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JP2002517228A - 異種ｇタンパク質共役受容体を発現する形質転換細胞株 - Google Patents

異種ｇタンパク質共役受容体を発現する形質転換細胞株

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Publication number
JP2002517228A
JP2002517228A JP2000553557A JP2000553557A JP2002517228A JP 2002517228 A JP2002517228 A JP 2002517228A JP 2000553557 A JP2000553557 A JP 2000553557A JP 2000553557 A JP2000553557 A JP 2000553557A JP 2002517228 A JP2002517228 A JP 2002517228A
Authority
JP
Japan
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receptor
gene
gpc
heterologous
cell line
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2000553557A
Other languages
English (en)
Inventor
ケッスマン，ヘルムート
ディーレンバーガー，フランツ
Original Assignee
ディスカバリー・テクノロジーズ・リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ディスカバリー・テクノロジーズ・リミテッド filed Critical ディスカバリー・テクノロジーズ・リミテッド
Publication of JP2002517228A publication Critical patent/JP2002517228A/ja
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
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Abstract

(57)【要約】 GPC受容体（グアニルヌクレオチド結合性調節タンパク質と相互作用する、膜貫通ドメインを持つ受容体）またはGPC受容体制御シグナル伝達系と試験物質（リガンド、修飾物質）の間の相互作用を検出するため、またはこのタイプの受容体もしくはシグナル伝達系と相互作用することができる物質を検索するために、正のフィードバックを伴うGPC受容体制御シグナル伝達経路を有し異種GPC受容体を発現する形質転換細胞株（例えばトウモロコシ黒穂菌の形質転換細胞株）を使用する。上記形質転換株はさらに、その発現を測定技術手段によって記録することができるレポーター遺伝子であって、GPC受容体の刺激によって誘導されるプロモーターが制御するレポーター遺伝子を含む。レセプター刺激によって刺激されうる上記プロモーターは内因性であり、上記レポーター遺伝子は内因性遺伝子または異種遺伝子である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、異種Gタンパク質共役受容体（GPC受容体）を発現し、GPC受容体ま
たはGPC受容体によって制御されるシグナル伝達系と物質（リガンド、修飾物質
）との相互作用をそれぞれ検出して、当該受容体またはシグナル伝達系と相互作
用する物質を見出すのに適した、第1の独立請求項の属概念に従う形質転換細胞
株に関する。さらに本発明は、上記細胞株を作出するためのベクター、ならびに
上記の相互作用を検出するためおよび上記受容体またはシグナル伝達系に作用す
る物質を見出すための上記細胞株の使用（スクリーニングアッセイ）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Gタンパク質共役受容体（GPC受容体）は7つの膜貫通ドメインを持つ受容体で
あり、ヘテロ三量体型グアニルヌクレオチド結合性調節タンパク質（Gタンパク
質）と共役して数多くの細胞外シグナルを伝達するためのシグナル伝達系を形成
する［H.G.Dohlmann，J.Thorner，M.CaronおよびR.J.Lefkowitz（1991）Annu.Re
v.Riochem.，60，653-688］。この種のシグナル伝達系は単純な真菌類からまさ
にヒトに至るまで広範な生物に存在する。
【０００３】 この種の受容体の一例はソマトスタチン受容体であり、これは哺乳類細胞中の
GPC受容体のプロトタイプに相当する。ソマトスタチンは中枢神経系と末梢組織
において広範囲に及ぶ調節効果を有し、一連の受容体サブクラスに作用する。
【０００４】 GPC受容体およびG-タンパク質を含むシグナル伝達系によるシグナル伝達は次
の一般的特徴を有する。ヘテロ三量体型Gタンパク質が、膜貫通受容体分子（GPC
受容体）と、エフェクターと呼ばれる酵素との間のシグナル伝達物質として働き
、当該エフェクターが二次メッセンジャー物質を産生する。アデニル酸シクラー
ゼ、ホスホリパーゼCおよびイオンチャネルが、哺乳類系でよく研究されている
エフェクターの例である。
【０００５】 Gタンパク質はグアニルヌクレオチド結合性αサブユニット、βサブユニット
およびγサブユニット（Gα、Gβ、Gγサブユニット）からなる［M.I.Simon，M.
P.StrathmannおよびN.Gautam（1991）Science，252，802-808］。Gタンパク質は
、GDPまたはGTPがαサブユニットに結合しているか否かによって、2種類の形態
で存在する。GDPが結合している場合、Gタンパク質はヘテロ三量体αβγ複合体
として存在する。Gタンパク質へのGTPの結合により、αサブユニットが解離して
βγ複合体が残る。Gαβγ複合体と細胞膜中の活性型GPC受容体との会合は、GT
Pと結合型GDPとの交換速度を増加させる。その結果、結合型GαサブユニットのG
βγ複合体からの解離速度が増加する。遊離のαサブユニットおよびGβγ複合
体は、様々なシグナル伝達経路の細胞エフェクターにシグナルを伝達できる。
【０００６】 GPC受容体は治療用化合物にとって重要な標的分子である。ヒトゲノムはおそ
らく約5000種類GPC受容体遺伝子を含み、新しい治療用化合物はそれらにリガン
ドとして作用できる。リガンドと受容体の間および修飾物質と対応シグナル伝達
系の間のそのような相互作用の研究にはスクリーニング試験系が使用され、先行
技術によればそれらのスクリーニング試験系には、生化学的リガンド結合研究、
哺乳類細胞でのレポーター系、または酵母細胞でのレポーター系が使用される。
【０００７】 この種の試験系で使用される酵母細胞は、当該酵素細胞が異種GPC受容体を発
現するように形質転換される。WO92/05244（US5749029）にはそのような酵母細
胞が記述されている。それら酵母細胞は異種GPC受容体を発現する第1の異種DNA
配列と、哺乳類Gタンパク質のαサブユニットを発現する第2の異種DNA配列とを
含む。
【０００８】 酵母細胞中の内因性GPC受容体は、細胞外ペプチド（いわゆるフェロモン）に
よる様々な細胞型の同定を容易にする。フェロモン活性化シグナル伝達経路は発
生プログラムを誘導し、それが一倍体α-およびa-細胞の融合および二倍体α/a-
細胞の形成をもたらす［M.WhitewayおよびB.Errede（1993）「Signal Transduct
ion，Prokaryotic and Simple Eukaryotic Systems」（J.KurjanおよびB.L.Tayl
or編，Academic Press）の189〜237頁］。交雑種型αの細胞はa細胞中でα因子
受容体（Ste2）に結合するα因子を分泌し、交雑種型ａの細胞はα細胞中で特異
的ａ因子受容体（Ste3）に結合するａ因子を分泌する。Ste2とSte3はどちらもGP
C受容体ファミリーに属する。フェロモンの対応する受容体への結合後に、それ
らのフェロモン受容体はおそらくそのコンフォメーションを変える。これはGα
サブユニット（Gpa1）のGβγ複合体（Ste4、Ste18）からの解離をもたらし、し
たがってGタンパク質の活性化をもたらす。興味深いことに、また哺乳類系でのG
タンパク質の機能とは対照的に、このGαサブユニットはシグナル伝達に対して
負の影響を持ち、一方、Gβγ-サブユニットはフェロモンシグナルを伝達する。
【０００９】 哺乳動物と酵母におけるGPC受容体制御シグナル伝達のもう一つの基本的な相
違は、受容体刺激に対する反応として二次メッセンジャー物質を生成するエフェ
クター酵素が今までに酵母細胞では発見されていないという事実からなる。おそ
らくβγ複合体はSte20プロテインキナーゼ（これは次にSte11、Ste7、Fus3およ
びKss1からなるプロテインキナーゼカスケードを活性化する）および「構造」タ
ンパク質Ste5にフェロモンシグナルを直接伝達するのだろう［I.Herskowitz（19
95）Cell，80，187-197］。
【００１０】 酵母におけるフェロモン刺激が細胞に与える結果には、遺伝子全般にわたる転
写誘導および細胞周期の停止が含まれる。これらのフェロモン誘導性遺伝子はフ
ェロモンの生合成（MFA1、MFA2、MFa1、MFa2、STE6、STE13）、受容体STE2およ
びSTE3の産生、フェロモンシグナル伝達（GPA1、FUS3）、細胞周期停止（FAR1、
CLN2、CLN3）、形態変化および細胞融合（FUS1、FUS2、CHS1）ならびにフェロモ
ン脱感作（SST2、BAR1）に必要な産物をコードする。
【００１１】 フェロモンが制御する転写は、配列特異的DNA結合タンパク質Ste12によって促
進される。STE12遺伝子の転写はフェロモンでは誘導されない。フェロモンシグ
ナル伝達経路の機能的に重複したMAPキナーゼ相同体Fus3およびKss1が特異的リ
ン酸化によって転写因子Ste12を活性化するのではないかと思われる。フェロモ
ン誘導性遺伝子はそのプロモーター領域にシス作用性のDNA配列、いわゆる「フ
ェロモン応答配列」（PRE）を持っている。しかし、酵母内のある遺伝子のプロ
モーター領域にPRE配列が存在するだけでは、その遺伝子の転写がフェロモン誘
導性であることにはならない。したがって、例えばSTE12遺伝子は数個のPREを持
つが、STE12の発現はフェロモン誘導性ではない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
発明の基本的特徴 本発明の目的は、異種GPC受容体を発現する形質転換細胞株（ヒト、動物また
は植物細胞ならびに真菌細胞）を作出することである。これらの形質転換細胞株
は、物質（リガンド、修飾物質）とGPC受容体とのまたはGPC受容体制御シグナル
伝達系との相互作用をそれぞれ検出して、対応するスクリーニングアッセイで上
記受容体またはシグナル伝達系と相互作用する物質を見出すのに適しているべき
である。この目的にとって好適であるために、上記形質転換細胞は上述した種類
の相互作用に対して高い感受性を示すべきである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記の目的は、特許請求の範囲に定義する形質転換細胞株によって達成される
。
【００１４】 本発明の細胞株（ヒト、動物または植物細胞ならびに真菌細胞）はGPC受容体
を含むシグナル伝達系を持ち、当該シグナル伝達系はリガンドによって活性化さ
れ、正のフィードバックを示す。この正のフィードバックの機構は、GPC受容体
によって活性化される転写因子をコードする遺伝子の転写が、それ自体、受容体
刺激によって誘導されるという事実からなる。
【００１５】 本発明の細胞株は正のフィードバックを伴う内因性のGPC受容体シグナル伝達
系を有してもよく、または組換えDNA技術を使って既存のGPC受容体シグナル伝達
鎖に正のフィードバック機構を組み込むこともできる。正のフィードバック機構
により、上記の天然シグナル伝達系またはそれに相当するように修飾されたシグ
ナル伝達系は、上述した相互作用の検出に使用される既知の細胞系と比較して、
著しく高い感度を示す。これは、正のフィードバック機構を持つ細胞株が、GPC
受容体による活性化に対して、当該受容体が内因性であるか形質転換によって導
入された異種受容体であるかに関わらず、上述のような検出に使用される既知の
細胞系よりも高感度に反応することを意味する。
【００１６】 トウモロコシ疫病菌であるトウモロコシ黒穂菌Ustilago maydisは、天然状態
でGPC受容体制御シグナル伝達鎖に正のフィードバック機構が存在する、GPC受容
体に関する細胞試験系の一例である。フェロモン活性化シグナル伝達におけるこ
の正のフィードバックは、トウモロコシ黒穂菌について、H.A.Hartmann，R.Kahm
annおよびM.Boelkerによって記述されている［EMBO J.，15，1632-1641（1996）
］。担子菌であるトウモロコシ黒穂菌は真核モデル生物として使用される。病原
性型である場合、この菌は宿主植物トウモロコシでトウモロコシの胴枯れを引き
起こすので、病原性真菌類を研究するためのモデル系としても役立つ。トウモロ
コシ黒穂菌の遺伝子構成は比較的容易に改変できる［F.Banuette（1995）Annu.R
ev.Genet.，29，179-208］。
【００１７】 他の細胞株、特に他の黒穂菌科の真菌または担子菌細胞も、一般に、正のフィ
ードバックを伴う上述のようなGPC受容体活性化シグナル伝達経路を発現させる
ので、黒穂菌と同様に、天然状態で上記の試験反応に供されると考える必要があ
る。
【００１８】 本発明では、GPC受容体によって誘導される標的遺伝子の転写が正のフィード
バックによって増幅されるGPC受容体活性化シグナル伝達系を天然の状態または
遺伝子修飾された状態で有する細胞株が、特定のGPC受容体または対応するシグ
ナル伝達系と試験物質との相互作用を検出するために使用される。さらに上記の
細胞は、内因性のまたは異種起源のレポーター遺伝子を有し、当該レポーター遺
伝子の発現は上記受容体の活性化によって誘導されるプロモーターが制御し、当
該レポーター遺伝子の発現を測定技術によって検出および定量することができる
（例えば測定可能な細胞成長をもたらす必須成長酵素、または生化学的反応にお
いて測定可能な効果をもたらす他の酵素）。
【００１９】 本発明の細胞株の細胞において、異種GPC受容体は、内因性Gタンパク質または
異種Gタンパク質、特に異種Gタンパク質αサブユニットと会合できる。加えて、
上記の細胞は、GPC受容体制御シグナル伝達を担う内因性αサブユニットを阻害
することで異種受容体と異種Gタンパク質の間の相互作用を促進する遺伝子の突
然変異を含有することもできる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
「異種」なる用語は、本明細書では対応細胞株を基準として使用される。した
がって、この用語は、天然状態では対応細胞株に存在せず、他の生物から対応細
胞株に導入されるDNA配列、タンパク質および他の物質またはそれらの組み合せ
を指す。
【００２１】 「上流」および「下流」なる用語は、以下の説明では、転写および翻訳の方向
を指すために使用される。もう一つの配列に先立って転写または翻訳される配列
を当該他の配列の「上流」と呼ぶ。
【００２２】 本発明の細胞株を作出する際に利用する方法と材料を、トウモロコシ黒穂菌を
例に挙げて詳細に説明する。しかしこれは本発明の細胞株をこの種に制限するも
のでは決してない。他の細胞株についても、それらの方法および材料が同様に適
用されるべきであり、当業者は何の問題もなくこれを行なうことができる。
【００２３】 天然状態のトウモロコシ黒穂菌の場合、1つのシグナル伝達系により、酵母に
ついて上述したように、同様の方法で、細胞型（a1およびa2）の同定と融合を行
なうことができる。このシグナル伝達系はフェロモンおよび対応するフェロモン
受容体によって制御される［J.KronstadおよびC.Staben（1997）Annu.Rev.Genet
.，31，245-276］。交雑種型a1のトウモロコシ黒穂菌の細胞は、a2細胞中で特異
的Mfa1受容体（Pra2）に結合するペプチドフェロモンMfa1を分泌する。交雑種型
a2の細胞は、Mfa2受容体（Pra1）を発現するa1細胞でのみ作用するMfa2フェロモ
ンを分泌する。フェロモン受容体Pra1およびPra2はGPC受容体である。
【００２４】 対応するフェロモンを結合することによる受容体Pra1およびPra2の活性化はお
そらくヘテロ三量体型Gタンパク質（今のところ、そのうちのαサブユニットGpa
3だけが知られている）の解離を引き起こす［E.Regenfelder，T.Spellig，A.Har
tmann，S.Lauenstein，M.BoelkerおよびR.Kahmann（1997）EMBO J.，16，1934-1
942］。Gpa3は、酵母における機能的相同体（Gpa1）とは対照的に、フェロモン
シグナル伝達に対して正の影響をもつ。興味深いことに、Gpa3の細胞エフェクタ
ーは、アデニルシクラーゼ（Uac1）であるように思われる。なぜならgpa3遺伝子
中の変異は一方ではフェロモンシグナル伝達を不可能にし、他方ではアデニルシ
クラーゼ欠損突然変異体の成長と類似するフィラメント様の成長を引き起こすか
らである。さらにまた、gpa3突然変異体のフィラメント様の成長は、アデニルシ
クラーゼによって産生される二次メッセンジャー物質である環状AMPの添加によ
って逆転させることができる［R.KahmannおよびC.Basse（1997）Trends in Plan
t Sci.，2，366-368；S.Gold，G.Duncan，K.BarrettおよびJ.Kronstad（1994）G
enes Dev.，8，2805-2816］。そのため、黒穂菌におけるフェロモンシグナル伝
達は、酵母におけるフェロモン制御シグナル伝達の場合よりも、哺乳類系での対
応する機構に、より類似しているように思われる。
【００２５】 最後の例として、黒穂菌におけるフェロモン刺激は、ハイブリッド型遺伝子座
aおよびbにある全遺伝子、すなわちmfa1、mfa2、pra1、pra2、lga2、rga2、bE、
bWの転写誘導をもたらす［M.Urban，R.KahmannおよびM.Boelker（1996）Mol.Gen
.Genet.，251，31-37］。これらの遺伝子はすべて、それらの関連遺伝子調節領
域に、少なくとも1つのシス作用性DNA配列「フェロモン応答配列」（PRE）を持
っている。トウモロコシ黒穂菌のPRE配列は、配列特異的DNA結合タンパク質Prf1
によって識別される。フェロモン刺激はPrf1の活性化につながり、それが上記遺
伝子のフェロモン誘導性転写をもたらす。prf1遺伝子のプロモーターもPREを持
つので、prf1遺伝子の転写もフェロモン刺激によって活性化される（H.A.Hartma
nn，R.KahmannおよびM.Boelker（1996）EMBO J.，15，1632-1641）。黒穂菌のフ
ェロモンシグナル伝達経路には、prf1遺伝子のフェロモン誘導性転写による正の
フィードバック機構が本来備わっている。
【００２６】 正のフィードバックを伴うGPC受容体制御シグナル伝達系は、GPC受容体の刺激
によって活性化される転写因子をコードし、その結果として、GPC受容体によっ
て制御される標的遺伝子の転写を制御する遺伝子の転写が、それ自体、GPC受容
体の刺激によって誘導されるという事実によって同定できる。
【００２７】 上述の機構を図1の左側に図解する。この機構により、例えば上記受容体への
リガンドの結合などを検出する感度が著しく高くなる。既に上述したように、ま
た比較例として図1の右側に図示するように、対応するアッセイで上述の検出に
使用される対応する酵母系および他の細胞系は、正のフィードバック機構を持た
ない。酵母の対応する機構では、GPC受容体によって活性化される転写因子（Ste
12）の発現が、受容体刺激によって誘導されない（図1参照）。
【００２８】 しかし、異種受容体とリガンドの間の相互作用を測定するために使用される酵
母株を、それらの酵母株が正のフィードバック機構を持つように改変することが
考えられる。これを達成するために、フェロモン刺激によって活性化される転写
因子をコードするSTE12遺伝子のプロモーターを、フェロモン誘導性であるプロ
モーター（例えばFUS1プロモーター）で置き換える。
【００２９】 様々な黒穂菌株および黒穂菌トランスフェクションに適した発現ベクターが知
られている。発現ベクターは、宿主細胞で異種DNA配列を発現させるために使用
される複製可能なDNAコンストラクトである。発現させようとする異種DNA配列に
は、目的の宿主で上記異種DNA配列がコードするタンパク質またはタンパク質サ
ブユニットの発現を制御できる適当な制御配列を装備する必要がある。制御配列
には、転写プロモーター、転写を調節するための随意のシス作用性DNA配列、効
率のよい転写開始をもたらす適当なDNA配列、転写の終結とmRNAのポリアデニル
化を制御するDNA配列が包含される。
【００３０】 本発明の細胞株の作出に適したベクターには、プラスミド、ウイルスおよび遺
伝子組換えによって宿主ゲノムに組み込まれうるDNA断片が包含される。好適な
ベクターは、目的の発現宿主中で機能する、種由来の制御配列を含む。
【００３１】 黒穂菌ベクターは、当該プラスミドを黒穂菌細胞中で多数のコピーに複製でき
るようにする自律複製配列（UARS）、プロモーター、発現させようとする異種タ
ンパク質をコードする異種DNA配列、ポリアデニル化のための配列および選択マ
ーカー遺伝子を含むことができる。
【００３２】 この種類のプラスミドの一例はpJW42である［J.Wang，D.W.HoldenおよびS.A.L
eong（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，865-869］。このプラスミドは大腸
菌のhph遺伝子［L.GritzおよびJ.Davies（1983）Genes，25，179-188］を含み、
この遺伝子は抗生物質ハイグロマイシンBに対する耐性を付与するので、これを
選択マーカーとして利用することができる。他の利用可能なマーカー遺伝子は、
例えば、殺真菌剤カルボキシンに対する耐性を付与するトウモロコシ黒穂菌のcb
x遺伝子［P.L.E.BroomfieldおよびJ.A.Hargreaves（1992）Curr.Genet.，22，11
7-121］または抗生物質ノウルセオスリシン（nourseothricine）に対する耐性を
付与するストレプトミセス・ノウルセイ（Streptomyces noursei）のnat1遺伝子
［H.Krueger，G.Fiedler，C.SmithおよびS.Baumberg（1993）Genes，127，127-1
31］である。
【００３３】 好適なプロモーター配列は、hsp70遺伝子［D.W.Holden，J.W.KronstadおよびS
.A.Leong（1989）EMBO J.，8，1927-1934］、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒ
ドロゲナーゼ遺伝子［T.L.SmithおよびS.A.Leong（1990）Genes，93，111-117］
および翻訳伸長因子遺伝子［H.A.Hartmann，R.KahmannおよびM.Boelker（1996）
EMBO J.，15，1632-1641］のプロモーターからなる。生育条件による転写制御と
いう付加的な利点を持つ他のプロモーターには、アラビノースによって誘導され
グルコースによって抑制されるcrg1遺伝子のプロモーター［A.Bottin，J.Kaempe
rおよびR.Kahmann（1996）Mol.Gen.Genet.，253，342-352］および生育培地中の
イオン濃度によって負に調節されるsid1遺伝子のプロモーター［Z.An，B.Mei，W
.M.YuanおよびS.A.Leong（1997）EMBO J.，16，1742-1750］がある。ポリアデニ
ル化とmRNA終結を保証するために、これらの遺伝子を含む発現ベクターの異種配
列の下流に終結配列を結合させることもできる。
【００３４】 黒穂菌での異種GPC受容体の効率のよい発現を可能にするべく、新規発現ベク
ターを開発した。これらの発現ベクターは、GPC受容体のcDNAの転写を促進する
トウモロコシ黒穂菌hsp70プロモーターおよび同ターミネーターを含む。発現さ
せようとするDNA配列（例えばGPCR-cDNA）のクローニングを簡略化するために、
制限酵素部位がhsp70プロモーターと同ターミネーターの間に追加される。
【００３５】 黒穂菌形質膜への異種GPC受容体の細胞内局在を最適化するために、黒穂菌GPC
受容体のアミノ末端をコードする配列の少なくとも1セグメントを含む黒穂菌DNA
配列を含んでなる第1のセグメントを含有する発現ベクターを作成することもで
きる。黒穂菌のフェロモン受容体をコードするDNA配列（例えばMfa2フェロモン
受容体をコードするpra1遺伝子およびMfa1フェロモン受容体をコードするPra2遺
伝子）は、GPC受容体をコードしていて好適なベクターの作成に利用できる黒穂
菌遺伝子の例である。上記第1のセグメントの下流にあって当該第1のセグメント
に関して正しい読み枠にある第2のセグメントは、異種GPC受容体をコードするDN
A配列からなる。翻訳開始点のこのような改良により、異種タンパク質の発現量
を増加させることができる。第1および第2のセグメントは、例えば構成的hsp70
プロモーターまたは誘導性crg1プロモーターなどのプロモーターと、機能的に作
用するように結合される。
【００３６】 本発明細胞株の作出には、あらゆるGPC受容体と、それら受容体をコードする
対応DNA配列を利用できる。この種の受容体の例にはアドレナリン作動性受容体
（αまたはβ）、アデノシン受容体、アンギオテンシン受容体、ブラジキニン受
容体、カンナビノイド受容体、ケモカイン受容体、ドーパミン受容体、グルカゴ
ン受容体、ニューロキニン受容体、ニューロテンシン受容体、セロトニン受容体
、オピエート受容体、ムスカリン性受容体、ソマトスタチン受容体およびバソプ
レシン受容体がある。本明細書で使用する「受容体」なる用語はサブタイプなら
びにそれら受容体の突然変異体および相同体を包含し、またそれらをコードする
DNA配列も包含する。
【００３７】 本発明細胞株の作出には、あらゆるGαサブユニットと、それらGαサブユニッ
トをコードする対応DNA配列を利用できる。Gαサブユニットの例には、Gsサブユ
ニット、Goサブユニット、Gqサブユニット、GiサブユニットおよびGzサブユニッ
トがある。本明細書で使用する「Gαサブユニット」なる用語はサブタイプなら
びにそれらGαサブユニットの突然変異体および相同体を包含し、またそれらを
コードするDNA配列も包含する。黒穂菌での異種Gαサブユニットの機能的発現は
容易に検証することができる。なぜなら、黒穂菌GαサブユニットGpa3の欠損は
、無傷のgpa3遺伝子を持つ黒穂菌細胞の酵母様の成長とは対照的に、特徴的な視
覚的に観察できるフィラメント様の成長を引き起こすからである。フェロモンシ
グナル伝達鎖における内因性GαサブユニットGpa3の機能を引き継ぐ異種Gαサブ
ユニットは、gpa3突然変異体細胞のフィラメント様成長欠損を補って正常な酵母
様成長にするので、容易に同定できる。
【００３８】 本発明細胞株の作出には、あらゆるGβγサブユニットとそれらGβガンマサブ
ユニットをコードする対応DNA配列を利用できる。本明細書で使用する「Gβγサ
ブユニット」なる用語はサブタイプならびにそれらGβγサブユニットの突然変
異体および相同体を包含し、またそれらをコードするDNA配列も包含する。
【００３９】 本発明の細胞株における異種GPC受容体へのリガンドの結合を検出するため、
または一般に修飾物質とGPC受容体制御シグナル伝達系の間の相互作用を検出す
るためには、当該細胞にプロモーターとレポーター遺伝子を含む第3のDNAコンス
トラクトを与えることがとりわけ適切である。上記プロモーターは上記異種GPC
受容体の活性化によって誘導される。上記レポーター遺伝子はGPC受容体誘導性
プロモーターの下流に置かれ、当該プロモーターと機能的に作用できるように結
合される。レポーター遺伝子の発現は測定技術を使って記録することができ、そ
の発現は適当なリガンドによる異種GPC受容体の活性化を反映する。代表例であ
るトウモロコシ黒穂菌では、mfa1遺伝子のプロモーター、mfa2遺伝子のプロモー
ター、pra1遺伝子のプロモーター、pra2遺伝子のプロモーターまたはprf1遺伝子
のプロモーターを、GPC受容体誘導性プロモーターとして使用できる。様々な内
因性遺伝子または異種遺伝子をレポーター遺伝子として使用できる。レポーター
遺伝子の例には、pyr6遺伝子［J.W.Kronstad，J.Wang，S.F.Covert，D.W.Holden
，G.L.McKnightおよびS.A.Leong（1989）Genes，79，97-106］、pyr3遺伝子［A.
Spanos，N.Kanuga，D.W.HoldenおよびG.R.Banks（1992）Genes，117，73-79］、
lacZ遺伝子、hph遺伝子（ハイグロマイシン耐性）［L.GritzおよびJ.Davies（19
83）Genes，25，179-188］、ble遺伝子（フレオマイシン耐性）［D.Drocourt，T
.Calmels，J.P.Reynes，M.BaronおよびG.Tiraby（1990）Nucl.Acids Res.，18，
4009］、GFP遺伝子（緑色蛍光タンパク質）［T.Spellig，A.BottinおよびR.Kahm
ann（1996）Mol.Gen.Genet.，225，503-509］またはuidA（GUS）遺伝子［R.A.Je
fferson，S.M.BurgessおよびD.Hirsh（1986）Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，844
7-8451］がある。
【００４０】
【実施例】
実施例１： 黒穂菌発現ベクター（pDT78およびpDT99）の製造 トウモロコシ黒穂菌に異種GPC受容体を発現させるために、黒穂菌発現ベクタ
ーpDT78およびpDT99を作成した。
【００４１】 発現ベクターpDT78については、自律複製型黒穂菌ベクターpCM54［T.Tsukuda
，S.Carleton，S.FotheringhamおよびW.K.Holloman（1988）Mol.Cell.Biol.，8
，3703-3709］の3.1kb HindIII断片を、プラスミドpDWH10［J.Wang，D.W.Holden
およびS.A.Leong（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，865-869］の2kb HindII
I断片で置換した。この2kb HindIII断片は、BglII部位で分離されたトウモロコ
シ黒穂菌hsp70遺伝子のプロモーターと転写ターミーネーターとを含む。得られ
たプラスミドpDT48をSacIおよびPstIで切断し、プラスミドpNAT1（pDT65）から
単離した1.5kbのSacI-PstI断片（これはストレプトスリシン（streptothricine
）ファミリーの抗生物質ノウルセオスリシンに対する耐性を付与するストレプト
ミセス・ノウルセイのnat1遺伝子を含有する）を導入した［H.Kruegel，G.Fiedl
er，C.SmithおよびS.Baumberg（1993）Gene，127，127-131］。トウモロコシ黒
穂菌でのnat1遺伝子の発現は、トウモロコシ黒穂菌グリセルアルデヒド-3-リン
酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）遺伝子のプロモーター［T.L.SmithおよびS.A.Leon
g（1990）Genes，93，111-117］およびサッカロミセス・セレビシェのcyc1遺伝
子の転写ターミネーター［D.Drocourt，T.Calmels，J.P.Reynes，M.Baronおよび
G.Tiraby（1990）Nucleic Acids Res．18，4009］によって制御される。これに
よって得られるプラスミドpDT78は、トウモロコシ黒穂菌hsp70プロモーターとト
ウモロコシ黒穂菌hsp70ターミネーターの間に一つのBglII部位を持つ。この制限
酵素部位は、トウモロコシ黒穂菌中で発現させるべき異種GPC受容体をコードす
るDNA配列を導入するために利用できる。したがって、異種GPC受容体を指定する
cDNAの転写は、トウモロコシ黒穂菌hsp70プロモーターの転写制御配列によって
もたらされる。pDT78発現ベクターとその誘導体は、既知の形質転換法［J.Wang
，D.W.HoldenおよびS.A.Leong（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，865-869］
を使ってトウモロコシ黒穂菌に導入することができ、抗生物質ノウルセオスリシ
ン（40μg/ml）を生育培地に添加することによって、トウモロコシ黒穂菌細胞に
おけるこのプラスミドの存在についての選択がなされる。
【００４２】 黒穂菌内で発現させようとするDNA配列のクローニングを簡略化するために、h
sp70プロモーターを使って、hsp70プロモーターとターミーネーターの間に、（
例えばpDT78のように）唯一の制限部位を持つのではなく、いくつかの異なる制
限酵素部位を持つ別の発現プラスミドを作成した。ここではpDT99を例に挙げて
これを説明する。
【００４３】 pDT49は、トウモロコシ黒穂菌hsp70遺伝子のプロモーターおよび転写ターミネ
ーターを含む上記2kbのHindIII断片が反対向きに導入されている点以外は、上述
したpDT48と同一である。すなわち当該プラスミドの大腸菌lacZプロモーターと
、導入されたhsp70プロモーターとは、反対方向の転写をもたらす。pDT49のSmaI
、BamHI、XbaI、SalIおよびPstI部位を除去するために、pDT49をSmaIおよびPstI
で消化し、そのPstI部位の3'突出部分をT4 DNAポリメラーゼで除去し、そのプラ
スミドを再結合した。得られたプラスミドpDT85のhsp70プロモーターとターミネ
ーターの間のBglII部位に、制限酵素KpnI、EcoRI、NotI、NcoI、MluI、StuI、Sp
hI、BamHIおよびSacII用の部位を（この順序で）含む二本鎖オリゴヌクレオチド
を、SacII部位がKpnI部位よりもhsp70プロモーターの近くにくるように結合した
。得られたプラスミドpDT90には、そのSacI部位に、プラスミドpjahCbx8（この
プラスミドはトウモロコシ黒穂菌で殺真菌剤カルボキシンに対する耐性を付与す
る遺伝子を含有する）［P.L.E.BroomfieldおよびJ.A.Hargreaves（1992）Curr.G
enet.，22，117-121］の2.3kbのSacI断片を導入した。pDT99は形質転換法によっ
てトウモロコシ黒穂菌細胞に導入することができ［J.Wang，D.W.HoldenおよびS.
A.Leong（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，865-869］、殺真菌剤カルボキシ
ン（2μg/ml）を生育培地に添加することによって、トウモロコシ黒穂菌細胞に
おけるこのプラスミドの存在についての選択がなされる。
【００４４】 実施例２： トウモロコシ黒穂菌でのヒトβ2アドレナリン作動性受容体の発現（pDT94） トウモロコシ黒穂菌でヒトβ2アドレナリン作動性受容体（β2-AR）を発現さ
せるために、ヒトβ2アドレナリン作動性受容体のcDNAを含んでいるプラスミドp
TF3［B.K.Kobilka，R.A.F，Dixon，T.Frielle，H.G.Dohlman，M.A.Bolanowski，
I.S.Sigal，T.L.Yang-Feng，U.Francke，M.G.Caron，R.J.Lefkowitz（1987）Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA，84，46-50］のDNA約0.1μgを、ポリメラーゼ連鎖反応（P
CR）により、プライマー5'-CGGGATCCACAATGACCCAACCCGGCAACGGCAGCG-3'および5'
-CGGGATCCTCAGAGCAGCGAGTCATTTGTGCTACA-3'（ここにA＝アデノシン、C＝シトシ
ン、G＝グアニン、T＝チミジン）を使って増幅した。β2アドレナリン作動性受
容体のヒトDNA配列と比較して、特に転写開始ATGコドンの環境を、糸状菌の対応
するコンセンサス配列に相当するように改変さした［D.J.Ballance（1991）「Mo
lecular Industrial Mycology: Systems and Applications for Filamentous Fu
ngi」（S.A.LeongおよびR.M.Berka編，Dekker，ニューヨーク）の1〜29頁］。得
られた1.2kb PCR産物をBamHIで消化し、BamHIで直線化して脱リン酸化したベク
ターpBLUESCRIPTII KS+（Stratagene社）のBamHI部位にクローニングした。その
ようにしてクローニングされた1.2kbのBamHI b2-AR PCR産物のDNA配列を確認し
た。次に、得られたプラスミドpDT87の1.2kb BamHI断片を、発現ベクターpDT78
のBglII部位に、β2-AR配列がhsp70プロモーターの正しい向きに転写されるよう
に導入した。この時点で、得られたβ2-AR発現プラスミドpDT94は、既知の形質
転換法を使ってトウモロコシ黒穂菌細胞に導入できる［J.Wang，D.W.Holdenおよ
びS.A.Leong（1988）Proc.Natl.Acad.sci.USA，85，865-869］。
【００４５】 ヒトβ2-ARがトウモロコシ黒穂菌中で発現されることの生化学的証拠は、リガ
ンド結合研究によって得ることができる。そのようなリガンド結合研究は、pDT9
4で形質転換されたトウモロコシ黒穂菌細胞の膜画分で、例えば放射活性標識β2
-ARリガンド3-[125I]ヨードシアノピンドロールを使って、公表されたプロトコ
ルに従って行なうことができる［H.K.Dohlman，M.G.Caron，A.DeBlasi，T.Friel
leおよびR.J.Lefkowtiz（1990）Biochemistry，29，2335-2342］。
【００４６】 トウモロコシ黒穂菌中で発現したヒトβ2-ARが機能的であって、トウモロコシ
黒穂菌のフェロモンシグナル伝達鎖と相互作用することの証明は、pDT94で形質
転換されたトウモロコシ黒穂菌細胞にフェロモン誘導性レポーター遺伝子を導入
することによって得ることができる。プラスミドpMU1は酵素β-グルクロニダー
ゼ（GUS）をコードする細菌のuidA遺伝子を含有し［R.A.Jefferson，S.M.Burges
sおよびD.Hirsh（1986）Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，8447-8451］、その発現
は著しくフェロモン誘導性であるmfa1遺伝子のプロモーターによって調節される
［M.Urban，R.KahmannおよびM.Boelker（1996）Mol.Gen.Genet.，251，31-37］
。その結果、トウモロコシ黒穂菌中で発現したβ2-ARへのβ2-ARアゴニストの結
合は、pDT94およびpMU1を含有するトウモロコシ黒穂菌形質転換体を例えばβア
ドレナリン作動性アゴニストであるイソプロテレノールで刺激することによって
証明することができる。レセプターの刺激は、例えばA.Gururaj RaoおよびP.Fly
nn（1922）が「GUS Protocols」（S.R.Gallagher編，Academic Press社）の89〜
99頁に記述しているように、GUS活性に関する簡単な生化学的試験によって証明
することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の細胞株中に存在するような正のフィードバックを伴うシ
グナル伝達系（左側）と、例えば酵母細胞中に存在するような正のフィードバッ
クを伴わないシグナル伝達系（右側）との比較を表す図である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年６月２４日（２０００．６．２４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 DA11 EA04 FA02 GA11 HA01 HA11 4B063 QA01 QA07 QA08 QQ05 QQ07 QQ79 QR33 QR59 QR62 QR76 QR80 QS05 QS36 QX01 QX02 4B065 AA57X AB01 BA01 CA24 CA44 CA46

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 GPC受容体との相互作用またはGPC受容体制御シグナル伝達系
    との相互作用を検出するための形質転換細胞株であって、当該形質転換細胞株の
    細胞が異種GPC受容体および前記異種GPC受容体の刺激によって誘導されるプロモ
    ーターならびに前記プロモーターによって制御されるレポーター遺伝子を発現す
    る形質転換細胞株において、上記細胞が、正のフィードバックを有する内因性の
    または遺伝子工学によって導入されたGPC受容体制御シグナル伝達系を持つこと
    を特徴とする形質転換細胞株。
  2. 【請求項２】 上記細胞が天然状態で正のフィードバックを伴うGPC受容体
    制御シグナル伝達系を持つことを特徴とする請求項１に記載の形質転換細胞株。
  3. 【請求項３】 当該形質転換細胞株がトウモロコシ黒穂菌（Ustilago maydi
    s）の株であることを特徴とする請求項２に記載の形質転換細胞株。
  4. 【請求項４】 上記GPC受容体制御シグナル伝達系における正のフィードバ
    ックが遺伝子組換えを使って作り出されることを特徴とする請求項１に記載の形
    質転換細胞株。
  5. 【請求項５】 上記異種GPC受容体がα-アドレナリン作動性受容体、β-ア
    ドレナリン作動性受容体、アデノシン受容体、アンギオテンシン受容体、ブラジ
    キニン受容体、カンナビノイド受容体、ケモカイン受容体、ドーパミン受容体、
    グルカゴン受容体、ニューロテンシン受容体、セロチニン（serotinine）受容体
    、オピエート受容体、ムスカリン性受容体、ソマストスタチン（somastostatin
    ）受容体またはバソプレシン受容体であることを特徴とする請求項１〜４の一項
    に記載の形質転換細胞株。
  6. 【請求項６】 上記細胞がさらに異種Gタンパク質サブユニットも発現する
    ことを特徴とする請求項１〜５の一項に記載の形質転換細胞株。
  7. 【請求項７】 上記細胞がGs、Go、Gq、GiまたはGzサブユニットである異種
    Gαサブユニットを発現することを特徴とする請求項６に記載の形質転換細胞株
    。
  8. 【請求項８】 上記細胞が異種Gβγサブユニットを発現することを特徴と
    する請求項６に記載の形質転換細胞株。
  9. 【請求項９】 上記異種GPC受容体の刺激によって誘導される上記プロモー
    ターがトウモロコシ黒穂菌遺伝子mfa1、mfa2、pra1、pra2またはprf1のプロモー
    ターであることを特徴とする請求項３に記載の形質転換細胞株。
  10. 【請求項１０】 上記プロモーターによって制御される上記レポーター遺伝
    子がlacZ遺伝子、hph遺伝子、ble遺伝子、GFP遺伝子またはuidA遺伝子であるこ
    とを特徴とする請求項１〜９の一項に記載の形質転換細胞株。
  11. 【請求項１１】 上記プロモーターによって制御される上記レポーター遺伝
    子が、トウモロコシ黒穂菌のpyr6遺伝子またはトウモロコシ黒穂菌のpyr3遺伝子
    であることを特徴とする請求項３に記載の形質転換細胞株。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜１１の一項に記載の形質転換細胞株を作出する
    ためのベクターであって、当該ベクターが、形質転換されるべき細胞中で機能的
    なプロモーターとターミネーターの間に、GPC受容体をコードする異種DNA配列お
    よびマーカー遺伝子を含むことを特徴とするベクター。
  13. 【請求項１３】 上記プロモーターおよびターミネーター遺伝子がトウモロ
    コシ黒穂菌遺伝子であることを特徴とする請求項１２に記載のベクター。
  14. 【請求項１４】 上記プロモーター/ターミネーターがトウモロコシ黒穂菌h
    sp70遺伝子であること、または上記プロモーターがトウモロコシ黒穂菌のアラビ
    ノース誘導性crg1遺伝子のプロモーターであることを特徴とする請求項１３に記
    載のベクター。
  15. 【請求項１５】 上記マーカー遺伝子がトウモロコシ黒穂菌のcbx遺伝子、
    ストレプトミセス・ノウルセイ（Streptomyces noursei）のnat1遺伝子または大
    腸菌のhph遺伝子であることを特徴とする請求項１２〜１４の一項に記載のベク
    ター。
  16. 【請求項１６】 異種GPC受容体をコードする上記DNA配列が糸状菌のコンセ
    ンサス配列を伴う翻訳開始コドンを持つ請求項１３〜１５の一項に記載のベクタ
    ー。
  17. 【請求項１７】 当該ベクターが、形質転換されるべき細胞のGPC受容体の
    アミノ末端コード配列の少なくとも1セグメントを含むDNA配列を持ち、かつ、こ
    のDNA配列の上流に正しい読み枠で上記異種GPC受容体をコードするDNA配列を持
    つことを特徴とする請求項１２〜１６の一項に記載のベクター。
  18. 【請求項１８】 異種GPC受容体をコードする上記DNA配列が、α-アドレナ
    リン作動性受容体、β-アドレナリン作動性受容体、アデノシン受容体、アンギ
    オテンシン受容体、ブラジキニン受容体、カラビノイド（carabinoid）受容体、
    ケモカイン受容体、ドーパミン受容体、グルカゴン受容体、ニューロキニン受容
    体、ニューロテンシン受容体、セロトニン受容体、オピエート受容体、ムスカリ
    ン性受容体、ソマトスタチン受容体またはバソプレシン受容体をコードすること
    を特徴とする請求項１２〜１７の一項に記載のベクター。
  19. 【請求項１９】 試験物質と細胞とを相互作用させ、レポーター遺伝子の発
    現が測定技術を使って記録される、試験物質と異種GPC受容体とのまたはGPC受容
    体によって制御されるシグナル伝達系との相互作用の検出を行なうための、請求
    項１〜１１の一項に記載の形質転換細胞株の使用。
  20. 【請求項２０】 上記レポーター遺伝子が必須成長酵素を発現すること、お
    よびその細胞成長が濁度測定によって記録されることを特徴とする請求項１９に
    記載の使用。
  21. 【請求項２１】 上記レポーター遺伝子の発現が生化学的反応にさらされ、
    その反応生成物が測定技術を使って記録されることを特徴とする請求項１９に記
    載の使用。
  22. 【請求項２２】 上記レポーター遺伝子がuidA遺伝子であってβ-グルクロ
    ニダーゼをコードすること、および発現されたβ-グルクロニダーゼが適切な生
    化学的試験によって記録されることを特徴とする請求項２１に記載の使用。
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