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JP2002536339A - 細菌毒性におけるｄｎａメチル化の必須な役割に基づいて病原性細菌感染を処置および予防するための組成物および方法 - Google Patents

細菌毒性におけるｄｎａメチル化の必須な役割に基づいて病原性細菌感染を処置および予防するための組成物および方法

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JP2002536339A
JP2002536339A JP2000596959A JP2000596959A JP2002536339A JP 2002536339 A JP2002536339 A JP 2002536339A JP 2000596959 A JP2000596959 A JP 2000596959A JP 2000596959 A JP2000596959 A JP 2000596959A JP 2002536339 A JP2002536339 A JP 2002536339A
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JP
Japan
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dam
immunogenic composition
mutation
salmonella
bacterium
Prior art date
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Withdrawn
Application number
JP2000596959A
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English (en)
Inventor
マイケル ジェイ． マーン，
ダグラス エム． ヘイソフ，
デイビッド エイ． ロー，
ロバート エル． シンシェイマー，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of JP2002536339A publication Critical patent/JP2002536339A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＤＮＡアデニンメチラーゼ（Ｄａｍ）の活性を変更する非復帰遺伝子変異を有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａのような病原性細菌を含むワクチン組成物、ならびに免疫応答を誘発するためにこれらの組成物を使用する方法に関する。本発明はまた、ワクチンを調製するための方法、ならびに抗細菌活性を有し得る薬剤を同定するためのスクリーニング方法を提供する。代表的には、上記病原性細菌としては、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ａｂｏｒｔｕｓｏｖｉ、Ｓ．ａｂｏｒｔｕｓ−ｅｑｕｉ、Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ、Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、およびＳ．ｐｕｌｌｏｒｕｍが挙げられる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （他の出願に対する相互参照） 本特許出願は、それらの全体が参考として援用される、米国仮特許出願第 号から変更された米国特許出願第０９／２４１，９５１号（１９９９年２
月２日出願）および米国仮特許出願第 号から変更された同第０９／３
０５，６０３号（１９９９年５月５日出願）の優先権の利益を主張する。
【０００２】 （連邦政府に援助された研究の下でなされた発明に対する権利の声明） 本発明は、国立衛生研究所により与えられた、助成金番号ＡＩ３６３７３（Ｍ
．Ｍａｈａｎに対する）およびＡＩ２３３４８（Ｄ．Ｌｏｗに対する）の下で政
府の援助によりなされた。政府は、本発明に特定の権利を有し得る。
【０００３】 （発明の分野） 本発明は、微生物病因の予防または改変のために有用なワクチンに関する。特
に、本発明は、一般に、ＤＮＡアデニンメチラーゼ（Ｄａｍ）に影響する変異を
含む病原性細菌（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を含む免疫原性組成物に関す
る。本発明はまた、これらの組成物を使用して免疫応答を誘発する方法、および
スクリーニング方法に関する。
【０００４】 （発明の背景） 食品が原因となる（ｆｏｏｄ−ｂｏｒｎｅ）疾患は、我々の健康、国家の食品
の供給の安全性、および農産業に対して深刻な脅威を示す。毎年８０００万人を
超えるアメリカ人が、食中毒に罹り、費用は、医学処置および消費された賃金に
おいて年間５０億ドルと２３０億ドルとの間であると見積もられている（Ｓｎｙ
ｄｍａｎ，Ｄ．Ｒ．、Ｆｏｏｄ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ．：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
Ｄｉｓｅａｓｅｓ（第２版）、Ｇｏｒｂａｓｈ，Ｓ．Ｌ．ら編、７６８〜７８
１（１９９８））。食品が原因となる疾患に対する人間の防御は、失敗している
。なぜなら、人を衰弱させるより多くの疾患形態を引き起こし得、そして／また
は入手可能な抗生物質によりもはや制御され得ない新たな病原体が出現したから
である；例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１
５７：Ｈ７、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（Ｓ．ｅｎｔｅｒ
ｉｔｉｄｉｓ）、およびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＤＴ１０４が挙げられる
（Ａｌｔｅｒｋｒｕｓｅ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｆｏｏｄ ｂｏｒｎ
ｅ ｄｉｓｅａｓｅ、３：７月〜９月（１９９７））。サルモネラ症は、一年あ
たり１００〜４００万の間の症例であると評価される、米国における主要な食品
が原因となる疾患のうちの１つである（Ｓｈｅｒｅ，Ｋ．Ｄ．ら、Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ：ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、
第２版、Ｇｏｒｂａｃｈ，Ｓ．Ｌ．ら、編、６９９〜７１２（１９９８））。こ
の疾患は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに汚染された生産物（動物生産物（例えば、卵
）、牛乳、家禽、または動物の糞便に曝された食品（果実および野菜を含む）の
摂取に曝されることによって引き起こされる。大規模な製造および流通の実施に
起因して、サルモネラ症の発生は、大きな集団に影響を与えた（Ｔａｕｘｅ，Ｒ
．Ｖ．ら、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｆｏｏｄ ｂｏｒｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ：ａｎ
ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｐｕｂｌｉｃ ｈｅａｌｔｈ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｅｍ
ｅｒｇｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ，３：１０月〜１２月
（１９９７））。
【０００５】 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、種々の種が急性胃腸炎および腸熱を含む臨床疾患の
スペクトルの原因である病原性微生物の主な例である。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感
染は、経口摂取により獲得される。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染は、経口摂取によ
り獲得される。微生物は、胃を超えた後に、腸粘膜細胞に侵入し、そして複製す
る。Ｈｏｒｎｉｋら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２８３：６８６（１９７０）
を参照のこと。いくつかの種（例えば、Ｓ．ｔｙｐｈｉ）は、この粘膜障壁を通
過して、そしてパイエル板を介して、固有層および限局性リンパ節に広がる。人
間にのみ感染するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉは、腸チフスの原因であり
、そして非先進国における居住者には重要な公衆健康問題であり続ける。
【０００６】 尿路感染（ＵＴＩ）は、最も一般的な細菌感染に挙げられる。約２０％の女性
が、それらの寿命の間に少なくとも１回のＵＴＩを経験すると見積もられる。女
性は、ＵＴＩの主要な標的であるが、男性および子供もまた、この疾患に接し得
る。全てのＵＴＩのうちの約７０％が、尿路病原性（ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉ
ｃ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉによって引き起こされる。この疾患は、
より低い尿路（膀胱炎）に限定され得るか、または腎盂（腎盂腎炎）に関与し得
る。腎盂腎炎を患う女性から単離されたＥ．ｃｏｌｉのうち９０％を超えるもの
が、腎盂腎炎関連毛（ｐｙｅｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｐｉｌｉ）（ｐａｐ）遺伝子クラスターを含む（Ｏ’Ｈａｎｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．ら
、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１３：４１４〜４４７（１９８５））。Ｅ．ｃ
ｏｌｉにより引き起こされる腎盂腎炎を患うほとんどの患者は、Ｐａｐ毛に対す
る強力な免疫応答をマウントする。Ｐａｐ毛は、それらの先端に、これらの細菌
が尿路でコロニー形成することを可能にする付着素を含む。ほとんどのＰａｐ毛
−付着素複合体は、Ｐ式血液型レセプターに結合する。このレセプターは、腸、
膀胱および尿管の管壁の上皮細胞に発現される。ＵＴＩの病因における接着の役
割の本発明者らの理解にもかかわらず、ワクチンは、ＵＴＩに対して利用可能で
はない。これはまた、有意な罹病率および死亡率を引き起こす、多くの他の重要
な微生物病原体についてあてはまる。
【０００７】 微生物病原体または疾患生成微生物は、いくつかの機構のうちの１つによって
宿主に感染し得る。それらは、皮膚における傷を通して侵入し得るか、それらは
、ベクターの伝達によって導入され得るか、またはそれらは、粘膜表面と相互作
用し得る。病原体が正常な身体機能を破壊する能力が十分に発現される場合、疾
患は、宿主の感染後に続いて起こる。
【０００８】 各疾患生成微生物は、それらの病原性を増強し、かつそれらが宿主またはヒト
組織に侵入してそして正常な身体機能を破壊することを可能にする、毒性因子の
収集物を保有する。感染性疾患は、過去数千年にわたる主要な殺し屋であり、そ
してワクチンおよび抗菌剤が感染性疾患の発生における劇的な減少に重要な役割
を果たしつつ、感染性疾患はなお、世界規模の死の第１位の原因である。
【０００９】 宿主内の環境状態は、ほとんどの既知の毒性因子の発現を調節することを担う
（Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，Ｊ．Ｊ．，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：１（１９９２
））。過去、科学者は、毒性因子をコードし、そしてその因子の産生を担う遺伝
子を同定する試みにおいて、宿主内の環境条件を、インビトロで模倣することを
試みた。結果として、多くの毒性因子の同定は、研究者らが実験室内で宿主の環
境因子を模倣する能力に依存し、そしてそれによって制限される。しかし、Ｍａ
ｈａｎ，Ｍ．Ｊ．らにより発見され、そして米国特許第５，４３４，０６５号に
開示されるインビボ発現技術（ＩＶＥＴ）の出現とともに、どの遺伝子が宿主内
に発現されるか、および遺伝子が発現される宿主の組織を決定することが現在可
能である。結果として、宿主（ヒト身体）免疫系を回避し、そして疾患プロセス
に固有の生理学的変化を開始することを可能にする、特定の病原性微生物の分子
機構が、解明され、それによって、病原性微生物に対するより良好な治療アプロ
ーチおよび診断アプローチを開発することを可能にする。
【００１０】 水の衛生とともに、ワクチン接種による感染性疾患の予防は、疾患の予防の最
も効率的、経済的、かつ現実的な方法である。他の治療様式（抗生物質でさえも
）は、死亡率の減少および集団増殖に対するこのような主要な効果を有しなかっ
た。世界の人々の健康に対するワクチン接種の影響は、誇張しがたい。少なくと
も世界の一部でのワクチン接種は、以下の９つの主要な疾患を制御した：痘瘡、
ジフテリア、破傷風、黄熱病、百日咳、ポリオ、麻疹、おたふくかぜおよび風疹
。痘瘡の場合には、この疾患は、世界から全て根絶された。ワクチンの有効性は
、以下に一般的に記載されている、保護免疫応答を誘発するその能力に依存する
。
【００１１】 脊椎動物、特に鳥類および哺乳動物が微生物病原性を克服する手段は、複雑で
ある。宿主に侵入する病原体は、多くの高度に多方面の系および保護系を引き起
こす。微生物病原体またはその毒素が、身体の外側の防御を首尾よく突き抜け、
そして血流に達する場合、脾臓、肝臓および骨髄のリンパ組織は、これらの器官
を通る血液循環として外来物質を除去し、そして破壊する。リンパ組織は、重な
り合っている細網細胞および細網線維の網状構造から主に構成される。組織の隙
間への接着は、多数の白血球、より詳細には、リンパ球、および分化の種々の段
階における他の細胞（例えば、形質細胞、リンパ芽球、単球−マクロファージ、
好酸球および肥満細胞）である。２つの主要なリンパ球（Ｔ細胞およびＢ細胞）
は、抗原特異的免疫応答の媒介において異なりかつ補完的な役割を有する。
【００１２】 免疫応答は、非常に複雑であり、そして外来病原体を認識する能力を有する有
益なホメオスタシス機構である。外来病原体に対する初期応答は、「生来の免疫
」と呼ばれ、そして外来病原体の部位に対するナチュラルキラー細胞、マクロフ
ァージ、好中球、および他の白血球の迅速な移動によって特徴付けられる。これ
らの細胞は、貪食するか、消化するか、溶解するか、または短期間で病原体を溶
解するサイトカインを分泌するかのいずれかであり得る。生来の免疫応答は、抗
原特異的ではなく、そして一般に、「順応（ａｄａｐｔｉｖｅ）免疫応答」が生
成され得るまで外来病原体に対する防御の第１のラインとしてみなされる。Ｔ細
胞およびＢ細胞の両方は、順応免疫応答に関与する。種々の機構が、順応性免疫
応答の生成に関与する。順応性免疫応答を生成する全ての可能な機構の議論は、
この節の範囲を超えるが、十分に特徴付けられているいくつかの機構は、抗原の
Ｂ細胞認識、ならびにその後の、抗原特異的抗体を分泌する活性化および抗原提
示細胞に結合することによるＴ細胞活性化を含む。
【００１３】 微生物は、免疫系により外来として認識される細胞膜を有し得る。さらに、微
生物はまた、宿主の免疫系によりまた外来としてみなされる毒素またはタンパク
質を産生し得る。上記の第１の機構は、Ｂ細胞上の表面免疫グロブリンレセプタ
ーに対する抗原（例えば、細菌細胞壁または細菌毒素）の結合を含む。レセプタ
ーの結合は、Ｂ細胞の内部にシグナルを伝達する。これは、「第１シグナル」と
して当該分野において一般的にいわれるものである。いくつかの場合、１つのシ
グナルのみが、Ｂ細胞を活性化するために必要とされる。Ｔ細胞の補助に依存す
ることなくＢ細胞を活性化し得るこれらの抗原は、一般に、Ｔ独立抗原（または
胸腺独立抗原）といわれる。他の場合において、「第２シグナル」が必要とされ
、そしてこれは、Ｂ細胞に結合するＴヘルパー細胞によって通常提供される。Ｔ
細胞の補助が、特定の抗原へのＢ細胞の活性化に必要とされる場合、この抗原は
、Ｔ依存抗原（または胸腺依存抗原）といわれる。Ｂ細胞上の表面レセプターへ
と結合に加えて、この抗原はまた、Ｂ細胞によってインターナライズされ、次い
で、Ｂ細胞内でより小さなフラグメントに消化され、そして抗原性ペプチド−Ｍ
ＨＣクラスＩＩ分子の状況においてＢ細胞の表面上に提示され得る。これらのペ
プチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子は、いくつかの抗原に必要とされる「第２シグナ
ル」を提供するためにＢ細胞に結合するＴヘルパー細胞によって認識される。一
旦、Ｂ細胞が活性化されると、Ｂ細胞は、抗原の不活性化を最終的には導く、抗
原に対する抗体を分泌し始める。活性化されるべきＢ細胞の別の様式は、リンパ
節および脾臓の胚中心内での、濾胞性樹状細胞（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｄｅｎ
ｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）（ＦＤＣ）との接触によってである。濾胞性樹状細胞
は、リンパ節および脾臓を通って循環する抗原−抗体（Ａｇ−Ａｂ）複合体を捕
捉し、そしてＦＤＣは、これらをＢ細胞に提示して、これらを活性化する。
【００１４】 抗原に対する順応性免疫応答の十分に特徴付けられた別の機構は、抗原提示細
胞（例えば、マクロファージおよび樹状細胞）への結合によるＴ細胞の活性であ
る。マクロファージおよび樹状細胞は、強力な抗原提示細胞である。マクロファ
ージは、微生物成分（例えば、マクロファージマンノースレセプターおよびスカ
ベンジャーレセプター）を認識する種々のレセプターを有する。これらのレセプ
ターは、微生物を結合し、そしてマクロファージは、それらを飲み込み、そして
エンドソームおよびリソソーム内で微生物を分解する。いくつかの微生物は、こ
の様式で直接破壊される。他の微生物は、小さなペプチドに消化されて、このペ
プチドは、次いで、ＭＨＣクラスＩＩ−ペプチド複合体の状況においてマクロフ
ァージの表面上でＴ細胞に提示される。これらの複合体に結合するＴ細胞は、活
性化される。樹状細胞もまた、強力な抗原提示細胞であり、そしてＴ細胞を活性
化するために、ペプチド−ＭＨＣクラスＩ分子およびペプチド−ＭＨＣクラスＩ
Ｉ分子を提示する。
【００１５】 Ｂ細胞が遭遇したことのない抗原に結合する場合、この細胞は、「アイソタイ
プスイッチング」と呼ばれる発達経路を受ける。発達変化の間に、形質細胞は、
一般的なＩｇＭ型抗体の産生から非常に特異的なＩｇＧ型抗体の産生にスイッチ
する。細胞のこの集団において、いくつかは、「クローン性増殖」と呼ばれるプ
ロセスにおいて反復する分裂を受ける。これらの細胞は成熟して、血液中に免疫
グロブリンを放出する抗体工場になる。それらが十分に成熟である場合、それら
は、一般に、成熟に達した後２日または３日以内に、形質細胞（それらが死ぬま
で、毎秒あたり約２，０００個の同一の抗体を放出し得る細胞）を同定した。ク
ローンのこの群における他の細胞は、抗体を産生しないが、特定の抗原に遭遇す
る際にこの抗原を認識かつ結合する記憶細胞として機能する。
【００１６】 抗原による最初のチャレンジの結果として、本来のＢ細胞または親細胞に同一
なはるかに多くの細胞が存在し、これらの各々は、本来のＢ細胞として、いくつ
かの様式において、抗原に応答し得る。結果的に、抗原が２回目に出現した場合
に、これは、すぐに正確なＢ細胞のうちの１つに遭遇し、そしてこれらのＢ細胞
は、特定のＩｇＧ抗体についてプログラムされるので、この免疫応答は、すぐに
開始し、急速に加速し、より特異的であり、そしてより多数の抗体を産生する。
この事象は、第２または既往応答とみなされる。図１は、一次応答および二次応
答の結果として存在する抗体力価の比較を示す。免疫は、数年持続し得る。なぜ
なら、記憶細胞は、数ヶ月または数年生存するからであり、そしてまた、外来物
質は、時折、低レベルの免疫応答を絶えず誘発するに十分であるわずかな用量に
おいて再導入されるからである。この様式において、記憶細胞は、定期的に補充
される。
【００１７】 抗原に１回目に曝した後に、応答は、しばしば、抗体をゆっくりと生成し、そ
して産生される抗体の量は、少ない（すなわち、一次免疫）。同じ抗原での２回
目のチャレンジの際には、応答（すなわち、二次免疫）は、より迅速であり、そ
して非常に強く、それによってワクチンによって誘導されるべきである目標であ
る、病原性微生物での再感染後に、促進された二次応答に等しい免疫状態を達成
する。
【００１８】 一般に、活性なワクチンは、２つの一般的なクラス（サブユニットワクチンお
よび生物全体のワクチン）に分けられる。サブユニットワクチンは、生物全体の
成分から調製され、そして通常、以下にさらに詳細に議論されるように、疾患を
引き起こし得る生きている生物の使用を回避するためか、または生物全体のワク
チンに存在する毒性成分を回避するために、開発される。ヒトにおいてＨ．ｉｎ
ｄｌｕｅｎｚａ ｂ型により引き起こされる髄膜炎に対するワクチンとしてこの
生物の精製されたカプセルポリサッカリド物質を使用することは、抗原性成分に
基づくワクチンの例である。Ｐａｒｋｓら、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１３６（補遺
）：５５１（１９９７）、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１３６（
補遺）：５６３（１９７７）；およびＭａｋｅｌａら、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１
３６（補遺）：５４３（１９７７）を参照のこと。
【００１９】 古典的には、サブユニットワクチンは、部分的に精製された毒素の化学的な不
活性化によって調製されており、それ故、トキソイドと呼ばれている。ホルムア
ルデヒドまたはグルタルアルデヒドは、細菌毒素を解毒するための選り抜きの化
学物質であった。ジフテリアおよび破傷風毒素の両方は、ホルムアルデヒドで首
尾よく不活性化されており、ジフテリアおよび破傷風を管理するために、４０年
を超えて使用されている安全かつ有効なトキソイドワクチンを生じる。Ｐａｐｐ
ｅｎｈｅｉｍｅｒ，Ａ．Ｍ．、Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ．：Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｒ．Ｇｅｒｍａｎｉｅｒ、編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ．１〜３６頁（１９８４）；Ｂｉｚｚｉｎｉ，Ｂ．
，Ｔｅｔａｎｕｓ．同書３７〜６８頁。しかし、化学トキソイドは、所望の特性
ではない。実際、この型のワクチンは、開発するのがより困難であり得る。なぜ
なら、保護抗原が最初に同定されなければならず、次いで、手順が抗原を効率的
に単離するために開発されなければならない。さらに、いくつかの場合、サブユ
ニットワクチンは、そうでなければ保護抗原をマスクするかまたは免疫優勢であ
る物質の除去に起因してより免疫原性である外因性物質（例えば、膜または内毒
素）の欠如に起因して生物全体のワクチンが誘発するのと同じ強さの免疫応答を
誘発しない。
【００２０】 一方、生物全体のワクチンは、ワクチン接種のために生物全体を利用する。こ
の生物は、殺傷され得るか、または保護免疫を誘発する要件に依存して生存して
いる（通常、弱毒化される）。百日咳ワクチンは、例えば、殺傷され、細胞全体
のワクチンが、ホルムアミドでのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ細
胞の処理によって調製される。細菌Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓは、気道の上皮内層
でコロニー形成し、幼児および幼い子供に対して最も高い罹病率および死亡率を
有する、ヒトにおける高度に伝染性呼吸疾患である百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
）または百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ ｃｏｕｇｈ）を生じる。コロニー形成はさ
らに、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓにより産生される毒素によって大部分において引
き起こされる局所組織損傷および全身効果を生じる。Ｍａｎｃｌａｒｃｋら，Ｐ
ｅｒｔｕｓｓｉｓ，同書，６４〜１０６頁。これらの毒素としては、内毒素また
はリポポリサッカリド、気管細胞毒素と呼ばれるペプチドグリカンフラグメント
、熱不安定性皮膚壊死性毒素、アデニル酸シクラーゼ毒素、およびタンパク質外
毒素百日咳毒素が挙げられる。ワクチン接種は、百日咳を制御するための最も効
果的な方法であり、そしてジフテリアおよび破傷風トキソイド（ＤＰＴワクチン
）とともに投与される殺傷された細胞全体のワクチンは、多くの国々において疾
患を制御するに効果的であった。Ｆｉｎｅら、Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｎ
ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｒ
ｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，９：８６６〜８８３（１９８７）を参照のこと
。不幸なことに、百日咳ワクチンに含まれる、上記の大量の内因性産物に起因し
て、多くの子供は、注射の際に有害な反応を経験する。グラム陰性生物（ならび
に全ての他のグラム陰性生物）の外膜の必須成分である内毒素は、軽度から重篤
な広範な範囲の副作用（発熱、ショック、白血球増加症、および流産を含む）を
誘導し得る。百日咳ワクチンと関連する副作用は、通常、軽度であるが、それら
は、非常に重篤であり得る。しかし、インフルエンザウイルスワクチンに存在す
る毒素成分は、強力な発熱物質応答を誘導し得、そしてギヤン−バレー症候群の
生成を担っている。インフルエンザワクチンは、ニワトリ胚におけるウイルスの
増殖によって調製されるので、胚または卵の成分は、この毒性に寄与するようで
ある。
【００２１】 殺傷されたワクチンの使用はまた、ブタにおけるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒ
ｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ感染に対するワクチンの調製にこのような方法を適用
したＳｗｉｔｚｅｒら、米国特許第４，０１６，２５３号によって記載されてい
る。Ｂｒｏｗｎら、Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．１：２６３（１９５９）による技術論文
において、殺傷された細胞全体の使用は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕ
ｅｎｚａｅにより引き起こされる慢性気管支炎に対するワクチンを調製するため
に開示される。しかし、殺傷された細胞の使用は、通常、免疫原性能力の付きま
とう損失によって達成される。なぜなら、殺傷のプロセスは、通常、宿主におけ
る特異的な抗体の誘導に必要な、多くの表面抗原決定基を破壊または変更し得る
からである。殺傷されたワクチンは、多くの病原性細菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｓｐｐ．およびＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅを含む）に効果がないか、またはわずか
に効果がある。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉについての現在の使用におけ
る親の殺傷された細胞全体のワクチンは、適度に効果的であるのみであり、そし
て受け入れることのできない高い頻度で、顕著な全身的および局所的な有害反応
を引き起こす。
【００２２】 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａのような細胞内病原体の場合には、生存しているが弱毒
化された微生物に基づくワクチン（生ワクチン）が、非常に効果的な型の免疫性
応答を誘導することが、一般に同意されている。生弱毒化ワクチンは、良性であ
るが代表的に宿主組織において複製し得、そして好ましくは天然の感染に類似す
る免疫系にプロセシングおよび提示される多くの天然標的免疫原を恐らく発現す
る、生存生物からなる。この相互作用は、その免疫化個体が以前にその疾患に曝
露されたかのように、保護応答を惹起する。生細菌ワクチンの構築のために弱毒
化変異を規定する研究の大部分は、Ｓ．ｓｐｐ．において実施されている。なぜ
なら、これらは消化管関連リンパ系組織（ＧＡＬＴ）との直接的相互作用によっ
て感染を樹立し、強い体液免疫性応答をもたらすからである。これらはまた、宿
主細胞に侵入し、従って強い細胞媒介応答を惹起し得る。Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ
（１９９９）Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎ
ｅ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｐａｔｅｒｓｏｎ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）
５１〜１０９頁；Ｈｏｎｅら（１９９９）Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂａｃ
ｔｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｐａｔｅｒｓｏｎ編、Ｗｉｌ
ｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）１７１〜２２１頁；Ｓｉｒａｒｄら（１９９９）Ｉ
ｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．１７１：５〜２６。理想的には、これらの弱毒化微生物は、
特異的な抗体誘導のために必要である細胞表面成分の完全な一体性を維持するが
、依然として疾患を引き起こし得ない。なぜなら、例えば、これらは宿主におい
て、毒性因子を産生しないか、非常に遅く増殖するか、または全く増殖しないか
らである。さらに、これらの弱毒化株は、ビルレント野生型株を復帰変異させる
可能性を実質的に有さないべきである。伝統的に、生ワクチンは、抗原的に関連
するウイルスを別の種から単離すること、非標的種もしくは組織培養物における
、継代および適応による弱毒化を選択すること、または温度感受性改変体を選択
することのいずれかによって、得られた。最初のアプローチは、痘瘡に対してヒ
トを予防接種するためにウシポックスウイルスを使用した、Ｅｄｗａｒｄ Ｊｅ
ｎｎｅｒにより使用された。
【００２３】 非標的種において系列継代による弱毒化を選択することは、生ワクチンを得る
際に広く成功している第二のアプローチである。例えば、Ｐａｒｋｍａｎら、Ｎ
．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２７５：５６９〜５７４（１９６６）は、ミドリザ
ル腎臓細胞での系列増殖後に弱毒化風疹ワクチンを開発した。麻疹ワクチンが、
ニワトリ胚線維芽細胞においてウイルスを継代させることによって、調製された
。ポリオ、Ａ型肝炎、Ｂ型日本脳炎、デング熱、およびサイトメガロウイルスに
対するワクチンは、類似の手順に従って、全て調製されている。
【００２４】 動物モデル、特にサルが、系列継代および選択による生ワクチンの開発におい
て有用であるが、ワクチンが本当に非病原性であるかどうかの大きな不確実性が
、ヒトに接種されるまで残る。例えば、感染された幼い（ｓｕｃｋｌｉｎｇ）マ
ウス脳から産生される黄熱病のＤａｋｅｒ株は、１％のワクチンにおいて脳炎を
誘導した。別の重大な問題は、細胞培養物または動物（特に、サル）における継
代の間の外因性ウイルスによる、可能なワクチンの汚染である。動物からヒトへ
と伝達され得るウイルスの潜在的な危険に関するより最近の知見から、生ワクチ
ンを開発するこの選択は、非常に疑わしい。
【００２５】 上述の、生ワクチンを選択するいくらか危険なアプローチとは対照的に、現代
の開発アプローチは、病原体が疾患を誘導する能力に影響を与える特異的な変異
を、その病原体のゲノムに導入する。規定された遺伝子操作は、病原性微生物に
より引き起こされる種々の疾患に対する生ワクチンを開発する試みにおいて取ら
れる、現在のアプローチである。
【００２６】 より安全であり、より高い免疫性応答を惹起する生ワクチンを開発する努力に
おいて、研究者らは、特異的な遺伝的変異を有する生ワクチンを開発する努力に
焦点を当てた。Ｃｕｒｔｉｓｓは、米国特許第５，２９４，４４１号において、
Ｓ．ｔｙｐｈｉが、ｃｙａ（アデニレートシクラーゼ）遺伝子およびｃｒｐ（環
状３’，５’−ＡＭＰ［ｃＡＭＰ］レポータータンパク質）遺伝子のいずれかま
たは両方の欠失（Δ）を構築することによって弱毒化され得ることを開示する。
ｃＡＭＰおよびｃＡＭＰレセプタータンパク質（それぞれ多面性遺伝子ｃｙａお
よびｃｒｐの産物）は、互いに組み合わさって機能して、調節性複合体を形成し
、これは、多数の遺伝子およびオペロンの転写に影響を与える。その結果、これ
らの遺伝子のいずれかを変異させることによって、弱毒化微生物が得られる。さ
らに、ｃｙａ遺伝子またはｃｒｐ遺伝子のいずれかにおいて単一の変異を有する
微生物は、これらの遺伝子産物を予防接種されるべき宿主から清掃することによ
って、その欠損を補充し得ない。ｃｒｐ遺伝子産物は、哺乳動物組織においては
利用可能ではなく、そして一方で、ｃｙａ遺伝子産物により産生される代謝物（
ｃＡＭＰ）は、哺乳動物細胞内に存在し、Ｓ．ｔｙｐｈｉが侵入する細胞内に存
在する濃度は、ｃｙａが変異して野生型表現型を発現し得るために必要な濃度よ
り低い。Ｃｕｒｔｉｓｓら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、５５：３０３５〜３
０４３（１９８７）を参照のこと。
【００２７】 ｃＡＭＰは、いくらかのレベルで宿主組織に存在するので、Ｃｕｒｔｉｓｓら
は、変異をｃｒｐ遺伝子に導入することによって、Δ ｃｙａ微生物を安定化さ
せた。Ｔａｃｋｅｔら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６０（２）：５６３〜５
４１（１９９２）は、健康な成人入院患者志願者での研究を行い、この研究は、
ｃｙａ遺伝子およびｃｒｐ遺伝子に欠失を有する弱毒化Ｓ．ｔｙｐｈｉが熱およ
び菌血（血液中の細菌）を生成する傾向を有することを明らかにした。
【００２８】 生ワクチンを開発するための試みにおける類似のアプローチが、Ｄｒ．Ｂ．Ａ
．Ｄ．Ｓｔｏｃｋｅｒによりなされた。Ｓｔｏｃｋｅｒにより変異された遺伝子
は、これもまた宿主組織において生存不可能である産物を産生する。Ｓｔｏｃｋ
ｅｒは、米国特許第５，２１０，０３５号において、完全かつ非復帰変異ブロッ
クを生合成経路に導入することによって非ビルレントにされ、宿主組織において
利用不可能な代謝産物の要件を引き起こす、病原性微生物由来のワクチン株の構
築を記載する。具体的には、Ｓｔｏｃｋｅｒは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａをｐ−ア
ミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）および２，３−ジヒドロキシベンゾエート（哺乳動物
組織中の細菌に対して利用可能ではない物質）に対して栄養素要求性（すなわち
、栄養依存性）にする芳香族（ａｒｏ）代謝産物の生合成のための経路を中断す
ることによって、Ｓ．ｔｙｐｈｉが弱毒化され得ることを教示する。これらのａ
ｒｏ変異は、コリスミ酸（芳香族化合物ＰＡＢＡおよび２，３−ジヒドロキシベ
ンゾエートの前駆体）の合成を不可能にし、そしてＳａｌｍｏｎｅｌｌａには、
この欠損を克服し得る他の経路が存在しない。この栄養素要求性の結果として、
ａｒｏ欠失細菌は、宿主内で増殖し得ない；しかし、これらは、保護的な免疫性
応答を刺激するに十分に長く、細胞内で生存および増殖する。上述のＴａｃｋｅ
ｔらにより著作された技術論文において、Ｓ．ｔｙｐｈｉの弱毒化株もまた、Ｓ
ｔｏｃｋｅｒに従って、ａｒｏＣ遺伝子およびａｒｏＤ遺伝子に欠失を導入する
ことによって、ワクチンとしての使用のために構築された。しかし、健康な入院
患者志願者に投与されたこれらの弱毒化株は、熱および菌血を生成する傾向を有
する（Ｈｏｎｅら（１９８７）、Ｈｏｒｍａｅｃｈｅら（１９９６）Ｖａｃｃｉ
ｎｅ １４：２５１〜２５９；ＨａｓｓａｎおよびＣｕｒｔｉｓｓ（１９９７）
Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．４１：７８３〜７９１；ならびにＭｉｌｌｅｒら（１９９
０）Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４１：８１７〜８２１）。
【００２９】 これらのワクチン間の比較研究は、厳密には試験されておらず、従って、これ
らの現在の株の互いに対する効力は、不明確なままである。さらに、現在の生細
菌ワクチン候補の毒性（例えば、下痢のような症状）、およびヒト集団における
多くの個体が免疫無防備状態であることの現実性は、より良好な保護を与え、よ
り長く続き、そしてより低い毒性を有する、さらなるワクチンの検索を明らかに
正当化する。
【００３０】 ワクチン開発に関する別の重要な問題は、多くの病原性種が、類似の病原性株
に対して予防接種された動物宿主において疾患を引き起こし得る、複数の血清型
からなるという事実である。長期にわたる相互保護的なＳａｌｍｏｎｅｌｌａワ
クチンの開発の以前の試みは、しばしば疑問であった。例えば、生弱毒化ａｒｏ
Ａ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株は、異種の血清型（例えば、Ｂ群株（ｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍ）およびＤ群株（ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓおよびｄｕｂｌｉｎ））に
対する相互保護応答を惹起するがことが示されたが、この相互保護的な能力は、
このワクチンが免疫化された動物から除去された後に、事実上は排除される。Ｈ
ｏｒｍａｅｃｈｅら（１９９６）。
【００３１】 多くの細胞高分子と同様に、ＤＮＡは、インタクトなポリマーに小さな化学部
分を付加することによって、合成後「改変」に曝される。種々の生物において、
これは、図２に示すように、シトシンのＣ５位またはアデノシンのＮ６位のいず
れかでの、ＤＮＡへのメチル（−ＣＨ3）基の酵素的付加を伴う。ＤＮＡへのメ
チル基の付加の原因となる酵素は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼまたはＤＮ
Ａメチラーゼとして公知である。ＤＮＡメチラーゼは、以下の２つの分類に分割
され得る：（１）シトシンをメチル化するもの（ＤＮＡシトシンメチラーゼ）；
および（２）アデニンをメチル化するもの（ＤＮＡアデニンメチラーゼ）。
【００３２】 ＤＮＡアデニンメチラーゼ（Ｄａｍ）によるアデニン残基でのメチル化は、重
要な生物学的プロセス（例えば、ＤＮＡ複製、メチル指向ミスマッチ塩基対修復
、および転移）のタイミングおよび標的化を制御する（Ｍａｒｉｎｕｓ、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｉ
ｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、７８２〜７９１（１９９６））。さらに
、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、Ｄａｍは、上尿路感染症の重要な毒性決定因子である
腎盂腎炎関連毛（ｐａｐ）のようなオペロンの発現を調節する（Ｒｏｇｅｒｔｓ
ら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．、１３３：１０６８〜１０７５（１９８５）；ｖａｎ ｄｅ
ｒ Ｗｏｕｄｅら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４：５〜９（１９９
６））。後者の調節機構は、遺伝性ＤＮＡメチル化パターンの形成を包含し、こ
れは、調節タンパク質の結合を改変することによって、遺伝子発現を制御する。
【００３３】 生の病原性微生物から調製されるワクチンであって、安全であり、宿主に投与
されるとその宿主に効果的な型の免疫性応答を誘導する、ワクチンに対する重大
な必要性が残っている。異なる株（すなわち、ヘテロ血清型または種）に対する
免疫性応答を刺激し得る単一のワクチン株を開発することもまた、非常に所望さ
れる。病原性微生物により引き起こされる疾患に苦しむ患者を処置するために使
用され得る、安全かつ効果的な抗菌性薬物に対するさらなる必要性もまた、存在
する。
【００３４】 本願に引用する全ての参考文献および特許出願は、その全体が本明細書中に参
考として援用される。
【００３５】 （発明の要旨） 本発明は、ＤＮＡアデニンメチラーゼ（Ｄａｍ）がＳａｌｍｏｎｅｌｌａの病
因に必須であるという発見、ならびにＤａｍ-Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａがマウス腸
チフスに対する生弱毒化ワクチンとして効果的であり、そしてＳａｌｍｏｎｅｌ
ｌａの第二種に対する免疫性応答を惹起するという発見に基づく。ＤＮＡアデニ
ンメチラーゼは、有意な罹病率および死亡率を引き起こす多くの病原性細菌にお
いて高度に保存されるので、これらの病原体のＤａｍ誘導体は、生弱毒化ワクチ
ンとして効果的であり得る。さらに、ＤＮＡアデニン残基のメチル化は、細菌毒
性のために必須であるので、ＤＮＡアデニンメチラーゼの発現を変化させるか、
またはその活性を阻害する薬物は、恐らく広い抗菌作用を有し、従って、ＤＮＡ
アデニンメチラーゼおよびその産物をコードする遺伝子は、抗菌薬物開発のため
の前途有望な標的である。
【００３６】 従って、本発明の目的は、病原性微生物または類似の病原性微生物のスペクト
ルに対して宿主を予防接種するための、生ワクチンを提供することである。
【００３７】 本発明のさらなる目的は、抗原、好ましくは他の病原体の免疫原、特に微生物
（ウイルス、原核生物、および真核生物を含む）のためのキャリアとして働く、
生ワクチンを提供することである。
【００３８】 本発明のなお別の目的は、ＤＮＡアデニンメチラーゼおよびＤＮＡアデニンメ
チラーゼの産生を担う遺伝子を特異的に阻害する、抗菌薬物を提供することであ
る。さらに、本発明の組成物は、（ｉ）ＤＮＡアデニンメチラーゼ酵素活性、（
ｉｉ）ＤＮＡアデニンメチラーゼの発現、（ｉｉｉ）ＤＮＡアデニンメチラーゼ
アクチベーター、（ｉｖ）ＤＮＡアデニンメチラーゼレセプターに対する活性化
化合物、および／または（ｖ）ＤＮＡアデニンメチラーゼによって調節される毒
性因子、に対して阻害効果を有する、天然分子ならびに合成分子を含有する。
【００３９】 従って、本発明の１つの局面は、薬学的に受容可能な賦形剤中に生弱毒化病原
性細菌を含有する免疫原性組成物を提供し、この病原性細菌は、ＤＮＡアデニン
メチラーゼ（Ｄａｍ）活性を変化させる変異を含み、その結果、この病原性細菌
が弱毒化される。
【００４０】 別の局面において、本発明は、薬学的に受容可能な賦形剤中に殺傷された病原
性細菌を含有する免疫原性組成物を提供し、この病原性細菌は、変異ＤＮＡアデ
ニンメチラーゼ（Ｄａｍ）活性を変化させる変異を含む。
【００４１】 別の局面において、本発明は、病原性細菌の弱毒化株を提供し、この細菌は、
Ｄａｍ活性を変化させる変異を含み、その結果、この細菌が弱毒化される。
【００４２】 別の局面において、本発明は、個体において免疫性応答を惹起する方法を提供
し、この方法は、本明細書中に記載の任意の組成物を、免疫性応答を惹起するに
十分な量で個体に投与することを伴う投与を包含する。
【００４３】 別の局面において、本発明は、個体において病原性細菌による感染を予防する
方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載の任意の免疫原性組成物を、病原
性細菌による感染の際に、病原性細菌による感染に関する症状を減少させるに十
分な量で、個体に投与することを包含する。
【００４４】 別の局面において、本発明は、個体において病原性細菌による感染を処置する
方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載の任意の免疫原性組成物を、病原
性細菌による感染に関する症状を個体において減少させるに十分な量で、個体に
投与することを包含する。
【００４５】 別の局面において、本発明は、病原性細菌に感染した個体を処置する方法を提
供し、この方法は、Ｄａｍ活性を変化させる薬剤を含有する組成物を個体に投与
することを包含する。
【００４６】 別の局面において、本発明は、個体においてＳａｌｍｏｎｅｌｌａの第二種に
対する免疫性応答を惹起する方法を提供し、この方法は、弱毒化第一種Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａを含有する免疫原性組成物を個体に投与することを包含し、この第
一種は、Ｄａｍ活性を変化させる変異を含み、その結果、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
が弱毒化される。
【００４７】 別の局面において、本発明はまた、スクリーニング方法を提供する。本発明は
、抗菌活性を有し得る薬剤を同定する方法を包含し、この方法は、インビトロ転
写系を使用して、その薬剤がインビトロ転写系に添加される場合にｄａｍ遺伝子
からの転写のレベルを変化させる薬剤を検出することを包含し、ここで、薬剤は
、薬剤が添加されない場合の転写のレベルと比較して、ｄａｍ遺伝子からの転写
のレベルを変化させるその能力によって同定される。
【００４８】 別の局面において、本発明は、抗菌活性を有し得る薬剤を同定する方法を提供
し、この方法は、インビトロ転写系を使用して、インビトロ転写系にその薬剤が
添加される場合に、ＤａｍをコードするＲＮＡ転写物からの翻訳のレベルを変化
させる薬剤を検出する工程を包含し、ここで、薬剤は、薬剤が添加されない場合
の翻訳のレベルと比較して、ＤａｍをコードするＲＮＡ転写物からの翻訳のレベ
ルを変化させるその能力によって、同定される。
【００４９】 別の局面において、本発明は、抗菌活性を有し得る薬剤を同定する方法を提供
し、この方法は、その薬剤がＤａｍに結合するか否かを決定する工程を包含し、
ここで、薬剤は、Ｄａｍに結合するその能力によって同定される。
【００５０】 別の局面において、本発明は、抗菌活性を有し得る薬剤を同定する方法を提供
し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）Ｄａｍ結合部位を含む非メチル
化オリゴヌクレオチドを、Ｄａｍ、Ｓ−アデノシルメチオニン（Ｓ−ａｄｅｎｏ
ｓｙｌａｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、および薬剤と共にインキュベートする工程で
あって、ここでこの非メチル化オリゴヌクレオチドは、シグナルをさらに含む、
工程；（ｂ）全ての非メチル化標的部位を消化する工程であって、これによって
この非メチル化オリゴヌクレオチドを放出する工程；ならびに（ｃ）この非メチ
ル化標的部位の消化に起因するこのシグナルの増加として、ＤＮＡアデニンメチ
ラーゼの阻害を検出する工程であって、ここで、薬剤は、工程（ａ）、（ｂ）、
および（ｃ）の薬剤の非存在下での実施と比較して、シグナルの増加を引き起こ
すその能力によって同定される、工程。
【００５１】 別の局面において、本発明は、抗菌活性を有し得る薬剤を同定する方法を提供
し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）試験されるべき薬剤を、Ｄａｍ
機能を有する適切な宿主細胞と接触させる工程；および（ｂ）Ｄａｍ機能の変化
に関連する少なくとも１つの特徴を分析する工程であって、ここで、薬剤は、こ
の特徴の少なくとも１つを惹起するその能力により同定される、工程。
【００５２】 本発明はまた、本明細書中に記載のワクチンおよび株を調製する方法を提供す
る。１つの局面において、本発明は、本明細書中に記載の免疫原性組成物を調製
する方法を提供し、この方法は、薬学的賦形剤を、ＤＮＡアデニンメチラーゼ（
Ｄａｍ）活性を変化させる変異を含む病原性細菌と組み合わせる工程を包含し、
その結果、病原性細菌が弱毒化される。
【００５３】 別の局面において、本発明は、対応するかまたは類似の病原性微生物により引
き起こされる疾患に感染しやすい宿主による免疫性応答を惹起し得る弱毒化細菌
を調製するための方法を提供し、この方法は、少なくとも１つの変異をこの病原
性細菌において構築する工程を包含し、ここで、第一変異が、変化したＤａｍ機
能をもたらす。
【００５４】 本発明の別の目的は、ワクチンが、毒性遺伝子の全体の調節因子の発現を変化
させることにより、およびより具体的には、ＤＮＡアデニンメチラーゼの発現を
変化させることにより産生され得る方法を提供することである。
【００５５】 本発明の別の目的は、ワクチンが、ＤＮＡアデニンメチラーゼにより調節され
る遺伝子の発現を変化させることによって産生され得る方法を提供することであ
る。
【００５６】 別の局面において、本発明は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａのようなビルレント病原
性細菌から生ワクチンを調製するための方法を提供し、この方法は、それに対し
てワクチン化されることが所望される微生物であるか、もしくはそれに類似する
病原性細菌のビルレント株において、ＤＮＡアデニンメチラーゼの発現および／
またはＤＮＡアデニンメチラーゼにより調節される遺伝子の発現を変化させる工
程を包含する。
【００５７】 本発明のなおさらなる目的は、ＤＮＡアデニンメチラーゼの発現を変化させる
か、またはその活性を阻害する化合物をその脊椎動物に投与することによって、
病原体に感染した脊椎動物のような宿主を処置する方法を提供することである。
【００５８】 本発明のさらなる目的、利点および新規特徴は、部分的には以下の詳細な説明
に記載され、そして部分的には以下の明細書を調査することによって当業者に明
らかとなるか、または本発明の実施により知られ得る。本発明の目的および利点
は、添付の特許請求の範囲に特に指摘する器具、組合せ、組成物、および方法に
よって、理解され、そして達成され得る。
【００５９】 （詳細な説明） 本発明者らは、ｄａｍ遺伝子およびその産物酵素ＤＮＡアデニンメチラーゼ（
Ｄａｍ）が細菌性毒性のために必要であることを発見した。Ｄａｍ機能に関する
以前の研究の努力にも関わらず、細菌性毒性におけるＤａｍの重要な役割、この
役割の発明的意義、およびＤａｍ-変異体ワクチンが保護免疫応答を誘発する能
力について報告されていない。以前に他の研究室からｄａｍ変異について報告さ
れたもの全ては、腹腔内に送達される場合に、野生型より少なくとも１０００倍
低い毒性であるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株ＬＴ２を使用した。この発見の知識と合
わせて、本発明は、（ａ）（ｉ）ＤＮＡアデニンメチラーゼの発現のような機能
を変更する遺伝子、および／または（ｉｉ）ＤＮＡアデニンメチラーゼによって
調節される遺伝子のいずれかにおける非復帰遺伝子変異を有するワクチン；（ｂ
）（ｉ）ＤＮＡアデニンメチラーゼおよび／またはＤＮＡアデニンメチラーゼを
コードする遺伝子、（ｉｉ）ＤＮＡアデニンメチラーゼのアクチベーターおよび
／またはＤＮＡアデニンメチラーゼのリプレッサーのための活性化化合物、なら
びに（ｉｉｉ）Ｄａｍによって調節される毒性因子、に対する結合特異性を有す
る天然分子および／または合成分子であるインヒビターのクラス；（ｃ）ＤＮＡ
アデニンメチラーゼが細菌性病因に対して重要であるという知識に基づくワクチ
ンおよびインヒビターを調製するための方法；（ｄ）本明細書中に記載される免
疫原性組成物を使用して免疫応答を誘発する方法；（ｅ）（ｉ）病原性微生物で
感染される前に本発明のワクチンを用いてか、または（ｉｉ）病原性微生物で感
染された後に本発明のインヒビターを用いて脊椎動物を処置する方法；（ｆ）本
明細書中に記載される免疫原性組成物を使用して感染を予防する方法；ならびに
（ｇ）有用な治療用薬剤であり得る化合物を同定するためのスクリーニング方法
、に関する。
【００６０】 実施例に記載されるように、動物の５０％を殺傷するために必要とされるＳ．
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＤａｍ-変異体（ｄａｍ遺伝子（Ｍｕｄ−Ｃｍ）への
挿入によって生成される）の経口致死量（ＬＤ50）は、野生型と比較して１０，
０００倍より大きく増加し、腹腔内（ｉ．ｐ．）ＬＤ50は、野生型と比較して１
，０００倍より大きく増加した（実施例１；表１）。さらに、高度に弱毒化した
Ｄａｍ-変異体は、マウス腸チフスの当該分野で受け入れられたモデルにおいて
保護免疫応答を付与することが見出された（実施例２；表２）。Ｓ．ｔｙｐｈｉ
ｍｕｒｉｕｍ Ｄａｍ-挿入株で免疫した全ての１７のマウスは、ＬＤ50を超え
る１０+4の野生型チャレンジを生存させ、一方全ての１２の免疫していないマウ
スはチャレンジ後に死亡した。Ｄａｍ+ＳａｌｍｏｎｅｌｌａとＤａｍ-Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａを比較する生存研究は、Ｄａｍ-細菌が粘膜部位（パイアー班）の
コロニー形成において完全に秀でていることを示したが、より深い組織部位のコ
ロニー形成において重大な欠陥を示した（実施例２；図６）。理論に束縛される
ことを望むことなく、本発明者らは、Ｄａｍ-が保護免疫応答を誘発する理由の
１つの可能な説明が、変異体細菌が免疫応答を誘発するのに十分に長く腸粘膜に
おいて増殖することであるが、より深い組織に侵入および／またはコロニー形成
し得ないからであるということに注目する。
【００６１】 なおさらに驚くべきことに、特にＳａｌｍｏｎｅｌｌａの１種を含有するワク
チンが、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの第２の種に対する免疫応答、または第２の株に
対する少なくとも有意な持続する免疫応答を誘発し得ないという当該分野におい
て広範囲に支持された見解の点で、特にこれらの種が単一の遺伝子における変異
のために弱毒化される場合、本発明者らのデータはこのような交差保護を示す。
Ｄａｍ-Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍで免疫したマウス（血清型Ｂ）は、免疫の
１１週間後、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓおよびＳ．ｄｕｂｌｉｎ（血清型Ｄ）
で異種チャレンジ（１００〜１０００ ＬＤ50）に対して保護された（実施例３
；表３）。この保護は、ワクチン株が免疫された動物から取り除かれた後の６週
間より長く持続した（すなわち、６週間を超えても、Ｄａｍ-生物がパイアー班
、腸間膜リンパ節、肝臓および脾臓において検出され得なかった）。Ｓａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ交差保護と対照的に、免疫の５週間後にＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕ
ｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対して保護が観察されなかった。同様に、Ｄａ
ｍ-Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓによる免疫は、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍお
よびＳ．ｄｕｂｌｉｎに対する交差保護を付与した。生弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ株が、群Ｂ（ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株と群Ｄ（ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ
およびｄｕｂｌｉｎ）株（共有の共通ＬＰＳ抗原性決定基に帰属される）との間
の交差保護を誘発することを示したが、この交差保護応答は、非常に短い寿命で
あり、免疫の１０〜１２週間後、実質的に除去される。Ｈｏｒｍａｅｃｈｅら（
１９９６）Ｖａｃｃｉｎｅ ２５１〜２５９。
【００６２】 実施例１および３に記載されるようなＤａｍ誘導体の異所性発現（すなわち、
通常は抑制されるタンパク質の発現）は、ワクチン開発に対する広範な適用を有
する。多くの病原体のＤａｍ誘導体における異所性発現は、親の毒性生物に対す
る保護および／または交差保護応答を生じ得る。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｄａｍ
誘導体は、同族病原体に対する強い保護免疫応答を誘発するパッセンジャー細菌
性抗原およびウイルス性抗原を発現するためのプラットフォームとしての有用性
を有し得る。Ｄａｍ-免疫したマウスが完全毒性のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ生物の
致死細菌負荷を取り除き得るので、Ｄａｍ-ワクチンは予め存在する感染を効果
的に処置するための治療的有用性を有し得る。Ｄａｍ-誘導体は、複合タンパク
質を異所的に発現するので、ワクチンがヒトに対して害の少ない株中に構築され
得る可能性が開かれ、これは、免疫無防備状態の個体に対する感染の危険性を減
少する一方で、生ワクチンによって誘発される高レベルの保護の利益を開発する
。
【００６３】 ＤＮＡアデニンメチラーゼが、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａの細菌性病因論の
ために必須であるという事実はまた、非常に重要であり、その含意は多い。第１
には、ｄａｍ遺伝子は病原性細菌において高度に保存され、すなわち、ある微生
物のｄａｍの遺伝子配列は、同一の種においてのみならず細菌の属にわたる別の
微生物のｄａｍ遺伝子と配列同一性を共有し；そして第２には、このｄａｍ遺伝
子は毒性に関与する多くの遺伝子を調節する。ＤＮＡアデニンメチラーゼは有意
な羅患率および死亡率をもたらす多くの病原性細菌（例えば、Ｖｉｂｒｉｏ ｃ
ｈｏｌｅｒａｅ（Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ および Ｄａｓ，Ｇｅｎｅ，１
４０：６７〜７１（１９９４））、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ（１９９
９〜３，Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ）、病原性Ｅ．Ｃｏｌｉ（Ｂｌａｔｔｎｅ
ｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：１４５３〜１４７４（１９７７）、Ｙｅｒｓｉ
ｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ（１９９９〜３，Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ）、Ｈａｅ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２６９：４９６〜５１２（１９９５）、およびＴｒｅｐｏｎｅｍａ
ｐａｌｌｉｄｕｍ（Ｆｒａｓｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：３７５〜３８８
（１９９８）））に高度に保存されるので、これらの病原体のＤａｍ誘導体は生
弱毒化ワクチンとして有効であり得る。さらに、Ｄａｍは細菌毒性のために必須
であるので、Ｄａｍインヒビターは広範な抗菌性作用を有すると考えられ、従っ
て、ＤａｍまたはＤａｍの発現を変更する任意の遺伝子は、抗菌性薬物の開発の
ための有望な標的である。
【００６４】 この含意は、以下の通りである：（１）（ｉ）ＤＮＡアデニンメチラーゼおよ
び／またはｄａｍ遺伝子、（ｉｉ）Ｄａｍ活性因子および／またはＤａｍリプレ
ッサーのための活性化合物、ならびに（ｉｉｉ）Ｄａｍによって調節される毒性
因子、に対して結合特異性を有する天然分子および／または合成分子であるイン
ヒビターのクラスを合理的に開発することが現在において可能である；ならびに
（２）（ｉ）ＤＮＡアデニンメチラーゼの発現を変更する遺伝子および／または
（ｉｉ）ＤＮＡアデニンメチラーゼによって調節される毒性遺伝子のいずれかに
おいて非復帰遺伝子変異を有するワクチンを産生することが現在において可能で
ある。Ｄａｍは、遺伝子発現の包括的な調節因子であり、そしてこれらの調節さ
れた遺伝子の多くは種々の種および属に保存されるので、ＤＮＡアデニンメチラ
ーゼに基づくインヒビターおよびワクチンが交差保護を与えることが非常にあり
得る。従って、上で議論されるように、病原体の１つの株、種、血清型および／
または群に対するインヒビターまたはワクチンは、病原体の異なる株に対する保
護を提供する。
【００６５】 本明細書中に記載される組成物は、個体への投与のために使用され得る。それ
らは、例えば、実験的目的のために、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ抗体のような
抗菌抗体の供給源を得るために、投与され得る。それらはまた、個体の免疫応答
を誘発するために、および感染から個体を保護するために、またはＳａｌｍｏｎ
ｅｌｌａのような毒性細菌に感染された個体を処置するために、投与され得る。
【００６６】 （一般的技術） 本発明の実施は、他に示されない限り、以下を採用する：当該分野の技術内に
ある分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免
疫学の従来の技術。このような技術は、例えば以下の文献に完全に説明される。
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ、第二版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃ
ｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ
．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉ ＆ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒ
ａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒら ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ
．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏら編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．
Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃ
ｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ
ら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９９）。
【００６７】 （定義） 「ＤＮＡアデニンメチラーゼ」（Ｄａｍ）は、ＤＮＡのアデニン残基をメチル
化し得る酵素の群として定義される。Ｄａｍ遺伝子およびｄａｍ遺伝子によって
コードされるＤａｍ産物は当該分野において公知であり、この定義は、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ（ｇｉ １１８６８２）およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ（ｇｉ ２５００１５
７）由来のＤＮＡアデニンメチラーゼと同様の重要なアミノ酸を共有し、そして
ＤＮＡの配列「ＧＡＴＣ」を優先的にメチル化し、アデニンのＮ−６位をメチル
化するＤａｍ酵素を含む。特に、Ｄａｍの領域をコードする高度に保存されたＤ
ＮＡ配列は、本明細書中に記載されるような配列番号１〜４に示される。当該分
野で受諾されている表記に従って、「ｄａｍ」または「ｄａｍ遺伝子」は、ＤＮ
Ａアデニンメチラーゼをコードする遺伝子を示し、そして「Ｄａｍ」は、ＤＮＡ
アデニンメチラーゼ（すなわち、そのポリペプチド）を示す。本発明の目的のた
めに、遺伝子は、コード領域および／または調節領域を包含すると定義される。
【００６８】 Ｄａｍ「活性」または「機能」は、ｄａｍ発現または非発現に関連した任意の
生物活性を意味する。Ｄａｍ活性は、本明細書中に記載される。例えば、ｄａｍ
の非発現は、Ｄａｍによって調節される特定の遺伝子の抑制（または、あるいは
、脱抑制）を導き；従って、これらの遺伝子のいずれかの抑制（または、脱抑制
）は、Ｄａｍ活性である。別の例として、ＤＮＡのアデニンのメチル化（例えば
、ＧＡＴＣのメチル化）は、ｄａｍ発現および得られるＤａｍ産物に関する活性
であり；従って、アデニンメチル化は、Ｄａｍ活性である。従って、Ｄａｍ「活
性」または「機能」は、ｄａｍ発現に関する生物活性のいずれか１つ以上を包含
する。
【００６９】 Ｄａｍ活性の「変更」は、野生型Ｄａｍ機能と比較した任意のＤａｍ活性の任
意の変化である。「変更」は、Ｄａｍ活性の完全な損失であってもよいし、そう
でなくてもよく、Ｄａｍ活性の増加または減少を含む。Ｄａｍ活性を変更する変
異を含む細菌は、一般に「Ｄａｍ誘導体」といわれる。
【００７０】 「発現」は、転写および／または翻訳、ならびに発現に影響を及ぼす任意の因
子または事象（例えば、発現に影響を及ぼす第２の遺伝子のような上流事象）を
含む。
【００７１】 「ワクチン」は、ヒトの使用または動物の使用のための薬学的組成物、特に、
特定の標的または標的の群に対するある程度の特異的な免疫学的反応性（すなわ
ち、特定の標的または標的の群に対する免疫応答を誘発および／または増強する
）をレシピエントに付与するという意図で投与される免疫原性組成物である。こ
の免疫反応性または応答は、標的に対して免疫学的に反応性である抗体または細
胞（特に、Ｂ細胞、形質細胞、Ｔヘルパー細胞、および細胞傷害性Ｔリンパ球、
ならびにそれらの前駆体）、あるいはそれらの任意の組み合わせであり得る。本
発明の目的のために、標的は主にＳａｌｍｏｎｅｌｌａのような毒性細菌である
。弱毒化された細菌がキャリアとして使用される場合、この標的は本明細書中に
記載される別の抗原であり得る。免疫学的反応性は、実験的目的、特定の状態の
処置、特定の物質の除去、および／または予防のために所望され得る。
【００７２】 「病原性」細菌は、疾患をもたらし得る細菌である。「毒性」は、感染された
総数に対する明白な感染のケースの数の比として数で表され得る病原性の程度の
指数である。本明細書中に記載されるワクチンに使用される病原性細菌は、実験
室で通常使用される無毒株以外であり、そして公知であり、および／または疾患
を引き起こし得ることが理解される。
【００７３】 本明細書中に記載される組成物に使用される「弱毒化された」細菌は、減少し
た毒性を示す細菌である。当該分野で十分に理解され、そして上記したように、
毒性は、細菌が所与の集団の疾患をもたらし得る程度である。本発明の目的のた
めに、弱毒化された細菌は、一般に適切な政府機関によって指示されるように、
適切かつ受容可能な安全レベルに減少される毒性を有する。受容可能である弱毒
化の程度は、特に、レシピエント（すなわち、ヒトまたは非ヒト）ならびに例え
ば米国食品医薬品局（ＦＤＡ）のような規制機関によって提供される種々の規制
および基準に依存する。最も好ましくは、特にヒトの使用の場合、弱毒化された
細菌は無毒性であり、これらの生物の投与が疾患症状をもたらさないことを意味
する。当該分野において十分に理解されるように、弱毒化された細菌は、少なく
とも投与時において生きている。
【００７４】 「抗原」は、抗体またはＴ細胞抗原レセプターによって特異的に認識および結
合される物質を意味する。当該分野において十分に理解されるように、抗原は、
ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、ポリサッカリド、ガングリオシドおよび
脂質、ならびにそれらの一部および／または組み合わせを含み得る。抗原は、天
然に見出される抗原であり得るか、または合成であり得る。
【００７５】 「アジュバント」は、本明細書中に記載される弱毒化された細菌の免疫原性を
増強するためにその弱毒化された細菌と組み合わせて与えられる化学的因子また
は生物学的因子である。当該分野において公知であるように、「アジュバント」
は、抗原に加えられた場合に、レシピエント（宿主）の抗原に対する免疫応答を
非特異的に増強させるかまたは強化する物質である。
【００７６】 免疫応答（Ｂ細胞応答および／またはＴ細胞応答であり得る）を「刺激する」
、「誘発する」、または「惹起する」は、応答の増加を意味し、これは応答の誘
発および／増強から生じ得る。
【００７７】 「異種」は、比較される実体から誘導されること、および／または比較される
実体から異なることを意味する。例えば、細菌株に対する「異種」抗原は、その
株に通常かつ天然では関連しない抗原である。
【００７８】 「有効量」は、臨床的結果を含む有利なまたは所望の結果をもたらすのに十分
な量であり、それ自体、「有効量」は、適用される状況に依存する。有効量は、
１以上の用量で投与され得る。本発明の目的のために、Ｄａｍ誘導体細菌（また
はＤａｍ誘導体細菌を含む組成物）の有効量は、免疫応答を誘導する量である。
処置に関して、有効量は、細菌性疾患の進行を緩和し、改善し、安定化し、取り
消し、または減速するか、さもなくば疾患の病理学的結果を減少させるのに十分
な量である。予防に関して、有効量は、曝露および感染の際の１以上の症状を減
少させる（または完全に排除する）のに十分な量である。
【００７９】 「処置」は、有利なまたは所望の臨床的結果を得るための方法である。有利な
または所望の臨床的結果として、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定化
された（すなわち、悪化ではない）状態、疾患の伝播の予防、疾患進行の遅延ま
たは減速、疾患状態の改善または軽減が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】 疾患または感染の「予防」は、組成物を受容することを除いて、他の同じ状態
と比較して、本明細書中に記載される組成物を受容する個体の感染の１つ以上の
症状の減少（排除を含むが、これに限定されない）を意味する。当該分野におい
て理解されるように、感染の「予防」は、穏やかな症状を含み得るが、必ずしも
感染に関連した症状の排除を意味しない。
【００８１】 「宿主」と相互交換可能に使用される「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳
動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物として、家畜動物（例えば、ウシ）
、競技用動物、およびペットが挙げられるが、これらに限定されない。「個体」
はまた、ニワトリのような家禽を含む。「宿主」は、細菌に感染されていなくて
も感染されていてもよい。
【００８２】 「薬剤」は、単純または複雑な有機または無機の分子、ポリペプチド、ポリヌ
クレオチド、炭水化物またはリポタンパク質のような生物学的化合物または化学
的化合物を意味する。莫大な数の化合物（例えば、オリゴペプチドおよびオリゴ
ヌクレオチドのようなオリゴマー、および種々のコア構造に基づく合成有機化合
物）が合成され得、これらも、用語「薬剤」に含まれる。さらに、種々の天然の
供給源は、植物または動物の抽出物などのようなスクリーニングのための化合物
を提供し得る。化合物は、単一で、または互いに組み合わせて、試験され得る。
【００８３】 「抗菌活性」または「毒性制御」は、薬剤が、細菌の疾患をもたらす能力に負
に影響を及ぼし得ることを意味する。本発明の目的のために、毒性を制御し得る
薬剤は、Ｄａｍ活性を変更する薬剤であり、そして本明細書中に記載されるスク
リーニング法によって選択され得、さらに、さらなる研究において、細菌毒性を
制御することを証明し得、そして治療学的活性までも発揮し得る。
【００８４】 「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその同語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄ
ｉｎｇ）」を意味する。
【００８５】 「Ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他に示されない限り、複数の参照を含む
。例えば、「ａ」Ｄａｍは、任意の１以上のＤＮＡアデニンメチラーゼを意味す
る。
【００８６】 （本発明の組成物） 記載される組成物は、免疫応答を惹起するため、および／または細菌感染（特
に、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染）に関連する疾患を処置もしくは予防するために
有用である。生存している、病原性の細菌から調製されるワクチンは、対応する
病原性細菌により、同じ株、種、血清型および／または群の類似の病原性細菌に
より、あるいは、異なる株、種、血清型および／または群の異なる細菌により、
生じる疾患に感受性の宿主の免疫または処置のために提供される。本明細書にお
いて生成される生ワクチンはまた、抗原（例えば、他の病原の免疫原）のための
キャリアとして働き得、それにより複数の免疫原性反応を生成する。
【００８７】 従って、１つの実施形態において、本発明は、弱毒生病原性細菌（例えば、Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ）、および薬学的に受容可能な賦形剤を含む免疫原性組成物
を提供する。この病原性細菌は、ＤＮＡアデニンメチラーゼ（Ｄａｍ）活性を変
更する変異を含有（有する）しており、それにより病原性細菌は、弱毒化される
。いくつかの実施形態において、この変異は、ＤＮＡアデニンメチラーゼ（Ｄａ
ｍ）をコードする遺伝子中にあり、ここでこの変異は、ＤＮＡアデニンメチラー
ゼ活性を変更する。
【００８８】 Ｄａｍ活性は、増加または減少され得、そしてＤａｍ活性は、転写および／ま
たは翻訳を含む任意のレベルで変更され得る。例えば、翻訳に関しては、活性は
、多くの方法（産生されるタンパク質の量および／または産生されるタンパク質
の性質（すなわち、構造）を含む）において変更され得る。例えば、変異は、細
胞により産生されたＤａｍの量を、（翻訳事象および／または転写後事象への影
響に起因して）結果として増大または減少させ得る；あるいは、変異は、変化し
た活性を有する変化したＤａｍを生じさせ得る。Ｄａｍ活性を変更する変異およ
び変異体の生成には、当該分野で周知の技術を用いる。例としては、Ｄａｍ産物
は、より低いレベルで転写を開始することが公知のプロモーターを用いることに
より低下され得る。所定の転写調節エレメント（例えば、プロモーター）からの
転写のレベルを決定するためのアッセイは、当該分野で周知である。ネイティブ
なｄａｍプロモーターは、より低い翻訳活性のプロモーターで置換され得る；あ
るいは、ｄａｍ-（ここでは、ネイティブなｄａｍ遺伝子が取り除かれている）
が、より低い活性のプロモーターを含む再操作されたｄａｍ遺伝子を組み込むた
めの基礎として用いられ、ゲノムへ組み込まれ得る。あるいは、異なるｄａｍ遺
伝子（例えば、Ｔ４ ｄａｍ）が用いられ得る。ｄａｍオーバープロデューサー
の例である、野生型レベルの１００倍でＥ．ｃｏｌｉ Ｄａｍを産生するｐＴＰ
１６６プラスミドが用いられ得る。変異は、Ｄａｍ遺伝子自体（転写調節エレメ
ントおよび／または翻訳調節エレメントを含む）、ならびにＤａｍ産生および／
またはＤａｍ活性に影響する遺伝子（単数または複数）の中にあり得る。
【００８９】 任意の病原性（好ましくは、毒性）細菌の株は、本明細書において記載される
免疫原性組成物において用いられ得る。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ以外の病原性細菌が用いられる。他の実施形態においては、病原性Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ（好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ）が用いられる。ｄａｍの過剰発現
は有用なワクチンを導き得るので、ｄａｍ遺伝子は必須であってもなくてもよい
（すなわち、ｄａｍの欠失は、致死的であってもなくてもよい）。
【００９０】 本発明は、任意の公知の群、種または株、より好ましくは、群Ａ、ＢまたはＤ
（特定の脊椎動物宿主の特定の病原体であるほとんどの種を含む）を含む広範な
種々のＳａｌｍｏｎｅｌｌａに特に適切である。 生ワクチンが産生され得るＳ
ａｌｍｏｎｅｌｌａが起こす疾患の例としては、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；
Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｔｙｐｈｉ；Ｓ．ａｂｏｒｔｕｓ−ｏｖｉ；
Ｓ．Ａｂｏｒｔｕｓ−ｅｑｕｉ；Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ；Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ
；Ｓ．ｐｕｌｌｏｒｕｍ；および哺乳動物中で感染を生じることが公知であるか
または発見され得る他のものがある。
【００９１】 本発明が使用され得る他の生物体としては、Ｙｅｒｓｉｎｉａ種（特にＹ．ｐ
ｅｓｔｉｓ）、Ｖｉｂｒｉｏ種（特にＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）、Ｓｈｉｇｅｌｌ
ａ種（特にＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉおよびＳ．ｓｏｎｎｅｉ）；Ｈａｅｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ種（特にＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、より詳細にはＢ型）、Ｂｏｒｄｅｔ
ｅｌｌａ（特にＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（特にＮ．ｍｅ
ｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｏｈｏｅａｅ）；Ｐａｓｔｅｕｒ
ｅｌｌａ（特にＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、病原性Ｅ．ｃｏｌｉ、およびＴｒｅ
ｐｏｎｅｍａ（例えば、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ）；ならびに哺乳動物において感
染を生じることが公知かまたは発見され得る他の生物体が挙げられる。
【００９２】 別の実施形態において、本発明は、宿主をワクチン接種するために用いられる
ワクチンを提供する。このワクチンは、薬学的に受容可能な賦形剤および病原性
細菌の弱毒化形態を含む。ここで弱毒化は、少なくとも１つの変異に起因し得る
。ここで第１の変異は、（ｉ）１つ以上のＤＮＡアデニンメチラーゼの発現もし
くは活性、または（ｉｉ）ＤＮＡアデニンメチラーゼにより調節される１つ以上
の遺伝子の発現のいずれかを変更する。この第１の改変は、好ましくは非復帰で
あり、そしていくつかの実施形態においては、その遺伝子産物がこのＤＮＡアデ
ニンメチラーゼの１つ以上を活性化する遺伝子中で構築される。この第１の改変
は、その遺伝子産物がこのＤＮＡアデニンメチラーゼの１つ以上の活性を不活性
化するかまたは減弱する遺伝子中で構築され得る。他の実施形態において、この
第１の改変は、その遺伝子産物がこのＤＮＡアデニンメチラーゼの発現抑制する
遺伝子中で構築され、そしてこの遺伝子産物はＤａｍを抑制し得る。このワクチ
ンはさらに、この第１の変異と独立の第２の変異を含み得、この第２の変異は、
弱毒化された微生物を生じる。この第２の変異は、好ましくは非復帰である。
【００９３】 別の実施形態において、本発明は、ワクチン接種されるべき宿主中で免疫学的
反応を誘発させるためのワクチンを提供する。このワクチンは、この細菌細胞が
ｄａｍ遺伝子により発現されるＤＮＡアデニンメチラーゼ（Ｄａｍ）の発現を調
節する能力を無効にする、遺伝子に導入された変異を有する細菌細胞を含む。
【００９４】 Ｄａｍ−ワクチンにおける複数のタンパク質の異所性発現は、殺傷されたＤａ
ｍ−生物体が、殺傷されたＤａｍ＋生物体よりも有意に強い防御免疫反応を惹起
し得る可能性を示唆する。従って、いくつかの実施形態において、本発明は、殺
傷された病原性細菌（Ｄａｍ活性を変更している変異を含む）および薬学的に受
容可能な賦形剤を含む免疫原性組成物を提供する。好ましくは、この変異は、ｄ
ａｍ遺伝子中であり、そして本明細書において記載されるように、Ｄａｍ活性の
減少または増大を生じ得る。いくつかの実施形態において、ｄａｍ変異は、細菌
の死を生じる。他の実施形態において、この変異は、減弱され、そして細菌は、
当該分野で周知の方法（例えば、アジ化ナトリウム処理および／またはＵＶへの
曝露）を用いることにより殺傷される。変異が致死的である場合、細菌は（例え
ば、アジ化ナトリウムおよび／またはＵＶを用いる）殺傷のためにさらに処置さ
れ得る。これらのワクチンに適切な細菌の例としては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、
Ｖｉｂｒｉｏ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅを含む）およびＹｅｒｓｉｎｉａ（Ｙ．ｐ
ｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む）が挙げられるがこれらに限定され
ない。
【００９５】 好ましくは、この組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤を含む。薬学的に受容
可能な賦形剤は、薬学的に有効な物質の投与を容易にする比較的不活性な物質で
ある。例えば、賦形剤は、ワクチン組成物のための形態またはコンステンシーを
与え得るかまたは希釈剤として作用し得る。適切な賦形剤としては、安定化剤、
湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、カプセル化剤、緩衝液、な
らびに皮膚浸透強化剤が挙げられるがこれらに限定されない。薬学的に受容可能
な賦形剤の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、第１９版、１９９５
）に記載されている。
【００９６】 本発明はまた、所定の属（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）について、本明細
書に記載される変異体株（弱化されていようと殺傷されていようと）の任意の組
み合わせを含む免疫原性組成物を含む。２つの異なるワクチン株（例えば、Ｄａ
ｍ−およびＤａｍオーバープロデューサー）は、可能性として防御的な抗原の２
つの異なるレパートリーを生成し得るので、これらの組み合わせでの使用は、優
れた免疫応答を誘発し得る。
【００９７】 本発明による病原性細菌は、少なくとも１つの遺伝子において作製される非復
帰的変異の結果として、弱毒化、好ましくは無毒化される。それによりＤＮＡア
デニンメチラーゼの機能を変更する。本質的に、本発明の好ましい実施形態に従
って提供される生ワクチンは、病原性細菌に起源する。非復帰的な変異が、病原
体の遺伝子に導入され、従ってＤＮＡアデニンメチラーゼの発現を変更する。「
非復帰（ｎｏｎ−ｒｅｖｅｒｔｉｎｇ）」変異は、一般に、細胞分裂１０8中約
１未満、好ましくは１０10中約１未満、または好ましくは１０15中約１未満、な
おより好ましくは、１０20中約１未満に戻る。好ましくは、この変異は、あてに
なる（ｎｏｎ−ｌｅａｋｙ）；しかしＤａｍによる遺伝子の調節は、Ｄａｍ濃度
に極めて感受性であるらしい。従って、Ｄａｍの過剰発現およびＤａｍの過少発
現は、病原体の弱毒化を生じる。この変異は、好ましくは、ｄａｍ遺伝子自体の
中で作製されるが、以下にさらに詳細に考察される、本発明の他の実施形態にお
いて、本発明によるワクチンは、その産物がｄａｍ遺伝子を活性化するかまたは
抑制する、ｄａｍの「上流」または「下流」のいずれかの関連の遺伝子（単数ま
たは複数）を変異させることにより産生され得ることことが意図される。または
、代替的には、変異は、ＤＮＡアデニンメチラーゼにより調節される少なくとも
１つの毒性遺伝子中で構築される。変異は、非復帰である。なぜなら正常な遺伝
子機能の回復は、１つより多い事象（このような事象のそれぞれは、非常にまれ
である）の無作為の偶発的な発生によってのみ生じ得るからである。例えば、Ｄ
ａｍメチラーゼ活性は、下方制御され得るか、そして／あるいはプロモーターも
しくはコード領域への欠失の導入、プロモーターもしくはコード領域へのトラン
スポゾンもしくは介在ＤＮＡの挿入により、ｄａｍ遺伝子の発現をブロックする
アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用、またはｄａｍ遺伝子発現を妨げるリボ
ザイムの使用により遮られ得る。あるいは、この変異は、非復帰を生じるのに十
分な程度のインサーションおよび／または欠失であり得る。
【００９８】 欠失変異の場合、遺伝子情報の回復は、失われた遺伝子情報を回復するため、
直列で、多くの同時発生的な無作為のヌクレオチドインサーションを必要とする
。インサーションプラス反転の場合、遺伝子機能の回復は、挿入された配列の正
確な欠失および隣接する逆位配列の正確な再反転の同時発生を必要とする。これ
らの事象のそれぞれは、発現の頻度が極めてわずかで、検出不能なほど低い。従
って、「非復帰」変異の２種類のそれぞれは、原栄養体への復帰の可能性は、実
質的に全くない。
【００９９】 Ｄａｍ遺伝子におけるインサーションを構築する他の方法は、当業者に周知で
ありかつ明白である。
【０１００】 単一の非復帰変異は、毒性に対する復帰可能性に対して高い程度の安全性を提
供するが、発生の有限の可能性を（希ではあるが）有する事象がなお存在する。
微生物が、接合により、非毒性生物体へ遺伝能力をトランフファーし得る宿主に
存在する場合、復帰の機会は存在する。あるいは、まれな変異によりまたはスト
レス下で作動性になり得る、ＤＮＡアデニンメチラーゼの産生のための微小な代
替的経路が存在し得る。従って、いくつかの実施形態においては、本明細書に記
載される弱毒化細菌は、さらに第２の変異体を含む。２つの別のかつ関連しない
変異を有する生ワクチンは、生存し得、そして宿主中で合理的に長く生存し、宿
主への投与の際に強力な免疫応答を提供し、そして、それらは他の病原体の抗原
（例えば、他の病原体の抗原）のキャリアとしても働き、このような病原体から
の免疫防御を提供し得る。
【０１０１】 生弱毒化ワクチン候補物のための第２の変異として働き得るＳａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ弱毒化変異体の例は、ｇａｌＥ（ガラクトース誘
導毒性）、ｐｕｒおよびａｒｏ（インビボで利用不可能な芳香族化合物）、ｃｒ
ｐおよびｃｙａ（異化生成物制御を介する遺伝子発現における全体的変化）、な
らびにｐｈｏＰ（毒性遺伝子発現における全体的変化）である（Ｈｏｎｅら（１
９８７）、Ｈｏｒｍａｅｃｈｅら（１９９６）；ＨａｓｓａｎおよびＣｕｒｔｉ
ｓｓ（１９９７）；ならびにＭｉｌｌｅｒら（１９９０））。これらのワクチン
の間の比較研究は、厳格に試験されておらず、従ってお互いに対してのこれらの
現在の株の効力は未解明のままである。さらに、現在の生細菌ワクチン候補物の
毒性（例えば、下痢のような症状）、およびヒト集団内の多くの個体が、明白に
免疫無防備状態であるという事実は、良好な防御を提供し、より永続的であり、
そして毒性が低い、さらなるワクチンについて検索する正当な理由となる。
【０１０２】 上記の変異に加えて、生ワクチンとしての使用のための細菌が、１つ以上の遺
伝「マーカー特徴」を有することが所望され得る。この「マーカー特徴」は、同
じ種の他の細菌（野生型または他の生ワクチン株のいずれか）からこの細菌を容
易に識別可能にする。従って、望ましくは、この株の他のメンバーから生成され
るべきＤａｍ−変異体を識別するためのマーカーを有する、病原体の株を選択す
る。あるいは、このようなマーカーは、ワクチン株に導入され得る。以前に考察
したように、種々のマーカーが使用され得る。用いられるマーカーは、細菌の免
疫原性特徴に影響してはならず、そして生ワクチンを産生するための細菌の処理
を妨害してもならない。このマーカーは、目的の細菌の認識を可能にするために
、表現型を変えるのみである。例えば、Ｄａｍ変異体は、塩基のアナログ ２−
アミノプリンに感受性である（Ｍｉｌｌｅｒ「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」ＣＳＨＬ １９７２）。ｄａｍ遺伝子
はｃｙｓＧに遺伝的に連結されるので、当業者は、トランスポゾンインサーショ
ンのプールを使用して、ｃｙｓＧ＋に対してｃｙｓＧ−レシピエントを形質導入
し得る。これらの原栄養体は、２−アミノプリン感受性についてスクリーニング
される。ｄａｍ遺伝子中にインサーションが存在することを確実にするため、イ
ンサーションをクローニングし、そして隣接する領域を配列決定する。このマー
カーは、いくつかの他の栄養必要量でもあり得る。このようなマーカーは、野生
型株からのワクチン株を識別するにおいて有用である。
【０１０３】 次いで、対象の細菌を処理し、１つ以上の非復帰変異体を提供する。第１の変
異は、好ましくは（必須ではないが）ｄａｍ遺伝子を変異することにより、Ｄａ
ｍ機能（例えば、発現）を変化する。第２の変異が所望される場合、その損失が
弱毒化を生じることが公知の遺伝子が、さらに変異される。この変異は、欠失、
挿入、もしくは反転、またはその組み合わせであり得る。種々の技術が、ｄａｍ
の変更された発現を生じる所望の「あてになる（ｎｏｎ−ｌｅａｋｙ）」非復帰
な変異を有する細菌を得るための欠失、挿入、または反転を導入するために使用
され得る。２つの完全に独立した変異体（そのぞれぞれは、復帰の可能性がかな
り低い）の存在は、ワクチン株が毒性になり得ないことをほぼ完全に保証する。
【０１０４】 遺伝子を無効にするかまたは変異するために使用され得る多数の周知技術（例
えば、ＰＣＲ技術、転座エレメント、変異原性因子、形質導入ファージ、および
ＤＮＡ媒介形質転換、ならびに／または接合、の使用）が存在する。組換えＤＮ
Ａ技術のような当業者にまた公知である他の方法が、またワクチンとして使用さ
れるべき、単一の宿主株へ、１つ以上の変異遺伝子を首尾よく導入するために使
用され得る。
【０１０５】 集団のいくつかのメンバーへの１つ以上の非復帰変異を導入するために細菌を
操作した後、この細菌を所望の変異体の単離を容易にする条件下で、このような
変異が親の細菌を上回る選択的利点を有する条件下、または未変更細菌または他
の型の変異体からの所望の細菌の容易な認識を可能にする条件下のいずれかで増
殖させる。次いで、単離された自己栄養性変異体をクローニングし、毒性、復帰
の不能性、および毒性病原性株から宿主を防御するその変異体の能力についてス
クリーニングする。
【０１０６】 このワクチンは、広範な種々の家畜動物およびヒトで用いられ得る。ワクチン
により今日処置されるか、または処置され得る（細菌性疾患に感受性である場合
）家畜動物のなかには、（より重要な家畜動物を挙げれば）ニワトリ、ウシ、ブ
タ、ウマ、ヤギおよびヒツジが含まれる。
【０１０７】 本発明に従って、このワクチンは、少なくとも１つの遺伝子において非復帰の
変異を導入することにより産生される。ここでそれぞれの変異は、復帰の可能性
が実質的にゼロであることを保証するため、直列で、十分な数の塩基の変異であ
る。好ましくは、この変異は、活性タンパク質の産生を決定するためのその総無
能力の意味では、それぞれの変異された遺伝子の非発現を生じる。しかし、本明
細書において記載されるように、Ｄａｍオーバープロデューサーはまた、作製さ
れ得る。さらに、選択される遺伝子は、ＤＮＡアデニンメチラーゼの発現に関与
し、そして好ましくはこの遺伝子はｄａｍである。
【０１０８】 得られた株は、所望の免疫原性を有する非毒性の生ワクチンである。すなわち
、この変異は、宿主の天然の免疫応答を誘発する抗原の産生に影響しない。代表
的に、野生型病原体が、宿主内の特定の組織に達する場合、特異的毒性因子また
は毒性因子のセットは、この病原体が曝露される特定の環境の結果として発現さ
れる。Ｄａｍ−変異体は、多くの毒性因子全てを、同時にかつ特定の組織内でな
く、構成的に発現すると考えられている。多くの毒性因子の生理学的効果は組織
特異的であるので、悪い組織において構成的に発現される毒性因子は、疾患プロ
セスにおいて固有の生理学的変化を開始しない。しかし、これらの毒性因子は、
宿主からの免疫応答を惹起する。従って、この免疫系は、環境におけるこれらの
因子に遭遇する。ここでこの因子は、疾患を生じるための宿主中の必要な生理学
的変化を開始し得ず、そしてこの宿主は免疫応答を上昇させ得る。
【０１０９】 本発明の別の実施形態において、このワクチンは、少なくとも２つの遺伝子に
おいて、非復帰変異を導入することにより産生される。ここでこの変異は、それ
ぞれの変異が、復帰の可能性が実質的にゼロであること、およびそれぞれの変異
遺伝子の非発現の確実さを保証するのに十分大きい。選択された第１の遺伝子は
、ＤＮＡアデニンメチラーゼの発現に直接かまたは間接的のいずれかで関与する
。選択される第２の遺伝子はまた、第１の遺伝子変異の弱毒化効果にかかわらず
、弱毒化を生じ得る；しかし、この第２の変異は、第１の変異の防御効果に影響
し得ない。第１の遺伝子および第２の遺伝子における変異は、以前に考察された
ように、達成され得る。
【０１１０】 従って、本発明は、以下を含む、ワクチン接種されるべき宿主における免疫応
答を誘発させる（惹起する）ためのワクチンを提供する：ＤＮＡアデニンメチラ
ーゼの発現を変更する第１の遺伝子において第１の変異を有する細菌；およびこ
の第１の変異と独立してこの微生物を弱毒化する、この細菌中の第２の変異。
【０１１１】 別の実施形態において、本発明は、抗原のためのベクターまたはキャリアとし
て用いられ得る生ワクチンを提供する。この抗原は、非毒性の病原性ワクチンに
おいて用いられる細菌以外の細菌属または種の抗原を含む、任意の抗原であり得
る。この抗原は、細菌と付着したかもしくは結合した混合物として、添加され得
るか、または所望の抗原をコードする１つ以上の構造遺伝子は、発現カセットと
して非毒性病原性ワクチンに導入され得る。従って、本明細書において記載され
るワクチンにおける使用のために記載された任意の変異細菌は、所望の抗原をコ
ードする１つ以上の構造遺伝子を有する発現カセットをさらに含み得る。この発
現カセットは、転写開始および翻訳開始ならびに終止領域（目的の構造遺伝子に
天然に接するかまたはこの構造遺伝子に関して異種である）の調節制御下で、目
的の構造遺伝子（単数または複数）を含む。細菌またはバクテリオファージの構
造遺伝子が含まれる場合、天然のまたは野生型の調節領域は、通常（常にではな
いが）十分である。非毒性病原体により認識される調節領域を真核生物（時には
、原核生物）から単離された抗原の構造遺伝子に連結することが必要であり得る
。抗原としては、破傷風毒素のＣフラグメント、コレラ毒素のＢサブユニット、
Ｂ型肝炎表面抗原、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ ＬＰＳ、ＨＩＶ抗原およ
び/またはＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｅｉｉ ＬＰＳが挙げられるがこれらに限
定されない。
【０１１２】 発現カセットは、組換え構築物であってもよいし、天然に存在するプラスミド
の一部の形態であってもよい。発現カセットが組換え構築物の場合、発現カセッ
トは、エピソームの維持のための複製系に連結されてもよいし、非毒性の病原の
染色体ＤＮＡへの組換えおよび組込みのための条件下で、非毒性の病原性細菌に
導入されてもよい。目的の抗原の構造遺伝子は、細菌タンパク質（例えば、毒素
サブユニット）、ウイルスタンパク質（例えば、キャプシド）、または酵素経路
（例えば、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）のような糖質抗原の合成に関与する経
路）をコードし得る。例えば、他の生弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａワクチンにお
いて発現される抗原の中には、破傷風毒素のフラグメントＣ、コレラ毒素のＢサ
ブユニット、Ｂ型肝炎表面抗原、およびＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ ＬＰ
Ｓがある。さらに、ＨＩＶ抗原のＧＰ１２０およびＧＡＧは、弱毒化Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧにおいて発現されており、そしてＳｈｉ
ｇｅｌｌａ ｓｏｎｅｉｉ ＬＰＳは、弱毒化Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ
において発現されている。この構築物またはベクターは、多数の周知の方法（例
えば、形質導入、連結、形質転換、エレクトロポレーション、トランスフェクシ
ョンなど）を介して宿主株へと導入され得る。
【０１１３】 別の実施形態において、本発明に従って調製された生ワクチンは、ＤＮＡアデ
ニンメチラーゼにより、好ましくは、ＤＮＡアデニンメチラーゼ（Ｄａｍ）によ
り調節される遺伝子における不可逆変異を有するように調製される。これらの不
可逆変異は、以前に記載されたように調整され得る。
【０１１４】 別の実施形態において、ワクチンが提供される。ここで、バクテリアは、好ま
しくは、ＤＮＡアデニンメチラーゼ（Ｄａｍ）を過剰産生させることにより、Ｄ
ａｍの過剰産生を生じる、変異を有する。細菌遺伝子を過剰産生する産生の方法
は、本明細書中に記載され、かつ当該分野で公知であり、そしてさらなるｄａｍ
遺伝子；ｄａｍの転写を制御するプロモーターの変異；フィードバック阻害に対
する応答性の低下を生じるｄａｍ遺伝子における変異を保有するプラスミド（こ
れは統合されてもよいし、されなくてもよい）の添加を含むが、それらに限定さ
れない。
【０１１５】 本明細書中に記載される免疫原性組成物は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａのような行
限性細菌に対する免疫応答を増大させるアジュバントと共に用いられ得る。アジ
ュバントは、死菌ワクチンに特に適切であるが、この用途に限定される必要はな
い。適切なアジュバントは、当該分野で公知であり、そして以下が挙げられる：
水酸化アルミニウム、ミョウバン、ＱＳ−２１（米国特許第５，０５７，５４０
号）、ＤＨＥＡ（米国特許第５，４０７，６８４号および同第５，０７７，２８
４号）およびその誘導体および前駆体（例えば、ＤＨＥＡ−Ｓ）、β−２ミクロ
グロブリン（ＷＯ９１／１６９２４）、ムラミルジペプチド、ムラミルトリペプ
チド（米国特許第５，１７１，５６８号）およびモノホスホリルリピドＡ（米国
特許第４，４３６，７２８号；ＷＯ９２／１６２３１）およびその誘導体（例え
ば、ＤＥＴＯＸTM）、ならびにＢＣＧ（米国特許第４，７２６，９４７号）。他
の適切なアジュバントとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：
アルミニウム塩、スクアレン混合物（ＳＡＦ−１）、ムラミルペプチド、サポニ
ン誘導体、ミコバクテリア壁調製物、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロックコ
ポリマー界面活性剤、Ｑｕｉｌ Ａ、コレラ毒素Ｂサブユニット、ポリホスファ
ゼンおよび誘導体、ならびに免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）（例えば、Ｔａｋａ
ｈａｓｈｉｓ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４４：８７３−８７５により記載さ
れる複合体）。獣医学的用途のために、および動物における抗体の産生のために
、フロイントアジュバントの分裂促進的な成分が使用され得る。アジュバントの
選択は、特にヒト用途が意図される場合、アジュバントの存在下でのワクチンの
安定性、投与の経路、およびアジュバントの調節の受容性に一部依存する。例え
ば、ミョウバンは、ヒトにおけるアジュバントとしての用途として、米国食品医
薬品局（ＦＤＡ）により認可される。
【０１１６】 いくつかの実施形態において、免疫原性組成物はまた、キャリア分子を（アジ
ュバントの有り無しで）含み得る。キャリアは、当該分野で公知である。Ｐｌｔ
ｏｋｉｎ、Ｖａｃｃｉｎｅｓ、第３版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＷＢ Ｓｕ
ａｎｄｅｒｓ Ｃｏ．（１９９０）。細菌キャリア（すなわち、細菌由来のキャ
リア）としては、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）；ジフテリア毒素変異体
（ＣＲＭ１９７）；ジフテリア毒素；Ｂ群連鎖球菌αＣタンパク質；髄膜炎菌外
膜タンパク質（ＯＭＰＣ）；ジフテリア；型判別不可能なＨａｅｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（例えば、Ｐ６）の外膜タンパク質；組換えクラス３
タンパク質（Ｂ群髄膜炎菌のｒＰｏｒＢＰ）；加熱死菌Ｂｕｒｃｅｌｌａ ａｂ
ｏｒｔｕｓ；加熱死菌Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｉｓ；およ
びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ組換えエキソプロテインＡ。
別のキャリアは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である。
【０１１７】 本発明のワクチンは、単位容量形態、滅菌非経口溶液または懸濁液、滅菌非非
経口溶液または経口溶液または懸濁液、水中油または油中水エマルジョンなどで
個体に全身性投与するのに適切である。処方物または非経口、非非経口薬物送達
は、当該分野で公知であり、そしてＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
（１９９５）。このワクチンは、例えば、皮下注射か、筋肉内注射か、腹腔内注
射か、または皮内注射により、非経口投与され得る。投与はまた、経口、鼻内、
肺内（すなわち、エアロゾルにより）、および静脈内であり得る。投与の他の形
態に適切なさらなる処方物としては、坐剤および、いくつかの場合では、経口処
方物が挙げられる。投与の経路は、個体の状態および所望の臨床的効果に依存す
る。家畜動物（例えば、ニワトリ）への投与について、好ましい投与は、経口処
方である。生ワクチンのための処方物は、増大した免疫原性応答を提供する処方
物を、広範に、望ましく変化させ得る。
【０１１８】 本発明のワクチンおよび抗微生物薬は、広範な種々の脊椎動物に用いられ得る
。本発明のワクチンおよび抗微生物薬は、哺乳動物（例えば、ヒトおよび家畜動
物）での特定の用途を見出す。家畜動物としては、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、
ヤギ、家禽、ウサギ科（Ｌｅｐｏｒｉｄａｔｅ）（例えば、家兔（ｒａｂｂｉｔ
））、または家畜脊椎動物を冒す疾患にとらわれ得るか、または家畜脊椎動物を
冒す疾患についての媒介動物であり得る他の動物が挙げられる。投与のために適
切な個体は、細菌（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（Ｓ．ｓｐｐ．））の危険性
があるかまたは暴露している個体か、あるいは危険性があるかまたは暴露してい
ると予想される個体、および暴露および/または感染している個体である。ワク
チンまたは抗微生物薬の適用の様式は、広範に変化し得、投与のための従来の方
法のいずれかが、適用可能である。これらとしては、固体の生理学的に受容可能
な塩基で、または生理学的に受容可能な分散物中での経口適用、注射による非経
口適用などを含む。ワクチンまたは抗微生物薬の投薬量は、とりわけ、投与の経
路に依存し、そして保護されるべき種に従って変化する。１つ以上の投与が、ブ
ースター投薬として、通常、慣習的な間隔（例えば、２〜３週間）で提供され得
る。ＤＮＡアデニンメチラーゼは、脊椎動物に存在しないので、脊椎動物に投与
される場合、ＤＮＡアデニンメチラーゼのインヒビターは、０または低い毒性を
示すようである。さらに、ＤＮＡアデニンメチラーゼは、酵素であるので、これ
らは、細胞内に低い濃度で存在し；従って、インヒビターのより低い濃度の投与
を必要とし、そして全てのＤＮＡアデニンメチラーゼが阻害される可能性を増加
させる。
【０１１９】 （キットおよび株） 本発明はまた、本明細書中に記載されるような弱毒化株を提供する。好ましい
株は、Ｄａｍ活性を変化させる１つ以上の変異を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株で
ある。同様の株が、本明細書中に記載される。従って、１つの実施形態では、本
発明は、病原性細菌の弱毒化株を提供し、この株は、Ｄａｍ活性を変化させて、
その結果、細菌を弱毒化させる変異を含む。この変異は、本明細書中に記載の変
異のいずれかであり得る。好ましくは、この株は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株であ
る。
【０１２０】 本発明はまた、安定なパッケージングにおいて本明細書中に記載される任意の
１つ以上の株および/またはワクチン処方物を含むキットを含む。このキットは
、必要に応じて、（例えば、投与のための）指示書を提供する。いくつかの実施
形態において、この指示書は、非ヒト（例えば、ニワトリ、または他の家畜動物
）に投与するための指示書である。他の実施形態において、この指示書は、ヒト
への投与のための指示書である。
【０１２１】 （本発明の方法） 本発明はまた、本明細書中に記載される免疫原性組成物を用いる方法（Ｄａｍ
活性を変化する、潜在的に有用な薬剤を同定するためのスクリーニング方法、お
よび本明細書中に記載の免疫原性組成物を調製する方法）を提供する。
【０１２２】 本明細書中に記載の組成物のいずれかの投与を伴う任意の方法に関して、組成
物の任意の１つ以上が、投与され得る（すなわち、この組成物が、単独か、また
はお互いに組み合わせて投与され得る）ことが理解される。さらに、この組成物
は、予防および/または処置の目的のために、単独か、または他の様式（すなわ
ち、臨床的介入）と組み合わせて使用され得る。
【０１２３】 （免疫応答を惹起するための、疾患の予防のための、および疾患を処置するた
めの免疫原性組成物の使用） いくつかの実施形態において、本発明は、個体において免疫応答を惹起するた
めに本明細書中に記載される免疫原性組成物を用いる方法を提供する。一般に、
これらの方法は、免疫応答を惹起するために十分な量で個体に、本明細書中記載
される任意の１つ以上の免疫原性組成物を投与する工程を包含する。この免疫応
答は、組成物において、細菌の特定の種および/または株に対する免疫応答であ
り得るか、または、他の実施形態において、第２の種および/または株に対する
免疫応答であり得る。
【０１２４】 この免疫応答は、Ｂ細胞応答および/またはＴ細胞応答であり得る。好ましく
は、この応答は、抗原特異的である（すなわち、この応答は、免疫原性組成物に
おいて用いられる細菌に対する応答（すなわち、使用される細菌と関係する抗原
に対する応答）が検出される）。好ましくは、この免疫応答は、ワクチン組成物
の非存在下で持続する。従って、いくつかの実施形態において、この免疫応答は
、本明細書中に記載の免疫原性組成物の投与の後の、およそ以下のいずれかの間
持続する（複数の投与形態で与えられる場合、好ましくは、最も最近の投与の後
）：４週間、６週間、８週間、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、１年。
【０１２５】 本明細書中に記載される免疫原性組成物の投与の効果を決定するために、個体
は、抗体（体液性）または細菌に対する細胞性免疫応答のいずれか、またはその
組み合わせについて、当該分野において標準的な技術でモニターされ得る。ある
いは、このような応答を惹起することをすでに証明される場合、このようなモニ
タリングは必要ではなくてもよい。
【０１２６】 免疫応答を惹起する目的のために、本明細書中に記載される免疫原性組成物は
、非改変型形態で投与され得る。免疫原性を改善するために、細菌を改変するこ
とが、時折、好適であり得る。本明細書中で用いられるように、かつ当該分野で
公知なように、「免疫原性」とは、特定の抗体（Ｂ細胞）または細胞性（Ｔ細胞
）免疫応答を惹起するための能力、あるいは両方の能力をいう。免疫原性を改善
する方法は、とりわけ、グルタルアルデヒドまたは二官能性カプラーのような試
薬と架橋または多価プラットフォーム分子への結合を包含する。免疫原性はまた
、タンパク質キャリア（特に、Ｔ細胞エピトープおよび/またはＢ細胞エピトー
プを含むキャリア）へのカップリングにより改善され得る。
【０１２７】 組成物を受容するために適切な個体は上述されており、そして同様に、これら
の方法に適用される。一般に、このような個体は、感染と関連する症状および/
または疾患状態への暴露に感受性であるか、これらの症状および/または疾患状
態に暴露されているか、ならびに/あるいはこれらの症状および/または疾患状態
を提示する。この個体は、投与の時点で、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに暴露されてい
てもよいし、暴露されていなくてもよく、従って、投与の時点で、Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａに感染していてもよいし、感染していなくてもよい。好ましくは、個体
は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに暴露されていない。
【０１２８】 いくつかの実施形態において、本発明は、個体において、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａの第２の種、株、血清型、および/または群に対する免疫応答を惹起する方法
を提供する。この方法は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの第２の種、株、血清型、およ
び/または群に対する免疫応答を惹起するのに十分な量で、本明細書中に記載の
免疫原性組成物のいずれかを個体に投与する工程を包含する。この個体は、Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａの第２の種、株、血清型、および/または群に、以前に暴露さ
れていてもよいし、暴露されなくてもよい。いくつかの実施形態において、免疫
応答が惹起される第２のＳａｌｍｏｎｅｌｌａは、（投与された第１の血清型と
比較して）Ａ群、Ｂ群、またはＤ群のような第２の群由来である。他の実施形態
において、免疫応答が惹起される第２のＳａｌｍｏｎｅｌｌａは、（投与された
第１の血清型と比較して）第２の血清型由来である。
【０１２９】 第１の種および第２の種は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの任意の種であり得、この
いくつかは、上述されている。いくつかの実施形態において、第１の種は、Ｓ．
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍであり、そして第２の種は、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉ
ｓである。いくつかの実施形態において、第１の種は、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉ
ｕｍであり、そして第２の種は、Ｓ．ｄｕｂｌｉｎである。他の実施形態におい
て、第１の種は、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓであり、そして第２の種は、Ｓ．
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍである。さらに他の実施形態において、第１の種は、Ｓ
．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓであり、そして第２の種は、Ｓ．ｄｕｂｌｉｎである
。同様に、第１の群は、Ａ群、Ｂ群、またはＤ群のような、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａの公知の群のいずれかであり得る。この第２の群は、Ａ群、Ｂ群、またはＤ群
のような、公知の群のいずれかであり得る（ただし、この第２の群は、第１のか
らなる群から選択されるとは異なる）。他の実施形態において、第１の血清型は
、第２の血清型と異なる。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの血清型は、当該分野で公知で
ある。
【０１３０】 免疫応答が、１つ以上のさらなる抗原（すなわち、１つ以上のさらなるＳａｌ
ｍｏｎｅｌｌａの株、群、血清型、および/または種）に対して惹起され得るこ
とが理解される。従って、本発明は、免疫応答が、第３、第４、第５などのＳａ
ｌｍｏｎｅｌｌａの株、群、血清型、および/または種に対して惹起される、方
法を包含する。
【０１３１】 本発明はまた、個体において、病原性細菌の第２の種、株、血清型、および/
または群に対する免疫応答を惹起する方法を提供する。この方法は、病原性細菌
の第２の種、株、血清型、および/または群に対する免疫応答を惹起するのに十
分なＤａｍ誘導体量である、弱毒化細菌を含む免疫原性組成物を個体に投与する
工程を包含する。
【０１３２】 本発明はまた、個体における、細菌（好ましくは、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ）感染を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は
、毒性細菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の感染に関連する疾患症状を抑制する方法
を提供する。この方法は、感染に関連する疾患症状を抑制するのに十分な量で、
本明細書中に記載される任意の1つ以上の組成物を投与する工程を包含する。好
ましくは、この感染は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａが原因である。他の実施形態にお
いて、感染は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ）が原因で
ある。他の実施形態において、これらの方法は、個体において（非投与と比較し
て）病原性細菌（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の量を減少させる量で、本明
細書中に記載される任意の１つ以上の組成物を投与する工程を包含する。
【０１３３】 ワクチンは、投薬処方物に適合性の様式で、かつ例えば、治療的に有効な量で
、投与される。投与される量は、処置される個体、抗体を合成する個体の免疫系
の能力、投与の経路、および所望される防御の程度に依存する。投与される必要
のある活性成分の正確な量は、処置を管理する開業医の判断に依存し得、個体に
特有であり得る。
【０１３４】 １つの実施形態において、本発明は、Ｄａｍ活性を変化する薬剤を含む組成物
を、個体に投与する工程を包含する、病原性細菌と感染した個体を処置する方法
を提供する。他の実施形態において、本発明は、（ａ）宿主に化合物を投与する
工程を包含する、病原性微生物（細菌）に感染した宿主を処置する方法を提供す
る。ここで、この化合物は、１つ以上のＤＮＡアデニンメチラーゼの発現または
活性を変化させる。この化合物は、（ａ）１つ以上のＤＮＡアデニンメチラーゼ
に結合して、それによりＤＮＡアデニンメチラーゼの活性を変化させ得る；（ｂ
）このＤＮＡアデニンメチラーゼを発現する１つ以上の遺伝子に結合して、それ
によりこのＤＮＡアデニンメチラーゼの発現を変化させ得る。このＤＮＡアデニ
ンメチラーゼの発現は、過度に活動する。あるいは、このＤＮＡアデニンメチラ
ーゼの発現は、抑制される。いくつかの実施形態において、この化合物は、１つ
以上のＤＮＡアデニンメチラーゼ遺伝子配列に相補的な配列を有するアンチセン
スオリゴヌクレオチドである。
【０１３５】 本発明はまた、宿主に化合物を投与する工程を包含する病原性微生物（細菌）
に感染した宿主を処置する方法を提供する。ここで、この化合物は、ＤＮＡアデ
ニンメチラーゼにより調節される１つ以上の毒性因子に結合する。
【０１３６】 いくつかの実施形態において、本発明は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染のような
細菌感染を予防する方法を提供する。これらの実施形態において、免疫原性組成
物により惹起される免疫応答は、組成物を受容しない個体と比較して、免疫原性
組成物のレシピエントが、感染の１つ以上の減少した症状を提示するという意味
で、防御的である。他の実施形態では、防御は、組成物を受容しない個体と比較
して、組成物を受容する個体において、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａのような細菌の量
を減少させることにより与えられる。
【０１３７】 いくつかの実施形態において、本発明は、個体における細菌感染に関連する症
状を抑制する方法（あるいは、細菌感染を処置する方法）を提供する。この方法
は、Ｄａｍ活性を変化させる薬剤を含む組成物を、個体に投与する工程を包含す
る。細菌は、本明細書中に記載される細菌（特に、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のい
ずれかであり得る。
【０１３８】 別の実施形態において、本発明に関する抗微生物薬調製される。これは、ＤＮ
Ａアデニンメチラーゼ、好ましくは、ＤＮＡアデニンメチラーゼ（Ｄａｍ）を阻
害する。以下の議論は、ｄａｍ遺伝子およびその産物であるＤａｍに、特異的に
焦点を合わせるが、この特異性は、ただ単純化および明確さの目的のみであるこ
とが理解される。以下に議論される方法および組成物は、（ｉ）ＤＮＡアデニン
メチラーゼを発現する任意の遺伝子、（ｉｉ）ＤＮＡアデニンメチラーゼ遺伝子
を調節する任意の遺伝子または遺伝子産物、（ｉｉｉ）ＤＮＡアデニンメチラー
ゼにより調節される任意の遺伝子、および/あるいは（ｉｖ）ＤＮＡメチラーゼ
に対して適用可能であることが意図される。従って、ｄａｍおよびＤａｍである
、特定の遺伝子および遺伝子産物が、以下で議論されるが、他のＤＮＡアデニン
メチラーゼ遺伝子およびＤＮＡアデニンメチラーゼは、それぞれ、ｄａｍおよび
Ｄａｍの等価物であることが意図され、従って以下の議論に関して交換可能であ
る。
【０１３９】 Ｄａｍの阻害は、ｄａｍ遺伝子翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの使用、Ｄａｍ酵素活性の直接的インヒビター、Ｄａｍ活性化因子についての
抑制化合物および/またはＤａｍリプレッサーについての活性化化合物の単離に
よるＤａｍレベルの低下、ならびにＤａｍにより調節される毒性因子の標的化を
含む、多数のアプローチにより実行され得る。このアンチセンスアプローチは、
哺乳動物細胞由来のシトシンメチルトランスフェラーゼ（ＭｅＴａｓｅ）を阻害
するために以前に用いられた（ＭａｃＬｅｏｄ，Ａ．Ｒ．およびＳｚｙｆ，Ｍ．
，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，７：８０３７−８０４３（１９９５））。アンチ
センス核酸の副腎皮質細胞へのトランスフェクションは、ＤＮＡ脱メチル化を生
じ、そしてＭｅＴａｓｅ活性に関する腫瘍形成能を減少した。
【０１４０】 別の実施形態において、抗微生物薬は、Ｄａｍを活性化する。このような化合
物は、例えば、ｄａｍプロモーターを刺激する、リプレッサーを不活化する、お
よび/またはＤａｍの半減期を延長することにより、このような活性化に有効で
ある得る。
【０１４１】 （スクリーニングアッセイ） 本発明はまた、Ｄａｍ活性を変化させる能力に基づく抗細菌活性を有し得る（
従って、毒性を調節し得る）薬剤を同定する方法を包含する。これらの方法は、
種々の実施形態において実施され得る。本発明者らは、Ｄａｍ機能の喪失または
増加さえもが、当該分野で受容された（ａｒｔ−ａｃｃｅｐｔｅｄ）マウスモデ
ルにおけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａの有意により低い感染性を生じることを観察し
ている。このことは、Ｄａｍ機能の調節が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを含むが限定
されない、種々の細菌の病原性の制御を生じ得るが、宿主細胞には影響しないこ
とを示唆する。このことは、ヒトは、ｄａｍ遺伝子に対するホモログを有さない
ので、特にあてはまる。さらに、本発明者らは、ｄａｍが、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈ
ｏｌｅｒａｅおよびＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ
における本質的遺伝子であることを見出した（実施例７）。このことは、Ｄａｍ
が、これらの病原性生物における優れた薬物標的であることを示す。従って、本
発明の方法により同定された薬剤は、細菌感染、特に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
感染、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染、Ｖｉｂｒｉｏ感染、および/またはＹｅｒｓ
ｉｎｉａ感染の処置に有用であり得る。
【０１４２】 本明細書において記載される方法は、インビトロスクリーニングアッセイおよ
び細胞ベーススクリーニングアッセイである。インビトロでの実施形態において
、因子は、このＤａｍの機能を調節するその能力について試験される。細胞ベー
スの実施形態において、Ｄａｍ機能を有する生存細胞は、因子を試験するために
使用される。本発明の目的に関して、因子は、Ｄａｍの機能の全体の欠失に関連
する特徴が好ましいが、Ｄａｍの機能の任意の改変に基づいて、同定され得る。
【０１４３】 これらの全ての方法において、Ｄａｍの機能の改変は、陽性または陰性のいず
れにしても、Ｄａｍの機能に影響する任意のレベルで起こり得る。因子は、Ｄａ
ｍの転写を減少すること、かまたは妨害することにより、Ｄａｍの機能を改変し
得る。このような因子の例は、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチドを含む
、上流調節領域に結合する因子である。因子は、Ｄａｍ ＲＮＡの転写を増大さ
せることによりＤａｍの機能を改変し得る。因子は、Ｄａｍ ＲＮＡの翻訳を減
少することか、または妨害することによりＤａｍの機能を改変し得る。このよう
な因子の例は、アンチセンスポリヌクレオチドのようなＲＮＡに結合する因子、
またはＲＮＡを選択的に分解する因子である。Ｄａｍを阻害するためのアンチセ
ンスの試みは、上に記載している。因子は、Ｄａｍ ＲＮＡの翻訳を増大するこ
とによりＤａｍの機能を改変し得る。因子は、Ｄａｍに結合することによりＤａ
ｍの機能に欠陥を生じさせ得る。このような因子の例は、ポリペプチドまたはキ
レート剤である。因子は、Ｄａｍにより調節される遺伝子の遺伝子発現に影響す
ることにより、Ｄａｍの機能に欠陥を生じさせ得る。このような因子の例は、上
記に議論されたレベルのいずれかでＤａｍ調節遺伝子の発現を変化する因子であ
る。
【０１４４】 スクリーニング方法は、Ｄａｍ遺伝子を有する任意の病原菌に対して適用可能
に記載した。
【０１４５】 （インビトロスクリーニング法） 本発明のインビトロスクリーニングアッセイにおいて、因子は、以下のいずれ
かであり得るインビトロ系においてスクリーニングされる：（１）因子が、ｄａ
ｍの転写を阻害しているか、または増大しているかを決定するアッセイ；（２）
Ｄａｍ ＲＮＡもしくはＤａｍをコードするポリヌクレオチドの翻訳を妨害する
因子、または代替的にｄａｍの翻訳を特異的に増大する因子についてのアッセイ
；（３）Ｄａｍに結合する因子についてのアッセイ。
【０１４６】 因子が、ｄａｍの転写を阻害するか、または増大するかを決定するアッセイに
関して、インビトロ転写系またはインビトロ転写／翻訳系を用い得る。これらの
系は、市販され、そして一般的にポジティブコントロール、好ましくは、内部コ
ントロールとしてコード配列を含む。Ｄａｍをコードするポリヌクレオチドが、
導入され、そして転写が起ることを可能にする。いずれの因子も含まないインビ
トロ発現系（陰性コントロール）と因子を含むインビトロ発現系との間での転写
産物の比較は、因子がｄａｍの転写に影響するか否かを示す。コントロールとＤ
ａｍとの間での転写産物の比較は、因子が、このレベルで作用する場合、ｄａｍ
の転写に選択的に影響するか否かを示す（一般的な様式、非選択的な様式または
特異的な様式における転写に影響することとは対照的）。
【０１４７】 ｄａｍ ＲＮＡまたはＤａｍをコードするポリヌクレオチドの翻訳を因子が阻
害するかまたは増大するかを決定するアッセイに関して、上記のようなインビト
ロ転写／翻訳アッセイは、翻訳産物を比較することを除いて、用いられ得る。い
ずれの因子も含まないインビトロ発現系（陰性コントロール）と因子を含むイン
ビトロ発現系との間での翻訳産物の比較は、因子が、ｄａｍの翻訳に影響するか
否かを示す。コントロールとｄａｍとの間での翻訳産物の比較は、この因子が、
このレベルで作用する場合、ｄａｍの翻訳に選択的に影響するか否かを示す（一
般的な様式、非選択的な様式または特異的な様式における翻訳に影響することと
は対照的）。
【０１４８】 Ｄａｍに結合する因子についてのアッセイに関して、Ｄａｍは、まず原核生物
発現系または真核生物発現系において、ネイティブタンパク質として、またはＤ
ａｍが、十分に特徴付けられたエピトープまたはタンパク質と結合体化される融
合タンパク質として組換え的に発現される。次いで、組換えＤａｍは、例えば、
抗Ｄａｍ抗体または抗エピトープ抗体を用いる免疫沈降によるか、またはこの結
合体の固定したリガンドに結合することにより精製される。次いで、Ｄａｍまた
はＤａｍ融合タンパク質製のアフィニティーカラムを用いて、適切に標識された
化合物の混合物をスクリーニングする。適切な標識としては、蛍光色素、放射性
同位体、酵素および化学発光化合物が挙げられるが、これらに限定されない。非
結合化合物および結合化合物は、当業者により慣用的に使用される種々の条件（
例えば、高塩、界面活性剤）を用いる洗浄により分離され得る。アフィニティー
カラムに対する非特異的な結合は、単に結合体またはエピトープを含むアフィニ
ティーカラムを用いて化合物混合物を前処理することにより最小にし得る。同様
の方法は、Ｄａｍへの結合に対して競合する因子についてスクリーニングするた
めに用いられ得る。アフィニティークロマトグラフィーに加えて、別の分子への
結合の際に変化するタンパク質の融点または蛍光異方性の変化を測定するような
他の技術がある。例えば、ネイティブＤａｍまたはＤａｍ融合タンパク質に共有
結合するセンサーチップ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｓｔｉｔ
ｔら（１９９５）Ｃｅｌｌ ８０：６６１−６７０により供給された）を用いる
ＢＩＡｃｏｒｅアッセイを実施して、異なる因子のＤａｍ結合活性を決定し得る
。
【０１４９】 Ｄａｍの結合に関して、Ｄａｍの適切なフラグメントもまた、用いられること
が理解される。例えば、Ｄａｍの特定の領域が、ＤＮＡに結合するために重要で
あることが公知である場合には、この領域を含むか、またはまさにこの領域から
なるこのフラグメントが、用いられ得る。
【０１５０】 別の実施形態において、インビトロスクリーニングアッセイは、Ｄａｍに結合
する別の物質（大体、ポリヌクレオチド）と競合する因子を検出する。例えば、
Ｄａｍは、特定のＤＮＡモチーフ（すなわち、Ｄａｍ標的部位であるＧＡＴＣ）
に結合することが公知である。アッセイが行われ得、その結果、因子が、このモ
チーフに対する結合と競合するその能力について、試験される。競合結合アッセ
イは、当該分野において公知であり、そして本明細書において詳細に記載する必
要性はない。簡潔には、このようなアッセイは、推定の競合因子の増加された量
の存在下で形成されたＤａｍ複合体の量の測定を伴なう。これらのアッセイに関
して、反応物質の１つは、例えば、32Ｐを用いて標識される。本発明によりまた
包含される１つのこのようなアッセイは、以下でより詳細に記載される。
【０１５１】 Ｄａｍのインヒビターまたはアクチベーターの単離は、例えば、Ｄａｍについ
て、迅速なハイスループットアッセイを用いて、化学ライブラリー（Ｎｅｕｓｔ
ａｄｔら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８：２３９５−２３９
８（１９９８））またはペプチドライブラリー（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．，Ａｎｔｉｃ
ａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ．Ｒｅｓ．，１２：１４５−１６７（１９９７））をスク
リーニングすることにより実施し得る。このようなインヒビターライブラリーは
、いくつかの酵素の活性をブロックすることにおいて効果的であることがすでに
示されている（Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｃ．Ｄ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．
Ｌｅｔｔ．，８：３２０３−３２０６（１９９８））。このＤａｍアッセイは、
一方の末端で係留基（例えば、ビオチン）そして他方の末端にシグナルを有する
Ｄａｍ標的部位（ＧＡＴＣ配列）を含む二本鎖オリゴヌクレオチドからなる。こ
のシグナルは、放射活性化合物（例えば、リン−３２）、蛍光分子（例えば、フ
ルオレセイン）、または抗原であり得る。Ｄａｍ標的部位を含む非メチル化オリ
ゴヌクレオチドは、固体表面（例えば、アビジンを含む９６ウェルマイクロタイ
タープレート）に係留される。（標的オリゴヌクレオチドの全てのＧＡＴＣ部位
をメチル化するために十分な活性をちょうど有するようにあらかじめ決定された
）Ｄａｍ酵素を、インヒビターライブラリーとともにプレインキュベートして、
次いでＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の存在下で各ウェルに添加する。イ
ンキュベーションの後、サンプルウェルを緩衝液で洗浄して、制限酵素ＭｂｏＩ
を添加して、オリゴヌクレオチド内の全ての非メチル化ＧＡＴＣ部位を消化し、
従って分子のシグナル末端を遊離する。次いで、プレートウェルは、計数され（
放射活性シグナル）、蛍光についてスキャンされる（蛍光シグナル）か、または
西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素に結合体化した二次抗体とインキュベ
ートし、続いて、酵素の非放射活性基質とインキュベートされる。Ｄａｍの阻害
は、非メチル化ＧＡＴＣ部位の放出が原因であるサンプルウェル内のシグナルの
減少として検出される。このアッセイを用いて、阻害活性についての化学ライブ
ラリーおよびペプチドライブラリーを迅速にスクリーニングし得る。このような
研究の実施可能性は、ＭｅＴａｓｅ活性のインヒビターであるｓｉｎｅｆｕｎｇ
ｉｎの単離により示された。ｓｉｎｅｆｕｎｇｉｎは、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メ
チオニン（ＳＡＭ）のアナログであり、そしてＤＮＡのメチル化の競合インヒビ
ターとして作用する。しかし、ｓｉｎｅｆｕｎｇｉｎは、メチルドナーとしてＳ
ＡＭが必要である哺乳動物シトシンメチラーゼを含む全てのＤＮＡメチラーゼを
ブロックするので、この薬物は、細菌に対する化学療法剤として有用ではない。
【０１５２】 Ｄａｍのアクチベーターを単離するために、（低いパーセンテージの標的部位
（例えば、ＧＡＴＣ部位）、低いパーセンテージの標的オリゴヌクレオチド（例
えば、２０％）をメチル化するために十分な活性を含むようにあらかじめ決定さ
れた）Ｄａｍは、１つ以上の因子（アクチベーターライブラリーを含む）とプレ
インキュベートされて、次いでＳＡＭの存在下で各ウェルに添加される。Ｄａｍ
の活性化は、標的部位（例えば、ＧＡＴＣ）のメチル化、従ってＭｂｏＩ制限反
応の妨害が原因であるサンプルウェル内のシグナルの増加として検出される。
【０１５３】 従って、いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）ＤＮＡアデニンメチ
ラーゼ標的部位を含む非メチル化オリゴヌクレオチドを固体表面に係留する工程
（ここで、この非メチル化オリゴヌクレオチドは、第１の末端上の係留基および
第２末端上のシグナルを有する）；（ｂ）十分な活性を有するＤＮＡアデニンメ
チラーゼをインキュベートして、因子；インヒビターライブラリーを用いて、こ
の非メチル化オリゴヌクレオチド上のこの標的部位、好ましくはこの標的部位の
全てをメチル化する工程；（ｃ）このインキュベートされたＤＮＡアデニンメチ
ラーゼを、Ｓ−アデノシルメチオニンの存在下でこの係留された非メチル化オリ
ゴヌクレオチドに添加する工程；（ｄ）全ての非メチル化標的部位を消化し、そ
れによって、係留された非メチル化オリゴヌクレオチドを遊離する工程；および
（ｅ）この非メチル化標的部位の消化が原因であるこのシグナルの増加としてＤ
ＮＡアデニンメチラーゼの阻害を検出する工程を包含する、改変するかまたは調
節する因子（すなわち、Ｄａｍ機能を改変、好ましくは、Ｄａｍ機能を阻害する
因子）を同定する方法を提供する。好ましくは、この標的配列は、ＧＡＴＣ配列
である。この係留基は、当該分野において公知の任意の適切な部分（例えば、ビ
オチン）であり得る。このシグナルは、蛍光、放射活性、または抗原が原因であ
り得る。いくつかの実施形態において、この固体表面は、アビジンを含むマイク
ロタイタープレートである。制限酵素（例えば、ＭｂｏＩ）を用いて、この非メ
チル化標的部位を消化し得る。インヒビターライブラリーが、試験されるべき因
子の供給源として用いられる場合、このライブラリーは、生体分子（例えば、ペ
プチド）を含み得るか、または有機化合物もしくは無機化合物を含み得る。
【０１５４】 本発明のインビトロスクリーニング法が、構造的薬物設計、または理論的薬物
設計を包含することもまた理解され、これらの設計において、Ｄａｍのアミノ酸
配列、３次元原子構造または他の特性は、Ｄａｍに結合することが推測される因
子を設計することの基礎を提供する。一般的に、これに関連して因子の設計およ
び／または選択は、いくつかのパラメータ（例えば、Ｄａｍ標的の理解される機
能（ここで、ＤＮＡに結合することはこのような機能の一つである）、Ｄａｍ標
的の３次構造（公知かまたは推測される場合）、および理論的薬物設計の他の局
面）により決定される。コンビナトリアル化学の技術をまた用いて、候補の因子
の多くの置換を生じ得る。本発明の目的に関して、理論的薬物設計により設計さ
れたおよび／または得られた因子はまた、以下に記載された細胞ベースアッセイ
において試験され得る。
【０１５５】 （細胞ベーススクリーニング法） 細胞ベーススクリーニングアッセイにおいて、生存細胞、好ましくは、機能す
るｄａｍ遺伝子を含む細菌、または生存細胞、好ましくは、Ｄａｍコード配列を
含むポリヌクレオチド構築物を含む細菌は、因子に曝露される。対照的に、従来
のインビトロ薬物スクリーニングアッセイ（上記のような）は、代表的に単離さ
れた成分（例えば、酵素または他の機能性タンパク質）に対する試験因子の効果
を測定した。
【０１５６】 本明細書中に記載された細胞ベースのスクリーニングアッセイは、従来の薬物
スクリーニングアッセイを超えるいくつかの利点を有する：１）因子が所望の治
療的効果を達成するために細胞に侵入しなければならない場合、細胞ベースアッ
セイは、因子が細胞に侵入し得るか否かに関して指標を与え得る；２）細胞ベー
ススクリーニングアッセイは、因子がこのアッセイ系に添加される段階でＤａｍ
の機能を改変することに効果的でない因子であるが、それらが有効な因子になる
ように一旦、細胞内に入ると細胞の成分により改変される因子を同定し得る；３
）最も重大なことは、細胞ベースアッセイ系は、Ｄａｍの機能の改変に関連する
特徴を最終的に生じる経路の任意の成分に影響する因子の同定を可能にする。
【０１５７】 １つの実施形態において、因子を、適切な宿主細胞において、Ｄａｍの機能の
改変に関連する特徴を誘発するその能力により同定する。これに関連して適切な
宿主細胞は、任意の宿主細胞である。この宿主細胞においてＤａｍの機能が、観
察され得る。好ましくは、宿主細胞は、細菌細胞である。適切な宿主細胞として
は、Ｄａｍ遺伝子を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｖｉ
ｂｒｉｏ、Ｙｅｒｓｉｎｉａならびに他の任意の細菌属および種が挙げられるが
、これらに限定されない。アッセイの１つの例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて線毛オ
ペロン系を用い、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、レポーターの発現のレベルが決定され
る。メチル化に応答性である任意の細菌オペロン系は、当該分野において公知で
ある多くのレポーター系のいずれかを用いる細菌ベースアッセイに適切である。
因子の存在下でのこのような系からの転写および／または翻訳のレベルは、因子
がＤａｍ活性に影響したか否かを示す。
【０１５８】 １つの実施形態において、本発明は、以下の工程を包含する毒性を制御し得る
因子の同定をするための方法を提供する：（ａ）試験されるべき少なくとも１つ
の因子をＤａｍの機能を有する適切な宿主細胞と接触する工程；および（ｂ）こ
の宿主細胞においてＤａｍの機能の改変と関連する少なくとも１つの特徴（これ
はＤａｍの機能を増大、減少、または欠失をし得る特徴）を分析する工程であっ
て、ここで因子が、少なくとも１つのこのような特徴を誘発する能力により同定
された。これらの方法に関して、宿主細胞は、任意の細胞であり得、この細胞に
おいてＤａｍの機能が実証される。
【０１５９】 Ｄａｍの機能の欠失において脱抑制される遺伝子に関して、Ｄａｍの機能の欠
失は、レポーター系を用いて測定され得、この系においては、レポーター遺伝子
配列は、作動可能に目的のＤａｍ抑制遺伝子に連結される。このような抑制遺伝
子は、本明細書中に例を含めて記載される。本明細書中で用いられる場合、用語
「レポーター遺伝子」は、同定され得る遺伝子産物（すなわち、レポータータン
パク質）をコードする遺伝子を意味する。レポーター遺伝子としては、アルカリ
ホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラ
クトシダーゼ、ルシフェラーゼおよび緑蛍光タンパク質が挙げられるが、これら
に限定されない。レポーター遺伝子の産物のための同定方法としては、酵素アッ
セイおよび蛍光アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。これらの産物
を検出するためのレポーター遺伝子およびアッセイは、当該分野において周知で
あり、そして例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９８７）および定期的な更新版、ならびにＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，１
９９９）に記載される。レポーター遺伝子、レポーター遺伝子アッセイおよび試
薬キットはまた、市販の供給源（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
など）から容易に入手可能である。
【０１６０】 別の実施形態において、これらの方法は、以下の工程を包含する：（ａ）Ｄａ
ｍ（またはその機能的フラグメント）をコードするポリヌクレオチドを、そうで
なければＤａｍの機能を欠失する、適切な宿主細胞に導入する工程であって、Ｄ
ａｍ機能が、この宿主細胞において回復される、工程；（ｂ）工程（ａ）のこの
細胞を試験されるべき少なくとも１つの因子と接触させる工程；（ｃ）Ｄａｍの
機能の欠失に関連する少なくとも１つの特徴を分析する工程であって、ここで因
子が、少なくとも１つのこの特徴を誘発する能力により同定される、工程。
【０１６１】 これらの方法のために用いられる宿主細胞は、まずＤａｍの機能を欠失する（
すなわち、Ｄａｍをコードするポリヌクレオチドの導入前にＤａｍの機能を欠失
する）。Ｄａｍの機能を欠失する工程は、完全であることが好まれ得る。Ｄａｍ
の機能を欠失する宿主細胞を作り出す工程は、欠失変異誘発、遺伝子の機能的部
分の組換え置換、フレームシフト変異、変異体の単離に関する従来のもしくは古
典的な遺伝子技術、または調節ドメインの改変のような遺伝子操作が挙げられる
が、これらに限定されない種々の方法で達成され得る。Ｄａｍ（またはこれのホ
モログ）の機能の欠失が、致死的である細胞に関して、Ｄａｍの野生型のコピー
を含むプラスミドが、破壊プロセス、または変異誘発プロセスの間、細胞中にあ
る。細胞が、野生型遺伝子を含むプラスミドなしで生存し得ない場合、Ｄａｍの
機能の欠失が、致死的であると仮定される。実施例７は、Ｄａｍ遺伝子が必須で
あるか否かを決定するためのアッセイを記載する。
【０１６２】 Ｄａｍをコードするポリヌクレオチドまたはその機能的フラグメントの導入は
、用いられた特定の宿主細胞に依存し、そして当該分野において公知の多くの方
法（例えば、スフェロプラスティング、エレクトロポレーション、ＣａＣｌ2沈
殿、酢酸リチウム処理、およびリポフェクタミン処理）のいずれかによってであ
り得る。
【０１６３】 適切な宿主細胞に導入されるポリヌクレオチドは、Ｄａｍをコードするポリヌ
クレオチドまたはその機能的フラグメントを含むポリヌクレオチド構築物である
。これらの構築物は、要素（すなわち、機能的配列）を含み、これは、構築物の
導入の際に宿主細胞においてＤａｍアミノ酸配列の発現（すなわち、転写、翻訳
、およびもしあれば翻訳後修飾）を可能にする。これらの要素（例えば、適切な
選択マーカー）の構成は、用いられる宿主細胞に依存する。
【０１６４】 宿主細胞におけるＤａｍ（またはこれのホモログ）の機能の回復は、Ｄａｍの
機能（すなわち、野生型）に関連する検出可能なパラメータについて宿主細胞を
分析することにより決定され得る。これらのパラメータは、用いられた特定の宿
主細胞に依存する。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに関して、Ｄａｍの機能は、以下のい
ずれかに関連する：（ａ）Ｄａｍ調節遺伝子の抑制；（ｂ）毒性；（ｃ）ｐａｆ
線毛発現の調節；（ｄ）特定のアミ酸の感受性の欠失。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに
おけるＤａｍの存在下で抑制されることが公知の遺伝子は、上に記載されている
。レポーター構築物（上記を参照のこと）を作製するための当該分野において周
知の方法があれば、これらの遺伝子のいずれかは、レポーター系に適応するため
に改変され得る。適切なレポーター系の例は、上記で議論されている。
【０１６５】 いくつかの実施形態において、Ｄａｍをコードするポリヌクレオチドは、作動
可能に誘導性プロモーターに連結される。誘導性プロモーターの使用は、因子が
Ｄａｍ経路を介して作用するか否かを決定するための手段を提供する。因子が、
誘導性プロモーターが活性化される細胞において現れるＤａｍの機能の欠失を示
す特徴を生じる場合、誘導性プロモーターが活性化されない細胞において因子が
、同様の結果を誘発しないという観察は、因子が、Ｄａｍの機能の少なくとも１
つの工程または局面に影響することを示す。逆に、Ｄａｍの機能の欠失を示す特
徴がまた、誘導性プロモーターが活性化されない細胞において観察される場合、
この因子は、単にＤａｍの機能の経路を介して必ずしも作用しないことを仮定し
得る。
【０１６６】 本発明の細胞ベーススクリーニングアッセイは、例えば、レポータータンパク
質（すなわち、容易にアッセイ可能なタンパク質（例えば、β−ガラクトシダー
ゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑蛍光タン
パク質（ＧＦＰ）またはルシフェラーゼ））の発現が、Ｄａｍの機能に依存する
細胞株を構築することにより設計され得る。例えば、Ｄａｍ制御下の遺伝子は、
実施例１に記載されるようにコード領域内に挿入されたレポーター配列を有し得
る。この細胞は、試験因子に曝露され、そしてβ−ガラクトシダーゼ発現を行う
のに十分な時間および先に発現されたβ−ガラクトシダーゼの枯渇を可能にする
のに十分な時間の後、この細胞は、標準的なアッセイ条件下でβ−ガラクトシダ
ーゼの産生についてアッセイされる。
【０１６７】 アッセイ方法は、一般的に、薬剤が添加されていないコントロールサンプルに
対する比較を必要とする。さらに、コントロールとしてＤａｍ機能を部分的また
は完全に欠如する細胞を使用することは望ましくあり得る。例えば、薬剤がＤａ
ｍ経路に沿って作用した場合、当業者は、薬剤で処置したｄａｍ細胞と同じ表現
型をみると予測し得る。薬剤がＤａｍ経路に沿って作用しなかった場合、当業者
は、薬剤で処置した場合にｄａｍ細胞で生じる他の特徴をみると予測し得る。
【０１６８】 上記のスクリーニング方法は、抗細菌活性を示し得る任意の薬剤を検出するこ
とを表す一次スクリーニングを示す。当業者は、薬剤をさらに評価するために二
次試験がおそらく必要であることを認識する。例えば、二次スクリーニングは、
一次スクリーニングが細菌ではなく宿主細胞において行われた場合、目的の細菌
において薬剤を試験する工程を包含し得る。さらなるスクリーニングは、薬剤で
処置した細胞を使用して感染性アッセイを行うことである。マウスを用いる感染
性アッセイは、実施例１に記載され、そして他の動物モデル（例えば、ラット）
は当該分野で公知である。さらに、細胞傷害性アッセイは、一次スクリーニング
において陽性であった薬剤が生体で使用するために適切であるというさらなる確
証として行われる。細胞傷害性についての任意のアッセイは、この目的に関して
適切であり、このアッセイとしては、例えば、ＭＴＴアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ
）が挙げられる。
【０１６９】 （ワクチンおよび弱毒化細菌の調製） 本発明はまた、本明細書中に記載されるワクチンを調製または作製する方法お
よび本明細書中に記載される変異株（すなわち、Ｄａｍ誘導体）を作製する方法
を提供する。ワクチン調製物は上記で十分に議論され、そのためにこれらの方法
は、本発明に包含される。本明細書中に記載される変異のいずれか（Ｄａｍ発現
を含むＤａｍ活性を増加するか、減少するか、または除去する変異を含む）は、
本発明の調製方法において使用され得、そして本節では概して繰り返されない。
【０１７０】 １つの実施形態において、本発明は、変化したＤａｍ機能を有する弱毒化細菌
を含む免疫原性組成物を調製するための方法を提供し、この方法は、本明細書中
に記載される変異体および／または変異株（すなわち、Ｄａｍ誘導体）のいずれ
かを、薬学的に受容可能な賦形剤と合わせる工程を包含する。好適な実施形態は
、本明細書中に記載されるようなＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株を含む。Ｄａｍ活性を
除去した変異を有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株（例えば、本明細書中に記載の欠
失変異体）が特に好適である。
【０１７１】 １つの実施形態において、本発明は、対応する細菌または類似の病原性細菌に
より引き起こされる疾患に罹りやすい個体が免疫学的応答を惹起し得る弱毒化病
原性細菌（好ましくは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を調製する方法を提供し、この
方法は、上記の病原性細菌において少なくとも１つの変異を構築する工程を包含
し、ここで、第１の変異は、Ｄａｍ機能の変化（好ましくは、Ｄａｍの発現の変
化）を生じる。好ましくは、第１の変異は、Ｄａｍを発現する第１の遺伝子に導
入される。いくつかの実施形態において、上記の第１の変異は、第１の遺伝子に
導入され、その発現は、ＤＮＡアデニンメチラーゼ酵素を発現する遺伝子の発現
を抑制するかまたは過剰に活性化させる。いくつかの実施形態において、上記の
第１の変異は、第１の遺伝子に導入され、その発現は、ＤＮＡアデニンメチラー
ゼにより調節される。他の実施形態において、第２の変異は、上記の第１の変異
とは独立した遺伝子において作製され、上記の第２の変異は、細菌の弱毒化を引
き起こす。
【０１７２】 別の実施形態において、本発明は、対応する毒性細菌により引き起こされる疾
患に罹りやすい宿主被験体が免疫学的応答を惹起し得る弱毒化細菌を調製するた
めの方法を提供し、この方法は、（ａ）病原性細菌の毒性株のｄａｍ遺伝子にお
いて少なくとも１つの変異を構築する工程を包含する。いくつかの実施形態にお
いて、第２の変異を、上記の第１の変異とは独立して、上記細菌の弱毒化を生じ
る第２の遺伝子に導入する。
【０１７３】 別の実施形態において、対応するか、または類似の病原性細菌により引き起こ
される疾患に罹りやすい宿主が免疫学的応答を惹起し得る弱毒化細菌を調製する
ための方法を提供し、この方法は、（ａ）上記病原性細菌において第１の非回復
変異を構築する工程であって、ここでこの第１の非回復変異は、１つ以上のＤＮ
Ａアデニンメチラーゼの発現またはその活性を変化させる、工程、および（ｂ）
上記病原性細菌において第２の非回復変異を構築する工程、であって、ここで、
この第２の非回復変異は、上記第１の非回復変異とは独立しており、そして弱毒
化することである、工程、を包含する。いくつかの実施形態において、第１の非
回復変異は、その遺伝子遺伝子産物が、上記の１つ以上のＤＮＡアデニンメチラ
ーゼを活性化する遺伝子において構築される。いくつかの実施形態において、こ
の遺伝子産物は、ＤＮＡアデニンメチラーゼを活性化する。いくつかの実施形態
において、第１の非回復変異は、その遺伝子産物が、上記のＤＮＡアデニンメチ
ラーゼの発現を抑制する遺伝子において構築される。いくつかの実施形態におい
て、上記遺伝子産物は、ＤＮＡアデニンメチラーゼを抑制する。他の実施形態に
おいて、第１の非回復変異は、その遺伝子産物が、この１つ以上のＤＮＡアデニ
ンメチラーゼに対して直接結合することによりこの１つ以上のアデニンメチラー
ゼの活性を不活化するか、または低減する遺伝子中に構築する。いくつかの実施
形態において、上記ＤＮＡアデニンメチラーゼのうちの１つは、ＤＮＡアデニン
メチラーゼである。いくつかの実施形態において、病原性細菌は、Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａの株であり、好ましくは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｂｏｒｔｕｓ
−ｏｖｉ、Ｓ．ａｂｏｒｔｕｓｅｑｕｉ、Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ、Ｓ．ｇａｌｌｉｎ
ａｒｕｍ、Ｓ．ｐｕｌｌｏｒｕｍである。他の実施形態において、病原性細菌は
、以下のうちのいずれか１つである：Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｓｈｉ
ｇｅｌｌａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｎｅｉｓｓｅｒ
ｉａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、病原性Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅ
ｍａ。宿主は、脊椎動物（例えば、哺乳動物）、好ましくは、ヒトまたは家畜で
あり得る。いくつかの実施形態において、脊椎動物は、ニワトリである。
【０１７４】 いくつかの実施形態において、この調製方法は、抗原の付加を包含する。例え
ば、この抗原は、単にワクチン中の細菌に付加され得るか、あるいは、所望の抗
原をコードする、１つ以上の構造遺伝子を含む発現カセットが弱毒化細菌に挿入
され得る。
【０１７５】 抗原としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：破傷風毒素のフ
ラグメントＣ、コレラ毒素のＢサブユニット、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｖｉｂｒｉｏ
ｃｈｏｌｅｒａｅ ＬＰＳ、ＨＩＶ抗原および／またはＳｈｉｇｅｌｌａ ｓ
ｏｎｅｉｉ ＬＰＳ。
【０１７６】 別の実施形態において、本発明は、対応するかまたは類似の病原性微生物によ
り引き起こされる疾患に罹りやすい宿主が免疫学的応答を惹起し得る、弱毒化微
生物を調製する方法を提供し、この方法は、（ａ）上記病原性微生物において第
１の非回復変異を構築する工程であって、ここでこの第１の非回復変異は、ＤＮ
Ａメチラーゼにより調節される１つ以上の遺伝子の発現またはその活性を変化さ
せる、工程、および（ｂ）上記病原性微生物において第２の非回復変異を構築す
る工程であって、ここで、この第２の非回復変異は、上記第１の非回復変異とは
独立しており、そして弱毒化することである、工程、を包含する。
【０１７７】 上記の開示は、一般的に本発明を記載する。単に例示を目的として本明細書中
に提供され、限定することを意図しない、以下の特定の実施例を参照することに
よって、より完全な理解が得られ得る。
【０１７８】 （実施例） 以下の限定しない実施例は、病原性生細菌から調製したワクチンおよび本発明
の教示に従う抗微生物薬物についての標的部位を提供し、そして例示であって、
限定ではない方法によって提供される。全ての科学技術的用語は、当業者により
理解されるような意味を有する、組換えＤＮＡ技術は、今や周知かつ広く行き渡
っており、慣用的であるとみなされる。最も広くかつ一般的な用語において、こ
れらの技術は、１つの生物の遺伝的物質を第２の生物に移入する工程を包含し、
その結果、移入する遺伝的物質が、移入される生物の遺伝的物質の一部になる。
これは、代表的には、第１の生物に由来する一片のＤＮＡを、プラスミドまたは
染色体ＤＮＡのいずれかから得る第１の工程からなる。ＤＮＡの一片は、任意の
サイズであり得、そしてしばしば、特定の塩基対部位でＤＮＡを認識かつ切断す
る制限エンドヌクレアーゼ酵素の使用によって得られる。特定のＤＮＡの一片を
単離した後、このＤＮＡをプラスミド、ファージまたはコスミドベクターに挿入
するか、またはクローニングして、組換え分子を形成し、これは、引き続いて、
形質転換、形質導入、トランスフェクション、および接合のような種々の方法に
よって宿主細胞に移入され得る。
【０１７９】 形質転換は、外部環境からの裸のＤＮＡの取り込みを包含し、これは、種々の
化学薬剤（例えば、カルシウムイオン）の存在またはエレクトロポレーションに
より人工的に誘導され得る。形質導入は、ファージ（例えば、形質導入ファージ
またはコスミドベクター）内に組換えＤＮＡのパッケージングを包含する。一旦
、組換えＤＮＡが微生物宿主に導入されると、これは、別個の一片として存在し
続けるか、または宿主細胞の染色体に挿入または組み込まれ得、そして細胞分裂
の間に染色体とともに複製され得る。接合は、古典的な微生物接合技術を包含す
る。
【０１８０】 （実施例１：Ｄａｍ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ誘導体は毒性でない） （株構築） 使用した全てのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株は、Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ
）株１４０２８（野生型といわれるＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのスムーズ毒性
株）と同遺伝子系である。以前、他の研究室から報告された全てのｄａｍ変異は
、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株ＬＴ２を使用した。このＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株ＬＴ
２は、ｉ．ｐ．で送達された場合、野生型より少なくとも１０００倍病原性が低
い。表１中のデータを参照のこと。
【０１８１】 全ての制限酵素およびｐＢＲ３２２は、商業的供給源（例えば、Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ，１１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｄ．，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９２０３７）から購入したか、購入し得
る。エレクトロポレーションは、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ａｐ
ｐａｒａｔｕｓ Ｍｏｄｅｌ Ｎｏ．１６５２０９８を用いて行った。Ｓ．ｔｙ
ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞を製造業者の指示に従って調製した。コンピテント細胞
のアリコートを、所望のプラスミドのアリコートと混合し、そして１分間氷上に
置いた。この混合物を、キュベット電極（０．２ｃｍ）中に移し、そして製造業
者の指示に従って、２．５ＫＶ／ｃｍの電場強度で１回パルスした。
【０１８２】 （１．非極性ｄａｍ変異の構築） 非極性ｄａｍ変異の構築のために、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍゲノムＤＮＡ
を、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用するＰＣＲのためのテ
ンプレートととして使用した。ｄａｍの最初の１００コドンを含む、３５０ｂｐ
のＤＮＡフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチド対：５’−ＧＡＴＴＴＣＴ
ＡＧＡＧＴＡＧＴＣＴＧＣＧＧＡＧＣＴＴＴＣ−３’（配列番号１）（５’末端
にＸｂａＩ部位を含む）および５’−ＧＡＴＴＣＴＣＧＡＧＧＧＴＧＴＴＧＡＡ
ＣＴＣＣＴＣＧＣＧ−３’（配列番号２）（５’末端にＸｈｏＩ部位を含む）を
用いて、ＰＣＲにより増幅する。２．０ｍＭ Ｍｇ2+を含む緩衝液中で、９２℃
で４５秒、４２℃で１分および７２℃で１分３０秒を３０サイクルにわたり、Ｐ
ＣＲを行った。この手順を、ＤＮＡサーマルサイクラー＃８０１−０１５０（Ｐ
ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）において行った。次いで、このＰＣＲ産
物を、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで二重消化した。第２のＰＣＲ増幅において、ｄ
ａｍの最後の７９コドンを含む、３００ｂｐのＤＮＡフラグメントを、以下のオ
リゴヌクレオチドプライマー：５’−ＧＡＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＧＣＣＴＧ
ＡＣＧＣＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号３）（５’末端にＸｈｏＩ部位を含む）
および５’−ＧＡＴＴＧＣＡＴＧＣＴＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡＧＧＣＧＡＧ−３’
（配列番号４）（５’末端にＳｐｈＩ部位を含む）を用いて合成した。次いで、
このＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩおよびＳｐｈＩで二重消化した。自殺ベクターｐＣ
ＶＤ４４２（Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｓ．ら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．
，５９：４３１０−４３１７（１９９１））を、ＸｂａＩおよびＳｐｈＩで二重
消化し、バンドを精製し、そして２つの注文通りに切断したＰＣＲ産物で単一反
応物中に連結した。Ｄａｍの１００の内部アミノ酸のインフレーム欠失を作製し
、欠失接合点に独特のＸｈｏＩ部位を残した。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α
λ ｐｉｒをアンピシリン耐性を選択して形質転換した。次いで、適切なアンピ
シリン耐性構築物（制限消化により確認した）由来のＤＮＡを用いて、Ｓ．ｔｙ
ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ １４０２８に形質転換した。次いで、組み込まれたｐＣＶ
Ｄ４４２含有構築物を、ＬＢ５％スクロース／塩類無しプレートに分離した。分
離物を、プリンティングによりアンピシリン感受性を、そして２−アミノプリン
（０．６ｍｇ／ｍｌ）含有ＬＢプレート上に画線することによりＤａｍを確認し
た（Ｄａｍ変異対は、２−ＡＰ感受性である）。さらに、ＰＣＲを使用して、野
生型配列と比較して、サイズにより欠失を確認した。最後に、欠失領域をｐＧＰ
７０４にクローニングし、そして欠失接合点（ＸｈｏＩ部位を含む）付近または
そこにおける配列を得て、欠失が実際にインフレームであったことを確認した。
【０１８３】 ｄａｍ１０２挿入（ｄａｍ１０２：：上記で議論したＭｕｄ−Ｃｍ）により引
き起こされた変異を、毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株１４０２８へのＰ２２媒介形
質導入により動かして、構築株２を得た。
【０１８４】 （２．マウス毒性アッセイ） 種々のＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株全ての毒性特性を、上記のように、雌Ｂ
ＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内接種または経口接種により試験し、そして結果を以下
の表１に示す。
【０１８５】 雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）
から購入し、そして６〜８週齡の年齢で最初にチャレンジした。Ｓ．ｔｙｐｈｉ
ｍｕｒｉｕｍ株を、ルリアブロス（ＬＢ）中で定常期まで３７℃で一晩増殖させ
た。細菌を、ＰＢＳで１回洗浄し、次いで、おおむね適切な希釈にＰＢＳで希釈
した（サンプルを、ＬＢにおけるコロニー形成単位（ＣＦＵ）のためにプレート
して、正確な細菌数を与えた）。マウスを、腹腔内または経口を介してのいずれ
かで、２００μｌの適切な細菌希釈物でチャレンジした。経口を介する接種につ
いては、細菌を洗浄し、そして遠心分離により濃縮し、次いで、細菌を０．２Ｍ
Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ８．０）中に再懸濁して、胃酸を中和し、そして０．２ｍ
ｌのボーラスとしてエーテル麻酔下で動物に投与した。全てのＬＤ50決定につい
て、５匹のマウスを、各々、１つの希釈につき接種した。コントロールマウスに
は、ＰＢＳのみを与えた。
【０１８６】 本研究で使用した全ての細菌株は、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ １４０２８
（株１）の誘導体であった。変異株は、野生型と同遺伝子系であり、そして記載
のように、得たか、または構築した。（ｄａｍ１０２：：Ｍｕｄ−Ｃｍおよびｍ
ｕｔＳ１２１：：Ｔｎ１０対立遺伝子は、ＬＴ２中にあり（株７）、表２に示し
たように、高度に弱毒化した（実際に非病原性の）株を、それぞれ、Ｄｒ．Ｊｏ
ｈｎ Ｒｏｔｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ）およびＤｒ．Ｔｏｍ
Ｃｅｂｕｌａ（Ｔｈｅ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａ
ｔｉｏｎ）から得た；これらの対立遺伝子（および以下のさらなる対立遺伝子）
を、毒性株１４０２８に形質導入し、それぞれ、株２および５を構築した。ｄａ
ｍΔ２３２（株３）を、規定されたｄａｍ配列のインフレームの３００ｂｐ欠失
を構築するように設計されたＰＣＲプライマーとして働く内部オリゴヌクレオチ
ドを用いて構築した。ｄｃｍ１：：Ｋｍを（Ｊｕｌｉｏ，Ｓ．Ｍ．ら，Ｍｏｌｅ
ｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２５８：１７８−１８１（１９９８））に従って構
築した；Ｋｍ耐性決定因子は、ｄｃｍ配列の６００ｂｐを超える内部欠失と関連
する。ｌｒｐ３１：：Ｋｍは、ｌｒｐ遺伝子におけるヌル挿入である（株６）。
Ｄａｍ重複株（株４）は、野生型バックグラウンドにおいて組換えプラスミド（
ｐＴＰ １６６）上にＥ．ｃｏｌｉ ｄａｍを含む（Ｍａｒｉｎｕｓ，ら，Ｇｅ
ｎｅ，２８：１２３−１２５（１９８４）。
【０１８７】 インビボ競合研究について、細菌を上記で議論したように処理し、次いで、変
異細胞を、野生型細胞と１：１の比で混合した（おおよその投入細菌は、５００
変異体＋５００野生型であった）。実際の比を、ＬＢで投入細菌を最初にプレー
トすることにより決定し、次いで、適切な抗生物質に対する耐性について１００
コロニーをスコアリングした。細菌を、少なくとも５匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスに
腹腔内に注射し（記載のように１：１の変異体：野生型比で）（Ｃｏｎｎｅｒ，
Ｃ．Ｐ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１４：４６４１
−４６４５（１９９８））、次いで、４から５日後に、マウスが瀕死状態と見受
けられた場合、それらを屠殺し、そしてそれらの脾臓を単離し、ホモジナイズし
、希釈し、そしてプレートした。再び、変異体：野生型比を変異体表現型につい
て１００のコロニーをスコアリングすることにより決定した。競合指数は、回収
された変異体：野生型細菌の比であり、そして本質的には、野生型株と比較され
る変異株をどのように適合させるかを反映する。従って、０．０００１より低い
競合指数（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）を示すそれらの株は、変異株
が脾臓から回収されなかったという事実を反映する。結論として、マウスは野生
型の結果として死亡した。
【０１８８】 ＬＤ50アッセイの利点は、大きな毒性の欠損を定量することである。この欠点
は、感度が不足しており、従ってわずかであるが、重大な毒性寄与がしばしば見
落とされるということである。競合指数は、同時接種後に、感染組織から回収し
た変異体：野生型細菌比である。競合指数は、非常に感度が高く、わずかな毒性
寄与の検出を可能にする。しかし、その感度のために、大きな欠損を与える２つ
の変異体間の毒性における差異を定量することは、問題をはらんでいる。従って
、ＬＤ50および競合指数アッセイを協調して使用することは、大きな毒性欠損お
よびわずかな毒性欠損の両方を定量するに有効な手段である。競合指数は、野生
型に対して比較される変異株をどのように適合させるかのさらなる指標であるが
、完全な有毒性と必ずしも直接的に相関する必要はない。
【０１８９】 結果を表１に示す。ＬＤ50は、感染動物の５０％を殺傷するに必要な容量であ
る。これらの株の各々についての（ＬＤ50）アッセイを、野生型（株１；（ＮＤ
，決定せず））のアッセイと比較した。胃挿管法（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｕｂａｔ
ｉｏｎ）を介しての全ての誘導体に関する経口的ＬＤ５０を、少なくとも１２匹
のＢＡＬＢ／ｃマウスを感染させることにより決定した；腹腔内（ｉ．ｐ．）Ｌ
Ｄ50を、少なくとも６匹のマウスを感染させることにより決定した。
【０１９０】
【表１】 ｄａｍ挿入は下流の遺伝子の発現を減少させ得る（極性効果）ので、インフレ
ームの非極性ｄａｍ欠失を構築し、そしてｄａｍ挿入として同じ減少した毒性を
有することを示した。従って、弱毒化は、具体的にはＤａｍの欠如に起因してい
た。さらに、等しい数のＤａｍ+ ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＤａｍ- Ｓａｌ
ｍｏｎｅｌｌａをマウスに腹腔内接種することは、Ｄａｍ-変異体がマウス中で
の増殖の間に完全に排除されたことを示した（競合指数アッセイ）。組換えプラ
スミド由来のＤａｍを過剰生成する株４（表１）を用いて、同様の結果を観察し
た。このことは、正確なレベルのＤａｍメチラーゼが完全な毒性に必要であるこ
とを示唆した。これらの結果により、Ｄａｍメチラーゼが細菌の病原性に必須で
あることが初めて示された。
【０１９１】 Ｄａｍは、メチル指向型ミスマッチ修復（ｍｅｔｈｙｌ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ
ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ）（ＭＤＭＲ）の破棄によって引き起こされる
変異速度の増加を介してＳａｌｍｏｎｅｌｌａ毒性に影響を及ぼし得る。Ｍｕｔ
Ｓは、ＭＤＭＲにおいて必須な役割を果たすので、ｍｕｔＳ Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａが毒性を弱毒化したか否かを決定した。表１（上記）におけるデータは、経
口ＬＤ50および競合指標毒性アッセイの両方において、ｍｕｔＳ Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａが野生型と同一であったことを示し、これは、Ｄａｍが、ＭＤＭＲ経路
を介する病原性に影響を及ぼさないことを示す。ＭｕｔＳ-株は、Ｍｕｓ+株より
も、種間でより高いレベルのＤＮＡ変化を示すので、ＭｕｔＳ-株は、新たな毒
性決定因子を、より容易に獲得する（Ｍａｒｉｎｕｓ，Ｅ．ｃｏｌｉ ａｎｄ
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、第２版、７８２−７９１（１９９６））。Ｍｕｓ-株が十分にビル
レントであるという事実は、ｍｕｔＳ Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ変異体が臨床的分離菌に見出される高い頻度を説明し得る（ＬｅＣｌｅｒｃら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１２０８−１２１１（１９９６））。
【０１９２】 ＤａｍおよびＬｒｐは、Ｐａｐ線毛（ｐｉｌｉ）の発現を直接的に調節し、こ
れらは、尿路疾患性Ｅ．ｃｏｌｉの毒性について必須である（Ｏ’Ｈａｎｌｅｙ
ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７５：３４７−３６０（１９８５）；およ
びＲｏｂｅｒｔｓら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１３３：１０６８−１０７５（１９８５
））。ＤａｍがＬｒｐ媒介性経路を通してＳａｌｍｏｎｅｌｌａ毒性に影響を及
ぼすか否かを決定するために、Ｌｒｐ-Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを分析した（表１
）。Ｌｒｐを欠如するＳａｌｍｏｎｅｌｌａは、ＬＤ50および競合指標アッセイ
に基づいて十分にビルレントであった。これらのデータは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ Ｌｒｐがマウスにおいて毒性因子ではないことを示す。
【０１９３】 上記で議論される結果は、アデニンのメチル化がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ病原性
について重大であることを示す。シトシン残基のＤＮＡのメチル化は、植物およ
び動物の両方における生物学的プロセスの調節のために重要であるようである。
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、ＤＮＡシトシンメチラーゼ（Ｄｃｍ）を含むが、この
生物におけるシトシンのメチル化の役割は、明らかでない。ｄｃｍ-変異体（ｄ
ｃｍｌ：：Ｋｍ）は、ＬＤ50および競合指標アッセイにおいてビルレントであっ
た（データは示さず）。これらの結果は、シトシン残基ではなくアデニンのメチ
ル化が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ病原性に必要であることを示す。
【０１９４】 ＤＮＡアデニンのメチル化は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける毒性遺伝子発現を直接的
に制御することが示されている（Ｂｒａａｔｅｎら、Ｃｅｌｌ，７６：５７７−
５８８（１９９４））。従って、Ｄａｍが、インビボ誘導性（ｉｎ ｖｉｖｏ
ｉｎｄｕｃｅｄ）（ｉｖｉ）遺伝子と命名される、マウスにおいて優先的に発現
されるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ遺伝子を調節するか否かを決定した。Ｃｏｎｎｅｒ
，Ｃ．Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１４：４６４
１−４６４５（１９９８）；Ｈｅｉｔｈｏｆｆ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９４：９３４−９３９（１９９７）；Ｍａｈ
ａｎ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：６６６−６６８（１９９３）；Ｍ
ａｈａｎ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２
：６６９−６７３（１９９５）；および米国特許第５，４３４，０６５号（これ
らの全ては、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。富化培地にお
いて増殖される場合、Ｄａｍは、２０を超えるｉｖｉ遺伝子の発現を有意に（２
〜１８倍）抑制し、これらのうちの８つは、図３に提示される。この８つの融合
物のうちの４つは、公知の遺伝子であり、これらの全ては、毒性に関与するか、
または毒性に関連することが示されている：ｓｐｖＢは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
毒性プラスミド上に存在し、そして感染の全身性部位で増殖を容易にするために
機能する（Ｇｕｌｉｇら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７：８２５〜８３０
（１９９３）；ｐｍｒＢは、ディフェンシンと名付けられた抗菌性ペプチドに対
する耐性に関与する（Ｒｏｌａｎｄら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，７５：４１
５４〜４１６４（１９９３）；ｍｇｔＡおよびｅｎｔＦは、それぞれ、マグネシ
ウムおよび鉄の輸送に関与する（Ｅａｒｈａｒｔ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、１０７５〜１０９０（１９９６）；およ
びＶｅｓｃｏｖｉ，Ｇ．ら、Ｃｅｌｌ，８４：１６５〜１７４（１９９６））。
未知の機能のさらなるｉｖｉ遺伝子もまた、Ｄａｍ調節された。これらの結果は
，ＤａｍがＳａｌｍｏｎｅｌｌａ遺伝子発現の全体的な調節因子であることを示
す。
【０１９５】 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ病原は、ＰｈｏＰ（特定の毒性遺伝子の誘導因子および
レセプターの両方として作用するＤＮＡ結合タンパク質）によって制御されるこ
とが公知である（ＧｒｏｉｓｍａｎおよびＨｅｆｆｒｏｎ Ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏ
ｎｅｎｔ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，３１９−３３２（１９９
５）に総説される）。Ｄａｍ調節経路およびＰｈｏＰ調節経路が共通の遺伝子を
共有するか否かを決定するために、Ｄａｍの効果を、７つのＰｈｏＰ活性化ｉｖ
ｉ遺伝子（ｓｐｖＢ、ｐｍｒＢおよびｍｇｔＡを含む）で試験した。図４は、Ｄ
ａｍがこれら３つ遺伝子の発現を２〜１９倍抑制し、そしてこれらの抑制がＰｈ
ｏＰタンパク質に依存しなかったことを示す。Ｄａｍは、残り４つのＰｈｏＰ-
活性化遺伝子の発現に有意に影響を及ぼさなかった（データは示さず）。これら
の結果は、ＤａｍおよびＰｈｏＰがＳａｌｍｏｎｅｌｌａ毒性を制御する全体的
な調節ネットワークを構成することを示す。
【０１９６】 ＤＮＡへの調節タンパク質の結合は、特定のＤａｍ標的部位（ＧＡＴＣ配列（
ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｏｕｄｅら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０：５９１３
−５９２０（１９９８））のメチル化をブロックすることによってＤＮＡのメチ
ル化パターンを形成し得る。従って、ＤａｍとＰｈｏＰとの間の相互作用のさら
なる研究を、特定のＤＮＡ部位へのＰｈｏＰ（またはＰｈｏＰ調節化タンパク質
）の結合が、Ｄａｍによってこれらの部位のメチル化をブロックして、ＤＮＡの
メチル化パターンにおける変更を生じるか否かを決定するために実施した。Ｐｈ
ｏＰ+ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＰｈｏＰ-Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの分析は、Ｄ
ＮＡのメチル化パターンにおいて別個の差異を示した。ＭｂｏＩ（これは、メチ
ル化されていないＧＡＴＣ部位でのみ切断する）を有するＰｈｏＰ-細菌由来の
ゲノムＤＮＡの消化は、ＰｈｏＰ+細菌由来のＤＮＡ中に存在しないＤＮＡフラ
グメントの出現を生じた（図５、矢印を参照のこと）。これらの結果は、Ｐｈｏ
Ｐタンパク質（またはＰｈｏＰ調節化遺伝子産物）が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａゲ
ノム中の特定のＧＡＴＣ含有部位でＤａｍのメチル化をブロックすることを示す
。あるいは、ＰｈｏＰ+株およびＰｈｏＰ-株は、異なるレベルのＤａｍ活性を有
し得、次に、ＤＮＡのメチル化パターンに影響を及ぼし得る。しかし、この調節
は、転写レベルで生じない。なぜなら、Ｄａｍは、ＰｈｏＰ発現を変更せず、Ｐ
ｈｏＰもＤａｍ発現を変更しないからである（Ｄ．Ｍ．Ｈｅｉｔｈｏｆｆおよび
Ｍ．Ｊ．Ｍａｈａｎ，未公開資料）。さらなる分析により、これらのＰｈｏＰ−
防御部位が毒性遺伝子の調節領域内にあるか否か、およびＤＮＡのメチル化がＤ
ＮＡ−ＰｈｏＰ相互作用を変更することによってＰｈｏＰ調節に直接的に影響を
及ぼすか否かを決定する。
【０１９７】 （実施例２Ａ：Ｄａｍ-Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ弱毒化株の防御効率） ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内チャレンジまたは経口チャレンジの結果として弱
毒化を示した株を、さらに、１０5 Ｉ．Ｐ．または１０9経口で、野生型株によ
る引き続くチャレンジに対する防御免疫について試験した。ＢＡＬＢ／ｃマウス
を、１０+9のＤａｍ-Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの用量を用いて胃挿管を介し
て経口的に免疫した。５週間後、免疫したマウスを、記載されるように、１０+9 の野生型Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを用いて経口的にチャレンジした。５週間
後、生存しているマウスを、表２（以下）に記載されるように野生型１４０２８
株を用いてチャレンジした。チャレンジ後４週間の間の生存は、十分な防御とみ
なした。これらのデータは、ワクチン株の開発における本発明の潜在的な使用を
示す。
【０１９８】 Ｄａｍ-変異体は、非常に弱毒化されたので、Ｄａｍ-Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａが
弱毒化生ワクチンとして作用し得るか否かを決定した。表２は、Ｓ．ｔｙｐｈｉ
ｍｕｒｉｕｍ Ｄａｍ-挿入株を用いて免疫した全ての（１７／１７）マウスが
、ＬＤ50以上の１０+4の野生型チャレンジを生存したことを示し、一方全ての免
疫していないマウス（１２／１２）は、チャレンジ後に死んだ。
【０１９９】
【表２】 。
【０２００】 実質的に、Ｄａｍ-Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを用いる免疫後に観察された腸チフ
スの明白な効果はなく、野生型チャレンジ後の明白な効果も存在しなかった。さ
らに、非極性ｄａｍ欠失（株）を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａを用いて免疫した全
ての（８／８）マウスがチャレンジを生存したので、これらのデータは、防御が
Ｄａｍメチラーゼの非存在に依存して特異的であったことを示す。ワクチンとし
てのＤａｍ-変異体の毒性弱毒化および有効性（表１および２）は、感染の間に
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの増殖および／または生存に対して有害なようである毒性
決定因子の異所性発現（表３および４）に起因し得る。従って、異所性発現は、
なぜＤａｍ変異体が全体的に弱毒化され、さらになお、弱毒化生ワクチンとして
の十分な防御を提供するかについての説明を提供する。
【０２０１】 （コロニー形成の研究） マウス組織におけるＤａｍ+ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＤａｍ-Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａの生存を、比較した。図６に示されるように、Ｄａｍ-細菌は、粘膜部
位（パイアー斑）のコロニー形成において十分にうまくいった（ｐｒｏｆｉｃｉ
ｅｎｔ）が、より深い組織部位のコロニー形成において激しい欠損を示した。感
染の５日後、本発明者らは、腸間膜リンパ節において、（Ｄａｍ+細菌の数に対
して）Ｄａｍ-Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの数における３桁の規模の低下、ならびに
肝臓および脾臓において、Ｄａｍ-Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの数における８桁の規
模の低下を観察した。これらのデータは、Ｄａｍ-Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａが、少
なくとも５日間の間、マウス小腸のパイアー斑において生存し、宿主免疫応答の
誘発に対する機会を提供することを示す。しかし、Ｄａｍ-Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａは、疾患を引き起こし得なかった；これらは、全身性組織に侵入し得なかった
か、または侵入し得るが生存し得なかったかのいずれかであった。
【０２０２】 （実施例２Ｂ：殺傷されたＤａｍ誘導体の防御効率） （生存しているＤａｍ-またはＤａｍ過剰発現細菌が、十分な防御応答を誘発
するために必要であるか否かの決定） Ｄａｍ-ワクチンにおける複数のタンパク質の異所性発現（上記および下記を
参照こと）は、殺傷されたＤａｍ-生物が、殺傷されたＤａｍ+生物よりも有意に
強力な防御免疫を誘発し得、従って、粘膜ワクチンとして使用され得ることを示
唆する。インビトロにおいて増殖されたＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ Ｄａｍ-
細菌を、アジ化ナトリウム（０．０２％）および／またはＵＶ光への曝露によっ
て殺傷し、その後、その抗菌剤を、洗浄するか、または殺傷された生物から透析
するかのいずれかをする。全細胞の殺傷されたワクチン調製物の効率を、粘膜ア
ジュバント（例えば、コレラ毒素、Ｅ．ｃｏｌｉ不安定毒素、またはビタミンＤ
３（１，２５（ＯＨ）2Ｄ3））を用いてかまたは用いずに試験する。従って、１
０10の殺傷されたＤａｍ-Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを、単独でまたは粘膜アジュバ
ントと合わせて含むワクチン調製物を、ＢＡＬＢ／ｃマウスを経口的に免疫する
ために使用する（実施例に記載される通り）。用量レジメンのように、マウスを
、３週間の間、１週間に１回胃挿管によって免疫する。殺傷された野生型Ｓ．ｔ
ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍは、ネガティブコントロールとして作用する。免疫したマ
ウスを、最後の免疫の２週間後にビルレントＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを用い
て経口的にチャレンジして、有効な免疫応答が生成されるか否かを決定する。有
効な免疫応答が生成されるならば、殺傷されたワクチン調製物を用いて免疫した
マウスはまた、他の病原性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ血清型（例えば、ｅｎｔｅｒｉ
ｔｉｄｉｓ、ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、ｄｕｂｌｉｎ）を用いてチャレンジし
て、誘発された免疫が関連する株に対して交差防御性（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅ
ｃｔｉｖｅ）であるか否かを決定し、同様にＤａｍ-Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ生ワ
クチンの経口投与の場合についても決定する。死んでいるワクチン調製物を用い
て免疫したマウスが最後の免疫の２週間後（または３週間後）に防御される場合
、誘発された免疫が持続性であるか否かは、最後の免疫の７週間後に、免疫した
マウスをチャレンジすることによって決定される。
【０２０３】 Ｄａｍの過剰発現は、野生型（Ｄａｍ+）またはＤａｍ-のワクチン株のいずれ
かにおいて発現されない潜在的な防御抗原の新たなレパートリーの異所性発現を
生じ得るので、殺傷されたワクチン実験は、Ｄａｍの過剰発現株単独か、または
殺傷されたＤａｍ-生物と組合わせて用いて実施される。２つの異なるワクチン
株は、潜在的に防御抗原の２つの異なるレパートリーを生成し得るので、組合せ
におけるそれらの使用は、優位な免疫応答を誘発し得る。
【０２０４】 （実施例３：Ｄａｍ-Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによって誘発される交差防御） （Ｄａｍ-Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを用いる免疫は、異種血清型に対する交差防
御応答を誘発する） 図７に示され、そして以下で議論されるように、Ｄａｍ-変異体は、通常感染
の間にのみ発現される複数の遺伝子（およびおそらくタンパク質）を異所的に発
現する。複数の抗原のこのような異所性発現は、異種血清型に対する交差防御免
疫応答を生じ得る。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、（胃挿管を介して）経口的に投与し
て、１×１０9のＤａｍ-Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（血清型Ｂ）を用いて免疫
し、そして１１週間後にビルレントＳ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓおよびＳ．ｄｕ
ｂｌｉｎ（血清型Ｄ）（１００〜１０００ＬＤ50）を用いてチャレンジした。表
３におけるデータは、マウスが、免疫１１週間後の異種チャレンジに対して防御
されたことを示す。重要なことには、交差防御免疫は、マウス組織においてワク
チン株の持続に起因しなかった。なぜなら、マウスは、ワクチン株が免疫した動
物から除去された後（すなわち、Ｄａｍ−生物が、パイアー斑、腸間膜リンパ節
、肝臓および脾臓において検出され得ない後）、６週間よりも長く異種チャレン
ジに対して防御されたからである。誘発された交差防御は、免疫の５週間後に全
身性病原体Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対して
誘発された防御が存在しないので、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株に特異的である。
【０２０５】
【表３】 。
【０２０６】 同様に、Ｄａｍ-Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（ｄａｍ１０２：：Ｍｕｄ−Ｃ
ｍ、続いて上記の実験プロトコル）を用いる免疫は、５週間後に１０9のＳ．ｔ
ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよび１０9のＳ．ｄｕｂｌｉｎを用いるチャレンジに対
する交差防御を与え、そしてさらに長期間の間、交差防御を与え得る。
【０２０７】 （Ｄａｍ-誘導体は、インビトロにおいて異所的に複数のタンパク質を発現す
る） Ｄａｍ-株における複数のタンパク質の異所性発現は、共通のエピトープを共
有する異種血清型に対して誘発される交差防御に寄与し得る。この目的のために
、本発明者らは、Ｄａｍ-株が、インビトロにおいて通常抑制される多くのＳａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ遺伝子を異所的に発現することを示す。
【０２０８】 二次元タンパク質ゲル電気泳動を、Ｌｕｒｉａブロス中で増殖される対数期の
Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの全細胞タンパク質抽出物に対して、Ｏ’Ｆａｒｒ
ｅｌｌ（（１９７５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：４００７−４０２１）
の方法によって実施した。ｐＨ５〜７のアンホライン（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用する等電点電気泳動を、８
００Ｖで１７時間実施した。二次元は、５．５時間、１７５Ｖで泳動した１２．
５％ポリアクリルアミドスラブゲルからなった。タンパク質を、銀染色によって
可視化した（Ｍｅｒｒｉｌら（１９８４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１
０４：４４１−４４７．）。この結果を、図７に示す。この結果は、インビトロ
において増殖されたＤａｍ-株、Ｄａｍ+（野生型）株およびＤａｍ過剰産生（Ｏ
Ｐ）株の二次元ゲル電気泳動分析（２−Ｄタンパク質分析）が、Ｄａｍ-の条件
下で発現され、Ｄａｍ+（野生型）またはＤａｍ ＯＰ（通常よりも約１００倍
高く発現する）のいずれかの条件下で検出されなかったいくつかのタンパク質の
検出を生じることを示す。これらのデータは、Ｄａｍ-Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａが
、インビトロにおいて（およびおそらくインビボにおいて）複数のタンパク質を
異所的に発現することを示し、これは、タンパク質発現の調節不全が、免疫系に
対してプロセシングおよび提示されるべき複数の新規なタンパク質標的を提供し
得ることを示唆する。
【０２０９】 ２−Ｄタンパク質分析は、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａのＤａｍ過剰発現株（野生型
レベルの約１００倍でＥ．ｃｏｌｉ Ｄａｍを過剰発現するプラスミドｐＴＰ１
６６を有するＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＡＴＣＣ １４０２８）が、研究室
の増殖条件下でＤａｍ+（野生型）ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＤａｍ-Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａによって発現されない多くの遺伝子産物を発現することを示す。本
発明者らは、Ｄａｍ+によって産生され、Ｄａｍ-またはＤａｍ過剰発現株によっ
て産生されないタンパク質を検出していなかった。Ｄａｍ過剰発現株が防御免疫
を弱毒化および誘発する本発明者らの観察をひとまとめにして考えると、これら
の結果は、Ｄａｍ過剰発現がＤａｍ-株において産生される抗原とは異なるレパ
ートリーの抗原の発現を生じ得ることを示唆する。従って、Ｄａｍ-株と組み合
わせてＤａｍ過剰発現株からなるワクチンは、２つの異なるレパートリーの潜在
的な防御抗原の異所性発現に起因して、非常に交差防御性であり得る。
【０２１０】 （Ｄａｍ-株によって誘発される免疫は、野生型感染後に誘発される免疫より
も大きい） 病原体の最も有効な毒性特性の１つは、宿主免疫応答を回避する能力である。
このような「ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）」ストラテジーは、宿主免疫認識を回
避するために多くのその機能を厳密に調節することによって達成される。従って
、細菌性防御機構のように、ビルレント生物によって産生される多くの抗原が、
十分な量で産生されないようであるか、および／または宿主免疫応答を誘発する
ために十分な量で産生されないようである。しかし、Ｄａｍ-細菌は、免疫系に
対してプロセシングおよび提示される複数の抗原を異所的に発現し得、従って、
Ｄａｍ-ワクチンを用いて免疫した動物は、天然の感染を生存する動物よりも、
より強力な免疫応答を誘発し得る。
【０２１１】 Ｄａｍ-ワクチンによって誘発される免疫を、野生型株を用いる天然の感染後
に誘発された免疫と比較した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ビルレント株Ｓ．ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ（１０+5の生物）（すなわち、半分のマウスが野生型免疫を生
存した）かまたは１０+5のＤａｍ-生物のＬＤ50で、経口的に免疫した。免疫の
５週間後、免疫したマウスを、致死用量のビルレント株を用いてチャレンジした
。表５は、Ｄａｍ-ワクチンによって誘発される免疫が、野生型株を用いる免疫
を生存したマウスにおいて誘発される免疫（１０匹のマウスのうちの１匹が、１
０+7のチャレンジを生存した）よりも、少なくとも１００倍多かった（１０匹の
マウスのうちの３匹が、１０+9のチャレンジを生存した）ことを示す。
【０２１２】
【表４】 。
【０２１３】 さらに、Ｄａｍ-生物を用いる免疫は、広範なチャレンジ用量（１０+7〜１０+ 9 ）にわたって、比較的類似のレベルを示した。これは、１０+5のＤａｍ-細菌の
免疫用量が、全ての免疫した動物における防御免疫応答を確実にするために必要
とされる最小閾値の生物よりも少ないことを示唆する。Ｄａｍ−株によって誘発
される増強された免疫は、Ｄａｍ抑制抗原の異所性発現に一部起因し得るようで
あり、この抗原は、野生型感染の間の十分な量および／または期間において産生
し得ない。
【０２１４】 免疫化動物は、全身の組織において毒性細菌の増殖を阻害する。Ｄａｍ-サル
モネラは、マウスの小腸のパイアー斑のコロニー形成には十分に優れているが、
深部組織の部位（肝臓および脾臓）のコロニー形成には非常に劣ることが見出さ
れた（実施例１）。Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＤａｍ-変異体はまた、Ｍ細
胞に対してより細胞毒性ではなく、上皮浸潤に劣り、そしてタンパク質分泌にお
いて欠陥を示す。Ｐｕｃｃｉａｒｅｌｌｉら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１１５７８〜１１５８３。まとめると、これ
らのデータは、Ｄａｍ-変異体が、疾患は生じ得ないが、完全な保護免疫応答を
誘発し得る理由に関する可能な説明を提供する。Ｄａｍ-サルモネラで免疫化さ
れたマウスは、毒性生物体でのチャレンジの後に、疾患の顕著な症状を事実上示
さなかったので、野生型サルモネラの運命を、免疫化マウス対非免疫化マウスに
おいて比較した。図８中のデータは、Ｄａｍ-免疫化マウスが、１０9の生物体の
野生型チャレンジの後に、粘膜組織および全身の組織の両方において、少なくと
も５日間、高負荷（１０4）の毒性細菌を保有することを示す。しかし、免疫化
マウスは、これらの毒性生物体の増殖を単に阻害するだけではない能力を有し、
免疫化マウスは、粘膜組織および全身の組織の両方から毒性生物体を除去するこ
とが可能である（４匹のマウスのうち２匹は、チャレンジ後２８日間で、パイア
ー斑、腸間膜リンパ節、肝臓、および脾臓から全ての毒性生物体を除去した）。
肝臓および脾臓から１０4の毒性生物体を除去するこの能力は、腹腔内ＬＤ50が
１０生物体未満であるという事実を考慮すると重要である。従って、Ｄａｍ-サ
ルモネラを用いた免疫化は、試験された全ての組織において野生型生物体の増殖
を阻害する。毒性細菌の致死負荷を全身から除去する能力は、Ｄａｍ-ワクチン
が、既存の微生物感染の処置への治療的適用を有し得る可能性を示唆する。
【０２１５】 （実施例４：Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓに対するニワトリのワクチン接種） 家禽におけるＳ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ感染の動力学を完全に理解すること
は、産卵雌鶏からヒト消費者への、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓの、卵から生じ
る感染を防ぐための、有効なストラテジーの処方に必須である。サルモネラは、
腸の上皮にコロニー形成し、そして侵入することによって疾患を生じる。いくつ
か場合において、サルモネラが腸の粘膜を通って血流へ侵入した後には、広範な
播種および全身性の疾患が続く。Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓは、ニワトリにお
いて侵襲性の血清型であるが、他のパラチフスサルモネラ血清型とは明らかに異
なる、あるレベルの病原性をニワトリに対して示さなかった。Ｐｏｐｉｅｌおよ
びＴｕｒｎｂｕｌｌ（１９８５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４７（３）：７８
６−７９２。ニワトリは、汚染された飼料からのＳ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓに
容易に感染し得、腸でのコロニー形成、および肝臓のような内部の組織（ｉｓｓ
ｕｅ）に達する侵入の両方を伴う。Ｈｉｎｔｏｎら（１９８９）Ｖｅｔ．Ｒｅｃ
．１２４：２２３。
【０２１６】 成体雌鶏の、いくつかのＳ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ株での実験的な感染は、
腸でのコロニー形成（数ヶ月間持続した）をもたらしたが、他のＳ．ｅｎｔｅｒ
ｉｔｉｄｉｓ株を用いた研究においては、排泄物の排泄の期間はかなり短かった
。（ＧａｓｔおよびＢｅａｒｄ、１９９０）、ＧａｓｔおよびＢｅａｒｄ（１９
９０）Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．３４：９９１−９９３；Ｓｈｉｖａｐｒａｓａｄら
（１９９０）Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．３４：５４８−５５７。１つの研究において
、静脈内で感染した鳥類は、経口で感染した鳥類よりも長い間、Ｓ．ｅｎｔｅｒ
ｉｔｉｄｉｓを排泄する。Ｓｈｉｖａｐｒａｓｅｄら（１９９０）。
【０２１７】 卵および卵製品中のＳ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓを破壊する種々の方法の有効
性は、公衆衛生当局および卵産業にとって益々重要な話題となってきた。このよ
うな情報は、消費者および卵の商業的利用者または施設利用者に、卵含有食品の
安全な調製に関する教示を与えるために極めて必要とされる。Ｓｈｉｖａｐｒａ
ｓａｄら（１９９０）は、種々の調理法による、卵の中のＳ．ｅｎｔｅｒｉｔｉ
ｄｉｓを破壊するための、時間／温度の必要条件は、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ
ｍについて以前に決定された類似の必要条件と有意には異ならないことを観察し
た。Ｂａｋｅｒら（１９８３）Ｐｏｕｌｔ．Ｓｃｉ．７２：１２１１−１２１６
。Ｈｕｍｐｈｒｅｙらは、ファージ４型Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｔｙ
ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびＳ．ｓｅｎｆｔｅｎｂｅｒｇの株は、卵黄に植え付
けた場合、幾分かの卵黄が液体のままである調理の形態からは生き延び得ること
を見出した。Ｈｕｍｐｈｒｅｙら（１９８９）ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃ
ｔ．１０３：３５−４５。さらに、卵を、室温で、植え付け後２日間保存した場
合、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓの個体数は、卵黄中で、いずれの標準的な調理
方法も完全にはＳａｌｍｏｎｅｌｌａを除去しない程の高レベルまで増加した。
一方、冷蔵庫の温度でのＳ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ培養物の貯蔵は、熱に対す
る感受性を増加することが見出された。Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（１９９０）Ｊ．Ａｐ
ｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．６９：４９３−４９７。別の研究において、均質化
された全卵中のＳ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓファージ４型は、ファージ８型また
はファージ１３ａ型およびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍよりも熱耐性であるが、
非常に熱耐性なＳ．ｓｅｎｆｔｅｎｂｅｒｇ株７７５Ｗよりは熱耐性でないこと
が測定された。試験した全てのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株は、卵全体またはアルブ
ミン中よりも、卵黄中で、より熱耐性であった。Ｈｕｍｐｈｒｅｙら（１９９０
）Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．１０４：２３７−２４１。
【０２１８】 本発明のワクチン、特にＳｔｒａｉｎ３は、卵および卵製品中のＳ．ｅｎｔｅ
ｒｉｔｉｄｉｓを除去する際に有効であり得る。Ｄａｍ-Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒ
ｉｕｍワクチンを、以前に記載したように調製する。ワクチンを、経口投与によ
って（すなわち、ニワトリの飼料および／または水と混合されて）ニワトリに導
入する。一旦ワクチンを投与すると、代表的にＤａｍによって抑制される毒性要
素が発現され、そしてニワトリは免疫応答を誘導する。これらのＤａｍ制御遺伝
子のいくつかは、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓによって共有される遺伝子のホモ
ログであり、Ｄａｍ-Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍは、実施例３のデータが示す
ように、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓに対する交差保護（ｃｒｏｓｓ ｐｒｏｔ
ｅｃｔｉｏｎ）を誘導し得る。
【０２１９】 （実施例５：Ｄａｍ誘導性サルモネラワクチンの、ウシへの投与） サルモネラは、最も一般的に単離された、乳牛の感染性の腸の細菌性病原菌で
あり、そしてヒトの、牛肉および日用品の消費に関連した、最も一般的な人獣共
通伝染病の疾患である。近年、サルモネラ症のヒト症例の発生率および重篤度は
、部分的には、ウシの個体群における抗菌耐性なＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍＤ
Ｔ１０４の出現に起因して、上昇してきた。有病率の研究は、米国の酪農場の１
６〜７３％がサルモネラに感染しており、そして選別された乳牛の５０％までが
屠殺時にサルモネラに汚染されている。農場でのサルモネラ制御は、生産損失お
よびヒトの食品から生じる疾患を減少させるために重要である。
【０２２０】 大規模な商業用農場では、ウシが複数のサルモネラ血清型に曝露され、そして
子ウシが生後間もなく感染されることは非常に一般的である。このような状況下
で、異種サルモネラ血清型に対する免疫性を刺激することが可能なサルモネラワ
クチンを有することは大変望ましい。
【０２２１】 （Ａ．ウシのサルモネラ感染に関するＤａｍの必要性、および生ウシワクチン
としてのＤａｍ-誘導体の有効性） １〜３日齢のホルスタイン雄子ウシを、全ての実験のために使用する。子ウシ
の受動免疫性を評価するために、総血漿タンパク質の測定値を用いた。５．５以
上の総血漿タンパク質を有する子ウシのみを使用する。供給源である酪農場のサ
ルモネラ感染状態を、排泄物サンプルおよび環境サンプルをサルモネラについて
培養することによって、子ウシを購入する前に決定する。子ウシのサルモネラ陰
性状態を、毎日の排泄物のサルモネラ培養によって、購入後に確認する。
【０２２２】 子ウシを、動物バイオセイフティーレベル（Ａｎｉｍａｌ Ｂｉｏｓａｆｅｔ
ｙ）２の施設で飼育し、飼養する。子ウシに、２クォートの２０：２０の牛乳（
１日に２回取り替える）を与え、そして新鮮な子ウシ用穀物および新鮮な水に、
１日２４時間アクセスできる。各日の給餌の時間に、全ての子ウシに食欲および
態度のスコアを与える。食欲スコアは、１〜４の段階（１＝２クォートのミルク
を消費した、２＝２クォート未満で１クォートより多いミルクを消費した、３＝
１クォート未満のミルクを消費した、および４＝ミルクを消費しなかった）であ
る。態度スコアはまた、１〜４の段階（１＝立っている、２＝励ますと立つ、３
＝補助すると立つ、４＝立てない）である。全てのチャレンジ実験に続いて、子
ウシを１日に３回調べ、そして１日に２回バイタルパラメーターを記録した。立
てない子ウシはいずれも末期であると考えられ、そして安楽死させる。サルモネ
ラチャレンジ後は、実験結果の混乱を避けるために、子ウシに対してどんな抗菌
処置または抗炎症処置も行わない。
【０２２３】 ホルスタイン雄子ウシにおける生Ｄａｍ-サルモネラワクチンの安全性の決定
。１〜３日齢の子ウシにおけるＤａｍ-Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの安全性を
、以下のように決定する。１〜３日齢の子ウシ１８頭を、６頭ずつ３グループに
分ける。第１のグループの６頭を１０9のＤａｍ-サルモネラを用いて、第２のグ
ループを１０10のＤａｍ-サルモネラを用いて、第３のグループを１０11のＤａ
ｍ-サルモネラを用いて経口でチャレンジする。チャレンジ後の３週間、研究に
おける各子ウシを、脈拍数および呼吸数、直腸温度、食欲、ならびに態度を測定
するために、１日に２回評価する。サルモネラ培養のために、排泄物サンプルを
、毎日、各子ウシから収集する。チャレンジの３週間後に、子ウシを安楽死させ
、器官（肝臓、胆汁、脾臓、腸間膜リンパ節、回腸粘膜、小腸の内容物、盲腸粘
膜、および盲腸の内容物）をサルモネラについて培養した。
【０２２４】 サルモネラＤａｍベースのワクチンが粘膜組織および／または全身の組織をコ
ロニー形成しうるか否かの決定。ウシ組織のコロニー形成の動力学を、経口投与
の後、Ｄａｍ+およびＤａｍ-Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの両方について決定す
る。小腸の内容物、回腸粘膜、パイアー斑、盲腸粘膜、盲腸の内容物、腸間膜リ
ンパ節、肝臓、および脾臓中の「細菌負荷」を、感染後の時間の関数として子ウ
シにおいて測定する。２４頭のホルスタイン雄子ウシを、１０9のＤａｍ-Ｓ．ｔ
ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを用いて経口でチャレンジする。６頭を、無作為に、４グ
ループに割り当て、チャレンジの２４時間後ならびに５日後、１４日後、および
２８日後に安楽死させる。定量的なサルモネラ培養のために、死体解剖で、各子
ウシから組織を収集する。１０9のＤａｍ+Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを用いて
経口でチャレンジした２４頭のホルスタイン雄子ウシを全く同様に処理し、そし
てそれらはこれらの実験のための陽性コントロールとして役立つ。
【０２２５】 Ｄａｍ-サルモネラが理想的なウシのワクチンであるためには、Ｄａｍ-サルモ
ネラは、パイアー斑にコロニー形成し、Ｍ細胞中で、複製し、そして持続するべ
きであり、そしてパイアー斑リンパ濾胞を含む内在する免疫細胞（例えば、マク
ロファージ、Ｂ細胞、およびＴ細胞）に抗原を提示するべきである。重要なこと
には、Ｄａｍ-サルモネラは、肝臓および脾臓のような深部組織にコロニー形成
するべきではなく、そして最終的にはパイアー斑から除去されるべきである。こ
れらの基準が満たされる場合、おそらくサルモネラＤａｍ-変異体は、安全で有
効なウシのワクチンのための基礎として役立つ。
【０２２６】 同種野生型チャレンジに対するＤａｍ-Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍワクチン
接種の防御効果。１〜３日齢の２０頭の子ウシを、無作為に、１０頭ずつの２グ
ループに分ける。第１のグループに、１〜３日齢で、Ｄａｍ-Ｓ．ｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍを用いて、経口でワクチン接種した。残りの１０頭のワクチン接種さ
れていない子ウシは、コントロールとして役立つ。全ての子ウシを、５週齢で、
１０11の毒性Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを用いて経口でチャレンジする。チャ
レンジ後の３週間、各子ウシを１日に３回評価し、脈拍数および呼吸数、直腸温
度、食欲スコア、ならびに態度スコアを１日に２回記録する。サルモネラ培養の
ために、排泄物サンプルを、毎日、各子ウシから収集する。チャレンジ後に死亡
する全ての子ウシを死体解剖し、そして器官（肝臓、胆汁、脾臓、腸間膜リンパ
節、回腸粘膜、小腸の内容物、盲腸粘膜、および盲腸の内容物）を、サルモネラ
について培養した。毒性サルモネラチャレンジから生き残っている子ウシを、チ
ャレンジの３週間後に安楽死させ、死亡解剖し、そして器官（肝臓、胆汁、脾臓
、腸間膜リンパ節、回腸粘膜、小腸の内容物、盲腸粘膜、および盲腸の内容物）
をサルモネラについて培養した。
【０２２７】 子ウシにおける効能のために必要とされる最小用量のレジメン、およびウシの
組織における減少したワクチン持続性。任意のワクチンレジメンの３つの重要な
特性は、ｉ）ワクチンの用量、ｉｉ）動物の齢、およびｉｉｉ）免疫化された動
物におけるワクチンの持続性である。完全な保護を誘導するために必要とされる
最小の用量（ＬＤ50の１０，０００倍）、ならびにパイアー斑、腸間膜リンパ節
、肝臓および脾臓のようなマウスの組織における持続性の減少を測定する。
【０２２８】 （Ｂ．Ｄａｍ誘導体は、関連する（異種サルモネラ血清型）病原体株に対する
交差防御を誘導する） （異種野生型チャレンジに対するＤａｍ-Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍワクチ
ン接種の保護効果）３つの類似の毒性サルモネラチャレンジ実験を、３つの異な
るチャレンジ生物体を使用して行う。各実験は、１〜３日齢でＤａｍ-Ｓ．ｔｙ
ｐｈｉｍｕｒｉｕｍを使用する仔ウシの経口免疫化および５週齢での毒性サルモ
ネラを使用するチャレンジを含む。第１の実験において、Ｓ．ｍｏｎｔｅｖｉｄ
ｅｏ（血清群Ｃ１）を、このチャレンジ生物体として使用し、第２の実験におい
ては、Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ（血清群Ｄ）、最後の実験においては、Ｓ．ａｎａｔｕ
ｍ（血清群Ｅ１）を使用する。異なる仔ウシを、各実験のために使用する。各々
のこれらの３つの実験に関して、２０頭の１〜３日齢の仔ウシを、１０頭の２つ
の群に無作為に分ける。この第１の群を、１〜３日齢でＤａｍ-Ｓ．ｔｙｐｈｉ
ｍｕｒｉｕｍを使用して経口でワクチン接種する。残りの１０頭の非ワクチン接
種仔ウシは、コントロールとして役に立つ。全ての仔ウシを、５週齢で１０11の
毒性サルモネラを用いて経口でチャレンジする。
【０２２９】 チャレンジ後３週間、各仔ウシを、１日３回評価して、そして脈拍、呼吸数、
直腸温度、食欲スコア、および態度スコアを１日２回記録する。糞便サンプルを
、サルモネラ培養のために毎日各仔ウシから集める。チャレンジの後死亡した全
ての仔ウシを、検死して、そして器官（肝臓、胆汁、脾臓、腸間膜リンパ節、回
腸粘膜、小腸内容物、盲腸粘膜および盲腸内容物）を、サルモネラについて培養
する。毒性サルモネラチャレンジから生き残っている仔ウシを、チャレンジから
３週間後に安楽死させて、検死し、そして器官（肝臓、胆汁、脾臓、腸間膜リン
パ節、回腸粘膜、小腸内容物、盲腸粘膜および盲腸内容物）を、サルモネラにつ
いて培養する。Ｄａｍ過剰産生株、単独およびＤａｍ-変異体と組み合わせて誘
導される交差保護免疫の比較をまた、行う。
【０２３０】 （Ｃ．サルモネラの殺されたＤａｍ-誘導体） インビトロで増殖したＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ Ｄａｍ-細菌を、アジ化
ナトリウム（０．０２％）および／またはＵＶ線光に曝露することにより殺して
、その後、抗菌物質を、殺された生物体から洗浄かまたは透析する。殺された細
胞全体ワクチンの効果を、経口投与および非経口投与で試験する。非経口ワクチ
ン群に関して、殺された１０6のＤａｍ-サルモネラを、水酸化アルミニウムおよ
びクイル（ｑｕｉｌｌ） Ａアジュバントと混合し、そして筋肉内注射を介して
仔ウシに投与する。経口ワクチン接種群に関して、殺された１０10のＤａｍ-サ
ルモネラを、粘膜アジュバントとしてビタミンＤ３とともに経口投与する。投薬
レジメンとして、新生仔ウシを、３週間、週に１度免疫する。同じアジュバント
とともに、そして同じ経路によって殺された野生型Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ
を投与した新生仔ウシは、ネガティブコントロールとして役立つ。免疫化した仔
ウシを、上記の同様のプロトコルを使用して、最後の免疫化から２週間後、毒性
Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを用いてチャレンジして、効果的な免疫応答が生じ
るか否かを決定する。この場合、殺されたワクチン調製物で免疫した仔ウシをま
た、他の病原体サルモネラ血清型（例えば、ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ，Ｓ．ｄｕｂ
ｌｉｎ，およびＳ．ａｎａｔｕｍ）でチャレンジして、この誘導された免疫が、
関連する株に対して交差防御性であるか否かを決定する。この実験を、Ｄａｍ過
剰産生株を、単独または殺されたＤａｍ-生物体と組み合わせて使用して繰り返
す。
【０２３１】 Ｄａｍ過剰産生は、野生型（Ｄａｍ+）ワクチン株またはＤａｍ-ワクチン株の
いずれにおいても発現されない潜在的防御抗原の新しいレパートリーの異所性発
現を生じ得るので、殺ワクチン実験を、Ｄａｍ過剰産生株を、単独および殺され
たＤａｍ-生物体と組み合わせて使用して繰り返す。
【０２３２】 （実施例６：Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅにおけるｄａｍ-変異体の構築
） （Ａ．Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ｄａｍ変異体の構築） Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ｄａｍ変異体は、現在利用可能ではない。公知のＶ．
ｃｈｏｌｅｒａｅ ｄａｍ配列を使用して、プライマーを設計して、ｄａｍ遺伝
子をＰＣＲ増幅する。これをプローブとして使用して、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅラ
ムダクローンバンクに対してハイブリダイズさせて、野生型Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ
ｅ ｄａｍクローンを回収する。ハイブリダイズするクローンのＤＮＡの両末端
を、配列決定して、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ｄａｍ領域を含むか否かを決定する
。サブクローニングし、そしてこれらのサブクローンをベクターの両末端からさ
らに配列決定することは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ｄａｍ配列全体を含む最も小
さなＤＮＡ制限断片を同定する。抗生物質耐性マーカーと関連する復帰できない
ｄａｍ欠失変異体を、最近確立された方法に従い構築する（Ｊｕｌｉｏ，Ｓ．Ｍ
．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２５８：１７８−１８１（１９９８
））。
【０２３３】 Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ病原性におけるｄａｍ変異体の役割を、マウスコレラ（
乳獣マウスモデル）、ＬＤ50および競合的指標について２つの異なる毒性アッセ
イにおいて試験する。これらは実施例１に記載した。
【０２３４】 （Ｂ．Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅに対するヒト生弱毒化ワクチンを構築する目的の
ためのｄａｍ変異体の保護能力の決定） 上記で詳細に議論されるように、サルモネラＤａｍ-変異体は、腸チフス発熱
のためのマウスモデルにおいて生弱毒化ワクチンとして役立つ。この実験の目的
は、これらの所望の効果が、サルモネラＤＮＡアデニンメチル化に対して特異的
であるか否か、またはＤａｍ-変異体がまた、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅに対する防
御を提供するか否かを認識することであり、従って、生弱毒化ワクチンの新しい
生成についての基礎を提供し得る。
【０２３５】 ヒト生弱毒化ワクチンは、野生型へ復帰する危険を制限し、かつこれらの株が
、新生病原体に対する抗生物質耐性の蔓延のための貯蔵所として役立たないこと
を確実にするように設計しなければならい。従って、この分析の次の工程は、適
切な復帰しない抗生物質感受性誘導体を構築することである。ｄａｍにおける無
極性の欠失（オペロン内の下流遺伝子に対する影響はない）を、標準的なＰＣＲ
ベースのアプローチ、自殺ベクターへの連結、および生じたインフレーム欠失株
の回収によってこれらの遺伝子の内部配列を除去することで構築する。各遺伝子
の欠失を、標準的な陽性選択自殺ベクターストラテジーを使用して個々に導入し
（Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５９：４
３１０−４３１７（１９９１））、所望の復帰しない弱毒化した抗生物質感受性
ワクチン株を得る。このワクチンの効力を、上記のように再試験する。Ｄａｍが
、改変（すなわち、完全には欠失および／または無力化されていない）されるよ
うに構築された株を試験し、Ｄａｍ過剰産生株も同様に試験する。
【０２３６】 （実施例７：Ｖｉｂｒｉｏ．ｃｈｏｌｅｒａｅおよびＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｓ
ｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにおけるｄａｍ遺伝子の不可欠性） ｄａｍの重復を、Ｄａｍ変異体を含む組換えプラスミドを野生型Ｄａｍ遺伝子
座に組み込むことにより構築した。生じた重復は、ｄａｍの２つのコピー（変異
体コピーおよび野生型コピー）を含んだ。通常、組換えプラスミドは、所定の頻
度で分離し、そして組換え体（分離体）は、変異体遺伝子または野生型遺伝子の
いずれかを含むというおおよそ等しい可能性がある。遺伝子が必須である場合、
この重復の全ての分離体（このプラスミドによって再組換えする）は、野生型で
ある；変異体遺伝子を有する組換え体は死ぬ。この遺伝子を含む組換えプラスミ
ドが存在する場合、重復は、変異型または野生型のいずれかへ分離し得る。Ｖｉ
ｂｒｉｏ．ｃｈｏｌｅｒａｅおよびＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒ
ｃｕｌｏｓｉｓに関して、野生型および変異体の両方を含むこのｄａｍ遺伝子の
重復は、野生型ｄａｍ遺伝子を提供する組換えプラスミドが存在しない限り、変
異体に分離し得ない。
【０２３７】 前述の説明は、本発明の原理の例示としてのみ考慮される。さらに多数の改変
および変化が、当業者に容易に考えられるので、上記のように示された正確な構
築およびプロセスに本発明を限定することは所望されない。従って、全ての適切
な改変および等価物が、上記の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲内
にあるように戻され得る。
【図面の簡単な説明】
本明細書中に援用され、そして明細書の一部を形成する添付の図面は、本発明
を例示する際に補助し、記載と一緒になって本発明の原理を説明することに役立
つ。添付の図面は、一定の縮尺率で描かれていない。
【図１】 図１は、一次免疫応答および二次免疫応答に従って存在する抗体のレベルのグ
ラフである。
【図２】 図２は、シトシンおよびアデニンにおいて生じるメチル化の部位の概略図であ
る。
【図３】 図３は、Ｄａｍがインビボ誘導遺伝子を調節することを例示するグラフである
。ＬＢ内で増殖されたＤａｍ+およびＤａｍ-株中のＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ
ｉｖｉ融合物由来のβ−ガラクトシダーゼ発現。縦軸は、β−ガラクトシダー
ゼ活性（細胞懸濁液×１０3の１ｍｌあたりのＡ600ユニットの１分間あたりに形
成されるｏ−ニトロフェノール（ＯＮＰ）のμ−モル）を示す。
【図４】 図４は、ＤａｍがＰｈｏＰ活性化された遺伝子を発現することを例示するグラ
フである。最少培地中で増殖したＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｉｖｉ融合物由
来のβ−ガラクトシダーゼ発現。縦軸は、β−ガラクトシダーゼ活性（細胞懸濁
液×１０3の１ｍｌあたりのＡ600ユニットの１分間あたりに形成されるｏ−ニト
ロフェノール（ＯＮＰ）のμ−モル）を示す。ｄａｍ遺伝子型は横軸の下に示さ
れ、ｐｈｏＰ遺伝子型は、黒四角（ＰｈｏＰ+）およびグレイ色四角（ｐｈｏＰ- ）として示される。
【図５】 図５は、ＰｈｏＰがＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ＤＮＡメチル化パターンの形成に
影響をおよぼすことを示す。最少培地内で増殖するＰｈｏＰ+株およびＰｈｏＰ- 株内に形成されたＤＮＡメチル化パターン。矢印は、ＰｈｏＰ-Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａに存在するが、ＰｈｏＰ+Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに存在しないＤＮＡフラ
グメントを示す。
【図６】 図６は、１日目および５日目にＤａｍ-変異体（黒四角）で免疫されるかまた
は免疫されない（白四角）マウス中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａの量および組織分布
を示すグラフである。ＰＰ、パイアー班；ＭＬＮ、腸間膜リンパ節；ＣＦＵ、コ
ロニー形成単位。
【図７】 図７は、１日目、５日目、１４日目および２８日目にＤａｍ-変異体（黒四角
）で免疫されるかまたは免疫されない（白四角）マウス中のＳａｌｍｏｎｅｌｌ
ａの量および組織分布を示すグラフである。ＰＰ、パイアー班；ＭＬＮ、腸間膜
リンパ節；ＣＦＵ、コロニー形成単位。
【図８】 図８（Ａ）〜（Ｃ）は、Ｄａｍ-株（ｄａｍ非極性欠失、ＭＴ２１８８；（Ａ
））；Ｄａｍ+株（野生型、ＡＴＣＣ １４０２８（Ｂ））；およびＤａｍ+++株
（過剰産生株、ＭＴ２１２８）中で産生されるタンパク質を示すＳ．ｔｙｐｈｉ
ｍｕｒｉｕｍの全細胞タンパク質抽出物の２Ｄゲル電気泳動の半色調複写物であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/04 37/00 37/00 Ｇ０１Ｎ 33/02 Ｇ０１Ｎ 33/02 33/15 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｚ 33/53 33/53 Ｍ 33/566 33/566 (31)優先権主張番号 ０９／４９５，６１４ (32)優先日 平成12年２月１日(2000．2．1) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヘイソフ， ダグラス エム． アメリカ合衆国 カリフォルニア 93117， ゴレタ， アパートメント 320， カ ミノ デル サー 785 (72)発明者 ロー， デイビッド エイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 93117， ゴレタ， ラ ゴレタ ロード 6089 (72)発明者 シンシェイマー， ロバート エル． アメリカ合衆国 カリフォルニア 93110， サンタ バーバラ， ビア カイエント 4606 Ｆターム(参考） 2G045 AA28 AA29 CB21 DA20 FB03 FB05 FB06 FB07 JA20 4C084 AA13 NA14 ZB072 ZB352 4C085 AA03 BA07 BA20 BA21 BA23 BA24 CC01 CC07 DD23 FF02 FF11 FF21 GG06

Claims (85)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 薬学的に受容可能な賦形剤中に生弱毒化病原性細菌を含む免
    疫原性組成物であって、該病原性細菌は、該病原性細菌が弱毒化されるようにＤ
    ＮＡアデニンメチラーゼ（Ｄａｍ）活性を変更する変異を含む、免疫原性組成物
    。
  2. 【請求項２】 前記変異がＤａｍ活性を減少させる、請求項１に記載の免疫
    原性組成物。
  3. 【請求項３】 前記変異がＤａｍ活性を除去する、請求項２に記載の免疫原
    性組成物。
  4. 【請求項４】 前記変異がｄａｍ遺伝子の欠失である、請求項３に記載の免
    疫原性組成物。
  5. 【請求項５】 前記変異がＤａｍの発現において増加を引き起こす、請求項
    １に記載の免疫原性組成物。
  6. 【請求項６】 前記病原性細菌がＳａｌｍｏｎｅｌｌａである、請求項１に
    記載の免疫原性組成物。
  7. 【請求項７】 前記病原性細菌が、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓ．ｅｎ
    ｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ａｂｏｒｔｕｓｏｖｉ、Ｓ．ａｂｏ
    ｒｔｕｓ−ｅｑｕｉ、Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ、Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、およびＳ
    ．ｐｕｌｌｏｒｕｍからなる群より選択される、請求項６に記載の免疫原性組成
    物。
  8. 【請求項８】 前記変異がＤａｍ活性を除去する、請求項６に記載の免疫原
    性組成物。
  9. 【請求項９】 前記変異がｄａｍ遺伝子の欠失である、請求項８に記載の免
    疫原性組成物。
  10. 【請求項１０】 前記変異がＤａｍの発現において増加を引き起こす、請求
    項６に記載の免疫原性組成物。
  11. 【請求項１１】 前記病原性細菌がＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍである、請
    求項７に記載の免疫原性組成物。
  12. 【請求項１２】 前記変異がｄａｍ遺伝子の欠失である、請求項１１に記載
    の免疫原性組成物。
  13. 【請求項１３】 前記病原性細菌がＳ．ｄｕｂｌｉｎである、請求項７に記
    載の免疫原性組成物。
  14. 【請求項１４】 前記変異がｄａｍ遺伝子の欠失である、請求項１３に記載
    の免疫原性組成物。
  15. 【請求項１５】 前記病原性細菌がＳ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓである、請
    求項７に記載の免疫原性組成物。
  16. 【請求項１６】 前記変異がｄａｍ遺伝子の欠失である、請求項１５に記載
    の免疫原性組成物。
  17. 【請求項１７】 前記病原性細菌がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａである、請求項
    １に記載の免疫原性組成物。
  18. 【請求項１８】 前記病原性細菌がＥ．ｃｏｌｉである、請求項１７に記載
    の免疫原性組成物。
  19. 【請求項１９】 前記病原性細菌がＶｉｂｒｉｏである、請求項１に記載の
    免疫原性組成物。
  20. 【請求項２０】 前記細菌がＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅである、請求項１９に記
    載の免疫原性組成物。
  21. 【請求項２１】 前記細菌がＹｅｒｓｉｎｉａである、請求項１に記載の免
    疫原性組成物。
  22. 【請求項２２】 前記細菌がＹ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｏｌｏｓｉｓで
    ある、請求項２１に記載の免疫原性組成物。
  23. 【請求項２３】 前記細菌がＳｈｉｇｅｌｌａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、
    Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、ＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａおよびＴ
    ｒｅｐｏｎｅｍａからなる群より選択される、請求項１に記載の免疫原性組成物
    。
  24. 【請求項２４】 アジュバントをさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組
    成物。
  25. 【請求項２５】 異種抗原をさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物
    。
  26. 【請求項２６】 前記病原性細菌が、異種抗原をコードするポリヌクレオチ
    ド配列を含む発現カセットをさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  27. 【請求項２７】 前記変異が非復帰性である、請求項１に記載の免疫原性組
    成物。
  28. 【請求項２８】 前記細菌が該細菌の弱毒化を引き起こす第２の変異を含む
    、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  29. 【請求項２９】 請求項１に記載の免疫原性組成物を含む、キット。
  30. 【請求項３０】 薬学的に受容可能な賦形剤中に死滅した病原性細菌を含む
    免疫原性組成物であって、該病原性細菌が、ＤＮＡアデニンメチラーゼ（Ｄａｍ
    ）活性を変更する変異を含む、免疫原性組成物。
  31. 【請求項３１】 前記変異が非致死的であり、そして前記病原性細菌を弱毒
    化させる、請求項３０に記載の免疫原性組成物。
  32. 【請求項３２】 前記変異が致死的である、請求項３０に記載の免疫原性組
    成物。
  33. 【請求項３３】 前記病原性細菌がＳａｌｍｏｎｅｌｌａである、請求項３
    ０に記載の免疫原性組成物。
  34. 【請求項３４】 前記変異がｄａｍ遺伝子を欠失させる、請求項３３に記載
    の免疫原性組成物。
  35. 【請求項３５】 前記変異がＤａｍの過剰発現を引き起こす、請求項３３に
    記載の免疫原性組成物。
  36. 【請求項３６】 病原性細菌の弱毒化株であって、該細菌が弱毒化されるよ
    うに該細菌がＤａｍ活性を変更させる変異を含む、株。
  37. 【請求項３７】 前記変異がＤａｍ活性を減少させる、請求項３６に記載の
    弱毒化株。
  38. 【請求項３８】 前記変異がＤａｍ活性を除去する、請求項３７に記載の弱
    毒化株。
  39. 【請求項３９】 前記変異がｄａｍ遺伝子の欠失である、請求項３８に記載
    の弱毒化株。
  40. 【請求項４０】 前記変異がＤａｍの発現において増加を引き起こす、請求
    項３６に記載の弱毒化株。
  41. 【請求項４１】 前記細菌がＳａｌｍｏｎｅｌｌａである、請求項３６に記
    載の弱毒化株。
  42. 【請求項４２】 前記細菌がＳａｌｍｏｎｅｌｌａである、請求項３９に記
    載の弱毒化株。
  43. 【請求項４３】 前記細菌がＳａｌｍｏｎｅｌｌａである、請求項４０に記
    載の弱毒化株。
  44. 【請求項４４】 個体において免疫応答を誘発する方法であって、免疫応答
    を誘発するに十分な量において、請求項１に記載の免疫原性組成物を該個体に投
    与する工程を包含する、方法。
  45. 【請求項４５】 個体において免疫応答を誘発する方法であって、免疫応答
    を誘発するに十分な量において、請求項１２に記載の免疫原性組成物を該個体に
    投与する工程を包含する、方法。
  46. 【請求項４６】 個体において免疫応答を誘発する方法であって、免疫応答
    を誘発するに十分な量において、請求項１４に記載の免疫原性組成物を該個体に
    投与する工程を包含する、方法。
  47. 【請求項４７】 個体において免疫応答を誘発する方法であって、免疫応答
    を誘発するに十分な量において、請求項１６に記載の免疫原性組成物を該個体に
    投与する工程を包含する、方法。
  48. 【請求項４８】 前記免疫応答が投与後に約４週間を超えて持続する、請求
    項４５に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記免疫応答が投与後に約４週間を超えて持続する、請求
    項４６に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 前記免疫応答が投与後に約４週間を超えて持続する、請求
    項４７に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 前記個体がヒトである、請求項４４に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 前記個体が家畜動物である、請求項４４に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 前記動物がニワトリである、請求項５２に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 前記動物がウシである、請求項５２に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 個体において病原性細菌による感染を予防する方法であっ
    て、該病原性細菌による感染の際の該病原性細菌による感染に関連する症状を減
    少させるに十分な量において、請求項１に記載の免疫原性組成物を該個体に投与
    する工程を包含する、方法。
  56. 【請求項５６】 個体において病原性細菌感染を処置する方法であって、該
    個体において該病原性細菌による感染に関連する症状を減少させるに十分な量に
    おいて、請求項１に記載の免疫原性組成物を該個体に投与する工程を包含する、
    方法。
  57. 【請求項５７】 個体においてＳａｌｍｏｎｅｌｌａ感染を予防する方法で
    あって、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによる感染の際に該個体においてＳａｌｍｏｎｅ
    ｌｌａ感染に関連する症状を減少させるに十分な量において、請求項６に記載の
    免疫原性組成物を該個体に投与する工程を包含する、方法。
  58. 【請求項５８】 個体においてＳａｌｍｏｎｅｌｌａ感染を処置する方法で
    あって、該個体においてＳａｌｍｏｎｅｌｌａ感染に関連する症状を減少させる
    に十分な量において、請求項６に記載の免疫原性組成物を該個体に投与する工程
    を包含する、方法。
  59. 【請求項５９】 病原性細菌に感染した個体を処置する方法であって、Ｄａ
    ｍ活性を変更する薬剤を含む組成物を該個体に投与する工程を包含する、方法。
  60. 【請求項６０】 個体においてＳａｌｍｏｎｅｌｌａの第２の種に対する免
    疫応答を誘発する方法であって、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの弱毒化した第１の種を
    含む免疫原性組成物を該個体に投与する工程であって、該第１の種は、Ｓａｌｍ
    ｏｎｅｌｌａの第１の種が弱毒化されるようにＤａｍ活性を変更する変異を含む
    、工程を包含する、方法。
  61. 【請求項６１】 前記第１のＳａｌｏｍｏｎｅｌｌａ種が、Ｓ．ｔｙｐｈｉ
    ｍｕｒｉｕｍである、請求項６０に記載の方法。
  62. 【請求項６２】 前記第１のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種が、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉ
    ｔｉｓである、請求項６０に記載の方法。
  63. 【請求項６３】 抗細菌活性を有し得る薬剤を同定する方法であって、薬剤
    をインビトロ転写系に添加した場合にｄａｍ遺伝子からの転写レベルを変更する
    薬剤を、該インビトロ転写系を使用して、検出する工程であって、薬剤は、薬剤
    が添加されない場合の転写レベルと比較して、該ｄａｍ遺伝子からの転写レベル
    を変更するその能力によって同定される、工程を包含する、方法。
  64. 【請求項６４】 前記ｄａｍ遺伝子がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ由来である、請
    求項６３に記載の方法。
  65. 【請求項６５】 抗細菌活性を有し得る薬剤を同定する方法であって、薬剤
    をインビトロ転写系に添加した場合にＤａｍをコードするＲＮＡ転写物からの翻
    訳レベルを変更する薬剤を、該インビトロ翻訳系を使用して、検出する工程であ
    って、薬剤は、薬剤が添加されない場合の翻訳レベルと比較して、Ｄａｍをコー
    ドする該ＲＮＡ転写物からの翻訳レベルを変更するその能力によって同定される
    、工程を包含する、方法。
  66. 【請求項６６】 前記ＤａｍがＳａｌｍｏｎｅｌｌａ由来である、請求項６
    ５に記載の方法。
  67. 【請求項６７】 抗細菌活性を有し得る薬剤を同定する方法であって、該薬
    剤がＤａｍに結合するか否かを決定する工程であって、薬剤がＤａｍに結合する
    その能力によって同定される、工程を包含する、方法。
  68. 【請求項６８】 前記ＤａｍがＳａｌｍｏｎｅｌｌａ由来である、請求項６
    ７に記載の方法。
  69. 【請求項６９】 抗細菌活性を有し得る薬剤を同定する方法であって、以下
    の工程： （ａ）Ｄａｍ結合部位を含む非メチル化オリゴヌクレオチドとＤａｍ、Ｓ−ア
    デノシルメチオニンおよび薬剤とをインキュベートする工程であって、該非メチ
    ル化オリゴヌクレオチドがシグナルをさらに含む、工程； （ｂ）全ての非メチル化標的部位を消化して、それによって該非メチル化オリ
    ゴヌクレオチドを放出する、工程；ならびに （ｃ）該非メチル化標的部位の消化に起因する該シグナルにおける増加として
    、ＤＮＡアデニンメチラーゼの阻害を検出する工程、 を包含し、ここで薬剤が、薬剤の非存在下での工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）
    の実施と比較して、シグナルにおける増加を引き起こすその能力によって同定さ
    れる、方法。
  70. 【請求項７０】 前記オリゴヌクレオチドが固体表面に係留される、請求項
    ６９に記載の方法。
  71. 【請求項７１】 前記固体表面が、アビジンを含むマイクロタイタープレー
    トであり、前記オリゴヌクレオチドがビオチンを含む、請求項７０に記載の方法
    。
  72. 【請求項７２】 前記Ｄａｍ結合部位がＧＡＴＣ配列である、請求項６９に
    記載の方法。
  73. 【請求項７３】 前記ＤａｍがＳａｌｍｏｎｅｌｌａ由来である、請求項６
    ９に記載の方法。
  74. 【請求項７４】 薬剤が、ポリペプチド、有機化合物および無機化合物より
    選択される群からなるインヒビターライブラリーより選択される、請求項６９に
    記載の方法。
  75. 【請求項７５】 抗細菌活性を有し得る薬剤を同定する方法であって、以下
    の工程： （ａ）試験されるべき薬剤と、Ｄａｍ機能を有する適切な宿主細胞とを接触さ
    せる工程；および （ｂ）Ｄａｍ機能の変更と関連する少なくとも１つの特徴を分析する工程であ
    って、薬剤が少なくとも１つの該特徴を誘発するその能力によって同定される、
    工程、 を包含する、方法。
  76. 【請求項７６】 前記宿主細胞が細菌である、請求項７５に記載の方法。
  77. 【請求項７７】 前記細菌がＳａｌｍｏｎｅｌｌａである、請求項７６に記
    載の方法。
  78. 【請求項７８】 請求項１に記載の免疫原性組成物を調製する方法であって
    、薬学的賦形剤と、病原性細菌が弱毒化されるようにＤＮＡアデニンメチラーゼ
    （Ｄａｍ）活性を変更する変異を含む該病原性細菌とを組合せる工程を包含する
    、方法。
  79. 【請求項７９】 対応するまたは同様の病原性微生物により引き起こされる
    疾患に感受性である宿主による免疫学的応答を誘発し得る弱毒化細菌を調製する
    ための方法であって、該病原性細菌において少なくとも１つの変異を構築する工
    程であって、第１の変異がＤａｍ機能の変更を生じる、工程を包含する、方法。
  80. 【請求項８０】 第１の変異がｄａｍ遺伝子に導入される、請求項７９に記
    載の方法。
  81. 【請求項８１】 第２の変異が、前記第１の変異とは独立した遺伝子におい
    て作製され、該第２の変異が前記病原性細菌の弱毒化を引き起こす、請求項８０
    に記載の方法。
  82. 【請求項８２】 前記第１の変異がＤａｍの発現を変更する、請求項８０に
    記載の方法。
  83. 【請求項８３】 前記第１の変異がＤａｍの発現を除去する、請求項８２に
    記載の方法。
  84. 【請求項８４】 所望の抗原をコードする１以上の構造遺伝子を含む発現カ
    セットを、前記弱毒化細菌に挿入する工程をさらに包含する、請求項８０に記載
    の方法。
  85. 【請求項８５】 請求項８５に記載の方法であって、前記所望の抗原が、破
    傷風毒素のフラグメントＣ、コレラ毒素のＢサブユニット、Ｂ型肝炎表面抗原、
    Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ ＬＰＳ、ＨＩＶ抗原およびＳｈｉｇｅｌｌａ
    ｓｏｎｅｉｉ ＬＰＳからなる群より選択される、方法。
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