JP2002524068A - Novel BAG proteins and nucleic acid molecules encoding them - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、ヒト（ＢＡＧ−１Ｌ、ＢＡＧ−１、ＢＡＧ−２、ＢＡＧ−３、ＢＡＧ−４ならびにＢＡＧ−５）、無脊椎動物Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（ＢＡＧ−１、ＢＡＧ−２）、および分裂酵母Ｓ．ｐｏｍｂｅ（ＢＡＧ−１Ａ、ＢＡＧ−１Ｂ）由来のＢＡＧ−１関連タンパク質のファミリー、ならびにそれらをコードする核酸分子を提供する。 (57) [Summary] The present invention relates to human (BAG-1L, BAG-1, BAG-2, BAG-3, BAG-4 and BAG-5), invertebrate C.I. elegans (BAG-1, BAG-2), and fission yeast S. elegans. Provided are a family of BAG-1 related proteins from Pombe (BAG-1A, BAG-1B), as well as nucleic acid molecules encoding them.
Description
【０００１】 （政府に支援された研究および開発のもとでなされた発明に発明に対する権利
の陳述） 本発明は、国立衛生研究所によって与えられた助成金番号ＣＡ−６７３２９の
もとで、政府の支援とともになされた。合衆国政府は、本発明において特定の権
利を有する。[0001] Statement of Rights to Inventions on Inventions Made Under Government-Supported Research and Development. [0001] This invention was created under the grant number CA-67329 awarded by the National Institutes of Health. With the help of The United States Government has certain rights in the invention.
【０００２】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、一般的に、分子生物学および分子医学の分野に関し、より詳細には
、タンパク質折り畳みを調節し得るタンパク質の新規なファミリーに関する。こ
れらのタンパク質機能は、潜在的に多様であり、腫瘍細胞の増殖および転移を促
進することが挙げられる。BACKGROUND OF THE INVENTION Field of the Invention [0002] The present invention relates generally to the fields of molecular biology and molecular medicine, and more particularly to a novel family of proteins that can regulate protein folding. These protein functions are potentially diverse, including promoting tumor cell growth and metastasis.
【０００３】 （背景情報） 分子シャペロンのＨｓｃ７０／Ｈｓｐ７０ファミリーは、タンパク質折り畳み
反応、タンパク質生体活性の調節、分解、複合体集合／分解、および膜を横切る
トランスロケーションに関与する。これらのタンパク質は、カルボキシ（Ｃ）末
端ペプチド結合ドメインを介して標的タンパク質内の疎水性領域と相互作用し、
基質の結合および放出はｓｃ７０／Ｈｓｐ７０のＮ末端ＡＴＰ結合ドメインによ
って制御される。Ｈｓｃ７０／Ｈｓｐ７０に補助された折り畳み反応は、ペプチ
ドの結合、再折り畳みおよび放出の反復サイクルによって達成され、これらは、
Ｈｓｃ７０／Ｈｓｐ７０のＡＴＰ結合ドメイン（ＡＴＰａｓｅ）および続くヌク
レオチド交換によるＡＴＰ加水分解に共役される。哺乳動物Ｈｓｃ７０／Ｈｓｐ
７０シャペロン活性は、ペプチド結合サイクルを調節するか、またはこれらのシ
ャペロンの作用を特定のタンパク質および細胞内成分に標的化するかのいずれか
の、パートナータンパク質によって調節される。ＤｎａＪファミリータンパク質
（Ｈｄｊ−１／Ｈｓｐ４０；Ｈｄｊ−２；Ｈｄｊ−３）は、Ｈｓｃ７０／Ｈｓｐ
７０のＡＴＰａｓｅ活性を刺激し、ペプチド基質に緊密に結合するＡＤＰ結合状
態をもたらす。Ｈｉｐタンパク質は、ＡＴＰ加水分解を刺激する際に、Ｈｓｃ７
０／Ｈｓｐ７０およびＤｎａＪホモログと協力し、従ってまた、基質ポリペプチ
ドとのＨｓｃ７０／Ｈｓｐ７０複合体を安定化するが、一方Ｈｏｐタンパク質は
、Ｃ末端ペプチド結合ドメインとの相互作用を通じて、コシャペロン（ｃｏ−ｃ
ｈａｐｅｒｏｎｅ）機能を提供し得る。BACKGROUND [0003] The Hsc70 / Hsp70 family of molecular chaperones is involved in protein folding reactions, regulation of protein bioactivity, degradation, complex assembly / degradation, and translocation across membranes. These proteins interact with hydrophobic regions in the target protein via the carboxy (C) terminal peptide binding domain,
Substrate binding and release is controlled by the N-terminal ATP binding domain of sc70 / Hsp70. The Hsc70 / Hsp70-assisted folding reaction is achieved by repeated cycles of peptide binding, refolding and release,
Coupled to the ATP-binding domain of Hsc70 / Hsp70 (ATPase) and subsequent ATP hydrolysis by nucleotide exchange. Mammalian Hsc70 / Hsp
70 chaperone activity is regulated by partner proteins that either regulate the peptide binding cycle or target the action of these chaperones to specific proteins and intracellular components. DnaJ family proteins (Hdj-1 / Hsp40; Hdj-2; Hdj-3) are Hsc70 / Hsp
Stimulates 70 ATPase activity, resulting in an ADP-bound state that binds tightly to the peptide substrate. Hip protein stimulates Hsc7 to stimulate ATP hydrolysis.
Cooperates with the 0 / Hsp70 and DnaJ homologs and thus also stabilizes the Hsc70 / Hsp70 complex with the substrate polypeptide, while the Hop protein, through interaction with the C-terminal peptide binding domain, co-chaperones (co- c
hperone) function.
【０００４】 ａｔｈａｎｏｇｅｎｅ−１（ｂａｇ−１）と結合するＢｃｌ−２は、ギリシャ
語のａｔｈａｎｏｓから命名され、これは、抗細胞死をいう。ＢＡＧ−１は、以
前に、米国特許第５，５３９，０９４号（１９９６年６月２３日発行；これは、
本明細書中に参考として援用される）において、Ｂｃｌ−２結合タンパク質−１
（ＢＡＰ−１）といわれた。この初期の特許において、ＢＡＧ−１は、ヒトＢＡ
Ｇ−１タンパク質の一部（Ｎ末端アミノ酸１〜８５が存在しない）として記載さ
れる。さらに、ヒトＢＡＧ−１と本質的に同一のヒトタンパク質は、Ｚｅｉｎｅ
ｒおよびＧｅｈｒｉｎｇ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９
２：１１４６５−１１４６９（１９９５））によって記載された。米国特許第５
，５３９，０９４号の発行に続いて、ヒトＢＡＧ−１のＮ末端アミノ酸配列１〜
８５が報告された。[0004] Bcl-2, which binds to athanogene-1 (bag-1), is named for the Greek word athanas, which refers to anti-cell death. BAG-1 was previously disclosed in U.S. Patent No. 5,539,094, issued June 23, 1996;
Incorporated by reference herein), Bcl-2 binding protein-1
(BAP-1). In this earlier patent, BAG-1 was a human BA
Described as part of the G-1 protein (N-terminal amino acids 1-85 are absent). In addition, a human protein essentially identical to human BAG-1 is Zeine
r and Gehring (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9
2: 11465-11469 (1995)). US Patent No. 5
, 539,094, followed by the N-terminal amino acid sequence 1 to human BAG-1.
85 were reported.
【０００５】 ＢＡＧ−１およびそのより長いアイソフォームであるＢＡＧ−１Ｍ（Ｒａｐ４
６）およびＢＡＧ−１Ｌは、近年、Ｈｓｃ７０／Ｈｓｐ７０調節タンパク質とし
て記載される。ＢＡＧ−１は、Ｈｓｃ７０／Ｈｓｐ７０ ＡＴＰａｓｅドメイン
への結合についてＨｉｐと競合し、そして基質放出を促進する。ＢＡＧ−１はま
た、報告されるように、ＡＤＰ／ＡＴＰ交換（細菌Ｈｓｃ７０ホモログであるＤ
ｎａＫのタンパク質分解性ＧｒｐＥヌクレオチド交換タンパク質に類似）を加速
することによって、Ｈｓｃ７０に媒介されるＡＴＰ加水分解を刺激する。遺伝子
トランスフェクション研究は、ＢＡＧ−１タンパク質が、Ｈｓｃ７０／Ｈｓｐ７
０との相互作用を介して広範な種々の細胞表現型（アポトーシスに対する耐性の
増加、細胞増殖の促進、腫瘍細胞移動および転移の増強、ならびにステロイドホ
ルモンレセプターの転写活性の変更を含む）に影響を及ぼし得ることを示す。[0005] BAG-1 and its longer isoform, BAG-1M (Rap4
6) and BAG-1L have recently been described as Hsc70 / Hsp70 regulatory proteins. BAG-1 competes with Hip for binding to the Hsc70 / Hsp70 ATPase domain and promotes substrate release. BAG-1 also reports ADP / ATP exchange (the bacterial Hsc70 homolog D
Stimulates Hsc70-mediated ATP hydrolysis by accelerating the proteolytic GrpE nucleotide exchange protein of naK). Gene transfection studies showed that BAG-1 protein was Hsc70 / Hsp7
Influences a wide variety of cellular phenotypes through interaction with G.0, including increased resistance to apoptosis, enhanced cell proliferation, enhanced tumor cell migration and metastasis, and altered transcriptional activity of steroid hormone receptors. Indicates that it can affect.
【０００６】 当該分野での顕著な進行にもかかわらず、さらなる相同ＢＡＧタンパク質種、
ならびにそれをコードする核酸分子および／またはヌクレオチド配列のさらなる
同定および単離に対する対処されていない必要性が残ったままである。このよう
な種は、ＢＡＧドメイン、すなわちタンパク質折り畳みに影響を及ぼすかもしく
はそれを調節するタンパク質の部分の正体および組織が同定され得るさらなる手
段を提供する。さらに、このような種は、治療剤、特に抗癌剤の候補体としてア
ポトーシスを調節する薬剤を同定するに有用である。本発明は、これらの必要性
を満たし、そして実質的に関連する利点を提供する。[0006] Despite significant progress in the art, additional homologous BAG protein species,
There remains an unmet need for further identification and isolation of nucleic acid molecules and / or nucleotide sequences encoding them. Such species provide an additional means by which the identity and tissue of the BAG domain, the portion of the protein that affects or regulates protein folding, can be identified. In addition, such species are useful for identifying agents that modulate apoptosis as candidates for therapeutic agents, particularly anticancer agents. The present invention fulfills these needs, and provides substantially related advantages.
【０００７】 （発明の要旨） 本発明は、ヒト（ＢＡＧ−１Ｌ（配列番号２）、ＢＡＧ−１（配列番号１の残
基１１６から開始する）、ＢＡＧ−２（配列番号４）、ＢＡＧ−３（配列番号６
および配列番号２０）、ＢＡＧ−４（配列番号８および配列番号２２）ならびに
ＢＡＧ−５（配列番号１０および配列番号２４））、無脊椎動物Ｃ．ｅｌｅｇａ
ｎｓ（ＢＡＧ−１（配列番号１２）、ＢＡＧ−２（配列番号１４））、および分
裂酵母Ｓ．ｐｏｍｂｅ（ＢＡＧ−１Ａ（配列番号１６）、ＢＡＧ−１Ｂ（配列番
号１８））、ならびにそれらをコードする核酸分子由来の、ＢＡＧ−１関連タン
パク質のファミリーを提供する。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to human (BAG-1L (SEQ ID NO: 2), BAG-1 (starting at residue 116 of SEQ ID NO: 1), BAG-2 (SEQ ID NO: 4), BAG- 3 (SEQ ID NO: 6
And SEQ ID NO: 20), BAG-4 (SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 22) and BAG-5 (SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 24)), invertebrate C.I. elega
ns (BAG-1 (SEQ ID NO: 12), BAG-2 (SEQ ID NO: 14)), and fission yeast S. The present invention provides a family of BAG-1 related proteins derived from Pombe (BAG-1A (SEQ ID NO: 16), BAG-1B (SEQ ID NO: 18)), and nucleic acid molecules encoding them.
【０００８】 本発明の別の局面は、ＢＡＧ−１関連タンパク質（Ｈｓｃ７０／Ｈｓｐ７０シ
ャペロン活性を調節する）のファミリーに存在するアミノ酸配列、すなわち、Ｂ
ＡＧドメインを提供する。[0008] Another aspect of the invention is directed to amino acid sequences present in the family of BAG-1-related proteins (which regulate Hsc70 / Hsp70 chaperone activity), ie, B
Provide an AG domain.
【０００９】 本発明の別の局面は、Ｈｓｃ７０／Ｈｓｐ７０シャペロン活性の調節に有用な
、新規なポリペプチドおよび核酸組成物ならびに方法を提供する。[0009] Another aspect of the invention provides novel polypeptide and nucleic acid compositions and methods useful for modulating Hsc70 / Hsp70 chaperone activity.
【００１０】 本発明の別の局面は、ＢＡＧファミリーのタンパク質（例えば、ＢＡＧ−１（
配列番号２の残基１１６で開始する）、および関連するタンパク質のＨｓｃ７０
／Ｈｓｐ７０ファミリーのタンパク質またはＢＡＧファミリータンパク質と相互
作用し得る他のタンパク質との結合を調節する薬剤を検出するための方法に関す
る。[0010] Another aspect of the present invention relates to BAG family proteins (eg, BAG-1 (
Starting at residue 116 of SEQ ID NO: 2), and the related protein Hsc70
The present invention relates to a method for detecting an agent that modulates the binding to / Hsp70 family proteins or other proteins that can interact with BAG family proteins.
【００１１】 本発明のなお別の局面は、ＢＡＧファミリータンパク質のＨｓｃ７０／Ｈｓｐ
７０ファミリー分子シャペロンまたは他のタンパク質との結合によって形成され
る結合複合体の解離を誘導する薬剤を検出するための方法に関する。[0011] Yet another aspect of the present invention relates to the BAG family proteins Hsc70 / Hsp.
The present invention relates to a method for detecting an agent that induces the dissociation of a binding complex formed by binding to a 70 family molecular chaperone or other protein.
【００１２】 （定義） 本明細書中で使用される場合、用語「アポトーシス」とは、プログラムされた
細胞死のプロセスをいい、全てのプログラムされた細胞死が、アポトーシスを介
して起こるわけではないが、本明細書中で使用される場合、「アポトーシス」お
よび「プログラムされた細胞死」は、交換可能に使用される。Definitions As used herein, the term “apoptosis” refers to a process of programmed cell death, where not all programmed cell death occurs via apoptosis. As used herein, "apoptosis" and "programmed cell death" are used interchangeably.
【００１３】 本明細書中で使用される場合、用語「腫瘍細胞増殖」とは、腫瘍細胞が増殖し
、従って腫瘍塊に拡大する能力をいう。As used herein, the term “tumor cell growth” refers to the ability of tumor cells to grow and thus spread into a tumor mass.
【００１４】 本明細書中で使用される場合、用語「細胞移動」とは、細胞運動性が、腫瘍細
胞による浸潤および潜在的な転移において果たす役割をいう。[0014] As used herein, the term "cell migration" refers to the role that cell motility plays in invasion and potential metastasis by tumor cells.
【００１５】 本明細書中で使用される場合、用語「転移」とは、原発性腫瘍部位から離れた
身体の部分での新生物の出現におけるような、身体のある部分から別の部分への
疾患プロセスの伝播いい；リンパ管または血管によるか、あるいは重症の腔、ま
たはクモ膜下腔または他の腔を介する直接的な拡大によって腫瘍細胞の播種を生
じる。As used herein, the term “metastasis” refers to the transfer from one part of the body to another, such as in the appearance of a neoplasm in a part of the body remote from the site of the primary tumor. Propagation of the disease process results in dissemination of tumor cells by lymphatic vessels or blood vessels, or by direct expansion through severe cavities, or through the subarachnoid space or other cavities.
【００１６】 本明細書中で使用される場合、用語「ステロイドホルモンレセプター機能」と
は、ステロイドホルモンと結合するレセプター部位の、生理学的な細胞性機能お
よび分子性機能をいう。As used herein, the term “steroid hormone receptor function” refers to the physiological cellular and molecular functions of the receptor site that binds steroid hormones.
【００１７】 本明細書中で使用される場合、用語「実質的に精製された」とは、その天然の
環境から取り出され、単離され、または分離されて、そしてそれらが天然で会合
する他の成分を少なくとも６０％含まない、好ましくは７５％含まない、そして
最も好ましくは９０％含まない、核酸あるいはアミノ酸配列をいう。As used herein, the term “substantially purified” refers to a substance that has been removed from its natural environment, isolated or separated, and other forms with which it naturally associates. A nucleic acid or amino acid sequence that does not contain at least 60%, preferably does not contain 75%, and most preferably does not contain 90%.
【００１８】 本明細書中で使用される場合、「核酸分子」とは、オリゴヌクレオチド、ヌク
レオチド、またはポリヌクレオチド、およびそれらのフラグメントまたは部分を
いい、ならびに一本鎖または二本鎖であり得、そしてセンス鎖またはアンチセン
ス鎖を表し得る、ゲノム起源または合成起源のＤＮＡあるいはＲＮＡをいう。As used herein, “nucleic acid molecule” refers to an oligonucleotide, nucleotide, or polynucleotide, and fragments or portions thereof, and can be single-stranded or double-stranded, And, it refers to DNA or RNA of genomic or synthetic origin, which can represent a sense strand or an antisense strand.
【００１９】 本明細書中で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」とは、一本鎖核酸
が、塩基対形成を介して相補鎖と結合する任意のプロセスをいう。As used herein, “hybridization” refers to any process by which a single-stranded nucleic acid binds to a complementary strand through base pairing.
【００２０】 本明細書中で使用される場合、用語「相補的」または「相補性」とは、許容さ
れる塩条件および温度条件下での、塩基対形成によるポリヌクレオチドの自然な
結合をいう。As used herein, the terms “complementary” or “complementarity” refer to the natural association of polynucleotides by base-pairing under acceptable salt and temperature conditions. .
【００２１】 本明細書中で使用される場合、用語「相同性」とは、相補性の程度をいう。部
分的相同性または完全相同性（すなわち、同一性）が存在し得る。部分的相補配
列は、同一の配列が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害
する配列であり、そして機能的用語を使用して「実質的に相同」といわれる。完
全相補的配列の標的配列へのハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェ
ンシー条件下でのハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロットまたはノー
ザンブロット溶液ハイブリダイゼーションなど）を使用して試験され得る。実質
的に相同な配列またはプローブは、完全に相同な配列またはプローブの低ストリ
ンジェンシー条件下でのその標的配列への結合（すなわち、ハイブリダイゼーシ
ョン）と競合し、そして阻害する。[0021] As used herein, the term "homology" refers to a degree of complementarity. There may be partial homology or complete homology (ie, identity). A partially complementary sequence is a sequence that at least partially inhibits the same sequence from hybridizing to a target nucleic acid, and is said to be "substantially homologous" using functional terms. Inhibition of hybridization of the perfectly complementary sequence to the target sequence can be tested using a hybridization assay under low stringency conditions, such as Southern blot or Northern blot solution hybridization. A substantially homologous sequence or probe competes for and inhibits binding (ie, hybridization) of a completely homologous sequence or probe to its target sequence under conditions of low stringency.
【００２２】 本明細書中で使用される場合、用語「アンチセンス」とは、特異的ＤＮＡ配列
またはＲＮＡ配列に対して相補的であるヌクレオチド配列をいう。用語「アンチ
センス鎖」は、「センス」鎖に相補的である核酸鎖を称する際に使用される。ア
ンチセンス分子は、相補鎖の合成を可能にするウイルスプロモーターへの目的の
遺伝子の逆方向での連結による合成を含む、任意の方法によって生成され得る。
一旦細胞内に導入されると、この転写された鎖は、細胞によって生成された天然
の配列と組み合わさり、二重鎖を形成する。次いで、これらの二重鎖は、さらな
る転写または翻訳のいずれかをブロックする。この様式で、変異体表現型が生成
され得る。名称「ネガティブ」は、時折、アンチセンスを称する際に使用され、
そして「ポジティブ」は、時折、センス鎖を称する際に使用される。[0022] As used herein, the term "antisense" refers to a nucleotide sequence that is complementary to a specific DNA or RNA sequence. The term “antisense strand” is used to refer to a nucleic acid strand that is complementary to the “sense” strand. Antisense molecules can be produced by any method, including synthesis by reverse ligation of the gene of interest to a viral promoter that allows synthesis of the complementary strand.
Once introduced into the cell, this transcribed chain combines with the native sequence produced by the cell to form a duplex. These duplexes then block either further transcription or translation. In this manner, a mutant phenotype can be generated. The name "negative" is sometimes used to refer to antisense,
And "positive" is sometimes used to refer to the sense strand.
【００２３】 本明細書中で使用される場合、「アミノ酸配列」とは、オリゴペプチド、ペプ
チド、ポリペプチド、またはタンパク質配列、およびそれらのフラグメントまた
は部分をいい、そして天然に存在する分子または合成分子をいう。「アミノ酸配
列」が本明細書中で引用される場合、この用語は、天然に存在するタンパク質の
配列を除外する。「アミノ酸配列」、「ポリペプチド」または「タンパク質」は
、このアミノ酸配列を、その引用されるタンパク質分子に関連する完全な、ネイ
ティブのアミノ酸配列に限定することを意味されない。As used herein, “amino acid sequence” refers to an oligopeptide, peptide, polypeptide, or protein sequence, and fragments or portions thereof, and is a naturally occurring or synthetic molecule. Say. When an "amino acid sequence" is cited herein, the term excludes the sequence of the naturally occurring protein. "Amino acid sequence", "polypeptide" or "protein" is not meant to limit the amino acid sequence to the complete, native amino acid sequence associated with the referenced protein molecule.
【００２４】 タンパク質に関連して、本明細書中で使用される場合、用語「機能的フラグメ
ント」または「フラグメント」は、概して、そのタンパク質によって示される活
性を示し得るか、またはその活性をもたらし得る、そのタンパク質の部分をいう
。この部分は、３アミノ酸残基から全アミノ酸配列−１のアミノ酸までの大きさ
の範囲であり得る。例えば、「配列番号１のアミノ酸配列の少なくとも機能的フ
ラグメントを含む」タンパク質は、配列番号１のタンパク質の全長およびその部
分を包含する。As used herein in the context of a protein, the term “functional fragment” or “fragment” may generally exhibit, or result in, the activity exhibited by the protein. , That part of the protein. This portion can range in size from three amino acid residues to amino acids of the entire amino acid sequence-1. For example, a protein “comprising at least a functional fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1” encompasses the entire protein of SEQ ID NO: 1 and portions thereof.
【００２５】 本明細書中で使用される場合、ＢＡＧタンパク質の「誘導体」は、１以上のア
ミノ酸によって改変されているアミノ酸配列をいう。誘導体は、「保存的」変化
を有し得、ここで、置換アミノ酸は、類似の構造的特性または化学的特性を有す
る（例えば、無極性アミノ酸の別の無極性アミノ酸での置換（例えば、ロイシン
のイソロイシンでの置換））。誘導体はまた、「非保存的」変化を有し得、ここ
で、置換されたアミノ酸は、異なるが十分に類似の構造的特性または化学的特性
を有し、これらの特性は、例えば、所望の生物学的活性に不利に影響することの
ない置換（例えば、非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸の無極性Ｒ基を有するアミ
ノ酸の置換（例えば、グリシンのトリプトファンでの置換）、あるいは荷電Ｒ基
を有するアミノ酸での非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸での置換（例えば、リジ
ンのアスパラギンでの置換））を可能にする。As used herein, a “derivative” of a BAG protein refers to an amino acid sequence that has been modified by one or more amino acids. Derivatives can have “conservative” changes, wherein the substituted amino acid has similar structural or chemical properties (eg, replacement of a non-polar amino acid with another non-polar amino acid (eg, leucine With isoleucine))). Derivatives may also have "non-conservative" changes, wherein the substituted amino acids have different but sufficiently similar structural or chemical properties, such as, for example, Substitutions that do not adversely affect biological activity (eg, replacement of an amino acid with an uncharged polar R group with an amino acid with a non-polar R group (eg, replacement of glycine with tryptophan) or a charged R group This allows for the substitution of an amino acid having an uncharged polar R group for an amino acid (eg, substitution of lysine for asparagine).
【００２６】[0026]
【表１】 同様の小さな改変もまた、アミノ酸の欠失または挿入、あるいは両方を含み得る
。どのアミノ酸残基が所望の生物学的機能性を損失することなく上記のように改
変され得るかを決定する際のガイダンスは、当該分野で周知のコンピュータープ
ログラム（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア）を使用して決定され得る。さ
らに、誘導体はまた、そのコードポリペプチドに対する化学的改変から生じ得る
。この化学的改変としては、以下を含むがこれらに限定されない：水素のアルキ
ル基、アシル基またはアミノ基による置換；カルボキシル基の適切なアルキル部
分またはアリール部分とのエステル化；エーテル誘導体を形成するためのヒドロ
キシル基のアルキル化。さらなる誘導体はまた、Ｌ−型アミノ酸のその対応する
Ｄ−型対応物での置換から生じ得る。[Table 1] Similar small modifications may also include amino acid deletions or insertions, or both. Guidance in determining which amino acid residues can be modified as described above without loss of the desired biological functionality is provided using computer programs well known in the art (eg, DNASTAR software). Can be determined. In addition, derivatives may also result from chemical modifications to the encoded polypeptide. Such chemical modifications include, but are not limited to, the replacement of hydrogen with an alkyl, acyl, or amino group; the esterification of a carboxyl group with a suitable alkyl or aryl moiety; Of the hydroxyl group of. Further derivatives may also result from substitution of the L-form amino acid with its corresponding D-form counterpart.
【００２７】 本明細書中で使用される場合、用語「模倣物」とは、その構造が、タンパク質
／ポリペプチドまたはその部分（例えば、ＢＡＧ−１）の構造の知見から開発さ
れ、そしてそれ自体で、ＢＡＧ−１タンパク質のいくらかまたは全ての作用をも
たらし得る分子をいう。As used herein, the term “mimic” refers to a structure whose structure has been developed from knowledge of the structure of the protein / polypeptide or a portion thereof (eg, BAG-1) and And refers to molecules that can provide some or all of the effects of the BAG-1 protein.
【００２８】 本明細書中で使用される場合、「ペプチド核酸」とは、アミノ酸残基（例えば
、リジン）およびアミノ基が付加されたオリゴマーを含む分子をいう。これらの
低分子（抗遺伝子薬剤とも称される）は、それらの相補鎖の核酸に結合すること
によって転写の伸長を停止する（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ら、Ａｎｔｉｃａｎ
ｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．８：５３−６３（１９９３））。As used herein, “peptide nucleic acid” refers to a molecule that includes an oligomer to which amino acid residues (eg, lysine) and amino groups have been added. These small molecules (also referred to as anti-gene drugs) stop transcription elongation by binding to their complementary nucleic acid (Nielsen, PE et al., Anticanan).
cer Drug Des. 8: 53-63 (1993)).
【００２９】 （発明の詳細な説明） 本発明は、ヒト由来[ＢＡＧ−１Ｌ（配列番号２）、ＢＡＧ−１Ｓ（配列番号
２の残基１１６にて始まる）、ＢＡＧ−２（配列番号４）、ＢＡＧ−３（配列番
号６）および（配列番号２０）、ＢＡＧ−４（配列番号８）および（配列番号２
２）ならびにＢＡＧ−５（配列番号１０）および（配列番号２４）]、無脊椎動
物Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ由来[ＢＡＧ−１（配列番号１２）、ＢＡＧ−２（配列番
号１４）]および分裂酵母Ｓ．ｐｏｍｂｅ由来[ＢＡＧ−１Ａ（配列番号１６）、
ＢＡＧ−１Ｂ（配列番号１８）]、特に、ヒトＢＡＧ−１Ｌ（配列番号２）、Ｂ
ＡＧ−１（配列番号２の１１６残基にて始まる）およびＢＡＧ−２（配列番号４
）Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＢＡＧ−１（配列番号１２）およびＢＡＧ−２（配列番
号１４）、ならびにＳ．ｐｏｍｂ ＢＡＧ−1Ａ（配列番号１６）およびＢＡＧ
−１Ｂ（配列番号１８）を含む全長アミノ酸配列；ならびにヒトＢＡＧ−３（配
列番号６）および（配列番号２０）、ＢＡＧ−４（配列番号８）および（配列番
号２２）およびＢＡＧ−５（配列番号１０）および（配列番号２４）を含む部分
配列ならびにそれらの機能フラグメントのＢＡＧ−１関連タンパク質のファミリ
ーを提供する。特に本発明は、ヒトＢＡＧ−２（配列番号４）、ＢＡＧ−３（配
列番号６）および（配列番号２０）、ＢＡＧ−４（配列番号８）および（配列番
号２２）およびＢＡＧ−５（配列番号１０）および（配列番号２４）のタンパク
質を含むアミノ酸配列を提供する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to human-derived [BAG-1L (SEQ ID NO: 2), BAG-1S (starting at residue 116 of SEQ ID NO: 2), BAG-2 (SEQ ID NO: 4) , BAG-3 (SEQ ID NO: 6) and (SEQ ID NO: 20), BAG-4 (SEQ ID NO: 8) and (SEQ ID NO: 2)
2) and BAG-5 (SEQ ID NO: 10) and (SEQ ID NO: 24)]; elegans [BAG-1 (SEQ ID NO: 12), BAG-2 (SEQ ID NO: 14)] and fission yeast S. cerevisiae. pombe-derived [BAG-1A (SEQ ID NO: 16),
BAG-1B (SEQ ID NO: 18)], especially human BAG-1L (SEQ ID NO: 2), B
AG-1 (starting at residue 116 of SEQ ID NO: 2) and BAG-2 (SEQ ID NO: 4)
) C. elegans BAG-1 (SEQ ID NO: 12) and BAG-2 (SEQ ID NO: 14); pomb BAG-1A (SEQ ID NO: 16) and BAG
Full-length amino acid sequence comprising -1B (SEQ ID NO: 18); and human BAG-3 (SEQ ID NO: 6) and (SEQ ID NO: 20), BAG-4 (SEQ ID NO: 8) and (SEQ ID NO: 22) and BAG-5 (SEQ ID NO: 22) Nos. 10) and (SEQ ID NO. 24) and a family of BAG-1-related proteins of functional fragments thereof. In particular, the invention relates to human BAG-2 (SEQ ID NO: 4), BAG-3 (SEQ ID NO: 6) and (SEQ ID NO: 20), BAG-4 (SEQ ID NO: 8) and (SEQ ID NO: 22) and BAG-5 (SEQ ID NO: 22). Nos. 10) and (SEQ ID NO. 24) are provided.
【００３０】 本発明の別の局面は、ヒト由来[ＢＡＧ−１（配列番号１）、ＢＡＧ−２（配
列番号３）、ＢＡＧ−３（配列番号５）および（配列番号１９）、ＢＡＧ−４（
配列番号７）および（配列番号２１）ならびにＢＡＧ−５（配列番号９）および
（配列番号２３）]、無脊椎動物Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ由来[ＢＡＧ−１（配列番号
１１）、ＢＡＧ−２（配列番号１３）]および分裂酵母Ｓ．ｐｏｍｂｅ由来[ＢＡ
Ｇ−１Ａ（配列番号１５）、ＢＡＧ−１Ｂ（配列番号１７）]のＢＡＧ−１関連
タンパク質のファミリーをコードする核酸分子およびヌクレオチド配列を提供す
る。Another aspect of the present invention relates to human-derived [BAG-1 (SEQ ID NO: 1), BAG-2 (SEQ ID NO: 3), BAG-3 (SEQ ID NO: 5) and (SEQ ID NO: 19), BAG-4 (
SEQ ID NO: 7) and (SEQ ID NO: 21) and BAG-5 (SEQ ID NO: 9) and (SEQ ID NO: 23)]. elegans-derived [BAG-1 (SEQ ID NO: 11), BAG-2 (SEQ ID NO: 13)] and fission yeast S. cerevisiae. Pombe origin [BA
G-1A (SEQ ID NO: 15), BAG-1B (SEQ ID NO: 17)].
【００３１】 ＢＡＧ−１Ｌ（配列番号２）は、アポトーシスをブロックし、腫瘍細胞の転移
を促進し、かつ因子非依存性細胞増殖およびｐ５３耐性細胞増殖に起因する多機
能タンパク質である。ＢＡＧ−１Ｌ（配列番号２）は、いくつかの種類のタンパ
ク質（Ｂｃｌ−２、いくつかのチロシンキナーゼ増殖因子レセプター、ステロイ
ドホルモンレセプター、およびｐ５３誘導性細胞周期調節因子Ｓｉａｈ−１Ａを
含む）と相互作用する。BAG-1L (SEQ ID NO: 2) is a multifunctional protein that blocks apoptosis, promotes metastasis of tumor cells, and results from factor-independent and p53-resistant cell growth. BAG-1L (SEQ ID NO: 2) interacts with several types of proteins, including Bcl-2, some tyrosine kinase growth factor receptors, steroid hormone receptors, and the p53-inducible cell cycle regulator Siah-1A. Works.
【００３２】 ＢＡＧ−１は、Ｈｓｃ７０／Ｈｓｐ７０ファミリー分子シャペロンの調節因子
である。このタンパク質のカルボキシル末端ドメインは、Ｈｓｃ７０およびＨｓ
ｐ７０のＡＴＰａｓｅドメインとしっかり結合する（Ｋp＝１ｎＭ）（Ｚｅｉｎ
ｅｒ，Ｍ．、Ｇｅｂａｕｅｒ，Ｍ．、およびＧｅｈｒｉｎｇ，Ｕ．、ＥＭＢＯ
Ｊ．１６：５４８３〜５４９０、（１９９７））。ＢＡＧ−１は、これらの分子
シャペロンの活性を調節し、Ｈｓｐ７０／Ｈｓｃ７０結合タンパク質Ｈｉｐ（３
〜５）の明らかな機能的アンタゴニストとして作用する（Ｈｏｅｈｆｅｌｄ，Ｊ
．およびＪｅｎｔｓｃｈ，Ｓ．、ＥＭＢＯ Ｊ．１６：６２０９〜６２１６、（
１９９７）；Ｔａｋａｙａｍａ，Ｓ．、Ｂｉｍｓｔｏｎ，Ｄ．Ｎ．、Ｍａｔｓｕ
ｚａｗａ，Ｓ．、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｂ．Ｃ．、Ａｉｍｅ−Ｓｅｍｐｅ，Ｃ．、Ｘ
ｉｅ，Ｚ．、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｒ．Ｊ．、およびＲｅｅｄ，Ｊ．Ｃ．、ＥＭＢ
Ｏ Ｊ．１６：４８８７〜９６、（１９９７）；Ｚｅｉｎｅｒ，Ｍ．、Ｇｅｂａ
ｕｅｒ，Ｍ．、およびＧｅｈｒｉｎｇ，Ｕ．、ＥＭＢＯ Ｊ．１６：５４８３〜
５４９０、（１９９７））。一般的には、タンパク質リホールディングは、ＡＴ
Ｐの加水分解と共役した、標的ペプチドの結合および放出の反復サイクルを介し
てＨｓｐ７０／Ｈｓｃ７０により達成される（Ｅｌｌｉｓ，Ｒ．、Ｃｕｒｒ Ｂ
ｉｏｌ．７：Ｒ５３１−Ｒ５３３、（１９９７））。ＢＡＧ−１は、基質放出を
促進するようにみえるが、Ｈｉｐは、Ｈｓｐ７０／Ｈｓｃ７０の標的ペプチドと
の複合体形成を安定させる（Ｈｏｅｈｆｅｌｄ，Ｊ．、Ｍｉｎａｍｉ，Ｙ．、お
よびＨａｒｔｌ，Ｆ．−Ｕ．、Ｃｅｌｌ．８３：５８９〜５９８、（１９９５）
）。Ｈｓｃ７０／Ｈｓｐ７０との各基質相互作用は、標的タンパク質が新しいコ
ンフォメーションを達成するためにＨｓｃ７０／Ｈｓｐ７０と複合体を形成した
ままであるために最適な長さの時間という点において独特であるので、ＢＡＧ−
１の正味の効果は、リホールディング反応の促進または阻害のいずれかであり得
る。BAG-1 is a regulator of Hsc70 / Hsp70 family molecular chaperones. The carboxyl-terminal domain of this protein comprises Hsc70 and Hs
tightly binds to the ATPase domain of p70 (K p = 1 nM) (Zein
er, M .; Gebauer, M .; And Gehring, U.S.A. , EMBO
J. 16: 5483-5490, (1997)). BAG-1 regulates the activity of these molecular chaperones, and the Hsp70 / Hsc70 binding protein Hip (3
-5) acting as apparent functional antagonists (Hoehfeld, J
. And Jentsch, S .; EMBO J .; 16: 6209-6216, (
1997); Takayama, S .; Bimston, D .; N. , Matsu
zawa, S .; Freeman, B .; C. Aime-Sempe, C .; , X
ie, Z .; Morimoto, R .; J. And Reed, J. et al. C. , EMB
OJ. 16: 4887-96, (1997); Zeiner, M .; , Geba
Uer, M .; And Gehring, U.S.A. EMBO J .; 16: 5483 ~
5490, (1997)). In general, protein refolding
Achieved by Hsp70 / Hsc70 through repeated cycles of binding and release of the target peptide coupled to hydrolysis of P (Ellis, R., Curr B.
iol. 7: R531-R533, (1997)). BAG-1 appears to enhance substrate release, whereas Hip stabilizes Hsp70 / Hsc70 complex formation with the target peptide (Hoehfeld, J., Minami, Y., and Hartl, F.-U. 83, 589-598, (1995).
). Each substrate interaction with Hsc70 / Hsp70 is unique in that it has an optimal length of time for the target protein to remain complexed with Hsc70 / Hsp70 to achieve a new conformation, BAG-
One net effect can be either promotion or inhibition of the refolding reaction.
【００３３】 この７０ｋｄヒートショックファミリータンパク質（Ｈｓｐ７０／Ｈｓｃ７０
）は、種々の細胞プロセスに不可欠であり、そして癌に関係付けられているが、
これらのタンパク質が、インビボでどのように調節されているのかはまだ不明で
ある。種々の共シャペロンが同定されており、これらは、異なる亜細胞性コンパ
ートメントに対してＨｓｐ７０／Ｈｓｃ７０を標的とし得るか、または特定のタ
ンパク質もしくはタンパク質複合体との相互作用を促進し得る。ＢＡＧ−１は、
現在までに同定された他の全ての哺乳動物共シャペロン（例えば、ＤｎａＪファ
ミリーのタンパク質のメンバー、Ｈｉｐファミリーのタンパク質のメンバー、Ｈ
ｏｐファミリーのタンパク質のメンバーおよびシクロフィリンファミリーのタン
パク質）と機能的に異なる新規のＨｓｐ７０／Ｈｓｃ７０調節因子を表すように
みえる。This 70 kd heat shock family protein (Hsp70 / Hsc70
) Are essential for various cellular processes and have been implicated in cancer,
It is not yet clear how these proteins are regulated in vivo. A variety of co-chaperones have been identified, which may target Hsp70 / Hsc70 to different subcellular compartments or may facilitate interaction with specific proteins or protein complexes. BAG-1 is
All other mammalian co-chaperones identified to date (eg, members of the DnaJ family of proteins, members of the Hip family of proteins, H
It appears to represent a novel Hsp70 / Hsc70 modulator that is functionally distinct from the members of the op family of proteins and proteins of the cyclophilin family.
【００３４】 本発明の別の局面は、約４０〜５５アミノ酸の結合ドメインのアミノ酸配列を
提供し、このドメインはＨｓｃ７０／Ｈｓｐ７０のＡＴＰアーゼドメインに結合
する。このＢＡＧドメインはＣ末端の近くに位置しており、そしてユビキチン様
ドメインはＮ末端の近くに位置している。Another aspect of the invention provides the amino acid sequence of a binding domain of about 40-55 amino acids, which domain binds to the ATPase domain of Hsc70 / Hsp70. This BAG domain is located near the C-terminus and the ubiquitin-like domain is located near the N-terminus.
【００３５】 本発明のＢＡＧファミリーのタンパク質は、共通の保存されたＣ末端ドメイン
（「ＢＡＧ」ドメイン）を含み、このドメインは、Ｈｓｐ７０／Ｈｓｃ７０のＡ
ＴＰアーゼドメインへの結合を促進する。ＢＡＧ−１のカルボキシル末端ドメイ
ンは、Ｈｓｃ７０／Ｈｓｐ７０のＡＴＰアーゼドメインに結合し、そしてＡＤＰ
−ＡＴＰ交換因子として作用することによりそのシャペロン機能を調節する。Ｂ
ＡＧ−１の他のドメインは、Ｂｃｌ−２およびレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ
）のようなタンパク質との相互作用を媒介し、ＢＡＧ−１が、Ｈｓｃ７０／Ｈｓ
ｐ７０を他のタンパク質に対する標的とすることを可能にし、おそらく、それら
のコンフォメーションを変化させることによりそれらの機能を調節する。The BAG family proteins of the present invention contain a common, conserved C-terminal domain (“BAG” domain), which contains the Hsp70 / Hsc70 A
Promotes binding to the TPase domain. The carboxyl-terminal domain of BAG-1 binds to the ATPase domain of Hsc70 / Hsp70 and
Modulates its chaperone function by acting as an ATP exchange factor. B
The other domains of AG-1 are Bcl-2 and retinoic acid receptor (RAR
BAG-1 mediates the interaction with proteins such as Hsc70 / Hs
It allows p70 to be targeted to other proteins, possibly modulating their function by altering their conformation.
【００３６】 以前、ヒトＢＡＧ−１はインビトロにおける変性タンパク質基質のＨｓｃ７０
／Ｈｓｐ７０依存性リホールディングを阻害することが示された（Ｓ．Ｔａｋａ
ｙａｍａら、ＥＭＢＯ Ｊ １６、４８８７〜９６（１９９７）；Ｍ．Ｚｅｉｎ
ｅｒ、Ｍ．Ｇｅｂａｕｅｒ、Ｕ．Ｇｅｈｒｉｎｇ、ＥＭＢＯ Ｊ．１６、５４８
３〜５４９０（１９９７）；およびＪ．Ｈｏｅｈｆｅｌｄ、Ｓ．Ｊｅｎｔｓｃｈ
、ＥＭＢＯ Ｊ．１６、６２０９〜６２１６（１９９７））。実施例ＩＩＩ、パ
ートＡにおいて、組換えヒトＢＡＧ−１、ＢＡＧ−２（配列番号４）およびＢＡ
Ｇ−３（配列番号６）の効果を、以前ＢＡＧ−１を評価するために使用されたア
ッセイと類似したインビトロでのタンパク質リホールディングアッセイを使用し
て比較した。この研究は、Ｈｓｃ７０への等モル量の各々の組換えタンパク質の
添加がルシフェラーゼリホールディングの顕著な阻害を生じ、ＢＡＧ−２（配列
番号４）およびＢＡＧ−３（配列番号６）がＢＡＧ−１よりも幾分大きなインヒ
ビター活性を示す（図４Ａ）ことを示した。別々のルシフェラーゼホールディン
グ研究において、ＢＡＧ−１、ＢＡＧ−２（配列番号４）およびＢＡＧ−３（配
列番号６）はもう一度ルシフェラーゼリホールディングの阻害を示したが、この
研究において、種々の量のＢＡＧ−１、ＢＡＧ−２（配列番号４）およびＢＡＧ
−３（配列番号６）をＨｓｃ７０に対して添加、これは、Ｈｓｃ７０シャペロン
活性、すなわち、ルシフェラーゼホールディングの濃度依存性阻害を生じた（実
施例ＩＩＩ パートＡ）。以前の研究と同じ実験プロトコールを使用する研究に
ついてのさらなる追求は、実施例ＩＩＡにて教示されるように、ＢＡＧ−４（配
列番号２２）もまた、Ｈｓｃ７０／ＡＴＰアーゼと結合することを示した。Previously, human BAG-1 was a modified protein substrate in vitro, Hsc70
/ Hsp70-dependent refolding (S. Taka)
Yama et al., EMBO J 16, 4887-96 (1997); Zein
er, M .; Gebauer, U.S.A. Gehring, EMBO J .; 16,548
3-5490 (1997); Hoehfeld, S.M. Jentsch
EMBO J .; 16, 6209-6216 (1997)). In Example III, Part A, recombinant human BAG-1, BAG-2 (SEQ ID NO: 4) and BA
The effect of G-3 (SEQ ID NO: 6) was compared using an in vitro protein refolding assay similar to the assay previously used to evaluate BAG-1. This study shows that the addition of equimolar amounts of each recombinant protein to Hsc70 resulted in significant inhibition of luciferase refolding, with BAG-2 (SEQ ID NO: 4) and BAG-3 (SEQ ID NO: 6) It showed a somewhat greater inhibitor activity (FIG. 4A). In separate luciferase holding studies, BAG-1, BAG-2 (SEQ ID NO: 4) and BAG-3 (SEQ ID NO: 6) once again showed inhibition of luciferase refolding, but in this study varying amounts of BAG- 1, BAG-2 (SEQ ID NO: 4) and BAG
-3 (SEQ ID NO: 6) was added to Hsc70, which resulted in a concentration-dependent inhibition of Hsc70 chaperone activity, ie, luciferase folding (Example III, Part A). Further pursuit of studies using the same experimental protocol as previous studies showed that BAG-4 (SEQ ID NO: 22) also binds Hsc70 / ATPase, as taught in Example IIA. .
【００３７】 本発明のなお別の局面は、少なくとも約１５ヌクレオチド、そして一般的には
、約２５ヌクレオチド、好ましくは約３５ヌクレオチド、より好ましくは約４５
ヌクレオチド、および最も好ましくは約５５ヌクレオチドを有するヌクレオチド
配列を提供し、これらは比較的ストリンジェントな条件下において、図１〜９お
よび図１５〜１７に示される（特に、図１Ｂにおいて示されるＢＡＧドメイン（
例えば、ヒトＢＡＧ−３のヌクレオチド５５２〜５９３、またはヒトＢＡＧ−４
のヌクレオチド１６７〜２２１））核酸配列の一部に対してハイブリダイズし得
るか、または相補的である。[0037] Yet another aspect of the invention is that it comprises at least about 15 nucleotides, and generally about 25 nucleotides, preferably about 35 nucleotides, more preferably about 45 nucleotides.
Nucleotides, and most preferably, nucleotide sequences having about 55 nucleotides, which, under relatively stringent conditions, are shown in Figures 1-9 and 15-17 (particularly the BAG domain shown in Figure 1B). (
For example, nucleotides 552-593 of human BAG-3, or human BAG-4
Nucleotides 167-221)) are capable of hybridizing to or complementary to a portion of the nucleic acid sequence.
【００３８】 本発明のなお別の局面は、式 ＲN−Ｒ1Ｘ1Ｒ2Ｘ2Ｒ3Ｘ3Ｒ4Ｘ4Ｒ5Ｘ5Ｒ6Ｘ6Ｒ7Ｘ7Ｘ8Ｒ9Ｘ9Ｒ10Ｘ10Ｒ11Ｘ 11 −ＲC の化合物を提供し、ここで、 ＲNは、一群の独立して選択された１〜５５２個のアミノ酸であり； Ｒ1は、一群の独立して選択された３個のアミノ酸であり； Ｘ1は、荷電性または非荷電性のＲ基を有するアミノ酸（例えば、アスパラギ
ン酸、グルタミン酸、アスパラギンまたはグルタミン）であり； Ｒ2は、一群の独立して選択された７個のアミノ酸であり； Ｘ2は、荷電性のＲ基を有するアミノ酸（例えば、グルタミン酸）であり； Ｒ3は、一群の独立して選択された５個のアミノ酸であり； Ｘ3は、無極性のＲ基を有するアミノ酸（例えば、ロイシン、メチオニン、ま
たはイソロイシン）であり； Ｒ4は、一群の独立して選択された３個のアミノ酸であり； Ｘ4は、荷電性のＲ基を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグル
タミン酸）であり； Ｒ5は、独立して選択された１個のアミノ酸であり； Ｘ5は、無極性または非荷電性のＲ基を有するアミノ酸（例えば、ロイシン、
バリン、メチオニン、アラニン、またはスレオニン）であり； Ｒ6は、一群の独立して選択された１５個のアミノ酸であり； Ｘ6は、荷電性または非荷電性のＲ基を有するアミノ酸（例えば、アルギニン
、リジン、グルタミンまたはアスパラギン酸）であり； Ｒ7は、一群の独立して選択された２個のアミノ酸であり； Ｘ7は、荷電性のＲ基を有するアミノ酸（例えば、アルギニン）であり； Ｘ8は、荷電性のＲ基を有するアミノ酸（例えば、アルギニンまたはリジン）
であり； Ｒ9は、一群の独立して選択された２個のアミノ酸であり； Ｘ9は、無極性のＲ基を有するアミノ酸（例えば、バリン）であり； Ｒ10は、一群の独立して選択された３個のアミノ酸であり； Ｘ10は、非荷電性のＲ基を有するアミノ酸（例えば、グルタミン）であり； Ｒ11は、一群の独立して選択された２個のアミノ酸であり； Ｘ11は、無極性のＲ基を有するアミノ酸（例えば、ロイシン）であり；そして ＲCは、一群の独立して選択された１〜１００個のアミノ酸である。Yet another aspect of the present invention is a compound of the formula RN-R1X1RTwoXTwoRThreeXThreeRFourXFourRFiveXFiveR6X6R7X7X8R9X9RTenXTenR11X 11 -RC Providing a compound of the formula wherein RNIs a group of independently selected 1-552 amino acids; R1Is a group of three independently selected amino acids; X1Is an amino acid having a charged or uncharged R group (eg, asparagine)
Acid, glutamic acid, asparagine or glutamine); RTwoIs a group of 7 independently selected amino acids; XTwoIs an amino acid having a charged R group (eg, glutamic acid);ThreeIs a group of 5 independently selected amino acids; XThreeIs an amino acid having a nonpolar R group (eg, leucine, methionine, or
Or isoleucine); RFourIs a group of three independently selected amino acids; XFourAre amino acids having a charged R group (eg, aspartic acid or glu
Tamic acid); RFiveIs an independently selected amino acid; XFiveIs an amino acid having a non-polar or uncharged R group (eg, leucine,
Valine, methionine, alanine, or threonine); R6Is a group of 15 independently selected amino acids; X6Is an amino acid having a charged or uncharged R group (eg, arginine
, Lysine, glutamine or aspartic acid);7Is a group of two independently selected amino acids; X7Is an amino acid having a charged R group (eg, arginine); X8Is an amino acid having a charged R group (eg, arginine or lysine)
R9Is a group of two independently selected amino acids; X9Is an amino acid having a nonpolar R group (eg, valine);TenIs a group of three independently selected amino acids; XTenIs an amino acid having an uncharged R group (eg, glutamine);11Is a group of two independently selected amino acids; X11Is an amino acid having a nonpolar R group (eg, leucine);CIs a group of independently selected 1 to 100 amino acids.
【００３９】 少なくとも約１５ヌクレオチド、そして一般的には約２５ヌクレオチド、好ま
しくは約３５ヌクレオチド、より好ましくは約４５ヌクレオチドおよび最も好ま
しくは約５５ヌクレオチドのヌクレオチド配列が、例えば、ポリメラーゼ連鎖反
応(ＰＣＲ）、またはポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ
ポリメラーゼ）により媒介される他の類似した反応に対するプライマーとして有
用であり得る（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓら編、（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、１９９０）を参照のこと、これは本明細書中に参
考として援用される；例えば、４０〜４１頁を参照のこと）。さらに、本発明の
このようなヌクレオチド配列は、ハイブリダイゼーション反応（例えば、サザン
ブロット分析もしくはノーザンブロット分析）または結合アッセイ（例えばゲル
シフトアッセイ）におけるプローブとして有用であり得る。A nucleotide sequence of at least about 15 nucleotides, and generally about 25 nucleotides, preferably about 35 nucleotides, more preferably about 45 nucleotides and most preferably about 55 nucleotides, comprises, for example, a polymerase chain reaction (PCR), Or polymerase (eg, DNA polymerase or RNA)
Polymerases) may be useful as primers for other similar reactions mediated by (PCR Protocols: A guide to metth)
ods and applications, edited by Innis et al., (Academ
ic Press, Inc. , 1990), which is incorporated herein by reference; see, for example, pages 40-41). In addition, such nucleotide sequences of the invention can be useful as probes in hybridization reactions (eg, Southern blot analysis or Northern blot analysis) or binding assays (eg, gel shift assays).
【００４０】 本発明のヌクレオチド配列は、アンチセンス分子として特に有用であり得、こ
れは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、そして細胞内のｂａｇ−１核酸配列のすべ
てのもしくは一部の５’非翻訳領域または５’翻訳領域に対して標的化され得る
。例えば、アンチセンス分子は、図１ＡにＢＡＧドメインとして示される配列の
少なくとも一部に関し得る（例えば、ヒトＢＡＧ−１Ｌ（配列番号１）のヌクレ
オチド２７２〜３１９、またはヒトＢＡＧ−５（配列番号９）のヌクレオチド７
９〜１４７）。核酸の５’領域は、コードされるタンパク質の発現の制御に関与
するエレメントを含むので、核酸分子の５’領域に関するアンチセンス分子は、
細胞内に発現されるタンパク質のレベルに影響を及ぼし得る。[0040] The nucleotide sequences of the present invention can be particularly useful as antisense molecules, which can be DNA or RNA, and 5 'untranslated all or a portion of the bag-1 nucleic acid sequence in a cell. Region or the 5 'translation region. For example, an antisense molecule can relate to at least a portion of the sequence shown as a BAG domain in FIG. 1A (eg, nucleotides 272-319 of human BAG-1L (SEQ ID NO: 1), or human BAG-5 (SEQ ID NO: 9)). Nucleotide 7 of
9-147). Since the 5 'region of the nucleic acid contains elements involved in controlling the expression of the encoded protein, antisense molecules for the 5' region of the nucleic acid molecule are:
It can affect the level of protein expressed in the cell.
【００４１】 本発明のヌクレオチド配列はまた、細胞内のＢＡＧタンパク質をコードする遺
伝子の変異に起因する遺伝的欠損を同定するプローブとして有用であり得る。そ
のような遺伝的欠損は、細胞内のＢＡＧタンパク質の異常な発現または異常なＢ
ＡＧタンパク質の発現を導き得、この異常なＢＡＧタンパク質は、細胞内のＢｃ
ｌ−２関連タンパク質またはＨｓｃ７０／Ｈｓｐ７０タンパク質に適切に会合し
ない。結果として、例えば、ヒトＢＡＧ−１をコードする遺伝子内の遺伝的欠損
は、増加または減少したタンパク質ホールディングレベルにより特徴づけられる
病理を生じ得る。[0041] The nucleotide sequences of the present invention can also be useful as probes to identify genetic defects due to mutations in the gene encoding the BAG protein in cells. Such a genetic defect may result in abnormal expression of BAG protein or abnormal B
Which can lead to the expression of the AG protein, the abnormal BAG protein
Does not associate properly with 1-2 related proteins or Hsc70 / Hsp70 proteins. As a result, for example, a genetic defect in the gene encoding human BAG-1 can result in a pathology characterized by increased or decreased protein holding levels.
【００４２】 さらに、本発明に教示されているヌクレオチド化合物または組成物が、慣用的
な方法を使用して合成され得るか、または商業的供給源より購入され得る。さら
に、このようなヌクレオチド配列の集団が、核酸分子（図１〜９および図１５〜
１７に示されるアミノ酸配列をコードする、これもまた図１〜９および図１５〜
１７に示されるヌクレオチド配列に示されるヌクレオチドを含む）の制限エンド
ヌクレアーゼまたは穏やかなＤＮＡｓｅ消化により調製され得る。例えば、この
ようなヌクレオチド配列を調製または使用するための方法は、相同的な核酸分子
についてライブラリーをスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプロ
ーブとして当該分野に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９
）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌ．、ＮＹ１９８９）を参照
のこと。これらの各々は参考として、本明細書中に援用される）。In addition, the nucleotide compounds or compositions taught in the present invention can be synthesized using conventional methods, or purchased from commercial sources. In addition, such a population of nucleotide sequences can be used to identify nucleic acid molecules (FIGS. 1-9 and FIGS.
17 which also encodes the amino acid sequence shown in FIG.
17 (including the nucleotides set forth in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 17) or mild DNAse digestion. For example, methods for preparing or using such nucleotide sequences are well known in the art as hybridization probes for screening libraries for homologous nucleic acid molecules (eg, Sambrook et al., Molecu).
lar Cloning: A laboratory manual (Cold
Spring Harbor Laboratory Press 1989
Ausubel et al., Current Protocols in Mole.
See, Color Biology (Green Publ., NY1989). Each of these is incorporated herein by reference).
【００４３】 例えば、特定のヌクレオチド配列が、いずれか１つのＢＡＧファミリータンパ
ク質（図１〜９および図１５〜１７に示される）をコードする核酸分子とそのフ
ァミリー内の別の核酸との比較に基づいて設計され得る。例えば、このような比
較は、両方の核酸分子に存在する保存された領域にハイブリダイズするヌクレオ
チド配列の調製を可能にし、従って、他の細胞型または他の生物体に存在する相
同的な核酸分子を同定するための方法を提供する。さらに、このような比較は、
任意のＢＡＧファミリーヌクレオチド配列の独特な領域（例えば、ＢＡＧドメイ
ンに対応するヌクレオチド配列）にハイブリダイズするヌクレオチド配列の調製
を可能にし、従って、このモチーフを共有する他のタンパク質の同定を可能にす
る。この点において、図３および図２０に示されるヒトＢＡＧ−３タンパク質、
ならびに図５および図２４に示されるヒトＢＡＧ−５タンパク質は部分配列にす
ぎないが、例えば選択的スプライシングにより産生されるヒトＢＡＧ−３または
ＢＡＧ−５改変体が存在し得、そして適切に設計された本発明のヌクレオチド配
列をプローブとして使用して同定され得ることが認識される。このような有用な
プローブは、コードヌクレオチド配列の比較により開示された図に示される配列
の検査によって容易に同定され得る。For example, a particular nucleotide sequence is based on a comparison of a nucleic acid molecule encoding any one BAG family protein (shown in FIGS. 1-9 and 15-17) to another nucleic acid within that family. Can be designed. For example, such a comparison allows for the preparation of a nucleotide sequence that hybridizes to a conserved region present in both nucleic acid molecules, and is therefore a homologous nucleic acid molecule present in other cell types or other organisms. To provide a method for identifying Furthermore, such a comparison
It allows for the preparation of nucleotide sequences that hybridize to unique regions of any BAG family nucleotide sequence (eg, nucleotide sequences corresponding to BAG domains), and thus allows for the identification of other proteins that share this motif. In this regard, the human BAG-3 protein shown in FIGS.
And the human BAG-5 protein shown in FIGS. 5 and 24 is only a partial sequence, but human BAG-3 or BAG-5 variants produced by, for example, alternative splicing may be present and properly designed. It will be appreciated that the nucleotide sequence of the present invention can be identified using a probe as a probe. Such useful probes can be readily identified by inspection of the sequences shown in the disclosed figures by comparison of the encoding nucleotide sequences.
【００４４】 所望される場合、本発明のヌクレオチド配列は、検出可能な部分（例えば、放
射性標識、蛍光色素、強磁性体、蛍光タグ）または検出可能な結合剤（例えば、
ビオチン）を取り込み得る。これらおよび他の検出可能な部分ならびにこのよう
な部分をヌクレオチド配列に取り込む方法は、当該分野において周知であり、そ
して市販されている。例えば、標識されたヌクレオチド配列の集団が、本発明の
核酸分子のニックトランスレーションにより調製され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら
、前出、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出、１９８９）。If desired, a nucleotide sequence of the invention can include a detectable moiety (eg, a radiolabel, a fluorescent dye, a ferromagnet, a fluorescent tag) or a detectable binding agent (eg, a
Biotin). These and other detectable moieties and methods for incorporating such moieties into a nucleotide sequence are well known in the art and are commercially available. For example, a population of labeled nucleotide sequences can be prepared by nick translation of a nucleic acid molecule of the invention (Sambrook et al., Supra, 1989; Ausubel et al., Supra, 1989).
【００４５】 当業者は、本発明のヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関する方法
が、非特異的なバックグラウンドハイブリダイゼーションを最小化するために比
較的ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを実施する必要があり
得ることを知っている。そのようなハイブリダイゼーション条件は、経験的に決
定され得るか、または例えば知られている場合には、そのプローブと標的配列と
の間の、配列の相対ＧＣ含量および不一致数に基づいて推定され得る（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、１９８９を参照のこと）。One of skill in the art will appreciate that the methods for hybridization of nucleotide sequences of the present invention may need to perform hybridization under relatively stringent conditions to minimize non-specific background hybridization. Know that. Such hybridization conditions can be determined empirically, or estimated, for example, if known, based on the relative GC content and the number of mismatches between the probe and the target sequence. (For example,
See Sambrook et al., Supra, 1989).
【００４６】 本発明はさらに、ヒトＢＡＧファミリータンパク質に特異的な抗体を提供する
。本明細書中に使用される場合、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体およびモ
ノクローナル抗体、ならびにヒトＢＡＧ−１についての少なくとも約１×１０5
Ｍ-1の特異的結合活性を保持する抗体のポリペプチドフラグメントを含む。当業
者は、抗ＢＡＧ−１抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2および
Ｆｖフラグメント）が、ヒトＢＡＧ−１（配列番号２の残基１１６で始まる）に
対する特異的結合活性を保持し得、従って、それらのフラグメントが抗体の定義
に含まれることがわかる。さらに、用語「抗体」は、本明細書中で使用される場
合、天然に存在する抗体および天然に存在しない抗体ならびに結合活性を保持す
るフラグメント（例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体）を含む。このような天
然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築され得、組換え産生さ
れ得、または例えば、本明細書中に参考として援用されるＨｕｓｅらＳｃｉｅｎ
ｃｅ ２４６：１２５７〜１２８１（１９８９）により記載されるような種々の
重鎖および種々の軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニング
することにより、入手され得る。The present invention further provides antibodies specific for human BAG family proteins. As used herein, the term “antibody” refers to at least about 1 × 10 5 for polyclonal and monoclonal antibodies, and for human BAG-1.
Includes polypeptide fragments of antibodies that retain the specific binding activity of M- 1 . One of skill in the art will recognize that anti-BAG-1 antibody fragments (eg, Fab, F (ab ′) 2 and Fv fragments) retain specific binding activity to human BAG-1 (starting at residue 116 of SEQ ID NO: 2). Thus, it can be seen that those fragments are included in the definition of antibody. Furthermore, the term “antibody” as used herein includes naturally occurring and non-naturally occurring antibodies and fragments that retain binding activity (eg, chimeric or humanized antibodies). Such non-naturally occurring antibodies can be constructed using solid phase peptide synthesis, recombinantly produced, or, for example, Huse et al. Science, incorporated herein by reference.
ce 246: 1257-1281 (1989), which can be obtained by screening a combinatorial library consisting of various heavy chains and various light chains.
【００４７】 当業者は、精製されたＢＡＧファミリータンパク質（これは自然供給源より調
製され得るか、もしくは化学合成され得るか、もしくは組換え産生され得る）、
ＢＡＧファミリータンパク質の一部分（上記の合成ペプチドのような、ヒトＢＡ
Ｇファミリータンパク質の一部分を含む）は、免疫原として使用され得ることが
わかる。例えば、抗体を惹起するために有用なこのようなペプチドとしては、そ
のＮ末端の８５アミノ酸のペプチド部分または任意のヒトＢＡＧタンパク質のＢ
ＡＧドメイン（図１Ｂを参照のこと）が挙げられる。このようなタンパク質の特
に有利な使用は、免疫染色に関してであり、ここでその方法は、通常同じ組織切
片に存在する、癌細胞内のＢＡＧファミリータンパク質の免疫染色と隣接する非
腫瘍性前立腺上皮および基底細胞内のＢＡＧファミリータンパク質の免疫染色と
を対比させるプロセスを提供する。これらの結果は、いずれかのＢＡＧファミリ
ータンパク質が、組織学的に進行した腫瘍において、より高いまたはより低いレ
ベルで発現される傾向にあるか否かを決定するＧｌｅａｓｏｎ等級と相関付けら
れる。このプロセスから、所定の患者において疾患が進行している程度について
の決定がなされ得る、すなわち予後がなされ得る。The skilled artisan will appreciate that purified BAG family proteins, which can be prepared from natural sources, or can be chemically synthesized, or recombinantly produced,
Part of the BAG family protein (human BA, such as the synthetic peptide described above)
(Including portions of the G family proteins) can be used as immunogens. For example, such peptides useful for raising antibodies include a peptide portion of the N-terminal 85 amino acids or the B portion of any human BAG protein.
AG domain (see FIG. 1B). A particularly advantageous use of such proteins is with respect to immunostaining, where the method involves the non-neoplastic prostate epithelium adjacent to the immunostaining of BAG family proteins in cancer cells, usually present in the same tissue section. A process is provided for contrasting immunostaining of BAG family proteins in basal cells. These results correlate with the Gleason grade, which determines whether any BAG family protein tends to be expressed at higher or lower levels in histologically advanced tumors. From this process, a determination can be made about the extent to which the disease is progressing in a given patient, ie, a prognosis can be made.
【００４８】 以下、実施例ＩＶに記載される場合、ＢＡＧタンパク質の非免疫原性フラグメ
ントまたは合成ペプチドは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリ
ンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなキャリア分子とこのハプテンを結合さ
せることにより免疫原性にされ得る。さらに種々の他のキャリア分子およびキャ
リア分子にハプテンを結合させるための方法は、当該分野において周知であり、
そして例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ、１９８８）に記載されており、これは本明細書
中で参考として援用される。Hereinafter, as described in Example IV, a non-immunogenic fragment or synthetic peptide of the BAG protein comprises a carrier molecule such as bovine serum albumin (BSA) or keyhole limpet hemocyanin (KLH) and the hapten. Can be made immunogenic by binding. A variety of other carrier molecules and methods for attaching haptens to carrier molecules are well known in the art,
And for example, Harlow and Lane, Antibodies: A la
boration manual (Cold Spring Harbor L
Laboratory Pres, 1988), which is incorporated herein by reference.
【００４９】 （実施例） 以下の実施例は、当業者がより明確に理解し、そして本発明を実施し得るよう
に示される。これらの実施例は、本発明の範囲を制限するとみなされるべきでは
ないが、本発明の単なる例示および代表例であるとみなされるべきである。EXAMPLES The following examples are set forth so that those skilled in the art may more clearly understand and practice the present invention. These examples should not be considered as limiting the scope of the invention, but merely as being illustrative and representative thereof.
【００５０】 （実施例Ｉ） （ＢＡＧ−ファミリーｃＤＮＡ配列の単離および特徴付け） 本実施例は、ヒト、線虫、および酵母由来のＢＡＧ−ファミリーｃＤＮＡの単
離および特徴付けのための方法を記載する。Example I Isolation and Characterization of BAG-Family cDNA Sequences This example describes a method for the isolation and characterization of BAG-family cDNAs from humans, nematodes, and yeast. Describe.
【００５１】 （Ａ．ヒトＢＡＧ ｃＤＮＡ配列のクローニング） ヒトＪｕｒｋａｔ細胞ｃＤＮＡライブラリーの酵母ツーハイブリッドライブラ
リースクリーニングを、ｐＧｉｌｄａ−Ｈｓｃ７０／ＡＴＰａｓｅ（６７〜３７
７アミノ酸）およびｌａｃＺレポータープラスミドｐＳＨ１８−３４で形質転換
したＥＧＹ４８株酵母を用いて、Ｔａｋａｙａｍａら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１６：
４８８７〜９６（１９９７）；Ｍａｔｓｕｚａｗａら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１７：
２７３６〜２７４７（１９９８）（これらは、参考として本明細書中に援用され
る）に記載のように実行した。得られた約５×１０6の形質転換体のうち、３０
℃での１週間のインキュベーション後、１１２のＬｅｕ+コロニーを得た。これ
らのコロニーのβガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）活性のアッセイは、９６のコ
ロニーを生じた。次いで、ｐＧｉｌｄａ、ｐＧｉｌｄａ ｍＢＡＧ−１（１−２
１９）、またはｐＧｉｌｄａ Ｈｓｃ７０／ＡＴＰａｓｅで形質転換したＲＦＹ
２０６酵母株を用いて接合試験を実行した。これらのうち、６６がＨｓｃ７０／
ＡＴＰａｓｅとの特異的相互作用を示した。ｐＪＧ４−５のｃＤＮＡをトリプト
ファン（Ｔｒｐ）について栄養要求性であるＫＣ８ Ｅ．ｃｏｌｉ株を用いて回
収した。ＤＮＡ配列決定は、３つの、部分的に重複するヒトＢＡＧ−１、ＢＡＧ
−２をコードする４つの同一のｃＤＮＡおよび１つの重複するｃＤＮＡ、および
２つの、部分的に重複するＢＡＧ−３クローンを示した。(A. Cloning of Human BAG cDNA Sequence) A yeast two-hybrid library screening of a human Jurkat cell cDNA library was performed using pGilda-Hsc70 / ATPase (67-37).
EGY48 strain transformed with the lacZ reporter plasmid pSH18-34 using Takayama et al., EMBOJ. , 16:
4887-96 (1997); Matsuzawa et al., EMBO J. Clin. , 17:
2736-2747 (1998), which were incorporated herein by reference. Of about 5 × 10 6 transformants obtained, 30
After one week incubation at 0 ° C, 112 Leu + colonies were obtained. Assay of β-galactosidase (β-gal) activity of these colonies resulted in 96 colonies. Then, pGilda, pGilda mBAG-1 (1-2
19) or RFY transformed with pGilda Hsc70 / ATPase
A conjugation test was performed using the 206 yeast strain. Of these, 66 are Hsc70 /
A specific interaction with ATPase was shown. The cDNA of pJG4-5 was converted to KC8 E. coli, which is auxotrophic for tryptophan (Trp). E. coli strain was recovered. DNA sequencing was performed with three partially overlapping human BAG-1, BAG
Two identical and one overlapping cDNAs encoding -2 and two, partially overlapping BAG-3 clones are shown.
【００５２】 「ベイト（ｂａｉｔ）」としてＨｓｃ７０のＡＴＰａｓｅドメインを用いる、
上記の酵母ツーハイブリッドスクリーニングを用いて、ＢＡＧ−１または２つの
他のＢＡＧ−１様タンパク質（ＢＡＧ−２（配列番号４）およびＢＡＧ−３（配
列番号６）と名付けられる）の部分をコードするいくつかのヒトｃＤＮＡをクロ
ーニングした。ＢＡＧ−２（配列番号３）およびＢＡＧ−３（配列番号５）につ
いての最長のｃＤＮＡは、それぞれ２０７アミノ酸および１６２アミノ酸のオー
プンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、続いて終止コドンを含んだ。Ｈｓｃ７０
／ＡＴＰａｓｅでのツーハイブリッドライブラリースクリーニングにより得られ
た、すべてのＢＡＧ−１（配列番号１）、ＢＡＧ−２（配列番号３）およびＢＡ
Ｇ−３（配列番号５）のｃＤＮＡは、「ＢＡＧ」ドメインと名付けられ、そして
図１０に示される約４０〜５０アミノ酸の保存ドメインを含んだ。これらの結果
は、ＢＡＧ−１関連タンパク質のファミリーが全て、Ｈｓｃ７０／Ｈｓｐ７０を
結合するそのＣ末端近位に保存された約４５のアミノ酸領域を含むことを示す。Using the ATPase domain of Hsc70 as “bait”
Using the yeast two-hybrid screen described above, encodes portions of BAG-1 or two other BAG-1-like proteins, designated BAG-2 (SEQ ID NO: 4) and BAG-3 (SEQ ID NO: 6). Several human cDNAs were cloned. The longest cDNAs for BAG-2 (SEQ ID NO: 3) and BAG-3 (SEQ ID NO: 5) contained an open reading frame (ORF) of 207 amino acids and 162 amino acids, respectively, followed by a stop codon. Hsc70
All BAG-1 (SEQ ID NO: 1), BAG-2 (SEQ ID NO: 3) and BA obtained by two-hybrid library screening with / ATPase
The cDNA for G-3 (SEQ ID NO: 5) was named the "BAG" domain and contained a conserved domain of about 40-50 amino acids, shown in FIG. These results indicate that the family of BAG-1-related proteins all contain a conserved approximately 45 amino acid region near their C-terminus that binds Hsc70 / Hsp70.
【００５３】 （Ｂ．さらなるＢＡＧ−ファミリータンパク質の同定） ｂＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ検索プログラムを用いる翻訳されたＧｅｎｂａ
ｎｋデータベースの検索はまた、ＢＡＧ−ファミリータンパク質のさらなる検討
のための配列を提供するヒトＥＳＴを同定した。推定ＢＡＧ−４（配列番号８）
タンパク質およびＢＡＧ−５（配列番号１０）タンパク質は、ＢＡＧ−３のＢＡ
Ｇ−ドメイン（配列番号６）と最大の配列類似性を共有するＢＡＧ−ドメインを
含む。これらは、ＢＡＧ−４（登録番号ＡＡ６９３６９７，Ｎ７４５８８）およ
びＢＡＧ−５（登録番号ＡＡ４５６８６２，Ｎ３４１０１）と命名された。ＢＡ
Ｇ−４は、ＢＡＧ−３と６２％同一性および約８１％類似性を有し、そしてＢＡ
Ｇ−５は、ＢＡＧ−３と５１％の同一性および約７５％の類似性を有する。B. Identification of Additional BAG-Family Proteins Translated Genba Using bBLAST and FASTA Search Programs
Searches of the nk database also identified human ESTs that provided sequences for further investigation of BAG-family proteins. Putative BAG-4 (SEQ ID NO: 8)
The BAG-5 (SEQ ID NO: 10) protein and the BAG-5 (SEQ ID NO: 10)
It contains a BAG-domain that shares maximum sequence similarity with the G-domain (SEQ ID NO: 6). These were named BAG-4 (Accession No. AA693697, N74588) and BAG-5 (Accession No. AA456686, N34101). BA
G-4 has 62% identity and about 81% similarity with BAG-3 and BA
G-5 has 51% identity and about 75% similarity with BAG-3.
【００５４】 さらなるＢＡＧ−ファミリーのオルトログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）またはホ
モログ（相同体）をまた、コンピューターに基づく検索を用いて同定し、そして
線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよび分裂酵母Ｓ．ｐｏｍｂｅにおけるＢＡＧ−ファミ
リーホモログを生じた。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのゲノムは、ヒトＢＡＧ−１（Ａｆ
ｏ３９７１３、ｇｉ：２７７３２１１）（配列番号１２）およびＢＡＧ−２（配
列番号１４）（Ａｆｏ６８７１９、ｇｉ：３１６８９２７）に対してその全般的
配列において最も類似している２つの明白なＢＡＧ−ファミリータンパク質をコ
ードする。Ｓ．ｐｏｍｂｅは、ヒトＢＡＧ−１と最大の全般的配列類似性を共有
する２つのＢＡＧ−ファミリータンパク質を含む（Ａｌｏ２３Ｓ５４、ｇｉ／３
１３３１０５およびＡｌｏ２３６３４、ｇｉ／３１５０２５０）。ヒトおよびＣ
．ｅｌｅｇａｎｓのＢＡＧ−１タンパク質ならびにＳ．ｐｏｍｂｅのＢＡＧ−１
Ａはすべて、未知の機能のそのＮ末端近位のユビキチン様ドメイン（図１０Ａを
参照のこと）を有する。[0054] Additional orthologs or homologs of the BAG-family (homologues) were also identified using a computer-based search and the C. elegans C. elegans. elegans and fission yeast S. elegans. A BAG-family homolog in Pombe resulted. C. elegans genome is human BAG-1 (Af
o39713, gi: 2773211) (SEQ ID NO: 12) and two distinct BAG-family proteins most similar in their overall sequence to BAG-2 (SEQ ID NO: 14) (Afo68719, gi: 3168927). I do. S. pombe contains two BAG-family proteins that share the greatest overall sequence similarity with human BAG-1 (Alo23S54, gi / 3
133105 and Alo23634, gi / 3150250). Human and C
. elegans BAG-1 protein and S. elegans. Pombe's BAG-1
A all have a ubiquitin-like domain near its N-terminus of unknown function (see FIG. 10A).
【００５５】 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＢＡＧ−１（配列番号１２）タンパク質およびＳ．ｐｏ
ｍｂｅ ＢＡＧ−１Ａ（配列番号１６）タンパク質の全般の推定アミノ酸配列は
、それぞれ、ヒトＢＡＧ−１に対して約１８％同一（約６１％類似）および約１
７％同一（約６４％類似）である。このことは共通の先祖由来の遺伝子に起源す
ることを意味する。しかし、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＢＡＧ−１タンパク質（配列
番号１２）は、ヒト、マウスおよび酵母のＢＡＧ−１ホモログと比較して、その
ＢＡＧ−ドメインにおいて５〜７のアミノ酸インサートを含み（図１０Ｂを参照
のこと）、そしてＢＡＧ−ドメインに関してＢＡＧ−２（配列番号４）とより類
似している。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびヒトＢＡＧ−２はまた、Ｃ末端の２２５
アミノ酸領域として共通の祖先から誘導され得る。この領域は、ＢＡＧドメイン
ならびにＣ．ｅｌｅｇａｎｓＢＡＧ−２およびヒトＢＡＧ−２（約３４％のアミ
ノ酸配列同一性および約７０％の類似性を共有する）の両方の上流領域の両方を
包含する。しかし、ヒトＢＡＧ−２タンパク質（配列番号４）は、そのＣ．ｅｌ
ｅｇａｎｓ対応物に比較してそのＢＡＧ−ドメインにおいて９つのアミノ酸イン
サートを含む（図１０Ｂを参照のこと）。進化系統樹予想アルゴリズムは、ヒト
ＢＡＧ−２およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓＢＡＧ−２が、他のＢＡＧ−ファミリータ
ンパク質から進化的により離れているＢＡＧ−ファミリーの別の分枝を示すこと
を示唆する。他のＨｓｃ７０調節タンパク質において見出されるものに対して類
似の認識可能領域（例えば、ＤｎａＪファミリータンパク質のＪ−ドメインおよ
びＧ／ＦドメインおよびＨｉｐ／Ｈｏｐファミリータンパク質のＴｅｔｒａｔｒ
ｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｐｅａｔ（ＴＲ）ドメイン）を含む推定ＢＡＧ−フ
ァミリータンパク質は存在しない。C. elegans BAG-1 (SEQ ID NO: 12) protein and S. elegans BAG-1 (SEQ ID NO: 12) protein. po
The overall deduced amino acid sequence of the mbe BAG-1A (SEQ ID NO: 16) protein is about 18% identical (about 61% similar) and about 1% to human BAG-1 respectively.
7% identical (approximately 64% similar). This means that they originate from genes of common ancestry. However, C.I. elegans BAG-1 protein (SEQ ID NO: 12) contains 5-7 amino acid inserts in its BAG-domain as compared to human, mouse and yeast BAG-1 homologs (see FIG. 10B), and It is more similar to BAG-2 (SEQ ID NO: 4) with respect to the BAG-domain. C. elegans and human BAG-2 also have the C-terminal 225
It can be derived from a common ancestor as an amino acid region. This region contains the BAG domain as well as the C.I. elegans BAG-2 and both upstream regions of human BAG-2 (which share about 34% amino acid sequence identity and about 70% similarity). However, the human BAG-2 protein (SEQ ID NO: 4) has its C. el
It contains a nine amino acid insert in its BAG-domain compared to its egans counterpart (see FIG. 10B). The evolutionary phylogenetic tree prediction algorithm uses human BAG-2 and C.I. This suggests that elegans BAG-2 exhibits another branch of the BAG-family that is evolutionarily more distant from other BAG-family proteins. Recognizable regions similar to those found in other Hsc70 regulatory proteins (eg, the J-domain and G / F domain of DnaJ family proteins and Tetratr of Hip / Hop family proteins)
There is no putative BAG-family protein containing the icopeptide repeat (TR) domain).
【００５６】 （Ｃ．Ｈｓｃ７０／ＡＴＰａｓｅに結合するＢＡＧの酵母ツーハイブリッドア
ッセイ） ＢＡＧ−２タンパク質およびＢＡＧ−３タンパク質について得られる最長のｃ
ＤＮＡは酵母におけるＮ−末端トランス活性化（ＴＡ）ドメインとともに発現さ
れ、そしてＨｓｐ７０／ＡＴＰａｓｅまたは種々の無関係のタンパク質（Ｆａｓ
，Ｓｉａｈ、Ｆａｄｄ）（Ｎ末端ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインを含有する）か
らなる融合タンパク質との相互作用について酵母ツーハイブリッドアッセイによ
り試験された。ＴＡ−ＢＡＧ−２およびＴＡ−ＢＡＧ−３は、ＬｅｘＡ−Ｈｓｃ
７０／ＡＴＰａｓｅとの正の相互作用を示した。このことは、ＬｅｘＡオペレー
ターの制御下であるｌａｃＺレポーターのトランス活性化を生じる（図１１Ａ）
。ＬｅｘＡ−Ｆａｓ（サイトゾルドメイン）、ＬｅｘＡ−Ｓｉａｈ、ＬｅｘＡ−
Ｆａｄｄ、またはＬｅｘＡとの相互作用は検出されず（図１１Ａを参照のこと）
、このことはＢＡＧ−２およびＢＡＧ−３タンパク質がＨｓｃ７０／ＡＴＰａｓ
ｅと特異的に相互作用することを示す。Ｈｓｃ７０／ＡＴＰａｓｅとＢＡＧ−２
またはＢＡＧ−３のいずれかの間の特異的なツーハイブリッド相互作用はまた、
ＢＡＧ−２およびＢＡＧ−３がＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質と
して発現され、そしてＨｓｃ７０／ＡＴＰａｓｅがＴＡドメインと融合された場
合、観察された（図１１Ａ；右パネルを参照のこと）。これらの結果は、ＢＡＧ
−１に類似して、ＢＡＧ−２およびＢＡＧ−３が特異的にＨｓｃ７０／ＡＴＰａ
ｓｅと相互作用することを示す。C. Yeast two-hybrid assay for BAG binding to Hsc70 / ATPase The longest c obtained for BAG-2 and BAG-3 proteins
The DNA is expressed with an N-terminal transactivation (TA) domain in yeast, and Hsp70 / ATPase or various unrelated proteins (Fas
, Siah, Fadd) (containing an N-terminal LexA DNA binding domain) was tested for interaction with a yeast two-hybrid assay. TA-BAG-2 and TA-BAG-3 are LexA-Hsc
70 / ATPase showed a positive interaction. This results in transactivation of the lacZ reporter under the control of the LexA operator (FIG. 11A).
. LexA-Fas (cytosolic domain), LexA-Siah, LexA-
No interaction with Fadd or LexA was detected (see FIG. 11A).
This indicates that BAG-2 and BAG-3 proteins are Hsc70 / ATPas
It shows that it interacts specifically with e. Hsc70 / ATPase and BAG-2
Or a specific two-hybrid interaction between any of BAG-3 also
BAG-2 and BAG-3 were expressed as LexA DNA binding domain fusion proteins and were observed when Hsc70 / ATPase was fused with the TA domain (FIG. 11A; see right panel). These results indicate that BAG
BAG-2 and BAG-3 are specifically Hsc70 / ATPa
Indicates that it interacts with se.
【００５７】 ＢＡＧタンパク質がヘテロ二量体を形成し得るか否かを決定するために、酵母
ツーハイブリッドアッセイにおけるＢＡＧ−２およびＢＡＧ−３の同時発現をま
た行った。ＢＡＧ−２およびＢＡＧ−３の同時発現は、ＢＡＧ−１またはＨｓｐ
７０／Ｈｓｃ７０結合に必要なＣ末端ドメインの部分を欠失するＢＡＧ−１の欠
失変異体（ΔＣ）との相互作用を示し得ず、このことは、これらのタンパク質が
ヘテロ二量体を形成しないことを示唆する。To determine if the BAG protein could form a heterodimer, co-expression of BAG-2 and BAG-3 in a yeast two-hybrid assay was also performed. Co-expression of BAG-2 and BAG-3 can be either BAG-1 or Hsp.
Failed to show an interaction with a deletion mutant of BAG-1 (ΔC) that lacks a portion of the C-terminal domain required for 70 / Hsc70 binding, indicating that these proteins form heterodimers. Suggest not to.
【００５８】 （Ｄ．ＢＡＧ−２およびＢＡＧ−３の完全オープンリーディングフレーム配列
の単離および特徴付け） ＢＡＧ−２およびＢＡＧ−３の完全ＯＲＦを推定するため、ツーハイブリッド
スクリーニングに由来するハイブリダイゼーションプローブを用いて、λファー
ジｃＤＮＡライブラリーを以下のようにスクリーニングした。ヒトｊｕｒｋａｔ
Ｔ細胞λ−ＺａｐＩＩライブラリーのｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）を、最長のヒトＢＡＧ−２（クローン番号１１）ｃＤＮＡクローンおよ
びヒトＢＡＧ−３（クローン番号２８）ｃＤＮＡクローン由来の32Ｐ標識した精
製インサートＤＮＡを用いてハイブリダイゼーションすることによりスクリーニ
ングした。スクリーニングした約百万クローンから、３８ＢＡＧ−２クローンお
よび２３ＢＡＧ−３クローンを同定し、クローニングし、そしてヘルパーファー
ジ法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてｐＳＫＩＩプラスミドとしてそのｃＤＮ
Ａインサートを回収した。λファージのＤＮＡ配列決定に由来するヒトＢＡＧ−
２ ｃＤＮＡクローンは、インフレームで終止コドンに先導される、推定の２１
１アミノ酸タンパク質をコードするＯＲＦを示した。最長のヒトＢＡＧ−３λフ
ァージｃＤＮＡクローンは、終止コドンに先導されるが、同定可能な開始コドン
を伴わない、６８２アミノ酸の連続するＯＲＦを含む（図１０Ａを参照のこと）
。D. Isolation and Characterization of Complete Open Reading Frame Sequences of BAG-2 and BAG-3 To estimate the complete ORF of BAG-2 and BAG-3, a hybridization probe derived from a two-hybrid screen Was used to screen a λ phage cDNA library as follows. Human jurkat
T cell λ-ZapII library cDNA library (Stratag
ene) were screened by hybridization with 32 P-labeled purified insert DNA from the longest human BAG-2 (clone # 11) and human BAG-3 (clone # 28) cDNA clones. From the approximately one million clones screened, 38 BAG-2 and 23 BAG-3 clones were identified, cloned, and their cDN as a pSKII plasmid using the helper phage method (Stratagene).
The A insert was recovered. Human BAG- derived from DNA sequencing of phage λ
2 The cDNA clone has a putative 21 in-frame, preceded by a stop codon.
An ORF encoding a one amino acid protein is shown. The longest human BAG-3λ phage cDNA clone contains a 682 amino acid contiguous ORF, preceded by a stop codon but without an identifiable start codon (see FIG. 10A).
.
【００５９】 ＢＡＧ−１Ｌ（配列番号２）、ＢＡＧ−１（配列番号２の残基１１６で開始す
る）、ＢＡＧ−２（配列番号４）、およびＢＡＧ−３（配列番号６）は全て、そ
のＣ末端近位に相同なＢＡＧドメインを含むが、これらのタンパク質のＮ末端領
域は、異なる。検索ツール（Ｐｒｏｓｉｔｅ Ｓｅａｒｃｈ：ＰＰ ｓｅａｒｃ
ｈ（Ｐｒｏｓｉｔｅパターンデータベースを使用）、ＢＣＭ Ｓｅａｒｃｈ Ｌ
ａｕｎｃｈｅｒ，Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、お
よびＢｌｏｃｋｓ Ｓｅａｒｃｈ）の組み合わせを用いて、ＢＡＧ−２ Ｎ末端
領域が潜在的なキナーゼリン酸化部位を含むが、その他の点では他のタンパク質
または既知の機能的ドメインと明白な類似性を共有しないことが決定された。BAG-1L (SEQ ID NO: 2), BAG-1 (starting at residue 116 of SEQ ID NO: 2), BAG-2 (SEQ ID NO: 4), and BAG-3 (SEQ ID NO: 6) all have their Although containing a homologous BAG domain near the C-terminus, the N-terminal regions of these proteins are different. Search tool (Prosite Search: PP search)
h (using the Prosite pattern database), BCM Search L
Using the combination of Auncher, Baylor College of Medicine, and Blocks Search), the BAG-2 N-terminal region contains a potential kinase phosphorylation site, but is otherwise distinct from other proteins or known functional domains. It was decided not to share significant similarities.
【００６０】 対照的に、推定Ｎ末端領域ＢＡＧ−３は、図１０Ａに示されるようなＷＷドメ
インを含む。ＷＷドメインは、Ｙｅｓキナーゼアダプタータンパク質（ＹＡＰ）
、Ｎａ+−チャネル調節因子Ｎｅｄｄ４、フォルミン（ｆｏｒｍｉｎ）結合タン
パク質、ジストロフィンおよびペプチジルプロリルシス−トランス−イソメラー
ゼＰｉｎ−１を含む広範な種々のシグナル伝達タンパク質において同定されてい
る。これらのほぼ４０のアミノ酸ドメインはタンパク質相互作用を媒介し、そし
て好ましいペプチドリガンド配列ｘＰＰｘＹに結合する（Ｓｕｄｏｌ．，ＴＩＢ
Ｓ，２１：１６１〜１６３、１９９６（参考として本明細書に援用される））。In contrast, the putative N-terminal region BAG-3 contains a WW domain as shown in FIG. 10A. The WW domain is a Yes kinase adapter protein (YAP)
, Na + -channel regulator Nedd4, a formin binding protein, dystrophin and peptidyl prolyl cis-trans-isomerase Pin-1 have been identified in a wide variety of signaling proteins. These approximately 40 amino acid domains mediate protein interactions and bind to the preferred peptide ligand sequence xPPxY (Sudol., TIB.
S, 21: 161-163, 1996 (hereby incorporated by reference)).
【００６１】 （実施例ＩＩ） （ＢＡＧタンパク質およびＨｓｃ７０／ＡＴＰａｓｅのインビトロ会合） 本実施例は、ＢＡＧ−２（配列番号４）およびＢＡＧ−３（配列番号６）がＨ
ｓｃ７０／ＡＴＰａｓｅに結合することを種々のインビトロアッセイで示す。Example II In Vitro Association of BAG Protein and Hsc70 / ATPase In this example, BAG-2 (SEQ ID NO: 4) and BAG-3 (SEQ ID NO: 6)
Binding to sc70 / ATPase is shown in various in vitro assays.
【００６２】 （Ａ．Ｈｓｃ７０／ＡＴＰａｓｅに対するＢＡＧ−２およびＢＡＧ−３の溶液
結合アッセイ） Ｈｓｃ７０／ＡＴＰａｓｅとのＢＡＧ−２（配列番号４）およびＢＡＧ−３（
配列番号６）の会合は、Ｈｓｃ７０／ＡＴＰａｓｅまたはＢＡＧ−ファミリータ
ンパク質がＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タ
ンパク質として細菌内に発現されるインビトロタンパク質結合アッセイにより決
定された。ヒトＢＡＧ−２の５〜２１１残基（クローン番号１１）およびヒトＢ
ＡＧ−３のＣ末端の１３５アミノ酸（クローン番号２８）をコードする精製した
ｃＤＮＡ配列（図１０Ａを参照のこと）を、ｐＧＥＸ４Ｔ−１原核生物発現プラ
スミド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ
部位にサブクローニングした。これらのプラスミド、ならびにｐＧＥＸ４Ｔ−１
−ＢＡＧ−１、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１−ＢＡＧ−１（ΔＣ）、およびｐＧＥＸ−４
Ｔ−１−ＸＬ（これらは、以前に記載されている（Ｔａｋａｙａｍａら、前出（
１９９７）；Ｘｉｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３７：６４１０〜６４１８
（１９９８）（これらは、本明細書中に参考として援用される）は、ＸＬ−１ブ
ルー株Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃ
Ａ）において発現された。簡略にいえば、単一のコロニーを、５０μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含有する１ＬのＬＢ培地中に接種し、そして３７℃で一晩、増殖
した。次いで、培養物を新鮮ＬＢ／アンピシリンで半分に希釈し、そして１時間
室温まで冷却し、その後、０．４ｍＭのＩＰＴＧで６時間２５℃で誘導した。A. Solution Binding Assay of BAG-2 and BAG-3 to Hsc70 / ATPase BAG-2 (SEQ ID NO: 4) and BAG-3 (HSC70 / ATPase)
The association of SEQ ID NO: 6) was determined by an in vitro protein binding assay in which Hsc70 / ATPase or BAG-family proteins were expressed in bacteria as Glutathione S-transferase (GST) fusion proteins. Residues 5 to 211 of human BAG-2 (clone number 11) and human B
The purified cDNA sequence encoding the C-terminal 135 amino acids of AG-3 (clone no. 28) (see FIG. 10A) was obtained from the pGEX4T-1 prokaryotic expression plasmid (Pharmacia; Piscataway) EcoRI / XhoI.
The site was subcloned. These plasmids, as well as pGEX4T-1
-BAG-1, pGEX-4T-1-BAG-1 (AC), and pGEX-4
T-1-XL (these have been described previously (Takayama et al., Supra (
1997); Xie et al., Biochemistry, 37: 6410-6418.
(1998), which are incorporated herein by reference, refer to the XL-1 blue strain E. coli. coli (Stratagene, Inc., La Jolla, C
It was expressed in A). Briefly, a single colony was inoculated into 1 L of LB medium containing 50 μg / ml ampicillin and grown at 37 ° C. overnight. The culture was then diluted in half with fresh LB / ampicillin and cooled to room temperature for 1 hour before induction with 0.4 mM IPTG for 6 hours at 25 ° C.
【００６３】 細胞を回収し、そして５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ ２−メルカプトエタノール、５ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦおよび他のプロテアーゼインヒビター（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（１６９７４９８）から得られる）との混合物
中の０．５ｍｇ／ｍｌリゾチームとともに、室温で０．５時間インキュベートし
、続いて超音波処理した。細胞細片を２７，５００ｇでの１０分間の遠心分離に
よりペレット化し、そして得られた上清を３０ｍｌのグルタチオン−Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とともに４℃で一晩インキュベートした。次い
で、樹脂を、ＯＤ ２８０ｎｍが０．０１未満に達するまで、２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、および
０．１％ ２−メルカプトエタノールで洗浄した。ＧＳＴの除去のためには、固
定したＧＳＴ−融合タンパク質を有する樹脂を１０Ｕのトロンビン（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ，Ｉｎｃ）とともに、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ ２−メルカプトエタノ
ールおよび２．５ｍＭ ＣａＣｌ２中で、４℃で一晩インキュベートした。次い
で、遊離したタンパク質を、ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌの直線勾配を用い
てＦＰＬＣによりＭｏｎｏ Ｑ（ＨＲ１０／１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で精
製し、そしてシャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）アッセイ緩衝液中に透析した。The cells were harvested and 50 mM Tris (pH 8.0), 150 mM Na
Cl, 1% Tween-20, 0.1% 2-mercaptoethanol, 5 mM
EDTA, 1 mM PMSF and other protease inhibitors (Boeh
Ringer Mannheim (obtained from 1697498)) with 0.5 mg / ml lysozyme in a mixture with lysozyme for 0.5 h at room temperature followed by sonication. Cell debris was pelleted by centrifugation at 27,500 g for 10 minutes and the resulting supernatant was reconstituted with 30 ml of glutathione-Sepha.
Incubated with rose (Pharmacia) at 4 ° C. overnight. The resin is then washed with 20 mM Tri until the OD 280 nm reaches less than 0.01.
s (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20, and 0.1% 2-mercaptoethanol. For removal of GST, the resin with immobilized GST-fusion protein was loaded with 10 U thrombin (Boehr
20 mM Tris (pH 8.0), 150 m
Incubated overnight at 4 ° C. in M NaCl, 0.1% Tween-20, 0.1% 2-mercaptoethanol and 2.5 mM CaCl 2. The released protein was then purified on Mono Q (HR10 / 10, Pharmacia) by FPLC using a linear gradient of 0.5M NaCl, pH 8.0, and dialyzed into chaperone assay buffer.
【００６４】 次いで、溶液中でのＨｓｃ７０／ＡＴＰａｓｅに対するＢＡＧ−２（配列番号
４）またはＢＡＧ−３（配列番号６）の結合能力を試験した。ＧＳＴコントロー
ルまたはＧＳＴ−ＢＡＧタンパク質をグルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上に固
定し、３５Ｓ−標識したインビトロ翻訳化（ＩＶＴ）タンパク質への結合につい
て試験した。免疫沈降およびインビトロＧＳＴ−タンパク質結合アッセイを、ヒ
トＢＡｇ−２（クローン番号１１）またはヒトＢＡＧ−３（クローン番号２８）
が３５Ｓ−Ｌ−メチオニン標識タンパク質のインビトロ翻訳または２９３Ｔ細胞
における発現のためにサブクローニングされたｐＣＩ−Ｎｅｏフラッグまたはｐ
ｃＤＮＡ３−ＨＡを用いて、Ｔａｋａｙａｍａら（前出）（１９９７）に記載の
ように実行した。図１１Ｂにおいて示すように、35Ｓ−Ｈｓｃ７０／ＡＴＰａｓ
ｅは、インビトロでＧＳＴ−ＢＡＧ−１、ＧＳＴ−ＢＡＧ−２、およびＧＳＴ−
ＢＡＧ−３に結合したが、ＧＳＴ−ＢＡＧ−１（ΔＣ）または他のいくつかのコ
ントロールタンパク質には結合しなかった。ＢＡＧ−１（配列番号２の残基１１
６で開始する）、ＢＡＧ−２（配列番号４）、およびＢＡＧ−３（配列番号６）
はまた、それ自体またはお互いに対してほとんど、または全く結合を示さなかっ
た。このことは、これらのタンパク質が、強力に、ホモ二量体化もしくはヘテロ
二量体化またはホモオリゴマー化もしくはヘテロオリゴマー化しないことを示す
。しかし、ＢＡＧ−２（配列番号４）は結合アッセイにおいてそれ自体と弱い相
互作用を示し、そして酵母ツーハイブリッド実験において陽性の結果を生じてお
り、これは自己会合する能力を有し得ることを示すことに注意すべきである。Next, the binding ability of BAG-2 (SEQ ID NO: 4) or BAG-3 (SEQ ID NO: 6) to Hsc70 / ATPase in solution was tested. GST control or GST-BAG proteins were immobilized on glutathione-Sepharose and tested for binding to 35S-labeled in vitro translated (IVT) protein. Immunoprecipitation and in vitro GST-protein binding assays were performed using human BAg-2 (clone # 11) or human BAG-3 (clone # 28).
PCI-Neo flag or p subcloned for in vitro translation of 35S-L-methionine labeled protein or expression in 293T cells
This was performed as described in Takayama et al. (supra) (1997) using cDNA 3-HA. As shown in FIG. 11B, 35 S-Hsc70 / ATPas
e, GST-BAG-1, GST-BAG-2, and GST-
Bound to BAG-3, but not to GST-BAG-1 (ΔC) or some other control protein. BAG-1 (residue 11 of SEQ ID NO: 2)
6), BAG-2 (SEQ ID NO: 4), and BAG-3 (SEQ ID NO: 6)
Also showed little or no binding to itself or to each other. This indicates that these proteins do not strongly homo- or hetero-dimerize or homo- or hetero-oligomerize. However, BAG-2 (SEQ ID NO: 4) showed a weak interaction with itself in the binding assay and gave a positive result in the yeast two-hybrid experiment, indicating that it may have the ability to self-associate. It should be noted that
【００６５】 （Ｂ．インビボにおける、Ｈｓｃ７０に対するＢＡＧタンパク質の結合） ＢＡＧ−２（配列番号４）タンパク質およびＢＡＧ−３（配列番号６）タンパ
ク質が細胞においてＨｓｃ７０と相互作用する能力を、以前に記載される（Ｔａ
ｋａｙａｍａら、前出（１９９７））ような免疫沈降アッセイを用いて２９３Ｔ
ヒト上皮細胞においてＮ末端Ｆｌａｇエピトープタグとともにこれらのタンパク
質発現により試験した。ＢＡＧ−２およびＢＡＧ−３のλファージクローニング
領域をコードするｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３−Ｆｌａｇにインフレームにサブク
ローニングした。Ｆｌａｇ−ＢＡＧ−１、Ｆｌａｇ−ＢＡＧ−２またはＦｌａｇ
−ＢＡＧ−３をコードするプラスミドでトランスフェクトした後の２９３Ｔ細胞
から調製した抗Ｆｌａｇ免疫複合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／イムノブロットアッ
セイにより分析した。図１０Ｃに示すように、Ｈｓｃ７０に特異的な抗血清は、
Ｈｓｃ７０に関連するＢＡＧタンパク質の存在を検出した。一方、ＩｇＧ１で調
製したコントロール免疫複合体、およびＦｌａｇ−タグ化コントロールタンパク
質でトランスフェクトした細胞から調製した抗Ｆｌａｇ免疫複合体（Ｄａｘｘお
よびＡｐａｆ−１）は、Ｈｓｃ７０結合タンパク質を含まなかった。これらの結
果はさらに、ＢＡＧ−ファミリータンパク質が特異的にＨｓｃ７０に結合するこ
とを示す。B. Binding of BAG Protein to Hsc70 In Vivo The ability of the BAG-2 (SEQ ID NO: 4) and BAG-3 (SEQ ID NO: 6) proteins to interact with Hsc70 in cells has been described previously. (Ta
293T using an immunoprecipitation assay as described by Kayama et al., supra (1997).
Tested by expression of these proteins in human epithelial cells with N-terminal Flag epitope tag. The cDNAs encoding the λ phage cloning regions of BAG-2 and BAG-3 were subcloned in frame with pcDNA3-Flag. Flag-BAG-1, Flag-BAG-2 or Flag
Anti-Flag immune complexes prepared from 293T cells after transfection with a plasmid encoding -BAG-3 were analyzed by SDS-PAGE / immunoblot assay. As shown in FIG. 10C, the antiserum specific for Hsc70
The presence of the BAG protein associated with Hsc70 was detected. On the other hand, control immune complexes prepared with IgG1 and anti-Flag immune complexes prepared from cells transfected with Flag-tagged control protein (Daxx and Apaf-1) did not contain Hsc70 binding protein. These results further indicate that BAG-family proteins specifically bind to Hsc70.
【００６６】 （Ｃ．Ｈｓｃ７０のＡＴＰａｓｅドメインへのＢＡＧタンパク質結合のＢＩＡ
ｃｏｒｅアッセイ） ＢＡＧ−１（配列番号２の残基１１６で開始する）は、Ｈｓｃ７０のＡＴＰａ
ｓｅドメインに堅固に結合することが公知である（Ｓｔｕａｒｔら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，（印刷中）（１９９８））。従って、ＢＡＧ−２（配列番号４
）およびＢＡＧ−３（配列番号６）タンパク質を、Ｈｓｃ７０／ＡＴＰａｓｅに
結合する能力について試験した。Ｈｓｃ７０／ＡＴＰａｓｅに対するＢＡＧ−２
（配列番号４）およびＢＡＧ−３（配列番号６）の親和性および結合反応速度論
をまた、以前に記載（Ｓｔｕａｒｔら、（前出）（１９９８）、本明細書に参考
として援用される）の表面プラスモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いて、Ｈ
ｓｃ７０／ＡＴＰａｓｅについてＢＡＧ−１（配列番号２の１１６残基で開始す
る）のそれと比較した。(C. BIA of BAG Protein Binding to ATPase Domain of Hsc70)
core assay) BAG-1 (starting at residue 116 of SEQ ID NO: 2)
It is known to bind tightly to the se domain (Stuart et al., J. Bio.
l. Chem. , (During printing) (1998)). Therefore, BAG-2 (SEQ ID NO: 4)
) And BAG-3 (SEQ ID NO: 6) proteins were tested for their ability to bind Hsc70 / ATPase. BAG-2 against Hsc70 / ATPase
The affinity and binding kinetics of (SEQ ID NO: 4) and BAG-3 (SEQ ID NO: 6) have also been described previously (Stuart et al., Supra (1998), which is incorporated herein by reference). Using surface plasmon resonance technology (BIAcore)
sc70 / ATPase was compared to that of BAG-1 (starting at residue 116 of SEQ ID NO: 2).
【００６７】 ＢＡＧ−ファミリータンパク質を細菌中で生成し、そして図１２Ａおよび上記
実施例１に示すようにほぼ均質に精製した。次いで、精製したＢＡＧ−１（配列
番号２の１１６残基で開始する）タンパク質、ＢＡＧ−２（配列番号４）タンパ
ク質、およびＢＡＧ−３（配列番号６）タンパク質をバイオセンサーチップに固
定し、そして可溶性相におけるＨｓｃ７０との相互作用について試験した。反応
速度論的測定を、ＣＭ５センサーチップを備えるＢＩＡｃｏｒｅ−ＩＩ装置およ
びＡｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎ
ｓｏｒ ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて行った。簡略にいえば、タンパク質の固
定のために、このセンサーチップをＨＫ緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７
．４）、１５０ｍＭ ＫＣｌ）で５μｌ／分に平衡化し、次いで、１７μｌの０
．２Ｍ Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピル）−カルボジイミド
および０．０５Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ／ＥＤＣ）、続いて
３５μｌの目的のタンパク質（１０ｍＭアセテート、ｐＨ３．５〜４．５）をイ
ンジェクトすることにより活性化した。表面での過剰のＮＨＳ−エステルを、１
７μｌの１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で不活化し、固定後、５
μｌの再生緩衝液（５０ｍＭホスフェート（ｐＨ６．８）および４Ｍ ＧｕＨＣ
ｌ）をインジェクトした。結合アッセイについては、Ｈｓｐ７０（Ｓｉｇｍａ、
Ｈ８７７８）を、ＨＫ緩衝液中で溶解し、そして種々の濃度で調製した表面にわ
たって１０μｌ／分で注射した。５μｌの再生緩衝液での各インジェクト後、こ
の表面は、再生した。速度定数ＫassおよびＫdissをＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏ
ｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ３．０１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ
ＡＢ）で求めた。ＢＡＧ−１（配列番号２の１１６残基で開始する）、ＢＡＧ−
２（配列番号４）またはＢＡＧ−３（配列番号６）を含有するチップに対するＨ
ｓｃ７０の添加は、チップ表面で測定したＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｕｎｉｔｓ（ＲＵ
）における増加により反映されるように、濃度依存性結合を生じた（図３Ｂを参
照のこと）。対照的に、Ｈｓｃ７０は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいて、種々
のコントロールタンパク質ならびにＢＡＧドメインのＣ末端部分（Ｈｓｃ７０−
結合に必要である）を欠失するＢＡＧ−１の変異体と相互作用を提示し得なかっ
た（図３Ｂ）。さらに、ＢＡＧ−１（配列番号２の１１６残基で開始する）チッ
プ、ＢＡＧ−２（配列番号４）チップ、またはＢＡＧ−３（配列番号６）チップ
にわたる、ＧＳＴ、ＢＳＡおよびＢｃｌ−ＸＬのような種々のコントロールタン
パク質の流れは、わずかな相互作用を生じた。これらの結果はさらに、ＢＡＧ−
ファミリータンパク質がＨｓｃ７０と相互作用し、そして結合する特異性を示す
。BAG-family proteins were produced in bacteria and purified to near homogeneity as shown in FIG. 12A and Example 1 above. The purified BAG-1 (starting at residue 116 of SEQ ID NO: 2), BAG-2 (SEQ ID NO: 4), and BAG-3 (SEQ ID NO: 6) proteins are then immobilized on a biosensor chip, and The interaction with Hsc70 in the soluble phase was tested. Kinetic measurements were performed using a BIAcore-II instrument equipped with a CM5 sensor chip and the Amine Coupling Kit (Pharmacia Biosen).
sor AB, Sweden). Briefly, for the immobilization of proteins, this sensor chip was loaded with HK buffer (10 mM Hepes (pH 7).
. 4) Equilibrate to 5 μl / min with 150 mM KCl), then add 17 μl of 0
. 2M N-ethyl-N ′-(3-diethylaminopropyl) -carbodiimide and 0.05M N-hydroxysuccinimide (NHS / EDC), followed by 35 μl of the protein of interest (10 mM acetate, pH 3.5-4.5). Activated by injection. The excess NHS-ester at the surface is reduced to 1
After inactivation with 7 μl of 1 M ethanolamine-HCl (pH 8.5), fixation,
μl of regeneration buffer (50 mM phosphate (pH 6.8) and 4M GuHC
l) was injected. For binding assays, Hsp70 (Sigma,
H8778) was dissolved in HK buffer and injected at 10 μl / min over surfaces prepared at various concentrations. After each injection with 5 μl of regeneration buffer, the surface was regenerated. The rate constants K ass and K diss are calculated as BIAevaluatio
n software 3.01 (Pharmacia Biosensor)
AB). BAG-1 (starting at residue 116 of SEQ ID NO: 2), BAG-
2 (SEQ ID NO: 4) or BAG-3 (SEQ ID NO: 6)
The addition of sc70 is based on the response units (RU) measured on the chip surface.
) Produced concentration-dependent binding as reflected by the increase in (see FIG. 3B). In contrast, Hsc70 was used in the BIAcore assay for various control proteins as well as the C-terminal portion of the BAG domain (Hsc70-
(Required for binding) could not display an interaction with a mutant of BAG-1 lacking (FIG. 3B). In addition, such as GST, BSA and Bcl-XL across BAG-1 (starting at residue 116 of SEQ ID NO: 2), BAG-2 (SEQ ID NO: 4), or BAG-3 (SEQ ID NO: 6) chips. The flow of various control proteins resulted in slight interactions. These results further indicate that BAG-
The family proteins show specificity of interacting with and binding to Hsc70.
【００６８】 ＢＡＧ−１（配列番号２の残基１１６で開始する）タンパク質、ＢＡＧ−２（
配列番号４）タンパク質およびＢＡＧ−３（配列番号６）タンパク質へのＨｓｃ
７０の結合の速度は同様であり、擬一次反応速度論をともない、これはそれぞれ
、２．１、２．１および２．４×１０5Ｍ-1ｓｅｃ-1の会合速度定数（Ｋａｌ）
と推定された。固定されたＢＡＧ−１（配列番号２の１１６残基で開始する）、
ＢＡＧ−２（配列番号４）、またはＢＡＧ−３（配列番号６）にＨｓｃ７０をプ
ラトーなレベルに達するまで結合させた後、シャペロンを流体溶液から除去し、
そして解離定数をモニターした。ＢＡＧ−１（配列番号２の残基１１６で開始す
る）およびＢＡＧ−２（配列番号４）は、類似の解離定数（それぞれチップ表面
からのＨｓｃ７０の緩徐な消失をともなう）を示した。これは、それぞれ３．０
および５．０×１０-4ｓｅｃ-1の推定解離速度定数（Ｋd）を生じた（図３Ｂを
参照のこと）。対照的に、Ｈｓｃ７０は、ＢＡＧ−３を含有するバイオセンサー
チップからより迅速に解離し（図３Ｂを参照のこと）、１．７×１０-3ｓｅｃ-1 の推定Ｋdを生じた。反応速度論データから、ＢＡＧ−１（配列番号２の残基１
１６で開始する）、ＢＡＧ−２（配列番号４）およびＢＡＧ−３（配列番号６）
へのＨｓｃ７０の結合についてみかけの親和性（ＫD＝Ｋd／Ｋa）を計算し、そ
してそれぞれおよそＫD＝１．４ｎＭ、ＫD＝２．４ｎＭ、およびＫd＝７．４ｎ
Ｍに等しいと見積もられた。これらの結果は、Ｈｓｃ７０とＢＡＧ−ファミリー
タンパク質の相互作用が薬理学的関連性に十分な見かけの親和性で生じることを
示す。The BAG-1 (starting at residue 116 in SEQ ID NO: 2) protein, BAG-2 (
SEQ ID NO: 4) Hsc to protein and BAG-3 (SEQ ID NO: 6) protein
The rate of binding of 70 is similar, with pseudo-first-order kinetics, which are the association rate constants (Kal) of 2.1, 2.1 and 2.4 × 10 5 M −1 sec −1 , respectively.
It was estimated. Immobilized BAG-1 (starting at residue 116 of SEQ ID NO: 2),
After binding Hsc70 to BAG-2 (SEQ ID NO: 4) or BAG-3 (SEQ ID NO: 6) to plateau levels, the chaperone was removed from the fluid solution,
And the dissociation constant was monitored. BAG-1 (starting at residue 116 of SEQ ID NO: 2) and BAG-2 (SEQ ID NO: 4) showed similar dissociation constants, each with a slow disappearance of Hsc70 from the chip surface. This is 3.0
And an estimated dissociation rate constant (K d ) of 5.0 × 10 −4 sec −1 (see FIG. 3B). In contrast, Hsc70 dissociated more rapidly from the biosensor chip containing BAG-3 (see FIG. 3B), producing an estimated K d of 1.7 × 10 −3 sec −1 . From the kinetic data, BAG-1 (residue 1 of SEQ ID NO: 2)
16), BAG-2 (SEQ ID NO: 4) and BAG-3 (SEQ ID NO: 6)
The apparent affinities (K D = K d / K a ) for the binding of Hsc70 to Hc70 were calculated and were approximately K D = 1.4 nM, K D = 2.4 nM, and K d = 7.4 n, respectively.
It was estimated to be equal to M. These results indicate that the interaction of Hsc70 with BAG-family proteins occurs with an apparent affinity sufficient for pharmacological relevance.
【００６９】 （実施例ＩＩＩ） （ＢＡＧファミリータンパク質は、Ｈｓｐ７０／Ｈｓｃ７０依存性のタンパク
質折り畳みを阻害する） この実施例は、ＢＡＧ−２（配列番号４）タンパク質およびＢＡＧ−３（配列
番号６）タンパク質が、ＢＡＧ−１（配列番号２の残基１１６から始まる）タン
パク質と同様に、変性タンパク質の、Ｈｓｐ７０／Ｈｓｃ７０依存性再折り畳み
を阻害することを実証する。Example III BAG Family Proteins Inhibit Hsp70 / Hsc70-Dependent Protein Folding This example demonstrates that the BAG-2 (SEQ ID NO: 4) and Demonstrate that, like the BAG-1 (starting at residue 116 of SEQ ID NO: 2) protein, the denatured protein inhibits Hsp70 / Hsc70-dependent refolding.
【００７０】 Ｈｓｐ７０／Ｈｓｃ７０依存性のタンパク質再折り畳みに対する、ＢＡＧ−２
（配列番号４）タンパク質およびＢＡＧ−３（配列番号６）タンパク質の効果を
、Ｔａｋａｙａｍａら、前出、１９９８；Ｔｅｒａｄａら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉ
ｏｌ．，１３９：１０８９〜１０９５，１９９７（これらは、本明細書において
参考として援用される）によって以前に記載されたアッセイと類似のインビトロ
タンパク質再折り畳みアッセイを使用して決定した。簡潔には、ルシフェラーゼ
（２０μＭ）を、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．２）、５０ｍＭ 酢
酸カリウム、５ｍＭ ＤＴＴ、６Ｍ グアニジン塩酸塩中で、約２５℃で１時間
変性させた。変性ルシフェラーゼを、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．
２）、５０ｍＭ 酢酸カリウム、５ｍＭ ＤＴＴ中に１：４０に希釈した。Ｈｓ
ｃ７０（１．８μＭ）、ＤｎａＪ（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ，Ｉｎｃ．）（０．９μ
Ｍ）、および示したような種々の精製組換えタンパク質を、０．２容量の希釈し
た変性ルシフェラーゼを含有する再折り畳み緩衝液（３０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−Ｋ
ＯＨ（ｐＨ７．６）、１２０ｍＭ 酢酸カリウム、３ｍＭ 酢酸マグネシウム、
２ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＡＴＰ）に添加して、０．１μＭの最終濃度にし
た。ルシフェラーゼ活性を、３５℃での１．５時間のインキュベーション後に測
定した。BAG-2 for Hsp70 / Hsc70-dependent protein refolding
The effects of the (SEQ ID NO: 4) protein and the BAG-3 (SEQ ID NO: 6) protein were evaluated by Takayama et al., Supra, 1998; Terada et al., J Cell Bi.
ol. 139: 1089-1095, 1997, which are incorporated herein by reference, using an in vitro protein refolding assay similar to the assay previously described. Briefly, luciferase (20 μM) was denatured in 25 mM Hepes-KOH (pH 7.2), 50 mM potassium acetate, 5 mM DTT, 6 M guanidine hydrochloride for 1 hour at about 25 ° C. The denatured luciferase was added to 25 mM Hepes-KOH (pH 7.
2), diluted 1:40 in 50 mM potassium acetate, 5 mM DTT. Hs
c70 (1.8 μM), DnaJ (StressGen, Inc.) (0.9 μM)
M), and various purified recombinant proteins as indicated, were combined with a refolding buffer (30 mM Hepes-K) containing 0.2 volumes of diluted denatured luciferase.
OH (pH 7.6), 120 mM potassium acetate, 3 mM magnesium acetate,
(2 mM DTT, 2.5 mM ATP) to a final concentration of 0.1 μM. Luciferase activity was measured after 1.5 hours incubation at 35 ° C.
【００７１】 Ｈｓｃ７０およびＤｎａＪの組合せは、化学的に変性したホタルルシフェラー
ゼのＡＴＰ依存性再折り畳みを生じ、化学ルミネッセンスアッセイによってモニ
ターしたように、変性した酵素の半分以上の機能が、９０分の反応で回復した。
対照的に、Ｈｓｃ７０単独でもＤｎａＪ単独でも、変性ルシフェラーゼの実質的
な再折り畳みを誘導し得なかった。さらに、ルシフェラーゼ活性の自発的な回復
は、コントロールタンパク質、ＢＳＡ、ＧＳＴまたはＢｃｌ−ＸＬではほとんど
観察されなかった（図４Ａを参照のこと）。The combination of Hsc70 and DnaJ results in ATP-dependent refolding of chemically denatured firefly luciferase, with more than half of the function of denatured enzyme in a 90 minute reaction, as monitored by a chemiluminescence assay. Recovered.
In contrast, neither Hsc70 alone nor DnaJ alone was able to induce substantial refolding of denatured luciferase. Moreover, little spontaneous recovery of luciferase activity was observed with the control proteins, BSA, GST or Bcl-XL (see FIG. 4A).
【００７２】 Ｈｓｃ７０（１．８μＭ）と等モル量での、上記のアッセイへの組換え精製Ｂ
ＡＧ−１（配列番号２の残基１１６から始まる）、ＢＡＧ−２（配列番号４）ま
たはＢＡＧ−３（配列番号６）の添加は、ルシフェラーゼ再折り畳みの著しい阻
害を生じた。ＢＡＧ−２（配列番号４）およびＢＡＧ−３（配列番号６）は、図
４Ａに示されるように、ＢＡＧ−１（配列番号２の残基１１６から始まる）より
も幾分大きな阻害活性を提示した。対照的に、ＢＡＧ−１（ΔＣ）タンパク質（
これは、いくつかの他のコントロールタンパク質と同様にＨｓｃ７０を結合しな
い）は、ルシフェラーゼ再折り畳みに対する効果を有さなかった。Recombinant purification B to the above assay in equimolar amounts to Hsc70 (1.8 μM)
Addition of AG-1 (starting at residue 116 of SEQ ID NO: 2), BAG-2 (SEQ ID NO: 4) or BAG-3 (SEQ ID NO: 6) resulted in significant inhibition of luciferase refolding. BAG-2 (SEQ ID NO: 4) and BAG-3 (SEQ ID NO: 6) exhibit somewhat greater inhibitory activity than BAG-1 (starting at residue 116 of SEQ ID NO: 2), as shown in FIG. 4A. did. In contrast, the BAG-1 (ΔC) protein (
It does not bind Hsc70 like some other control proteins) had no effect on luciferase refolding.
【００７３】 Ｍｉｎａｍｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９６１７〜２４，１９
９６によって以前に記載されたような、さらなる再折り畳みアッセイにおいて、
精製Ｈｓｃ７０およびヒトＤｎａＪホモログＨｄｊ−１（Ｈｓｐ４０）を、網状
赤血球溶解産物（５％ ｖ：ｖ）において提供されるさらなる補因子と共に使用
して、変性ルシフェラーゼを再折り畳みし得る系を生成した。簡潔には、さらな
る補因子は、組換えルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ：ＱｕａｎｔｉＬｕｍ Ｔ
Ｍ）（これは、４２℃で１０分間熱変性させた）、１．８μＭ Ｈｓｃ７０（Ｓ
ｉｇｍａ；ウシ脳から精製された）、０．９μＭ Ｈｓｐ４０、および種々の組
換え精製タンパク質を含んだ。ルシフェラーゼ活性を、照度計（ＥＧ＆Ｇ Ｂｅ
ｒｔｈｏｌｄ，ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ照度計、Ｍｏｄｅｌ ＃ＬＢ９６Ｐ）を使
用して測定した（Ｐｒｏｍｅｇａルシフェラーゼアッセイキット）。全ての結果
を、同じ条件に供した非変性ルシフェラーゼに対して基準化した。ＡＴＰ、Ｈｓ
ｃ７０、またはＨｓｐ４０を欠くコントロール反応は、無視し得るルシフェラー
ゼ再折り畳みを生じた。[0073] Minami et al. Biol. Chem. 271: 19617-24, 19
In a further refolding assay, as previously described by 96,
Purified Hsc70 and the human DnaJ homolog Hdj-1 (Hsp40) were used with an additional cofactor provided in reticulocyte lysate (5% v: v) to create a system that could refold denatured luciferase. Briefly, an additional cofactor is a recombinant luciferase (Promega: QuantiLum T
M) (this was heat denatured at 42 ° C. for 10 minutes), 1.8 μM Hsc70 (S
igma; purified from bovine brain), 0.9 μM Hsp40, and various recombinant purified proteins. Luciferase activity was measured using an illuminometer (EG & G Be).
rthold, MicroLumat luminometer, Model # LB96P) (Promega luciferase assay kit). All results were normalized to non-denatured luciferase subjected to the same conditions. ATP, Hs
Control reactions lacking c70, or Hsp40, resulted in negligible luciferase refolding.
【００７４】 Ｈｓｃ７０の量に対して、種々の量の精製ＢＡＧ−１（配列番号２の残基１１
６から始まる）、ＢＡＧ−２（配列番号４）またはＢＡＧ−３（配列番号６）を
、上記のタンパク質再折り畳みアッセイにおいて使用した。ＢＡＧ−ファミリー
タンパク質の添加は、Ｈｓｃ７０シャペロン活性の濃度依存性阻害を生じた。さ
らに、Ｈｓｃ７０シャペロン活性のＢＡＧ−２（配列番号４）阻害およびＢＡＧ
−３（配列番号６）阻害は、ＢＡＧ−１（配列番号２の残基１１６から始まる）
について観察された強さと同じ強さであることが実証された。対照的に、ＢＡＧ
−１（ΔＣ）変異体ならびに他のコントロールタンパク質は、変性ルシフェラー
ゼのＨｓｃ７０媒介性再折り畳みを抑制しなかった。これらの結果は、ＢＡＧ−
２（配列番号４）およびＢＡＧ−３（配列番号６）が、ＢＡＧ−１（配列番号２
の残基１１６から始まる）と同程度に、Ｈｓｃ７０／Ｈｓｐ７０依存性のタンパ
ク質再折り畳み活性を阻害し得ることを示す。Various amounts of purified BAG-1 (residue 11 of SEQ ID NO: 2) relative to the amount of Hsc70
6), BAG-2 (SEQ ID NO: 4) or BAG-3 (SEQ ID NO: 6) were used in the protein refolding assay described above. Addition of BAG-family proteins resulted in a concentration-dependent inhibition of Hsc70 chaperone activity. Further, BAG-2 (SEQ ID NO: 4) inhibition of Hsc70 chaperone activity and BAG
-3 (SEQ ID NO: 6) inhibition is BAG-1 (starting at residue 116 of SEQ ID NO: 2)
Was demonstrated to be the same strength as that observed for. In contrast, BAG
The -1 (ΔC) mutant, as well as other control proteins, did not suppress Hsc70-mediated refolding of denatured luciferase. These results indicate that BAG-
2 (SEQ ID NO: 4) and BAG-3 (SEQ ID NO: 6)
, Starting from residue 116) of Hsc70 / Hsp70-dependent protein refolding activity.
【００７５】 （Ｂ．ＢＡＧは、Ｈｓｃ７０への結合についてＨｉｐと競合する） ＢＡＧ−１が、Ｈｓｃ７０への結合についてＨｉｐと競合することは公知であ
り、これらのタンパク質は、Ｈｓｃ７０媒介性のタンパク質再折り畳みに対して
逆の効果を及ぼす（Ｈｏｈｆｅｌｄ，Ｊ．、およびＪｅｎｔｓｃｈ，Ｓ．，Ｅｍ
ｂｏ Ｊ．，１６：６２０９〜６２１６，１９９７、これは、本明細書において
参考として援用される）。ＢＡＧ−２（配列番号４）およびＢＡＧ−３（配列番
号６）もまたＨｓｃ７０への結合についてＨｉｐと競合するか否かを決定するた
めに、再折り畳みアッセイを、Ｈｉｐタンパク質の存在下で、上記のように実施
した。B. BAG Competes with Hip for Binding to Hsc70 BAG-1 is known to compete with Hip for binding to Hsc70, and these proteins are Hsc70-mediated Has the opposite effect on folding (Hohfeld, J., and Jentsch, S., Em.
bo J. , 16: 6209-6216, 1997, which is incorporated herein by reference). To determine whether BAG-2 (SEQ ID NO: 4) and BAG-3 (SEQ ID NO: 6) also compete with Hip for binding to Hsc70, a refolding assay was performed in the presence of Hip protein as described above. Was carried out as follows.
【００７６】 Ｈｉｐを、Ｈｉｓ6−タンパク質として精製した。融合タンパク質を、ＢＬ２
１細胞中、２５℃で６時間、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを有するｐＥＴ２８−Ｈｉｐ
（Ｖ．Ｐｒａｐａｐａｎｉｃｈら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１８：９４
４〜９５２，１９９８、これは、本明細書において参考として援用される）から
誘導した。１Ｌの培養物からの細胞を、５０ｍｌの５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０中
に再懸濁し、次いで、０．５ｍｇ／ｍｌ リゾチームとともに、２５℃で０．５
時間インキュベートし、続いて超音波処理した。２７，５００ｇで１０分間の遠
心分離後、得られた上清を、２５ｍＭ イミダゾールとともに、４℃で３時間、
１５ｍｌ ニッケル樹脂（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）と混合した。次いで、この
樹脂を、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）、２５ｍＭ イミダゾール、１
５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて、ＯＤ２８０ｎ
ｍが＜０．０１の値に達するまで洗浄した。Ｈｉｓ6−Ｈｉｐタンパク質を、洗
浄緩衝液（Ｑｉａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）中で２５０ｍＭ イミダゾールを用いて
溶出し、そしてｐＨ８．０で０．５Ｍ ＮａＣｌの直線勾配を使用するＦＰＬＣ
によってＭｏｎｏ Ｑ（ＨＲ１０／１０ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で精製し、次
いで、シャペロンアッセイ緩衝液中で透析した。The Hip was purified as His 6 -protein. The fusion protein was expressed as BL2
PET28-Hip with 0.1 mM IPTG in one cell at 25 ° C. for 6 hours
(V. Prapapanich et al., Mol Cell Biol., 18:94.
4-952, 1998, which is incorporated herein by reference). Cells from a 1 L culture are combined with 50 ml of 50 mM phosphate buffer (p
H6.8), 150 mM NaCl, and 1% (v / v) Tween-20, then 0.5% at 25 ° C. with 0.5 mg / ml lysozyme.
Incubated for hours, followed by sonication. After centrifugation at 27,500 g for 10 minutes, the obtained supernatant was mixed with 25 mM imidazole at 4 ° C. for 3 hours.
It was mixed with 15 ml nickel resin (Qiagen, Inc.). The resin was then combined with 50 mM phosphate buffer (pH 6.8), 25 mM imidazole,
OD280n using 50 mM NaCl and 0.1% Tween-20.
Washing was performed until m reached a value of <0.01. The His 6 -Hip protein, washing buffer (Qiagene, Inc.) Was eluted with 250mM imidazole in, and using a linear gradient of 0.5M NaCl in pH 8.0 FPLC
On Mono Q (HR10 / 10 Pharmacia) and then dialyzed in chaperone assay buffer.
【００７７】 再折り畳みアッセイ反応において、ＢＡＧ−１（配列番号２の残基１１６から
始まる）、ＢＡＧ−２（配列番号４）またはＢＡＧ−３（配列番号６）（１．８
μＭ）に対して等モル濃度での精製Ｈｉｐの添加は、変性ルシフェラーゼの再折
り畳みに対するＢＡＧ−ファミリータンパク質の阻害性効果を完全に打ち消した
（図４Ｃを参照のこと）。これらの結果は、ＢＡＧ−ファミリータンパク質によ
るＨｓｃ７０シャペロン活性の抑制が可逆性であり、そしてＨｉｐが、ＢＡＧ−
１（配列番号２の残基１１６から始まる）の効果のみならず、ＢＡＧ−２（配列
番号４）およびＢＡＧ−３（配列番号６）の効果もまた拮抗することを実証する
。In a refolding assay reaction, BAG-1 (starting at residue 116 of SEQ ID NO: 2), BAG-2 (SEQ ID NO: 4) or BAG-3 (SEQ ID NO: 6) (1.8
The addition of purified Hip at equimolar concentrations (μM) completely abolished the inhibitory effect of BAG-family proteins on refolding of denatured luciferase (see FIG. 4C). These results indicate that the suppression of Hsc70 chaperone activity by BAG-family proteins was reversible, and that Hip was associated with BAG-family proteins.
It demonstrates that not only the effect of 1 (starting at residue 116 of SEQ ID NO: 2) but also the effects of BAG-2 (SEQ ID NO: 4) and BAG-3 (SEQ ID NO: 6) are antagonized.
【００７８】 要約すると、これらの結果は、ＢＡＧ−ファミリータンパク質が全て、Ｈｓｃ
７０／Ｈｓｐ７０を結合するＣ末端の近くに保存されたＢＡＧドメインを含むこ
と、およびヒトＢＡＧ−ファミリータンパク質が、Ｈｓｃ７０のＡＴＰａｓｅド
メインに対して高親和性で結合し得、そしてＨｉｐ抑制可能（ｒｅｐｒｅｓｓａ
ｂｌｅ）機構を通じてそのシャペロン活性を阻害し得ることを、実証する。In summary, these results indicate that all BAG-family proteins are Hsc
Including a conserved BAG domain near the C-terminus that binds Hsp70 / Hsp70, and that the human BAG-family protein can bind with high affinity to the ATPase domain of Hsc70 and is Hip repressible (repressa
ble) demonstrates that its chaperone activity can be inhibited through a mechanism.
【００７９】 （実施例ＩＶ） （ヒトＢＡＧ−３、ＢＡＧ−４およびＢＡＧ−５についての伸張した核酸配列
およびアミノ酸配列） 本明細書に開示される手順に従って、ヒトＢＡＧ−３、ＢＡＧ−４およびＢＡ
Ｇ−５に対する核酸配列およびアミノ酸配列を、さらに伸張した。ＢＡＧ−３、
ＢＡＧ−４およびＢＡＧ−５のついての伸張した配列を、それぞれ、図１５、１
６および１７に示し、これらはそれぞれの配列同定番号（「配列番号」）を有す
る。Example IV Extended Nucleic Acid and Amino Acid Sequences for Human BAG-3, BAG-4 and BAG-5 According to the procedures disclosed herein, human BAG-3, BAG-4 and BA
The nucleic acid and amino acid sequences for G-5 were further extended. BAG-3,
The extended sequences for BAG-4 and BAG-5 are shown in FIGS.
6 and 17, which have their respective sequence identification numbers ("SEQ ID NOs").
【配列表】 [Sequence list]
【図１】 図１は、ヒトＢＡＧ−１タンパク質の全長ｃＤＮＡ配列（配列番号１）を、そ
の対応するアミノ酸配列（配列番号２）と共に示す。全長配列内には、ＢＡＧ−
１（ヌクレオチド３９１で開始する）、ＢＡＧ−１Ｍ［（配列番号２）のヌクレ
オチド２６０で開始する］およびＢＡＧ−１Ｌ［（配列番号２）のヌクレオチド
４６で開始する］の重複部分配列が含まれる。FIG. 1 shows the full-length cDNA sequence of human BAG-1 protein (SEQ ID NO: 1) along with its corresponding amino acid sequence (SEQ ID NO: 2). Within the full length sequence, BAG-
1 (starting at nucleotide 391), overlapping subsequences of BAG-1M [starting at nucleotide 260 of (SEQ ID NO: 2)] and BAG-1L [starting at nucleotide 46 of (SEQ ID NO: 2)].
【図２Ａ】 図２Ａおよび２Ｂは、組み合わせて、ヒトＢＡＧ−２タンパク質のその対応す
るアミノ酸残基（配列番号４）と共に整列化した全長ｃＤＮＡ配列（配列番号３
）を示す。2A and 2B show, in combination, the full-length cDNA sequence (SEQ ID NO: 3) aligned with its corresponding amino acid residues of the human BAG-2 protein (SEQ ID NO: 4).
).
【図２Ｂ】 図２Ａおよび２Ｂは、組み合わせて、ヒトＢＡＧ−２タンパク質のその対応す
るアミノ酸残基（配列番号４）と共に整列化した全長ｃＤＮＡ配列（配列番号３
）を示す。2A and 2B show, in combination, the full-length cDNA sequence (SEQ ID NO: 3) aligned with its corresponding amino acid residues of the human BAG-2 protein (SEQ ID NO: 4).
).
【図３】 図３は、ヒトＢＡＧ−３タンパク質のその対応するアミノ酸残基（配列番号６
）と共に整列化したｃＤＮＡ配列（配列番号５）を示す。FIG. 3 shows the corresponding amino acid residues of human BAG-3 protein (SEQ ID NO: 6).
) Is shown together with the cDNA sequence (SEQ ID NO: 5).
【図４】 図４は、ヒトＢＡＧ−４タンパク質のその対応するアミノ酸残基（配列番号８
）と共に整列化したｃＤＮＡ配列（配列番号７）を示す。FIG. 4 shows the corresponding amino acid residues of human BAG-4 protein (SEQ ID NO: 8).
) Is shown together with the cDNA sequence (SEQ ID NO: 7).
【図５】 図５は、ヒトＢＡＧ−５タンパク質のその対応するアミノ酸残基（配列番号１
０）と共に整列化したｃＤＮＡ配列（配列番号９）を示す。FIG. 5 shows the corresponding amino acid residues of human BAG-5 protein (SEQ ID NO: 1).
0) shows the cDNA sequence aligned with (0) (SEQ ID NO: 9).
【図６Ａ】 図６Ａは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＢＡＧ−１タンパク質の全長ｃＤＮＡ配列（
配列番号１１）を示す。FIG. 6A shows C.I. elegans BAG-1 protein full length cDNA sequence (
SEQ ID NO: 11) is shown.
【図６Ｂ】 図６Ｂは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＢＡＧ−１タンパク質の２１０アミノ酸配列
（配列番号１２）を示す。FIG. 6B shows C.I. 2 shows the 210 amino acid sequence (SEQ ID NO: 12) of elegans BAG-1 protein.
【図７Ａ】 図７Ａは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＢＡＧ−２タンパク質の全長ｃＤＮＡ配列（
配列番号１３）を示す。FIG. 7A shows C.I. elegans BAG-2 full length cDNA sequence (
SEQ ID NO: 13) is shown.
【図７Ｂ】 図７Ｂは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＢＡＧ−２タンパク質の４５８アミノ酸配列
（配列番号１４）を示す。FIG. 7B shows C.I. 458 shows the 458 amino acid sequence of elegans BAG-2 protein (SEQ ID NO: 14).
【図８Ａ】 図８Ａは、Ｓ．ｐｏｍｂｅ ＢＡＧ−１Ａタンパク質の全長ｃＤＮＡ配列（配
列番号１５）を示す。FIG. 8A shows the S.D. Figure 3 shows the full length cDNA sequence of the pombe BAG-1A protein (SEQ ID NO: 15).
【図８Ｂ】 図８Ｂは、Ｓ．ｐｏｍｂｅ ＢＡＧ−１Ａタンパク質の１９５アミノ酸配列（
配列番号１６）を示す。FIG. 195 amino acid sequence of the pombe BAG-1A protein (
SEQ ID NO: 16) is shown.
【図９Ａ】 図９Ａは、Ｓ．ｐｏｍｂｅ ＢＡＧ−１Ｂタンパク質の全長ｃＤＮＡ配列（配
列番号１７）を示す。FIG. Figure 3 shows the full length cDNA sequence of the pombe BAG-1B protein (SEQ ID NO: 17).
【図９Ｂ】 図９Ｂは、Ｓ．ｐｏｍｂｅ ＢＡＧ−１Ｂタンパク質の２０６アミノ酸配列（
配列番号１８）を示す。FIG. 206 amino acid sequence of the pombe BAG-1B protein (
SEQ ID NO: 18) is shown.
【図１０Ａ】 図１０は、以下のＢＡＧ−ファミリータンパク質のトポロジーを示す；ヒトＢ
ＡＧタンパク質、ＢＡＧ−１（配列番号２）、ＢＡＧ−２（配列番号４）、ＢＡ
Ｇ−３（配列番号６）、ＢＡＧ−４（配列番号８）、ＢＡＧ−５（配列番号１０
）；Ｓ．ｐｏｍｂｅ ＢＡＧ−１Ａ（配列番号１６）およびＢＡＧ−１Ｂ（配列
番号１８）；ならびにＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ＢＡＧ−１（配列番号１２）および
ＢＡＧ−２（配列番号１４）。（Ａ）ＢＡＧドメインの相対的な位置を黒色で示
し、ユビキチン様領域を、灰色で示し、ＷＷドメインを、斜線で示す。核質様核
局在配列もまた示される。（Ｂ）ヒトＢＡＧ−１（配列番号２）、ＢＡＧ−２（
配列番号４）、ＢＡＧ−３（配列番号６）、ＢＡＧ−４（配列番号８）、ＢＡＧ
−５（配列番号１０）、Ｓ．ｐｏｍｂｅ ＢＡＧ−１Ａ（配列番号１６）および
ＢＡＧ−１Ｂ（配列番号１８）、ならびにＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ＢＡＧ−１（配
列番号１２）およびＢＡＧ−２（配列番号１４）のＢＡＧドメインのアミノ酸配
列を整列化し、それらの相同性を実証する。黒色および灰色の陰付き部分は、そ
れぞれ、同一アミノ酸および類似アミノ酸を示す。FIG. 10 shows the topology of the following BAG-family proteins; human B
AG protein, BAG-1 (SEQ ID NO: 2), BAG-2 (SEQ ID NO: 4), BA
G-3 (SEQ ID NO: 6), BAG-4 (SEQ ID NO: 8), BAG-5 (SEQ ID NO: 10)
); pombe BAG-1A (SEQ ID NO: 16) and BAG-1B (SEQ ID NO: 18); elegans BAG-1 (SEQ ID NO: 12) and BAG-2 (SEQ ID NO: 14). (A) The relative position of the BAG domain is shown in black, the ubiquitin-like region is shown in gray, and the WW domain is shown in oblique lines. The nucleoplasmic nuclear localization sequence is also shown. (B) Human BAG-1 (SEQ ID NO: 2), BAG-2 (
SEQ ID NO: 4), BAG-3 (SEQ ID NO: 6), BAG-4 (SEQ ID NO: 8), BAG
-5 (SEQ ID NO: 10); pombe BAG-1A (SEQ ID NO: 16) and BAG-1B (SEQ ID NO: 18); The amino acid sequences of the BAG domains of elegans BAG-1 (SEQ ID NO: 12) and BAG-2 (SEQ ID NO: 14) are aligned and demonstrate their homology. Black and gray shaded areas indicate identical and similar amino acids, respectively.
【図１０Ｂ】 図１０は、以下のＢＡＧ−ファミリータンパク質のトポロジーを示す；ヒトＢ
ＡＧタンパク質、ＢＡＧ−１（配列番号２）、ＢＡＧ−２（配列番号４）、ＢＡ
Ｇ−３（配列番号６）、ＢＡＧ−４（配列番号８）、ＢＡＧ−５（配列番号１０
）；Ｓ．ｐｏｍｂｅ ＢＡＧ−１Ａ（配列番号１６）およびＢＡＧ−１Ｂ（配列
番号１８）；ならびにＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ＢＡＧ−１（配列番号１２）および
ＢＡＧ−２（配列番号１４）。（Ａ）ＢＡＧドメインの相対的な位置を黒色で示
し、ユビキチン様領域を、灰色で示し、ＷＷドメインを、斜線で示す。核質様核
局在配列もまた示される。（Ｂ）ヒトＢＡＧ−１（配列番号２）、ＢＡＧ−２（
配列番号４）、ＢＡＧ−３（配列番号６）、ＢＡＧ−４（配列番号８）、ＢＡＧ
−５（配列番号１０）、Ｓ．ｐｏｍｂｅ ＢＡＧ−１Ａ（配列番号１６）および
ＢＡＧ−１Ｂ（配列番号１８）、ならびにＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ＢＡＧ−１（配
列番号１２）およびＢＡＧ−２（配列番号１４）に対するＢＡＧドメインのアミ
ノ酸配列を整列し、それらの相同性を実証する。黒色および灰色の陰付き部分は
、それぞれ、同一アミノ酸および類似アミノ酸を示す。FIG. 10 shows the topology of the following BAG-family proteins; human B
AG protein, BAG-1 (SEQ ID NO: 2), BAG-2 (SEQ ID NO: 4), BA
G-3 (SEQ ID NO: 6), BAG-4 (SEQ ID NO: 8), BAG-5 (SEQ ID NO: 10)
); pombe BAG-1A (SEQ ID NO: 16) and BAG-1B (SEQ ID NO: 18); elegans BAG-1 (SEQ ID NO: 12) and BAG-2 (SEQ ID NO: 14). (A) The relative position of the BAG domain is shown in black, the ubiquitin-like region is shown in gray, and the WW domain is shown in oblique lines. The nucleoplasmic nuclear localization sequence is also shown. (B) Human BAG-1 (SEQ ID NO: 2), BAG-2 (
SEQ ID NO: 4), BAG-3 (SEQ ID NO: 6), BAG-4 (SEQ ID NO: 8), BAG
-5 (SEQ ID NO: 10); pombe BAG-1A (SEQ ID NO: 16) and BAG-1B (SEQ ID NO: 18); The amino acid sequences of the BAG domain for elegans BAG-1 (SEQ ID NO: 12) and BAG-2 (SEQ ID NO: 14) are aligned and demonstrate their homology. Black and gray shaded areas indicate identical and similar amino acids, respectively.
【図１１】 図１１は、ＢＡＧ−ファミリータンパク質とＨｓｃ７０／ＡＴＰａｓｅとの相
互作用を実証するアッセイを示す。（Ａ）その示された融合タンパク質を発現す
る酵母を使用するツーハイブリッドアッセイ。青色は、ｌａｃＺレポーター遺伝
子の活性を生じる、陽性相互作用を示す。（Ｂ）ＧＳＴ融合タンパク質および35 Ｓ標識化インビトロ翻訳タンパク質を使用する、インビトロタンパク質アッセイ
。（Ｃ）抗Ｆｌａｇ抗体またはＩｇＧ１コントロール抗体、およびＦｌａｇタグ
化した、ＢＡＧ−１（配列番号２の残基１１６で開始する）、ＢＡＧ−２（配列
番号４）、ＢＡＧ−３（配列番号６）、ＤａｘｘまたはＡｐａｆ−１を発現する
２９３Ｔ細胞由来の溶解物を使用する、共免疫沈降アッセイ。FIG. 11 shows an assay demonstrating the interaction of Bsc-family proteins with Hsc70 / ATPase. (A) Two-hybrid assay using yeast expressing the indicated fusion protein. Blue indicates a positive interaction resulting in the activity of the lacZ reporter gene. (B) In vitro protein assay using GST fusion protein and 35 S-labeled in vitro translated protein. (C) Anti-Flag or IgG1 control antibody and Flag-tagged BAG-1 (starting at residue 116 of SEQ ID NO: 2), BAG-2 (SEQ ID NO: 4), BAG-3 (SEQ ID NO: 6) Co-immunoprecipitation assay using lysates from 293T cells expressing Daxx or Apaf-1.
【図１２】 図１２は、Ｈｓｃ７０／ＡＴＰａｓｅとのＢＡＧ−ファミリータンパク質相互
作用の表面プラズモン共鳴分析を示す。（Ａ）精製組換えタンパク質のＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析。（Ｂ）最大に結合したＨｓｃ７０／ＡＴＰａｓｅを有する、また
は有さない固定化されたＢＡＧタンパク質を含むバイオセンサーチップの代表的
なＳＰＲ結果。FIG. 12 shows a surface plasmon resonance analysis of BAG-family protein interaction with Hsc70 / ATPase. (A) SDS- of purified recombinant protein
PAGE analysis. (B) Representative SPR results of a biosensor chip with immobilized BAG protein with or without Hsc70 / ATPase bound maximally.
【図１３】 図１３は、固定化された、ＢＡＧ−１（配列番号２の残基１１６で開始する）
、ＢＡＧ−１（ΔＣ）、ＢＡＧ−２（配列番号４）またはＢＡＧ−３（配列番号
６）タンパク質を含む、バイオセンサーチップの代表的なＳＰＲ結果を示す。Ｈ
ｓｃ７０／ＡＴＰａｓｅは、最大結合に到達するまでチップ上を流動し（矢印／
左）（応答ユニット）、次いでＨｓｃ７０／ＡＴＰａｓｅを用いずに流動を続け
る（矢印／右）。ＢＡＧ−４（配列番号４）およびＢＡＧ−３（配列番号６）に
ついて、Ｈｓｃ７０は、０．０１７５、０．０３５、０．０７、０．１４、およ
び０．２８μＭで注入した。FIG. 13. Immobilized, BAG-1 (starting at residue 116 of SEQ ID NO: 2).
1 shows representative SPR results of a biosensor chip containing BAG-1 (ΔC), BAG-2 (SEQ ID NO: 4) or BAG-3 (SEQ ID NO: 6) protein. H
sc70 / ATPase flows over the chip until maximum binding is reached (arrow /
Left) (response unit), then continue to flow without Hsc70 / ATPase (arrow / right). For BAG-4 (SEQ ID NO: 4) and BAG-3 (SEQ ID NO: 6), Hsc70 was injected at 0.0175, 0.035, 0.07, 0.14, and 0.28 μM.
【図１４】 図１４は、Ｈｓｃ７０シャペロン活性のＢＡＧ−ファミリータンパク質調節を
示す。（Ａ）ＢＡＧタンパク質およびＢＡＧ変異体タンパク質の非存在または存
在下での、Ｈｓｃ７０＋ＤｎａＪによって化学的に変性させたルシフェラーゼの
タンパク質再折り畳みアッセイ。（Ｂ）ＢＡＧ−ファミリータンパク質［ＢＡＧ
−１（配列番号２の残基１１６で開始する）、ＢＡＧ−２（配列番号４）、ＢＡ
Ｇ−３（配列番号６）］に起因するが、ＢＡＧ−変異体（ＢＡＧ−１（ΔＣ））
に起因しない、Ｈｓｃ７０媒介タンパク質再折り畳みの濃度依存性阻害。（Ｃ）
熱変性ルシフェラーゼのＨｓｃ７０／Ｈｓｃ４０媒介再折り畳みを、示されるよ
うに、１．８μＭ Ｈｉｐの存在下（黒棒）または非存在下（斜線棒）で、種々
のＢＡＧ−ファミリータンパク質（１．８μＭ）を用いて（レーン３〜１０）、
または用いずに（レーン１、２）アッセイした（平均±；ｎ＝３）。Ｈｓｃ７０
を等量のＢＳＡと置き換きかえたコントロール（ＣＮＴＬ）を示す（レーン１）
。FIG. 14 shows BAG-family protein regulation of Hsc70 chaperone activity. (A) Protein refolding assay of luciferase chemically denatured by Hsc70 + DnaJ in the absence or presence of BAG protein and BAG variant protein. (B) BAG-family protein [BAG
-1 (starting at residue 116 of SEQ ID NO: 2), BAG-2 (SEQ ID NO: 4), BA
G-3 (SEQ ID NO: 6)], but a BAG-mutant (BAG-1 (ΔC))
Concentration-dependent inhibition of Hsc70-mediated protein refolding not due to. (C)
Hsc70 / Hsc40-mediated refolding of heat-denatured luciferase was performed with various BAG-family proteins (1.8 μM) in the presence (black bars) or absence (shaded bars) of 1.8 μM Hip as shown. Using (lanes 3-10)
Or without (lanes 1 and 2) (mean ±; n = 3). Hsc70
Shows a control (CNTL) in which was replaced by an equivalent amount of BSA (lane 1)
.
【図１５Ａ】 図１５Ａは、ヒトＢＡＧ−３タンパク質の伸長させたｃＤＮＡ配列（配列番号
１９）を示す。FIG. 15A shows the extended cDNA sequence of human BAG-3 protein (SEQ ID NO: 19).
【図１５Ｂ】 図１５Ｂは、図１５ＡのヒトＢＡＧ−３タンパク質の対応するアミノ酸残基（
配列番号２０）を示す。FIG. 15B shows the corresponding amino acid residues of the human BAG-3 protein of FIG. 15A (
SEQ ID NO: 20) is shown.
【図１５Ｃ】 図１５Ｃは、図１５ＡのヒトＢＡＧ−３タンパク質のその対応するアミノ酸残
基（配列番号２０）と共に整列化した、その伸長させたｃＤＮＡ配列（配列番号
１９）を示す。FIG. 15C shows the extended cDNA sequence (SEQ ID NO: 19) of the human BAG-3 protein of FIG. 15A, aligned with its corresponding amino acid residues (SEQ ID NO: 20).
【図１６Ａ】 図１６Ａは、ヒトＢＡＧ−４タンパク質の伸長させたｃＤＮＡ配列（配列番号
２１）を示す。FIG. 16A shows the extended cDNA sequence of human BAG-4 protein (SEQ ID NO: 21).
【図１６Ｂ】 図１６Ｂは、図１６ＡのヒトＢＡＧ−４タンパク質の対応するアミノ酸残基（
配列番号２２）を示す。FIG. 16B shows the corresponding amino acid residues of the human BAG-4 protein of FIG. 16A (
SEQ ID NO: 22) is shown.
【図１６Ｃ】 図１６Ｃは、図１６ＡのヒトＢＡＧ−４タンパク質のその対応するアミノ酸残
基（配列番号２２）と共に整列化した、その伸長させたｃＤＮＡ配列（配列番号
２１）を示す。FIG. 16C shows the extended cDNA sequence (SEQ ID NO: 21) of the human BAG-4 protein of FIG. 16A, aligned with its corresponding amino acid residue (SEQ ID NO: 22).
【図１７Ａ】 図１７Ａは、ヒトＢＡＧ−５タンパク質の伸長させたｃＤＮＡ配列（配列番号
２３）を示す。FIG. 17A shows the extended cDNA sequence of human BAG-5 protein (SEQ ID NO: 23).
【図１７Ｂ】 図１７Ｂは、図１７ＡのヒトＢＡＧ−５タンパク質の対応するアミノ酸残基（
配列番号２４）を示す。FIG. 17B shows the corresponding amino acid residues of the human BAG-5 protein of FIG. 17A (
SEQ ID NO: 24) is shown.
【図１７Ｃ】 図１７Ｃは、図１７ＡのヒトＢＡＧ−５タンパク質のその対応するアミノ酸残
基（配列番号２４）と共に整列化した、その伸長させたｃＤＮＡ配列（配列番号
２３）を示す。FIG. 17C shows the extended cDNA sequence (SEQ ID NO: 23) of the human BAG-5 protein of FIG. 17A, aligned with its corresponding amino acid residue (SEQ ID NO: 24).
【図１８】 図１８は、以下のＢＡＧ−ファミリータンパク質のトポロジーを示す；ヒトＢ
ＡＧタンパク質、ＢＡＧ−１（配列番号２）、ＢＡＧ−２（配列番号４）、伸長
ＢＡＧ−３（配列番号２０）、伸長ＢＡＧ−４（配列番号２２）、伸長ＢＡＧ−
５（配列番号２４）；Ｓ．ｐｏｍｂｅ ＢＡＧ−１Ａ（配列番号１６）およびＢ
ＡＧ−１Ｂ（配列番号１８）；ならびにＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ＢＡＧ−１（配列
番号１２）およびＢＡＧ−２（配列番号１４）。ＢＡＧドメインの相対的な位置
を黒色で示し、ユビキチン様領域を、灰色で示し、ＷＷドメインを、斜線で示す
。核質様各局在配列もまた示される。FIG. 18 shows the topology of the following BAG-family proteins; human B
AG protein, BAG-1 (SEQ ID NO: 2), BAG-2 (SEQ ID NO: 4), extended BAG-3 (SEQ ID NO: 20), extended BAG-4 (SEQ ID NO: 22), extended BAG-
5 (SEQ ID NO: 24); pombe BAG-1A (SEQ ID NO: 16) and B
AG-1B (SEQ ID NO: 18); elegans BAG-1 (SEQ ID NO: 12) and BAG-2 (SEQ ID NO: 14). The relative position of the BAG domain is shown in black, the ubiquitin-like region is shown in gray, and the WW domain is shown in oblique lines. The nucleoplasmic localization sequences are also shown.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 Ｃ０７Ｋ 14/435 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 14/395 14/47 14/435 16/14 14/47 16/18 16/14 Ｃ１２Ｐ 21/08 16/18 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｍ 33/53 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 2G045 AA26 AA34 AA35 AA40 DA12 DA13 DA14 DA36 DA78 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA06 DA03 DA06 EA04 GA11 HA12 HA15 4B063 QA01 QA19 QA20 QQ03 QQ08 QQ43 QR08 QR32 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 QX07 4B064 AG27 CA02 CA10 CA19 CC24 DA05 DA14 4C084 AA07 AA13 BA01 BA02 BA21 BA22 CA05 CA18 CA51 CA62 ZB26 ZC03 ZC41 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA15 CA40 CA50 DA76 EA28 EA51 FA72 FA74 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 43/00 C07K 14/435 4H045 C07K 14/395 14/47 14/435 16/14 14/47 16 / 18 16/14 C12P 21/08 16/18 C12Q 1/68 A C12P 21/08 G01N 33/15 Z C12Q 1/68 33/50 Z G01N 33/15 33/53 D 33/50 M 33/53 33 / 566 C12N 15/00 ZNAA 33/566 A61K 37/02 F-term (reference) 2G045 AA26 AA34 AA35 AA40 DA12 DA13 DA14 DA36 DA78 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA06 DA03 DA06 EA04 GA11 HA12 HA15 4B06QAQ Q19 Q19 Q19 QR32 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 QX07 4B064 AG27 CA02 CA10 CA19 CC24 DA05 DA14 4C084 AA07 AA13 BA01 BA02 BA21 BA22 CA05 CA18 CA51 CA62 ZB26 ZC03 ZC41 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA15 CA74 CA50 FA76 EA
Claims (34)
； Ｒ2は、独立して選択される７アミノ酸の群であり； Ｘ2は、荷電Ｒ基を有するアミノ酸であり； Ｒ3は、独立して選択される５アミノ酸の群であり； Ｘ3は、無極性Ｒ基を有するアミノ酸であり； Ｒ4は、独立して選択される３アミノ酸の群であり； Ｘ4は、荷電Ｒ基を有するアミノ酸であり； Ｒ5は、独立して選択される１アミノ酸であり； Ｘ5は、無極性Ｒ基を有するアミノ酸または非荷電Ｒ基を有するアミノ酸であ
り； Ｒ6は、独立して選択される１５アミノ酸の群であり； Ｘ6は、荷電Ｒ基を有するアミノ酸または非荷電Ｒ基を有するアミノ酸であり
； Ｒ7は、独立して選択される２アミノ酸の群であり； Ｘ7は、荷電Ｒ基を有するアミノ酸であり； Ｘ8は、荷電Ｒ基を有するアミノ酸であり； Ｒ9は、独立して選択される２アミノ酸の群であり； Ｘ9は、無極性Ｒ基を有するアミノ酸であり； Ｒ10は、独立して選択される３アミノ酸の群であり； Ｘ10は、非荷電Ｒ基を有するアミノ酸であり； Ｒ11は、独立して選択される２アミノ酸の群であり； Ｘ11は、無極性Ｒ基を有するアミノ酸であり；そして ＲCは、独立して選択される約１〜１００アミノ酸の群である、 化合物。1. A compound having the formula: RN-R1X1RTwoXTwoRThreeXThreeRFourXFourRFiveXFiveR6X6R7X7X8R9X9RTenXTenR11X 11 -RC Where RNIs a group of about 1-552 amino acids independently selected; R1Is a group of three amino acids independently selected; X1Is an amino acid having a charged R group or an amino acid having an uncharged R group
RTwoIs a group of independently selected 7 amino acids; XTwoIs an amino acid having a charged R group; RThreeIs a group of 5 amino acids independently selected; XThreeIs an amino acid having a non-polar R group; RFourIs a group of three amino acids independently selected; XFourIs an amino acid having a charged R group; RFiveIs an independently selected amino acid; XFiveIs an amino acid having a nonpolar R group or an amino acid having an uncharged R group
R; R6Is a group of 15 amino acids independently selected; X6Is an amino acid having a charged R group or an amino acid having an uncharged R group
R7Is a group of two amino acids independently selected; X7Is an amino acid having a charged R group; X8Is an amino acid having a charged R group; R9Is a group of two amino acids independently selected; X9Is an amino acid having a non-polar R group; RTenIs a group of three amino acids independently selected; XTenIs an amino acid having an uncharged R group; R11Is a group of two amino acids independently selected; X11Is an amino acid having a non-polar R group; and RCIs a group of about 1-100 amino acids independently selected.
号９、配列番号１９、配列番号２１および配列番号２３からなる群から選択され
るヌクレオチド配列からの少なくとも２０ヌクレオチドに対応するかまたは相補
的なヌクレオチド配列を有する、実質的に精製された核酸分子。2. at least 20 nucleotides from a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 23 A substantially purified nucleic acid molecule having a nucleotide sequence corresponding to or complementary to:
号１０、配列番号２０、配列番号２２および配列番号２４からなる群から選択さ
れる機能的に活性なＢＡＧファミリータンパク質をコードするヌクレオチド配列
に対応するかまたは相補的なヌクレオチド配列を有する、請求項２に記載の核酸
。3. A functionally active BAG family selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 24 3. The nucleic acid of claim 2, having a nucleotide sequence corresponding to or complementary to a nucleotide sequence encoding a protein.
号９、配列番号１９、配列番号２１および配列番号２３からなる群より選択され
る、請求項３に記載の核酸。4. The method according to claim 3, which is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, and SEQ ID NO: 23. Nucleic acids.
号１０、配列番号２０、配列番号２２および配列番号２４からなる群から選択さ
れる機能的に活性なＢＡＧタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相補的で
ある、請求項３に記載の核酸。5. A functionally active BAG protein selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 24 4. The nucleic acid of claim 3, which is complementary to a nucleotide sequence encoding
た核酸分子。6. A substantially purified nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
た核酸分子。7. A substantially purified nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
た核酸分子。8. A substantially purified nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
た核酸分子。9. A substantially purified nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9.
された核酸分子。10. A substantially purified nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19.
された核酸分子。11. A substantially purified nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21.
された核酸分子。12. A substantially purified nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23.
に精製されたＢＡＧファミリータンパク質。13. A substantially purified BAG family protein encoded by the nucleic acid molecule of claim 1.
番号１０、配列番号２０、配列番号２２および配列番号２４からなる群から選択
されるアミノ酸配列を含む実質的に精製されたＢＡＧファミリータンパク質、ま
たはそのフラグメント、誘導体もしくは模倣物。14. Substantially comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 24 A purified BAG family protein, or a fragment, derivative or mimetic thereof.
実質的に精製されたタンパク質。15. Corresponding to the amino acid sequence of 157 to 204 of SEQ ID NO: 2,
A substantially purified protein.
実質的に精製されたタンパク質。16. Corresponding to the amino acid sequence of 272 to 319 of SEQ ID NO: 2,
A substantially purified protein.
実質的に精製されたタンパク質。17. Corresponding to the amino acid sequence of 164 to 211 of SEQ ID NO: 4,
A substantially purified protein.
、実質的に精製されたタンパク質。18. A substantially purified protein corresponding to the amino acid sequence of 418 to 510 of SEQ ID NO: 20.
、実質的に精製されたタンパク質。19. A substantially purified protein corresponding to the amino acid sequence of 378-457 of SEQ ID NO: 22.
的に精製されたタンパク質。20. A substantially purified protein corresponding to the amino acid sequence from 6 to 97 of SEQ ID NO: 24.
、実質的に精製されたタンパク質。21. A substantially purified protein corresponding to the amino acid sequence from 180 to 257 of SEQ ID NO: 24.
、実質的に精製されたタンパク質。22. A substantially purified protein corresponding to the amino acid sequence of 272 to 349 of SEQ ID NO: 24.
、実質的に精製されたタンパク質。23. A substantially purified protein corresponding to the amino acid sequence of 362 to 444 of SEQ ID NO: 24.
ホルモンレセプター機能を調節するために有用な、請求項１に記載の核酸分子を
含む、薬学的組成物。24. A pharmaceutical composition comprising the nucleic acid molecule of claim 1, useful for modulating tumor cell growth, cell migration and metastasis, and steroid hormone receptor function.
細胞増殖、細胞移動および転移、ならびにステロイドホルモンレセプター機能を
調節する方法。25. A method of modulating tumor cell growth, cell migration and metastasis, and steroid hormone receptor function by administering the nucleic acid molecule of claim 1.
ホルモンレセプター機能を調節するために有用な、配列番号２、配列番号４、配
列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号２０、配列番号２２および配列
番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはそのフラグメント、誘
導体もしくは模倣物からなる、実質的に精製されたＢＡＧファミリータンパク質
を含む薬学的組成物。26. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20 useful for modulating tumor cell growth, cell migration and metastasis, and steroid hormone receptor function A pharmaceutical composition comprising a substantially purified BAG family protein consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 24, or a fragment, derivative or mimetic thereof.
、腫瘍細胞増殖を調節する、方法。27. A method of modulating tumor cell growth by administering the pharmaceutical composition of claim 26.
、細胞移動および転移を調節する、方法。28. A method of regulating cell migration and metastasis by administering the pharmaceutical composition of claim 26.
、ステロイドホルモンレセプター機能を調節する、方法。29. A method of modulating steroid hormone receptor function by administering a pharmaceutical composition according to claim 26.
に結合する、実質的に精製された抗体。30. A substantially purified antibody that specifically binds to the BAG family protein of claim 14.
の抗体。31. The antibody according to claim 30, wherein said antibody is a monoclonal antibody.
るための方法であって、以下の工程： ａ．該サンプルを得る工程； ｂ．請求項１１に記載の抗体の該ＢＡＧファミリータンパク質との結合に適切
な条件下で、該抗体に添加する工程；および ｃ．該結合したＢＡＧファミリータンパク質を検出する工程、 を包含する、方法。32. A method for detecting the presence of a BAG family protein in a sample, comprising the steps of: a. Obtaining said sample; b. Adding the antibody of claim 11 to said antibody under conditions suitable for binding to said BAG family protein; and c. Detecting the bound BAG family protein.
する第１の核酸分子の存在を検出するための方法であって、以下の工程； ａ．該サンプルを得る工程； ｂ．該サンプルに、該第１の核酸分子とハイブリダイズし得る第２の核酸分子
を、該第２の核酸分子の該第１の核酸分子との結合に適切な条件下で、添加する
工程；および ｃ．該ハイブリダイズした第１および第２の核酸分子を検出する工程、 を包含する、方法。33. A method for detecting the presence of a first nucleic acid molecule encoding a BAG family protein in a sample, comprising the steps of: a. Obtaining said sample; b. Adding to said sample a second nucleic acid molecule capable of hybridizing with said first nucleic acid molecule under conditions suitable for binding of said second nucleic acid molecule to said first nucleic acid molecule; and c. Detecting the hybridized first and second nucleic acid molecules.
ファミリータンパク質の発現のレベルを決定することによって決定する、方法。34. The risk or prognosis of metastatic spread of cancer in a cancer patient by BAG
A method, as determined by determining the level of expression of a family protein.
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