JP2002512599A - 富グアニジンオリゴアプタマー及び免疫応答の調節方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 アプタマーオリゴヌクレオチドは、ＣＤ２８のような補助刺激因子並びにＩＬ−２及びＧＭＣＳＦのようなサイトカインをコードする遺伝子を調節するＳｐ１タンパク質及びＳｐ１関連タンパク質のＤＮＡ結合部位に特異的に結合する。このオリゴヌクレオチドは、Ｔ細胞活性化を調節する分子を特異的に調節する調節タンパク質とＤＮＡ結合部位において競合する。これは、遺伝子の転写を阻止することによって遺伝子発現を有効に調節する。アプタマーは、乾癬、Ｉ型（インスリン依存性）真性糖尿病、多発性硬化症、自己免疫ブドウ膜炎、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎）、敗血症性ショックのようなＴ細胞の異常な活性化が関与する疾病の治療効果を与えるために、また、同種移植片拒絶のようなＴ細胞の正常な活性化を調節するために投与される。

Description

【発明の詳細な説明】 富グアニジンオリゴアプタマー及び免疫応答の調節方法 発明の分野 本発明の分野は免疫学である。 発明の背景 多くの主要Ｔ細胞仲介疾患の発病及び悪化の原因は、Ｔ細胞の異常な活性化に よって誘発される不適正な免疫応答にある。Ｉ型（インスリン依存性）真性糖尿 病、甲状腺炎、サルコイド症、多発性硬化症、自己免疫性ブドウ膜炎、リウマチ 様関節炎、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸 炎）、および再生不能性貧血のような他の多くの疾病の原因もＴ細胞の異常な活 性化にあると考えられている。更に、敗血症性ショック及び腫瘍誘発性悪液質の ような種々の症候群にもＴ細胞の活性化及び毒性になり得るレベルのリンホカイ ンの産生増進が関与すると考えられる。また、Ｔ細胞の正常な活性化は、“外来 ”ドナー組織の有効な破壊に必要なシグナルを供給することによって移植細胞及 び移植器官の拒絶を仲介する。 Ｔ細胞の増殖並びに特定の免疫調節サイトカインの遺伝子発 現及び分泌に導くＴリンパ球の活性化には独立した２つのシグナルが必要である 。第一のシグナルは、特異的Ｔ細胞レセプター／ＣＤ３複合体によって、抗原提 示細胞（ＡＰＣ）表面の主要組織適合複合体分子によって提示される抗原が認識 されることによって生じる。Ｔ細胞とＡＰＣとの抗原非特異的細胞内相互作用に よって第二のシグナルが生じ、このシグナルは抗原に対するＴ細胞応答を調節す る。これらの二次シグナルまたは共刺激シグナルは抗原に対するＴ細胞応答の大 きさを決定する。共刺激された細胞は、特定のサイトカイン遺伝子の転写レベル を上昇させ、選択されたｍＲＮＡを安定させることによって反応する。共刺激の 非存在下のＴ細胞活性化は、不全性または無力性のＴ細胞応答を生じる。１つの 重要な共刺激シグナルは、Ｔ細胞表面レセプタ−ＣＤ２８とＡＰＣ上のＢ７関連 分子との相互作用によって提供される（Ｌｉｎｓｌｅｙ ａｎｄ Ｌｅｄｂｅｔ ｔｅｒ（１９９３）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１：１９１−２１２ ）。ＣＤ２８は、９５％のＣＤ４⁺Ｔ細胞（Ｂ細胞抗体産生のヘルパー機能を果 たす）及び５０％のＣＤ８⁺Ｔ細胞（細胞障害性機能を有する）上で構成的に発 現されている（Ｙａｍａｄａら（１９８５）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５：１１６４−１１６８）。抗原刺激またはｉｎ ｖｉｔｒｏのマイトジェン 刺激の後、高レベルの表面ＣＤ２８の誘発及びいくつかの免疫調節サイトカイン の産生が生じる。これらの免疫調節サイトカインとしては、Ｔ細胞の細胞周期の 進行に必要なインターロイキン−２（ＩＬ−２）、多様な抗ウイルス効果及び抗 腫瘍効果を示すインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）、好中球及びリンパ球の 強力な走化性因子として知られたインターロイキン−８（ＩＬ−８）がある。こ れらのサイトカインがＴ細胞活性化のＣＤ２８経路によって調節されることが証 明された（Ｆｒａｓｅｒら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：３１３−３１ ６、Ｓｅｄｅｒら（１９９４）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７９：２９９−３０４、 Ｗｅｃｈｓｌｅｒら（１９９４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５３：２５１５−２５ ２３）。ＩＬ−２、ＩＦＮγ及びＩＬ−８は、広範囲の免疫応答の促進に必須で あり、多くのＴ細胞仲介疾患の状態で超発現していることが判明している。 乾癬の場合には、活性化した病変性Ｔ細胞がＩＬ−２及びＩＦＮγのようなＴ ｈ１サイトカインを主として放出する（Ｓｃｈｌａａｋら（１９９４）Ｊ Ｉｎ ｖｅｓｔ Ｄｅｒｍ １０２：１４５−１４９）。分泌されたこれらのサイトカインは正常な角化細胞 を誘発し、乾癬病変で見られる表現型（ＨＬＡＤＲ⁺／ＩＣＡＭ−１⁺）と同じ表 現型を正常な角化細胞に発現させる（Ｂａａｄｓｇａａｒｄら（１９９０）Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍ ９５：２７５−２８２）。またＩＬ−８は、ｉｎ ｖ ｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのプロ炎症特性を有しており、且つ、活性化Ｔ細胞 と乾癬病巣の角化細胞との双方によって大量に分泌されるので、角化細胞の過増 殖のような乾癬皮膚に見られる病理変化の主要な原因になると考えられている。 更に、Ｂ７ファミリーレセプター（活性化ＡＰＣで見出されるＣＤ２８の天然リ ガンド）の１つであるＢＢ１は、乾癬に罹った皮膚の角化細胞中で発現している が健康な皮膚の角化細胞中では検出されないことが判明した（Ｎｉｃｋｏｌｏｆ ｆら（１９９３）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １４２：１０２９−１０４０ ）。このことは、疾病の発生病理にＴ細胞活性化が重要であることを裏付ける。 アレルギー性接触皮膚炎及び肥厚性扁平苔癬のような他のＴ細胞仲介皮膚疾患 では、大多数の皮膚及び上皮のＣＤ３⁺Ｔ細胞中でＣＤ２８が高レベルで発現し ているが、健康な皮膚及び基 底細胞腫（非Ｔ細胞性皮膚疾患）中ではＣＤ２８は血管周囲のＴ細胞中でのみ発 現している。アレルギー性接触皮膚炎及び肥厚性扁平苔癬の双方ではまた、Ｂ７ 発現が皮膚の樹状細胞、皮膚のＡＰＣ及び角化細胞で観察されるが、健康な皮膚 及び基底細胞腫では観察されない（Ｓｉｍｏｎら（１９９４）Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍ １０３：５３９−５４３）。従って、これは、ＣＤ２８／Ｂ７経路 がＴ細胞仲介皮膚疾患の重要なメディエーターであることを示唆する。 自己寛容の喪失を原因とするいくつかの自己免疫疾患を伴うＴ細胞の異常な活 性化の主な特徴は、ＣＤ２８⁺Ｔ細胞の存在とそのリガンドＢ７の活性化された 免疫担当ＡＰＣ（単球、マクロファージまたは樹状細胞）上の発現である。この ような疾患の例は、自己免疫性グレイブ甲状腺炎（Ｇａｒｃｉａ−Ｃｏｚａｒら （１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａ １２ ３２）、サルコイド症（Ｖａｎｄ ｅｎｂｅｒｇｈｅら（１９９３）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５：３１７−３２１ ）、リウマチ様関節炎（Ｖｅｒｗｉｌｇｈｅｎら（１９９４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ ｌ １５３：１３７８−１３８５）及び全身性エリテマトーデス（Ｓｆｉｋａｋ ｉｓら（１９９４）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９６：８−１４） である。移植された細胞及び器官の拒絶がＴ細胞の正常な活性化によって仲介さ れる場合には、Ｔ細胞レセプター結合が生じているときに、例えばドナー組織上 の外来抗原に対して適正なアロジェネイック応答を生じさせるＣＤ２８と適正Ｂ ７リガンドとの結合が生じていなければならない（Ａｚｕｍａら（１９９２）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７５：３５３−３６０、Ｔｕｒｋａら（１９９２）Ｐｒｏ ｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１１１０２−１１１０５）。 自己免疫疾患の伝統的な治療方法では、Ｔ細胞活性化、即ち、自己抗原に対す る自己反応性免疫応答のエフェクター段階を阻止しない。現状では、ステロイド 及び非ステロイド系の抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）のような薬剤が症状を軽減する ために使用されているが、これらの薬剤は病気の進行を阻止できない。更に、ス テロイドは、骨粗鬆症、器官毒性及び糖尿病の誘発などの副作用を生じ、また、 軟骨変性プロセスを促進したり２〜８時間程度のいわゆる注射後フレアを生じた りする。ＮＳＡＩＤＳは、胃腸にも副作用があり、また、顆粒球減少症及び医原 性肝炎の危険も増す。 特に病気の進行した時期には、別の形態の治療方法として免 疫抑制剤も使用される。しかしながらこれらの薬剤は、免疫系全体を抑制し、高 血圧及び腎毒性のような重大な副作用をしばしば生じる。また、シクロスポリン 及びＦＫ５０６のような確定された免疫抑制剤はＣＤ２８依存性Ｔ細胞活性化経 路を阻害することができない（Ｊｕｎｅら（１９８７）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉ ｏｌ ７：４４７２−４４８１）。 現在使用されているＴ細胞活性化に影響を及ぼす物質は、合成ペプチド、モノ クローナル抗体及び可溶化形態のＴ細胞活性化分子である。ＣＤ２８、ＣＤ４０ Ｌ及びＣＡＭファミリーの接着分子のようなＴ細胞活性化分子に競合的な合成ペ プチドが今日まで同定されたことはない。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、乾 癬のようなＴ細胞仲介疾患に対する治療効果（抗ＣＤ４（Ｐｒｉｎｚら（１９９ ４）Ｌａｎｃｅｔ ３３８：３２０−３２１））、及び、同種移植片中の正常な Ｔ細胞活性化に対する免疫抑制効果（抗ＶＣＡＭ−１及びＶＬＡ−４（Ｉｓｏｂ ｅら（１９９４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５３：５８１０−５８１８））を発揮 し得ることを示した。しかしながら、治療の長期化に伴って、宿主動物体内でモ ノクローナル抗体に対する抗体が産生され、モノクローナル抗体の有効性が低下 する。これらのモノ クローナル抗体に対する誘発免疫応答の危険性を見掛けの上で低減する“ヒト化 ”モノクローナル抗体が開発されている。しかしながら、これらのモノクローナ ル抗体はいまだ開発途上であり、更に、これらの新しいモノクローナル抗体は依 然として大きいタンパク質であり、そのためターゲット部位に到着するのが難し い。ヒトＩｇ Ｃγ鎖に融合したヒトＣＴＬＡ−４遺伝子（配列的にＣＤ２８に 近縁）の細胞外ドメインを含むＣＴＬＡ−４ＩｇのようなＴ細胞活性化分子の可 溶化形態が開発されている。ＣＴＬＡ−４Ｉｇは、ラットのゼノジェネイック（ Ｌｅｎｓｃｈｏｗら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７７８９−７９２）及び アロジェネイック（Ｔｕｒｋａら（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓ ｃｉ ＵＳＡ ８９：１１１０２−１１１０５）な心臓同種移植片の拒絶を防止 することによってＴ細胞の正常な活性化を特異的にブロックすることを示し、ま た、ラットの自己免疫性糸球体腎炎中で見出されるようなＴ細胞の異常な活性化 に治療効果を有することを示した（Ｎｉｓｈｉｋａｗａら（１９９４）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２４：１２４９−１２５４）。しかしながら、可溶性ＣＴ ＬＡ−４Ｉｇはモノクローナル抗体と同様の制約を有しており、更 に、製造コストも高い。また、このＣＤ２８様分子の真の機能は未知であり、治 療効果が評価可能になるためにはその機能を完全に決定する必要がある。 ＣＤ２８の細胞表面発現の阻害は、活性化Ｔ細胞の長期の非反応性及び欠失を 導く。不活性化により、Ｔ細胞の増殖は阻止され、インターロイキン−２、イン ターフェロン−ガンマ及びインターロイキン−８のような特異的免疫調節サイト カインのＴ細胞特異的産生が阻害される。 ＣＤ２８遺伝子の発現の調節は、アンチセンス及び三重鎖形成オリゴヌクレオ チドを使用し、オリゴデオキシ−リボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチ ドをＣＤ２８遺伝子またはプロモーター領域の内部のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に ハイブリダイズさせることによって得られる（ＣＤ２８ Ｔａｍ特許）。オリゴ ヌクレオチドは、Ｔ細胞の正常及び異常な活性化の効果をブロックするために使 用される常用の物質の多くの欠点を防止する。しかしながら、アンチセンス戦略 用に設計されたこれらのオリゴは、細胞内ヌクレアーゼまたは細胞外媒質に存在 するヌクレアーゼによって分解され易い。 タンパク質に対するＤＮＡ（またはＲＮＡ）の結合は、遺伝 子の転写を調節する基本的経路であることがこれまでに判明していた。これらの 調節タンパク質または転写因子は、特異的二次構造をもつＤＮＡ配列を認識し、 その後の相互作用によって遺伝子発現の正または負の調節を導く。アプタマーは 、特定のタンパク質に特異的に結合し得る短いオリゴヌクレオチド配列である。 異なるアプタマー配列は異なるタンパク質に特異的に結合し得ることが証明され た。例えば配列ＧＧＮＮＧＧ〔Ｎ＝グアノシン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデノ シン（Ａ）またはチミジン（Ｔ）を表す〕はトロンビンに特異的に結合する（Ｂ ｏｃｋら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５５：５６４−５６６、及び、Ｔｏｏｌ ｅらの特許第５５８２９８１号（１９９６））。 しかしながら、上のＤＮＡ結合部位における転写因子として知られた調節タン パク質との競合的阻害物質として機能し得るアプタマー配列が記載されたことは ない。転写因子は、遺伝子の５’上流プロモーター領域の特異的調節配列に一次 的に結合することによって遺伝子を調節するタンパク質のクラスである。この相 互作用が転写の開始を導く。Ｓｐ１、ＡＰ２、ＡＰ−１、ＥＧＲ−１及びＮＦκ Ｂのようないくつかの転写因子が、Ｔリンパ球及びＢリンパ球の活性化に必須で ある(Ｓｋｅｒｋａら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：２２５００−２２５０６，Ｊｕｎｇら（１９ ９５）Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７６６：２４５−２５２)。いくつ かの場合には、共刺激により開始されるシグナルによってこれらの転写因子が誘 発される（Ｊｕｎｇら(１９９５)Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ｓｃｉ ７６６：２４５−２ ５２）。従って、特異的ＤＮＡ結合部位とタンパク質との相互作用を妨害しその 結果として補助刺激経路を含むいくつかの免疫経路を抑制し得る物質及び方法の 開発が依然として要望されている。発明の概要 本発明によれば、ＣＤ２８のような補助刺激分子並びにＩＬ−２及びＧＭＣＳ Ｆのようなサイトカインをコードする遺伝子を調節するＳｐ１タンパク質及びＳ ｐ１近縁タンパク質のようなタンパク質のＤＮＡ結合部位に特異的に結合するよ うに設計されたアプタマーオリゴヌクレオチドが提供される。 好ましい実施態様においては、オリゴヌクレオチドは、Ｓｐ１タンパク質及び Ｓｐ１近縁タンパク質のような特異的調節タンパク質に結合するように設計され 、調節下にある遺伝子のプロモーター領域にこれらの転写因子と競合的に結合す るように設計されている。これは、遺伝子の転写を阻止することによっ て遺伝子発現を調節する機能を果たす。従って、アプタマーオリゴヌクレオチド はまた、ＲＮＡまたはＤＮＡの機能、即ち、そのタンパク質への翻訳、その細胞 質へのトランスロケーションまたはその総合的生物機能に必要な他の何らかの活 性を阻害することができる。ＲＮＡまたはＤＮＡがその機能の全部または一部を 発揮できないとき、その結果としてＴ細胞活性化を調節するゲノムの一部分の適 正な発現に欠陥が生じ、上記のような代謝の調節が生じる。 Ｔ細胞活性化を調節できる分子を特異的に調節する調節タンパク質とＤＮＡ結 合部位において競合するように、囮であるアプタマー核酸をターゲッティングさ せるのが好ましい。ＣＤ２８タンパク質はこの方法に特に有用であることが知見 された。ＣＤ２８遺伝子及びＣＤ２８関連遺伝子の発現を阻害することは、乾癬 及び他の皮膚病、Ｔ細胞の異常な活性化に伴う症候群、自己免疫疾患及び同種移 植片拒絶の治療に有用であると期待される。 Ｔ細胞活性化を調節することが判っている調節下のタンパク質の発現を阻害す るなどのように、調節タンパク質とＤＮＡ結合部位において競合するオリゴヌク レオチドを患者に接触させ ることから成るＴ細胞活性化の調節方法が提供される。ＣＤ２８遺伝子及びＣＤ ２８関連遺伝子の転写を調節するＳｐ１タンパク質及びＳｐ１関連タンパク質の ようなタンパク質に結合するオリゴヌクレオチドが好ましい。 本発明の別の特徴によれば、アプタマーは、乾癬、ＡＩＤＳによって悪化した 乾癬及び他の皮膚病、Ｉ型（インスリン依存性）真性糖尿病、甲状腺炎、サルコ イド症、多発性硬化症、自己免疫性ブドウ膜炎、リウマチ様関節炎、全身性エリ テマトーデス、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎）、敗血症性ショッ ク、腫瘍誘発性悪液質及び再生不能性貧血のようなＴ細胞の異常な活性化が関与 する疾病を治療するため、及び、同種移植片拒絶のような場合にＴ細胞の正常な 活性化を調節するために投与される。これは、ＣＤ２８分子及びＣＤ２８関連分 子などのＴ細胞活性化分子の合成及び発現を撹乱することによって達成できる。 本発明の更に別の特徴によれば、Ｓｐ１タンパク質及びＳｐ１関連タンパク質 のような特異的調節タンパク質に結合でき、従って、（ａ）これらのタンパク質 によって正常に調節され及び（ｂ）Ｔ細胞応答を調節するＣＤ２８タンパク質及 びＣＤ２８ 関連タンパク質のような遺伝子の転写を阻害できるアプタマーが提供される。図面の簡単な説明 図１Ａ及び図１Ｂは、それぞれ細胞外流体中及びジャーカット細胞中の³²Ｐ標 識ホスホロチオエート、ＩＣＮ１６０６４（配列４）のｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性 を表すグラフである。図１Ｃ及び図１Ｄは、それぞれ細胞外流本中及びジャーカ ット細胞中の³²Ｐ標識ホスホロチオエート、ＩＣＮ１６２１４（配列２１）のｉ ｎ ｖｉｔｒｏ安定性を表すグラフである。 図１Ｅ及び図１Ｆは、２０％ポリアクリルアミド変性ゲルで電気泳動させ次い でＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを用いて可視化することによって評価したオリ ゴヌクレオチド、ＩＣＮ１６０６４（配列４）及びＩＣＮ１６２１４（配列２１ ）(２，０００ｃｐｍ)の各々の時間依存性（０−９６時間）分解を表すグラフで ある。Ｎｉｃｋｓｐｉｎカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用し、１０，０００ ｃｐｍの細胞外（図１Ｅ）及び細胞（１Ｆ）の溶出液中に各時点で残存していた 無傷の全長³²Ｐ−ＲＴ０３Ｓ（○）及び³²Ｐ−ＲＴＣＯ６Ｓ（●）を時点ｔ＝０ に対するパーセンテージとして測定した。分子量標準（Ｓｔｄ）、³²Ｐ− ｄＮＴＰ（Ｎ）及び遊離³²Ｐ−オルトホスフェート（Ｐ）を同時に分析した。 図２は、ゲルシフト分析を表すグラフであり、Ｇ（グアニジン）富化１２量体 配列モチーフを含むオリゴヌクレオチド（レーン５及び１１）が、ＨｅＬａ核抽 出物とのインキュベーション後に、他のホスホロチオエートオリゴヌクレオチド で観察されたバンドＢとは異なる電気泳動シフトをもつバンドＡを生じることを 示す。 図３は、ＣＤ２８プロモーター領域（残基−１９７〜＋２８）に由来する２２ ６ｂｐのインサート（２８ｂ）または残基−５１〜−２２が表１の配列３で置換 された突然変異体（２８ｈ−１）をＣＡＴリポーター遺伝子の上流に含むプラス ミドベクターをジャーカット細胞にトランスフェクションし、次いでホスホロチ オエートオリゴヌクレオチド、ＩＣＮ１６０６４及びＩＣＮ１６４８１、で処理 するかまたは処理しないときのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー ゼ（ＣＡＴ）の発現を表すグラフである。 図４は、２８ｂ、即ちＣＤ２８遺伝子の上流領域−１９７〜＋２８に対するＳ ｐ１の結合が特異的であることを示すゲルス ーパーシフトアッセイを表すグラフである。 図５は、３２Ｐ標識二重鎖オリゴ２８ｂ（親２８ｂ、表１の配列１に由来）に 対するＳｐ１の結合と、コールド二重鎖オリゴ２８ｂと図１Ａ及び１６４８１の アプタマーオリゴとの競合的結合とを表すグラフである。特定実施態様の詳細な説明 Ｓｐ１タンパク質及びＳｐ１関連タンパク質のような調節タンパク質のＤＮＡ 結合部位に特異的に結合するアプタマーオリゴヌクレオチドは、対象遺伝子のプ ロモーター領域の特異的二重鎖ＤＮＡ領域に調節タンパク質が結合することを阻 止するであろう。アプタマーによる競合的結合は、遺伝子の転写を妨害し、従っ て遺伝情報がＤＮＡからタンパク質に伝達されることを阻止するであろう。オリ ゴヌクレオチドはターゲット特異的という特性を有しており、この特性によって 多目的性になり得る。オリゴヌクレオチドは４つのモノマー単位から成る長い鎖 であるため、任意のターゲットＲＮＡ配列に応じて容易に合成できる。 オリゴヌクレオチドに仲介される遺伝子発現の阻害は、多くのモデル及びｉｎ ｖｉｔｒｏ系において証明されており、ヒ トの多くの疾病の新しい治療戦略としてその治療能力が期待されている（Ｕｈｌ ｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ（１９９０）Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ ９０：５４４ −５８４；Ｚｏｎ ａｎｄ Ｓｔｅｃ（１９９１）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉ ｄｅｓ ａｎｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａ ｃｈ：８７−１０８；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０：１８ ７４−１８８０；Ｏｒｓｏｎら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９：３４３５−３４４１，Ｈｅｌｅｎｅ ａｎｄ Ｔｏｕｌｍｅ（１９９０ ）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １０４９：９９−１２５；Ｔｈ ｉｅｒｒｙ ａｎｄ Ｄｒｉｔｓｃｈｉｌｏ（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ ｉｄ Ｒｅｓ ２０：５６９１−５６９８）。最近では、細胞内摂取の増進を示 すホスホロチオエート（Ｚｏｎ ａｎｄ Ｓｔｅｃ（１９９１）Ｏｌｉｇｏｎｕ ｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ：８７−１０８）及びホスホロチオエート−３’ヒドロキシプ ロピルアミン（Ｔａｍら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ２２ ：９７７−９８６）のようなヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドの合成が進歩 したので、オリゴヌクレオチド を新しい形態の治療薬として使用することが考察されている。調節タンパク質結 合部位をターゲッティングするアプタマーオリゴヌクレオチドは、核酸を主体と する化合物の代替クラスを表し、従来技術の方法で遭遇した問題に理想的な解決 を与える。アプタマーオリゴヌクレオチドは、特異的遺伝子発現の調節に直接関 与し、その結果としてターゲットタンパク質発現をスイッチオフするが、レセプ ター−リガンド相互作用の結合メカニズム及び親和性の完全な理解を必要とする ようなターゲットタンパク質に対する可溶性レセプターの競合的阻害には関与し ない。オリゴヌクレオチドは小さい分子であり、従って、大きい分子から成る阻 害物質で生じるような立体上の問題は生じない。ターゲットの説明 本文中で考察されるターゲットは、免疫応答の開始または維持において重要な 役割を果たす転写因子によって調節され得る分子である。これらの分子としては 、ＣＤ２８のような共刺激分子並びにＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮγのよ うなサイトカインがある。 治療薬については、ＣＤ２８分子またはＣＤ２８関連分子のような共刺激分子 の発現を低下させることによって治療できる 疾病に罹患している疑いのある動物が本発明のオリゴヌクレオチドの投与によっ て治療できる。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに加えて、担体、増 粘剤、希釈剤、バッファ、防腐剤、界面活性剤、リポソームまたは脂質成分など を含有する医薬組成物の形態に製剤化できる。医薬組成物はまた、オリゴヌクレ オチドに加えて、抗菌薬、抗炎症薬、麻酔薬などの１種または複数の有効成分を 含有し得る。 医薬組成物は、局部的治療もしくは全身的治療のいずれが望ましいかに従って 、また、治療すべき領域に依存して、種々の方法で投与され得る。外用投与（眼 内、膣内、直腸内、鼻孔内など）、吸入による経口投与、または、静脈内点滴、 皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射のような非経口投与が可能である。 外用投与に好適な製剤形態は、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、 液滴剤、坐薬剤、スプレー剤、液剤及び散剤などである。慣用の医薬用担体、水 性、粉末状または油状の基剤、増粘剤なども所要または所望であろう。坐薬剤を 塗布したコンドームまたはグローブも有用であろう。 経口投与に好適な組成物としては粉末または顆粒、水または非水性媒体中の懸 濁液または溶液、カプセル、小袋または錠剤 がある。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤の使用が望ま しい。 非経口投与に好適な製剤の形態としては、バッファ、リポソーム希釈剤及び他 の適当な添加剤を含有し得る無菌水溶液の形態がある。 投与用量は、治療すべき障害の重篤度及び反応性に依存するが、通常は数日か ら数カ月の治療計画に従ってまたは治癒に成功するかもしくは病状の軽減が得ら れるまで毎日１回から数回の投与を行う。最適投与用量、投与方法及び反復投与 の程度は当業者が容易に決定できよう。 好ましい全身投与では、アプタマーを５ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回静脈内投 与する。好ましい外用投与では、アプタマーを１〜５％溶液として１日１回投与 する。肺に投与する場合には好ましくは、アプタマーを５ｍｇのエアゾールとし て１日１回投与する。 本発明は、Ｔ細胞活性化を調節し得るタンパク質に対応するＲＮＡ及びＤＮＡ の機能を阻害するためにアプタマーオリゴヌクレオチドを使用する。本文中に使 用した“オリゴヌクレオチド”なる用語は、リボ核酸またはデオキシリボ核酸の オリゴマ ーまたはポリマーを意味する。この用語は、天然に産生する塩基、糖及び糖間（ 主鎖）結合から成るオリゴマー、並びに、同様に機能する天然に産生しない部分 をもつオリゴマー、などのオリゴマーを包含する。このような修飾または置換さ れたオリゴヌクレオチドはしばしば、細胞内摂取の増進及びヌクレアーセの存在 下の安定性強化などの特性を有するので天然型形態よりも好ましい。 本発明のオリゴヌクレオチドは好ましくは、約３〜約５０個の核酸塩基ユニッ トを含む。より好ましくはこのようなオリゴヌクレオチドは約８〜約３０個の核 酸塩基ユニットを含み、更に好ましくは約１２〜約２２個の核酸塩基ユニットを 含む。核酸塩基ユニットは、ホスホジエステル結合または他の結合を介して隣接 核酸塩基ユニットに適正に結合された塩基−糖の組合せであることは理解されよ う。 本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、公知の固相合成技術によっ て常套的な手段で好都合に作製し得る。このような合成のための装置は、Ａｐｐ ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのような複数の販売業者が販している。このよ うに他の任意の手段も合成に使用できるが、オリゴヌクレオチドの実際の合成は 当業者の通常の知識の範囲内である。また、ホスホロチオエート及び３’アミン −ホスホロチオエートのような他のオリゴヌクレオチドを調製するために同様の 技術を使用することもよく知られている。 本発明によれば、転写を開始させるＤＮＡの読み取り枠（ＯＲＦ）によって特 定されたメッセンジャーＲＮＡが、ＤＮＡのＯＲＦからの情報だけでなく、５’ 非翻訳領域、３’非翻訳領域及び介在配列のリボヌクレオチドのような当業者に 公知の領域を形成する結合リボヌクレオチドを含むことは、通常の知識をもつ当 業者には理解されよう。従って、これらの結合リボヌクレオチド及び情報性リボ ヌクレオチドに全面的にまたは部分的にターゲットされるオリゴヌクレオチドを 本発明によって作製し得る。好ましい実施態様では、アプタマーオリゴヌクレオ チドは、Ｓｐ１タンパク質及びＳｐ１関連タンパク質のような調節タンパク質と ＤＮＡ結合部位において相互作用し、この相互作用によって、Ｔ細胞活性化に関 与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を遮断する。好ましい実施態様では 、これらの調節されるべきタンパク質は、ＣＤ２８及びＣＤ２８分子の相同タン パク質をすべて包含する。ＧＧＧＧ、ＧＮＧＧ、ＧＧＮＧ〔Ｎ ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＴ］のような少なくとも３個のグアノシン（Ｇ）残基を 含む４つのヌクレオチドから成る領域として定義される富Ｇ領域を少なくとも２ つ含む配列から成るオリゴヌクレオチドが好ましい。このような２つの富Ｇ領域 が最大で６個の残基、好ましくは４個またはそれ以下の残基によって隔てられた オリゴヌクレオチドが本発明に有用である。全体としてまたは部分として使用し 得る好ましい配列セグメントを以下に示す： 正しい配列であると考えて上記の配列を示したが、もしも誤りがある場合には 、正しい配列が本発明の目的であることを理解されたい。本発明に有用なオリゴ ヌクレオチドは、これらの配列の１つまたはその一部から成る。従って、上記の オリゴヌクレオチドのいずれか、または、ＣＤ２８分子及びＣＤ２８関 連分子を含むＴ細胞活性化分子の合成を調節するための好ましいオリゴヌクレオ チドターゲットに関する知識から平均的な当業者が容易に作製できる同様のオリ ゴヌクレオチドのいずれかを使用するのが好ましい。ＣＤ２８及び／またはＣＤ ２８相同タンパク質の産生の阻害または調節は疾病の治療において有意な治療効 果を発揮すると期待されている。組成物の有効性を評価するために、１つのアッ セイまたは一連のアッセイが必要である。実施例 オリゴヌクレオチド 標準ホスホラミジット化学法を用い、全自動ＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌ ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｍｏｄｅｌ ３９４）でオリゴデオキシヌクレ オチドを合成した。β−シアノエチルホスホラミジット、合成試薬及びＣＰＧポ リスチレンカラムは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ，Ｆｏｓ ｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から購入した。３’−アミノ−修飾因子Ｃ３、ＣＰＧ カラムはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）から購入した 。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの場合は、標準酸化ボトルをテトラエ チ ルチウラムジスルフィド／アセトニトリルで置換し、ホスホロチオエート結合の 段階的付加のために標準ＡＢＩホスホロチオエートプログラムを使用した。規制 ポアガラスカラムから開裂後、オリゴヌクレオチドを濃縮水酸化アンモニウムで ５５℃で８時間処理することによって保護基を除去した。逆相セミプレップＣ８ カラム（ＡＢＩ）を用いたＨＰＬＣによってオリゴヌクレオチドを精製した。Ｄ ＭＴ保護基を開裂し、８０％酢酸で処理し、エタノール沈殿させた後、分析用Ｃ １８カラム（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いたＨＰＬＣに よって生成物の純度を評価した。９０％を上回る純度のオリゴヌクレオチド全部 を凍結乾固した。オリゴヌクレオチドを無菌脱イオン水（ＩＣＮ，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ）で復元し、ＯＤ２６０ｎｍの評価後に４００μＭに調節し、アリコー トに分け、実験に使用するまで−２０℃で保存した。全ての場合について、表１ に示した各オリゴヌクレオチドの少なくとも３つのバッチを使用した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏオリゴヌクレオチド安定性試験 従来技術に記載の手順（Ｔａｍら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒ ｅｓ ２２：９７７−９８６）でオリゴヌクレオ チドの時間的安定性分析を行った。オリゴヌクレオチドの分解プロフィルを電気 泳動によって評価し、Ｎｉｃｋｓｐｉｎカラムを用いて定量した。細胞系及びＴ細胞精製 健康なドナーの６０ｍｌの血液をフィコール−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心し て得られたバッフィコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。次に、 ＬｙｍｐｈｏｋｗｉｋのＴ細胞特異的リンパ球単離試薬（ＬＫ−２５Ｔ，Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ，Ｃａｎｏｇａ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いてＰＢＭＣからＴ細胞 を精製した。平均収量４０〜６０×１０⁶のＴ細胞を次に、２０〜３０ｍｌのＲ ＰＭＩ−ＡＰ５（２０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファｐＨ７．４、５％の自己血漿、 １％のＬ−グルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び０．０５％ の２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（ＩＣＮ，Ｃｏｓｔ ａ Ｍｅｓａ，ＣＡ））中で３７℃で一夜インキュベートして、夾雑付着細胞を 完全に除去した。全部の実験で、Ｔ細胞をＲＰＭＩ−ＡＰ５で洗浄し、次いで９ ６ウェルのマイクロタイタープレートに細胞濃度２〜３×１０⁶細胞／ｍｌで平 板培養した。 Ｔ細胞リンパ腫細胞系、ジャーカットＥ６−１（ＣＤ２８⁺／ＣＤ４⁺）細胞（ １５２−ＴＩＢ）をＲＰＭＩ−１０（２０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファｐＨ７．４ 、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１ ％のＬ−グルタミン及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ −１６４０培地）中に維持した。マイトジェン誘発Ｔ細胞活性化及びオリゴヌクレオチド処理 ヒト末梢Ｔ細胞またはＴ細胞リンパ腫細胞系（０．２〜０．３×１０⁶）の添 加に先立って、重複９６ウェルのマイクロタイタープレートを、精製した抗ＣＤ ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（６．２５〜２００ｎｇ／ウェル）（クローン ＨＩＴ ３ａ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）でプレコート し、低温の燐酸塩緩衝生理食塩水ｐＨ７．４（ＰＢＳ）で２回洗浄した。抗ＣＤ ３ ｍＡｂで処理したＴ細胞を更に、２ｎｇのホルボール１２−ミリステート１ ３−アセテート（ＰＭＡ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ） の添加によって活性化し、３７℃で４８時間インキュベートした。抗−ＣＤ３／ ＰＭＡで活性化したＴ細胞を、活性化直後に１〜２０μＭのＣＤ２８特異的オリ ゴヌクレオチド及び対照オリゴヌクレオチ ドで処理し、２４時間後に再処理した。重複する一方のマイクロプレートのＴ細 胞を免疫蛍光分析に使用し、１Ａをサイトカイン試験に使用し、第二のプレート をＴ細胞増殖分析に使用した。免疫蛍光試験 活性化の後、重複する第一のマイクロプレートから得られた１５０μｌの細胞 上清を、細胞由来のサイトカイン産生を分析するために別のマイクロプレートに 移した。残りの細胞を等張生理食塩水溶液ｐＨ７．４（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋ ｉｎｓｏｎ，Ｍａｎｓｆｉｅ１ｄ，ＭＡ）で２回洗浄し、５０μｌの等張生理食 塩水溶液に再浮遊させ、２つのサンプルに分割した。１つのサンプルアリコート をＰＥ−ＣＤ２８／ＦＩＴＣ−ＣＤ４ｍＡｂで同時染色し、第二のアリコートを ＰＥ／ＦＩＴＣ標識したアイソタイプ適合の対照モノクローナル抗本で染色する ことによって非特異的蛍光を評価した。蛍光標識モノクローナル抗体はいずれも Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）から入手した。飽 和濃度のｍＡｂを用いて、暗中、４℃でインキュベーションを４５分間行った。 取込まれなかったラベルをＰＢＳ洗浄によって除去した後、ＦＡＣＳｃａｎ フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。ゲー トされた（ｇａｔｅｄ）生存細胞中で抗原密度を間接測定し、平均蛍光チャンネ ル（ＭＣＦ）として表した。ＣＤ２８ ｍＡｂで染色した細胞のＣＤ４⁺サブセ ットの表面発現は、ＣＤ２８^-ＣＤ４^-細胞のＭＣＦからＣＤ２８⁺ＣＤ４⁺のＭＣ Ｆを減算することによって決定した。多数ドナーにおける全部のオリゴヌクレオ チドの各バッチ中の非処理対照細胞及びオリゴヌクレオチド処理細胞の生存率を 、生体色素ヨウ化プロピジウム（５μｇ／ｍｌの最終濃度）で染色することによ って測定した。ヨウ化プロピジウムを排除した生存細胞のパーセンテージをフロ ーサイトメトリーによって測定すると、全てのオリゴヌクレオチドについて１〜 ２０μＭの範囲の用量でオリゴヌクレオチドを使用した全部のバッチで、処理後 に９０％を上回る値（９０〜９９％の範囲）が得られた。サイトカイン分析 細胞由来のヒトのサイトカインの濃度を重複する第一のマイクロプレートの細 胞上清中で測定した。マイトジェン誘発によるインターロイキン−２（ＩＬ−２ ）のレベル変化を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ ＆ ＤシステムＱｕａｎｔｉ ｋｉｎｅ キット、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて測定した。全部のＥＬＩＳＡ の結果をｐｇ／ｍｌで表した。電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ） Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを製造業者のプロトコル（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）通りに用い、試験オリゴヌクレオチドの５ ’端を〔γ−³²Ｐ〕−ＡＴＰ（ＩＣＮ，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）で標識し た。１０μｇのＨｅＬａ細胞核抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ）を約８０，０００ｃｐ ｍの標識オリゴヌクレオチドと共に室温で２０分間インキュベートした。結合反 応混合物は、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＮａＣｌ、 ０．５ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、４％のグリ セロール及び０．５μｇのポリ（ｄＩ．ｄＣ）を含んでいた。ＤＮＡ−タンパク 質複合体を、０．５×ＴＢＥバッファ（５０ｍＭのトリス、４５ｍＭのホウ酸、 ０．５ｍＭのＥＤＴＡ）を含む４％のポリアクリルアミドゲルで１００Ｖで約３ 時間電気泳動させた。ゲルを乾燥し、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒ（Ｂｉｏｒ ａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を使用してオートラジオグラフィー処理した。ＤＮアーゼのフットプリントアッセイ及びゲルシフトアッセイのためのｃＤＮＡ の調製 ＤＮアーゼのフットプリントアッセイ及びゲルシフトアッセイにおいてタンパ ク質−ＤＮＡ結合に使用したｃＤＮＡ（約３００塩基対）は、プラスミドｐＣＡ Ｔ３ｅ ２８ｂ、ｐＣＡＴ３ｅ２８ｈまたはｐＣＡＴ３ｅ ２８ｈ−１から単離 した。６０μｇの各プラスミドをＢｇｌＩＩで消化し、先ず、一部の量を直鎖性 を検査するためにアガロースゲルに載せ、次に、残りの量をフェノール／ｓｅｖ ａｇ抽出し、エタノール沈殿させ、次いで水に再浮遊させてＳａｃＩで消化した 。少量を再度ゲルに載せ、切断された否かを検査した。（４ｋｂのバンド及び３ ００ｂ．ｐ．のバンドの２つのバンドが出現する筈である）。残りの量をフェノ ール／ｓｅｖａｇ抽出し、エタノール沈殿させた。次に脱リン酸化するために、 ＤＮＡペレットを少量の水（６２μｌ）に再懸濁させ、１μｌの２０Ｕ／μｌの アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉ ａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）及び７μｌの１０×反応バッファを添加した。反応混 合物を３７℃で１時間インキュベートした後、７μｌのｐＨ８．０の０．２Ｍの ＥＧＴＡを添加し、管全体を６５℃で１０分間加 熱した。総量７７μｌの脱リン酸化したＤＮＡを１％アガロースゲルに載せ、Ｑ ｉａｇｅｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）社製のＱｉａｑｕｉｃｋゲル 抽出キットを用いて３００ｂ．ｐ．のバンドを精製した。精製した３００ｂ．ｐ ．バンドの最終容量は７０μｌであり、その濃度を以下のごとく計算した。６０ μｇ×（３００ｂ．ｐ．／４３００ｂ．ｐ．）＝４．２μｇ。これらの全部の操 作後の回収率を５０％と仮定して２．１μｇ／７０μｌ＝３０ｎｇ／μｌ。³²Ｐ 末端標識反応（キナーゼ処理）の各々には、５μｌ〜７μｌの精製３００ｂ．ｐ ．ＤＮＡを使用した。ゲルシフトアッセイ用ポリアクリルアミドゲルの調製 ０．５×ＴＢＥ中の４％非変性ポリアクリルアミドゲル溶液をＰｒｏｍｅｇａ Ｇｅｌ Ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓの技術報告に従って調製し た（４％アクリルアミド、０．０５％ビスアクリルアミド、２．５％グリセロー ル、０．５×ＴＢＥ）。２５０ｍｌの上記ゲル溶液から成る予製液を調製し、濾 過し、４℃で保存した。毎回の使用では、毎回２５ｍｌの４％ゲル予製液に１２ ．５μｌのＴＥＭＥＤと１８７．５μｌの１０％過硫酸アンモニウムとを添加し 、１６．５ｃｍ×１６．５ｃｍ× ０．７５ｍｍのガラスプレートに注いだ。最適結果を得るたにどの場合にもゲル を一夜重合させた。サンプルを充填する前に、０．５×ＴＢＥバッファ中でゲル を３０分間前処理した。二重鎖オリゴヌクレオチドの形成及び精製 ここで使用した方法は、“逆平行ポリプリンホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドは、ラットα１（Ｉ）コラーゲン遺伝子プロモーターと共に安定な三重鎖 を形成し培養ラット線維芽細胞中の転写を阻害する（Ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕ ｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒｍ ｓｔａｂｌｅ ｔｒｉｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒａｔ α１（Ｉ） ｃｏｌｌａｇｅｎ ｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒ ｅｄ ｒａｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）”，Ｊａｃｏｂ Ｊｏｓｅｐｈら，Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ ．１１，２１８２−２１８８，に記載の方法である。互いに相補的な同量の一本 鎖を、０．２５ＭのＮａＣｌ中で８０℃で５分間加熱し、次いで室温までゆっく りと冷却した。アニールした二重鎖オリゴヌクレオチドを、６％非変性（２９： １）ポ リアクリルアミドゲルで電気泳動させて精製し、切り出し、“粉砕し浸漬させ” 、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎ ｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓに記載の方 法を用いてエタノール沈殿させた。各標識反応に約２０ｎｇの二重鎖オリゴを使 用した。ＤＮＡの末端³²Ｐ標識 １５０〜２００ｎｇの３００ｂ．ｐ．のｃＤＮＡまたは２０ｎｇの二重鎖オリ ゴを、１０μＣｉの〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰ（４，５００Ｃｉ／ミリモル，ＩＣＮ， Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）及び１０Ｕのキナーゼと１×キナーゼバッファ（双方とも Ｐｒｏｍｅｇａ社製）と共に１０μｌ容量で３７℃で１時間インキュベートし、 Ｃｅｎｔｒｉ Ｓｐｉｎ−１０カラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉ ｏｎ,Ａｄｅｌｐｈｉａ，ＮＪ）で精製した。約８０，０００〜１００，０００ ｃｐｍのキナーゼ化ＤＮＡを各ゲルシフト反応に使用した。ゲルシフトアッセイ タンパク質（核抽出物または精製転写因子）を、１×ゲルシフトバッファ（Ｐ ｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と共 に室温で５〜１０分間インキュベートした後、キナーゼ化したＤＮＡを添加し、 室温で更に２０〜３０分間インキュベートした。次に、前処理した４％非変性ゲ ルにサンプルを充填した。０．５×ＴＢＥ中で１００Ｖで約３〜４時間処理した 後、ゲルを２枚のＷｈａｔｍａｎペーパーで乾燥し、蛍リン光体映像装置（ｐｈ ｏｓｐｈｏｒ−ｉｍａｇｅｒ）で一夜露光した。抗体ゲルスーパーシフトアッセイ Ｓｐ１に対する抗体（クローン１Ｃ６，Ｓａｎｔａ ＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を精製Ｓｐ１（Ｐｒｏｍｅｇ ａ）と共に１時間プレインキュベートした後、³²Ｐ標識したｃＤＮＡまたはオリ ゴを添加した。競合的ゲルシフトアッセイ 約７０〜１００モル過剰の非標識オリゴヌクレオチド（一本鎖または二重鎖） をタンパク質と共に室温で約３０分間プレインキュベートした後、³²Ｐ標識した ＤＮＡを添加した。ｐＣＡＴ３ｅ ２８ｂ、ｐＣＡＴ３ｅ ２８ｈ、ｐＣＡＴ３ｅ２８ｈ−１の構築 ジャーカット全ＲＮＡを鋳型として用いたＲＴ ＰＣＲによってＣＤ２８の上流 のｃＤＮＡ（−１９７〜＋２８）を作製し た。このｃＤＮＡピースを先ず、ＴＡクローニングベクターＰＣＲ２．１（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。次に、同じ ｃＤＮＡをｐＣＡＴ３ｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＸｈｏＩ−ＳａｃＩ部位に挿入す ることによってサブクローニングした。ｐＣＡＴ３ｅ ２８ｈ及びｐＣＡＴ３ｅ ２８ｈ−１は、ｐＣＡＴ３ｅ ２８ｂ中の−５１〜−２２の配列が欠失し別の １５のヌクレオチドで置換されたｐＣＡＴ３ｅ ２８ｂの突然変異体である。トランスフェクション（一過性発現） トランスフェクションの１日前に、２つまたは３つのＴ１５０中でジャーカッ ト細胞を８０〜９０％の集密細胞から１：４または１：５希釈物として調製した 。トランスフェクションの直前に、全部の細胞を１つのフラスコにプールしてカ ウントした（約４０×１０⁴／ｍｌの濃度が必要）。１０個のトランスフェクシ ョン反応物を得るために１１×４×１０⁶の細胞を５０ｍｌの円錐管中で遠心し た。細胞を初期容量の半量のＰＢＳで１回洗浄し、次いで４４ｍｌの予め加温し た新しいジャーカット培地（９０％のＲＰＭＩ１６４０、１０％のＦＢＳ、１％ のＬ−グルタメート、１％のペニシリン／ストレプトマイシン） に再浮遊させ、最終濃度１×１０⁶／ｍｌとした。４ｍｌの細胞を６ウェルプレ ートの各ウェルにピペット注入した。２．５μｌの２ｍｇ／ｍｌのプラスミド（ ｐＣＡＴ３ｅシリーズ）を１．５ｍｌの管にピペット注入し、１４７．５μｌの ＲＰＭＩ１６４０培地（無血清、抗生物質非含有）を添加し、次いで２０μｌの Ｑｉａｇｅｎ社製のＳｕｐｅｒｆａｃｔ試薬をプラスミド／培地溶液に添加し、 ピペットで５回上下させて混合し、室温で５〜１０分間静置した。トランスフェ クション複合体を各ウェルの細胞に滴下し、プレートに穏やかな渦流を与えて混 合した。細胞を３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーターでインキュベートし、２４ 時間後にＣＡＴアッセイ用に採取した。トランスフェクション後にオリゴを添加 する場合には、４００μＭのオリゴを含む５０μｌの予製液を指定された時点（ トランスフェクションの１時間後）に細胞に添加し、細胞をインキユベーターに 戻した。ＣＡＴアッセイ ２４時間のインキュベーション後、細胞が残らないように細胞培地で十分にす すぎながら、ピペットによって各ウェルから１５ｍｌの円錐管に細胞を採集した 。細胞を２，０００ｒｐｍ で室温で５分間遠心した。培地をピペットで除去した。各細胞ペレットを２ｍｌ のＰＢＳで３回洗浄した（ＰＢＳを添加し、渦流させ、遠心し、培地をピペット で除去した）。ピペット先端でＰＢＳの最終洗浄液をできるだけ完全に除去した 。４００μｌの１×リポーター溶解バッファ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＣＡＴ酵素アッ セイシステム）を各細胞ピペットに添加し、１．５ｍｌの管に移した。細胞ペレ ットを溶解バッファ中で室温で３０分間インキュベートし、場合によっては渦流 させた。３０分間のインキュベーション後、これらの管を６０℃で１０分間加熱 し、次いで室温で１２，０００ｒｐｍで２分間遠心し、上清（溶解液）を新しい １．５ｍｌの管にピペットで注入した。各ＣＡＴアッセイ反応に、１００μｌの 溶解液を使用し、残量を−８０℃で凍結した。ＣＡＴアッセイの各々を以下のよ うに設定した。１８．５μｌの水と、１００μｌの溶解液、５μｌの５ｍｇ／ｍ ｌのｎ−ブチリルＣｏＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び１．５μｌの０．１μＣｉ／μ ｌのクロラムフェニコール−１４Ｃ（ＩＣＮ）とを、１．５ｍｌの管で混合し（ 総量１２５μｌ）、３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、３００μｌ のキシレン（ＩＣＮ）を各管に添加し、５秒間激しく渦流させ、室温で３ 分間全速で遠心し、２８０μｌの上相（キシレン相）をピペットで新しい管に移 した。１００μｌの０．２５ＭのトリスｐＨ８．０を２８０μｌのキシレン相に 添加し、渦流させ、上記同様に遠心した。２００μｌの上相をシンチレーション バイアルにピペットで移し、５ｍｌのシンチレーション流体を添加し、転倒によ って混合し、サンプルをシンチレーションカウンターでカウントした。ｉｎ ｖｉｔｒｏオリゴヌクレオチド安定性はホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドの生物活性を延長させる 。 ホスホロチオエートのヌクレオチド間結合によるオリゴの修飾はヌクレアーゼ 耐性を与え、従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性を１〜２時間から２４時間まで 延長させる（Ｓｔｅｉｎ，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１００４−１ ０１２）。ここでは、図１Ａの富Ｇオリゴ（配列４）が図１Ｂの非富Ｇホスホロ チオエート（配列２１）よりも大きいｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性を有していたこと を証明する。図１Ａの電気泳動図は、細胞外１Ａ（Ｓ）及び細胞１Ｂ（Ｌ）の双 方がジァーカット細胞との９６時間のインキュベーション後に図１Ｂ（配列２１ ）よりもかなり多くの完全形³²Ｐ−標識１Ａ（配列４）を残存させて いることをはっきりと示す。この観察はＮｉｃｋｓｐｉｎカラムのデータ（図１ Ｂ）に一致する。９６時間後に図１Ａ（配列４）から回収された完全形のオリゴ は５４％（Ｓ）及び５９％（Ｌ）であり、図１Ｂ（配列２１）では１０％（Ｓ） 及び３４％（Ｌ）であった。これらのデータは、図１Ａ（配列４）中の富Ｇ領域 が存在するだけでより大きいヌクレアーゼ耐性が与えられたことを示唆し、これ はこの特定オリゴが折畳まれた二次構造を形成する能力をもつことに関連すると 推測される。活性化ヒトＴ細胞中の機能性ＣＤ２８発現及びＣＤ２８特異的ＩＬ−２産生のア プタマーオリゴヌクレオチドによる阻害は特異的富Ｇモチーフに依存する 。 表１のホスホロチオエートオリゴヌクレオチド配列４〜２１（５μＭ）による ＣＤ２８の発現及びＣＤ２８特異的ＩＬ−２産生の相対的阻害を表２に示す。こ こでは、これらのアプタマーオリゴヌクレオチドの生物活性に対する正確な配列 要件を検討した。表２は、阻害活性が配列依存性であること、特に４つの塩基（ 配列５〜８）によって隔てられた２つのＧカルテットを含むモチーフの存在に依 存することを示す。これらのデータは、図１Ａ（配列４）のようなオリゴとその 推定ターゲットと の相互作用が、（アンセンス及び抑制遺伝子モデルについて見出されるような） 核酸：核酸ハイブリダイゼーション要件よりもオリゴ−タンパク質相互作用中で 見られるような正確なコンホメーション要件に依存することを示唆する。特異的１２量体配列モチーフを含むオリゴヌクレオチドは特異的タンパク質オリ ゴ複合体を形成する 。 図２は、ＨｅＬａ細胞抽出物と共にプレインキュベートした³²Ｐ標識オリゴヌ クレオチドの電気泳動移動度シフト分析を示す。表３に挙げたオリゴは、４つの ヌクレオチドによって隔てられた２組のＧテトラッドを含む１２量体のモチーフ を含有する２つのオリゴ〔図１Ａ（配列４）及びＩＣＮ１６４８１（配列５）〕 を含む。試験オリゴのうちで、このようなモチーフを含むオリゴ（レーン５及び １１）だけが、他のホスホロチオエートオリゴとは異なるオリゴ−タンパク質シ フト（バンドＡ）を生じた。これらのデータは、特異的タンパク質−オリゴ相互 作用が１２量体のモチーフを含有するオリゴによって生じることを示唆する。活性化ヒトＴ細胞中の機能性ＣＤ２８発現のアプタマーオリゴヌクレオチドによ る阻害は特異的オリゴ−タンパク質複合体の 存在に相関関係を有している 。 表４は、濃度５μＭで使用されたいくつかのホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドが、マイトジェンに誘発されるＣＤ２８発現及びＩＬ−２産生の双方に対 して与える阻害効果と、これらのオリゴヌクレオチドが転写因子の富化ソースで あるＨｅＬａ核抽出物と共にインキュベートされたときに特異的オリゴ−タンパ ク質複合体を形成するこれらのオリゴヌクレオチドのアプタマー能力とを比較す る。これらのデータは、ＣＤ２８発現及びＩＬ−２分泌に対するモチーフ含有オ リゴの阻害活性と特異的ゲルシフトバンドの形成との相関関係をはっきりと示す 。２つのＧテトラッド内部で生じた置換は機能を喪失させ、オリゴ−タンパク質 複合体を消滅させる。ＣＤ２８上流プロモーター領域−１９７〜＋２８（２８ｂ）はＳｐ１に結合する 。 ２８ｂとも呼ばれる³²Ｐ標識ＣＤ２８プロモーター領域−１９７〜＋２８をＳ ｐ１タンパク質と共にインキュベートし、０．５μｇから開始してＳｐ１抗体の ３回の系列希釈物を調製した。ゲルスーパーシフトアッセイを実施し、ＤＮＡ− タンパク質−抗体複合体を電気泳動後に分解し、データを図４に示す。 データは、Ｓｐ１がＣＤ２８プロモーターの２８ｂ領域に結合することを示す。 特異的Ｓｐ１抗体の０．００６１７μｇまでの系列希釈後に、Ｓｐ１／³²Ｐ−２ ８ｂ／Ｓｐ１抗体バンド（バンドＢ）が消滅して２８ｂ／Ｓｐ１バンド（バンド Ａ）が残るのでこの相互作用が特異的であることが判明する。これは、２８ｂが Ｓｐ１に特異的に結合することを示す。遊離³²Ｐ標識２８ｂはバンドＣである。ＣＤ２８上流プロモーター領域−１９７〜＋２８（２８ｂ）に由来し１２量体の 富Ｇモチーフを含有するオリゴ−５１〜−２２もＳｐ１に結合し得る。 ＣＤ２８プロモーター領域−１９７〜＋２８中の富Ｇモチーフに対する２８ｂ 中の正しいＳｐ１結合領域を制限するために、２８ｂオリゴ（配列１、表１）と 呼ぶ３０量体の二重鎖（ｄｓ）オリゴを合成した。このオリゴはその配列中に１ ２量体ＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧを含んでいた。我々はこれをＣＤ２８プロモー ター領域中のＳｐ１結合部位であると仮定した。３２Ｐ標識の後、２８ｂオリゴ をＳｐ１抽出物と共にインキュベートすると、これらは実際に互いに結合した（ 図５、バンドＡ、レーン２及び３）。コールドの二重鎖２８ｂオリゴと競合させ ると、 バンドが消滅した。これは、結合がＳｐ１特異的であることを示す（レーン４） 。意外にも、一本鎖ホスホロチオエート富Ｇオリゴ、図１Ａ（レーン５）及び１ ６４８１（レーン６）（双方とも富Ｇモチーフを含む）はＳｐ１結合で競合した が対照オリゴＩＣＮ１６４７６（レーン７）は競合しなかった。このデータは、 ホスホロチオエート富Ｇオリゴ、即ち、図１Ａ及びＩＣＮ１６４８１がＳｐ１の ＤＮＡ結合部位に対する結合のアプタマーとして作用し得ることを示す。この相 互作用の結果、プロモーター領域の−５１〜−２２のＳｐ１部位に対するＳｐ１ 結合が阻止され、従ってＣＤ２８遺伝子のＳｐ１仲介転写が阻害され、成熟ＣＤ ２８タンパク質の発現が低下する。 アプタマー及びこのようなアプタマーを利用する免疫応答の調節方法を以上に 開示した。特定実施態様に基づいて本発明を説明したが、発明の範囲は請求の範 囲のみによって限定される。

【手続補正書】 【提出日】平成１２年１１月１７日（２０００．１１．１７） 【補正内容】 （１） 請求の範囲を別紙に記載のとおりとする。 （２） 明細書第９頁、第１３行の「ＣＤ２８ Ｔａｍ特許」を「（１９９６年 ８月３０日出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１５０７参照）」とする。 （３） 明細書第１１頁、第１０ないし１４行の、「本発明によれば、ＣＤ２８ のような補助刺激分子並びにＩＬ−２及びＧＭＣＳＦのようなサイトカインをコ ードする遺伝子を調節するＳｐ１タンパク質及びＳｐ１近縁タンパク質のような タンパク質のＤＮＡ結合部位に特異的に結合するように設計されたアプタマーオ リゴヌクレオチドが提供される。」を「本発明は、核酸単位約１２から約２２の 間の長さ（両端値を含む）を有し、ＧＧｎＧ、ＧＧＧＧ、ＧｎＧＧ、ｎＧＧＧ及 びＧＧＧｎ［Ｇはグアニジンであり、ｎは任意のヌクレオチドである］からなる グループから選択された少くとも２つの富Ｇ領域を含む配列を有するアプタマー を提供する。」とする。 （４） 明細書第１７ないし１８行の「のような」を「を含む」とする。請求の範囲 １．核酸単位約１２から約２２の間の長さを有し（両端値を含む）、ＧＧｎＧ、 ＧＧＧＧ、ＧｎＧＧ、ｎＧＧＧ及びＧＧＧｎ〔Ｇはグアニジン及びｎは任意のヌ クレオチドを表す〕のグループから選択された少なくとも２つの富グアニジン領 域を含む配列を有しているアプタマー。 ２．上記少くとも２つの領域のうちの少なくとも２つが２〜７個（両端値を含む ）未満のヌクレオチドによって隔てられていることを特徴とする請求項１に記載 のアプタマー。 ３．上記少くとも２つの領域のうちの少なくとも２つが３〜６個（両端値を含む ）のヌクレオチドによって隔てられていることを特徴とする請求項１に記載のア プタマー。 ４．上記少くとも２つの領域のうちの少なくとも２つが４個のヌクレオチドによ って隔てられていることを特徴とする請求項１に記載のアプタマー。 ５．免疫調節タンパク質の核酸結合部位について競合することを特徴とする請求 項１に記載のアプタマー。 ６．免疫調節タンパク質がＳｐ１、ＮＦκＢ、ＥＧＲ１及び ＡＰ２のグループから選択されることを特徴とする請求項２に記載のアプタマー 。 ７．上記少くとも２つの富グアニジン領域のうちの少なくとも１つがＧＧｎＧか ら成り、上記少くとも２つの領域のうちの少なくとも２つが２〜７個のヌクレオ チドによって隔てられていることを特徴とする免疫調節タンパク質の核酸結合部 位について競合する請求項１に記載のアプタマー。 ８．２つ以上の富グアニジン領域のうちの少なくとも１つがＧＧＧＧから成り、 ２つ以上の領域のうちの少なくとも２つが２〜７個（両端値を含む）のヌクレオ チドによって隔てられていることを特徴とする免疫調節タンパク質の核酸結合部 位に競合する請求項１に記載のアプタマー。 ９．上記少くとも２つの富グアニジン領域のうちの少なくとも１つがＧｎＧＧか ら成り、上記少くとも２つの領域のうちの少なくとも２つが２〜７個（両端値を 含む）のヌクレオチドによって隔てられていることを特徴とする免疫調節タンパ ク質の核酸結合部位について競合する請求項１に記載のアプタマー。 １０．上記少くとも２つの富グアニジン領域のうちの少なくとも１つがｎＧＧＧ またはＧＧＧｎから成り、上記少くとも２つ の領域のうちの少なくとも２つが２〜７個（両端値を含む）ヌクレオチドによっ て隔てられていることを特徴とする免疫調節タンパク質の核酸結合部位について 競合する請求項１に記載のアプタマー。 １１．配列５’ＴＴＧ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＧＧ３’（配列４ ）から成ることを特徴とする請求項１に記載のアプタマー。 １２．配列５’ＧＧＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＧＧＧ ＣＴＧ ＧＡＡ３’（配列５ ）から成ることを特徴とする請求項１に記載のアプタマー。 １３．配列５’ＧＧＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＧＧ３’（配列１３）から成ること を特徴とする請求項１に記載のアプタマー。 １４．配列５’ＴＴＧ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＧＧＧ３’（配列７ ）から成ることを特徴とする請求項１に記載のアプタマー。 １５．配列５’ＴＴＧ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＡＧ ＧＴＧ ＧＧＧ３’（配列８ ）から成ることを特徴とする請求項１に記載のアプタマー。 １６．配列５’ＧＧＧ ＴＴＧ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＧＧ３’ （配列６）から成ることを特徴とする請求項１に記載のアプタマー。 １７．請求項１から１６のいずれか一項に記載のアプタマーを患者に投与するこ とから成る患者の免疫系応答の調節方法。 １８．請求項１から１６のいずれか一項に記載のアプタマーを患者に投与するこ とから成る不適正な免疫系応答によって特徴づけられる障害を有する患者の治療 方法。 １９．障害が移植片対宿主応答であることを特徴とする請求項１８に記載の方法 。 ２０．障害が自己免疫疾患であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。 ２１．障害がリウマチ様関節炎であることを特徴とする請求項２０に記載の方法 。 ２２．障害が多発性硬化症であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。 ２３．障害がエリテマトーデスであることを特徴とする請求項２０に記載の方法 。 ２４．障害がインスリン依存性真性糖尿病であることを特徴とする請求項２０に 記載の方法。 ２５．障害が乾癬であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 25/00 29/00 １０１ 29/00 １０１ 37/02 37/02 37/06 37/06 43/00 １１１ 43/00 １１１ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＧＧｎＧ、ＧＧＧＧ、ＧｎＧＧ及びＧＧＧ〔Ｇはグアニジン及びｎは任意の ヌクレオチドを表す］のグループから選択された少なくとも２つの富グアニジン 領域を含む配列を有しているアプタマー。 ２．上記少くとも２つの領域のうちの少なくとも２つが７個未満のヌクレオチド によって隔てられていることを特徴とする請求項１に記載のアプタマー。 ３．上記少くとも２つの領域のうちの少なくとも２つが３〜６個（両端値を含む ）のヌクレオチドによって隔てられていることを特徴とする請求項１に記載のア プタマー。 ４．上記少くとも２つの領域のうちの少なくとも２つが４個のヌクレオチドによ って隔てられていることを特徴とする請求項１に記載のアプタマー。 ５．免疫調節タンパク質の核酸結合部位について競合することを特徴とする請求 項１に記載のアプタマー。 ６．免疫調節タンパク質がＳｐ１、ＮＦκＢ、ＥＧＲ１及びＡＰ２のグループか ら選択されることを特徴とする請求項２に 記載のアプタマー。 ７．上記少くとも２つの富グアニジン領域のうちの少なくとも１つがＧＧｎＧか ら成り、２つ以上の領域のうちの少なくとも２つが７個未満のヌクレオチドによ って隔てられていることを特徴とする免疫調節タンパク質の核酸結合部位につい て競合する請求項１に記載のアプタマー。 ８．上記少くとも２つの富グアニジン領域のうちの少なくとも１つがＧＧＧＧか ら成り、上記少くとも２つの領域のうちの少なくとも２つが７個未満のヌクレオ チドによって隔てられていることを特徴とする免疫調節タンパク質の核酸結合部 位について競合する請求項１に記載のアプタマー。 ９．上記少くとも２つの富グアニジン領域のうちの少なくとも１つがＧｎＧＧか ら成り、上記少くとも２つの領域のうちの少なくとも２つが７個未満のヌクレオ チドによって隔てられていることを特徴とする免疫調節タンパク質の核酸結合部 位について競合する請求項１に記載のアプタマー。 １０．上記少くとも２つの富グアニジン領域のうちの少なくとも１つがＧＧＧか ら成り、上記少くとも２つの領域のうちの少なくとも２つが７個未満のヌクレオ チドによって隔てられてい ることを特徴とする免疫調節タンパク質の核酸結合部位について競合する詰求項 １に記載のアプタマー。 １１．配列５’ＴＴＧ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＧＧ３’（配列４ ）から成ることを特徴とする請求項１に記載のアプタマー。 １２．配列５’ＧＧＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＧＧＧ ＣＴＧ ＧＡＡ３’（配列５ ）から成ることを特徴とする請求項１に記載のアプタマー。 １３．配列５’ＧＧＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＧＧ３’（配列１３）から成ること を特徴とする請求項１に記載のアプタマー。 １４．配列５’ＴＴＧ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＧＧＧ３’（配列７ ）から成ることを特徴とする請求項１に記載のアプタマー。 １５．配列５’ＴＴＧ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＡＧ ＧＴＧ ＧＧＧ３’（配列８ ）から成ることを特徴とする請求項１に記載のアプタマー。 １６．配列５’ＧＧＧ ＴＴＧ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＧＧ３’ （配列６）から成ることを特徴とする請求項１に記載のアプタマー。 １７．請求項１から１６のいずれか一項に記載のアプタマーを患者に投与するこ とから成る患者の免疫系応答の調節方法。 １８．請求項１から１６のいずれか一項に記載のアプタマーを患者に投与するこ とから成る不適正な免疫系応答によって特徴づけられる障害を有する患者の治療 方法。 １９．障害が移植片対宿主応答であることを特徴とする請求項１８に記載の方法 。 ２０．障害が自己免疫疾患であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。 ２１．障害がリウマチ様関節炎であることを特徴とする請求項２０に記載の方法 。 ２２．障害が多発性硬化症であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。 ２３．障害がエリテマトーデスであることを特徴とする請求項２０に記載の方法 。 ２４．障害がインスリン依存性真性糖尿病であることを特徴とする請求項２０に 記載の方法。 ２５．障害が乾癬であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。