JP2002523015A

JP2002523015A - ヒトボールトｒｎａ

Info

Publication number: JP2002523015A
Application number: JP2000537986A
Authority: JP
Inventors: レオナルドエイチ．ローム，; バレリーエイ．キックホーファー，
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1998-03-27
Filing date: 1999-03-26
Publication date: 2002-07-30
Also published as: EP1090110A2; US6110740A; WO1999049025A3; WO1999049025A2; AU3210099A; AU763574B2; CA2324345A1

Abstract

(57)【要約】ヒトボールト会合ｖＲＮＡまたはその相補鎖をコードするポリヌクレオチド。ヒトボールトＲＮＡ、またはその相補鎖から本質的になる精製および単離されたポリヌクレオチド分子、あるいはヒトボールトＲＮＡおよびその相補鎖から本質的になるヌクレオチド配列の組合せ。多剤耐性の癌を患う患者を診断する方法。多剤耐性の癌を患う患者を処置する方法。ヒトボールト会合ｖＲＮＡとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、多剤耐性の癌を処置するための組成物。多剤耐性の癌を患う患者を処置するための組成物についてスクリーニングする方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（連邦政府により援助された研究または開発に関する陳述）本発明は、国立衛生研究所により授与された、助成金番号ＧＭ３８０９７の
下での政府の援助によりなされた。米国政府は、本発明に特定の権利を有する。

【０００２】（関連出願の相互参照）本出願は、１９９８年３月２７日に出願され、「ヒトボールト（ｖａｕｌｔ）
ＲＮＡ」と表題を付された、同時係属米国特許出願第６０／０７９，６３４号の
一部継続出願である。

【０００３】（背景）癌は、米国における罹患率および死亡率の主要な原因である。癌の処置は、一
般に、化学療法、放射線治療および手術を含む。あいにく、ほとんどの癌は、化
学療法を使用して治療され得ない。なぜなら、腫瘍細胞は、時間の経過とともに
いくつかの化学療法剤に対して耐性を発生する傾向があるからである。これらの
癌は、「多剤耐性の癌」（ＭＤＲ）といわれる。

【０００４】多数のタンパク質の過剰発現が、ＭＤＲ細胞株と関連していることが見出され
ており、このタンパク質としては、Ｐ糖タンパク質（Ｐｇｐ）および多剤耐性関
連タンパク質（ＭＲＰ）が挙げられる。これらのタンパク質は、細胞傷害性薬物
の流出ポンプとして作用することによって、薬物耐性を媒介するようである。し
かし、Ｐ糖タンパク質または多剤耐性関連タンパク質のいずれかの過剰発現と関
連しない多数のＭＤＲ癌細胞株が、公知である。

【０００５】最近、Ｐ糖タンパク質または多剤耐性関連タンパク質のいずれかを過剰発現し
ないＭＤＲ腫瘍細胞株において過剰発現されるタンパク質が記載されている。こ
のタンパク質は、本来、そのタンパク質が本来同定された細胞株を参照して、肺
耐性関連タンパク質（ＬＲＰ）と名付けられた。しかし、一旦肺耐性関連タンパ
ク質についてのｃＤＮＡが単離され、そして対応するタンパク質配列が明らかに
されると、肺耐性関連タンパク質は、以前に公知のタンパク質であるヒト主要ボ
ールトタンパク質（ＭＶＰ）であることが見出された。

【０００６】ボールトは、実質的に全ての高等生物においてかつほとんどの正常組織におい
て見出される、大きなバレル形状の多サブユニットの細胞質リボ核タンパク質小
器官である。哺乳動物のボールトは、ラットにおいて、およそ２１０ｋＤａ、１
９３ｋＤａおよび１０４ｋＤａ（ＭＶＰ）、ならびに小ＲＮＡ（ｖＲＮＡ）の分
子量を、１：１：２４：４の相対的なモル比で有する、３つのタンパク質からな
る。ヒトボールトＲＮＡは、まだ特徴付けされていない。

【０００７】ＭＶＰは、多数の非ＰｇｐＭＤＲ腫瘍細胞株において過剰発現されることが
示されており、これには、ＳＷ１５７３／２Ｒ１２０（非小細胞肺癌）、ＧＬＣ
４／ＡＤＲ（小細胞肺癌）、ＭＤＦ−７／ＭＲ（乳癌）、および８２２６／ＭＲ
２０（骨髄腫）細胞株が挙げられる。さらに、薬物の非存在下で培養することに
よって単離された復帰変異細胞株は、ＭＶＰの発現を下方制御する。しかし、ト
ランスフェクション研究は、ＭＶＰｃＤＮＡ単独の過剰発現が薬物耐性の表現
型を付与するに十分ではないことを示した。

【０００８】従って、多剤耐性の癌を標的とする薬剤についての必要性が残ったままである
。さらに、多剤耐性の癌を処置するための方法に必要性が残ったままである。さ
らに、ヒトボールトＲＮＡを特徴付けするための必要性が残ったままである。

【０００９】（要約）本発明の１つの実施態様に従って、配列番号１、配列番号２、配列番号３また
はそれらの相補鎖に示されるような配列を有するポリヌクレオチドを含む、ヒト
ボールト関連ｖＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが提供される。本発明の別
の実施態様に従って、配列番号４またはその相補鎖に示されるような配列を有す
る精製および単離されたポリヌクレオチド分子が提供される。

【００１０】本発明の別の実施態様に従って、ヒトボールトｖＲＮＡまたはその相補鎖から
本質的になる精製および単離されたポリヌクレオチド分子、あるいはヒトボール
トｖＲＮＡおよびその相補鎖から本質的になるヌクレオチド配列の組合せを提供
する。

【００１１】本発明のさらに別の実施態様に従って、多剤耐性の癌を患う患者を診断する方
法が提供され、この方法は、最初に患者由来の組織および液体のサンプルを提供
することおよび患者サンプル中のヒトボールト関連ｖＲＮＡのレベルを決定する
ことを包含する。次いで、決定されたヒトボールト関連ｖＲＮＡのレベルは、多
剤耐性の癌を患う患者におけるヒトボールト関連ｖＲＮＡの公知の範囲のレベル
と比較される。決定されたヒト関連ボールト関連ｖＲＮＡのレベルが、多剤耐性
の癌を患う患者におけるヒトボールト関連ｖＲＮＡのレベルの範囲内である場合
、多剤耐性の癌の診断がなされる。

【００１２】本発明の別の実施態様に従って、多剤耐性の癌を患う患者を診断する方法が提
供され、この方法は、最初に患者由来の組織または液体のサンプルを提供するこ
とおよび患者サンプルにおけるボールトのレベルを決定することを包含する。次
いで、決定されたボールトのレベルは、多剤耐性の癌を患う患者におけるボール
トの公知の範囲のレベルと比較される。決定されるボールトのレベルが、多剤耐
性の癌を患う患者におけるボールトのレベルの範囲内である場合、多剤耐性の癌
の診断がなされる。

【００１３】本発明のなお別の実施態様に従って、多剤耐性の癌を患う患者を処置する方法
が提供され、この方法は、本明細書に開示される方法に従って、多剤耐性の癌を
患う患者を診断すること、および次いで、この患者を処置することを包含する。
この処置は、ヒトボールト関連ｖＲＮＡとハイブリダイズするポリヌクレオチド
（例えば、配列番号１の残基２１〜３８に相補的な配列、配列番号１の残基３９
〜５３に相補的な配列、および配列番号１の残基５０〜６５に相補的な配列番号
からなる群より選択されるポリヌクレオチド）を、患者に投与することを包含し
得る。

【００１４】さらに、本発明の別の実施態様は、ヒトボールト関連ｖＲＮＡとハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドを含む、多剤耐性の癌を患う患者を処置するための組成
物である。このポリヌクレオチドは、配列番号１の残基２１〜３８に相補的な配
列を有し得るか、または配列番号１の残基３９〜５３に相補的な配列を有し得る
か、または配列番号１の残基５０〜６５に相補的な配列を有し得るか、あるいは
これら上記の配列の組合せを有し得る。

【００１５】さらに、多剤耐性の癌を患う患者を処置するための組成物をスクリーニングす
る方法が提供される。この方法は、ｖＲＮＡとボールト粒子との会合を破壊する
組成物または処置を決定することを包含する。好ましい実施態様において、決定
されるこの組成物または処置は、ｖＲＮＡとボールト粒子の副ボールトタンパク
質との会合を破壊する。

【００１６】（詳細な説明）本発明は、ヒトボールトＲＮＡ（ｖＲＮＡ）のヌクレオチド配列およびヒトボ
ールトＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（ｈｖｇ）の解明を含む。さらに、
ボールト数と多剤耐性の表現型との間の関係が、決定される。次いで、これらの
配列およびこの関係は、多剤耐性の癌の処置のための組成物の調製において、多
剤耐性の癌を診断する方法において、および多剤耐性の癌を処置する方法におい
て利用される。

【００１７】（Ａ）ヒトボールトＲＮＡ配列およびヒトボールトＲＮＡをコードするヌクレ
オチド配列の決定および特徴付け）ヒトボールトＲＮＡ配列およびヒトボールトＲＮＡをコードするヌクレオチド
配列を、以下のように決定した。最初に、ヒトボールトＲＮＡをコードする遺伝
子を、λＦＩＸＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、Ｕ
Ｓ）ヒトゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離した
。合計６．２５×１０⁵の組換え体を、Ｋｉｃｋｈｏｅｆｅｒ，Ｖ．Ａ．ら（１
９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８、７８６８〜７８７３（その全体が本
明細書中に参考として援用される）に記載される技術に従って、無作為にプライ
ムされた部分的なヒトｖＲＮＡ遺伝子を使用してスクリーニングした。ラットと
ウシガエルのｖＲＮＡ配列間の比較は、塩基１１〜２７および塩基１１０〜１２
９（ラットｖＲＮＡ配列に基づく）が保存されることを示した。これらの保存さ
れた領域に対するプライマーを、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＤＮ
Ａ合成機で合成し、そしてゲノムＤＮＡからの部分的なヒトｖＲＮＡ遺伝子のポ
リメラーゼ連鎖反応に使用した。この精製されたポリメラーゼ連鎖反応産物を、
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ⁺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にサブクローニン
グし、そしてＳｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｕ．Ｓ．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ
．）を使用してジデオキシ方法により配列決定した。これらの部分的なヒトｖＲ
ＮＡ遺伝子を、ハイブリダイゼーションプローブとして使用した。

【００１８】２つのクローン、番号１および４を同定し、そしてプラーク精製した。サザン
ブロット分析に基づいて、３５０塩基のＳａｃＩフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔＳＫ⁺中にサブクローニングして、そして配列決定して、ｈｖｇ１
（配列番号１）と命名される配列を生じた。サブクローニングおよび配列決定分
析は、互いに約７ｋ塩基対内に、第２のクローン（番号４）が、ｈｖｇ２と命名
された（配列番号２）およびｈｖｇ３と命名された（配列番号３）、という２つ
のｖＲＮＡ遺伝子を含むことを示した。この配列は、ＧｅｎＢａｎｋ^TMに提出さ
れ、そして、ｈｖｇ１、ｈｖｇ２およびｈｖｇ３それぞれについて、登録番号Ａ
Ｆ０４５１４３、ＡＦ０４５１４４、およびＡＦ０４５１４５が与えられた。こ
れらの配列を使用して、ＧｅｎＢａｎｋ^TMデータベースの検索を、関連配列につ
いて実行して、そしてヒトｖＲＮＡ遺伝子ファミリーの１つのさらなるメンバー
を、Ｘ染色体上（本発明者らがｈｖｇ４と命名した、番号Ｚ９７０５４の登録塩
基５８３９２〜５８４９２）に同定した。これらの４つのヒトｖＲＮＡをコード
する４つの遺伝子の配列は、以下である：配列番号１（ＡＦ０４５１４３、ｈｖｇ１）：

【００１９】

【化１】配列番号２（ＡＦ０４５１４４、ｈｖｇ２）：

【００２０】

【化２】配列番号３（ＡＦ０４５１４５、ｈｖｇ３）

【００２１】

【化３】配列番号４（Ｚ９７０５４の塩基５８３９２〜５８４９２、ｈｖｇ４）

【００２２】

【化４】この４つのヒトｖＲＮＡ（ｈｖｇ１ｖＲＮＡ、ｈｖｇ２ｖＲＮＡ、ｈｖｇ３
ｖＲＮＡおよびｈｖｇ４ｖＲＮＡ）は、それらのそれぞれのコード遺伝子
に対して相補的な配列を有する。

【００２３】ここで図１を参照すると、ｈｖｇ１、およびｈｖｇ３の比較が示される。同一
塩基は、ダッシュにより示される。アステリスクは、欠失を示す。理解され得る
ように、ｈｖｇ１は、９６塩基長であり、一方ｈｖｇ２およびｈｖｇ３は、８８
塩基長である。さらに、ｈｖｇ１、ｈｖｇ２およびｈｖｇ３は、互いに約８４％
の同一性を共有する。３つのヒトｖＲＮＡ遺伝子の全ては、ｈｖｇ１配列に基づ
いて、それぞれ、塩基１１〜２０および塩基６５〜７５に位置する、内部ＲＮＡ
ポリメラーゼＩＩＩ型プロモーターエレメントを含む。

【００２４】（Ｂ）非Ｐｇｐ多剤耐性細胞株におけるヒトｖＲＮＡレベルの決定）次いで、ヒトｖＲＮＡのレベルを、いくつかの非Ｐｇｐ多剤耐性細胞株におい
て決定した。初めに、いくつかの多剤耐性細胞株を、以下のように維持した。Ｓ
Ｗ１５７３／２Ｒ１２０（非小細胞肺癌）、およびＧＬＣ４／ＡＤＲ（小細胞肺
癌）を、それぞれ、１１５ｎＭおよび１１５６ｎＭのドキソルビシンの存在下で
、１週間当たり１回培養した。同様に、ＭＣＦ−７／ＭＲ（乳癌細胞）および８
２２６／ＭＲ４、８２２６／ＭＲ２０（骨髄腫細胞）を、それぞれ、８０ｎＭ、
４０ｎＭ、２００ｎＭのミトキサントロンの存在下で、１週間当たり２回培養し
た。薬物感受性ＳＷ１５７３、ＧＬＣ４／Ｓ、ＭＤＦ−７、および８２２６／Ｓ
細胞を、１０％仔ウシ血清および抗生物質を補充した、ＲＰＭＩ１６４０培地
中で増殖させた。

【００２５】次いで、抽出物を、以下のような、種々の薬物感受性細胞株、薬物耐性細胞株
、および薬物復帰細胞株の細胞下（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）画分により調製し
た。１×１０⁸の細胞を収集して、計数して、０．５％のＮｏｎｉｄｅｔＰ−
４０、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフッ化物、およびプロテアーゼインヒ
ビター混合物（２μｇ／ｍｌアプロチニン、０．５ｍＭベンズアミジン、２
ｍｇ／ｍｌキモスタチン、５μＭロイペプチン、５μＭペプスタチン）を
含有する、５ｍｌの冷緩衝液Ａ（５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４）、１
．５ｍＭＭｇＣｌ₂および７５ｍＭＮａＣｌ）中に再懸濁した。全ての引き
続く工程を、４℃で実行した。細胞をボルテックスして、氷上で５分間インキュ
ベートして、そして２０，０００×ｇで２０分間遠心分離した。除核液（ｐｏｓ
ｔｎｕｃｌｅａｒ）を、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した。得られた上
清を、Ｓ１００画分と命名した。核ペレット、Ｎ画分、および１００，０００×
ｇペレット、Ｐ１００画分を、１０％グリセロール、１ｍＭフェニルメチルスル
ホニルフッ化物、およびプロテアーゼインヒビターをその本来の容量で含む緩衝
液Ａ中でＤｏｕｎｃｅホモジナイゼーションにより再懸濁した。等容量の画分を
、タンパク質含量およびＲＮＡ含量について分析した。次いで、ＧＬＣ４／ＡＤ
ＲＰ１００画分を、緩衝液Ａにおける２０／３０／４０／４５／５０／６０％
スクロース段階勾配（それぞれ、各層にＬ／２／２／２／２／１ｍｌを含む）に
適用し、そしてＢｅｃｋｍａｎＳＷ−４１ローターで１６時間２８，０００ｒ
ｐｍで遠心分離した。これらの条件下で、インタクトなボールト粒子は、４０／
４５％スクロース層に位置した。各層の勾配画分を収集して、緩衝液Ａで４倍に
希釈して、そして１００，０００×ｇで３時間遠心分離した。ペレットを、緩衝
液Ａ中に再懸濁して、そしてタンパク質含量およびＲＮＡ含量の両方について分
析した。

【００２６】次いで、タンパク質サンプルを、ＳＤＳサンプルローディング緩衝液中に可溶
化して、７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動上で分画して、そして
電気ブロッティングによりＨｙｂｏｎｄ−Ｃ（ＡｍｅｒｓｈａｍＣｏｒｐ．）
に転写した。ウエスタンブロットを、確立された手順に従って、抗ラットボール
トポリクローナル抗体（Ｎ２）を使用して実行した。反応性バンドを、増強した
化学発光系（ＡｍｅｒｓｈｍＣｏｒｐ．）を使用して検出した。細胞画分から
のＲＮＡを、フェノール（ｐｈｅｎｏ）／クロロホルム抽出およびエタノール沈
澱により精製した。総ＲＮＡを、グアニジニウム−フェノール法により単離した
。続いて、このＲＮＡを、８Ｍ尿素、１０％ポリアクリルアミドゲルにより分画
して、そしてＺｅｔａＧＴメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に電気ブロットした
。このメンブレンを、無作為にプライムしたヒトｖＲＮＡ遺伝子プローブ（ｈｖ
ｇ１、比活性１×１０⁹ｃｐｍ／μｇ）を用いてハイブリダイズした。ハイブリ
ダイゼーションを、製造業者の推奨に従い実行した。ハイブリダイズしたバンド
を、オートラジオグラフィーにより検出した。反応性バンドの定量（タンパク質
またはＲＮＡのいずれか）を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウエアを使用してＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓＰｅｒｓｏｎａｌＤｅｎｓｉｔｏｍｅ
ｔｅｒＳＩで走査することによって実行した。表Ｉにおける倍数の変化を、Ｇ
ＬＣ４データのセット（これは、以前に公開された値と適合した）を除いて、複
数のデータのセットから算定した。

【００２７】これらの細胞下分画技術を使用して、１００，０００×ｇのボールトペレット
、Ｐ１００画分、および全てのＭＶＰを、この画分と会合させ、そしてボールト
にアセンブリした。対照的に、総細胞性ｖＲＮＡ画分の一部のみが、ボールトと
会合するＰ１００画分に分画する。この非ボールト会合ｖＲＮＡは、可溶性画分
またはＳ１００画分に分画する。

【００２８】ここで図２を参照すると、分画された８２２６／ＭＲ４細胞において、ｈｖｇ
１ｖＲＮＡ、ｈｖｇ２ｖＲＮＡおよびｈｖｇ３ｖＲＮＡのノーザンブロッ
トが示される。理解され得るように、ｈｖｇ１ｖＲＮＡは、ボールト会合Ｐ１
００画分および非ボールト会合Ｓ１００画分の両方において存在する。対照的に
、ｈｖｇ２ｖＲＮＡおよびｈｖｇ３ｖＲＮＡは、非ボールト会合Ｓ１００画
分にのみ存在する。

【００２９】ここで図３を参照すると、いくつかの細胞株において、総ｈｖｇ１ｖＲＮＡ
、ｈｖｇ２ｖＲＮＡおよびｈｖｇ３ｖＲＮＡのノーザンブロットが示される
。理解され得るように、ｈｖｇ１ｖＲＮＡは、全ての試験した細胞株において
存在し（レーン１〜１０の上方）、一方ｈｖｇ２ｖＲＮＡおよびｈｖｇ３ｖ
ＲＮＡの両方は、試験された１０個の細胞株の５個にのみ存在した（レーン４〜
８の下方）。

【００３０】従って、複数のヒトｖＲＮＡが存在するが、本発明者らは、ｈｖｇ１によりコ
ードされる形態のみが全ての細胞株に一貫して存在して、そして１００，０００
×ｇでペレットにする（ｐｅｌｔ）ことにより明らかであるように、ボールト粒
子と一貫して会合することを決定した。対照的に、ｈｖｇ２およびｈｖｇ３によ
りコードされるｖＲＮＡは、全ての細胞株に存在せず、そしてボールトと一貫し
て会合しないが、それらは、いくつかのＭＤＲ細胞株（例えば、ＭＤＲＨｅＬ
ａ細胞）においてボールトと会合する（データは示さず）。しかし、これらの株
由来のゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析は、３つの遺伝子の全てが一様に存在すること
を示す（データは示さず）。

【００３１】（Ｃ）非Ｐｇｐ多剤耐性におけるヒトボールトレベルの決定：）次に、親細胞株におけるヒトボールトのレベルを、精製したラット肝臓ボール
ト（０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、および０．２５μｇ）に対する
、レーン当たり４×１０⁸細胞からのＰ１００画分のタンパク質レベルの比較に
より決定した。ウエスタン分析および定量を、本明細書中に記載されるように実
行した。ボールトの標準曲線を作成して、そして直線回帰分析を使用して、親細
胞株における１つの細胞当たりのボールト粒子数を推定した。薬物耐性細胞株お
よび薬物復帰変異細胞株についてのボールトを、表Ｉにおいて決定された倍数の
変化を使用して算定した。

【００３２】ここで図４を参照すると、Ｎ画分、Ｐ１００画分およびＳ１００に対する、分
画された小細胞肺癌細胞ＧＬＣ４／Ｓ（親）、ならびにそれに由来する薬物耐性
細胞株ＧＬＣ４／ＡＤＲおよびそれに由来する薬物復帰変異細胞株ＧＬＣ４／Ｒ
ＥＶにおけるＭＶＰのウエスタンブロットが示される。理解され得るように、Ｍ
ＶＰは、ＧＬＣ４／ＡＤＲ細胞およびＧＬＣ４／ＲＥＶ細胞の両方のＰ１００画
分と主に会合し、そしてＭＰＶレベルは、薬物耐性細胞株と比較した場合、薬物
復帰変異細胞株においての方がより低い（レーン６および９）。

【００３３】ここで図５を参照すると、ＲＮＡについて抽出されたＮ画分、Ｐ１００画分お
よびＳ１００に対する、分画された小細胞肺癌細胞ＧＬＣ４／Ｓ、ＧＬＣ４／Ａ
ＤＲおよびＧＬＣ４／ＲＥＶにおけるｈｖｇ１ｖＲＮＡのノーザンブロットが
示される。理解され得るように、ボールト会合ｈｖｇ１ｖＲＮＡは、親細胞株
から薬物耐性細胞株で、約１５倍増大した（レーン３および６）。さらに、薬物
耐性株において、非ボールト会合Ｓ１００画分からボールト会合Ｐ１００画分で
、ｈｖｇ１ｖＲＮＡの存在下でシフトが存在した（レーン５および６）。これ
は、ｈｖｇ１ｖＲＮＡの漸増画分が親株においてよりも薬物耐性株において、
ボールトと会合することを示す。同様に、ボールト会合ｈｖｇ１ｖＲＮＡレベ
ルは、薬物耐性細胞株と比較した場合、薬物復帰変異細胞株においての方が低か
った（レーン６および９）。さらに、ＭＶＰおよびｈｖｇ１ｖＲＮＡレベルの
両方が、薬物耐性細胞株と比較して薬物復帰変異細胞株において匹敵するレベル
に減少した（表Ｉ）。

【００３４】ここで図６を参照すると、小細胞肺癌細胞ＧＬＣ４／Ｓ、ＧＬＣ４／ＡＤＲお
よびＧＬＣ４／ＲＥＶの１０μｇにおける総ｈｖｇ１ｖＲＮＡのノーザンブロ
ットが示される。理解され得るように、総ｖＲＮＡレベルは、この３つの細胞株
において一定のままであった。従って、薬物復帰変異細胞株および薬物耐性細胞
株におけるｖＲＮＡとボールトとの増大した会合は、ｖＲＮＡ遺伝子の転写にお
ける増大に起因しない。さらに、総ｖＲＮＡの約２０％のみが、これらのＭＤＲ
癌細胞株においてボールト粒子と会合する（データは示さず）。従って、薬物耐
性細胞株において生じるボールト粒子の総数における増大は、総ｖＲＮＡプール
のボールト会合画分における増大を生じる。対応して、薬物復帰変異細胞株にお
いて、薬物耐性細胞株と比較した場合、総ｖＲＮＡプールのボールト会合画分に
おける減少が存在するが、しかし親細胞株に対しては増大する。さらに、ＵＶ架
橋研究は、ｖＲＮＡが副ボールトタンパク質と主に相互作用して、そしてＭＶＰ
と相互作用しないことを示した（データは示さず）。

【００３５】ここで図７を参照すると、スクロース平衡化勾配におけるＭＶＰレベルのウエ
スタンブロットを示し、ここでレーン１〜６は、それぞれ、充填２０、３０、４
０、４５、５０および６０％の層に対応し、そしてレーン７は、ＧＬＣ／４／Ａ
ＤＲＰ１００画分の層に対応する。レーンＭは、ＮｏｖａｇｅｎｔＰｅｒｆ
ｅｃｔＰｒｏｔｅｉｎＭａｒｋｅｒである。ここで図８を参照すると、図７
の勾配画分から抽出されたＲＮＡ（レーン１〜６）および総ＲＮＡＳＷ１５７
３１標準物（レーン７）のノーザンブロットが示される。理解され得るように、
ＭＶＰおよびｖＲＮＡの大部分は４５％層に存在し、これは精製されたボールト
粒子の以前に公開された挙動と一致しており、このことは、Ｐ１００画分におい
てみられたＭＶＰおよびｖＲＮＡの増大がアセンブルしたボールト粒子のレベル
を正確に反映することを確認する。従って、Ｐ１００画分におけるＭＶＰおよび
ｖＲＮＡレベルの変化は、ボールト粒子レベルがこの細胞株における薬物感受性
のレベルに依存して変化することを示す。

【００３６】４つのさらなるＭＤＲ細胞株（親細胞株および入手可能である場合には、薬物
復帰変異細胞株を含む）を試験した。これらは、ＳＷ１５７３／２Ｒ１２０およ
び２Ｒ１２０／ｒｅｖ（非小細胞肺癌）、８２２６／ＭＲ４および８２２６／Ｍ
Ｒ２０（骨髄腫細胞）ならびにＭＤＦ−７／ＭＲ細胞であった。

【００３７】ここで表Ｉを参照すると、それらのそれぞれの親細胞株におけるレベルとの６
つの試験された薬物耐性細胞株および薬物復帰変異細胞株の全てにおけるＰ１０
０画分のＭＶＰおよびｖＲＮＡレベルの比較を示し、ここで倍数の増大は、親細
胞株のレベルで除算された薬物耐性細胞株または薬物復帰変異細胞株のレベルと
して与えられる。

【００３８】表Ｉ薬物耐性細胞株および薬物復帰変異細胞株中のＭＰＶレベルおよびｖＲＮＡレ
ベルの親細胞株に対する増加

【００３９】

【表１】理解され得るように、親細胞株レベルに対して、耐性／復帰変異細胞株レベル
におけるＭＶＰレベルの１５倍もの増加、ならびに親細胞株レベルに対して耐性
／復帰変異細胞株レベルにおけるｖＲＮＡレベルの１３倍もの増加が存在した。
これらの結果は、薬物耐性細胞株および薬物復帰変異細胞株に関連する増加した
ＭＶＰが、１００，０００×ｇでペレット化され得る高分子形態（例えば、ボー
ルト）へと集合したことを示す。さらに、ＭＶＰのたった１．３倍の上方制御は
、８２２６／ＭＲ２０細胞株において薬物耐性表現型を付与するのに十分であっ
た。

【００４０】さらに、親細胞株におけるボールトのコピー数を、精製されたボールトの増加
量と比較したＰ１００画分中のタンパク質レベルの分析により決定した。ここで
、図９を参照すると、４つの親細胞株由来の各レーン４×１０³細胞のＰ１００
画分のウェスタンブロット（レーン１〜４）、および精製されたラット肝臓ボー
ルトの各レーン０．０５〜０．２５ｍｇのＰ１００画分のウェスタンブロット（
レーン５〜９に示す）を示している。これらの結果を表ＩＩに示す。

【００４１】表ＩＩボールト粒子のコピー数の評価

【００４２】

【表２】理解されるように、細胞当たりのボールトレベルが、試験された異なる細胞株
間でかなり変化しており、そしてより低いレベルの内因性ボールト粒子を有する
細胞株（ＧＬＣ４／ＳおよびＭＣＦ７／Ｓ）は、表Ｉにおいて見られるように最
高の倍の誘導を示した。表ＩＩに記載された細胞株の中で、ＧＬＣ４およびＳＷ
１５７３はドキソルビシンで選択したが、８８２６／ＳおよびＭＣＦ７／Ｓはミ
トキサントロンで選択した。ＧＬＣ４薬物耐性細胞株における非常に多数のボー
ルト（細胞当たり２４５，０００のボールト）は、この株が耐性である高濃度の
ドキソルビシン（１μＭ）を反映し得る。このドキソルビシンのレベルは、ＳＷ
１５７３耐性株を選択するために使用されるレベル（０．１μＭ）よりも１０倍
高く、ＳＷ１５７３耐性株は、細胞当たり３分の１のボールト数しか示さない。
ＧＬＣ４薬物復帰変異細胞株は、ボールト数が減少したが、このボールト数は、
なお親株の４倍を超えて高い。しかし、ＧＬＣ４薬物復帰変異細胞株は、ここで
１μＭのドキソルビシンによる殺傷に感受性であるが、０．１μＭのドキソルビ
シンにはなお耐性であり、従って、ＳＷ１５７３薬物復帰変異細胞株は、薬物感
受性に関しては、ＳＷ１５７３薬物復帰変異体よりもＳＷ１５７３薬物耐性細胞
株に、そして薬物感受性に関してはそれよりもＳＷ１５７３耐性株に類似してい
る。理解され得るように、ＧＬＣ４薬物復帰変異細胞株におけるボールトレベル
（７１，０００）は、ＳＷ１５７３薬物耐性細胞株におけるボールトレベル（８
５，０００）に類似している。従って、絶対的ボールトレベルは、薬物耐性の程
度を直接的に示すようである。

【００４３】（Ｄ）多剤耐性の癌を処置するための方法および組成物）本明細書中の開示から理解され得るように、ｖＲＮＡとボールトの間には有力
な関係が存在し、そしてそれに由来する特定の画分が、任意の特定の時間でボー
ルト粒子と会合する、ｖＲＮＡのプールが存在する。ボールトの一般的なプール
における増加（薬物耐性細胞株におけるような）は、ボールト会合するｖＲＮＡ
プールの画分における増加を生じる。さらに、ボールトの過剰発現は、非Ｐｇｐ
ＭＤＲ癌に関与する経路の必要な構成要素である。

【００４４】ｖＲＮＡは、ボールト粒子の構造成分ではない（なぜなら、リボヌクレアーゼ
消化はボールト粒子の形態学に影響しないから）が、ｖＲＮＡはボールト粒子の
機能において基礎的役割を有しているようである。従って、多剤耐性の癌におけ
るボールトの役割におけるボールトの機能を破壊する１つの方法は、ｖＲＮＡ成
分を標的とすることである。

【００４５】本発明の１つの実施態様に従って、ボールトのｖＲＮＡ成分を破壊することに
より多剤耐性の癌を処置する方法が存在する。好ましい実施態様において、この
ｖＲＮＡ成分を、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）（例えば、Ｃ−５
プロピン（ウリジンおよびシチジンのアナログ）を含むホスホロチオエートＯＤ
Ｎ（Ｃ−５ＰＳ−ＯＤＮ））をｖＲＮＡに結合するのに十分な量で投与するこ
とにより破壊する。有利なことに、これらの改変型ＯＤＮをナノモル濃度で使用
し得、そしてこれらはヌクレア−ゼ抵抗性であるが、ＲＮＡにハイブリダイズす
るときはＲＮアーゼＨ活性に対して感受性である。

【００４６】適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を決定するために、一連の連続
したアンチセンスＯＤＮ（長さ１５〜１８塩基）をｈｖｇ１の配列全体を含むよ
うに合成し、そしてアンチセンスＯＤＮ指向性ＲＮアーゼＨ切断アッセイを使用
して、標的化分解に感受性であるｈｖｇ１の領域を決定した。標的化分解に感受
性であるｈｖｇ１ｖＲＮＡの２つの領域（Ｈ２およびＨ４）を同定した。さら
に、Ｓ１００抽出物を使用して非ボールト会合ｖＲＮＡのプールを研究し、そし
てアンチセンスＯＤＮＨ５が３つすべてのｖＲＮＡ（ｈｖｇ１、ｈｖｇ２およ
びｈｖｇ３）を標的とすることを決定した。Ｈ２Ｃ−５ＰＳ−ＯＤＮおよび
Ｈ４Ｃ−５ＰＳ−ＯＤＮの両方を合成し、そしてインビトロＲＮアーゼＨ活
性アッセイにおいて活性であることを決定した（データは示さず）。

【００４７】表ＩＩＩｈｖｇ１ｖＲＮＡに対する種々のアンチセンスヌクレオチドについてのＲＮ
アーゼＨ切断アッセイの結果

【００４８】

【表３】理解され得るように、Ｈ２ハイブリダイゼーションにより、除タンパクされた
ｈｖｇ１ｖＲＮＡのＲＮアーゼＨ消化（＋＋＋）、ボールトと会合されたｈｖ
ｇ１ｖＲＮＡのＲＮアーゼＨ消化（＋＋）、または可溶性非ボールト画分中の
ｈｖｇ１ｖＲＮＡのＲＮアーゼＨ消化（＋＋＋）が可能であった。同様に、Ｈ
３ハイブリダイゼーションにより、可溶性非ボールト画分中のｈｖｇ１ｖＲＮ
ＡのＲＮアーゼＨ消化（＋＋＋）、および少しの程度ボールトと会合されたｈｖ
ｇ１ｖＲＮＡのＲＮアーゼＨ消化（＋／−）が可能であった。さらに、Ｈ４ハ
イブリダイゼーションにより、除タンパクされたｈｖｇ１ｖＲＮＡのＲＮアー
ゼＨ消化（＋＋）、可溶性非ボールト画分中のｈｖｇ１ｖＲＮＡのＲＮアーゼ
Ｈ消化（＋＋＋）、そしてある程度ボールトと会合されたｈｖｇ１ｖＲＮＡの
ＲＮアーゼＨ消化（＋）が可能であった。最後に、Ｈ５ハイブリダイゼーション
により、可溶性非ボールト画分中のみのｈｖｇ１ｖＲＮＡのＲＮアーゼＨ消化
（＋＋＋）が可能であった。

【００４９】さらに、非接着ＧＬＣ４／ＡＤＲ細胞株におけるｖＲＮＡを標的とした。この
株は、その親株よりも１５倍高いレベルのボールトを有する。アンチセンスＯＤ
Ｎ濃度（１００ｎＭ）は、ＯＤＮの型に依存して、２４時間以内に平均約７０％
のｖＲＮＡ発現阻害を生じるように決定した。この濃度は、ノーザンブロット分
析により決定したところ、培養物中で３日間で５０〜７５％の間のｖＲＮＡレベ
ルの阻害を生じた（データは示さず）。

【００５０】従って、本発明の１つの実施態様に従って、本質的にヒトボールトＲＮＡまた
はその相補鎖からなる、精製および単離されたポリヌクレオチド分子、あるいは
本質的にヒトボールトＲＮＡとその相補鎖からなるヌクレオチド配列の組合せが
提供される。さらに、本発明の別の実施態様に従って、ストリンジェントな条件
下でこのようなポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド分子が
提供される。このようなストリンジェントな条件の１例は、３×ＳＳＣ、１×デ
ンハート溶液、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．５％Ｓ
ＤＳ、および２ｍＭＥＤＴＡ中での６５℃１８時間のハイブリダイゼーション
である。このハイブリダイゼーションの後は、０．３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤ
Ｓ中での６５℃２０分間の洗浄を３〜４回行う。

【００５１】（実施例Ｉ）（多剤耐性の癌を患う患者を診断する方法）本発明の１つの実施態様に従って、多剤耐性の癌を患う患者を、まずその患者
由来の組織サンプルまたは流体サンプルを提供することにより診断する。このサ
ンプルは、骨髄、大脳棘液（ｃｅｒｅｂｒａｌｓｐｉｎａｌｆｌｕｉｄ）、
血液、涙、唾液、または生検標本であり得るか、あるいは他の適切な組織サンプ
ルまたは流体サンプルであり得る。次に、ボールト会合ｖＲＮＡ（例えば、ボー
ルト会合ｈｖｇ１ｖＲＮＡ）のレベルを決定する。次いで、このボールト会合
ｖＲＮＡのレベルを、多剤耐性の癌を患う患者中のボールト会合ｖＲＮＡについ
て既知の範囲のレベルと比較する。決定したボールと会合ｖＲＮＡのレベルが、
多剤耐性の癌を患う患者中のボールト会合ｖＲＮＡについてのレベルの範囲内で
ある場合に、多剤耐性の癌との診断がなされる。

【００５２】本発明の別の実施態様に従って、多剤耐性の癌を患う患者を、まずその患者由
来の組織サンプルまたは流体サンプルを提供することにより診断する。このサン
プルは、骨髄、大脳棘液、血液、涙、唾液、または生検標本であり得るか、ある
いは他の適切な組織サンプルまたは流体サンプルであり得る。次に、ボールトの
レベルを決定する。次いで、このボールトのレベルを、多剤耐性の癌を患う患者
中のボールトについて既知の範囲のレベルと比較する。決定したボールトのレベ
ルが、多剤耐性の癌を患う患者中のボールトについてのレベルの範囲内である場
合に、多剤耐性の癌との診断がなされる。

【００５３】（実施例ＩＩ）（多剤耐性の癌を患う患者を処置する方法）本発明の別の実施態様に従って、多剤耐性の癌を患う患者を、多剤耐性の癌細
胞中に存在するボールトを破壊し、これらの細胞を化学療法に感受性にすること
により処置する。これは、ヒトｖＲＮＡに親和性を有する少なくとも１つのアン
チセンスポリヌクレオチドをこの患者に投与することにより達成する。好ましい
実施態様において、このアンチセンスポリヌクレオチドは、ボールト会合してい
る場合はヒトｖＲＮＡに結合する。特に好ましい実施態様において、このアンチ
センスポリヌクレオチドを、配列番号１の残基２１〜３８に相補的な配列を有す
るポリヌクレオチド、配列番号１の残基３９〜５３に相補的な配列を有するポリ
ヌクレオチド、配列番号１の残基５０〜６５に相補的な配列を有するポリヌクレ
オチド、および上記の組合せからなる群から選択する。この方法はまた、ハイブ
リダイズされたｖＲＮＡを消化し得るＲＮアーゼをこの患者に投与する工程も包
含し得る。しかし、ハイブリダイズされたｖＲＮＡを分解する適切なＲＮアーゼ
は、その細胞中に存在する。

【００５４】（実施例ＩＩＩ）（多剤耐性の癌を患う患者を処置するための組成物）本発明の別の実施態様に従って、多剤耐性の癌を患う患者を処置するための組
成物が提供される。この組成物は、ヒトｖＲＮＡに親和性を有する少なくとも１
つのアンチセンスポリヌクレオチドを含む。好ましい実施態様において、このア
ンチセンスポリヌクレオチドは、ボールト会合している場合にヒトｖＲＮＡに結
合する。特に好ましい実施態様において、このアンチセンスポリヌクレオチドを
、配列番号１の残基２１〜３８に対応する配列を有するＲＮＡポリヌクレオチド
、配列番号１の残基３９〜５３に対応する配列を有するＲＮＡポリヌクレオチド
、配列番号１の残基５０〜６５に対応する配列を有するＲＮＡポリヌクレオチド
、および上記の組合せからなる群から選択する。この組成物はさらに、本明細書
中の開示を参照して当業者により理解されるような、適切なキャリアおよび他の
適切な物質を含み得る。

【００５５】（実施例ＩＶ）（多剤耐性の癌を患う患者を処置するための組成物についてスクリーニングす
る方法）本発明の１つの実施態様に従って、多剤耐性の癌を患う患者を処置するための
組成物をスクリーニングする方法が提供される。この方法は、ボールト粒子とｖ
ＲＮＡの会合を破壊する、組成物または処置を決定する工程を包含する。好まし
い実施態様において、この方法は、ボールト粒子の副ボールトタンパク質とのｖ
ＲＮＡの会合を破壊する、組成物または処置を決定する工程を包含する。

【００５６】本発明は、特定の好ましい実施態様に関してかなり詳細に議論してきたが、他
の実施態様も可能である。従って、添付の特許請求の範囲の精神および範囲は、
本出願中に含まれる好ましい実施態様の記載に限定されるべきではない。

【００５７】（図面）本発明のこれらおよび他の特徴、局面および利点は、上記の詳細な説明、添付
された特許請求の範囲、および以下の添付した図面によってより理解される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ｈｖｇ１、ｈｖｇ２およびｈｖｇ３の比較を示し、ここで同一塩基は
、ダッシュにより示され、そして欠失は、アステリスクにより示される。

【図２】図２は、分画された８２２６／ＭＲ４細胞における、ｈｖｇ１ｖＲＮＡ、ｈ
ｖｇ２ｖＲＮＡおよびｈｖｇ３ｖＲＮＡのノーザンブロットを示す。

【図３】図３は、いくつかの細胞株における、総ｈｖｇ１ｖＲＮＡ、ｈｖｇ２ｖＲ
ＮＡおよびｈｖｇ３ｖＲＮＡのノーザンブロットを示す。

【図４】図４は、Ｎ画分、Ｐ１００画分およびＳ１００について、分画された小細胞肺
癌細胞ＧＬＣ４／Ｓ（親）、ならびにその誘導物の薬物耐性細胞株ＧＬＣ４／Ａ
ＤＲの細胞およびその誘導物の薬物復帰変異細胞株ＧＬＣ４／ＲＥＶの細胞にお
ける、ＭＶＰのウエスタンブロットを示す。

【図５】図５は、ＲＮＡについて抽出された、Ｎ画分、Ｐ１００画分およびＳ１００に
ついての、分画された小細胞肺癌細胞ＧＬＣ４／Ｓ、ＧＬＣ４／ＡＤＲおよびＧ
ＬＣ４／ＲＥＶにおける、ｈｖｇ１ＲＮＡのノーザンブロットを示す。

【図６】図６は、１０μｇの小細胞肺癌細胞ＧＬＣ４／Ｓ、ＧＬＣ４／ＡＤＲおよびＧ
ＬＣ４／ＲＥＶにおける、総ｈｖｇ１ｖＲＮＡのノーザンブロットを示す。

【図７】図７は、スクロース平衡勾配におけるＭＶＰレベルのウエスタンブロットを示
し、ここでレーン１〜６は、それぞれ、充填２０％、３０％、４０％、４５％、
５０％、および６０％層に対応し、そしてレーン７は、ＧＬＣ／４／ＡＤＲＰ
１００画分の層に対応する。

【図８】図８は、図７の勾配画分から抽出されたＲＮＡ（レーン１〜６）および総ＲＮ
ＡＳＷ１５７３１標準物（レーン７）のＲＮＡのノーザンブロットを示す。

【図９】図９は、４つの親細胞株のＰ１００画分（レーン１〜４）、および精製された
ラット肝臓のボールトのＰ１００画分（レーン５〜９）のウエスタンブロットを
示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１１年１０月１４日（１９９９．１０．１４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００６

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００６】ボールトは、実質的に全ての高等生物においてかつほとんどの正常組織におい
て見出される、大きなバレル形状の多サブユニットの細胞質リボ核タンパク質小
器官である。哺乳動物のボールトは、ラットにおいて、およそ２４０ｋＤａ、１
９３ｋＤａおよび１０４ｋＤａ（ＭＶＰ）、ならびに小ＲＮＡ（ｖＲＮＡ）の分
子量を、１：１：２４：４の相対的なモル比で有する、３つのタンパク質からな
る。ヒトボールトＲＮＡは、まだ特徴付けされていない。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００７

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００７】ＭＶＰは、多数の非ＰｇｐＭＤＲ腫瘍細胞株において過剰発現されることが
示されており、これには、ＳＷ１５７３／２Ｒ１２０（非小細胞肺癌）、ＧＬＣ
４／ＡＤＲ（小細胞肺癌）、ＭＣＦ−７／ＭＲ（乳癌）、および８２２６／ＭＲ
２０（骨髄腫）細胞株が挙げられる。さらに、薬物の非存在下で培養することに
よって単離された復帰変異細胞株は、ＭＶＰの発現を下方制御する。しかし、ト
ランスフェクション研究は、ＭＶＰｃＤＮＡ単独の過剰発現が薬物耐性の表現
型を付与するに十分ではないことを示した。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１７】（Ａ）ヒトボールトＲＮＡ配列およびヒトボールトＲＮＡをコードするヌクレ
オチド配列の決定および特徴付け）ヒトボールトＲＮＡ配列およびヒトボールトＲＮＡをコードするヌクレオチド
配列を、以下のように決定した。最初に、ヒトボールトＲＮＡをコードする遺伝
子を、λＦＩＸＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、Ｕ
Ｓ）ヒトゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離した
。合計６．２５×１０⁵の組換え体を、Ｋｉｃｋｈｏｅｆｅｒ，Ｖ．Ａ．ら（１
９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８、７８６８〜７８７３（その全体が本
明細書中に参考として援用される）に記載される技術に従って、無作為にプライ
ムされた部分的なヒトｖＲＮＡ遺伝子を使用してスクリーニングした。ラットと
ウシガエルのｖＲＮＡ配列間の比較は、塩基１１〜２７および塩基１１０〜１２
９（ラットｖＲＮＡ配列、ＧｅｎＢａｎｋ^TM登録番号Ｚ１１７７１に基づく）が
保存されることを示した。これらの保存された領域に対するプライマーを、Ａｐ
ｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＤＮＡ合成機で合成し、そしてゲノムＤＮ
Ａからの部分的なヒトｖＲＮＡ遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応に使用した。この
精製されたポリメラーゼ連鎖反応産物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ⁺（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にサブクローニングし、そしてＳｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｕ
．Ｓ．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ．）を使用してジデオキシ方法により
配列決定した。これらの部分的なヒトｖＲＮＡ遺伝子を、ハイブリダイゼーショ
ンプローブとして使用した。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２３】ここで図１を参照すると、ｈｖｇ１、ｈｖｇ２およびｈｖｇ３の比較が示され
る。同一塩基は、ダッシュにより示される。アステリスクは、欠失を示す。理解
され得るように、ｈｖｇ１は、９６塩基長であり、一方ｈｖｇ２およびｈｖｇ３
は、８８塩基長である。さらに、ｈｖｇ１、ｈｖｇ２およびｈｖｇ３は、互いに
約８４％の同一性を共有する。３つのヒトｖＲＮＡ遺伝子の全ては、ｈｖｇ１配
列に基づいて、それぞれ、塩基１１〜２０および塩基６５〜７５に位置する、内
部ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ型プロモーターエレメントを含む。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３０】従って、複数のヒトｖＲＮＡが存在するが、本発明者らは、ｈｖｇ１によりコ
ードされる形態のみが全ての細胞株に一貫して存在して、そして１００，０００
×ｇでペレットにする（ｐｅｌｔ）ことにより明らかであるように、ボールト粒
子と一貫して会合することを決定した。対照的に、ｈｖｇ２およびｈｖｇ３によ
りコードされるｖＲＮＡは、全ての細胞株に存在せず、そしてボールトと一貫し
て会合しないが、それらは、いくつかの癌細胞株（例えば、ＨｅＬａ細胞）にお
いてボールトと会合する（データは示さず）。しかし、これらの株由来のゲノム
ＤＮＡのＰＣＲ分析は、３つの遺伝子の全てが一様に存在することを示す（デー
タは示さず）。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３５】ここで図７を参照すると、スクロース平衡化勾配におけるＭＶＰレベルのウエ
スタンブロットを示し、ここでレーン１〜６は、それぞれ、充填２０、３０、４
０、４５、５０および６０％の層に対応し、そしてレーン７は、ＧＬＣ／４／Ａ
ＤＲＰ１００画分の層に対応する。レーンＭは、ＮｏｖａｇｅｎｔＰｅｒｆ
ｅｃｔＰｒｏｔｅｉｎＭａｒｋｅｒである。ここで図８を参照すると、図７
の勾配画分から抽出されたＲＮＡ（レーン１〜６）および総ＲＮＡＳＷ１５７
３標準物（レーン７）のノーザンブロットが示される。理解され得るように、Ｍ
ＶＰおよびｖＲＮＡの大部分は４５％層に存在し、これは精製されたボールト粒
子の以前に公開された挙動と一致しており、このことは、Ｐ１００画分において
みられたＭＶＰおよびｖＲＮＡの増大がアセンブルしたボールト粒子のレベルを
正確に反映することを確認する。従って、Ｐ１００画分におけるＭＶＰおよびｖ
ＲＮＡレベルの変化は、ボールト粒子レベルがこの細胞株における薬物感受性の
レベルに依存して変化することを示す。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４２】

【表２】理解されるように、細胞当たりのボールトレベルが、試験された異なる細胞株
間でかなり変化しており、そしてより低いレベルの内因性ボールト粒子を有する
細胞株（ＧＬＣ４／ＳおよびＭＣＦ７／Ｓ）は、表Ｉにおいて見られるように最
高の倍の誘導を示した。表ＩＩに記載された細胞株の中で、ＧＬＣ４およびＳＷ
１５７３はドキソルビシンで選択したが、８８２６／ＳおよびＭＣＦ７／Ｓはミ
トキサントロンで選択した。ＧＬＣ４薬物耐性細胞株における非常に多数のボー
ルト（細胞当たり２４５，０００のボールト）は、この株が耐性である高濃度の
ドキソルビシン（１μＭ）を反映し得る。このドキソルビシンのレベルは、ＳＷ
１５７３耐性株を選択するために使用されるレベル（０．１μＭ）よりも１０倍
高く、ＳＷ１５７３耐性株は、細胞当たり３分の１のボールト数しか示さない。
ＧＬＣ４薬物復帰変異細胞株は、ボールト数が減少したが、このボールト数は、
なお親株の４倍を超えて高い。しかし、ＧＬＣ４薬物復帰変異細胞株は、ここで
１μＭのドキソルビシンによる殺傷に感受性であるが、０．１μＭのドキソルビ
シンにはなお耐性であり、従って、ＧＬＣ４薬物復帰変異細胞株は、薬物感受性
に関しては、ＳＷ１５７３薬物復帰変異株よりもＳＷ１５７３耐性株に類似して
いる。理解され得るように、ＧＬＣ４薬物復帰変異細胞株におけるボールトレベ
ル（７１，０００）は、ＳＷ１５７３薬物耐性細胞株におけるボールトレベル（
８５，０００）に類似している。従って、絶対的ボールトレベルは、薬物耐性の
程度を直接的に示すようである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｃ０８６ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｑ 1/68 33/50 ＴＧ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者キックホーファー，バレリーエイ．アメリカ合衆国カリフォルニア 92354，シャーマンオークス，スキャドロックレーン 3918 Ｆターム(参考） 2G045 AA26 AA40 BB20 CA25 CB01 CB07 CB11 DA12 DA13 DA14 DA36 DA78 FB02 4B024 AA01 AA12 BA80 CA01 CA11 DA01 DA05 DA11 EA04 GA11 HA12 HA17 4B063 QA01 QA19 QQ02 QQ03 QQ52 QR08 QR42 QR56 QR62 QS25 QS34 QS36 QX02 4B065 AA01X AA57X AA87X AB01 BA02 CA23 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA13 BA35 CA18 CA25 NA14 ZB26 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１に示される配列からなるか、または配列番号１に
相補的な配列からなる、単離されたポリヌクレオチドまたは精製されたポリヌク
レオチド。
【請求項２】配列番号１に示される配列から本質的になるか、または配列
番号１に相補的な配列から本質的なる、単離されたポリヌクレオチドまたは精製
されたポリヌクレオチド。
【請求項３】配列番号１に示される配列を含むか、または配列番号１に相
補的な配列を含む、単離されたポリヌクレオチドまたは精製されたポリヌクレオ
チド。
【請求項４】請求項１に記載の配列をコードする、単離されたポリヌクレ
オチドまたは精製されたポリヌクレオチド。
【請求項５】請求項２に記載の配列をコードする、単離されたポリヌクレ
オチドまたは精製されたポリヌクレオチド。
【請求項６】請求項３に記載の配列をコードする、単離されたポリヌクレ
オチドまたは精製されたポリヌクレオチド。
【請求項７】配列番号１からなるポリヌクレオチド配列にストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド分子、または配列番号１から
なるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌ
クレオチド分子の相補鎖。
【請求項８】請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含
む、ベクター。
【請求項９】請求項８に記載のベクターによって安定に形質転換またはト
ランスフェクトされている、原核生物の宿主細胞または真核生物の宿主細胞。
【請求項１０】多剤耐性の癌を患う患者を診断する方法であって、以下：（ａ）該患者由来の組織または液体のサンプルを提供する工程；（ｂ）該患者サンプルにおいて、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌ
クレオチドのレベルを決定する工程；および（ｃ）（ｂ）において決定されたポリヌクレオチドのレベルを、多剤耐性の癌
を患う患者における該ポリヌクレオチドの公知の範囲のレベルと比較する工程、
を包含し、ここで（ｂ）において決定される該ポリヌクレオチドのレベルが多剤
耐性の癌を患う患者における該ポリヌクレオチドのレベルの範囲内である場合、
多剤耐性の癌の診断がなされる、方法。
【請求項１１】前記サンプルが、骨髄、大脳脊髄液、血液、涙、唾液およ
び生検標本からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】多剤耐性の癌を患う患者を処置する方法であって、以下：（ａ）請求項１０に記載の多剤耐性の癌を患う患者を診断する工程；および（ｂ）該患者を処置する工程、を包含する、方法。
【請求項１３】（ｂ）が請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレ
オチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを前
記患者に投与する工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】請求項１２に記載の方法であって、ここで（ｂ）が配列番
号１の残基２１〜３８、配列番号１の残基３９〜５３、配列番号１の残基５０〜
６５、またはそれらの組合せからなる群より選択されるポリヌクレオチドとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを、前記患者に投
与する工程を包含する、方法。
【請求項１５】多剤耐性の癌を患う患者を処置する方法であって、請求項
１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズするポリヌクレオチドを該患者に投与する工程を包含する、方法
。
【請求項１６】、多剤耐性の癌を患う患者を処置する方法であって、配列
番号１の残基２１〜３８、配列番号１の残基３９〜５３、配列番号１の残基５０
〜６５、またはそれらの組合せからなる群より選択されるポリヌクレオチドとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを、該患者に投
与する工程を包含する、方法。
【請求項１７】請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを
含む、多剤耐性の癌を患う患者を診断または処置するための組成物。
【請求項１８】請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、多剤
耐性の癌を患う患者を診断または処置するための組成物。
【請求項１９】配列番号１の残基２１〜３８、配列番号１の残基３９〜５
３、配列番号１の残基５０〜６５またはそれらの組合せからなる群より選択され
る配列からなるポリヌクレオチドを含む、多剤耐性の癌を患う患者を診断または
処置するための組成物。
【請求項２０】配列番号１の残基２１〜３８、配列番号１の残基３９〜５
３、配列番号１の残基５０〜６５またはそれらの組合せからなる群より選択され
る配列から本質的になるポリヌクレオチドを含む、多剤耐性の癌を患う患者を処
置するための組成物。
【請求項２１】配列番号１の残基２１〜３８、配列番号１の残基３９〜５
３、配列番号１の残基５０〜６５またはそれらの組合せからなる群より選択され
る配列を含むポリヌクレオチドを含む、多剤耐性の癌を患う患者を診断または処
置するための組成物。
【請求項２２】配列番号１の残基２１〜３８、配列番号１の残基３９〜５
３、配列番号１の残基５０〜６５またはそれらの組合せからなる群より選択され
るポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌク
レオチドを含む、多剤耐性の癌を患う患者を診断または処置するための組成物。
【請求項２３】配列番号２に示される配列からなるか、または配列番号２
に相補的な配列からなる、単離されたポリヌクレオチドまたは精製されたポリヌ
クレオチド。
【請求項２４】配列番号２に示される配列から本質的になるか、または配
列番号２に相補的な配列から本質的になる、単離されたポリヌクレオチドまたは
精製されたポリヌクレオチド。
【請求項２５】配列番号２に示される配列を含むか、または配列番号２に
相補的な配列を含む、単離されたポリヌクレオチドまたは精製されたポリヌクレ
オチド。
【請求項２６】請求項２３に記載の配列をコードする、単離されたポリヌ
クレオチドまたは精製されたポリヌクレオチド。
【請求項２７】請求項２４に記載の配列をコードする、単離されたポリヌ
クレオチドまたは精製されたポリヌクレオチド。
【請求項２８】請求項２５に記載の配列をコードする、単離されたポリヌ
クレオチドまたは精製されたポリヌクレオチド。
【請求項２９】配列番号２からなるポリヌクレオチド配列にストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド分子、または配列番号２か
らなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリ
ヌクレオチド分子の相補鎖。
【請求項３０】請求項２３〜２８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
ドを含む、ベクター。
【請求項３１】請求項３０に記載のベクターによって安定に形質転換また
はトランスフェクトされている、原核生物の宿主細胞または真核生物の宿主細胞
。
【請求項３２】多剤耐性の癌を患う患者を診断する方法であって、以下：（ａ）該患者由来の組織または液体のサンプルを提供する工程；（ｂ）該患者のサンプルにおいて、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の
ポリヌクレオチドのレベルを決定する工程；および（ｃ）（ｂ）で決定されたポリヌクレオチドのレベルを、多剤耐性の癌を患う
患者における該ポリヌクレオチドの公知の範囲のレベルと比較する工程、を包含し、ここで（ｂ）で決定されたポリヌクレオチドのレベルが、多剤耐性の
癌を患う患者における該ポリヌクレオチドの該範囲のレベル内である場合、多剤
耐性の癌の診断がなされる、方法。
【請求項３３】前記サンプルが、骨髄、大脳脊髄液、血液、涙、唾液およ
び生検標本からなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】多剤耐性の癌を患う患者を処置する方法であって、以下：（ａ）請求項３２に記載の多剤耐性の癌を患う患者を診断する工程、および（ｂ）該患者を処置する工程、を包含する、方法。
【請求項３５】（ｂ）が請求項２３〜２８のいずれか１項に記載のポリヌ
クレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
を、前記患者に投与する工程を包含する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】請求項２３〜２８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
ドを含む、多剤耐性の癌を患う患者を診断または処置するための組成物。
【請求項３７】請求項２３〜２８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
ドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、
多剤耐性の癌を患う患者を診断または処置するための組成物。
【請求項３８】配列番号３に示される配列からなるか、または配列番号３
に相補的な配列からなる、単離されたポリヌクレオチドまたは精製されたポリヌ
クレオチド。
【請求項３９】配列番号３に示される配列から本質的になるか、または配
列番号３に相補的な配列から本質的になる、単離されたポリヌクレオチドまたは
精製されたポリヌクレオチド。
【請求項４０】配列番号３に示される配列番号を含むか、または配列番号
３に相補的な配列を含む、単離されたポリヌクレオチドまたは精製されたポリヌ
クレオチド。
【請求項４１】請求項３８に記載の配列をコードする、単離されたポリヌ
クレオチドまたは精製されたポリヌクレオチド。
【請求項４２】請求項３９に記載の配列をコードする、単離されたポリヌ
クレオチドまたは精製されたポリヌクレオチド。
【請求項４３】請求項４０に記載の配列をコードする、単離されたポリヌ
クレオチドまたは精製されたポリヌクレオチド。
【請求項４４】配列番号３からなるポリヌクレオチド配列にストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド分子、または配列番号３か
らなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリ
ヌクレオチド分子の相補鎖。
【請求項４５】請求項３８〜４３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
ドを含む、ベクター。
【請求項４６】請求項４５に記載のベクターにより安定に形質転換または
トランスフェクトされている、原核生物の宿主細胞または真核生物の宿主細胞。
【請求項４７】多剤耐性の癌を患う患者を診断する方法であって、以下：（ａ）該患者由来の組織または液体のサンプルを提供する工程；（ｂ）該患者のサンプルにおいて、請求項３８〜４３のいずれか１項に記載の
ポリヌクレオチドのレベルを決定する工程；および（ｃ）（ｂ）において決定されたポリヌクレオチドのレベルを、多剤耐性の癌
を患う患者における該ポリヌクレオチドの公知の範囲のレベルと比較する工程、
を包含し、ここで該（ｂ）において決定されたポリヌクレオチドのレベルが、多
剤耐性の癌を患う患者における該ポリヌクレオチドの該レベルの範囲内である場
合、多剤耐性の癌の診断がなされる、方法。
【請求項４８】前記サンプルが、骨髄、大脳脊髄液、血液、涙、唾液およ
び生検標本からなる群より選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】多剤耐性の癌を患う患者を処置する方法であって、以下：（ａ）請求項４７に記載の多剤耐性の癌を患う患者を診断する工程、および（ｂ）該患者を処置する工程、を包含する、方法。
【請求項５０】（ｂ）が請求項３８〜４３のいずれか１項に記載のポリヌ
クレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
を、前記患者に投与する工程を包含する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】請求項３８〜４３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
ドを含む、多剤耐性の癌を患う患者を診断または処置するための組成物。
【請求項５２】請求項３８〜４３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
ドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、
多剤耐性の癌を患う患者を診断または処置するための組成物。
【請求項５３】配列番号４に示される配列からなるか、または配列番号４
に相補的な配列からなる、単離されたポリヌクレオチドまたは精製されたポリヌ
クレオチド。
【請求項５４】配列番号４に示される配列から本質的になるか、配列番号
４に相補的な配列から本質的になる、単離されたポリヌクレオチドまたは精製さ
れたポリヌクレオチド。
【請求項５５】配列番号４に示される配列を含むか、または配列番号４に
相補的な配列を含む、単離されたポリヌクレオチドまたは精製されたポリヌクレ
オチド。
【請求項５６】請求項５３に記載の配列をコードする、単離されたポリヌ
クレオチドまたは精製されたポリヌクレオチド。
【請求項５７】請求項５４に記載の配列をコードする、単離されたポリヌ
クレオチドまたは精製されたポリヌクレオチド。
【請求項５８】請求項５５に記載の配列をコードする、単離されたポリヌク
レオチドまたは精製されたポリヌクレオチド。
【請求項５９】配列番号４からなるポリヌクレオチド配列にストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド分子、または配列番号４か
らなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリ
ヌクレオチド分子の相補鎖。
【請求項６０】請求項５３〜５８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
ドを含む、ベクター。
【請求項６１】請求項６０に記載のベクターにより安定に形質転換または
トランスフェクトされた原核生物の宿主細胞または真核生物の宿主細胞。
【請求項６２】多剤耐性の癌を患う患者を診断する方法であって、以下：（ａ）該患者由来の組織または液体のサンプルを提供する工程；（ｂ）該患者のサンプルにおいて、請求項５３〜５８のいずれか１項に記載の
ポリヌクレオチドのレベルを決定する工程；および（ｃ）（ｂ）において決定された該ポリヌクレオチドのレベルを、多剤耐性の
癌を患う患者における該ポリヌクレオチドの公知の範囲のレベルと比較する工程
、を包含し、ここで（ｂ）において決定された該ポリヌクレオチドのレベルが、多
剤耐性の癌を患う患者における該ポリヌクレオチドの該範囲のレベル内である場
合、多剤耐性の癌の診断がなされる、方法。
【請求項６３】前記サンプルが、骨髄、大脳脊髄液、血液、涙、唾液およ
び生検標本からなる群より選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】多剤耐性の癌を患う患者を処置する方法であって、以下：（ａ）請求項６２に記載の多剤耐性の癌を患う患者を診断する工程、および（ｂ）該患者を処置する工程、を包含する、方法。
【請求項６５】（ｂ）が請求項５３〜５８のいずれか１項に記載のポリヌ
クレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
を、前記患者に投与する工程を包含する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】請求項５３〜５８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
ドを含む、多剤耐性の癌を患う患者を診断または処置するための組成物。
【請求項６７】請求項５３〜５８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
ドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、
多剤耐性の癌を患う患者を診断または処置するための組成物。
【請求項６８】多剤耐性の癌を患う患者を処置するための組成物をスクリ
ーニングする方法であって、ｖＲＮＡとボールト粒子との会合を破壊する組成物
または処置を決定する工程を包含する、方法。
【請求項６９】前記決定される組成物または処置が、ｖＲＮＡとボールト
粒子の副ボールトタンパク質との会合を破壊する、請求項６８に記載の方法。