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JP2002536977A - ポリマーの製法 - Google Patents

ポリマーの製法

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JP2002536977A
JP2002536977A JP2000599868A JP2000599868A JP2002536977A JP 2002536977 A JP2002536977 A JP 2002536977A JP 2000599868 A JP2000599868 A JP 2000599868A JP 2000599868 A JP2000599868 A JP 2000599868A JP 2002536977 A JP2002536977 A JP 2002536977A
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JP
Japan
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nucleic acid
sequence
synthesis
dna
reaction
Prior art date
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Pending
Application number
JP2000599868A
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English (en)
Inventor
エフ シュテーラー ペーア
エフ シュテーラー コード
ミュラー マンフレート
Original Assignee
フェビット フェラリウス バイオテクノロジー ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority claimed from PCT/EP1999/006316 external-priority patent/WO2000013017A2/de
Priority claimed from DE19957116A external-priority patent/DE19957116A1/de
Application filed by フェビット フェラリウス バイオテクノロジー ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング filed Critical フェビット フェラリウス バイオテクノロジー ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング
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Abstract

(57)【要約】 本発明は次の工程：（ａ）複数の個々の反応領域を含有する表面を有する担体を製造する工程、（ｂ）それぞれ異なる塩基配列を有する核酸フラグメントを複数の個々の反応領域で部位分解合成する工程、および（ｃ）個々の反応領域から核酸フラグメントを剥離する工程、を包含する、ポリマー、特に選択自由な配列の合成核酸二本鎖の製法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明はポリマー、特に選択自由な配列の合成核酸二本鎖の製法に関する。
【０００２】 発明の背景 遺伝子工学ともしばしば呼ばれる、ＤＮＡ−組換え操作の発展による、遺伝要
素、例えば遺伝子フラグメント、全遺伝子又は制御領域のマニピュレーションお
よび構築は、遺伝子治療、分子医学（基礎研究、ベクター開発、ワクチン、再生
等）の領域における遺伝子工学的方法およびその更なる発展に対する特別な要求
に導いた。重要な適用領域は作用物質の開発、薬剤開発の範囲における作用物質
の生産、組合せのバイオ合成（抗体、エフェクター、例えば成長因子、神経伝達
物質等）、バイオテクノロジー（例えば、酵素デザイン、ファーミング（pharmi
ng）、生物学的製法、バイオリアクター等）、診断薬（バイオチップス、レセプ
ター／抗体、酵素デザイン等）および環境テクノロジー（特殊化した、または適
合させた微生物、生産法、衛生化、センサー等）でもある。
【０００３】 公知技術 多くの方法、特に酵素により支持された方法、は異なる目的のために照準を定
めたＤＮＡのマニピュレーションを可能にする。
【０００４】 これらの方法は、全て現存する遺伝材料を使用しなければならない。このこと
は一方では、十分に定義されているが、一方では一種の“ユニットシステム”で
あり、その都度存在しかつ容易に修飾可能な要素の限られた量の可能な組合せの
みを可能にする。
【０００５】 この際、提供される遺伝材料の照準を合わせた変更を可能にするこの組合せ要
素の一つの形において、完全合成ＤＮＡは従来あまり重要な役割を果たさなかっ
た。
【０００６】 従来公知の全ての方法は、分子生物学的および特に遺伝子工学的実験の工程、
例えばＤＮＡの単離、マニピュレーション、好適な標的細胞への移入、増殖、新
たな単離等を、多くの場合複数回実施しなければならないので、多くの作業を費
やし、この作業に相当する時間を必要とする。実施する作業工程の多くは十分に
自動化および迅速化することができず、相当する作業は時間がかかりかつ集中的
な作業であることに変わりがない。遺伝子生産物の機能調査および特徴付けを予
め行わなければならない、遺伝子の単離の際に、情報流は多くの場合、単離した
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）からｃＤＮＡおよび相応する遺伝子ライブラリーを介して、
かつ費用のかかるスクリーニング法を介して個々のクローンに流れる。これは探
索し、かつその中にクローニングしたＤＮＡをしばしば不完全な形で含有し、こ
うして更なるスクリーニング法等を引き続き行う。
【０００７】 更に、前記のＤＮＡ−フラグメントの組換えは、非常に限定された柔軟性を有
し、かつ記載された煩雑な作業と共に非常に僅かな最適化を可能にする。遺伝学
、機能的なゲノミックおよびプロテオミック、すなわち遺伝子産物の作用の研究
における多様性および複雑さに直面して、まさにそのような最適化が近代生物学
の更なる発展に関しての困難な点である。
【０００８】 慣用の方法は酵素法による組換えである（インビトロ）：この際、ＤＮＡ−要
素（単離したゲノムＤＮＡ、プラスミド、アンプリコン、ウィルスゲノムまたは
細菌ゲノム、ベクター）を最初に相当する制限酵素で切断し、定義された末端を
有するフラグメントにする。これらの末端の性質により生じたフラグメントを新
たに組み合わせることができ、（同様に酵素的に）結合させてより大きなＤＮＡ
−要素にすることができる。ＤＮＡの増殖の目的で、クローニングベクターとし
て作用するプラスミド中でこのことはしばしば生じる。
【０００９】 組換えＤＮＡは一般に、好適な生物中でクローナルに増殖させなけらばならず
（クローニング）、この時間のかかる工程および相当する方法による単離の後に
新たにマニピュレーション、例えば組換えを行わなければならない。しかしなが
ら、この方法においては制限酵素の切断位により制限される：それぞれの酵素は
（二本鎖）ＤＮＡに関して１つの特異的な配列を認識し、この際その長さはそれ
ぞれの酵素に依存して３から１２個のヌクレオチド塩基を有しており、こうして
それぞれのＤＮＡ−要素上に統計的な分布に従って特定の数の切断位が存在し、
そこでＤＮＡ−鎖は切断される。この際、組換えにとって重要であるのは、操作
するＤＮＡの定義されたフラグメントへの切断であり、引き続きこのフラグメン
トは所望の配列に一緒にされる。１０〜３０キロ塩基対（ｋｂｐ）の切断すべき
ＤＮＡの境界領域までこの組換え技術は十分に異なりかつ特異的な酵素を提供す
ることができる。更に、前操作および市販品の提供者により、組換えＤＮＡを取
り込み、クローニング（およびこれにより増殖および選択）を可能にする、相当
するベクターが提供される。そのようなベクターは、効果的な組換えおよび統合
のために適当な切断位を有する。
【００１０】 しかしながら、マニピュレーションするＤＮＡの長さが長くなるほど、統計的
な法則から多くのかつ不所望な切断位の問題は増える。６個のヌクレオチド塩基
の酵素認識配列において、４０００塩基対当たり統計的平均において１つの切断
位（４６）および８個のヌクレオチド塩基において６５０００当たり（４８）で
ある。従って、大きなＤＮＡ−要素（例えばウィルスゲノム、染色体）のために
は、制限酵素での組換えは、あまり好適ではない。
【００１１】 更に、細胞中での相同的組換えによる組換えは公知である：この際、大きなＤ
ＮＡ−要素は、組換えすべき要素上に同じ配列の断片の存在において相同的組換
えの自然の工程を介して、新たに一緒にされ、マニピュレーションされる。この
組換え法は制限酵素法におけるより、著しく間接的であり、更に制御困難である
。この方法はしばしば制限酵素を用いる前記の組換えより、明らかに低下した収
量を示す。
【００１２】 第２の著しい欠点は、一方では最初に存在していなくてはならず、他方ではそ
れぞれのシステムにとって非常に特異的である、同じ配列の断片に限定されるこ
とである。相応する配列の所定の導入は著しい困難を有している。
【００１３】 更に、複製すべき断片の限られた領域を短い完全合成ＤＮＡ−オリゴマー（い
わゆるプライマー）によりＤＮＡ−複製の開始を設定することにより、ＤＮＡ（
強い複製を含む）の酵素的合成を可能にするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）も
公知である。このためにはこれらの両側の領域は公知でなければならず、その間
にある領域のために特異的でなくてはならない。しかしながら、ポリメラーゼは
ストランドの複製においてそれぞれの酵素に依存する頻度で誤ったヌクレオチド
を構築するので、出発配列の一定の粗悪化の危険性が常に存在する。多くの適用
において、この潜行する粗悪化は非常に妨害的である。化学合成においては、プ
ライマー中に配列、例えば前記の制限切断位、を導入することができる。このこ
とは全配列の（限定された）マニピュレーションを可能にする。その間に、複製
した領域は約３０Ｋｂｐの領域にまでなるが、このＤＮＡ−分子の最も大きな部
分は予め存在するＤＮＡのコピーである。
【００１４】 このプライマーは自動固相−合成を用いて製造され、かつ広く入手可能である
が、しかしながら従来の合成自動装置の構成は、ＰＣＲには必要でないほど多量
すぎるプライマー−ＤＮＡ（μｍｏｌ−配合物）の製造を条件とし、一方変異の
多様性は制限されたままである。
【００１５】 合成ＤＮＡ−要素 ６０年代のコーラナ（Khorana:特に、Shabarova: Advanced Organic Chemistr
y of Nucleic Acids, VCH Weinheim;）のパイオニア的な仕事以来、化学合成Ｄ
ＮＡ−分子から遺伝学的もしくはコードする配列を有する二本鎖ＤＮＡに一緒に
するための配合物が繰り返し記載されている。この際公知技術は核酸から構成さ
れた約２ｋｂｐまでの長さの遺伝要素である。核酸およびペプチドの化学的固相
合成は自動化されている。相応する方法および装置は、例えばＵＳ４３５３９８
９およびＵＳ５１１２５７５に記載されている。
【００１６】 短いオリゴヌクレオチドからの二本鎖ＤＮＡの構築は、２つの方法により行わ
れる（Holowachuk et. al., PCR Methods and Applications, Cold Spring Harb
or Laboratory Press）：１つは個々の一本鎖核酸（好適な配列）の合成、相補
性領域をハイブリダイゼーションすることによる並置および、例えばリガーゼに
よる分子の残りの部分の結合による全二本鎖の合成が行われる。これに対して、
個々の一本鎖の核酸としての端部に重なる領域の合成、ハイブリダイゼーション
することによる並置、一本鎖領域の酵素（ポリメラーゼ）による充填および残り
の分子の結合による合成の可能性もある。
【００１７】 両方の方法において遺伝要素の全長は、一方では肉眼的カラム−合成における
核酸のための煩雑さおよび製造費用により、および他方では肉眼的カラム−合成
とは異なる理論により製造し、次いで一緒にした核酸は２〜３０００のヌクレオ
チド塩基に限定されてしまう。こうして、ＤＮＡ−組換え技術と同じ大きさの範
囲がカバーされる。
【００１８】 総括すると、公知技術は理論的な操作と同様にして、存在するもの（この場合
核酸の形の遺伝材料）を調査し、かつ組み合わせる（組換え操作）措置を記載さ
している。次いで、そのような組換え実験の結果を調べて、これから特に使用し
た要素およびその組み合わせた作用に関して、逆推論を可能にする。従って、こ
の措置は（点）分析的および組み合わせ的措置として記載されている。
【００１９】 こうして、公知技術は全ての任意の組合せの系統的な実験を可能にしていない
。組み合わせた要素の変更はほとんど不可能である。変更の系統的な試験は不可
能である。
【００２０】 本発明の対象およびこれにより解決した課題 すでに存在する核酸フラグメントを使用することなしに、デジタル方式の遺伝
情報（標的配列、データバンク等）の生化学的遺伝情報（核酸）への直接的な変
換法が達成されるべきである。
【００２１】 従って、本発明の対象はポリマーの製法であり、その際、平行な合成工程によ
り、担体上に多数のオリゴマー構成ブロックを構築し、担体から剥がし、かつポ
リマーの構築のために相互に接触させる。少なくとも３００ｂｐ、特に少なくと
も１０００ｂｐの長さを有する二本鎖核酸−ポリマーを合成するのが有利である
。核酸−ポリマーは有利に遺伝子、遺伝子クラスター、染色体、ウィルスゲノム
および細菌ゲノム、またはこれらの断片から選択されている。ポリマーの構築の
ために使用するオリゴマー構成ブロックは有利に５〜１５０、特に有利に５〜３
０モノマー単位である。連続する工程においてそれぞれ部分的に相補性のオリゴ
ヌクレオチド構成ブロックを担体から剥がし、ハイブリダイゼーション条件下に
相互に、もしくはポリマー中間生成物と接触させる。好適なポリマーのその他の
例は核酸類似体およびタンパク質である。
【００２２】 特に有利な実施形において、本発明は任意に選択可能な配列を有する合成ＤＮ
Ａの製法、および こうして配列中に含有されれる任意の公知または新規機能性遺伝要素に関する。
この方法は、次の工程： （ａ）複数の個々の反応領域を含有する表面を有する担体を製造する工程、 （ｂ）それぞれ異なる塩基配列を有する核酸フラグメントを複数の個々の反応領
域で部位分解（ortsaufgeloest）合成する工程、および （ｃ）個々の反応領域から核酸フラグメントを剥離する工程、 を包含する。
【００２３】 個々の反応領域で合成される核酸フラグメントの塩基配列を、これらの塩基配
列が統合して核酸二本鎖−ハイブリッドになるように選択するのが有利である。
次いで、工程（ｃ）による核酸フラグメントの剥離を１つ以上の工程で、剥離し
た核酸フラグメントの複数のもの、すなわち少なくともいくつかが核酸二本鎖−
ハイブリッドに統合するような条件下に行う。引き続き、核酸二本鎖−ハイブリ
ッドの１本のストランドを形成する複数の核酸フラグメントを、少なくとも部分
的に相互に共有結合させることができる。これは、例えばリガーゼでの酵素処理
により、および／またはストランド中のギャップをＤＮＡ−ポリメラーゼで充填
することにより行われる。
【００２４】 この方法は、調節合成の範囲において、構成成分として働く非常に多くの個々
の核酸ストランドの合成を包含し、例えばマイクロ流動反応担体中で１００００
０塩基対を越える長さであってよい二本鎖核酸配列が生じる。
【００２５】 有利にはＤＮＡからなる非常に複雑な合成核酸の本発明による製造は以下の原
理による行われる：最初に、反応担体上の多くの反応領域中でのその場の合成に
より比較的短いＤＮＡ−ストランドを合成する。このことは例えば特許出願ＤＥ
１９９２４３２７.１、ＤＥ１９９４０７４９.５、ＰＣＴ／ＥＰ９９／０６３１
６およびＰＣＴ／ＥＰ９９／０６３１７中に記載された担体上で行うことができ
る。この際、全ての反応領域は個々に予め設定した約１０〜１００の長さのヌク
レオチドのＤＮＡ−配列の個別で、特異的な合成のために好適である。このＤＮ
Ａ−ストランドは非常に長いＤＮＡ−分子の所定の構築のための構成成分を形成
する。この際使用した流動マイクロプロセッサは適用のために特別に構成した反
応室を有している。
【００２６】 こうして、ＤＮＡ−合成自体は、自動化された固相合成に類似に行われるが、
いくつかの新規な観点がある：“固相”はこの場合は担体の表面上の個々の反応
領域、例えば反応室の壁であり、すなわち従来の合成の場合におけるように反応
室中に導入した粒状物中ではない。マイクロ流動反応担体（例えば、場合により
分枝した管および反応室を有する構造）中での合成の統合により、試薬および他
の成分、例えば酵素を供給することができる。
【００２７】 合成の後は、この反応領域からの合成構成成分の剥離を実施する。この剥離工
程は個々の、多くのまたは全てのＤＮＡ−ストランドに位置特異的および／また
は時間特異的に実施することができる。
【００２８】 有利な方法のためには、流動室もしくは流動コンパートメントの中に複数の反
応領域を実現し、利用して、そこで合成したＤＮＡ−ストランドを１つの工程で
剥離し、反応領域が流動的に結合するコンパートメントから取り出すことができ
るように設定する。
【００２９】 その後、剥離したＤＮＡ−ストランドの好適な組合せを構成する。次いで、一
本鎖および／または二本鎖構成成分を統合することは、例えば合成のための１つ
以上の反応領域を包含する反応室内で行われる。この際、個々の構成成分の配列
は、個々の構成成分を接触させる際に相互に相補的な領域が両方の一緒にされた
末端で提供され、この領域のハイブリダイゼーションにより更なるＤＮＡ−スト
ランドの特異的な並置が達せられるように、選択される。このＤＮＡ−ハイブリ
ッドのホスホジエステル−主鎖は、例えばリガーゼにより共有的に結合し、二本
鎖の場合により存在するギャップを公知法で酵素的にポリメラーゼで充填する。
場合により存在する一本鎖領域は酵素（例えばクレノウフラグメント）により好
適なヌクレオチドの添加下に充填することができる。このようにしてより長いＤ
ＮＡ−分子が生じる。このように合成されたＤＮＡ−ストランドのクラスターを
反応室の中で統合することにより再び最終ＤＮＡ−分子のより長い部分配列を製
造することができる。このことは段階的に実施することができ、この際部分配列
は常により長いＤＮＡ−分子にまとめられていく。このようにして、塩基対１０
００００を越える長さの完全合成分子としての非常に長いＤＮＡ−配列を製造す
ることができる。
【００３０】 長い合成ＤＮＡ−分子のために必要な個々の構成成分の量は、位置および／ま
たは時間分解合成法における構成成分の平行合成により反応担体中で達成される
。この平行合成は有利な実施形においては光依存性位置および／または時間分解
ＤＮＡ−合成により、流動マイクロプロセッサ中で行われる、このマイクロプロ
セッサは特許出願ＤＥ１９９２４３２７.１、ＤＥ１９９４０７４９.５、ＰＣＴ
／ＥＰ９９／０６３１６およびＰＣＴ／ＥＰ９９／０６３１７中にも記載されて
いる。
【００３１】 この際、小型化反応担体は従来のＤＮＡ−合成装置に比較して少なくともファ
クター１０００だけ使用物質の量の減少に作用する。同時に、著しく多数の定義
された配列の核酸二本鎖が製造される。こうして、長いＤＮＡ−分子の合成のた
めの前提であるのだが、非常に多様の個々の構成成分の形成が、経済的に意味の
ある量の資源の使用下に行うことができる。ヌクレオチドの長さ２０個の重なる
構成成分からなる１０００００塩基対の配列の構築のために個々の構成成分１０
０００個が必要である。このことは平行数の高い合成法において相当する小型化
装置を用いて達成することができる。
【００３２】 遺伝分子の合理的な操作および全ての可能な変異体の系統的な把握のためには
、構成成分はその個々の配列において柔軟にかつ経済的に製造されなければなら
ない。このことは、この方法を有利にＤＮＡ−ストランドのその場での光依存性
位置および／または時間分解の合成のためのプログラム可能な光源マトリックス
の使用により達成され、このＤＮＡ−ストランドを再びより長いＤＮＡ−ストラ
ンドの構築のための構成成分として使用することが可能である。この柔軟な合成
は構成成分の個々の配列の自由なプログラム化を可能にし、これによりシステム
（ハードウェア）の構成部分を著しく変更することなく、部分配列または最終配
列の任意の変異体の製造をも可能にする。構成成分のプログラム化した合成、こ
うして最終合成生成物のプログラム化した合成により、多様の遺伝要素を系統的
に操作することができる。同時に、コンピュータ制御プログラム可能な合成の使
用は、相当するデータバンクとのコミュニケーションをも含めて全工程の自動化
を可能にする。
【００３３】 個々の構成成分の配列の選択は、生化学的および機能的パラメータを考慮して
、合理的に目標配列を設定することにより行うことができる。この際、（例えば
、データバンクから）目標配列のインプットによりアルゴリズムは好適な重なり
領域を見つけだす。それぞれの課題の設定により、多くの異なる部分配列が製造
され、すなわち反応担体の中にまたは複数の反応担体の上に分散する。ハイブリ
ッドの形成のための装置の条件は、例えば温度、塩濃度等は、相当するアルゴリ
ズムにより提供すべき重なり領域に関して決める。こうして並置の最大特異性が
達せられる。目標配列のためのデータは完全自動バージョンにおいて公的なまた
は私的なデータバンクから直接取ることができ、相応する目標配列に変換するこ
とができる。相応する生成物は所望の場合再び相応する自動の工程に、例えば好
適な標的細胞中でのクローニングに、供給することができる。
【００３４】 境界を有する反応室の中の反応領域中での個々のＤＮＡ−ストランドの合成に
よる段階的な構築は困難な配列、例えばレトロウィルスおよび相応するレトロウ
ィルスベクターにおいて存在するような、配列断片の内部繰り返しを有する配列
、の構築も可能にする。流動反応室の中の構成成分の制御した剥離により、個々
の構成成分上の重なる領域の配分による問題が生じることなく、任意の配列の合
成を行うことができる。
【００３５】 非常に長いＤＮＡ−分子の構築の際に必要である、高い品質要求度は、特に有
効な時間−品質コントロールの使用により満たすことができる。その際構成要素
の位置分解合成を監視し、同様に剥離および統合を最終配列の製造まで監視する
。次いで、全ての工程は光透過性の反応担体中で経過する。更に、この可能性は
、透過光中で反応および流動経過を例えばＣＣＤ−検出装置により追跡すること
を達成する。
【００３６】 小型化した反応担体を有利に、個々の反応室中での剥離工程を可能にし、こう
して反応室の中に存在する反応領域で合成されたＤＮＡ−ストランドが単独で、
またはクラスターで剥離されるように実施する。反応担体の好適な実施形におい
ては反応室中で段階的な工程で構成成分を統合することが可能であり、更に構成
成分、部分配列または最終生成物の取出し、または分子の選別もしくは分離が可
能である。
【００３７】 目標の配列はその統合された遺伝要素としての完成の後に、移入により細胞中
にもたらされ、これによりクローニングされ、かつ機能研究に沿って調査される
。その他の可能性は、合成生成物を最初に精製または分析することであり、その
際この分析は例えば配列決定であってよい。配列決定の方法は相応する装置を用
いる直接的な結合によっても開始でき、例えば特許出願ＤＥ１９９２４３２７.
１、ＤＥ１９９４０７４９.５、ＰＣＴ／ＥＰ９９／０６３１６およびＰＣＴ／
ＥＰ９９／０６３１７中にも記載されているポリマーの統合された合成および分
析のための装置を用いて開始することができる。生じた目標配列をクローニング
の後単離し、分析することも同様に考えられる。
【００３８】 本発明による方法は、この方法で製造される統合された遺伝要素を介して、分
子生物学の更なる発展のために生物学的多様性を系統的な方法に包含する手段を
提供する。こうして、所望の遺伝情報を有するＤＮＡ−分子の製造はもはや分子
生物学的操作のための狭い通路ではない、それというのも小さなプラスミドから
複雑なベクターを越えミニ染色体まで全ての分子を合成的に製造することができ
、更なる操作に提供されるためである。
【００３９】 この製法は異なる多くの核酸の製造を可能とし、こうして問題を提起する制御
要素、レギュレーターのためのＤＮＡ−結合位、シグナルカスケード、レセプタ
ー、成長因子の作用および相互作用のための系統的配合が可能となった。
【００４０】 遺伝要素の完全合成による全核酸への統合により、公知の遺伝的手段、例えば
プラスミドおよびベクターは更に利用することができ、かつ相応する経験に更に
積み重ねることができる。他方では、この経験は存在するベクター等の最適化に
努めることにより迅速に変化する。例えば、一定の細胞タイプ中での増殖のため
にプラスミドを好適にする機構は、本発明による方法を基礎にして初めて効率的
に調査することができる。
【００４１】 多数の変異体のこの効率的な調査により、遺伝要素の全組合せを開発すること
ができる。こうして現在迅速に開発されている高平行分析（特に、ＤＮＡ−アレ
イまたはＤＮＡ−チップ）と共に、第２の重要な要素としての統合した遺伝要素
のプログラム化した合成が達せられる。この両方の要素が一緒になってのみ、効
率的な分子生物学の基礎を形成することができる。
【００４２】 相応するＤＮＡ−分子のプログラム化した合成においてはコードする配列およ
び機能的要素の任意の組み立て構成が可能であるだけでなく、中間領域の適合も
可能である。このことは最小−ベクターおよび最小−ゲノムに迅速に導くことが
でき、こうして更にその小さな寸法による利点が生じる。移送の手段、例えばウ
ィルスベクターを、例えばレトロウィルスベクターまたはアデノウィルスベクタ
ーの使用において、これによりより効果的にすることができる。
【００４３】 公知の遺伝配列の組合せを越えて、新規遺伝要素の開発が可能であり、これを
存在する要素に構築することができる。そのような開発研究のためにはこのシス
テムの柔軟性が著しく価値がある。
【００４４】 合成ＤＮＡ−分子はこの際ここで記載した方法の開発の全ての工程で既存の組
換え操作と完全に互換性である。“慣用の”分子生物学的適用のためにも、統合
した遺伝要素を例えば相応するベクターにより製造することができる。従来あま
り使用しなかった酵素のための相応する断片の導入も、統合した遺伝要素におい
ては全く制限するファクターではない。
【００４５】 公知技術に対する改良点 この方法を用いて、“遺伝モジュール”としての全ての所望の機能要素、例え
ば遺伝子、遺伝子の一部、制御要素、ウィルスのパッケージングシグナル等の、
遺伝情報の担体としての合成核酸分子への統合が可能となる。この統合により特
に次の利点が示される： これで高度に機能を統合したＤＮＡ−分子を開発することができ、この際不必
要なＤＮＡ−領域が除かれる（最小−遺伝子、最小−ゲノム）。
【００４６】 遺伝要素の自由な組合せ並びに配列の変更、例えば発現する生物もしくは細胞
タイプ（コドン−利用）への適合のための配列の変更、は同様に例えば機能的遺
伝パラメータの最適化のための配列の変更、例えば遺伝子制御を可能にする。
【００４７】 同様に、転写の機能的パラメータ、例えばスプライシング、ｍＲＮＡ−レベル
での制御、翻訳レベルでの制御、の最適化のための変更が可能にされ、かつ更に
遺伝子生成物、例えばアミノ酸配列（例えば、抗体、成長因子、レセプター、溝
、孔、トランスポーター等）の機能的パラメータの最適化が可能にされる。
【００４８】 総括すると、この方法で実現したシステムは著しく柔軟で、かつ従来存在しな
い方法で、時間、材料および作業を著しく減少させて、遺伝材料のプログラム化
した製造を可能にする。
【００４９】 大きなＤＮＡ−分子、例えば数１００ｋｂｐの染色体は従来の方法では照準を
合わせてマニピュレーションすることがほぼ困難であった。すでに、３０ｋｐｂ
を越える複雑な（すなわち大きな）ウィルスゲノム（例えばアデノウィルス）は
遺伝子操作のクラシックな方法では操作およびマニピュレーションが困難である
。
【００５０】 本発明方法により、遺伝子のクローニングの最終段階までの著しい短縮が達せ
いられた：１つまたは複数の遺伝子をＤＮＡ−分子として合成し、かつ次いで（
例えば精製などのような好適な準備の後に）直接標的細胞中に導入し、結果を研
究する。こうして、多工程の、多くの場合Ｅ.コリのような微生物を介して進行
するクローニング工程（例えば、ＤＮＡ−単離、精製、分析、組換え、細菌中で
のクローニング、単離、分析等）が最終的なエフェクター細胞中へのＤＮＡ−分
子の最終的な移入に減少される。合成により製造した遺伝子または遺伝子フラグ
メントにおいては中間宿主（多くの場合Ｅ.コリ）中でのクローニングによる増
殖はもはや必要ない。こうして、標的細胞のために決定した遺伝子生成物は中間
宿主に毒性作用を及ぼすという危険性は回避される。こうしてクラシックなプラ
スミドベクターを使用する際に、相応する核酸フラグメントのクローニングにお
いて著しい問題にしばしば導く、ほとんどの遺伝子生成物の毒性が明らかに取り
除かれる。
【００５１】 その他の著しい改良点は、時間の短縮および遺伝材料の配列決定の後までの工
程の減少であり、この際予め見いだされた潜在的遺伝子をそのような物として証
明し、かつクローニングする。通常、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
として挙げることのできる興味深いモデルを見いだした後に、ゾンデで（例えば
、ＰＣＲを用いて）ｃＤＮＡ−ライブラリー中に相応するクローンを探すが、こ
れは最初にその製造の際に使用したｍＲＮＡの全配列を含有していなければなら
ないわけではない。他の方法においては、抗体により発現−遺伝子ライブラリー
中に探す（スクリーニング）。
【００５２】 両方の方法を本発明による方法で、著しく短縮することができる：“インシリ
コ”で決定された遺伝子−配列（すなわち、ＤＮＡ−配列中の相応するモデルの
コンピュータによる認識により決定された遺伝子−配列）の存在において、また
はタンパク質配列を解明することにより、該配列またはその変異体を有する相応
するベクターを統合した遺伝要素のプログラム化した合成を介して直接生じさせ
、好適な標的細胞中に導入することができる。
【００５３】 そのように行われる数１００ｋｂｐまでのＤＮＡ−分子の合成は、ウィルスゲ
ノム、例えばアデノウィルスの直接的な完全合成を可能にする。これらは基礎研
究（特に遺伝子治療）のための重要な手段であるが、そのゲノムの大きさ（約４
０ｋｂｐ）のために、遺伝子操作のクラシックな方法では容易に入手困難であっ
た。最適化のための変異体の迅速で経済的な製造はこれにより特に強く制限され
ている。この制限が本発明方法により解消されたのである。
【００５４】 この方法により、合成の統合、合成生成物の剥離およびＤＮＡ−分子への統合
が一つのシステム中で行われる。マイクロシステム技術による製法で、最終生成
物の精製までの全ての必要な機能および工程は、小型化反応担体中で統合される
。これらは合成領域、剥離領域（クラスター）、反応室、供給溝、弁、ポンプ、
濃縮器、分離領域等であってよい。
【００５５】 プラスミドおよび発現ベクターは配列決定したタンパク質または相応する部分
配列のために直接製造され、かつ生成物は例えば好適な制御要素の使用下に生化
学的および機能的に分析されうる。こうして、クローニングによる遺伝子−ライ
ブラリー中での探索は省略される。相応して、ＯＲＦは配列決定作業（例えば、
ヒトゲノムプロジェクト）から直接相応するベクター中にプログラムされ、所望
の遺伝要素と組み合わされる。ｃＤＮＡ−ライブラリーの費用のかかるスクリー
ニングによるクローンの同定はなくなる。こうして配列分析から機能分析への情
報の流れは強く短縮され、コンピュータ中での第１次データの分析によりＯＲＦ
は提供されたその日に想定した遺伝子を含む相当するベクターを合成し、かつ提
供することができる。
【００５６】 合成ＤＮＡを獲得するための従来の固相合成に対して、本発明による方法は、
僅かな材料費で優れている。数１０００００ｋｂｐの長さの複雑な統合遺伝子要
素の製造のための１０００の異なる構成成分の製造のために、相応する平行にし
たフォーマット中でおよび相応する小型化において（実施例を参照）、マイクロ
流動システムは個々のＤＮＡ−オリゴマーのための従来の固相合成−自動装置（
唯一のカラムを使用する際）より明らかに少ない装入物質を使用する。ここでは
ミリリットルの使用に対してマイクロリットル、すなわちファクター１０００で
ある。
【００５７】 最も新しい免疫学の知識を考慮下に、前記方法は著しく効率的でかつ迅速なワ
クチン−デザイン（ＤＮＡ−ワクチン）を可能にする。
【００５８】 実施例 本発明は、この方法を実施するに際して、その配列において自由に決定可能で
ある、多数の核酸分子、多くの場合はＤＮＡの製造を前提とする。これらの構成
成分は１つの構成成分種の中でほぼ１００％同一の配列を有していなければなら
ない（従来の合成自動装置の合成能に類似）。必要な変異体の製造のためには高
平行な合成法のみを挙げることができる。こうして、例えばこのシステムは柔軟
に作業することができ、かつその際合成すべき種々の構成成分が多数必要である
にもかかわらず、できるだけ僅かな空間と試薬を必要とし、具体化は有利にその
中で個々の配列が決定可能に構成されているマイクロ流動システム中で行われる
。そのようなシステムのためには２つの種類のプログラム化した合成が提供され
、これは特許出願ＤＥ１９９２４３２７.１、ＤＥ１９９４０７４９.５、ＰＣＴ
／ＥＰ９９／０６３１６およびＰＣＴ／ＥＰ９９／０６３１７中にも記載されて
いる：これは１つは反応領域のプログラム可能な流動個別化による合成であり、
他方は反応領域のプログラム可能な光依存性個別化である。
【００５９】 両方の方法においては合成はマイクロ流動反応担体中で実施される。この際、
この反応担体のデザインはシステム中で剥がした合成生成物、すなわち構成成分
を段階的に統合することにあり、その際核酸担体の剥離後にこれを相応する反応
領域に集め、そこで統合が達せられる。そのような統合領域のグループは次いで
再び相互に接触され、多少長いカスケードの経過において合成の最終生成物が生
じる：ＤＮＡ−分子の形の遺伝子工学的情報担体。その際、次の方法を挙げる：
合成、剥離および統合を時間的に順次に、しかしながら空間的には統合してマイ
クロ流動反応担体中で行うか、または合成、剥離および統合を１つ以上のマイク
ロ流動反応担体中で部分的に平行に行う。更に、マイクロ流動反応担体はプログ
ラム化した合成のための反応領域のみを有し、引き続き剥離および溶離を統合の
ための反応容器中で行うことも可能である。
【００６０】 非常に大きなＤＮＡ−分子においては、合成、剥離および統合は、分子の分解
を阻止する凝縮−戦略により補足される。このためには、例えばヒストン（細胞
核中の染色体の凝縮を真核生物において可能とする核タンパク質）、トポイソメ
ラーゼ（真核生物および原核生物中のＤＮＡのねじりのための酵素）の使用また
は他のＤＮＡ−結合性で、安定化性および凝縮性の試薬もしくはタンパク質を挙
げることができる。このことはそれぞれ反応担体のデザインに従って、凝縮反応
の統合によりその他のこのための反応室中で行われるか、または構成成分の段階
的な組合せおよび統合の際に添加することにより行われる。
【００６１】 配列の自由な選択は、最終生成物までの構成成分の制御され、かつ効果的な段
階的な統合にとって著しく重要である。それというのも重なる相補性の末端の選
択により、統合の特異性および生化学的限定条件（塩濃度、温度等）に影響を与
える。興味深い遺伝子に関する配列の設定において、および最終生成物（例えば
、プラスミドベクター）の決定のための他の遺伝要素（制御領域、クローニング
に対する耐性遺伝子、伝搬シグナル等）の自動的またはマニュアルな選択により
、所定の配列を好適な構成成分に分解し、かつこれを反応担体の必要数に合成す
る。このフラグメントもしくはそのハイブリダイゼーションすべき重なり領域を
ハイブリダイズするための条件ができるだけ類似している（特にＧＣ：ＡＴ比、
融点等）ように選択する。
【００６２】 システムの更なる仕上げにおいては、同様にマイクロ流動技術もしくはマイク
ロシステム技術で実施された要素を精製および生じた生成物の単離にかけること
を予定している。これは、例えば最終二本鎖ＤＮＡが蛍光を発するシントン（Sy
ntonen）の使用下にその構築された後に、一定の総蛍光を示さなければならない
方法であってよい。場合により、凝縮に作用するタンパク質を使用する際に、こ
のタンパク質は蛍光マーカーを付けていてもよく、これは分離して検出可能であ
るのが有利である（参照シグナル）。この場合には、反応担体−構造において混
合物から最終生成物を蛍光により分類することができる（Chou et al., Proceed
ings of the National Academy of Science PANS 96 : 11-13, 1999）。こうし
て、その後の作業に直接生成物を提供するために、十分な品質が達せられる。
【００６３】 データバンクに存在する配列プロジェクトからの情報は、（コンピュータに支
持され）完全に自動的に遺伝子に基づいて調査される。同定したまたは予測した
遺伝子（ＯＲＦｓ）は完全合成ＤＮＡに変換され、これは場合により好適と思わ
れる制御およびその他の遺伝要素を有していてよく、こうして例えば１つ以上の
ベクターが生じる。この生成物は提供されるか（例えば、純粋なＤＮＡとして）
、または直接機能の研究に、特に好適な標的細胞中への移入により導入される。
この情報は公的なデータバンクから、分散した使用者の仕事から、またはその他
の情報源から、例えば特許出願ＤＥ１９９２４３２７.１およびＤＥ１９９４０
７４９.５に記載された方法から由来してもよい。
【００６４】 標的配列の一定の１つの位置または複数の位置で変異体がランダム化された配
列で出現することは興味深い。一つの例は結合位の変異、例えば２０アミノ酸の
領域、すなわち核酸６０個の領域にわたって、偶然生じたヌクレオチドの変異が
構築された変異体、の徹底的なテストである。このことは実施形において、合成
工程の際に反応領域の活性化によりシントンの混合に導き、全ての添加したシン
トンは統計的に分布して配置されることが可能である。この方法の適用は、標的
配列の一定の位置に異なる長さのＤＮＡ−構成成分を導入することを計画するこ
とができ、例えばその際、重なりおよびハイブリダイゼーションのために同じ配
列を有する異なる構成成分を異なる反応領域で製造する。
【００６５】 図１は反応担体３０をその上に存在する相互に壁３２により分離しているマイ
クロ溝３３に対して直角に縦断面で記載しており、反応担体の下側３１は光透過
性である。更に一本鎖核酸１０を慣例に則って５′−および３′−末端の記載で
概略的に示してある。これらは固相合成により反応担体３０に３′−末端で共有
結合する１０ａとして示されている。同様に光源を有し、かつ反応担体３０に向
いた調節可能な露光開口部を有する光源マトリックス２０を示す。
【００６６】 図２は、反応領域１２およびマイクロ溝３３の間の壁３２を有する反応担体３
０の断面図である。矢印は貫流方向を示す。
【００６７】 図３は図１と同様に反応担体３０の縦断面を示し、この際マイクロ溝３３中で
一本鎖核酸が剥離している。
【００６８】 図４中には再び反応担体３０が横断面で示されており、この際マイクロ溝３３
中では一本鎖核酸が剥離している。
【００６９】 図５は個々の反応領域を有する流動反応室５０および部分配列の統合が行われ
る反応部屋を有する、横断面でのマイクロ溝の配置を示す。反応室５４中で、全
てのマイクロ溝は１つの反応担体の中に一緒に導入される。そこでは最終的な合
成生成物の統合も行われ、この最終生成物は出口５５により取り出される。記号
５１ａおよび５１ｂは図６および図７もしくは図８中に拡大して示した反応部屋
の図により特徴付けられる。矢印は流れ方向を示す。
【００７０】 図６は剥離した一本鎖核酸を有するマイクロ溝の後の反応部屋５１ａの拡大し
た図を示す。
【００７１】 図７は２本の相互に並列する相補性の核酸一本鎖からなる二本鎖ハイブリッド
６０を有するマイクロ溝後の反応部屋５１ａの拡大図を示す。
【００７２】 図８は統合した二本鎖核酸−ハイブリッド６２、核酸ハイブリッド８５の構成
成分の共有結合のための酵素６３（例えばリガーゼ）、線状に共有結合した核酸
二本鎖６５および環状に閉環した核酸二本鎖６６（例えば、ベクター）を有する
。
【００７３】 記号６４として、核酸−ハイブリッドとの酵素の反応を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】 光源マトリックス２０および反応担体３０をその上に存在する相互に壁３２に
より分離しているマイクロ溝３３に対して直角に縦断面で記載した図である。更
に一本鎖核酸１０を慣例に則って５′−および３′−末端の記載で概略的に示し
てある。これらは固相合成により反応担体３０に３′−末端で共有結合する１０
ａとして示されている。
【図２】 反応領域１２およびマイクロ溝３３の間の壁３２を有する反応担体３０の断面
図である。
【図３】 図１と同様に反応担体３０の縦断面を示す図である。この際マイクロ溝３３中
で一本鎖核酸が剥離している。
【図４】 反応担体３０の横断面図である。この際マイクロ溝３３中では一本鎖核酸が剥
離している。
【図５】 マイクロ溝の配置を示す概略図である。
【図６】 剥離した一本鎖核酸を有するマイクロ溝の後の反応部屋５１ａを示す概略図で
ある。
【図７】 二本鎖ハイブリッド６０を有するマイクロ溝の後の反応部屋５１ａの概略図で
ある。
【図８】 反応部屋５１ｂの概略図である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年４月１２日（２００１．４．１２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 １９９ ４０ ７５２．５ (32)優先日 平成11年８月27日(1999．8．27) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 ＥＰ９９０６３１６ (32)優先日 平成11年８月27日(1999．8．27) (33)優先権主張国 欧州特許庁（ＥＰ） (31)優先権主張番号 １９９ ５７ １１６．３ (32)優先日 平成11年11月26日(1999．11．26) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｊ Ｐ，ＵＳ (72)発明者 マンフレート ミュラー ドイツ連邦共和国 シュリースハイム マ ンハイマーシュトラーセ 11 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 HA19 4J031 AA04 AB06 AC05 AC09 AE10 AF09

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 平行な合成工程により、担体上に多数のオリゴマー構成ブロ
    ックを構築し、担体から剥がし、かつポリマーの構築のために相互に接触させる
    ことを特徴とする、ポリマーの合成法。
  2. 【請求項２】 少なくとも３００ｂｐ、特に少なくとも１０００ｂｐの長さ
    を有する二本鎖核酸−ポリマーを合成する、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 遺伝子、遺伝子クラスター、染色体、ウィルスゲノムおよび
    細菌ゲノム、またはこれらの断片から選択された核酸−ポリマーを合成する、請
    求項１または２記載の方法。
  4. 【請求項４】 オリゴマー構成ブロックが５〜１５０、有利に５〜３０モノ
    マー単位である、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
  5. 【請求項５】 連続する工程においてそれぞれ部分的に相補性のオリゴヌク
    レオチド構成ブロックを担体から剥がし、ハイブリダイゼーション条件下に相互
    に、もしくはポリマー中間生成物と接触させる、請求項１から４までのいずれか
    １項記載の方法。
  6. 【請求項６】 次の工程： （ａ）複数の個々の反応領域を含有する表面を有する担体を製造する工程、 （ｂ）それぞれ異なる塩基配列を有する核酸フラグメントを複数の個々の反応領
    域で部位分解合成する工程、および （ｃ）個々の反応領域から核酸フラグメントを剥離する工程、 を包含する、選択自由な配列を有する合成核酸二本鎖を製造するための、請求項
    １から５までのいずれか１項記載の方法。
  7. 【請求項７】 個々の反応領域で合成した核酸フラグメントの塩基配列を、
    これらの核酸フラグメントが統合して核酸二本鎖−ハイブリッドになることが可
    能なように選択する、請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】 工程（ｃ）による核酸フラグメントの剥離を１つ以上の工程
    で、剥離した核酸フラグメントの複数のものが核酸二本鎖−ハイブリッドに統合
    するような条件下で実施する、請求項６または７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 核酸二本鎖−ハイブリッドの１本のストランドを形成する複
    数の核酸フラグメントを、相互に共有結合する、請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 共有結合がリガーゼでの処理および／またはＤＮＡ−ポリ
    メラーゼでのストランド中のギャップの充填を包含する、請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 配列中の１カ所以上の位置に分子、例えばタンパク質、核
    酸、ペプチド、薬剤、サッカリド、脂質、ホルモンおよび／または有機化合物、
    との特異的相互作用のための認識配列を含有している、請求項６から１０までの
    いずれか１項記載の方法。
  12. 【請求項１２】 核酸二本鎖の配列が、天然に存在する配列、天然に存在し
    ない配列またはこれら両方からの組合せである、請求項６から１１までのいずれ
    か１項記載の方法。
  13. 【請求項１３】 この配列が、データバンク、配列決定実験またはポリマー
    の統合した合成および分析のための装置から採取されている、請求項６から１２
    までのいずれか１項記載の方法。
  14. 【請求項１４】 オリゴマー構成ブロックをプログラム可能な光源マトリッ
    クスを用いる位置分解および／または時間分解照射により合成する請求項１から
    １３までのいずれか１項記載の方法。
  15. 【請求項１５】 オリゴマー構成ブロックの位置分解および／または時間分
    解合成を１つ以上の流動反応室および流動反応室内の１つ以上の反応領域を有す
    るマイクロ流動反応担体中で実施する、請求項１から１４までのいずれか１項記
    載の方法。
  16. 【請求項１６】 合成構成成分が自然に存在するヌクレオチド、修飾ヌクレ
    オチドまたはこれらの混合物を含有する、請求項１から１５までのいずれか１項
    記載の方法。
  17. 【請求項１７】 修飾合成構成成分をマーキングおよび統合した核酸二本鎖
    の後の検出のために使用する、請求項１から１６までのいずれか１項記載の方法
    。
  18. 【請求項１８】 マーカー基として光依存性に検出される分子を使用する請
    求項１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１から１８までのいずれか１項記載の方法により製
    造した選択自由な配列の核酸二本鎖の治療または薬理学的目的のための使用。
  20. 【請求項２０】 請求項１から１８までのいずれか１項記載の方法により製
    造した選択自由な配列の核酸二本鎖の診断目的のための使用。
  21. 【請求項２１】 意図する目的への直接的な導入を包含する、請求項１９ま
    たは２０項記載の使用。
  22. 【請求項２２】 エフェクター細胞中への変換を包含する請求項１９または
    ２０項記載の使用。
  23. 【請求項２３】 請求項１から１８までのいずれか１項記載の方法により製
    造した選択自由な配列の核酸二本鎖であって、この際この核酸二本鎖を段階的な
    組合せおよび統合の間にまたはこれに引き続いて安定化、凝縮および／または形
    態学的マニピュレーションする、核酸二本鎖の使用。
  24. 【請求項２４】 安定化、凝縮および／または形態学的マニピュレーション
    を機能的分子、例えばヒストンまたはトポイソメラーゼにより実施する請求項２
    ３記載の使用。
  25. 【請求項２５】 請求項１から１８までのいずれか１項記載の方法により製
    造された核酸二本鎖の、好適な標的細胞中での転写、転写した配列の発現、およ
    び場合により発現した遺伝子生成物の獲得に使用することができる増殖可能なク
    ローニングベクターとしての使用。
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