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JP2002518998A - ヌクレオチドシーケンスの電気化学的認識用マルチセンサーアレイおよび方法 - Google Patents

ヌクレオチドシーケンスの電気化学的認識用マルチセンサーアレイおよび方法

Info

Publication number
JP2002518998A
JP2002518998A JP2000556236A JP2000556236A JP2002518998A JP 2002518998 A JP2002518998 A JP 2002518998A JP 2000556236 A JP2000556236 A JP 2000556236A JP 2000556236 A JP2000556236 A JP 2000556236A JP 2002518998 A JP2002518998 A JP 2002518998A
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JP
Japan
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oligonucleotide
electrode
redox
nucleic acid
array
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2000556236A
Other languages
English (en)
Inventor
ラムレイ−ウッドイヤー、テリー ドゥ
カルアナ、ダレン、ジェイ．
ヘラー、アダム
Original Assignee
セラセンス、インク．
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by セラセンス、インク． filed Critical セラセンス、インク．
Publication of JP2002518998A publication Critical patent/JP2002518998A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

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Abstract

(57)【要約】 センサーおよびその製造方法ならびに核酸シーケンスの電気化学的検出におけるその使用。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、特定の診断用オリゴヌクレオチドの認識や決定等を含めた核酸シー
ケンスの分析に使用するマイクロ電極に関するものである。より詳しくは、本発
明は、オリゴヌクレオチドの検出および認識に有用な電極およびマイクロ電極の
アレイ、ならびに化学的に活性なヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチ
ドの反応性電気泳動沈着により電極およびマイクロ電極アレイを再生可能に製造
する方法に関するものである。
【０００２】 発明の背景 オリゴヌクレオチド対合の検出、例えばＤＮＡやＲＮＡの検知は、ヒトゲノム
の配列決定、微生物またはある種の癌を引き起こす突然変異体といった特定の疾
患誘導剤の検出を含む疾患の検出、生体接合阻害剤（bioconjugation-blocking
drugs）の同定等、様々な用途に用いられる。迅速な検出に必要とされるオリゴ
ヌクレオチドのコピー数は1千万を超え、また公知の分析方法に必要とされるコ
ピー数はおよそ１０億であるため、一般に、特定のヌクレオチドシーケンスを検
出するには核酸のサンプルを増幅させる必要がある。さらに、従来の配列決定技
術は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法等、自動化が進んでいるにも関わらず、
いまだ多くの時間を要する。
【０００３】 これらの問題に対応するため、集積回路の製造に用いるツールを利用し、ＤＮ
ＡおよびＲＮＡセンサーのアレイの開発が進められている。これらのアレイによ
れば、検出に要するシーケンスのコピーが少なくてすみ、かつより短い時間で多
くの種類のシーケンスを走査できる。
【０００４】 ３５×３５マイクロメーター（１．５×１０-5ｃｍ2）画素のアレイを複数備
えたＤＮＡ検知シリコンチップ（２．５×２．５ｃｍ）であって、各画素が異な
る短い（１０塩基まで）オリゴヌクレオチドシーケンスを備えているものが、現
在利用可能である。このチップが必要とする膨大な量のシーケンスは、例えば種
々の光化学処理工程、または光食刻法を使用した処理工程といった単純な公知の
技術を用い、これらのアレイ上でヌクレオチドごとに合成される。これらの処理
工程は非常に多くの時間を要する。加えて、これらのアレイを用いて光学的およ
び／または分光法的方法で特定の核酸を識別しようとすれば、各画素に１０9以
上のコピーが存在していなければならない。これらのアレイおよび方法は、最大
限の検知画素を有し、かつ検知画素のサイズが集積回路の機能素子を構成する電
子装置のサイズと密度に近くなった非常に小型のチップの製造工程の簡易化や能
率的な精査には適さない。
【０００５】 マイクロ電極を用いてオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを認識する
電気化学的手段がすでに述べられている。ミランら（Millan et.al.）（1994ア
ナリティカルケミストリー（Anal. Chemistry）66:2943）は、ＤＮＡの二本鎖に
おけるレドックス対のインターカレーションをボルタンメトリーによって検出し
、のう胞線維症に関与する突然変異体の観察に成功した。シュウら（Xu et. al.
）（1994、ジャーナルオブアメリカンケミカルソサエティー（J.Am.Chem.Soc.）
116:8386; 1995 ジャーナルオブアメリカンケミカルソサエティー117:2627)は
、金属キレートタグのＤＮＡの二本鎖へのインターカレーション後、金属キレー
トタグの電気発生化学ルミネセンスによってハイブリダイゼーションを観察した
。コリ−ヨウソウフィら（Korri-Youssoufi et.al） (1997 （J. Am. Chem. Soc
.）119:7388)は、電気化学的に共重合させたピロールとオリゴヌクレオチド置換
ピロールにおけるハイブリダイゼーションによる抵抗力の増加を測定した。この
ような共重合の結果、一本鎖オリゴヌクレオチドによるカバー力が高く（１０-6 ｍｏｌｃｍ2）なる。１０μＭのオリゴヌクレオチド濃度で、平方センチメート
ルあたり６×１０8のハイブリダイゼーション事象が検出された。
【０００６】 異なるオリゴヌクレオチド検知システムの相対的な利点の尺度となるのは、サ
イズ、検出されるコピーの数、選択性（突然変異体を検知する能力によって査定
される）、製造の安易さ、システムのコスト等である。これらの尺度を組み合わ
せることには、容認できる数値に達するほどの実益がない。いくつかの用途にお
いて、特にサンプルが小さい場合に行なわれる組合せアレイでの検知に関連する
用途においては、検知素子サイズの組み合せ、検出されたコピーの数、および一
塩基のみが異なる長鎖のオリゴヌクレオチドシーケンスを識別する能力が特に関
連する要素である。
【０００７】 検出素子のサイズにより、アレイにおける検出素子の表面密度が決定する。検
出されたコピーの数により、特定のシーケンスの検出に必要な増幅（例えばＰＣ
Ｒ）サイクル数が決定し、またこのサイクル数の増加に伴いエラー率が増加する
。さらに、長さが増加するオリゴヌクレオチドで、一塩基しか相違しないものを
識別する能力により、突然変異体の場所を突き止める能力と特異性とのバランス
が決定する。
【０００８】 ミランら、アナリティカルケミストリー、1994, 66:2943、シンガールら（Sin
gahal et al.）、アナリティカルケミストリー、1997, 69:4828、およびネピア
ら（Napier et al.）、バイオコンジュゲイトケミストリー（Bioconjugate Chem
.）、1997、8:906には、電気化学的技術がハイブリダイゼーション事象の測定に
最適であることが示されている。望まれながらもいまだ達成されない目標は、集
積回路における最小ゲートとサイズの変わらない検知素子を用い、遺伝子の単一
のコピーにおける一塩基の突然変異を正確に検出することである。小型化が重要
とされる多くの用途において、マイクロ電極の使用が効果的であることがわかっ
ている（カワゴエら（Kawagoe, et al.）、アナリティカルケミストリー、1991
、63:2961、ピシュコら（Pishko et al）、アナリティカルケミストリー、1992
、 63:2668、アベら（Abe et al）、アナリティカルケミストリー、1992、64:21
60）。しかしながら、多くの場合、特に、異なる素子の信号を比較するアレイに
おいては、ミクロンサイズ電極の使用の妨げとなっているのは、電極サイズでは
なく、むしろ特異性を付与するための電極被覆の再現性（reproducibility）で
あった。
【０００９】 選択的に電極を被覆する方法が、これまでに述べられている。コリ−ヨウソウ
フィらは、ピロールのオリゴヌクレオチド修飾モノマーを電気化学的に共重合し
、（アメリカンケミカルソサエティー（Am. Chem. Soc.）、1997、119:7388）、
５０μｍ×５０μｍのマイクロ電極を有するアレイ４８を構成したが、各マイク
ロ電極はそれぞれ異なるオリゴヌクレオチドシーケンスによって被覆（derivati
zed）されていた。マイクロ電極を使用してオリゴヌクレオチドのハイブリダイ
ゼーションを認識する電気化学的方法については、ヘラーら（Heller et al.）
（米国特許第５，６０５，６６２号、米国特許第５，６３２，９５７号、 米国
特許第５，８４９，４８６号)およびヒルら（Hill et al.）（米国特許第４，８
４０，８９３号）に述べられている。これらの方法により、ハイブリッド結合分
子の蛍光を測定することで（コリ−ヨウソウフィら、ヘラーら）、もしくは標的
ＤＮＡによるハイブリダイゼーションの競争阻害がもたらした測定定常状態電流
の降下から（ヒルら）、ハイブリダイゼーションを分析することができる。
【００１０】 迅速かつ効率的なＤＮＡの検出方法は、特に遺伝物質に蓄積されている膨大な
情報量考慮すれば必要性が高く、また迅速な処理により実用可能となりつつある
。したがって、感度が向上し、容易に使用でき、素子あたりの精査時間を短縮で
き、かつ確かな情報を提供できる新規のアレイおよびその製造方法が必要とされ
ている。この目標に向けての進展は、電極サイズの縮小、ならびに検出に必要な
コピー数の減少、例えば単一のオリゴヌクレオチドにおける一塩基不正対合の検
出と並行してみられるであろう。
【００１１】 発明の要旨 本発明は、少数の核酸シーケンスのコピーを効率的かつ迅速に検出および認識
するのに適したマイクロ電極アレイを構成することができる電極を提供するもの
である。本発明の電極およびマイクロ電極は、個々の核酸分子を個々のマイクロ
電極上に電気泳動的に沈着し、これにより、光食刻法により形成したマスク（ph
otolithographic mask）を要することなく、アレイ上に個々に処理可能な（addr
essable）素子、ハイブリダイゼーションおよび／または溶解検知素子を設ける
ことができる。沈着されたセンサーオリゴヌクレオチドはレドックスポリマーと
結合し、このレドックスポリマーが電極上に配置される。電極上に配置されたレ
ドックスポリマーは、ハイブリダイゼーション事象の電気化学的検出の基盤とな
る。
【００１２】 本発明のマイクロ電極は、コピー数の少ない（例えば、約４０，０００コピー
）オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出するため、化学的に活性
なオリゴヌクレオチドの反応性電気泳動沈着により再生可能に活性化している。
相補的コピーのハイブリダイゼーションおよび／またはハイブリッドの融解は、
個々のマイクロ電極（約１〜１０マイクロメートル（８×１０-7ｃｍ2））によ
り、電気化学的に、好ましくは電流測定によって観察される。ハイブリダイゼー
ション条件の厳しさ、例えば温度等を制御することにより、一塩基対の不正対合
を有するオリゴヌクレオチドを本発明の電極によって識別することができる。
【００１３】 本発明の電極アレイは、特定疾患の診断に役立つ特定の核酸シーケンスの分析
と検出に特に有用である。例えば、本発明の電気化学的ハイブリダイゼーション
検出システムに要される少数のコピーにより、一滴の血液に含有される核酸シー
ケンスが検査され、細菌、菌類、または真核生物の病原体を含む特定の微生物の
診断に使用できる核酸シーケンスの存在が確認される。本発明の電気化学的検出
システムによれば、少数のサンプルにおける一塩基対の不正対合を識別する能力
により、ガンの選別を含む特定疾患の診断に役立つ突然変異体核酸シーケンスの
迅速かつ能率的な検出が可能になる。本発明のセンサーアレイを使用すれば、核
酸のサンプルを増幅する必要はなく、細胞組織サンプルを増幅せずに直接使用す
ることができる。
【００１４】 本発明の電極アレイは、１以上の特定疾患の診断に役立つ核酸シーケンスを、
同時に、しかも多数分析し検出するのに有用である。例えば、マルチセンサーア
レイは流路システムを備えていてもよく、この流路システムは、特定の核酸シー
ケンスに対してそれぞれ特異性を有する多数のセンサーをサンプルが通過するよ
う配置されている。サンプル内に含有される標的ＤＮＡは、シーケンス診断用セ
ンサーにハイブリダイゼーションし、捕捉され直接検出される。
【００１５】 上記発明の要旨は、開示している各実施の形態、または本発明の全ての実施方
法を記載することを意図したものではない。図面および以下の詳細な説明により
、これら実施の形態を更に詳細に例を用いて示す。
【００１６】 本発明は、様々な変更例や変形例の形式にしてもよく、その明細書は図面で示
した実施例によって示され、詳細に示されている。しかし、その目的は、本発明
、特に実施の形態に限定されない。また、本発明の精神および範囲に属する目的
は、全ての変形例、均等物、変更例を包括するものである。
【００１７】 図面の簡単な説明 本発明は、添付図面を参照し、本発明の様々な実施の形態に関する下記の詳細
な説明を考慮することにより、更に完璧に理解されるであろう。
【００１８】 図１は、本発明のＤＮＡ検知用マイクロ電極アレイの平面図である。
【００１９】 図２は、一本鎖のオリゴヌクレオチドを有するマイクロ電極アレイを示した断
面図である。
【００２０】 図３は、ハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドと標識プローブオリゴヌ
クレオチドとが付着したマイクロ電極アレイを示した断面図である。
【００２１】 図４は、（ａ）レドックスポリマーおよび（ｂ）オリゴヌクレオチドの電気泳
動的沈着の電位−時間変化を示すグラフである。それぞれ２０μＡの電流を２１
４７秒および−１０μＡの電流を９００秒流した。
【００２２】 図５は、（ａ）レドックスポリマー、（ｂ）レドックスポリマーおよびオリゴ
ヌクレオチドおよび（ｃ）イオン強度の高い溶液中でハイブリダイゼーションし
た後のレドックスポリマーとオリゴヌクレオチドによって塗布された厚さ１０μ
ｍのマイクロ電極の周期的ボルタモグラムを示す。走査率は５０ｍＶ／秒、ボル
タモグラムは０．３Ｖ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌで開始した。
【００２３】 図６は、緩衝液中マイクロ電極上のレドックスポリマーの酸化（四角）および
還元（円）ピーク電流の走査率の依存性を示すグラフである。実線は還元ピーク
電流の直線回帰に一致し、破線は酸化ピーク電流に一致する。
【００２４】 図７は、レドックスポリマーおよびオリゴヌクレオチドを有する、ｐｄ（Ａ） 25-30 −ＨＲＰおよびｐｄ（Ｇ）18-20−ＨＲＰでハイブリダイゼーションされた
典型的な塗布電極の電流滴定反応を示すグラフである。過酸化水素（１ｍＭ）を
５ｍＬの試験溶液に添加し、反応を開始する。バックグラウンド電流は−５〜−
１２ｐＡの間であった。０．００Ｖｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌの電位を与えた後、電
流が安定ベースラインに達するまで、２００秒かかった。反応時間は、溶液中の
過酸化水素の混合によって制御した。矢印はＨ2Ｏ2がセルに導入される点を示す
。
【００２５】 図８は、ハイブリッドが融解したときの電流の消失；温度が直線的（破線）に
２０℃〜６０℃で０．２５℃／分の割合で傾斜する時の電気泳動的な過酸化水素
還元電流の時間−温度依存性を示すグラフである。垂直方向の矢印は過酸化水素
がセルに導入されたポイントを示す。
【００２６】 図９Ａ〜９Ｉは、相補的鎖（図９Ａ、９Ｄ、９Ｇ）、1箇所の塩基対が不適正
（図９Ｂ、９Ｅ、９Ｈ）、４箇所の塩基対が不適正（図９Ｃ、９Ｆ、９Ｉ）の標
的オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションもしくは非ハイブリダイゼー
ションを示す連続グラフである。ハイブリダイゼーション条件はそれぞれ２５℃
（図９Ａ〜９Ｃ）；４５℃（図９Ｄ〜９Ｆ）；および５７℃（図９Ｇ〜９Ｉ）と
した。
【００２７】 図１０は、本発明の電極上の電極の核酸ハイブリダイゼーションアッセイを表
す模式図である。１０は電極、１２はレドックスポリマー；１４はセンサーオリ
ゴヌクレオチド；１６はプローブオリゴヌクレオチド；および１８は検出マーカ
ーを示す。
【００２８】 図１１は、実施例７で説明したセンサーを用いた、電気泳動的に沈着されたレ
ドックスポリマー（実線）およびオリゴヌクレオチドプローブと反応したレドッ
クスポリマー（破線）の第5の周期的ボルタモグラムを示す（直径７μｍのカー
ボンマイクロ電極；走査率５０ｍＶｓ-1；１Ｍ ＮａＣｌおよび１．０ｍＭ ＥＤ
ＴＡを含有する、ｐＨ７のＨＥＰＥＰＳ緩衝液）。
【００２９】 図１２は、触媒電流によって測定された、プローブオリゴヌクレオチド過重の
標的のハイブリダイゼーションへの効果を示すグラフである。プローブ過重は、
電気泳動的沈着の持続時間によって達成される。（ａ）１分、（ｂ）２．５分、
（ｃ）５分および（ｄ）１０分（攪拌、１ｍＬのｐＨ７のＨＥＰＥＳ、１．０ｍ
ＭのＥＤＴＡ、１．０ｍＭ Ｈ2Ｏ2、−０．０６Ｖ（Ａｇ／ＡｇＣｌ）を含有す
る１．０Ｍ ＮａＣｌ緩衝液。０秒後、１０μｌの４０ｎＭ ＳＢＰ標識標的溶液
を添加）。
【００３０】 図１３Ａ〜１３は、ＳＢＰ標識標的を、完全相補的または部分的不適正標的に
（曲線ａ）、1箇所が不適正の塩基対（曲線ｂ）および４箇所が不適正の塩基対
（曲線ｃ）に添加した後、２５℃（図１３Ａ）；４５℃（図１３Ｂ）；および５
７℃（図１３Ｃ）でのマイクロ電極の触媒電流の増加を示すグラフである（０秒
後、１０μｌの４０ｎＭ ＳＢＰ標識標的溶液を添加；攪拌。１ｍＬ ｐＨ７のＨ
ＥＰＥＳ，１．０ｍＭのＥＤＴＡ、１．０ｍＭ Ｈ2Ｏ2、−０．０６Ｖ（Ａｇ／
ＡｇＣｌ）を含有する１．０Ｍ ＮａＣｌ緩衝液）点線は式４に最もよく一致し
ている。
【００３１】 図１４は、プローブを有するレドックスポリマーが塗布された触媒電流の電流
−時間プロットを示すグラフである。４箇所の不適正塩基を伴うＳＢＰ標識標的
を５５０秒後に導入し（矢印Ａ）、続いて、ＳＢＰ標識完全適正標的を１４５０
秒後に導入した（矢印Ｂ）（攪拌。１ｍＬ ｐＨ７のＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭの
ＥＤＴＡ、１．０ｍＭ Ｈ2Ｏ2、−０．０６Ｖ（Ａｇ／ＡｇＣｌ）を含有する１
．０Ｍ ＮａＣｌ緩衝液。４５℃で温度制御）。
【００３２】 図１５Ａ〜１５Ｃは、本発明のシステムの模式図である。プローブオリゴヌク
レオチドを導電性レドックスポリマーと電極上で共有結合している。標識標的核
酸シーケンスをハイブリダイゼーションすると、ＳＢＰヘム中心および電極の間
にレドックスポリマーを介して電気接触が確立される。この接触によってＨ2Ｏ2 が電気触媒還元されて水になる。図１５Ｂのサイクル参照。図１５Ｃは、本発明
の好ましい実施形態における、標的核酸シーケンスの固定化された第一のプロー
ブおよび第二の標識プローブへのハイブリダイゼーションを示す模式図である。
【００３３】 図１６は、本発明の好ましい実施形態におけるシステムの模式図である。核酸
シーケンス、例えば、遺伝子もしくはＲＮＡの断片を１以上のオリゴヌクレオチ
ドプローブと反応させる。第一のオリゴヌクレオチドプローブは熱安定性ペルオ
キシダーゼを介して電極上に固定化される。第二のオリゴヌクレオチドプローブ
を、好ましくは熱安定性ペルオキシダーゼによって標識する。第２の標識プロー
ブは固定化されていてもいいし、または遊離状態であってもよい。第１および第
２のプローブの双方で標的シーケンスのハイブリダイゼーションによって電流が
測定された。
【００３４】 好ましい実施形態の詳細な説明 本発明は、例えば核酸合成、未知の核酸シーケンスの分析、突然変異体等変性
核酸シーケンスの診断に際しての核酸ハイブリダイゼーションの検知に応用でき
る。特に、本発明は、電気泳動により個々のマイクロ電極上に個々の活性オリゴ
ヌクレオチドを沈着させて形成したマイクロ電極アレイの装置、製造方法、およ
び使用方法に関するものである。本発明は、以下に挙げた実施例に限定されるも
のではないが、その説明により、本発明の様々な態様の理解が得られるであろう
。
【００３５】 図１は、オリゴヌクレオチド標識センサー１０１のアレイ１００を示している
。また、図２および図１５Ａに示すように、センサー１０１は、それぞれ作用電
極１０２、作用電極１０２上に沈着したレドックスポリマー１０４、およびレド
ックスポリマー１０４に結合したセンサーオリゴヌクレオチド１０６を備えてい
る。各特定作用センサー１０１におけるセンサーオリゴヌクレオチド１０６のシ
ーケンスは同じであってもよいが、センサーオリゴヌクレオチド１０６のシーケ
ンスは少なくとも２個のセンサー１０１間で異なっていることが好ましく、一般
的には、大多数のセンサーがそれぞれ特有のオリゴヌクレオチドシーケンスを有
している。好ましくは、アレイが少なくとも４、１００、１，０００、１０,０
００、またはそれ以上のセンサーを有し、各センサーオリゴヌクレオチド１０６
が特定の核酸シーケンスを有している。また、これに代わる実施形態では、例え
ば以下に述べるような分離した診断用装置においては、アレイにおけるセンサー
は１０個未満である。
【００３６】 これに代わる実施形態においては、単一または複数の病原体を同定するストリ
ップも考察されている。ストリップの小型化は、可能であるが特に必要ではない
。このような装置により、以下を目的とする安価で迅速な試験が行える。 ａ）以後の適切な抗生物質療法のため、伝染性の病原体が、グラム陽性の微生物
かグラム陰性の微生物かを識別する。 ｂ）感染の種類、例えば咽喉部の感染が連鎖球菌性のものか否かを識別する。 ｃ）感染の場所、例えば局所的な感染なのか、全身性の感染（血液運搬性（bloo
d-borne））なのかを識別する。
【００３７】 医師が治療する伝染病の大半がE大腸菌（E. coli）に由来するため、黄色ブド
ウ球菌または連鎖球菌が関与する伝染病を識別し、かつ類別するストリップは、
以後の治療を決定する上で特に有用と考えられる。約１００個のセンサーを備え
たアレイであれば、現在医師が治療しているほとんど全てのウイルス性、菌性、
細菌性の病原体を十分に識別できる。
【００３８】 一般的に、アレイ１００は、基板１１４上に作用電極１０２を形成して製造さ
れる。次いで、レドックスポリマー１０４を、各作用電極１０２上に電気泳動に
より沈着させる。レドックスポリマー１０４には、一般に、ポリマーと、ポリマ
ーに結合した遷移金属錯体等のレドックス種とが含まれる。また、上記ポリマー
には、一般に、センサーオリゴヌクレオチドに対する反応性結合部位が含まれる
。
【００３９】 センサーオリゴヌクレオチドがレドックスポリマーに結合するよう、ポリマー
の反応性結合部位と反応する官能基を形成するようにセンサーオリゴヌクレオチ
ドを処理することが好ましい。センサーオリゴヌクレオチドは「反応性電気泳動
」、すなわちイオン性オリゴヌクレオチドを電極表面またはその近傍に移動させ
るのに十分な電位を電極に印加することを含む処理工程により、与えられた電極
上に選択的に沈着する。次いで、センサーオリゴヌクレオチドは、レドックスポ
リマー中のポリマーにおける反応性結合部位を介してレドックスポリマーと結合
する。移動するオリゴヌクレオチド、電極表面、化学的表面調製剤（chemical s
urface modifier）（あれば）、および／または電極上のポリマーのいずれか１
以上を化学的に活性化させ、結合反応を起こさせてもよい。
【００４０】 本発明のアレイを精査過程で使用する場合には、標的オリゴヌクレオチド１０
８（例えばＤＮＡまたはＲＮＡセグメント）を、特定のハイブリダイゼーション
条件下においてアレイと接触させる。標的オリゴヌクレオチド１０８に、センサ
ーオリゴヌクレオチド１０６のいずれかに対して相補的なシーケンスが含まれて
いれば、図３および図１５Ａに示すようにセンサーと標的オリゴヌクレオチド１
０６および１０８のそれぞれによりハイブリッドが形成される。
【００４１】 一実施形態においては、各標的オリゴヌクレオチド１０８が、検出化合物１１
２の電気化学的反応を触発する触媒１１０と結合する。これにより、検出化合物
１１２がアレイ１００と接触し、作用電極１０２に電位が印加されると、その作
用電極またはオリゴヌクレオチド１０６、１０８がハイブリッドを形成している
作用電極において電気信号が発生する。この電気信号は、検出化合物１１２の電
気化学的反応によって発生するものである。
【００４２】 また、図１５Ｃに示される本発明の代わりの実施形態において、標的核酸シー
ケンス１０７は、センサーオリゴヌクレオチド１０６と第２の触媒標識オリゴヌ
クレオチドプローブ１０９との両方とハイブリッドを形成する。標的シーケンス
１０７と、第１の固定センサーシーケンス１０６および第２の標識シーケンス１
０９の両方とのハイブリダイゼーションした結果、上述したように、作用電極１
０２に電気信号が生じる。
【００４３】 ［アレイ］ センサー１０１のアレイ１００は基板１１４上に形成される。基板１１４の形
成に用いられる材料は、絶縁性または半導電性であるのが典型的である。好適な
材料の例としては、シリコン、融解シリコンダイオード（fused silicon dioxid
e）、ケイ酸塩ガラス、アルミナ、アルミノケイ酸塩セラミック、エポキシ、ガ
ラスファイバ強化エポキシ等のエポキシ複合材、強化エポキシ、ポリエステル、
ポリイミド、ポリアミド、またはポリカーボネート等が挙げられる。
【００４４】 センサー１０１のアレイ１００は規則性アレイであっても不規則性アレイであ
ってもよく、かつ複数のセンサーを備えている。一実施例においては、アレイ１
００は行と列とに配置されたセンサーを備えている。アレイは複数のセンサーを
備えていてもよく、例えば、４以上のセンサー、好ましくは１０以上のセンサー
、より好ましくは１００以上のセンサー、さらに好ましくは１，０００以上のセ
ンサー、最も好ましくは１０,０００以上のセンサーを備えていてもよい。アレ
イのサイズ、およびアレイ上でのセンサー密度は、アレイの所望の用途に応じて
変更される。例えば、上述したように、単一または複数の病原体を識別するスト
リップが考察され、このストリップの小型化は可能であるが、特に小さくする必
要はない。このようなアレイによれば、ほとんど全てのウイルス性、菌性、細菌
性の病原体の識別に必要なセンサーがより少なくてすむ（およそ１００）。また
その代わりとして、分離した診断装置において、代謝異常と相関関係にある核酸
シーケンスの存在を確認するために、約４つのセンサーからなるアレイを利用す
ることができる。対照的に、１００以上のセンサーを備えたアレイを用い、様々
な病理的条件を選別することができる。もしくは、１０,０００以上の個々のセ
ンサーアレイを用い、核酸突然変異体を選別することも可能である。センサー間
の間隔は、概してセンサーの直径よりも大きい。好ましくは、これらの間隔が少
なくとも直径の２倍であり、より好ましくは少なくとも直径の１０倍である。
【００４５】 例えば病原体を識別するための特定核酸の診断解析を含むいくつかの用途にお
いては、アレイ上のセンサーの数は少なくてもよく、例えば２以上でよい。特定
の核酸変種または突然変異体を診断するためには、アレイ上のセンサーの数は１
０以上、または１００以上であってもよい。オリゴヌクレオチドまたはペプチド
の生物共役反応（bioconjugation reactions）を識別するためには、アレイは個
々のセンサーを１０,０００以上備えていてもよい。また、患者サンプルにおけ
る特定の病原菌を識別するためには、単一のサンプルの同時分析用におよそ１０
０の公知の診断用オリゴヌクレオチドを含むアレイを提供することが可能である
。アレイ内の各センサーのサイズは、所望の用途に応じて変更可能であり、例え
ば１〜１０マイクロメートル程度に小型化することができるが、特に特に小さく
する必要はない。
【００４６】 ［作用電極］ 作用電極１０２は、図1に示すように、一般に絶縁性基板１１４上に沈着され
た導電性材料の薄膜である。種々の導電性材料を用いて作用電極１０２を形成す
ることができる。好適な材料の例としては、金属、 炭素、導電性ポリマー、お
よび金属化合物が挙げられる。これらの材料の例としては、金、銀、銅、パラジ
ウム、タンタル、タングステン、アルミニウム、グラファイト、窒化チタン、お
よび二酸化ルテニウムが挙げられる。好ましい材料は、飽和カロメル電極（ＳＣ
Ｅ）の電位よりも０．２Ｖ正である電位が印加されていれば、ミネラルウォータ
ー中で速やかに腐食しない。腐食電流密度は、好ましくは１０3Ａｃｍ-2未満で
あり、より好ましくは１０6Ａｃｍ-2未満である。
【００４７】 これらの材料からなる薄膜は、例えばスパッタリング、反応スパッタリング、
物理蒸着、プラズマ蒸着、化学蒸着、焼付け、およびその他の被覆方法を含む様
々な方法によって形成することができる。また、例えばパターンマスクを使用し
て、分離した導電性素子を沈着して各作用電極を形成してもよい。そうでなけれ
ば、連続した導電膜を基板に付着させ、その膜から作用電極をパターン形成する
ことも可能である。
【００４８】 金属やその他の材料からなる薄膜のパターニング技術は、半導体の技術分野で
は周知であり、またフォトリソグラフィー技術もこれに含まれる。模範的な技術
の例としては、導電性材料からなる薄膜を沈着し、次にフォトレジストの層を薄
膜の上に沈着させることが挙げられる。典型的なフォトレジストは、特定の波長
を有する光、または特定の波長範囲に該当する光に露光することにより変性され
る化学物質、しばしば有機化合物である。露光により、フォトレジストは化学薬
品によりいくらか除去されやすくなる。フォトレジスト層を塗着した後、マスク
を介し、フォトレジストを光またはその他の電磁放射に曝す。そうでなければ、
電子等、荷電粒子の光線下でフォトレジストにパターンを形成する。マスクはフ
ォトレジストの性質に応じ、陽マスクとしても陰マスクとしてもよい。また、マ
スクには、作用電極の所望パターンが含まれる。いったん露光を行えば、作用電
極間におけるフォトレジストおよび薄膜の部分は、例えば標準なエッチング術、
食刻法、腐食法（乾式または湿式）を用いて選択的に除去され、アレイ上には分
離した作用電極のみが残る。
【００４９】 作用電極は、例えば、正方形、長方形、円形、卵形のような様々な形状とする
ことができる。作用電極は非常に小さくてもよく、例えばその大きさは５０μｍ
以下、好ましくは１０μｍ以下、より好ましくは５μｍ以下とすることができる
。いくつかの実施形態においては、作用電極は三次元構造を有している。小型化
された本発明の作用電極の表面積は、概して１×１０-4ｃｍ2以下であり、好ま
しくは１×１０-5ｃｍ2以下であり、より好ましくは１×１０-6ｃｍ2以下であり
、最も好ましくは１×１０-7ｃｍ2以下である。一般に、基板上の小型センサー
の密度は、１，０００センサー／ｃｍ2以上、好ましくは１０,０００センサー／
ｃｍ2以上である。
【００５０】 電極１０２は、電位を印加するため、例えば基板を介してバイア（図示せず）
によって；作用電極１０２（図1に示す）と共に基板１１４上に形成された導電
線１２２（「ランナ」としても知られる）によって；および／または、シリコン
基板上に形成された後、誘電材料で被覆された導電線であって、その上に誘電材
料を貫通して導電線に達するバイアと共に作用電極が形成されているものによっ
て、コンタクトパッド１２０に接続されている。導電線（または「ランナ」）が
基板上に形成されると、これらの導電線は、無機または有機オーバレーヤ（over
layer）によりオリゴヌクレオチドへの暴露から遮蔽される。
【００５１】 半導電性または光導電性材料を用いた場合、電極は禁止帯幅よりもエネルギー
が大きいフォトンに照らされ、特定の部位または素子に所望の電位を発生させる
か、もしくは特定のミクロゾーン（microzone）を絶縁体から導体へと一時的に
変換し、これにより照射が行なわれている間、このゾーンを電気的に接続する。
【００５２】 カウンタおよび比較電極が、電解液中において作用電極のアレイを有する基板
表面から離れたところに存在していてもよい。そうでなければ、カウンタおよび
比較電極が基板の一部であるか、例えば作用電極と同一の面か異なる面に配置さ
れた、アレイを有する「チップ」の一部であってもよい。各作用電極が、専用の
カウンタまたは比較電極を有する必要はない。同一のカウンタまたは比較電極が
、アレイ上の複数の電極としての機能を果たし、全ての電極として機能すること
すらある。
【００５３】 比較電極は、イオンを濾過せず、一定の電位を保つものであることが好ましい
。比較電極は、例えば銀製の電線または構造体であってもよく、電解液に接触し
ている。銀製の電線または構造体の表面は部分的に酸化されて、化学的、電気化
学的、その他によりＡｇ+Ｃｌ-を生成する。
【００５４】 ［流路アレイ］ マルチセンサーアレイは、分析される溶液が多数のセンサーを通過するための
流路を備えていてもよい。、標的ＤＮＡまたはＲＮＡは、センサーを通過する上
記サンプル溶液より捕捉される。流路は、プラスチック、シリコン、セラミック
材料、またはその他の好適な材料で構成されていてよい。精査に要されるサンプ
ル溶液の量を減らすため、好ましくは流路の幅を２００μｍ以下にする。流路が
狭いため、流路内の液体の通路には、空気を含むがこれに限定されない加圧流動
体の使用のようなポンピング技術を用いてもよく、または２以上の電極間に電位
を印加し、溶液が狭い通路内を通過できるようにしてもよい。
【００５５】 ［レドックスポリマー］ レドックスポリマー１０４は、作用電極１０２上に沈着されている。一般には
、レドックスポリマー１０４は作用電極１０２間の基板１１４上には沈着されず
、これにより作用電極１０２間の電気分離状態を保っている。レドックスポリマ
ーに可動性の活性レドックス官能基が含まれていれば、通常、レドックスポリマ
ーにより電極へ、または電極から電子が十分に輸送される。例えば、レドックス
ポリマーの一種として、レドックスヒドロゲルが挙げられるが、これは概して多
量の水を含んでいる。水溶性反応物質および生成物は、しばしば水に分散するの
とほぼ同じ速さでレドックスヒドロゲルに浸透する。レドックスヒドロゲルにお
ける電子伝導は、ヒドロゲルが水和された後、可動性であるポリマーセグメント
間の電子の交換によって行なわれる。
【００５６】 一般に、レドックスポリマーには、電気還元および電着塗装イオン、官能基（
functionalities）、種、標準カロメル電極（ＳＣＥ）のレドックス電位より数
百ミリボルト高いかまたは低いレドックス電位を有する分子が含まれている。好
ましいレドックスポリマーは、ポリマーに結合したレドックス種を有し、このポ
リマーが今度は作用電極に固定される。このポリマーは、さらにオリゴヌクレオ
チドに対する結合部位を有している。レドックスポリマーは、中性のｐＨにおい
て、ＳＣＥに対して、約−４００ｍＶを超えて還元することはなく、また約８０
０ｍＶを超えて酸化することがないものであるのが好ましく、さらにＳＣＥに対
して、約−１５０ｍＶを超えて還元することはなく、また約＋４００ｍＶを超え
て酸化することがないものであるのが最も好ましい。最も好ましいレドックスポ
リマーは、オスミウム、ルテニウム、またはコバルトレドックス中心を有し、か
つＳＣＥに対するレドックス電位が約−１５０ｍＶから約＋４００ｍＶの範囲で
ある。
【００５７】 一般的に、本発明において好適に使用されるレドックスポリマーは、サンプル
分析期間中におこる拡散によるレドックス種の損失を防ぐか、または実質的に減
少させる構造または電荷を有している。レドックス種とポリマー間の結合は、共
有結合、配位結合、イオン結合のいずれかであってよい。有用なレドックスポリ
マーおよびその製造方法が、第５，２６４，１０４号、第５，３５６，７８６号
、第５，２６２，０３５号、および第５，３２０，７２５号、および第５，６６
５，２２２号に記載されており、これらを参照し、本明細書において援用する。
あらゆる有機または有機金属レドックス種がポリマーに結合し、レドックスポリ
マーとして使用可能であるが、好ましいレドックス種は遷移金属化合物または錯
体である。好ましい遷移金属化合物または錯体としては、オスミウム、ルテニウ
ム、鉄、およびコバルト化合物または錯体が挙げられる。最も好ましいのはオス
ミウム化合物および錯体である。
【００５８】 ある種の重合性レドックスポリマーは、重合性組成物中に共有結合したレドッ
クス種を含有している。この種の媒体（mediator）の一例が、ポリ（フェロセン
）である。
【００５９】 他の種類のレドックスポリマーとしては、イオン結合したレドックス種を含有
するものが挙げられる。一般に、この種の媒体には、逆荷電レドックス種に結合
した荷電ポリマーが含まれる。この種のレドックスポリマーの例としては、Ｎａ
ｆｉｏｎ（登録商標）デュポン（DuPont）等の負荷電ポリマーであって、オスミ
ウムまたはルテニウムポリピリジルカチオンを1以上含む正荷電レドックス種と
結合したものが挙げられる。レドックスポリマーの他の例としては、四級化ポリ
（４−ビニルピリジン）またはポリ（１−ビニルイミダゾール）等のイオン結合
正荷電ポリマーと、フェリシアン化物またはフェロシアン化物のような負荷電レ
ドックス種が挙げられる。よって、結合がイオン性のものである場合、レドック
スポリマーは、逆荷電レドックスポリマー内に結合された、それ自体が重合性の
高荷電レドックス種で構成されていてもよい。
【００６０】 また、本発明の他の実施形態においては、好適なレドックスポリマーには、ポ
リマーに配位結合したレドックス種が含まれる。例えば、この媒体は、ポリ（１
−ビニルイミダゾール）またはポリ（４−ビニルピリジン）に対するオスミウム
またはコバルト２，２’−ビピリジル錯体の配位によって形成される。
【００６１】 好ましいレドックス種は、１以上のリガンドを有する遷移金属錯体、最も好ま
しくはオスミウム、ルテニウム、またはコバルトの錯体であって、各リガンドは
２，２’−ビピリジン、１，１０−フェナントロリン、２，２’，２’’−ター
ピリジン、またはこれらの誘導体といった窒素含有複素環を有するものである。
より好ましいレドックス種は、２つのリガンドと錯体を形成したオスミウムカチ
オンであり、各リガンドが２，２’−ビピリジン、１，１０−フェナントロリン
、またはこれらの誘導体を含み、かつこれら２つのリガンドは必ずしも同一では
ない。好ましいオスミウム、ルテニウム、またはコバルトの錯体においては、イ
オンが６つの配位部位を有しており、これらの３つ以上に窒素が配位し、かつリ
ガンドの数が１〜３の範囲である。最も好ましい錯体では、５つの配位部位に窒
素が配位し、リガンドの数が２〜３の範囲である。
【００６２】 好ましいレドックス種は、錯体が速やかに酸化還元されるよう、相互間および
作用電極間で速やかに電子を交換する。好ましいレドックス種は、ポリマーに配
位結合もしくは共有結合している。配位結合に好ましいポリマーは、ピリジン、
イミダゾール、またはこれらの誘導体といった窒素含有複素環を有しており、こ
れらはリガンドとしてレドックス種に結合する。
【００６３】 上述したオスミウム遷移金属錯体等のレドックス種と錯体を形成する好ましい
ポリマーとしては、ポリ（１−ビニルイミダゾール）（「ＰＶＩ」と称す）ポリ
（４−ビニルピリジン）（「ＰＶＰ」と称す）およびピリジニウム修飾ポリ（ア
クリル酸）が挙げられる。ポリ（１−ビニルイミダゾール）の好適なコポリマー
置換基としては、アクリロニトリル、アクリルアミド、アクリルヒドラジド、お
よび置換または四級化Ｎ-ビニルイミダゾールが挙げられる。オスミウム遷移金
属錯体はポリマーのイミダゾール基またはピリジン基に配位結合する。一般に、
オスミウム遷移金属錯体とイミダゾール基および／またはピリジン基の比は１：
１０〜１：１の範囲、好ましくは１：２〜１：１の範囲、より好ましくは３：４
〜１：１の範囲である。また、錯体を形成した遷移金属原子の数と重合したビニ
ル官能基の数の比は、１：２〜１：３０の範囲、好ましくは１：５〜１：２０の
範囲である。
【００６４】 その他のレドックス種の例としては、キノン類と、酸化された状態でナイルブ
ルーやインドフェノールのようなキノイド構造を有する種とが挙げられる。好ま
しいキノンおよびキノイドは６員環に水素原子を有していない。
【００６５】 ポリマーもまた、センサーオリゴヌクレオチドに対する結合部位を有している
。一実施形態においては、センサーオリゴヌクレオチドは、ポリマーのヒドラジ
ド官能基に結合しているカルボジイミドにより、ポリマーに結合している。ヒド
ラジド官能基は様々な方法によって得ることができる。
【００６６】 例えば、一実施形態において、ポリマーは、ＰＶＩまたはＰＶＰとポリアクリ
ルアミド（「ＰＡＡ」と称す）とのコポリマーである。オスミウム遷移金属錯体
は、ＰＶＩまたはＰＶＰ成分のイミダゾール基またはピリジン基にそれぞれ結合
している。センサーオリゴヌクレオチドに対する結合部位を形成するため、アク
リルアミドのアミド基の一部が公知の処理によってヒドラジド基に変換される。
一般に、アミド基の少なくとも５％が変換され、好ましくは少なくとも１０％が
変換され、より好ましくは少なくとも２０％が変換される。
【００６７】 ＰＶＩまたはＰＶＰとＰＡＡとの比率は、一般に５：１〜１：１５の範囲、好
ましくは２：１〜１：１２の範囲、より好ましくは１：１〜１：１０の範囲であ
る。
【００６８】 他の実施形態においては、ポリマーは、ＰＶＩまたはＰＶＰとＰＡＡおよびヒ
ドラジド修飾ＰＡＡポリマー（「ＰＡＨ」と称す）との共重合体の架橋集形（cr
oss-linked combination）である。ＰＡＨにおけるヒドラジド修飾アミド基と非
修飾アミド基との比率は、一般に、１：１〜１：２０の範囲、好ましくは１：２
〜１：１０の範囲である。また、ＰＶＩまたはＰＶＰの共重合体とＰＡＨとの比
率は、一般に、１：５〜２：１の範囲、好ましくは１：３〜１：１の範囲である
。以下に述べるように、２つのポリマーを、各ポリマーのヒドラジド修飾基を用
いて架橋することができる。
【００６９】 さらに他の実施形態においては、ポリマーは修飾ポリ（アクリル酸）である。
上記ポリ（アクリル酸）におけるカルボン酸官能基の一部をピリジンまたはイミ
ダゾール反応剤（reactive agent）によって処理し、ピリジン基またはイミダゾ
ール基をポリマーに付着させる。このような基としては、例えば、カルボジイミ
ド結合を用いて付着可能な４−（２−アミノエチル）-ピリジンのような４−（
アミノアルキル）−ピリジンが挙げられる。よって、ピリジン基またはイミダゾ
ール基をオスミウム遷移金属錯体との結合に使用することができる。一般に、少
なくとも２％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％の
カルボン酸官能基を、ピリジンまたはイミダゾール反応剤で処理する。カルボン
酸基の残りの部分は、オリゴヌクレオチドに結合させるため、ヒドラジド基に機
能化される。一般に、少なくとも２％、好ましくは少なくとも５％、より好まし
くは少なくとも１０％のカルボン酸基がヒドラジド基に機能化される。
【００７０】 電極表面にレドックスポリマーを固定するために、様々な方法を用いることが
できる。一方法は、吸着による固定である。この方法は、比較的高分子量を有す
るレドックスポリマー、例えば分子量が１０4ダルトン以上、好ましくは１０5ダ
ルトン以上、最も好ましくは１０6ダルトン以上のレドックスポリマー、に対し
て特に有用である。ポリマーの分子量は、例えば、ピアースカタログ（Pierce c
atalog）、1994、T155〜T167に記載されているような二官能基性または多官能基
性架橋剤により増加することができる。本発明で有用な架橋剤の官能基の例とし
ては、エポキシ、アルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミド、ハロゲン、イミダ
ート、チオール、およびキノン官能基が挙げられる。まや架橋剤の例としては、
二官能基性ポリ（エチレングリコール）および塩化シアヌルが挙げられる。有用
な架橋剤の具体例としては、４００または６００ドルトンのポリ（エチレングリ
コール）ジグリシジルエーテル（ＰＥＧＤＧＥ）が挙げられる。また、他の架橋
剤を用いてもよい。いくつかの実施形態においては、付加的な架橋剤は必要でな
い。
【００７１】 他の実施形態において、レドックスポリマーは、電極表面の機能化、そして電
極表面の官能基へのレドックスポリマーの化学結合、しばしば共有結合、によっ
て固定化される。この種の固定化の一例は、ポリ（４−ビニルピリジン）によっ
て開始される。ポリマーのピリジン環は、部分的に、ｂｐｙが２，２’−ビピリ
ジンである［Ｏｓ（ｂｐｙ）2Ｃｌ］+/+2といったの還元／酸化種と錯体を形成
する。ピリジン環の一部は２−ブロモエチルアミンとの反応により四級化される
。そして、ポリマーは、例えばポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテ
ルのようなジエポキシドを用いて架橋される。
【００７２】 炭素表面は、例えば、ジアゾニウム塩の電気還元により、レドックス種または
ポリマを付着させるため修飾することができる。一説明として、ｐ−アミノ安息
香酸のジアゾ化により形成されたジアゾニウム塩の還元により、フェニルカルボ
ン酸官能基を有する炭素表面が修飾される。そして、これらの官能基は、１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩のような、
カルボジイミドにより活性化され得る。その後、活性化された官能基は、上述の
四級化されたオスミウム含有レドックスポリマ、または２−アミノエチルフェロ
センのようなアミン官能化レドックス対と結合され、レドックス対を形成する。
【００７３】 同様に、金および他の金属の表面も、シスタミンのようなアミンにより機能化
できる。［Ｏｓ（ｂｐｙ）2（ピリジン−４−カルボキシレート）Ｃｌ］0/+のよ
うなレドックス対は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カル
ボジイミド塩酸塩により活性化され、金結合アミンと反応してアミドを形成する
反応性Ｏ−アシルイソ尿素を形成する。
【００７４】 ［センサーオリゴヌクレオチド］ センサーオリゴヌクレオチド１０６は、作用電極上に固定された核酸シーケン
スであり、標的核酸シーケンスとハイブリッドを形成するハイブリダイゼーショ
ンプローブとして有用である。センサーオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲ
ＮＡシーケンスを含み、またペプチドが付着したＤＮＡまたはＲＮＡシーケンス
を含み、これらのオリゴヌクレオチドは特定の診断または固定化目的に有用であ
り、ペプチド核酸（ＰＮＡ、タンパク質核酸としても知られている）を含んでい
る。ＰＮＡはハイブリダイゼーションプローブとして有用である。なぜなら、ハ
イブリットのセグメント間での静電気反発を減少させる負荷電フォスフェート官
能基がＰＮＡには存在しないため、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡがＰＮＡにより、
より強固に結合されるからである。この強固な結合により、認識に要するセグメ
ントがより短くてすむ。一般に、８塩基ＰＮＡがプローブとして効果的に使用さ
れる。ＤＮＡおよびＲＮＡプローブに関して述べたように、ＰＮＡプローブは、
例えば検出化合物の電気化学的反応に触媒作用を及ぼす触媒のような標識に結合
することができる。ＤＮＡまたはＲＮＡプローブと同様に、ＰＮＡプローブは特
定電極のレドックスポリマーと結合することができる。
【００７５】 センサーオリゴヌクレオチドを、従来のヌクレオチド、合成ヌクレオチド、ペ
プチドヌクレオチド等で構成するようもしてもよい。センサーオリゴヌクレオチ
ドは、一般に、ハイブリダイゼーションに有用なヌクレオチドシーケンスを含み
、かつその長さは約５〜約３００ヌクレオチド、好ましくは約８〜２０ヌクレオ
チドである。各作用電極は選択されたセンサーオリゴヌクレオチドで形成され、
選択されたセンサーオリゴヌクレオチドは、他の作用電極のヌクレオチドと同一
または異なるシーケンスを含んでいてもよい。一般に、各作用電極は、アレイ上
で所望の重複（redundancy）に従い、独特のセンサーオリゴヌクレオチドシーケ
ンスを含んでいる。したがって、例えば、センサーアレイにおける少なくとも２
個の作用電極１０２が、好ましくは少なくとも４個の作用電極１０２が、より好
ましくは少なくとも１０個の作用電極１０２が、さらに好ましくは少なくとも１
００個の作用電極１０２が、最も好ましくは少なくとも１，０００個の作用電極
１０２が、異なるヌクレオチドシーケンスを有するセンサーオリゴヌクレオチド
を有している。
【００７６】 センサーオリゴヌクレオチドの特定のヌクレオチドシーケンスは、所望の用途
に応じて選択される。例えば、癌のような特定疾患を誘発する危険に関与する遺
伝子の突然変異の検出に有用なアレイには、公知の遺伝子の突然変異体と特異的
にハイブリッドを形成し、それを識別するよう設計されたオリゴヌクレオチドセ
ンサーシーケンスを１以上含まれるであろう。特定の病原体微生物を検出するた
め、血液サンプルの検査を行う診断用アレイには、病原体と特異的にハイブリッ
ドを形成し、それを識別するよう設計されたオリゴヌクレオチドセンサーシーケ
ンスを１以上含まれるあろう。核酸シーケンスの検出および識別を行うため、本
発明のアレイを多種多様な用途で使用できるということは、核酸配列決定の分野
の当業者にとっては既に明白であろう。
【００７７】 ［センサーオリゴヌクレオチドの電極への結合］ センサーオリゴヌクレオチドは、公知の技術を用いて生産できる。センサーオ
リゴヌクレオチドは、レドックスポリマーと結合させるため、好ましくはオリゴ
ヌクレオチドの一端部に反応性基を添加して調製する。使用される特定の反応性
基は、一般に、レドックスポリマーの反応部位の官能基や副反応の可能性によっ
て左右される。
【００７８】 一実施形態においては、レドックスポリマーの反応部位が、上述のようにヒド
ラジドである。本実施形態においては、好適な反応物質はオリゴヌクレオチドの
５’−フォスフェートエステルである。オリゴヌクレオチドを水等の溶媒中に溶
解し、０．１Ｍの１−メチルイミダゾール緩衝液と組み合わせる。そしてオリゴ
ヌクレオチド溶液をカルボジイミドと組み合わせ、フォスフェートエステルを活
性化させる。模範的なカルボジイミドは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）である。その代わりとして、過
ヨウ素酸塩による３’端部の酸化により、ヒドラジン部位と反応するアルデヒド
基が生成される。いったんフォスフェート基が活性化されると、オリゴヌクレオ
チド溶液はヒドラジン活性結合部位を有する電極と反応する。
【００７９】 単一または複数の特定電極に対して選択的にオリゴヌクレオチドを結合させる
ため、単一または複数の電極に電位を与えてオリゴヌクレオチドを引き付け、オ
リゴヌクレオチドの電極への移動が促がされるが、この方法は電気泳動として知
られている。この方法は、低イオン強度で行なわれるのが好ましく、具体的には
０．１ＭＮａＣｌ以下、より好ましくは０．００１モルＮａＣｌ以下、最も好ま
しくは添加塩が存在しない状態でかつ精製反応物質を用いて行う。
【００８０】 電気泳動法においては、通常従来のオリゴヌクレオチドがアニオン性官能基を
含んでいるため、かつ電極が正荷電されるよう電位が印加されているため、吸引
力が生じる。いくつかの用途においては、固定されるオリゴヌクレオチドにはペ
プチドシーケンスが付着されている。ペプチドはカチオンおよびアニオンの両方
を含有できる。特定の実施形態では、溶液のｐＨ、印加電位、およびオリゴヌク
レオチド溶液の等電点を調整し、特定オリゴヌクレオチドの所望電極への電気泳
動的移動またはイオン移動を調整するようにしてもよい。オリゴヌクレオチドは
、適切な電位が印加されている単一または複数の電極に優先的に引き付けられる
ため、オリゴヌクレオチドはこれら電極に沈着されたレドックスポリマーに優先
的に結合する。
【００８１】 いくつかの実施形態においては、オリゴヌクレオチドに反発し、その沈着を防
止するような電位を特定電極に印加する。自然型オリゴヌクレオチドは、中性の
ｐＨでポリアニオンであり、正の電位が印加されている電極に引き付けられ、負
の電位が印加されている電極には反発される。付着させる分子の具体的なイオン
特性を知ることで、アレイの各電極が所望通りに選択的に分子を吸引または反発
するよう、アレイの各電極に対し適切な電位が印加できるようになる。
【００８２】 ［プローブオリゴヌクレオチド］ 本発明のプローブオリゴヌクレオチドは、標識された標的核酸シーケンス１０
８または第２の標識ハイブリダイゼーションプローブ１０９を有している。標識
オリゴヌクレオチドは、例えばオリゴヌクレオチドの触媒といった標識を結合さ
せて調製できる。触媒は、検出化合物の電気化学的反応に対して触媒作用を及ぼ
す。検出化合物の電気化学的反応は、検出化合物の電気的酸化または電気的還元
であることが好ましい。この電気化学的反応により、レドックスポリマーおよび
触媒を介して電極に電流が形質導入（transduce）される。図１５Ａに示した実
施形態においては、プローブオリゴヌクレオチドがヌクレオチドの相補的シーケ
ンスを有するセンサーオリゴヌクレオチドに優先的に結合するため、適切なセン
サーオリゴヌクレオチドを有するセンサーに電流が発生する。しきい値（thresh
old value）を超える電流を持つ電極を観察することで、プローブオリゴヌクレ
オチドのシーケンス部分を決定することができる。また、プローブオリゴヌクレ
オチドが１以上のセンサーオリゴヌクレオチドに対して相補的な部分を有する場
合、１以上の電極において電流が発生する。
【００８３】 図１５Ｃに示した実施形態においては、センサーオリゴヌクレオチドおよび標
識プローブオリゴヌクレオチドの双方に対する標的核酸シーケンスのハイブリダ
イゼーションにより、プローブオリゴヌクレオチドに付着した触媒が作用電極に
結合される。限界値を超える電流を有する電極は、ハイブリダイゼーションが起
こったことを示している。
【００８４】 ［センサーオリゴヌクレオチドの電極への結合］ 第１電極修飾オリゴヌクレオチドは、静電気結合よりもむしろ共有結合によっ
てレドックスポリマーに結合されることが好ましい。最も好ましい実施形態にお
いては、レドックスポリマーは、オリゴヌクレオチドと反応して共有結合する官
能基を有する。ポリアニオン性オリゴヌクレオチドを用いてレドックスポリマー
を修飾する場合、中性のｐＨで、かつ低イオン強度（０〜０．１ＭＮａＣｌ）で
のレドックスポリマーの電荷は、負であるか、荷電していないか、もしくは正電
荷が５ｍｅｒあたり１未満、好ましくは１０ｍｅｒあたり１未満、最も好ましく
は２０ｍｅｒあたり１未満の極めて微弱な正である。
【００８５】 ポリアニオン性オリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合、オリゴヌク
レオチド修飾レドックスポリマーと、酵素触媒を標識とする相補的オリゴヌクレ
オチドを含めたプローブとの間に強力な静電気的相互作用が存在しないことが好
ましい。センサーオリゴヌクレオチドとプローブオリゴヌクレオチドとが結合し
ているか、またはハイブリッドを形成している場合、例えば約０．５Ｍ ＮａＣ
ｌのような高いイオン強度で精査が行なわれるため、静電気的相互作用の程度は
、塩を添加し、イオン強度を十分に上昇させることによって減少させられる。通
常は、ＮａＣｌを約０．５Ｍの濃度に、好ましくは１Ｍの濃度とするのに必要な
量だけ添加すれば十分である。触媒標識プローブオリゴヌクレオチドとオリゴ糖
修飾レドックスポリマー間の静電気的相互作用の程度もまた、ｐＨ７で負荷電、
非荷電、もしくは微弱な正荷電である触媒標識を用いて減少させることが可能で
ある。好ましい触媒標識は、約８以下の等電点（ｐＩ）を有するものであり、よ
り好ましくはｐＩが約６．５以下のもの、最も好ましくはｐＩが約５またはそれ
以下のものである（等電点はｐＨ単位によって表される）。
【００８６】 ブロッキング緩衝液（Blocking buffers）、ＴＷＥＥＮ等の洗浄剤、およびそ
の他公知の方法を用いてプローブオリゴヌクレオチドの非特異性結合を減少させ
ることができる。
【００８７】 ペプチドオリゴヌクレオチド（例えば、核酸とアミノ酸の両方を含むハイブリ
ッド合成分子）は、ｐＨ７において必ずしも負荷電でなくてよい。ペプチドオリ
ゴヌクレオチドをセンサーオリゴヌクレオチドとして使用した場合、レドックス
ポリマーは実質的に正荷電を有し、および／またはプローブオリゴヌクレオチド
は、従来のオリゴヌクレオチド（アミノ酸を含まない）を使用する際に必要であ
ったような、特に低い等電点を必要としない触媒で標識されてもよい。ハイブリ
ダイゼーション対（センサーオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオ
チド）の一方が自然性オリゴヌクレオチドであり、もう一方がタンパク質オリゴ
ヌクレオチドまたはペプチドオリゴヌクレオチド（アミノ酸シーケンスと核酸シ
ーケンスとの組み合せ）である場合、弱荷電のレドックスポリマーと酵素標識と
が好ましい。レドックスポリマーと酵素標識の電荷は、レドックスポリマーと反
応させるためにオリゴヌクレオチドを電気泳動的に沈着させた溶液のｐＨ、なら
びにプローブオリゴヌクレオチドがセンサーオリゴヌクレオチドとハイブリッド
を形成した溶液のｐＨを制御することによって調節することができる。
【００８８】 ハイブリダイゼーション後、プローブオリゴヌクレオチドは様々な方法でセン
サーオリゴヌクレオチドから除去される。模範的な方法は、熱または化学薬品を
用いてオリゴヌクレオチド間のハイブリッド形成結合を変性（融解）させること
である。
【００８９】 ［触媒］ 本発明においては様々な触媒を使用することができる。触媒の例としては、検
出化合物の電気化学的反応を触媒する酵素があげられる。様々な酵素を使用する
ことができ、例えば、過酸化水素のために使用されるペルオキシダーゼ、グルコ
ースのために使用されるグルコースオキシダーゼやグルコースデヒドロゲナーゼ
、ラクテートのために使用されるラクテートオキシダーゼやラクテートデヒドロ
ゲナーゼがあげられる。熱安定性酵素（３７℃で少なくとも１時間作用可能な酵
素）を使用する。熱安定性酵素は、３７℃で１時間作用可能である。ここで「作
用可能」とは、加熱後の活性の消失が３０％未満、より好ましくは１０％未満で
あることを意味する。類似のシーケンスを保存する必要がある場合、この場合の
ように、例えば、突然変異が検出される可能性がある場合、または癌や遺伝子疾
患を診断すべきとき、例えば、認識プロセスにおいて作製されたハイブリッドの
溶融温度以下の約５℃で作用させると、酵素がその酵素活性の約７０%以上を保
持する時間が１時間を超えるような熱安定性の高い酵素を使用することが好まし
い。大豆ペルオキシダーゼは有用な熱安定性酵素の一例である。
【００９０】 触媒もまた、前駆体化合物が電極酸化可能な、もしくは電極還元可能な化合物
の加水分解を促進する酵素である。そのような触媒の一例としては、アルカリフ
ォスフェート、ｐ−アミノフェノールのフォスフェートエステル誘導体の加水分
解を促進し、電気還元可能なＰ-アミノフェノールを作製する酵素がある。
【００９１】 [プローブオリゴヌクレオチドと触媒の結合] プローブオリゴヌクレオチドを様々な方法で触媒に結合させる。特に、プロー
ブオリゴヌクレオチドは反応的機能性とともに１以上の官能基を持つプローブを
触媒上に繰り返し結合させることによって調製することができる。
【００９２】 一実施形態においては、プローブオリゴヌクレオチドの５'-フォスフェートエ
ステルを０．１ ｍＭ の１-メチルイミダゾール緩衝液およびＥＤＣを含有する
溶液中で活性化し、ヒドラジンモノヒドレートと反応させ、モノヒドラジドを作
製する。前記酵素を処理し、例えば、過ヨウ素酸塩ナトリウムで処理することに
よって、アルデヒドの機能性単位を生成する。前記処理した酵素およびヒドラジ
ド機能性オリゴヌクレオチドを反応させて、シッフ塩基（ヒドラゾンとしても知
られている）を、酵素のアルデヒドとオリゴヌクレオチドのヒドラジドの間に作
製する。これらのシッフ塩基をボロヒドリドナトリウム等の還元剤を用いて還元
し、触媒標識オリゴヌクレオチドを作製した。
【００９３】 [検出化合物] 検出化合物は通常、標識触媒もしくは酵素（酵素がペルオキシダーゼであると
きは過酸化水素）の存在下で還元もしくは酸化された化合物（例えば、基質）で
ある。それは、また容易に電気酸化もしくは電気還元され、より活性の少ない前
駆体から電気化学的に酵素−触媒加水分解反応によって形成される化合物でもあ
る。
【００９４】 [サンプル] 本発明の方法において、核酸サンプルを分析し、それが装置／システムのオリ
ゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーションすることができるかどうかを
分析した。前記核酸サンプルはＤＮＡでもＲＮＡでもよい。前記サンプルは体液
もしくは組織サンプル、例えば、血液、尿、糞便であることが好ましい。前記サ
ンプルを分析し、１以上の特定の核酸シーケンスの有無を分析した。核酸サンプ
ルがＲＮＡ（例えば、病原体および癌から検出されることがより好ましい）であ
るとき、量が多く、加水分解速度が遅いことからリボソームＲＮＡが好ましい。
ＲＮＡは病原体および細胞にＤＮＡより多く生成される（比率はそれぞれ１０4
：１）。そのような場合、制限エンドヌクレアーゼセグメント長、約２００〜３
００長を使用することが好ましい。しかし、５０〜 １，０００塩基長のシーケ
ンスを使用することもできる。
【００９５】 前記サンプルは直接使用してもよいが、サンプルを処理してハイブリダイゼー
ション用の核酸を放出することが好ましい。例えば、血液もしくは糞便もしくは
尿サンプル（もしくはその他の組織）を処理して細胞を溶出する。放出されたＤ
ＮＡおよび／またはＲＮＡを、例えば、エンドヌクレアーゼを用いて分解し、核
酸フラグメントを、好ましくは約２５０〜３００塩基対に調製する。核酸フラグ
メントを、例えば、熱によって変性させ、一本鎖サンプルを作製し、本発明の診
断アッセイシステムにおいて使用し、特異的プローブとのハイブリダイゼーショ
ンを分析する。本発明の好ましい方法においては、核酸サンプルは、例えば、Ｐ
ＣＲによって増幅せず、アッセイにおいて直接行う。
【００９６】 [アレイの操作] 操作の好ましい態様においては、アレイを、その上に固定化された１以上のセ
ンサーオリゴヌクレオチドの一部または全部に対して相補的な標的核酸シーケン
ス（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含有する１または複数の溶液に曝す。標的シーケン
スは、付着した触媒、好ましくは酵素標識を含有してもよい。また、標的シーケ
ンスを標識せず、付着した触媒（酵素）標識を含む第２の標識オリゴヌクレオチ
ドシーケンスを添加してもよい。アレイが曝露された同一もしくは異なる溶液は
、触媒（酵素）の基質を含有する。センサーオリゴヌクレオチドをハイブリダイ
ゼーション条件において、標的および／または酵素標識プローブオリゴヌクレオ
チドからなる溶液の中で反応させた後、マイクロ電極に電位を与える。
【００９７】 標識酵素によって促進される反応の発生と関連する電流を検出する。電流は、
標識酵素の基質の電気酸化もしくは電気還元の結果起こることもあり、酵素−触
媒反応の生成物の電気酸化または電気還元の結果起こることもあり、または、多
数の変換工程がある場合は、反応のシーケンスの最終生成物の電気酸化もしくは
電気還元で起こることがある。例えば、酵素標識がその基質、過酸化水素の電気
還元によるペルオキシダーゼの場合、水に電流を流してもよい。過酸化水素は安
定な前駆体からin situで生成することができる。例えば、過酸化水素よりもむ
しろ、グルコースを試験溶液に添加することができる。溶液に、グルコースと酸
素分子の反応を触媒し、グルコノラクトーンや過酸化水素を生成することが知ら
れているグルコースオキシダーゼを添加することによって過酸化水素を生成する
こともできる。添加したグルコースオキシダーゼは、安定性を改善するために、
例えば、過酸化シリカゲル中に固定化させてもよいし、ゾル−ゲルプロセスによ
って作製してもよい。
【００９８】 いかなる「配線」されていない酵素でも、検出化合物を作製するために使用す
ることができる。検出化合物は通常ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡシーケンスを標
的するために使用する触媒の基質もしくは共基質であり、反応を認識するために
適用される。反応を触媒し、それによって化合物が生成されたことを確認する触
媒の例としてはコリンオキシダーゼがある。過酸化水素とは異なり、コリンは安
定な化合物である。コリンオキシダーゼの触媒中心（１または複数）は電極上で
レドックスポリマー(１または複数)を有する電子の変換をしない。酵素は溶解さ
れたコリンと溶解された酸素の反応を触媒し、それによって過酸化水素を生成す
る。したがって、コリンオキシダーゼが電極上でレドックスポリマー中に共固定
化され、コリンが空気もしくは酸素が溶解している溶液中に存在するとき、過酸
化水素を添加する必要がなくなる。
【００９９】 しかし、レドックスポリマー中の検出化合物を生成するための別の実施例は、
レドックスポリマー中に加水分解酵素に組み込むことによってキノンに酸化され
、空気酸化可能なポリフェニルを生成するレドックスポリマーである。キノンは
、例えば、オキシダーゼ等のフラビン蛋白質の共基質である。しかし、実施例３
は加水分解酵素を用いている。それによって空気酸化可能なアミンフェノン、例
えば、ｐ−アミンフェノールを、例えば、アミド型蛋白質分解酵素によって生成
する。また、酸化されたキノイド型の生成物（ｐ−アミノフェノール）はオキシ
ダーゼおよびその他のレドックス酵素の基質である。
【０１００】 また、オリゴヌクレオチド-標識酵素はグルコースオキシダーゼであってもよ
く。また、ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション後のグルコース
の電気還元であってもよい。
【０１０１】 [不適正の識別] オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションされた相補的鎖の溶融温度は、
例えば、下記式を用いて計算することができる。
【０１０２】
【数１】 例えば、１８塩基対のオリゴヌクレオチドを使用するとき、溶融温度は約５８
℃と計算される。不適正塩基対が１箇所のとき、融点は約５℃減少する。不適正
塩基対が４箇所のとき、約２０℃減少する。オリゴヌクレオチドの標的への融着
を分析することによって、不適正および相補的オリゴヌクレオチドシーケンスを
識別することができる。
【０１０３】 実施例 本発明は、以下の実施例によってさらに理解されるだろう。これらの実施例は
本発明を限定するものではない。
【０１０４】 実施例１ レドックスポリマーを用いた電極の調製 [材料] ２５〜３０塩基一本鎖ポリ（デオキシチミジン）−５'−フォスフェート（ｐ
（ｄＴ）25-30）（カタログ＃２７−７８３９−０１）、１２〜１８塩基一本鎖
ポリ（デオキシグアニジン）−５'−フォスフェート（ｐ（ｄＧ）25-18）（カタ
ログ＃２７−７８８５−０１）および２５〜３０塩基一本鎖ポリ（デオキシアデ
ノシン）−５'−フォスフェート（ｐ（ｄＡ）25-30）（カタログ＃２７−７９８
６−０１）は、ファルマシアバイオテック(Pharmacia Biotech)から入手した。
過ヨウ素酸ナトリウム（カタログ＃３１，１４４−８）、ツイーン２０（Tween2
0）（カタログ＃２７、４３４３−８）および１−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−3−エチレンカルボジイミドヒドロクロリド（カタログ＃１６，１４６−
２）は、アルドリッチ(Aldrich)から購入した。イミダゾール（カタログ＃Ｉ−
２０−２）および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（カタログ＃Ｐ−８３
７５）は、シグマ(Sigma)から購入した。特に記載のない限り、測定はすべてｐ
Ｈ７．０の０．４Ｍ塩酸ナトリウムを含有するリン酸緩衝液中で行った。
【０１０５】 直径１０μｍのガラスカーボンマイクロ電極（カタログ＃ＥＥ０１７）は、サ
イプレスシステムズ（ローレンス、カンザス州）（Cypress Systems (Lawrence,
KA)）から入手した。マイクロ電極を１．０〜０．３μｍのアルミナペーストで
研磨し、脱イオン水で超音波処理した。マイクロ電極は使用するまでずっと、脱
イオン水中に保存しておいた。直径３ミリメートルのガラス製カーボンマクロ電
極も同様に研磨した。
【０１０６】 ＥＧ＆Ｇ Ｍ２７０ソフトウェアにサポートされた、コンピュータ制御のＥＧ
＆Ｇガルバノスタットモデル２７３を、電気泳動沈着法において使用した。
【０１０７】 [Ｏｓ[4，4'−ジメチル−2，2'ビピリジン]2Ｃｌ]+/2+レドックス中心を有す
るポリアクリルアミド−ポリ（１−ビニルイミダゾール）レドックスポリマーを
、参考文献であるルームレーウッドイヤーら、アナリティカルケミストリー（Lu
mley-Woodyear, et al., Anal. Chem. ）43:1332-1338 (1995)に記載の方法で作
製した。ＰＡＡ−ＰＶＩ−Ｏｓレドックスポリマーを、０．１ｍｇ／ｍＬの脱イ
オン化した水溶液中から１〜４マイクロ電極および直径３ｍｍのマクロ電極上に
電気泳動的に沈着させた。その際、これらの電極の集合体をショートした。マイ
クロ電極をはるかに大きなマクロ電極にショートすることによって、その面積の
測定は容易になり、通過した電荷を測定することによって、電気泳動方法におい
て単位面積当たりに沈着した材料の量を正確に測定することが可能となった。
【０１０８】 ＋２０マイクロアンペアの電流を３０分間維持し、その間の総合的な電荷を６
５ｍＣとした。図４は、この期間の電位の増加を示す。図４に示すように、レド
ックスポリマーのマイクロ電極への定電流沈着中に変化した電位は極わずかであ
った。このことから沈着された層はそれほど抵抗性がないことがわかる（図４曲
線ａ参照）。
【０１０９】 マイクロ電極および直径３ｍｍのガラスカーボン製マクロ電極へショートさせ
ることによって、再生可能な厚さの膜を沈着させた。マクロ電極の面積は、定電
流、電流密度、したがってレドックスポリマーフィルムの厚さによって決まる。
実際に沈着された電気活動的ポリマーポリマーの量は電量分析法によって、走査
率５０ｍＶｓ-1で周期的ボルタモグラムの還元波および酸化波を統合することに
よって測定した。３つの異なる電極に対し、３０回沈着を試みたところ（各電極
に対し、１０回沈着）、２４回沈着に成功した。平均的な統合電荷は１．１２×
１０-10Ｃ、標準偏差＋／−０．０９×１０-10Ｃであった。これは沈着した物質
の量が＋／−８％の再生率で沈着したことを示すものである。トリエポキシド架
橋剤であるＮ，Ｎ−ジグリシジル−４−グリシドキシアニリン（５μｇ／ｍｌ）
を電気泳動的沈着反応に使用されるＰＡＡ−ＰＵＩ−Ｏｓレドックスポリマー溶
液に添加し、類似の溶液、類似の条件で再生可能フィルムを作製した。
【０１１０】 電気泳動的プロセスのまさにその性質によって、沈着は導電性カーボン表面に
限定された。光学顕微鏡による試験から、マイクロ電極およびマクロ電極の表面
全体に光沢のある紫色のレドックスポリマーフィルムが塗布されていること、周
囲の絶縁体にはポリマーが沈着されていないことがわかった。
【０１１１】 実施例２ センサーオリゴヌクレオチドの作製およびレドックスポリマーとの結合 簡単なオリゴヌクレオチドシーケンスｐｄ（Ｔ）25-30を電気泳動的に輸送し
、ＰＡＡ−ＰＶＩ−Ｏｓレドックスポリマーと共有結合させ、２工程プロセスで
、電極上のレドックスポリマーフィルムに通電した。まず、一本鎖オリゴヌクレ
オチドの末端５'−フォスフェートをＥＤＣと反応させて活性化した。次に、活
性オリゴヌクレオチドを電気泳動的に沈着させ、レドックスポリマーと反応させ
た。この工程によって、一本鎖オリゴヌクレオチドをＰＡＡ−ＰＶＩ−ＯｓのＮ
Ｈ2ヒドラジド官能基に共有結合させた。この処理では下記工程を行った。
【０１１２】 センサーオリゴヌクレオチド、ｐｄ（Ｔ）25-30１８５マイクログラムを、０
．１Ｍイミダゾール２７マイクロリットルと予備的に混合した１４７マイクロリ
ットルの脱イオン水に溶解させた。脱イオン水中、体積５０マイクロリットルの
０．５Ｍ ＥＤＣを添加し、４℃で一晩活性化処理した。その後２００マイクロ
リットルの活性化ｐｄ（Ｔ）25-30 溶液を脱イオン水で希釈し、体積を2.5ミリ
リットルとし、これを反応性電気泳動的沈着工程に用いた。 反応性電気泳動的沈着には、−１０マイクロアンペアの電流を１つのマクロ電極
に対して９００秒かけた。本工程中の電位の増加を図４に示す。
【０１１３】 活性化ｐｄ（Ｔ）25-30の反応性電気泳動的沈着は自己制限的であり、したが
って再生可能であった。電位は、最初の１０分間急上昇し、その後平坦になり、
定められた量のｐｄ（Ａ）25-30 を沈着したとき、最初に導電性レドックスポリ
マーフィルムは高い抵抗性を示した（図４、曲線ｂ参照）。したがって、補助マ
クロ電極を使用中の電流密度の制御は再生可能正にとって必須であった。−０．
３ｎＡの電流を流した個別のマイクロ電極に関する実験において、電位は最初の
１０分間は安定（−０．９〜−１．０Ｖ）、その後急速に上昇し、電位的プラト
ーの終点に達したとき、単に電位をモニターし、プロセスを止めるだけで、沈着
された材料の量を制御することが可能となることがわかった。
【０１１４】 実施例３ ペルオキシダーゼ標識オリゴヌクレオチド オリゴヌクレオチドｐｄ（Ａ）25-30およびｐｄ（Ｇ）18-20を西洋ワサビペル
オキシダーゼ（ＨＲＰ）で、上記ルームレーウッドイヤーら、ジャーナルオフア
メリカンケミストリーソサエティー（Lumley-Woodyear, et.al., 1996 J.Am.Che
m.Soc.）118:5504に記載の方法で標識した。一般的に、オリゴヌクレオチドモノ
ヒドラジド末端を、５'−フォスフェート官能基の活性化および、余剰のヒドラ
ジンとの縮合によって作製した。次にＨＲＰオリゴ糖アルコール官能基を過ヨウ
素酸塩で酸化し、アルデヒド類を得た。その後アルデヒド類およびヒドラジド類
を縮合してヒドラゾン類を作製した。
【０１１５】 ＨＲＰ標識オリゴヌクレオチドの活性は、測定された蛋白質濃度およびロイコ
塩基色素２，２'−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−硫酸）（
ＡＢＴＳ）のＨＲＰ触媒過酸化水素酸化の前記色素に対する割合から導いた。蛋
白質濃度は、バイオラッドプロテインアッセイキットＩＩ（BioRad Protein Ass
ay Kit II）を用いて測定した。色素形成率は、ヒューレットパッカードダイオ
ードアレイ（Hewlett Packard Diode Array）ＵＶ／Ｖｉｓモデル８４５２Ａ分
光光度計を用いて、分光光度的に測定した。その処理においては、２．９ｍＬの
５ｍＭ ＡＢＴＳを５０マイクロリットルの０．１８７５ ｍｇ/ｇＬのＨＲＰ標
識オリゴヌクレオチド溶液に添加し、続いて５０マイクロリットルの６０ｍＭ過
酸化水素に添加した。４０４ ｎｍでの吸光度の変化を６０秒間記録した。
【０１１６】 ＨＲＰ、ｐｄ（Ａ）25-30−ＨＲＰおよびｐｄ（Ｇ）18-20−ＨＲＰの活性を比
較したところ、いずれかのオリゴヌクレオチドに付着後、僅か４２％のＨＲＰ活
性が保存されていたこと、２つのオリゴヌクレオチドのＨＲＰ標識の活性におい
て測定可能な差はなかったことがわかった。４℃で１週間保存しても活性の消失
は認められなかったが、実験毎にＨＲＰ標識オリゴヌクレオチドの新鮮なサンプ
ルを調製した。
【０１１７】 実施例４ プローブオリゴヌクレオチドの感知 電気化学的測定は、ウォータージャケット、サーモスタット電気化学的セルを
用いた、１対の直径１０マイクロメータのガラスカーボン作用電極、銀／銀クロ
リドバイオアナリティカルシステム(Bioanalytical Systems)比較電極、および
プラチナ配線対向電極を備えたファラデーケージ(Faraday cage)の中で行った。
ＣＨインストルメントソフトウェアとともにコンピュータ制御のＣＨインストル
メントモデル７２０低ノイズ型ビポテンシオスタット（bipotentiostat）用いて
電流をモニターした。特に記載のない限り、測定はｐＨ７．０の０．４Ｍ塩酸ナ
トリウムを含有するリン酸緩衝液中で行った。
【０１１８】 ｐｄ（Ｔ）25-30 をもつ1対のＰＡＡ−ＰＶＩ−Ｏｓ塗布マイクロ電極の過酸
化水素による電気還元電流を測定することによって、核酸ハイブリッドの作製を
観察した。その電極を、４×１０-7Ｍの相補的ｐｄ（Ａ）25-30−ＨＲＰもしく
は４×１０-7Ｍの非相補的ｐｄ（Ｇ）18-20−ＨＲＰのいずれかを含有するハイ
ブリダイゼーション溶液に浸漬した。その溶液を攪拌し、４℃で維持した。その
溶液は、ＨＲＰ標識オリゴヌクレオチドの他に、５×１０-2Ｍ トリスＨＣｌ、
１Ｍ ＮａＣｌ、０．２％ ツイーン（ＴＷＥＥＮ）２０、０．１ mM ＥＤＴＡお
よび４×１０-6Ｍの非結合であるが活性のあるオリゴヌクレオチドの標識からの
ＨＲＰ残基を含有していた。この非結合ＨＲＰは、触媒電流（非特異的吸収によ
る）に寄与しなかった。２０分後、ハイブリダイゼーション溶液から電極を取り
出し、緩衝液に浸漬してすすぎ、５ｍｌの緩衝液を含有する電気化学的セルに移
し、温度制御した（２５℃）。０．０V ｖｓ.Ａｇ／ＡｇＣｌで平衡を保った。
電極を２時間安定化し、１ｍＭの過酸化水素を注入し、触媒電気還元電流をモニ
ターした。
【０１１９】 １７個のハイブリッドマイクロ電極を作り試験したところ、そのうち６個はレ
ドックスポリマーフィルムが失われていたため電流が測定されず、１個は１０ｐ
Ａ、１個は６ｐＡ、９個は約２０＋／−２ｐＡの電流がそれぞれ流れた。
【０１２０】 続いて、前記ハイブリッドを融解するために、電流の変化をモニターしながら
セルの温度を０．２５℃／分の一定割合で上昇させた。
【０１２１】 実施例５ システムの電気化学的特徴 図５は、上記実施例４に記載の方法で作製したマイクロ電極の周期的ボルタモ
グラムを示す。グラフにおいて、（ａ）は電気化学的に沈着されたＰＡＡ−ＰＶ
Ｉ−Ｏｓレドックスポリマーフィルム、（ｂ）は、ｐｄ（Ｔ）25-30の反応的電
気泳動的沈着によって、ｐｄ（Ｔ）25-30と共有結合した後のレドックスポリマ
ーフィルム、（ｃ）は、ＨＲＰ−標識ｐｄ（Ａ）25-30でハイブリダイゼーショ
ンした後、過酸化水素を添加する前の結合ｐｄ（Ｔ）25-30含有フィルムを示す
ボルタモグラムをそれぞれ表す。１．１２×１０-1-Cでの完全に還元されたフィ
ルムの電気酸化に必要な誘導電荷は、１．１６×１０-15モルのＯｓ+2に相当し
た。ポリマーのレドックス電位は＋７５V ｖｓ.Ａｇ／ＡｇＣｌであった。これ
はハチアら、1996、ネイチャーゲネティクス（Hacia et.al, 1996 Nature Genet
.）14:441に既に報告がある。還元波のピーク高は走査率に比例しており、固定
化された表面結合レドックスポリマーを示していた（図６）。一方、酸化波のピ
ーク高は、走査率の平方根に比例しており、レドックスポリマーのセグメントの
連続的な動きを示していた（アオキら、1995ジャーナル オフ フィジカルケミス
トリー（Aoki et.al., 1995 J. Phys. Chem.）99:5102）。そのように振る舞い
の混合は、水和されたフィルムにおいて予測されることであり、そのレドックス
中心が還元されると粘性が低くなる。走査率５０ｍＶ／秒で、ピーク−ピーク分
離は４５＋／−５ ｍＶであった。移動性Ｏｓ+2負荷鎖セグメントとの一致は少
なく、移動性Ｏｓ+3負荷鎖セグメントとは多く一致した。
【０１２２】 ｐｄ（Ｔ）25-30のレドックスポリマーフィルムへの反応性電気泳動的結合は
、ボルタモグラムに劇的な変化をもたらした。そのためフィルムの抵抗性の上記
急上昇と一致するように（図４）、その抵抗性は非常に大きく、還元波／酸化波
はかろうじて目視可能であった。
【０１２３】 ハイブリダイゼーション後、過酸化水素を添加する前、電気酸化波および電気
還元波のピークを再び定めた（図５Ｃ）ところ、還元波および酸化波のインテグ
ラル、すなわち電気酸化およびレドックス中心の電気酸化に必要な誘導電荷にお
いて３２＋／−１０％の減少が観察された。
【０１２４】 １つのマイクロ電極を相補的ｐｄ（Ａ）25-30−ＨＲＰに曝露し、他方のマイ
クロ電極を非相補的ｐｄ（Ｇ）18-20−ＨＲＰに曝露した後、１対のマイクロ電
極において同時に過酸化水素による電気泳動的な還元電流の変化を測定した。ｐ
ｄ（Ａ）25-30−ＨＲＰに曝露されたマイクロ電極の電流は過酸化水素を注入す
るとすぐ、２０＋／−２ｐＡ増加し（図８）、一方、ｐｄ（Ｇ）18-20−ＨＲＰ
に曝露されたマイクロ電極の電流は僅かに２．５＋／−２．５ｐＡ上昇しただけ
だった。測定中の電気ノイズは０．５ ｐＡだった。ｐｄ（Ｔ）25-30を、電気泳
動的沈着の前にＥＤＣによって活性化しなかったとき、したがって、レドックス
ポリマーフィルムと共有結合しなかったとき、ｐｄ（Ａ）25-30−ＨＲＰに曝露
した電極の過酸化水素による電気還元電流は僅かに４＋／−２ｐＡであり（図７
）、ｐｄ（Ｇ）18-20−ＨＲＰに曝露した電極では測定されなかった。
【０１２５】 ｐｄ（Ｔ）25-30−ＨＲＰ／ｐｄ（Ａ）18-20−ＨＲＰハイブリッドフィルムに
よるマイクロ電極に関する連続的な実験では、セル内の溶液の温度を、２５℃〜
４９℃とし、０．２５℃／分で直線的に傾斜させ、過酸化水素による電気還元電
流をモニターした。図８に示すように、温度が４０℃に到達するまでは、電流は
増加し、温度が更に１℃だけ上昇し４１℃になると、電流は約３０％減少した。
【０１２６】 実施例６ 電気化学的不適正の同定 本発明の電極を用いて、オリゴヌクレオチドの不適正を電極測定によって高速
、効率的かつ特異的に検出した。
【０１２７】 電極構造の模式図を図１０に示す。上記実施例１に記載の方法によって、カー
ボンマイクロ電極上のイオン強度の低い溶液中で定電流での電気泳動的沈着によ
って、直径７ μｍのカーボン電極１０にレドックスーポリマー１２を塗布した
。反応性メチルイミダゾール基が電荷された（カルボンジイミド活性化された）
一本鎖プローブオリゴヌクレオチド(センサーオリゴヌクレオチド) 14 [SEQ. ID
NO: 4] を、実施例２に記載の方法によって電気泳動的に沈着させ、レドックス
ポリマーフィルム１２に共有結合して、作用電極を形成した。標的一本鎖オリゴ
ヌクレオチド（相補型、不適正塩基対が1箇所 [SEQ. ID NO. 2]もしくは不適正
塩基対が4箇所[SEQ. ID NO. 3])を熱安定性大豆ペルオキシダーゼ１８と共有結
合させ、ＳＢＰ-標識標的シーケンスを作製した。その後作用電極および標的オ
リゴヌクレオチドを様々なハイブリダイゼーション温度で反応させた。
【０１２８】 標的とプローブオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって、ペ
ルオキシダーゼをレドックスポリマーと近接させると、レドックスポリマーフィ
ルムは、０．０６Ｖｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌで、Ｈ2Ｏ2電気還元の触媒となる。触
媒電流を測定したところ、その電流は約４０,０００表面結合および電気接続さ
れた大豆ペルオキシダーゼ分子によって生成されたものに対応した。
【０１２９】 このオリゴヌクレオチドセンサーは、下記表に示した１８塩基対オリゴヌクレ
オチドプローブのハイブリダイゼーションを実時間（例えば、１０未満）で検出
することができる。
【０１３０】 ハイブリダイゼーション条件をコントロールすることによって、すなわち、ハ
イブリダイゼーション温度をコントロールすることによって、前記センサーは不
適正塩基対が１箇所のオリゴヌクレオチド間の判別することができた。本発明の
センサーはＤＮＡシーケンスを適用するマイクロ電極の小さなアレイおよび遺伝
子疾患の診断において有用である。
【０１３１】
【表１】 上記表に示した相補的鎖[SEQ. ID NO: 1]の融点は下記式によって測定した。
【０１３２】
【数２】 不適正塩基対が１箇所の場合、融点は約５℃減少し、不適正塩基対が４箇所で
はさらに１５℃減少した。図９Ａ〜９Ｃに示すように、２５℃では、不適正塩基
対が４箇所の場合も含めて、３つ全てのオリゴヌクレオチドを標的プローブとハ
イブリダイゼーションした。４５°Cでは、不適正塩基対が４箇所の場合、ハイ
ブリダイゼーションされず、ハイブリダイゼーション温度は約４０℃の融点以上
であった（図９Ｄ〜９Ｆ）。不適正塩基対が１箇所の場合の融点以上であるが、
相補的鎖の融点以下のハイブリダイゼーション温度である５７℃では、相補的鎖
だけがハイブリダイゼーションされた(図９Ｇ〜９Ｉ)。
【０１３３】 したがって、本発明のセンサーおよびアッセイシステムは、ハイブリダイゼー
ションの厳重さ、例えば、反応温度をコントロールすることによって相補型と不
適正塩基対１箇所のものを識別することができる。
【０１３４】 単一電極における測定コピー数は約４０,０００分子であると推定される。
【０１３５】 実施例７ ハイブリダイゼーション事象検出のための電気化学的アレイおよびシステム 特に記載のない限り、材料、方法および装置は上記実施例６と同一とした。
【０１３６】 全てのガラス製品は、アクエット（Aquet）(ＶＷＲ)に一晩浸漬して洗浄し、
脱イオン水ですすいだ。過ヨウ素酸ナトリウム(カタログ＃３１,１４４-８)、１
-（３-ジメチルアミノプロピル）-３-エチルカルボジイミドヒドロクロリド（Ｅ
ＤＣ）(カタログ＃１６,１４６−２)は、アルドリッチから購入した。イミダゾ
ール（カタログ＃Ｉ-２０-２)および大豆ペルオキシダーゼ（ＳＢＰ）（カタロ
グ＃Ｐ-１４３２)は、シグマから購入した。全ての緩衝塩およびその他の無機化
学物質はシグマまたはアルドリッチから購入した。電気導電性レドックスポリマ
ー（ＰＡＡ-ＰＶＩ-Ｏｓ）、アクリルアミド、アクリルヒドラジド、および１-
ビニルイミダゾールの７：１コポリマー、[Ｏｓ(４,４'-ジメチル-２,２'-ビピ
リジン)2Ｃｌ]+/+2と結合したイミダゾール官能基は、先に記載の方法で合成し
た。
【０１３７】 使用したプローブおよび標的オリゴヌクレオチドは、ゲノシス（Genosys）か
ら購入した。これらを表１に示す。１８塩基プローブは、１２−Ｔスペーサーお
よびオリゴヌクレオチド間に１２−Ｃスペーサーを持つ１８塩基標的および末端
第一アミン官能基と共に購入した。第一アミンを使用して、ＳＢＰの過ヨウ素酸
塩酸化オリゴ糖のアルデヒド官能基を持つシッフ塩基を作製し、続いて、ＮａＢ
Ｈ4を還元して第二アミンを得た。
【０１３８】 電流―時間の追跡記録にはワイーティーレコーダー（Y-t recorder）（キップ
アンドゾネン、オランダ）(Kipp&Zonen、Holland)を用いた。電気化学的測定は
低ノイズ型ＣＨインストルメント（CH Instruments）モデル８３２電気化学的検
出器とペンチウムコンピュータ（Pentium computer）を併用して行った。ウォー
タージャケットを接地ファラデーケージに入れた。特に記載のない限り、使用し
た３電極システムは、マイクロ電極、Ａｇ／ＡｇＣｌ比較電極および大面積のプ
ラチナフラッグもしくは配線からなる。２５℃以上での測定においては、寒天塩
橋を用いて比較電極を２５℃の一定温度に維持した。マイクロ電極は、ブタン火
炎のなかで、軟性ガラス管（キンブルプロダクト（Kimble Products）、米国）
中に直径７μｍの炭素繊維(グッドフロー、Goodfellow、英国)を個別に封着する
ことにより、自作した。電極表面の露出は、ガラスを折り、まずサンドペーパー
によって、続いて粒径が３μｍのアルミナによって研磨することにより行った。
前記電極をフェロセンメタノール中、およびｐＨ７．０のリン酸緩衝液中で周期
的ボルタメトリーによって試験し、リークの有無および炭素繊維によるガラス封
着の完全性を調べた。再び研磨したマイクロ電極を脱イオン水中に保存した。
【０１３９】 [ポリマーの沈着] 電気泳動的沈着のためにデザインされた小型セルにおいて、セルの底面部とな
る１００μｍの厚さのプラチナ箔を対向電極とした。銀の配線は、偽比較電極と
して機能した。脱イオン水中０．０８５ ｍｇＭＬ-1 ＰＡＡ-ＰＶＩ-Ｏｓレドッ
クスポリマー溶液１００μｌをセル内に入れ、置換する前に２５沈着まで使用し
た。
【０１４０】 マイクロ電極をポテンシオスタットに接続した後、マイクロマニピュレータを
使用してマクロ電極をレドックスポリマー溶液中に入れ、マイクロ電極を、その
先端がセルの底面部の対向電極から１ｍｍ離れるまで下げた。−１．０２５Ｖ(
Ａｇ／ＡｇＣｌ)で２分間マクロ電極の電位を平衡化することによって、電気泳
動的にレドックスポリマーを沈着させた。その後、その電極を脱イオン水で洗浄
した。その沈着物を緩衝液中で周期的ボルタメトリーによって確認した。静電気
が増加すると、電極のレドックスポリマー塗布の電気化学的特徴は変化するであ
ろうから、作用電極もセルの一部も接触していることは必須ではなかった。
【０１４１】 [プローブオリゴヌクレオチドの付着] ｐＨ７の２０ｍＭメチルイミダゾール緩衝液中４５０〜５５０μｇのプローブ
オリゴヌクレオチドの溶液５０μｌを、前記緩衝液の０．２Ｍ ＥＤＣ溶液５０
μｌに添加した。この混合物を４℃で一晩維持した。その溶液を４５０μｌの水
で希釈し、体積をミクロン管（アミコン(Amicon)）を用いて３０００ダルトンカ
ットオフ膜を用いて体積を５０μｌまで減少させた。この処置を２回繰り返し、
溶液から緩衝塩を除去した。その溶液を５０μｌまで減少させ、その後、上記レ
ドックスポリマー沈着と類似の電気化学的セルに移動させ、そして、プローブオ
リゴヌクレオチドの電気泳動的沈着に使用された。前記オリゴヌクレオチドはＥ
ＤＣで活性化されているので、マイクロ電極上のレドックスポリマーヒドラジド
官能基と反応した。特に記載のない限り、ＥＤＣ活性化オリゴヌクレオチドの沈
着条件は、＋０．９V (Ａｇ／ＡｇＣｌ)の電位を与え、持続時間が５分であるこ
とを除き、レドックスポリマーの沈着条件と同じとした。オリゴヌクレオチドを
沈着させた後、周期的ボルタモグラムを、１Ｍ ＮａＣｌ含有緩衝溶液中で記録
した。
【０１４２】 [ＳＢＰを用いたオリゴヌクレオチドの標識] 表１の３つの１８塩基標的オリゴヌクレオチド、すなわち１つの完全に相補的
なプローブ[SEQ. ID NO: 1]、不適正塩基が１箇所の [SEQ. ID NO: 2]、および
不適正塩基が４箇所の[SEQ. ID NO: 3]は、5'-アミン-末端１２-カーボンスペー
サーと共に購入した。それらを、以下のようにＳＢＰで標識した：１０ ｍｇ Ｓ
ＢＰを０．２５ ｍＬのｐＨ７０．１ Mリン酸緩衝液に溶解し、０．２５ ｍＬの
過ヨウ素酸ナトリウムを水に新たに溶解させた溶液を加えた。その溶液を暗室に
１時間放置し、その後、標準Ｇ-２５ゲル濾過カラムに通した（長さ６０ｃｍ、
直径１．５ ｃｍ)。得られた酸化酵素の濃度をバイオラッドプロテインアッセイ
（Biorad protein assay）（プロテインアッセイキットＩＩ (Protein assay ki
t II)）を用いて測定した。１０倍分子量過剰の酵素を２００〜３００μｇのオ
リゴヌクレオチドに添加し、０．５ｍＬとした。その溶液を、０．５ ｍＬの０
．４Ｍ ＮＡＢＨ4を添加する前、３時間反応させ、その後、４℃で１３時間放置
した。得られた標識オリゴヌクレオチドの濃度は３５〜５０ｍＭであった。
【０１４３】 ＳＢＰ標識オリゴヌクレオチドの活性は、測定された蛋白質濃度およびロイコ
塩基色素２，２'−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−硫酸）（
ＡＢＴＳ）のＨＲＰ触媒過酸化水素酸化の前記色素に対する割合から導いた。色
素形成率の初速度は、ヒューレットパッカードダイオードアレイＵＶ／Ｖｉｓモ
デル８４５２Ａ分光光度計を用いて、分光光度的に測定した。その処理において
は、２．９ｍＬの５ｍＭ ＡＢＴＳを、５０マイクロリットルの０．１８７５ ｍ
ｇ/ｇＬのＨＲＰ標識オリゴヌクレオチド溶液に添加し、続いて５０マイクロリ
ットルの６０ ｍＭ過酸化水素に添加した。４０４ ｎｍでの吸光度の変化を６０
秒間記録した。
【０１４４】 天然のＳＢＰの特異的活性は、天然の西洋ワサビペルオキシダーゼの２５℃で
の特異的活性の４５％であったと報告されている（シグマ(SIGMA)、カタログ, 1
997, 812頁)。ＳＢＰのオリゴヌクレオチドへの付着後、活性の５７%が保存され
た。過ヨウ素酸塩での酸化によって誘発された活性の消失は、ＮａＢＨ4還元工
程ではなかった。等電点は等電焦点化電気泳動（ファスタゲルシステム、ファル
マシア(Phastgel System, Pharmacia)）によって測定した。等電点は、天然の酵
素で９．１、過ヨウ素酸塩で酸化した酵素で４．５および過ヨウ素酸塩で酸化後
、ＮａＢＨ4-還元した酵素で８．０であった。
【０１４５】 [ハイブリダイゼーションのアンプロメトリー検出] ハイブリダイゼーションは、１ Ｍ ＮａＣｌ、１ ｍＭ Ｈ2Ｏ2および １ ｍＭ
ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）を含有する１ ｍＬのｐＨ７の ＨＥ
ＰＥＳ(Ｎ−[2−ヒドロキシエチル]ピペリジン-Ｎ'-[2-エタンスルホン酸])緩衝
液中で行った。その緩衝溶液を所定の温度に温度制御し、空気動力モーターによ
る回転ガラスへらを用いて攪拌した。前記電極をポテンシオスタットに接続し、
−０．０６Vｖｓ.Ａｇ／ＡｇＣｌで分極化した。２０秒後、電流は−５〜１５
ｐＡで安定した。そして１０μｌのオリゴ-ＳＢＰ結合体を１ｍＬのセルに注入
し、濃度を０．４ ｎＭとした。経時的な電流の変化を記録し、そして、観察さ
れたハイブリダイゼーションの時間的変化は、シグマプロットグラフソフトウェ
ア（Sigma Plot graphing software）（ＳＰＳＳ）を用いた拡散限定ラングミュ
ア式(diffusion limited Langmuir equation)と一致した。
【０１４６】 レドックスポリマーが予備塗布された電極がＳＢＰに密に塗布されたときに到
達する電流を測定するために、過ヨウ素酸塩で酸化された酵素をマイクロ電極の
レドックスポリマーフィルム上に自己架橋させた。その架橋によって、酵素の酸
化されたオリゴ糖のアルデヒド官能基と、その表面（リジンおよびアルギニン）
アミン類とが縮合された。これらの実験において、レドックスポリマーがヒドラ
ジド官能基を持たないことから、レドックスポリマーと酸化された酵素の共有結
合はＳＰＢ固定化の原因ではなかった。
【０１４７】 第二の実験において、電極をヒドラジドによって機能化されたレドックスポリ
マーで予備的に塗布した。ＥＤＣ活性化プローブオリゴヌクレオチドをレドック
スポリマーに、反応性電気泳動的沈着を介して結合させた。その後、過ヨウ素酸
塩で酸化されたＳＢＰを電極上に結合し、自己架橋させた。これらの実験は、０
．４ｎＭの過ヨウ素酸塩で酸化されたＳＢＰを含有するハイブリダイゼーション
緩衝液中で行った。
【０１４８】 [結果] 過ヨウ素酸塩で酸化されたＳＢＰを、レドックスポリマーを塗布された電極上
で、反応性ヒドラジド官能基無しで自己架橋させたとき、２５℃でのＨ2Ｏ2電気
還元電流は、０〜−４５ｐＡにかけて上昇し、その後平坦となった。電極をヒド
ラジド機能化レドックスポリマーで塗布し、その後電気泳動的に沈着したＥＤＣ
活性化プローブで反応させたとき、３０ｐＡで電流は平坦となった。酸化された
ＳＢＰが、付着されたオリゴヌクレオチドを併用して、または併用せずに、Ｎａ
ＢＨ4によって還元された後、触媒電流は検出されなかった。このことはＳＢＰ
のレドックスポリマーへの非特異的吸着が重要でなかったことを示す。
【０１４９】 図１１の実線の曲線は、７μｍのマイクロ電極上に電気泳動的に沈着されたレ
ドックスポリマーの典型的なボルタモグラムを示す。レドックスポリマーフィル
ムの小さな分子に対する透過性を、フェロセンエタノールを用いて調べた。透過
性は非常に高く、０．5Ｖでの拡散限定電流は、塗布しない電極を僅かに２〜５
％下回った。電気泳動的沈着によって形成された塗布の再生可能性を試験するた
めに、同じ電極を再び研磨し、同じレドックスポリマー溶液を用いて２５回再び
塗布した。２５のフィルムの周期的ボルタモグラムのピーク高が明らかになり、
それらの高さにおける標準偏差は±5％であった。
【０１５０】 ＥＤＣ活性プローブオリゴヌクレオチドのレドックスポリマー上への沈着によ
って、レドックスポリマーの反応性5'フォスフェートとヒドラジド官能基が結合
した。そのプローブの反応性電気泳動的沈着は、陽極および陰極ピークの分離を
増加させた（図１１、破線）。陽極波および陰極波を統合したものは、変化しな
かった。このことはレドックスポリマーが、オリゴヌクレオチド沈着の結果、失
われなかったことを示す。
【０１５１】 標的ハイブリダイゼーションの率、および得られたＨ2Ｏ2電気還元電流に関す
るＥＤＣ活性化プローブオリゴヌクレオチドの量すなわち、負荷の効果を調べた
。図１２に示すように、電気泳動的沈着の持続時間が5分間のとき最適プローブ
負荷となった。プローブ沈着を１０分間続けたとき、続くＳＢＰ標識標的の導入
の上昇は遅くなり、最大電流は減少した。５分未満の沈着時間においては、電流
の増加は速くなかったが、最大電流は増加した。
【０１５２】 バックボーンに反応性ヒドラジド官能基をもたないレドックスポリマーを同様
に沈着させたとき、ＳＢＰ標識標的オリゴヌクレオチドをプローブオリゴヌクレ
オチドの５分間の電気泳動を塗布されたフィルムと５分間ハイブリダイゼーショ
ンを行った後観察された電流は、２５℃で僅か０．３５〜０．７５ｐＡであった
。
【０１５３】 図１３Ａ〜１３Ｃは、２５℃（図１３Ａ）および４５℃（図１３Ｂ）および５
７℃（図１３Ｃ）における、、表１に示した完全（曲線Ａ）、不適正塩基対が１
箇所（曲線Ｂ）および不適正塩基が４箇所（曲線Ｃ）のＳＢＰ標的オリゴヌクレ
オチドについての電流変化をそれぞれ示す。２５℃で、Ｈ2Ｏ2は、３つのＳＢＰ
標識標的のいずれかを有する電極に電気還元された。４５℃では、Ｈ2Ｏ2 は、
標的が完全に適合する時のみ、または不適正塩基が１箇所だけの時のみ電気還元
されたが、不適正の塩基が４箇所のときは電気還元されなかった。５７℃では、
Ｈ2Ｏ2は標的が完全に適合したときのみ、効率的に（４５ｐＡ電流)電気還元さ
れた。 ２５℃、４５℃および５７℃での、完全に適合したハイブリッドの電流
は、それぞれ６ｐＡ、２８ｐＡおよび４５ｐＡであった。
【０１５４】 不適正塩基対が４箇所のＳＢＰ標識標的４５℃でのハイブリダイゼーション
の結果を図１４に示す。不適正塩基対が４箇所の標的（40μＭ ＳＢＰ中１０μ
ｌ）を、ｔ＝５５０秒（矢印Ａ）で導入し、続いて、完全に相補的なＳＢＰ-標
識標的（４０μＭＳＢＰ中１０μｌ）をt=１４５０秒(矢印Ｂ)で導入した。それ
ぞれ得られた電流は、２．３ｐＡおよび２５ｐＡであった。
【０１５５】 [結果の解釈] ハイブリダイゼーションされたプローブ検出のためのスキームを図１５Ａに示
す。レドックスポリマーフィルムを電気泳動的に電極上に沈着させた。このフィ
ルムを、1秒の電気泳動的沈着工程において、オリゴヌクレオチドプローブの5'-
活性化-ポリ-Tスペーサーと反応させた。図１５Ｂに示すように、ＳＢＰ-標識標
的オリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションの後、電極からレドック
スポリマーを通って、その標識のヘム中心へ電子が流れ、これらの中心を還元し
た。ＳＢＰは、熱安定性に優れているため、標的を標識するために、より活性の
ある西洋ワサビペルオキシダーゼに対して好適であった（ブリークら（Vreeke e
t al.）、アナリティカルケミストリー、1995、 Anal. Chem. ）67: 4247)。
【０１５６】 電気泳動的沈着は、ガラス包埋された炭素繊維の導電性領域に限定されていた
ため、電極および溶液も再生可能であるとき、再生可能な大きさおよび特徴のレ
ドックスポリマーフィルムが沈着された。これは重要である。なぜなら、マルチ
電極がアレイ状で使用されている場合、電極対の電極間の差を測定することが可
能であり、電流の小さな差の重要性が塗布の再生可能性に依存するからである。
±０．０５μｍのマイクロ電極回路の製造に使用できるプロセスによって作製さ
れるとき、電極の大きさは再生可能とすることできる。２５の連続的に沈着され
たフィルムにおいて、ボルタメトリーピークは、標準偏差、シグマ、±５％の正
規分布を示した。
【０１５７】 マイクロ電極を薄い層のレドックスポリマーで予備的に塗布する目的は、反応
中心と標的標識ＳＢＰの方向によって独立しているＳＢＰおよび電極の間を電気
接触させることである。レドックスポリマーフィルムが存在しない場合、電気接
触は、電極表面に近いＳＢＰヘムだけで確立される。ガラスカーボン状の西洋ワ
サビペルオキシダーゼでは、適切に方向づけられた酵素分子の割合が僅か１%で
ある。その電極を レドックスポリマーで塗布すると、そのレドックス電位はペ
ルオキシダーゼの電位に比べて減少し、その後、方向に関わりなく、電子がヘム
中心に向かって流動された。今電子は、レドックスポリマーフィルムのランダム
に移動するセグメントを有するヘム中心の衝突を介して、輸送され、架橋された
。これらの係留セグメントの動きは、レドックスポリマーが水和されたとき増加
した。電子は、レドックスポリマーを介して、ポリマーネットワークの接近する
レドックス官能基搬送セグメント間の自己変換衝突の関連プロセスによって拡散
した。図１５Ｂは、電極と標的間のＳＢＰ標識の電子輸送のスキームを示す。そ
のような輸送によって、＋０．０６Ｖ (Ａｇ／ＡｇＣｌ)でＨ2Ｏ2から水への還
元が起こる（式１）。この電位Ｈ2Ｏ2は触媒がないとき、電気還元されない。
【０１５８】
【数３】 高速な電子変換ゆえに、また、レドックスポリマー が電極上に十分に吸着さ
れるために、レドックスポリマー塗布電極のボルタモグラムの陽極波および陰極
波のピークが約20mV（図１１、実線の曲線）のみで分離された。プローブオリゴ
ヌクレオチドがレドックスポリマーと結合した後、 前記ピークは１８０ｍVまで
上昇した（図１１、破線の曲線）。このことは低速の電子輸送を示すものである
。遅速の輸送の明らかな原因は、ポリアニオニック（polyanionic）プローブと
ポリカチオニック（polycationic） レドックスポリマーの間にイオン橋が形成
されたことであった。それは, レドックスポリマー のセグメントの動き、した
がって電子の移動中の衝突の頻度を制限するものであった。
【０１５９】 図１１は、オリゴヌクレオチドを有するレドックスポリマーフィルムの過重が
SBP-標識ハイブリッドが形成された後、電流を減少させたことを示す。前記電流
は最初、プローブの量が増加し、ＳＢＰ標識標的が捕捉されるにつれて上昇する
（図１２、曲線ａ、ｂおよびｃ）。しかし、プローブの量が過渡に上昇しすぎる
と、電流は減少し、電流の変化率から明らかなようにハイブリダイゼーション速
度も遅くなった（図１２、曲線ｄ）。電流が減少するのは、過剰のイオン架橋が
おこり、電子変換レドックス中心の密度の希釈によって結合されて、レドックス
ポリマーのセグメントの動きが制限されることが原因だと考えられる。
【０１６０】 一貫して、電流がハイブリッドのＳＢＰ標識を流れた後のみならず、ハイブリ
ダイゼーションがない場合にも、過ヨウ素酸塩-酸化型ＳＢＰをフィルム上に自
己架橋させた時に、レドックスポリマーフィルムにプローブオリゴヌクレオチド
を組み込んだ後、電流は３０％減少した。レドックスポリマー フィルムがプロ
ーブによって過重されたとき、電流の増加が緩慢になるのも、イオン橋の形成に
よる。これらはフィルムを効果し、プローブオリゴヌクレオチドへのＳＢＰ−標
識標的のアクセスを遅くする。
【０１６１】 沈着の最適持続時間は５分であった。この時間の電流への依存は、ハイブリダ
イゼーションの速度で表されており、拡散限定ラングミュア式によってよく説明
される（Ｒ＝0．99）（式２）（ピーターリンズら、1996、ラングミュア（Peter
linz et al., 1996, Langmui ）12:4731）。
【０１６２】
【数４】 上記式において、ｋdは、拡散質量輸送速度に関連する表面架橋率（ここでは、
ＳＢＰ標識標的の電極結合プローブへのハイブリダイゼーション速度）をあらわ
し、ｅmax は、可能なすべてのプローブのハイブリダイゼーションが起こった後
の酵素の最大表面濃度をあらわす。レドックスポリマーフィルムおよび基質の無
視し得る程度の拡散（この場合、Ｈ2Ｏ2）については、飽和電流は下記式 によ
ってあらわされる。
【０１６３】
【数５】 数式３において、ｋは媒体と酵素の間の反応速度を表し、[Ｏｓ2+]は、フィル
ムにおける還元レドックス中心を表し、ＫMおよびｋcatは通常の意味を表し、[
Ｓ]は基質（Ｈ2Ｏ2）濃度を表す。実験において、基質濃度はＫMよりはるかに高
かったので、数式３の分母の３番目の言葉は無視してもよい。したがって、電流
は、フィルム中の電子拡散によっても、または酵素の代謝回転速度によっても限
定された。数式２と単純化した数式３の組合せによって、数式４が導き出される
。この数式は図２および３の曲線に一致した。
【０１６４】
【数式６】 図１０のハイブリダイゼーション時間的変化のもっともよく一致するパラメー
ターを表２にまとめて示す。それは、異なるプローブ、過重を持つマイクロ電極
のための数式４に最もよく一致するパラメータを示す。計算され測定された（図
２）の電流は数式４と一致し、中間差はいずれの実験においても２％未満であっ
た。
【０１６５】
【表２】 プローブによって過重を受けていないフィルムのａ、ｂおよびｃのｋd値が類
似するとき、過重フィルムのｋdは有意に低下した。このことはハイブリダイゼ
ーション-誘発性の拡散工程が過剰量のオリゴヌクレオチドを有するマトリック
ス内で制限されるが緩慢となることを示すものであった。時間の電流依存性は、
ハイブリダイゼーションを異なる温度で、オリゴヌクレオチド内に不適性塩基を
有するとき、拡散限定ラングミュア式と一致した。しかし、ノイズは温度および
Ｒ2が減少すると増加した。
【０１６６】 １つの完全なオリゴヌクレオチドシーケンスおよび２つの不完全なオリゴヌク
レオチドシーケンスへのハイブリダイゼーション時間的変化に最もよく一致する
パラメータを表３に示す。これは、図１３に示す、２５℃、 ４５℃および ５７
°Cでの３つの標的のための数式４に最も一致するパラメータである。計算され
測定された（図１２）の電流は数式４に一致し、中間差は、２５℃での実験で２
％未満、４５℃での実験で４％、および５７℃での実験で１０％であった。
【０１６７】
【表３】 図１２の破線の曲線は、表３にリストした定数に一致する数式を表す。拡散限
定ラングミュア式は、これらの時間的変化に、特に、図１０の２５℃で相補的オ
リゴヌクレオチドの場合に特によく一致した。この一致は、数例でノイズによっ
て困難であった。１例で、不適正塩基対が４箇所の場合一致が悪かった。
【０１６８】 温度によって完全に適合するハイブリッドの電流の上昇（２５℃、６ｐＡ; ４
５℃、２８ｐＡ；および５７℃、４５ｐＡ）は、６０ｋＪｍｏｌ-1の活性化エネ
ルギーを生み出す。これは関連するレドックスポリマーに報告されている活性エ
ネルギーと類似する（グレッグら、ジャーナルオフ フィジカルケミストリー(G
regg et al., 1991, J. Phys. Chem.) 95:5970）。ハイブリッドの溶融温度以下
の時のみ、ＳＢＰ-標識がレドックスポリマーに電気接触させるため、２５℃、
４５℃および５７℃での活性化エネルギーが活性化した電流は、ハイブリッドが
完全に適合したとき、有意に異なっており、不適正塩基対を１箇所もしくは不適
正塩基対を４箇所含んでいた。不適正塩基対を１箇所有する１８塩基対ハイブリ
ッドの溶融温度の理論値は、オリゴヌクレオチドの中間における不適正、および
不適正塩基対がＧＣであるときの完全ハイブリッドの溶融温度の理論値より約
５〜７℃低かった（アンダーソン、1995、ジーンプローブ２、プラクティカルア
プローチ、ヘイムスおよびハギンス共著、オックスフォードユニバーシティープ
レスインク、ニューヨーク、１〜２９ページ（Anderson, 1995, in: Gene Probe
s 2, A Practical Approach, Hames and Higgins, Eds., Oxford University Pr
ess, Inc., New York, pages 1-29））。不適正が４箇所の塩基対の溶融温度の
理論値は、完全ハイブリッドのそれより２０〜２３℃低い。１８塩基対ハイブリ
ッドの実際の溶融温度は、完全に適合するとき、１箇所の塩基対が不適正の時、
４箇所の塩基対が不適正の時、それぞれ５９．５℃、５４℃および３７〜４０℃
であった。その結果、電流は完全に適合するハイブリッドの場合、３つの温度２
５℃、４５℃もしくは５７℃で流れる。不適正が１箇所の塩基対では２５℃およ
び４５℃で電流は流れるが、５７℃では流れなかった。そして不適正が４箇所の
塩基対のハイブリッドの場合、２５℃のときだけ電流が流れ、４５℃または５７
℃のときは流れなかった。図１３に示す。例えば、５７℃で完全に適合するハイ
ブリッドの電流は４５ｐＡであり、１箇所の塩基対が不適正の場合、電流は１３
ｐＡであった。図１２は、４５℃で行った実験の結果を示す。そこではまず、Ｓ
ＢＰ-標識標的ハイブリダイゼーションを、４塩基対を添加しながら、３７〜４
０℃で行った。続いて、相補的ＳＢＰ標識標的をハイブリダイゼーション温度５
９．５℃で行った。この実験では、部分的に適合するシーケンスを有する外生オ
リゴヌクレオチドが存在すると、適正の標的のハイブリダイゼーションは妨害さ
れず、また、ハイブリダイゼーションに達したときに到達する電流の大きさ（約
３０ｐＡ）に影響しないことを示す（図１３Ｂおよび図１４）。
【０１６９】 電流を発生するコピーの数は、ＳＢＰ標識の代謝回転率から推定できる。ＳＢ
Ｐ標識の代謝回転率は２５℃で４６０ s-1 であった。１回の 代謝回転ごとに２
つの電子が輸送され、この代謝回転率は、１標識につき、１．５×１０ -16Ａの
電流に相当する。完全なハイブリダイゼーションについて測定された２５℃での
飽和電流は５ｐＡであり、そして３４,０００コピーの「配線化された」および
活性標識のアウトプットがあった。直径７μｍの電極において、その対応する対
応する表面積は１．４×１０-13モルcm-2であり、これは、理論的に計算された
１８塩基対プローブの表面密度の範囲０．０３〜３．８×１０-13 モルcm-2 に
よく一致する（チャンら、バイオフィジクスジャーナル（Chan et.al., 1995, B
iophys. J.）69:2243）。
【０１７０】 [結論] 要約すると、１箇所の塩基対が不適正の１８塩基対オリゴヌクレオチドは、電
流摘定的に感知され、レドックスポリマー塗布電極によって増幅された。検出電
流は、約４０,０００の活性まで発生し、かつ「配線化された」熱安定性ＳＢＰ
標識ハイブリッドのコピーであった。
【０１７１】 本発明の方法の使用により、レドックスポリマーに結合したオリゴヌクレオチ
ドにハイブリダイゼーションされた遺伝子もしくはＲＮＡのセグメントの存在、
例えば、遺伝子の異なる領域にハイブリダイゼーションされたＳＢＰ標識シーケ
ンスが調べられた。例えば、図１４参照。
【０１７２】 実施例８ 核酸シーケンスの電気化学的検出 上記実施例と同様の方法で、１以上の特異的ハイブリダイゼーション プロー
ブ オリゴヌクレオチド を電極上に固定化する。好ましくは共有結合によって、
電極上のレドックスポリマーに固定化する。検出すべき標的シーケンスを含有す
る試験サンプルを前記固定化したオリゴヌクレオチドと、適切なハイブリダイゼ
ーション条件で反応させた。
【０１７３】 また前記試験サンプルを１以上の第２の特異的オリゴヌクレオチド プローブ
と反応させた。第２のオリゴヌクレオチド プローブは触媒、好ましくは熱的に
安定なペルオキシダーゼ、最も好ましくは大豆ペルオキシダーゼで標識した。好
ましいシステムにおいては、固定化された第一のオリゴヌクレオチドを有する試
験サンプルと、第２の標識オリゴヌクレオチドとの反応は同時に行う。そのよう
なシステムを図１５Ｃおよび図１６に示す。
【０１７４】 第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブの両方を標的シーケンスにハイ
ブリダイゼーションすることによって、図１５Ｂに示すスキームのように作用電
極に電流が発生した。その電流はハイブリダイゼーション事象と相関する。 実施例９病原体スクリーニングのための診断アレイ アレイに特定の病原体の診断のオリゴヌクレオチド プローブを選択的に沈着
させることによって、患者サンプルをスクリーニングして病原性微生物の有無を
調べるためのセンサーアレイを、上記方法によって作製した。具体的には、複数
の電極を基板上に配置する。好ましい実施形態においては、１００以上の電極を
配置してアレイを形成する。配置された電極にレドックスポリマーを上記の方法
で塗布する。
【０１７５】 特定の病原体診断のための一連のオリゴヌクレオチドプローブを電極と結合さ
せる。好ましい実施形態においては、いくつかの冗長をアレイ中に作製し、不正
確性を改善する。オリゴヌクレオチドの電極アレイへの特異的な結合は、上記電
気泳動的沈着法によって行う。電極に引き付けられる前記オリゴヌクレオチドを
反応基を介してレドックスポリマーと結合させる。電気泳動的沈着法は、異なる
オリゴヌクレオチド プローブを用いて繰り返し行い、診断アレイを作製する。
【０１７６】 各オリゴヌクレオチド プローブ は、相補的シーケンスにハイブリダイゼーシ
ョンするために、好ましくは約８〜１００塩基、好ましくは１０〜４０塩基、最
も好ましくは約１５〜３０塩基を含む。
【０１７７】 診断アッセイにおいては、患者サンプルは、例えば、血液、糞便もしくは組織
スワブ、または水、空気もしくは食物から得る。核酸シーケンスはサンプル、組
織もしくは細胞から分離してもよいし、しなくてもよいが、制限酵素消化、好ま
しくは短い認識サイト、例えば、４塩基の酵素によって分割することが好ましい
。その後分割したサンプルを、例えば、加熱、急冷もしくはイオン強度の低い溶
液に暴露することによって変性させて一本鎖ＤＮＡにすることが好ましい。
【０１７８】 前記変性したサンプルをハイブリダイゼーションに好適な条件に供する。サン
プルＤＮＡの特定のオリゴヌクレオチド プローブへのハイブリダイゼーション
を電気化学的に検出した。好ましい実施形態においては、消化されたＤＮＡの異
なる領域にハイブリダイゼーションされた第二の特異的オリゴヌクレオチド プ
ローブを添加する。第２のプローブを、例えば触媒で標識した。その触媒はレド
ックス酵素であることが好ましく、熱安定性レドックス酵素、例えば、大豆ペル
オキシダーゼであることが最も好ましい。サンプル核酸シーケンスを第１および
第２の診断用オリゴヌクレオチド プローブとハイブリダイゼーションすると、
直ちに酵素は配線レドックスポリマー（例えば、ヒドロゲル）と電気接続し、
過酸化水素の電気還元を触媒する。電極センサーに発生した電流を特定の病原体
の診断に供する。
【０１７９】 本明細書にはいくつかの文献および特許の引用を参照のために含んでいる。
【０１８０】
【配列表】
SEQUENCE LISTING <110>THERASENSE,INC. <120>MULTI‐SENSOR ARRAY FOR ELECTOROCHEMICAL RECOGNITION OF NUCLEOTIDE
SEQUENCES AND METHODS <130>R4880 <140>PCT/US99/14460 <141>1999-06‐24 <150>US60/090,517 <151>1998-06-24 <150>US60/093,100 <151>1998-07-16 <150>US60/114,919 <151>1999-01-05 <160>4 <210>1 <211>18 <212>DNA <213>Unkown <220> <223>Target Sequence <400>1 gaaacaccaa tgatattt 18 <210>2 <211>18 <212>DNA <213>Artifical Sequence <220> <223>Single-stranded probe oligonucleotide <400>2 gaaacaccag tgatattt 18 <210>3 <211>19 <212>DNA <213>Artifical Sequence <220> <223>Single-stranded probe oligonucleotide <400>3 gaaacaccaa agatagata 19 <210>4 <211>18 <212>DNA <213>Artifical Sequence <220> <223>Single-stranded probe oligonucleotide <400>4 ctttgtggtt actataaa 18
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明のＤＮＡ検知用マイクロ電極アレイの平面図である。
【図２】 図２は、一本鎖のオリゴヌクレオチドを有するマイクロ電極アレイを示した断
面図である。
【図３】 図３は、ハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドと標識プローブオリゴヌ
クレオチドとが付着したマイクロ電極アレイを示した断面図である。
【図４】 図４は、（ａ）レドックスポリマーおよび（ｂ）オリゴヌクレオチドの電気泳
動的沈着の電位−時間変化を示すグラフである。それぞれ２０μＡの電流を２１
４７秒および−１０μＡの電流を９００秒流した。
【図５】 図５は、（ａ）レドックスポリマー、（ｂ）レドックスポリマーおよびオリゴ
ヌクレオチドおよび（ｃ）イオン強度の高い溶液中でハイブリダイゼーションし
た後のレドックスポリマーとオリゴヌクレオチドによって塗布された厚さ１０μ
ｍのマイクロ電極の周期的ボルタモグラムを示す。走査率は５０ｍＶ／秒、ボル
タモグラムは０．３ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌで開始した。
【図６】 図６は、緩衝液中マイクロ電極上のレドックスポリマーの酸化（四角）および
還元（円）ピーク電流の走査率の依存性を示すグラフである。実線は還元ピーク
電流の直線回帰に一致し、破線は酸化ピーク電流に一致する。
【図７】 図７は、レドックスポリマーおよびオリゴヌクレオチドを有する、ｐｄ（Ａ） 25-30 −ＨＲＰおよびｐｄ（Ｇ）18-20−ＨＲＰでハイブリダイゼーションされた
典型的な塗布電極の電流滴定反応を示すグラフである。過酸化水素（1ｍＭ）を
５ｍＬの試験溶液に添加し、反応を開始する。バックグラウンド電流は−５〜−
１２ｐＡの間であった。０．００ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの電位を与えた後、電流
が安定ベースラインに達するまで、２００秒かかった。反応時間は、溶液中の過
酸化水素の混合によって制御した。矢印はＨ2Ｏ2がセルに導入される点を示す。
【図８】 図８は、ハイブリッドが融解したときの電流の消失；温度が直線的（破線）に２
０℃〜６０℃で0.２５℃／分の割合で傾斜する時の電気泳動的な過酸化水素還元
電流の時間−温度依存性を示すグラフである。垂直方向の矢印は過酸化水素がセ
ルに導入されたポイントを示す。
【図９】 図９Ａ〜９Ｉは、相補的鎖（図９Ａ、９Ｄ、９Ｇ）、1箇所の塩基対が不適正
（図９Ｂ、９Ｅ、９Ｈ）、４箇所の塩基対が不適正（図９Ｃ、９Ｆ、９Ｉ）の標
的オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションもしくは非ハイブリダイゼー
ションを示す連続グラフである。ハイブリダイゼーション条件はそれぞれ２５℃
（図９Ａ〜９Ｃ）；４５℃（図９Ｄ〜９Ｆ）；および５７℃（図９Ｇ〜９Ｉ）と
した。
【図１０】 図１０は、本発明の電極上の電極の核酸ハイブリダイゼーションアッセイを表
す模式図である。１０は電極、１２はレドックスポリマー；１４はセンサーオリ
ゴヌクレオチド；１６はプローブオリゴヌクレオチド；および１８は検出マーカ
ーを示す。
【図１１】 図１１は、実施例７で説明したセンサーを用いた、電気泳動的に沈着されたレ
ドックスポリマー（実線）およびオリゴヌクレオチドプローブと反応したレドッ
クスポリマー（破線）の第5の周期的ボルタモグラムを示す（直径７μｍのカー
ボンマイクロ電極；走査率５０ｍＶｓ-1；１Ｍ ＮａＣｌおよび１．０ｍＭ ＥＤ
ＴＡを含有する、ｐＨ７のＨＥＰＥＰＳ緩衝液）。
【図１２】 図１２は、触媒電流によって測定された、プローブオリゴヌクレオチド過重の
標的のハイブリダイゼーションへの効果を示すグラフである。プローブ過重は、
電気泳動的沈着の持続時間によって達成される。（ａ）１分、（ｂ）２．５分、
（ｃ）５分および（ｄ）１０分（攪拌、１ｍＬのｐＨ７のＨＥＰＥＳ、１．０ｍ
ＭのＥＤＴＡ、１．０ｍＭ Ｈ2Ｏ2、−０．０６Ｖ（Ａｇ／ＡｇＣｌ）を含有す
る１．０Ｍ ＮａＣｌ緩衝液。０秒後、１０μｌの４０ｎＭ ＳＢＰ標識標的溶液
を添加）。
【図１３】 図１３Ａ〜１３は、ＳＢＰ標識標的を、完全相補的または部分的不適正標的に
（曲線ａ）、1箇所が不適正の塩基対（曲線ｂ）および４箇所が不適正の塩基対
（曲線ｃ）に添加した後、２５℃（図１３Ａ）；４５℃（図１３Ｂ）；および５
７℃（図１３Ｃ）でのマイクロ電極の触媒電流の増加を示すグラフである（０秒
後、１０μｌの４０ｎＭ ＳＢＰ標識標的溶液を添加；攪拌。１ｍＬ ｐＨ７のＨ
ＥＰＥＳ，１．０ｍＭのＥＤＴＡ、１．０ｍＭ Ｈ2Ｏ2、−０．０６Ｖ（Ａｇ／
ＡｇＣｌ）を含有する１．０Ｍ ＮａＣｌ緩衝液）点線は式４に最もよく一致し
ている。
【図１４】 図１４は、プローブを有するレドックスポリマーが塗布された触媒電流の電流
−時間プロットを示すグラフである。４箇所の不適正塩基を伴うＳＢＰ標識標識
標的を５５０秒後に導入し（矢印Ａ）、続いて、ＳＢＰ標識完全適正標的を１４
５０秒後に導入した（矢印Ｂ）（攪拌。１ｍＬ ｐＨ７のＨＥＰＥＳ、１．０ｍ
ＭのＥＤＴＡ、１．０ｍＭ Ｈ2Ｏ2、−０．０６Ｖ（Ａｇ／ＡｇＣｌ）を含有す
る１．０Ｍ ＮａＣｌ緩衝液。４５℃で温度制御）。
【図１５】 図１５Ａ〜１５Ｃは、本発明のシステムの模式図である。プローブオリゴヌク
レオチドを導電性レドックスポリマーと電極上で共有結合している。標識標的核
酸シーケンスをハイブリダイゼーションすると、ＳＢＰヘム中心および電極の間
にレドックスポリマーを介して電気接触が確立される。この接触によってＨ2Ｏ2 が電気触媒還元されて水になる。図１５Ｂのサイクル参照。図１５Ｃは、本発明
の好ましい実施形態における、標的核酸シーケンスの固定化された第一のプロー
ブおよび第二の標識プローブへのハイブリダイゼーションを示す模式図である。
【図１６】 図１６は、本発明の好ましい実施形態におけるシステムの模式図である。核酸
シーケンス、例えば、遺伝子もしくはＲＮＡの断片を１以上のオリゴヌクレオチ
ドプローブと反応させる。第一のオリゴヌクレオチドプローブは熱安定性ペルオ
キシダーゼを介して電極上に固定化される。第二のオリゴヌクレオチドプローブ
を、好ましくは熱安定性ペルオキシダーゼによって標識する。第２の標識プロー
ブは固定化されていてもいいし、または遊離状態であってもよい。第１および第
２のプローブの双方で標的シーケンスのハイブリダイゼーションによって電流が
測定された。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年６月２７日（２０００．６．２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ 37/00 １０２ Ｇ０１Ｎ 27/46 ３３６Ｇ (31)優先権主張番号 ６０／１１４，９１９ (32)優先日 平成11年１月５日(1999．1．5) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ヘラー、アダム アメリカ合衆国、78759 テキサス州、オ ースチン、アパートメント 271、スパイ スウッド スプリングス ロード 4711 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA01 CA09 CA11 HA13 HA14 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 CC08 FA15 4B063 QA01 QA13 QA19 QQ42 QQ54 QR31 QR56 QR84 QS34 QS36 QS39 QX04

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 核酸センサーであって、 電極と、前記電極上に配置されたレドックスポリマーと、前記レドックスポリマ
    ーに結合したオリゴヌクレオチドプローブとを備え、前記プローブは、ＤＮＡ、
    ＲＮＡ（リボソームＲＮＡであってもよい）を有していてもよく、前記センサー
    は、触媒を有していてもよく、前記触媒としては、酵素、熱安定性酵素、ペルオ
    キシダーゼ、または大豆ペルオキシダーゼが好ましい核酸センサー。
  2. 【請求項２】 基板上に配置され、かつ電気的に隔離された請求項１に記載の
    核酸センサーを複数備えたアレイであって、各核酸センサーが特定のオリゴヌク
    レオチドプローブを有し、少なくとも２個のオリゴヌクレオチドプローブが異な
    る診断用シーケンスを有していてもよく、および／または１以上の前記プローブ
    が、癌、疾患、病原体、またはそれらの組み合わせの診断に有用であるアレイ。
  3. 【請求項３】 前記基板上に配置されたセンサーの密度が、平方センチメート
    ルあたり１０以上、平方センチメートルあたり１００以上、または平方センチメ
    ートルあたり１，０００以上であり、および／または各センサーの大きさが２５
    マイクロメートル以下であり、および／または各オリゴヌクレオチドが少なくと
    も１０ヌクレオチドのシーケンス、または少なくとも１５ヌクレオチドのシーケ
    ンスを有する請求項２に記載のアレイ。
  4. 【請求項４】 核酸センサーの製造方法であって、レドックスポリマーで電極
    を被覆する工程と、オリゴヌクレオチドを前記電極上に電気泳動的に沈着させる
    工程と、前記オリゴヌクレオチドと前記レドックスポリマーとを結合させる工程
    とを含み、前記電気泳動沈着には、前記オリゴヌクレオチドの存在下で電極に電
    位を印加することが含まれていてもよく、これにより前記オリゴヌクレオチドが
    選択的に電極に移動しレドックスポリマーに結合する製造方法。
  5. 【請求項５】 核酸シーケンス検出用アレイの製造方法であって、 基板上に複数の電極を沈着させることと、前記複数の電極をレドックスポリマー
    で被覆することと、オリゴヌクレオチドプローブを電気泳動沈着により各電極と
    選択的に結合させることとを含む製造方法。
  6. 【請求項６】 核酸シーケンスの決定方法であって、請求項２または３に記載
    のアレイとサンプル核酸シーケンスとを、前記シーケンスと相補的プローブとの
    ハイブリダイゼーションに適した条件下で接触させる工程と、 １上の電極において発生した電流と、前記サンプルシーケンスと前記１以上の電
    極の前記プローブとのハイブリダイゼーションとを関連付け、それによって前記
    サンプルの核酸シーケンスを決定する工程とを含む方法。
  7. 【請求項７】 癌、または病原体によって誘発される疾患を診断する方法であ
    って、 患者サンプルを、複数のオリゴヌクレオチドセンサーを有するバイオセンサーア
    レイに適用する工程であって、各センサーが電極、前記電極上に配置されたレド
    ックス媒体、および前記レドックス媒体に結合した診断用オリゴヌクレオチドプ
    ローブとを有する工程と、 前記サンプルと前記アレイとを、前記オリゴヌクレオチドプローブと相補的核
    酸シーケンスとのハイブリダイゼーションに適した条件下で反応させる工程と、 前記アレイの１以上の電極で発生した電気化学的電流と、前記サンプルと疾患
    診断用アレイの相補的オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション
    とを関連付ける工程とを含み、 第２オリゴヌクレオチドプローブを添加する工程が含まれていてもよく、前記
    第２オリゴヌクレオチドプローブは触媒によって標識されており、前記触媒はア
    レイ上でハイブリッドを形成するサンプル核酸シーケンスとハイブリッドを形成
    するよう設計された酵素であってもよく、前記第２オリゴヌクレオチドプローブ
    のハイブリダイゼーションにより、前記触媒から前記電極への電気化学的信号の
    移送が誘発される方法。
  8. 【請求項８】 前記アレイが４以上、１００以上、または１，０００以上のオ
    リゴヌクレオチドセンサーを備え、各オリゴヌクレオチドセンサーは特定病原体
    の診断に有用なオリゴヌクレオチドプローブを有している請求項７に記載の方法
    。
  9. 【請求項９】 前記核酸サンプルが、ＤＮＡまたはリボソームＲＮＡであって
    もよいＲＮＡを有し、 前期サンプルが制限酵素によって消化されてもよく、かつ変性して一本鎖シー
    ケンスを形成してもよい請求項７または８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 基板上に配置された電気的に隔離された複数のセンサーを備
    え、各センサーが電極を有するアレイと、前記電極上に配置されたレドックス媒
    体と、前記レドックス媒体に結合した第１オリゴヌクレオチドプローブと、酵素
    が付着した第２オリゴヌクレオチドプローブとを含み、前記第１および第２オリ
    ゴヌクレオチドプローブが特定の標的シーケンスとハイブリッドを形成するよう
    設計されており、かつ前記酵素が、前記第１および第２オリゴヌクレオチドプロ
    ーブと標的シーケンスとのハイブリダイゼーションにより、電気化学的信号を誘
    発する診断用アッセイシステム。
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