にする。本発明はまた、ポリペプチドの発現の欠損に罹った患者の治療やワクチンの提供に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は特にポリペプチドの高発現の提供に関する。

【０００２】ヒトHsp70A遺伝子はHuntC.And MorimotoR.I.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci. USA
82,6455-6459により配列決定された。この遺伝子は２１５塩基の５’非翻訳領域
（５’ＵＴＲ）を含有するｍＲＮＡをコードする。脊椎動物ＨｓｐｍＲＮＡｓ
のほとんどに関してはヒトＨｓｐ７０５’ＵＴＲの塩基組成はグアノシンおよ
びシトシン（〜６２％）を多く含み、（Joshi C.P. and Nguyen H.T.(1995)Nucl
eic Acids Res. 23, 541-549）、ヒトHsp70 ５’ＵＴＲにはこの領域における
２次構造を構成する高いポテンシャルがあることが示唆されている。ヒトＨｓｐ
７０５’ＵＴＲの機能は今まで究明されていないと考えられている。

【０００３】対照的にショウジョウバエ（Drosophila）Ｈｓｐ７０５’ＵＴＲは広範に研
究されている（Di Nocera P.P.and Dawid I. (1983)Proc. Natl.Acad.Sci. USA
80,7095-7098;Bonner J.J et al. (1984) Cell 37, 979-991; McGarry T.J. an
d Lindquist S. (1985) Cell 42, 903-911;Hultmark D. et al (1986) Cell 44,
429-438; Lindquist S. and Peterson R.(1990)Enzyme44、147-166）。ショウジ
ョウバエＨｓｐ７０５’ＵＴＲの配列はヒトHsp70 ５’ＵＴＲと相同ではな
い。アデノシンが豊富な組成（〜５０％）によるショウジョウバエHsp70 ５’
ＵＴＲ領域における２次構造の欠落により、このｍＲＮＡの熱ショック間の効果
的な翻訳が可能となる（Hess M.A and Duncan R.F.(1996) Nucleic Acids Res
. 12 2441-2449）。

【０００４】インビボとインビトロの両システムに関する実験研究により、５’ＵＴＲにお
いて安定した２次構造を形成する高いポテンシャルをもつｍＲＮＡは非能率に翻
訳される（Kozac M.(1991) J.Biol. Chem.v266, 19867-19870; Kozac M. (1991
) J.Cell Biol. 115 887-903）ことが明らかに実証された。更に、５’ＵＴＲに
おける構造的モチーフは、翻訳の負のレギュレーター（negative regulator）と
して作用するタンパク質の結合のための部位を提供する（Gray N.K and Hentze
M.W.(1994) EMBO J. 13, 3882-3891; Stripecke R. et al (1994) Mol. Cell. B
iol. 14, 5898-5909）。

【０００５】ＷＯ９４／１１５２１はウシｈｓｐ７０プロモーターを使用することにより
誘導的発現を行うことを目的とする。プロモーターは、ヒトまたはウシｈｓｐ７
０５’非翻訳領域と関連している可能性がある。

【０００６】驚くべきことに本発明者らは今般、翻訳効率を増加させる２次構造を形成する
高いポテンシャルを有する分子を同定した。

【０００７】本発明によれば、ポリペプチドをコードする領域に作動可能に連結された場合
にそのポリペプチドの翻訳効率の増加をもたらす（非翻訳領域が存在しないとき
に得られるポリペプチドとの対比において）非翻訳領域を有するＲＮＡ分子を提
供する、転写可能なＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子が哺乳類Ｈｓｐ７０をコ
ードしないＤＮＡ分子が提供される。

【０００８】翻訳効率の増加は、好ましくは、少なくとも１０％の増加である。更に好まし
くは、少なくとも１００％の増加である。最も好ましくは、少なくとも５００％
の増加である。

【０００９】翻訳効率の増加を提供する本発明の使用（および、これにより高発現を提供す
る）は、たとえば、国際公開９４／１１５２１に記載の発明と対比される。これ
にはヒトＨｓｐ７０５’非翻訳領域を使用する可能性が記載されているが、翻
訳効率を増加させることは記載されていない。いずれにしても上記に示すように
、国際公開９４／１１５２１は特にウシｈｓｐ７０プロモーター、および誘発的
発現を促進する際の使用に関する発明である。国際公開９４／１１５２１に記載
のウシプロモーターｈｓｐ７０は本発明には使用されていない。本発明ではヒト
Ｈｓｐ７０プロモーターが例えば使用できる。ｈｓｐプロモーターでないプロモ
ーターも使用することができ、好ましいことがある。更に、国際公開９４／１１
５２１と対比して、本発明においてタンパク質発現を増加するために、熱ショッ
クは必要ではない。

【００１０】本発明の好ましいＤＮＡ分子は、ａ）配列

【化２】［転写により、この配列は下記の５’ＵＴＲを有するｍＲＮＡ分子を作製する。
５’ＵＴＲ：

【化３】ｂ）ａ）に記載の配列の相補配列、またはｃ）上記ａ）またはｂ）に定義された配列と実質的な配列同一性を有する配列を
含んでなる、ＤＮＡ分子である。

【００１１】したがって、本発明の非翻訳領域を提供するために転写されうる特定の配列を
有するDNA分子は、本発明の範囲内である（（a）参照）。

【００１２】ＤＮＡ分子は通常二本鎖であるので、この配列の相補的配列も本発明の範囲内
である（ｂ）参照）。いずれにしても、該相補的配列はプローブやプライマーを
設計する上で、またはアンチセンス分子（発現レベルが高すぎる場合、発現を抑
えるために使用されうる）を提供する上で有用である。さらに、ｃＤＮＡ（これ
もまた本発明の範囲内である）は該相補的配列を含有する。

【００１３】上記a) またはｂ）において定義された分子と実質的な配列同一性を有するDNA
分子は、該分子に対して同様の方法で使用することができ、従って、本発明の範
囲内である（c）参照）。

【００１４】本発明はさらに、本明細書において定義されているように、治療に用いるため
の、特に、治療または予防ワクチンにおいて使用するための、ＤＮＡ分子を提供
し、粒子衝撃で投与する場合に好ましく、免疫応答を増加させる際の使用に最も
好ましい。高免疫応答は、本技術分野のプロモーター、例えばＣＭＶ極初期（im
mediate early）プロモーターやＳＶ４０プロモーターを組み込んだ同等の構築
物により得られた免疫応答より大きい免疫応答である。

【００１５】本発明のＵＴＲは、所定の発現システムにおけるコード配列の発現に対し熱シ
ョックを与えることができることが好ましい。しかしながら、非翻訳領域は熱シ
ョック応答がない場合でさえも発現の増加を提供するので、このことは必須では
ない。

【００１６】本発明の非翻訳領域はＧ＋Ｃの含有量は５０％を超えることが望ましく、５５
％を越えるかまたは６０％を超えることがより望ましい。高Ｇ＋Ｃ含有量は、安
定した２次構造を形成する増加傾向としばしば関連性がある。

【００１７】本発明の好ましいＤＮＡ分子は、ポリペプチドをコードするコード領域に作動
可能に連結された場合、該ポリペプチドの翻訳効率を増加させることができる（
非翻訳領域が存在しないときに得られるポリペプチドとの対比において）非翻訳
領域を有するＲＮＡ分子を提供する、転写可能なＤＮＡ分子であり、該ＤＮＡ分
子はヒトｈｓｐ７０をコードせず、該非翻訳領域は−１０ｋＣａｌ／ｍｏｌ未満
のΔＧである。

【００１８】本発明の目的のために、ΔＧはＲＮＡ構造予想プログラムＭＦＯＬＤ（Zuker
M. & Jacobson A.B.(1995)Nucleic ac.Res.(23)2791-2798）を用いて計算できる
。予想されたΔＧはインターネット上に置かれているプログラムを用いて計算で
きる（http://mfold1.wustl.edu/~mfold/mRNA/form1.cgi）。

【００１９】 ΔＧは−３０ｋＣａｌ／ｍｏｌ未満、または−４０ｋＣａｌ／ｍｏｌ未満であ
ることが好ましい。一般的に、ΔＧの値が低ければ低いほど、所定のポリヌクレ
オチド領域については２次構造の度合いは大きくなる。

【００２０】翻訳効率の増加は本発明を用いて広く様々なシステムで達成されることができ
る。実際、本発明者等は２つの非常に異なるレポーター(ホタルルシフェラーゼ
およびクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ) のコード配列の上
流に５’ＵＴＲを与え、通常のトランスフェクトした細胞培養条件においてレポ
ーター発現が非常に増加した（５倍から１０倍）ことを実証した。

【００２１】この効果は２つの異なるプロモーター (ＨＳＰおよびＳＶ４０−プロモーター
)および、多種のヒト細胞系 (ＨｅｐＧ２，Ｈｅｐ３Ｂ，ＨＥＫ２９３，ＷＩ−
３８)において得られた。５’ＵＴＲはｍＲＮＡのレベルを改変しなかったが、
翻訳効率を上げた。この純粋な翻訳効果および熱ショック応答が非常に保存され
るメカニズムであるという事実は本発明の適用可能性を支持する証拠を提供する
。

【００２２】原理上は所定のポリペプチドの発現は本発明を使用して増加させることができ
る。しかしながら、熱ショックタンパク質でないポリペプチドの発現を増加させ
るために本発明を使用することが好ましい。最も好ましくは、本発明は比較的高
い商業的なまたは科学的な価値を有するポリペプチドの発現増加の提供に用いる
ことができる。例えば、それを治療用ポリペプチドの発現を増加させるために使
用することができる。これらはインターフェロン、副腎皮質ホルモン（インシュ
リン等）、インターロイキン、エリスロポイエチン、ｔｐａ、成長因子等を含む
。もちろん、本発明はまた他のポリペプチド、例えば農食品（agro-alimentary
）または化粧品産業において有用なポリペプチドの発現を増加させるために用い
ることができる。

【００２３】本発明のさらなる点は新しいベクターの提供である。これらは、転写の際に本
発明の非翻訳配列を提供するＤＮＡ配列を含む、公知のベクターを改変すること
により得てもよい。これは組換え型ＤＮＡ技術、または突然変異誘発技術により
なされることができる。別法では、ベクターはデノボ（de novo）作製されても
よい。

【００２４】ベクターは多くの目的のために、例えば、増幅、目的の配列の維持または操作
、所望の遺伝子産物の生産、医療目的などに使用することができる。本発明のベ
クター（および核酸）は、必要ならば、単離された形態で単離精製されて提供さ
れてもよい。それらは、汚染タンパク質を実質的に含まない形態で提供されても
よい。

【００２５】多くの異なる種類のベクターを用いることができ、例えば、プラスミド、ファ
ージミド、コスミド、ＹＡＣｓ，ＰＡＣｓおよびウイルスが挙げられる。ウイル
スベクターはバクテリオファージも含まれる。これらは力価コンビナトリアル・
ライブラリーを作製するために使用することができる。ファージディスプレイを
使用して、多くの異なるポリペプチドは発現させることができる（抗体・抗体の
一部等）。これらの技術は、たとえばMJ Geisow in Tibtech 10, 75-76(1992)お
よび、D.Chiswell et al in Tibtech 10, 8-84(1992)に記載されている。上記の
ベクターを含め、他のベクターを使用することができる。

【００２６】いかなるベクターが使用されるとしても、そのベクターは、１以上の選択可能
なマーカー、例えば、薬物耐性マーカーおよび／または特定の培地上での成長を
可能にするマーカーを含むことが好ましい。ベクターは、本発明による核酸分子
がベクターに挿入される際に不活性化されるマーカーを含む場合もある。ここで
、不活性化されるマーカーとは異なる、少なくとも１つの更なるマーカーがある
のが望ましい。

【００２７】本発明の好ましいベクターは、所望のポリペプチドを発現するのに使用できる
細胞（しかし、無細胞発現系も使用できる）に導入されてもよい。例えば、ポリ
ペプチドは、バクテリアや酵母のような微生物、培養された昆虫細胞（バキュロ
ウィルス感染していてもよい）、哺乳類細胞（例えばＣＨＯ細胞）あるいは、例
えば乳中にタンパク質を分泌するトランスジェニック動物により生成されうる（
国際特許出願WO８８／００２３９等参照）。グリコシル化が所望される場合は、
真核細胞の発現系が好ましい。

【００２８】特に好適な発現系は、培養の際に分割できる細胞系および培養の際に長期間に
わたって維持されうる細胞系である。これらは、不死細胞系（immortal cell li
nes）と呼ばれることが多い。好ましい細胞系は、哺乳類またはヒト細胞系であ
る。

【００２９】本発明の発現系では、様々な転写および翻訳制御配列が使用できる。これらは
、発現されるべきポリペプチドをコードするコード配列に作動可能に連結するこ
とができる。制御配列はコード配列に対して異種であってよい。例えば、プロモ
ーター、オペレーターおよびエンハンサー配列が提供されてもよく、ポリアデニ
ル化部位、スプライス部位、終止および開始コドンも提供されてもよい。ポリペ
プチドは、はじめにシグナル配列を含むように発現されてもよい。別のシグナル
配列が、別の発現系のために提供される。あるいは、シグナル配列はなくてもよ
い。

【００３０】核酸を操作する技術、ポリペプチドを発現および精製する技術等は、バイオテ
クノロジー分野の当業者に周知である。このような技術は、Sambrookら［分子ク
ローニング（Molecular Cloning）、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory P
ress(1989)];Old&Primrose［遺伝子操作の原理（Principles of Gene Manipulat
ion）、第５版、Blackwell Scientific Publications(1994)］；およびStryer［
生化学（Biochemistry）、第４版、W H Freeman and Company(1995)］のような
標準的な教科書に開示されている。

【００３１】本発明は、医学（ヒトの治療および獣医学的な治療の両方）において有用であ
る。本発明は、既存の疾患治療あるいは予防治療のために使用できる。特に、本
発明は、ポリペプチド発現の欠損に関わる疾患治療に有用である。従って、本発
明は、遺伝子療法、特に単一ポリペプチドの発現に悪影響を及ぼす突然変異によ
り生じる疾患の治療に使用できる（しかし、本発明は一般的に応用可能であり、
複数のポリペプチド発現に悪影響を及ぼす疾患の治療にも使用できる）。遺伝子
療法は、例えばガン、心臓血管疾患、嚢胞性線維症等の治療に用いることができ
る。

【００３２】ポリペプチド発現の欠損に関わる疾患の治療は、このポリペプチドをコードす
る、本発明のＤＮＡ分子、このＤＮＡ分子を含むベクターあるいはこのＤＮＡ分
子あるいはベクターを含む細胞を患者に与えることにより行われる。患者内のポ
リペプチドの発現は、欠損を補うことあるいは少なくとも減少させることに使用
できる。ＤＮＡ分子あるいはベクターは、患者のゲノムに組み込ませることがで
きる。

【００３３】核酸分子あるいはベクターを患者に導入するための好適な技術として、適切な
ビヒクルにおける「裸の」核酸の局所応用が挙げられる。核酸は、リン酸緩衝食
塩水（ＰＢＳ）のような薬学上許容できる賦形剤と共に存在してもよい。ある技
術は粒子衝撃（bombardment）（「遺伝子銃」技術としても既知であり、米国特
許第５，３７１，０１５号に記載されている）に関与する。ここで不活性粒子（
例えば核酸でコートされた金粒子）を発射装置から高圧下で放出することにより
、粒子が受容者（例えば皮膚）を貫通するのに十分な速度で加速される。（本発
明の核酸分子でコートされた粒子は、本発明の範囲内であり、このような粒子を
搭載した装置も同様である。）核酸を直接受容者に投与する他の方法としては、
超音波、電気刺激、エレクトロポレーションおよびマイクロシーディング法が挙
げられる。特に好ましいのは、デリバリのマイクロシーディング方式（the micr
oseeding mode of delivery）である。これは、米国特許第５，６９７，９０１
号に記載されている。

【００３４】本発明の核酸分子はまた、遺伝子療法において有用な、特殊化された送達ベク
ターによって投与されてもよい。遺伝子療法の手法は、例えばVerme et al.,Nat
ure 1997,389:239-242で議論されている。ウィルス系および非ウィルス系の両方
を使用することができる。ウィルスによる系としては、レトロウィルス、レンチ
ウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスウィルスおよびワク
シニアウィルスによる系などが挙げられる。非ウィルスベースの系は、核酸およ
びリポソームベースの系の直接投与を含む。

【００３５】本発明による核酸配列は、形質転換された細胞により投与されてもよい。この
ような細胞には、被験体から採取した細胞が含まれる。本発明の核酸分子は、こ
のような細胞にインビトロで導入され、形質転換された細胞は、後に被験体に戻
すことができる。非ベクター核酸分子が導入されうるので、この核酸分子はベク
ターとして細胞に導入される必要はない。このような分子の中には、相同的組換
えにより、細胞内に既に存在する核酸に組み込まれるものもある。所望ならば、
形質転換された細胞は、インビトロで成長させてもよく、１以上の、その結果生
じる細胞を、本発明で使用してもよい。細胞は、患者の適切な部位で、既知の外
科的あるいは顕微外科的技術（組織移植、マイクロインジェクション等）により
提供されうる。

【００３６】ポリペプチドの発現における欠損を治療する他の方法は、転写されうるＤＮＡ
分子を患者に与えて、本発明の非翻訳領域を提供することからなる。この分子は
、ポリペプチドをコードする患者内に既に存在する配列と作動可能に連結される
ような方法で提供されうる。

【００３７】ポリペプチドの発現における欠損を治療するための更なる方法は、このポリペ
プチドをコードするＲＮＡ分子を患者に与えることからなり、このＲＮＡ分子は
、本発明のＤＮＡ分子を転写することにより生産されうる。このＲＮＡ分子は、
その後インビボで翻訳されて、ポリペプチドを提供することができる。

【００３８】ポリペプチドの発現における欠損を治療するための更なる方法は、ポリペプチ
ドを患者に与えることからなり、このポリペプチドは、本発明の発現系を用いて
生成されたものである。

【００３９】本発明は、ＤＮＡワクチンの提供にも有用である。遺伝子発現カセットを生き
た宿主へ直接注入することにより、多くの細胞が、導入された遺伝子生成物を生
成するための製造所へと形質転換される。これらの送達された遺伝子の発現は、
重要な免疫学的意義を有し、結果として、発現された抗原に対する宿主の特異的
免疫活性化を生じる。組換えＤＮＡ技術により生成されたワクチンは、弱毒化さ
れたあるいは不活性化されたバクテリアやウィルスをベースとする従来のワクチ
ンよりも安全ではあるが、免疫性に乏しいことが多い。ＤＮＡワクチンにおいて
、送達されるべき遺伝子のコード配列の上流に本発明の非翻訳領域を配置するこ
とにより、著しく発現が増加し、従って免疫原性を高めることができる。高度に
保護された熱ショック応答機構により、ポリペプチド発現の増加は、遺伝子が送
達される全ての組織において期待できる。ＤＮＡワクチンは、ウィルス、バクテ
リアおよび寄生性感染（例えば、ジフテリア、マラリア、リーシュマニア症、ト
キソプラスマ症、クリプトスポリジウム症、結核症、ＨＩＶ、ＨＳＶ、インフル
エンザウィルス、Ａ型、Ｂ型およびＣ型肝炎）を防ぐために設計されうるが、ガ
ン、免疫関連疾患の治療あるいは避妊目的にも用いられる。これらの応用は全て
、本発明の範囲内である。

【００４０】医学において使用する際、上述の核酸分子、ベクター、ポリペプチドおよび細
胞は、通常、薬学上許容できる組成物の形態である。１以上の薬学上許容できる
担体は、このような組成物に存在していてもよい。本発明の範囲内にある医薬組
成物は、任意の適切な経路、例えば、経口的（頬、舌下を含む）、直腸、鼻、局
所的（頬、舌下あるいは経皮を含む）、膣あるいは非経口的（皮下、筋内、静脈
内あるいは皮内を含む）経路による投与に適応されてもよい。所望の投与経路に
応じて、異なった薬物送達系が、医薬組成物を投与するのに使用されうる。薬物
送達系は、例えば、Langer(Science 249,1527-1533(1991)）およびIllum&Davis(
Current Opinions in Biotechnology 2,254-259(1991))により記載されている。
要するに、本発明は、ここで議論される疾患のうちの１つあるいはそれ以上を治
療する際に用いられる医薬品を製造するのに使用されうるということが理解され
る。

【００４１】上述の用途に加えて、本発明は、研究のために広く適用可能である。

【００４２】細胞トランスフェクションは、ポリペプチドの機能の研究において、標準的に
用いられる技術である。更に、多くの細胞スクリーニングが、所与のポリペプチ
ドを発現するように、トランスフェクトされた細胞で行われる。この技術は、レ
ポーター（例えば、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール−アセチル−トラン
スフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ）を用いて、プロモーターの機能を研究す
るのにも使用される。本発明の非翻訳領域を、レポーター遺伝子のコード配列の
上流に配置することにより、目的のポリペプチド発現が著しく増加する。従って
、このような実験の感度を高めることができる。

【００４３】高ポリペプチド発現は、大量の所与のポリペプチドが合成される必要のある、
多くの他の研究応用においても有用である。例えば、構造の研究（結晶学、ＮＭ
Ｒ等）、抗体あるいはそのフラグメント（例えば、精製あるいは結合の研究にお
いて使用されうる）の生成あるいは高スループットスクリーニングに有用である
。

【００４４】本発明は、診断目的にも有用である。例えば、本発明は、特定の疾患に関連す
る部分の存在を診断するのに有用な抗体あるいはそのフラグメントの提供の増強
に使用されうる。ここで本発明は、添付の図面を参照して、例によってのみ説明
される。

【００４５】以下の配列を参考のために記載する。これらは、様々な種からのｈｓｐ７０
５’ＵＴＲ配列を示す。

【００４６】

【００４７】

【００４８】この配列はGenbankデータベース（ｇ４１４９７４）においてのみ利用可能で
ある。

【００４９】以下参照の目的で、ヒトｈｓｐ７０Ａ５’ＵＴＲと様々な他の種由来のｈｓ
ｐ７０５’ＵＴＲとの、およびヒトＨＳＰ７０Ｂ５’ＵＴＲとの配列同一性
を示す。

【００５０】 var/tmpweb/analseq/al9179/s1:215nt ＡＬＩＧＮは二つの配列の包括的な整列を計算する。 version 2.0uPlease cite:Myers & Miller, CABIOS(1989)4:11-17 ヒト２１５ヌクレオチド対ラット２１７ヌクレオチドスコアリングマトリックス：ＤＮＡ、ギャップペナルティー：−１６／−４４９．２％同一；包括的整列スコア：−１０２

【００５１】ＤＮＡへのマトリックスをリセットする。 /var/tmpweb/analseq/al10142/s1:215nt ＡＬＩＧＮは二つの配列の包括的な整列を計算する。 version 2.0uPlease cite:Myers & Miller, CABIOS(1989)4:11-17 ヒト２１５ヌクレオチド対ニワトリ１１１ヌクレオチドスコアリングマトリックス：ＤＮＡ、ギャップペナルティー：−１６／４３２．７％同一；包括的整列スコア：−３４９

【００５２】ＤＮＡへのマトリックスをリセットする。 /var/tmpweb/analseq/al10710/s1:215nt ＡＬＩＧＮは二つの配列の包括的な整列を計算する。 version 2.0uPlease cite:Myers & Miller, CABIOS(1989)4:11-17 ヒト２１５ヌクレオチド対マウス２１８ヌクレオチドスコアリングマトリックス：ＤＮＡ、ギャップペナルティー：−１６／−４４９．６％同一；包括的整列スコア：−３９

【００５３】ＤＮＡへのマトリックスをリセットする。 /var/tmpweb/analseq/al10998/s1:215nt ＡＬＩＧＮは二つの配列の包括的な整列を計算する。 version 2.0uPlease cite:Myers & Miller, CABIOS(1989)4:11-17 ヒト２１５ヌクレオチド対ミドリザル１８０ヌクレオチドスコアリングマトリックス：ＤＮＡ、ギャップペナルティー：−１６／−４６９．３％同一；包括的整列スコア：４０３

【００５４】

【実施例】材料細胞培地（BMEおよびMEM）、ペニシリン、ストレプトマイシン、トリプシン−
EDTA溶液、ベルセン(versene)、非必須アミノ酸、および制限酵素は、Gibco, Li
fe Technologies, Inc.から得た。ウシ胎児血清（熱不活性化）はHycloneから得
て、培養フラスコ（TPP T150）および６０mm培養皿(Falcon)はBecton Dicksonか
ら購入した。プラスミドは、Promegaから得た。HepG2、Hep3B、HEK293、およびW
I-38細胞系は、American Type Culture Collectionから得た。

【００５５】方法プラスミド構築物 HSP70レポーターベクターは、ホタルルシフェラーゼアッセイについてはpGL3
プロモーターベクタープラスミドを用いて生成し、クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）アッセイについてのpCAT3プロモーターベクタ
ープラスミドは、PROMEGAから購入した。ヒトHS70プロモーター、ヒトHSP70 5'U
TRおよび3'UTRは、ヒトゲノムバンク(Clontech)からＰＣＲにより増幅した（Adv
antage GC genomic PCR kit、Clontech）。オリゴヌクレオチドは、ヒトhsp70A
遺伝子からデザインした(Hunt C. And Morimoto, R.I. (1985) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 82, 6455-6459)(Genbank: g184416)。

【００５６】ＰＣＲ反応のオリゴヌクレオチドのデザインに用いたヒトHsp70 5'UTRおよび
領域（太字）の配列：

【化４】

【００５７】ヒトGrp78 5'UTRについては、プライマーをTing J. and Lee A.S. (1988) DNA
(4) 275-278によって公表された配列を用いてデザインした(GenBank: g183644)
。

【００５８】 5'UTRはHind IIIとNco I部位の間に挿入し、HSP70プロモーターはBgl IIとNco
I部位との間に挿入した。ヒトHsp70 3'UTRは、XbalとBamH1部位との間に挿入し
た。

【００５９】ジシストロン構築物は、pCl-neo (PROMEGA)を用いて生成した。Hsp70 5'UTR-
ルシフェラーゼまたはFMDV-IRES-ルシフェラーゼは、EcoR I部位でクローニング
した。

【００６０】総ての構築物は、配列をチェックした。

【００６１】細胞培養条件 HepG2およびWI-38細胞系を、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプト
マイシン−グルタミンを補足したＢＭＥに保持した。HepG2細胞については、培
地に１％非必須アミノ酸、１％ナトリウムを補足した。Hep3BおよびMEK293を、
１０％ウシ胎児血清(Hyclone)および１％ペニシリン−ストレプトマイシン−グ
ルタミンを補足したＭＥＭ(Gibco Life Technologies, Inc)に保持した。細胞は
、５％ＣＯ_２を含む加湿空気中に３７℃で保持した。

【００６２】一過性トランスフェクション HepG2、Hep3B、293、およびWI-38細胞を、リン酸カルシウム共沈法を用いて、
上記構築物およびルシフェラーゼアッセイについては内部コントロールpRL-TKベ
クターまたはＣＡＴアッセイについてpSVe-βGalベクターで一過性トランスフェ
クションを行った。

【００６３】レポーター遺伝子活性の定量レポーター遺伝子活性を、トランスフェクションの４８時間後に定量した。熱
ショック実験では、トランスフェクションの４８時間後に、細胞を４２℃で４０
分間熱ショックを加え、次に３７℃で４時間保持した後、ルシフェラーゼ活性を
測定した。

【００６４】ルシフェラーゼ活性を、Dual Luciferase Assay (Promega)を用いて定量した
。値は、pRL-TKから発現したレニラルシフェラーゼ活性で規格化した。ＣＡＴ活
性は、pSVe-βGalから発現したβ−ガラクトシダーゼで規格化した。

【００６５】ＣＡＴｍＲＮＡの定量 ^３３ＰＣＡＴプローブは、製造業者のプロトコールに従ってMaxiscript^（商
^標）：イン・ビトロ転写キット(Ambion)を用いて線形化したpTRI-CATベクター（
CAT Direct^（商標）：ＣＡＴｍＲＮＡ検出キット、Ambion）で合成した。

【００６６】コンフルエンスまでトランスフェクションした細胞を、リン酸緩衝食塩水（PB
S）で洗浄した。細胞を、TRIZOL（Gibco, Life Technologies, Inc）中で溶解さ
せた。総ｍＲＮＡを、クロロホルム／イソアミルアルコール２４：１v/vを用い
て抽出した。総ｍＲＮＡを、等容のイソプロパノールでペレット化した。ペレッ
トを７０％冷エタノール溶液で洗浄した後、Direct Protect^（商標）キット（Ly
sate Ribonuclease Protection Assay、Ambion）のリーシス緩衝液で可溶化した
。

【００６７】ＣＡＴｍＲＮＡは、製造業者のプロトコールに従ってDirect Protect（商標）
キット(Ambion)を用いる溶解産物リボヌクレアーゼ保護アッセイ(lysate ribonu
clease protection assay)によって定量した。

【００６８】保護した断片を８Ｍ尿素を含む５％ポリアクリルアミドゲルに溶解し、放射能
をPhosphorimager (STORM, Molecular Dynamics)を用いて定量した。

【００６９】例１：HSP70プロモーターによって行ったルシフェラーゼレポーターの発現に対
するヒトHSP70ｍＲＮＡの5'UTRの効果（図１）ヒトHSP70プロモーターを、5'UTRの非存在下または存在下でホタルルシフェラ
ーゼ遺伝子のコード配列の上流でクローニングした（それぞれ、プラスミドＡお
よびＢ）。HepG2細胞をこれら二種類のキメラ構築物でトランスフェクションし
、ルシフェラーゼのレベルを通常条件または４２℃での３０分間の熱ショック後
と比較した。ヒトHSP70ｍＲＮＡの5'UTRが存在するだけで、ルシフェラーゼの発
現レベルが著しく増加した。いずれの条件下でも（通常および熱ショック）、5'
UTRの存在下では同様なｇ倍の刺激が見られ、このルシフェラーゼ発現の増加は
この5'UTRに固有のものであり、ストレスとは無関係であることを示した。従っ
て、ヒトHsp70 5'UTRを用いて、通常の細胞条件で多種多様な遺伝子の発現を高
めることができることを期待することができる。

【００７０】例２：様々な細胞系でのルシフェラーゼの発現に対するヒトHSP70ｍＲＮＡの5'U TRの効果（図２） HSPは至る所に存在するタンパク質であり、熱ショック応答は高度に保存され
た機構である。従って、ヒトHsp70 5'UTRの同様な効果が他の細胞系で期待され
た。三種類の他のヒト細胞系を、同一構築物でトランスフェクションした。Hep3
Bは、HepG2と極めて近い肝細胞系である。試験した二種類の他の細胞系であるWI
-38およびHEK293は、異なる起源のものである。WI-38は胎児肺組織由来の繊維芽
細胞様細胞系であり、HEK293は形質転換した一次腎細胞系である。図２に示され
るように、ヒトHSP70ｍＲＮＡの5'UTRは、試験した三種類の細胞系でルシフェラ
ーゼ遺伝子の発現を増加した。Hep3B細胞で5'UTRの存在下では、約９倍の刺激が
得られ、HepG2で見られた刺激に匹敵した。WI-38およびHEK293細胞では、5'UTR
の効果は少なかった（約５倍の刺激）が有意のままであり、この5'UTR効果は細
胞の種類に特異的ではないことを示していた。従って、この配列は、遺伝子が様
々な細胞で発現される広汎な用途のスペクトルに用いることができると予想する
ことができる。

【００７１】例３：クロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼｍＲＮＡの翻訳効率に対するヒトHSP70 5'UTRの効果（図３） HSP70 5'UTRの存在下でのルシフェラーゼ発現のレベルが一層高くなることは
、ルシフェラーゼｍＲＮＡ（転写またはｍＲＮＡ安定性の増加による）のレベル
が一層高くなることによって、またはルシフェラーゼｍＲＮＡの翻訳が一層効率
的になることによって説明することができる。これらの二種類の可能な機構を識
別するため、HSP70 5'UTRの非存在下または存在下でのｍＲＮＡレベル（それぞ
れプラスミドＨおよびＩ）をトランスフェクションしたHepG2細胞で測定した。
この実験では、ＣＡＴ遺伝子をレポーターとして用い、SV40によって行った。ル
シフェラーゼ遺伝子以前に観察されたように、ＣＡＴ遺伝子のコード配列の上流
でクローニングしたHSP70 5'UTRが存在すると、ＣＡＴ活性が増加した（約１０
倍）。更に、HSP70 5'UTRの存在下では、ＣＡＴｍＲＮＡレベルに有意な変化は
なく、更に高いレベルのＣＡＴが得られた。この結果は、HSP70 5'UTRが、用い
たレポーター遺伝子またはプロモーターとは無関係にｍＲＮＡの翻訳効率を増加
することを示している。従って、翻訳効率を増加するこのヒトHSP70 5'UTR特性
は広汎な種類の遺伝子およびプロモーターについて得ることができ、広範囲の用
途に用いることができると予想することができる。

【００７２】例４：SV40 3'UTRの存在下でのルシフェラーゼの発現に対するヒトHSP70 5'UTR
の効果（図４）市販のプラスミドにおけるレポーターコード配列の下流に含まれる3'UTRは、S
V40ラージＴ抗原の3'UTRであることが多い。このウイルス3'UTRは、トランスフ
ェクション実験においてレポーターを高レベルで発現させることが知られている
。ヒトHSP70 5'UTRがこの非相同SV40 3'UTRを用いてルシフェラーゼの発現を増
加させることができるかどうかを決定するため、ヒトHSP70 5'UTRの存在または
非存在下でSV40 3'UTRを含む二種類のベクターを生成させた（それぞれプラスミ
ドＣおよびＤ）。予想されるように（図４）、SV40ラージＴ抗原3'UTRは、試験
した三種類の細胞系においてルシフェラーゼ遺伝子を高レベルで発現させた。ヒ
トHSP70 3'UTRで得た発現のレベル（図１および２）と比較して、このウイルス3
'UTRの存在下では５〜１０倍高レベルのルシフェラーゼが観察された。しかしな
がら、ヒトHSP70 5'UTRの存在下では、試験した三種類の細胞系でルシフェラー
ゼ発現のレベルを２倍だけ増加することができた。

【００７３】例５：翻訳に対する効果は総てのストレスタンパク質5'UTRの共通の特性ではな
い（図５） HSP70 5'UTRの効果を別のストレスタンパク質5'UTRと比較するため、ヒトGRP7
8 5'UTRを用いた。ヒトGRP78 5'UTRは、長さがHSP70 5'UTRと同様であり（HSP70
について２１５bpであるのに対して２２１bp）、それらはいずれも同様にＧ＋Ｃ
濃度が高い（６３％）。MFOLDプログラム(Zuker M. and Jacobson A.B. (1995)
Nucleic Ac. Res. (23) 2791-2798)を用いてこれら二種類の5'UTRの安定性を計
算し、同様な高ΔＧ値が得られ（約６０kCal/モル）、これらに種類の5'UTRは比
較的高安定性の構造物を形成することを示唆している。従って、GRP78 5'UTRはH
SP70 5'UTRに匹敵する興味深い5'UTRであった。図５に示されるように、この5'U
TR（プラスミドＧ）はルシフェラーゼ遺伝子の発現のレベルを変更しない。この
結果は、HSP70 5'UTRで得た効果が全ストレスタンパク質5'UTRの共通の特性では
ないことを示している。

【００７４】例６：Hsp70 5'UTRはインターナルリボソームエントリーサイト（IRES）として
機能しない（図６） IRES構造物は、ピコルナウイルスｍＲＮＡの5'UTR領域並びに少数の真核細胞
ｍＲＮＡに見いだされる(Sachs A.B. et al (1997) Cell (89) 831-838)。これ
らの構造物により、ｃａｐと無関係なタンパク質が翻訳される。IRES構造を明ら
かにするのに重要な実験は、ユニークプロモーターによって調節される二種類の
オープンリーディングフレーム（ORF）の間でクローニングした推定IRESを有す
るジシストロンプラスミドの使用である。配列がIRES構造を含むときには、第二
のORFは上流の第一のORFの存在とは無関係に翻訳される。このようなプラスミド
は、ヒトHsp70 5'UTR（プラスミドＪ）または古典的IRES構造（口蹄疫ウイルスI
RES（FMDV-IRES））（プラスミドＫ）を用いて、または第一のORFとルシフェラ
ーゼ遺伝子（第二のORF）との間の任意の配列（プラスミドＬ）なしで得られた
。図６に示されるように、FMDV-IRESは、ジシストロンの関係においてルシフェ
ラーゼの翻訳を開始することができる。対照的に、ヒトHsp70 5'UTRを用いてま
たはルシフェラーゼコード配列の上流の任意の配列なしでは、ルシフェラーゼ活
性は得られない。この結果は、ヒトHsp70 5'UTRはIRES構造を含まないことを示
している。

【００７５】例７：イン・ビトロでのオボアルブミンの発現に対するHSP70要素の効果 HSP70 5'UTR要素の翻訳増強特性がＤＮＡワクチン接種に有利であるかどうか
を決定するため、モデル抗原ニワトリオボアルブミンについての一連の発現プラ
スミドを構築した。これらのプラスミドは総て、ベクターpCI（Promega、サウザ
ンプトン、英国）由来の共通主鎖を組込んでいる。このプラスミドにおける重要
な要素は、ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期プロモーターであり、これは
挿入された抗原、SV40ポリアデニル化および転写ターミネーター配列、およびア
ンピシリン耐性遺伝子を発現する。

【００７６】ニワトリオボアルブミン遺伝子(Genbank登録V00383)の全コード領域をコード
するｃＤＮＡカセットをプロモーターとSV40要素との間のプラスミドに挿入して
、povarepを作成する。オボアルブミン遺伝子翻訳開始コドンの上流にATG配列を
含む第二の変異体を調製した（pOvaOLD）。この変更により、povarepと比較して
povaold由来の転写体における翻訳効率が著しく抑制される。HSP70の5'UTR要素
を両ベクターにクローニングし、phspovarepおよびphspovaoldを作成した。

【００７７】四種類総ての構築物の配列を確認した後、四種類の異なる細胞系（HepG2、293
、Hela、およびCHO細胞）にトランスフェクションして、発現レベルを評価した
。トランスフェクション効率を補正するため、一定量のルシフェラーゼ発現プラ
スミド（pGL3-コントロール；Promega）をそれぞれのトランスフェクションにお
いて加えた。培養上清をトランスフェクションの４８時間後に集め（チェック）
、ルシフェラーゼ活性およびオボアルブミン顔料についてELISAによって分析し
た。

【００７８】それぞれの試料中のオボアルブミン産生を、ルシフェラーゼ活性を用いてトラ
ンスフェクション効率について規格化した。相対的タンパク質発現レベルは、HS
P70要素の存在下および非存在下で見られるレベルの比として表される（下表１
を参照されたい）。pOvaOLDおよびpHSPOvaOLD構築物については、生成したオボ
アルブミンのレベルが分析の検出限界以下であったため、有意な結果は得られな
かった。しかしながら、pHSpOvaREPは、四種類総ての細胞系においてpOvaREPよ
り一層有意にオボアルブミンを産生した。HSP70要素の効果は、２９３細胞系で
最も顕著であった。

【００７９】

【表１】

【００８０】例２：HSP70 5'UTR要素を含むオボアルブミン発現プラスミドを用いるマウスの
免疫化例１に記載した四種類のプラスミドを用いてバイオリスティック遺伝子送達に
よって雌Balb/cマウスをワクチン接種した（REF-PJV特許明細書）。動物を６群
に分けて、０日および４３日目にプラスミド０．５ｇを２回投与した。血清試料
を、１日前、２１日、４２日、５７日および７１日目に採取した。特異的抗オボ
アルブミンIgG力価は、ELISAによって測定した。

【００８１】四種類総てのプラスミドはプライミング用量に対して同様な応答を誘発し、２
１日および４２日の時点で群間には見かけの差は見られなかった。しかしながら
、免疫化の４３日後には、有意差が現れた（表２）。HSP70 5'UTR要素の包含に
より、発現のよくないpOvaOLDおよび最適発現のpOvaREPのいずれに対しても免疫
応答が高くなった。これらのデータは、HSP70 5'UTR要素がＤＮＡワクチン化の
効果を高めるのに有用であることを示唆している。

【００８２】

【表２】

【００８３】従って、本発明は、治療、好ましくは例えば粒子衝撃によって投与するときの
治療または予防的ワクチン接種での使用、最も好ましくは免疫応答の増加に使用
するための本発明によるＤＮＡ分子も提供する。

【００８４】本発明は、本発明によるＤＮＡ分子の有効量を投与することを含んでなる治療
または予防的ワクチン接種の方法も提供する。好ましくは、ＤＮＡ分子は粒子衝
撃によって投与され、最も好ましくは免疫応答の増加に使用される。

【００８５】定義疑念を回避するために、本明細書で用いられるある種の用語を、下記において
更に定義する。同様の用語は、それに応じて解釈すべきである。

【００８６】「ポリペプチド」これは、ペプチド結合によって互いに結合した複数のアミノ酸を有する任意の
残基を意味する。これは、タンパク質およびペプチドを包含する。

【００８７】「約」数値に関連して用いるときには、この用語は値の両側の誤差を考慮している。
好ましくは、誤差は数値の±１０％であり、更に好ましくは±５％である。

【００８８】「配列同一性」本発明の目的に対して、配列同一性は、例えばALIGNプログラム（第２．０版
）を用いることによって決定することができる。これにより、２つの配列の包括
的配列を計算する（Myers and Miller, (1989) CABIOS, 4, 11-17を参照された
い）。ギャップペナルティ：-16/-4。情報については、http://www.infobiogen.
Fr/services/menuserv.Htmlを参照されたい。

【００８９】「実質的な配列同一性」この用語は、所定のポリヌクレオチド配列と少なくとも５０％の配列同一性を
有するポリヌクレオチド配列を包含するのに用いられる。好ましくは、配列同一
性の程度は、少なくとも７５％である。少なくとも９０％、少なくとも９５％ま
たは少なくとも９９％の配列同一性が最も好ましい。

【００９０】「熱ショック」これは、熱ショック応答を誘発するのに十分な温度の増加である。古典的には
、細胞に対して、３７℃から４２℃への移行が、熱ショックを誘発するのに用い
られる。

【００９１】「翻訳効率の増加」これは、活性ポリペプチドを提供するための翻訳が予想されたよりも高度に所
定数のｍＲＮＡ分子から得られることを意味する。

【００９２】所見本発明の上記説明は単に発明を例示したものであり、様々な変更および改質を
特許請求の範囲に記載されている本発明の精神または範囲から離反することなく
行うことができると理解すべきである。

【００９３】好ましくは、本発明の特定の態様に関して任意の特徴を説明する場合には、特
に断らない限り必要な変更を加えて本発明の他の態様に適用されると考えるべき
である。

【００９４】本明細書に引用される総ての文書の内容は、この文書に引用されている総ての
引用文献と同様に、その開示の一部として本明細書に引用される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ヒトＨＳＰ７０プロモーターにより駆動されるルシフェラーゼレポー
ターの発現に対するヒトＨｓｐ７０５’ＵＴＲの効果を示す。ヒトＨＳＰ７０
プロモーターは、５’ＵＴＲ（プラスミドＡおよびＢそれぞれ）の存在あるいは
不存在下、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子のコード配列上流でクローニングされ
た。両プラスミドについて、３’ＵＴＲはＨＳＰ７０３’ＵＴＲであった。Ｈ
ｅｐＧ２細胞は、これら２つのキメラ構造体でトランスフェクトされ、ルシフェ
ラーゼのレベルが、通常の条件下で、あるいは４２℃で３０分間の熱ショック後
に比較された。

【図２】図２は、様々な細胞系におけるルシフェラーゼの発現に対するヒトＨｓｐ７０
５’ＵＴＲの効果を示す。同一の構造体（ＡおよびＢ）が、３つの他のヒト細
胞系（Ｈｅｐ３Ｂ、ＨＥＫ２９３、ＷＩ−３８）においてトランスフェクトされ
、ルシフェラーゼレベルが、通常の細胞培養条件下で比較された。

【図３】図３は、クロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼｍＲＮＡの翻
訳効率に対するヒトＨｓｐ７０５’ＵＴＲの効果を示す。ＳＶ４０プロモータ
ーは、ヒトＨｓｐ７０５’ＵＴＲ（プラスミドＨおよびＩそれぞれ）の存在あ
るいは不存在下、クロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）遺伝子のコード配列上流でクローニングされた。ＨｅｐＧ２細胞は、これら
２つの構造体でトランスフェクトされ、ＣＡＴｍＲＮＡのレベルおよび活性が
測定された。

【図４】図４は、ＳＶ４０３’ＵＴＲの存在下でのルシフェラーゼ発現に対するヒト
Ｈｓｐ７０５’ＵＴＲの効果を示す。Ｈｓｐ７０プロモーターは、Ｈｓｐ７０
５’ＵＴＲ（プラスミドＣおよびＤそれぞれ）の存在あるいは不存在下、ルシ
フェラーゼのコード領域上流でクローニングされ、両プラスミドについて、３’
ＵＴＲはＳＶ４０３’ＵＴＲであった。構造体（ＣおよびＤ）は、３つのヒト
細胞系（ＨｅｐＧ２、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｐ３Ｂ）においてトランスフェクトさ
れ、ルシフェラーゼレベルが、通常の細胞培養条件下で比較された。

【図５】図５は、ルシフェラーゼの発現に対する、ヒトＧｒｐ７８５’ＵＴＲとヒト
Ｈｓｐ７０５’ＵＴＲとの効果の比較を示す。ＳＶ４０プロモーターは、ヒト
Ｈｓｐ７０５’ＵＴＲ（プラスミドＦ）あるいはヒトＧｒｐ７８５’ＵＴＲ
（プラスミドＧ）の存在下あるいは任意の５’ＵＴＲ（プラスミドＥ）の不存在
下、ルシフェラーゼのコード領域上流でクローニングされた。ＨｅｐＧ２細胞は
、これら３つの構造体でトランスフェクトされ、ルシフェラーゼレベルが、通常
の細胞培養条件下で比較された。

【図６】図６は、ジシストロニック（dicistronic）な状況でのルシフェラーゼの発現
に対する、ヒトＨｓｐ７０５’ＵＴＲとＦＭＤＶＩＲＥＳとの効果の比較を
示す。ＣＭＶプロモーターおよび第一のＯＲＦは、ヒトＨｓｐ７０５’ＵＴＲ
（プラスミドＪ）あるいはＦＭＤＶＩＲＥＳ（プラスミドＫ）の存在下、ルシ
フェラーゼのコード配列上流でクローニングされた。ＨｅｐＧ２細胞は、これら
３つの構造体でトランスフェクトされ、ルシフェラーゼレベルが、通常の細胞培
養条件下で比較された。

【図７】図７は、本明細書中で言及されるプラスミドＡ〜Ｌの概略マップである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ４Ｈ０４５Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/50 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者エルブ、ジャン‐クレマン、コストフランス国レ、ジュリ、アブニュ、ド、ケベック、25、ゾーヌ、アンデュストリエル、ド、クルタブフ、サントル、ド、ルシュルシュ、グラクソ、クルタブフ、ラボラトワール、グラクソスミスクライン内 (72)発明者ジョナサン、ヘンリー、エリスイギリス国ハートフォードシャー、スティーブネージ、ガネルズ、ウッド、ロード、グラクソスミスクライン内Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA08 BA31 BA80 CA04 CA11 DA02 EA04 FA02 GA11 HA17 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90Y AA93X AB01 AC14 BA02 BD50 CA24 CA44 CA45 4C084 AA13 BA44 NA10 ZC192 4C085 AA03 BA01 BB23 DD62 GG10 4H045 AA10 AA20 CA40 EA20 EA31 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリペプチドをコードする領域に作動可能に連結された場合にそのポリペプチ
ドの翻訳効率の増加をもたらす非翻訳領域を有するＲＮＡ分子を提供する、転写
可能なＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子が哺乳類Ｈｓｐ７０をコードしないＤ
ＮＡ分子。
【請求項２】ウシｈｓｐ７０プロモーターを含まない、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項３】非翻訳領域が少なくとも１７５ヌクレオチド長である、請求項１または２に記
載のＤＮＡ分子。
【請求項４】非翻訳領域が少なくとも２００ヌクレオチド長である、請求項１〜３のいずれ
か一項に記載のＤＮＡ分子。
【請求項５】非翻訳領域が少なくとも２１５ヌクレオチド長である、請求項１〜４のいずれ
か一項に記載のＤＮＡ分子。
【請求項６】非翻訳領域が５’非翻訳領域である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤ
ＮＡ分子。
【請求項７】ａ）配列【化１】ｂ）ａ）に記載の配列の相補配列、またはｃ）上記ａ）またはｂ）において定義された配列と実質的な配列同一性を有する
配列を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子。
【請求項８】非翻訳領域が−１０ｋＣａｌ／ｍｏｌ未満のΔＧを有する、請求項１〜７のい
ずれか一項に記載のＤＮＡ分子。
【請求項９】配列が−３０ｋＣａｌ／ｍｏｌ未満のΔＧを有する、請求項１〜８のいずれか
一項に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１０】配列が−４０ｋＣａｌ／ｍｏｌ未満のΔＧを有する、請求項１〜９のいずれか
一項に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１１】非翻訳領域が−５０ｋＣａｌ／ｍｏｌ未満のΔＧを有する、請求項１〜１０の
いずれか一項に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１２】ポリペプチドの発現が熱ショック応答である、請求項１〜１２のいずれか一項
に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１３】請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子を転写することにより得る
ことができる、ＲＮＡ分子。
【請求項１４】請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子を含んでなるベクター。
【請求項１５】請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子または請求項１４に記載の
ベクターを含んでなる発現系。
【請求項１６】１以上の細胞を含んでなる、請求項１５に記載の発現系。
【請求項１７】１以上の真核細胞を含んでなる、請求項１６に記載の発現系。
【請求項１８】１以上の哺乳類細胞を含んでなる、請求項１６に記載の発現系。
【請求項１９】１以上のヒト細胞を含んでなる、請求項１６に記載の発現系。
【請求項２０】無細胞発現系である、請求項１５に記載の発現系。
【請求項２１】請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の発現系を用いてポリペプチドを発現
させ、場合によってはそのポリペプチドを精製することを含んでなる、ポリペプ
チドを得る方法。
【請求項２２】熱ショックを受けた発現系を提供する工程を含んでなる、請求項２１に記載の
方法。
【請求項２３】請求項２１または２２に記載の方法により得られたポリペプチド。
【請求項２４】ポリペプチドをコードする請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子
、前記ＤＮＡ分子を含んでなるベクター、または前記ＤＮＡ分子またはベクター
を含んでなる細胞を患者に与えることを含んでなる、ポリペプチドの発現の欠損
を治療する方法。
【請求項２５】請求項１〜１２のいずれか一項に記載の非翻訳領域を与える転写可能なＤＮＡ
分子を患者に与えることを含んでなるポリペプチドの発現の欠損を治療する方法
であって、前記分子が前記ポリペプチドをコードする患者に既に存在する配列に
作動可能に連結されるように提供される方法。
【請求項２６】請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子を含んでなるまたは前記Ｄ
ＮＡ分子を含むベクターを含んでなるワクチンを患者に与えることを含んでなる
、高免疫応答を与えることにより治療可能な疾患（例えば、感染症）を治療する
方法。
【請求項２７】ＤＮＡ分子またはベクターが患者のゲノムに組み込まれる条件で提供される、
請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２８】細胞が患者内に維持される条件で提供される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】細胞が、患者から単離され、かつ患者に再導入される前に改変された細胞であ
る、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】請求項１３に記載のＲＮＡ分子または請求項２３に記載のポリペプチドを患者
に与えることを含んでなる、ポリペプチドの発現の欠損を治療する方法。
【請求項３１】請求項１〜１２に記載のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子、請求項１３に記載
のＲＮＡ分子、請求項２３に記載のポリペプチド、または請求項１６〜１９のい
ずれか一項に記載の細胞を含んでなる、薬学上許容される組成物。
【請求項３２】請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子または前記ＤＮＡ分子を含
むベクターを含んでなるワクチン。
【請求項３３】ポリペプチドの高発現を達成するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記
載のＤＮＡ分子、請求項１３に記載のＲＮＡ分子、請求項１４に記載のベクター
、または請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の発現系の使用。
【請求項３４】添付した図面および実施例に関し実質的に記載された発明。
【請求項３５】治療のために使用される、請求項１〜１２に記載のいずれか一項に記載のＤＮ
Ａ分子。
【請求項３６】治療用または予防用ワクチン接種に使用される、請求項３５に記載のＤＮＡ分
子。
【請求項３７】粒子衝撃（particle bombardment）により投与される、請求項３５または３６
に記載のＤＮＡ分子。
【請求項３８】高免疫応答を達成するために使用される、請求項３５、３６、または３７に記
載のＤＮＡ分子。
【請求項３９】請求項１〜１２に記載のＤＮＡ分子の有効量を投与することを含んでなる、治
療用または予防用ワクチン接種方法。
【請求項４０】ＤＮＡ分子が粒子衝撃により投与される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】高免疫応答を達成するために使用される、請求項３９または４０に記載の方法
。