JP2002512003A

JP2002512003A - パラミキソウイルスワクチンのためのアルファウイルスベクター

Info

Publication number: JP2002512003A
Application number: JP2000521221A
Authority: JP
Inventors: マークパーリングトン、; シャオマオリー、
Original assignee: コノートラボラトリーズリミテッド
Priority date: 1997-11-14
Filing date: 1998-11-13
Publication date: 2002-04-23
Also published as: EP1034289A1; WO1999025858A1; BR9815285A; US20030180257A1; AU749345B2; US6475780B1; AU1139099A; CA2309826A1

Abstract

(57)【要約】ＤＮＡベクターは少なくともアルファウイルスＲＮＡゲノムの部分に相補的であり、完全なアルファウイルスＤＮＡゲノム複製領域の補体を有する第１ＤＮＡ配列、およびパラミキソウイルス蛋白質、特に呼吸系発疹ウイルス融合（ＲＳＶＦ）蛋白質またはＲＳＶＦ蛋白質と特異的に反応する抗体を発生するＲＳＶＦ蛋白質断片を符号化する第２ＤＮＡ配列からなり、第１および第２ＤＮＡ配列はプロモータ、好適にはイントロンＡを含む、サイトメガロウイルスプロモータの転写制御下にある。このようなベクターもｉｎｖｉｖｏで発現すると、ＲＳＶＦ蛋白質の免疫保護能力を強化するためにプロモータ配列とアルファウイルス配列の間に配置された追加のヌクレオチド配列を含む。このようなＤＮＡベクターは、それへの投与により、ヒト宿主を含む、ＲＳＶまたはその他のパラミキソウイルスによる感染で生じた疾患に対して宿主に免疫形成するために使用され、このような目的のために薬学的に受容可能な担体と免疫原組成物として製剤される。このようなベクターは試料中のＲＳＶまたは他のパラミキソウイルス感染の検出のための抗体を作るためにも使用される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明はパラミキソウイルス科ワクチンの分野に関し、および特にアルファウ
イルスベクターにおける呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）の融合（Ｆ）蛋白質を符
号化するＤＮＡからなるワクチンに関する。

【０００２】（発明の背景）ヒト呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）は乳児、年少の子供および施設に収容され
た高齢者における重症な気道感染の原因となる主要病原体として同定された（本
出願を通じて参考文献１、２、３、４−種々の参考文献は本発明が関わる技術の
状態をより十分に記述するために括弧内に引用される。各引用に対する完全な文
献情報は請求範囲の直前の明細書末尾に見られる。これらの参考文献の開示は本
開示への参考文献によりここに含まれる。）地球的死亡率及び罹患率の数字は有効なＲＳＶワクチンに対する差し迫った需
要があることを示す（参考文献５、６）。米国だけで、年間約十万人の子供がＲ
ＳＶ感染から生じる肺炎および細気管支炎の重症例で入院させられる。ＲＳＶ感
染の子供に対する入院患者および外来医療は米国で毎年三億四千万ドル以上の経
費と評価された。世界保健機構（ＷＨＯ）および国立アレルギー及び感染性疾患
研究所（ＮＩＡＩＤ）ワクチン諮問委員会はワクチン開発でＨＩＶに対してのみ
ＲＳＶを第２に格づけた。年間死亡率および罹患率の数字の両方ならびにＲＳＶ
感染を管理するための驚くほどの健康管理経費が有効なＲＳＶワクチンの開発を
積極的に追求するために刺激を与えた。しかし、このようなワクチンはまだ入手
できない。

【０００３】ホルマリン不活化（ＦＩ−ＲＳＶ）および弱毒ウイルスワクチンは臨床試験で
有効性を示すことに失敗した（参考文献７、８、９、１０）。さらに、生じたホ
ルマリン不活化ＲＳＶワクチンは野性型ＲＳＶへの被曝に続くある子供の疾患を
促進した（参考文献７、８、９、１０）。ＲＳＶ疾患の相乗作用に含まれる機構
の解明は安全なＲＳＶワクチンの設計、特に血清反応陰性個体群のために重要で
ある。最近の実験的証拠は、細胞媒介反応の平衡失調が免疫相乗作用に寄与する
ことを示唆する。ＦＩ−ＲＳＶで免疫形成され、ウイルスに挑戦させられたマウ
スで観察された強化した組織病理学はＣＤ４＋細胞またはインターロイキン−４
（ＩＬ−４）およびＩＬ−１０の両方の枯渇で阻害される。

【０００４】ＲＳＶ融合（Ｆ）糖蛋白質はウイルスの主要免疫原蛋白質の１つである。この
外被糖蛋白質は宿主細胞膜へのウイルスの融合とウイルスの細胞から細胞へのス
プレッドの両方を媒介する（参考文献１）。Ｆ蛋白質は、Ｎ末端Ｆ₂およびＣ末
端Ｆ₁部分からなるジスルフィド結合二量体を形成するために蛋白質分解的に開
裂される前駆体分子として合成される（参考文献１１）。Ｆ蛋白質のアミノ酸配
列はＲＳＶ亜群ＡおよびＢ中に高度に保存され、交差保護的抗原である（参考文
献６、１２）。バクロウイルス発現系では、ＲＳＶＦ蛋白質の切断分泌バージ
ョンがＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ挿入細胞に発現された（参考文献１３）
。組換え蛋白質はコトンラットにおいて保護的であることを示した（参考文献１
３）。

【０００５】パラインフルエンザウイルス感染に対する生ウイルスワクチンおよび糖蛋白質
サブユニットワクチンの開発に関する研究は追求される。ホルマリン不活化ＰＩ
Ｖ種１、２、３ワクチンによる臨床試験は、このワクチンが有効でないことを示
した（参考文献１４、１５、１６）。ワクチンがＲＳＶ感染の予防に有効でない
だけでなく、後にＲＳＶに感染するようになるワクチン摂取者の多くがより重症
の疾患を受けることを示したホルマリン不活化ＲＳＶワクチンによる臨床試験後
、化学的不活化ワクチンの追加の開発は続けられなかった。パラインフルエンザ
ワクチンの研究の大部分は、ＰＩＶ−１およびＰＩＶ−２に対して報告されるよ
り有意に少ない研究の候補ＰＩＶ−３ワクチン（参考文献１７）に集中した。Ｐ
ＩＶ−３ワクチンへの最近の接近は密接に関連したウシパラインフルエンザウイ
ルス種３の使用およびウイルスの低温適応による弱毒ウイルスの発生を含んだ（
参考文献１８、１９、２０、２１）。

【０００６】パラインフルエンザウイルス種３ワクチン開発への別の接近は、表面糖蛋白質
ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）および融合（Ｆ）蛋白質に集中する
サブユニット接近である（参考文献２２、２３、２４）。ＨＮ抗原、典型種ＩＩ
糖蛋白質は血球凝集およびノイラミニダーゼ活性の両方を示し、シアル酸含有宿
主細胞受容体へのウイルスの付着の原因となる。Ｉ型Ｆ糖蛋白質はウイルス外被
の細胞膜との融合ならびにウイルスの細胞から細胞へのスプレッドを媒介する。
最近、ＨＮおよびＦ糖蛋白質の両方が膜融合に対して必要であることが示された
。Ｆ糖蛋白質はジスルフィド結合したＦ２およびＦ１部分へ蛋白質分解的に開裂
させられる不活性前駆体（Ｆ）として合成される。ＰＩＶ−１、−２および−３
のＨＮおよびＦ蛋白質は構造的に同様であるので、それらは抗原的に区別される
。ＰＩＶ種の１つのＨＮおよびＦ蛋白質に対して中和する抗体は交差保護的でな
い。このように、有効ＰＩＶサブユニットワクチンはパラインフルエンザウイル
スの３つの異なる種からのＨＮおよびＦ糖蛋白質を含まねばならない。いずれか
の糖蛋白質に対する抗体はｉｎｖｉｔｒｏで中和する。直接の相関が中和抗体
力価の水準と乳児におけるＰＩＶ−３感染への抵抗の間に観察された。パライン
フルエンザウイルス種３に対する天然サブユニットワクチンが２つの表面糖蛋白
質の保護性を研究した。典型的に、糖蛋白質は非イオン性界面活性剤を用いてウ
イルスから抽出され、さらにレクチン親和性または免疫親和性クロマトグラフィ
ー法を用いて精製される。しかし、これらの方法のいずれも全ての状況下のワク
チンの大規模生産には完全に適当ではないだろう。小動物保護モデル（ハムスタ
ーおよびコトンラット）では、糖蛋白質による免疫形成は生きているＰＩＶ−３
による感染を防ぐことを示した（参考文献２５、２６、２７、２８、２９）。

【０００７】ＰＩＶ−３のＨＮおよびＦ糖蛋白質も組換えＤＮＡ法を用いて生産された。Ｈ
ＮおよびＦ糖蛋白質はバクロウイルス発現システムを用いる昆虫細胞中で、ワク
シニアウイルスおよびアデノウイルス組換え体の使用で生産された（参考文献３
０、３１、３２、３３、３４）。バクロウイルス発現システムでは、ＰＩＶ−３
糖蛋白質の全長および切断形の両方ならびにキメラＦ−ＨＮ融合蛋白質が発現さ
れた。組換え蛋白質は小動物モデルにおいて保護的であることを示した（１９９
１年１１月２９日に提出され、この譲受人に譲渡された、ＷＯ９１／００１０４
、米国特許出願番号０７／７７３，９４９参照）。

【０００８】セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）はトガウイルス科のアルファウイルス属の一
員である。成熟ウイルス粒子は５’−キャップ形成および３’―ポリアデニル化
される正の極性のｓｓＲＮＡゲノムの単一コピーを含む。細胞に導入するとｍＲ
ＮＡおよび裸のＲＮＡが感染を開始するように機能する。感染／形質導入におい
て、ゲノムの５窒フ三分の二は自己開裂により非構造性蛋白質（ｎｓＰ１から４
へ）に加工されるポリ蛋白質に翻訳される。一旦ｎｓ蛋白質が合成されると、プ
ラス鎖（４２Ｓ）ゲノムを全長マイナス鎖に複製する原因となる（参考文献１４
）。これらのマイナス鎖はついで新しいプラス鎖（４２Ｓ）ゲノムおよび２６Ｓ
サブゲノムｍＲＮＡの合成のためのテンプレートとして役立つ（参考文献１４）
。ゲノムの最後の三分の一と共直線性である、このサブゲノムｍＲＮＡはＳＦＶ
構造性蛋白質を符号化する。

【０００９】１９９１年ＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍおよびＧａｒｏｆｆ（参考文献１５）はＳＦ
ＶｃＤＮＡレプリコンに基づく一連の発現ベクターを設計した。これらのベク
ターは異種挿入物に対する道を作るために削除されたウイルス構造性蛋白質遺伝
子を有したが、ｎｓＰ１から４へのレプリカーゼ複合体お生産に対する非構造性
符号化領域を保存した。ＲＮＡ複製のために必要な短い５’及び３’配列要素も
保存された。ポリリンカー部位は全て三個のフレームにおける翻訳停止部位が続
く２６Ｓ促進因子下流に挿入された。Ｓｐｅ１部位はｉｎｖｉｔｒｏ転写反応
で使用のためのプラスミドの線形化に対するＳＦＶｃＤＮＡの３’末端の直後
に挿入された。

【００１０】異種蛋白質を符号化するＳＦＶＲＮＡの注入は多くの研究で異種蛋白質の発
現および抗体の誘導を生じることを示した（参考文献１６、１７）。免疫形成の
目的で異種蛋白質を発現するＳＦＶＲＮＡの使用はプラスミドＤＮＡ免疫形成
に関連したいくつかの利点を有する。例えば、ウイルス抗体を符号化するＳＥＶ
ＲＮＡはウイルスに対する抗体による中和のために力価の喪失無しにそのウイ
ルスに対する抗体の存在で導入される。また、蛋白質はｉｎｖｉｖｏで発現さ
れるので、蛋白質はウイルスそれ自体で発現された蛋白質と同じ立体配座を有す
るはずである。従って、免疫原性、保護エピトープおよび恐らく免疫強化の喪失
に導く蛋白質精製中に生じる立体配座変化に関する懸念はプラスミドＤＮＡ免疫
形成で避けられる。

【００１１】この譲受人に譲渡された、１９９５年６月７日に提出された同時係属米国特許
出願番号０８／４７６，３９７および参考文献（ＷＯ９６／０４０９４５）によ
りここに含まれるものの開示において、ＲＳＶ感染に対するＤＮＡ免疫形成のた
めのＲＳＶＦ蛋白質を符号化するＤＮＡを含むプラスミドベクターの使用が記
載された文献がある。この譲受人に譲渡された、１９９７年７月１８日に提出さ
れた同時係属米国特許出願番号０８／８９６，５００および文献によりここに含
まれるものの開示において、ＲＳＶ感染に対するＤＮＡ免疫形成のためのＲＳＶ
Ｇ蛋白質符号化ＤＮＡを含むプラスミドベクターの使用が記載される文献があ
る。

【００１２】この譲受人に譲渡された、１９９７年９月４日に提出された、私の同時係属米
国特許出願番号０８／９２３，５５６および参考文献に含まれるものの開示にお
いて、私は、免疫形成に対するＲＮＡ転写物を作るために、パラミクソウイルス
蛋白質、特にＲＳＶ−Ｆを含む、セムリキ森林ウイルスベクターを含み、アルフ
ァウイルスベクターを用いるＤＮＡベクターを記載する。

【００１３】ＷＯ９５／２７０４４、参考文献でここに含まれるものの開示において、アル
ファウイルスＲＮＡ配列に相補的なｃＤＮＡに基づくアルファウイルスｃＤＮＡ
ベクターの使用が記載される。一旦、異種プロモータの転写制御下でｃＤＮＡか
ら転写されると、アルファウイルスＲＮＡはそれ自体のレプリカーゼにより自己
複製し、転写組換えＲＮＡ分子のコピー数をそれによって増幅することができる
。

【００１４】ＲＳＶによる感染は重症の疾患に導く。ＲＳＶおよびその他のパラミクソウイ
ルスにより生じた疾患に対する防御のために、ワクチンを含む、免疫原製剤のｉ
ｎｖｉｖｏ投与のために改良したベクターを提供することが有用で、望ましい
。特に、疾患増大を生じない（免疫強化）、血清反応陰性乳児を含む、ヒトで免
疫原性で防御的であるワクチンを提供することが望ましい。

【００１５】（発明の概要）本発明は新規な免疫原物質および呼吸系発疹ウイルスにより生じた疾患に対し
て免疫形成のためのこのような新規な物質に基づいた免疫形成手順を提供する。
特に、本発明はパラミキソウイルス科による感染で生じた疾患に対するＤＮＡワ
クチンの提供を指向する。

【００１６】本発明の１つの側面に従って、少なくともアルファウイルスＲＮＡゲノムの部
分に相補的で、ｉｎｖｉｖｏ複製を可能にする完全なアルファウイルスＲＮＡ
ゲノム複製領域の補体を有する第１のＤＮＡ配列；パラミキソウイルス蛋白質と
特異的に反応する抗体を発生するパラミキソウイルス蛋白質または蛋白質断片を
符号化する第２ＤＮＡ配列で、複製に本質的でない第１ＤＮＡ配列の領域に挿入
される第２ＤＮＡ配列；プロモータの転写制御下にある第１および第２ＤＮＡ配
列；および宿主においてベクターからｉｎｖｉｖｏで発現すると、パラミキソ
ウイルス蛋白質の免疫保護能力を強化する第２ＤＮＡ配列に隣接して位置した第
３ＤＮＡ配列からなる、ベクターが提供される。

【００１７】パラミキソウイルス蛋白質はパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）および呼
吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）からなる群から選ばれる。ＰＩＶ蛋白質はＰＩＶ−
１、ＰＩＶ−２、ＰＩＶ−３またはＰＩＶ−４、特にＰＩＶ−３のＨＮおよびＦ
糖蛋白質からである。ＲＳＶ蛋白質は特にＲＳＶのＦまたはＧ糖蛋白質である。

【００１８】第２ＤＮＡ配列は全長ＲＳＶＦ蛋白質を符号化し、または経膜アンカおよび
細胞質テールを欠くＲＳＶＦ蛋白質を符号化する。経膜アンカおよび細胞質テ
ールに対する符号化領域の欠如はＲＳＶＦ蛋白質の分泌形を生じる。選択的に
、前述の米国特許出願０８／８９６，５００に記載のように、第２ＤＮＡ配列は
全長ＲＳＶ−Ｇ蛋白質または経膜領域を欠く切断ＲＳＶＧ蛋白質を符号化し、
蛋白質の分泌形を生じる。

【００１９】アルファウイルスは好適にはセムリキ森林ウイルスであり、第１ＤＮＡ配列は
プラスミドｐＳＦＶＩに含まれるセムリキ森林ウイルス配列である。

【００２０】第３ヌクレオチド配列はｉｎｖｉｖｏで、異所性ｍＲＮＡスプライシングを
防ぐ一対のスプライス部位からなり、ここで実質的に投与におけるベクターから
の全ての転写ｍＲＮＡがＲＳＶ蛋白質を符号化する。このような第３ヌクレオチ
ド配列は好適には第１ヌクレオチド配列とプロモータ配列の間に配置される。こ
のような第３ヌクレオチド配列は同時係属米国特許出願番号０８／４７６、３９
７（ＷＯ９６／０４０９４５）の図８に示されるように、ウサギβ−グロビンイ
ントロンＩＩのものである。

【００２１】プロモータ配列は即時早期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータである
。ヒトサイトメガロウイルスイントロンＡ配列はプロモータの下流および第３ヌ
クレオチド配列の上流で提供される。

【００２２】Ｆ蛋白質を符号化し、発明の１つの実施態様に従って提供されるベクターは特
異的にｐＭＰ４４であり、図１Ｄに示される同定特性を有する。

【００２３】ベクターの投与に従って、ここに提供されるベクターはＲＳＶ感染またはＲＳ
ＶＦ蛋白質もしくはＲＳＶＧ蛋白質のｉｎｖｉｖｏ発現による疾患に対し
て宿主を免疫形成するために使用され、経膜領域またはその他のパラミキソウイ
ルス蛋白質を欠く。本発明の追加の側面に従って、それ故に、呼吸系発疹ウイル
スまたはその他のパラミキソウイルスによる感染で生じた疾患に対して宿主に免
疫形成する方法が提供され、それはここに提供されたベクターの有効量を宿主に
投与することからなる。

【００２４】本発明はまた呼吸系発疹ウイルスによる感染で生じた疾患に対して宿主を保護
するためにＲＳＶＦまたはＧ蛋白質と特異的に反応する抗体を発生できるＲＳ
ＶＦもしくはＧ蛋白質またはＲＳＶ若しくはＧ蛋白質の断片を符号化する遺伝
子を用いる新規な方法を含み、それは遺伝子を分離することからなり；少なくと
もアルファウイルスＲＮＡゲノムの部分と相補的で、前記遺伝子とＤＮＡ配列が
プロモータの転写制御下にあるベクターを形成するために複製に対して本質的で
ない前記ＤＮＡ配列の領域の完全なアルファウイルスＲＮＡゲノム複製領域の補
体を有するＤＮＡ配列に前記遺伝子を操作的に結合し；宿主にＲＳＶＦまたは
Ｇ蛋白質による強化した免疫保護を生じる免疫保護強化配列に遺伝子を操作的に
結合し、好適には制御配列とアルファウイルス配列の間に免疫保護強化配列を導
入することにより；および宿主にベクターを導入する。対応する手順はその他の
パラミキソウイルス科に対して使用される。

【００２５】さらに、本発明は、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）による感染で生じた疾患に
対して宿主の保護のためにワクチンを生産する方法を含み、それはＲＳＶまたは
Ｇ蛋白質を符号化する第１ＤＮＡ配列を分離することからなり、それから経膜ア
ンカおよび細胞質テールが欠如し；少なくともアルファウイルスＲＮＡゲノムの
部分に相補的で、前記第１および第２ＤＮＡ配列がプロモータの転写制御下にあ
るベクターを形成する複製に本質的でない前記第２ＤＮＡ配列の領域に完全なア
ルファウイルスゲノム複製領域を有する第２ＤＮＡ配列に前記第１ＤＮＡ配列を
操作的に結合し；宿主中のベクターからｉｎｖｉｖｏで発現すると、ＲＳＶ
ＦまたはＧ蛋白質の免疫保護能力を強化するために第３ヌクレオチド配列に第１
ヌクレオチド配列を操作的に結合し；およびｉｎｖｉｖｏ投与のためのワクチ
ンとしてベクターを調剤する。対応する手順はその他のパラミキソウイルス科に
対して使用される。

【００２６】本発明はさらに、ここに記載された方法ならびにベクターの免疫有効量からな
る免疫原組成物により作られた、ヒト宿主を含む、宿主への投与のためのワクチ
ンを含む。

【００２７】（発明の一般的説明）上述のように、一般に、本発明はＤＮＡベクターを用いるＤＮＡ免疫形成によ
りパラミキソウイルスによる感染で生じた疾患に対する宿主の保護に関する。特
に、発明は呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）による感染で生じた疾患に対して宿主
の保護に関するが、特異的にそれに制限されない。続く説明は、ＲＳＶＦまた
はＧと特異的に反応する抗体を発生するＲＳＶＦまたはＧ蛋白質およびその断
片を符号化するＤＮＡ配列を用いることに特異的に関する。

【００２８】本出願では、用語「ＲＳＶＦ蛋白質」および「ＲＳＶＧ蛋白質」は、ＲＳ
Ｖの種々の系統で天然に生じるものおよび免疫原特性を保持しながら符号化する
遺伝子のＰＣＲ増幅で導入されるもの、経膜アンカーおよび細胞質テールを欠く
ＲＳＶＦおよびＧの分泌形、ならびにＲＳＶＦおよびＧ蛋白質および機能的
同族と特異的に反応する抗体を発生できる断片を含む、そのアミノ酸配列の変化
を有する蛋白質を含む、全長ＲＳＶＦおよびＧ蛋白質を定義するために使用さ
れる。本出願では、第１蛋白質が免疫学的に第２蛋白質と同じ機能に関連しおよ
び／または有するならば、第２蛋白質の「機能的同族」である。例えば、機能的
同族は蛋白質の断片またはその置換、付加もしくは欠落突然変異体である。

【００２９】ベクターは少なくともアルファウイルスＲＮＡゲノム、特異的にはセムリキ森
林ウイルスの部分に相補的で、ｉｎｖｉｖｏで複製を可能にする完全なアルフ
ァウイルスＲＮＡゲノム複製領域の補体を有する第１ＤＮＡ配列を含むように構
成される。ＲＳＶＦまたはＧ蛋白質を符号化する第２ＤＮＡ配列は複製に本質
的でない第１ＤＮＡ配列の領域に挿入される。第１および第２ＤＮＡ配列はベク
ターで免疫形成された宿主中にＲＳＶ蛋白質の発現を可能にするプロモータの転
写制御下にある。

【００３０】プロモータ配列は即刻早期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータである
。このプロモータは参考文献３６に記載される。ラウス肉腫ウイルスＬＴＲｓの
ような構成プロモータ、およびメタロチオネインプロモータのような誘発性プロ
モータ、および組織特異性プロモータを含んで、何らかの他の慣用のプロモータ
が使用される。

【００３１】組換えベクターは宿主にｉｎｖｉｖｏで発現されるとＲＳＶＦまたはＧ蛋
白質の免疫保護能力を強化するためにアルファウイルスに隣接して配置された第
３ヌクレオチド配列を含む。このような強化はｉｎｖｉｖｏ発現の増加、例え
ば、ｍＲＮＡ安定性の増加、転写および／または翻訳の強化で、提供される。こ
の追加の配列は好適にはプロモータ配列とアルファウイルスの間に配置される。

【００３２】この強化配列は転写中の異所性ｍＲＮＡスプライシングを防ぐために一対のス
プライス部位からなるので、実質的に全ての転写ｍＲＮＡは関心のある遺伝子、
例えば、ＲＳＶＦ蛋白質を符号化するそのままのアルファウイルスＲＮＡであ
る。特異的に、ウサギβ−グロビンイントロンＩＩ配列は参考文献３７に記載の
ようなスプライス部位を提供する。

【００３３】追加の強化はプロモータと増強構造配列の間に追加のＤＮＡ配列を含むことで
得られる。このような追加のＤＮＡ配列は即刻早期サイトメガロウイルスイント
ロンＡ配列からなる。

【００３４】ここに提供されたベクターは、動物に投与されると、投与される動物における
抗体反応および保護の授与で示されるように、ｉｎｖｉｖｏＲＳＶＦ蛋白質
発現を生じる。以下の実施例に詳述される結果から分かるように、ＤＮＡベクタ
ーは高い抗ＦＩｇＧ抗体タイターおよび授与保護を生じた。

【００３５】前述の米国特許出願番号０８／４７６，３９７および０８／８９６，５００と
比較して、ここに記載されたベクターは低い薬量および短い時間を用いて保護免
疫反応を提供する。天然のＲＳＶＦを用いる前述の米国特許出願番号０８／９
２３，５５８、０８／８９６，５５０および０８／４７６，３９７と比較して、
ここに記載のベクターはＤＮＡの摂取を増加し、免疫反応を強化することで知ら
れる物質、カルジオトキシンによる動物モデルの前処理の欠如で保護免疫反応を
生じる。

【００３６】ここに提供されたベクターもＲＳＶからの追加の抗原、少なくとも１つの他の
病原体またはサイトカインのような少なくとも１つの免疫調節剤を符号化する第
４のヌクレオチド配列からなる。このようなベクターはキメラまたはバイシスト
ロン構造に前記第４ヌクレオチド配列を含む。選択的に、第４ヌクレオチド配列
を含むベクターは分離して構成され、ここに提供されたＤＮＡベクターと共に、
宿主に共投与される。

【００３７】さらに、シムリキ森林ウイルス配列の３’末端で適当なｉｎｖｉｖｏ開裂を
保証するために、シムリキ森林ウイルスセグメントの３’末端で、肝炎デルタウ
イルスリボソーム配列が提供される。この効果を達成するために何らかの他の慣
用の配列が使用される。

【００３８】技術に熟練した人には、本発明の種々の実施態様がＲＳＶ感染の予防接種、診
断および治療の分野で多くの応用を有することは明白である。このような用途の
追加の無制限の議論がさらに以下に示される。

【００３９】１．ワクチンの調製および使用ワクチンとしての使用に好適な免疫原性組成物は、ＲＳＶのＦ遺伝子またはＲ
ＳＶのＧ遺伝子、および他のパラミクソウイルス遺伝子、および本明細書中に開
示されているベクターから調製することができる。ワクチンは、抗Ｆ抗体または
抗Ｇ抗体の産生を誘導する個体での免疫応答を高める。ＤＮＡベクターを含有す
る免疫原性組成物（ワクチンを含む）は、生理学的に受容可能な液体溶液での注
射剤、あるいはポリヌクレオチドを投与するための乳剤として調製することがで
きる。核酸は、レシチンリポソーム、または（例えば、国際特許公開ＷＯ９３／
２４６４０（参考文献３８）に記載されている）核酸リポソームとしてこの分野
で知られている他のリポソームなどのリポソームと組み合わせることができる。
あるいは、ＤＮＡベクターは、下記においてより詳細に記載されている補助薬と
組み合わせることができる。カチオン性脂質を含むリポソームは、ＤＮＡおよび
ＲＮＡなどのポリアニオンと自発的かつ迅速に相互作用して、１００％までのポ
リヌクレオチドが捕捉されるリポソーム／核酸の複合体をもたらす。さらに、こ
のようなポリカチオン性複合体は細胞膜と融合して、リソソーム小胞の分解性酵
素を迂回するポリヌクレオチドの細胞内送達をもたらす。ＰＣＴ特許出願公開Ｗ
Ｏ９４／２７４３５は、遺伝子的に免疫化するための組成物であって、カチオン
性脂質およびポリヌクレオチドを含む組成物を記載している。核酸の細胞内取り
込みを助ける媒介因子（カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、および他のト
ランスフェクションを容易にする媒介因子など）を都合良く使用することができ
る。

【００４０】ポリヌクレオチドの免疫原性調製物はまた、生分解性の時間放出粒子を含むマ
イクロカプセルとして配合することができる。例えば、米国特許第５，１５１，
２６４号は、ＢｉｏＶｅｃｔｅｕｒｓＳｕｐｒａＭｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ
ｓ（ＢＶＳＭ）と呼ばれている一種のリン脂質／糖脂質／多糖の粒子状キャリア
を記載している。この粒子状キャリアは、生物学的活性を有する様々な分子をそ
の層の１つに輸送することを目的としている。

【００４１】米国特許第５，０７５，１０９号は、５０：５０のポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃ
ｏ−グリコリド）における抗原（トリニトロフェニル化されたキーホールリンペ
ットヘモシアニンおよびブドウ球菌のエンテロトキシンＢ）のカプセル化を記載
している。他のカプセル化ポリマーとして、ポリ（グリコリド）、ポリ（ＤＬ−
ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、コポリオキサラート類、ポリカプロラクトン、
ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（エステルアミド）、ポリオル
トエステル、ならびにポリ（艨|ヒドロキシ酪酸）およびポリ無水物などが提案
されている。

【００４２】ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ９１／０６２８２は、複数の生体接着性マイクロスフ
ェアおよび抗原を含む送達ビヒクルを記載している。このようなマイクロスフェ
アは、デンプン、ゼラチン、デキストラン、コラーゲンまたはアルブミンから作
製される。この送達ビヒクルは、粘膜を経由するワクチンの取り込みを特に目的
としている。この送達ビヒクルは、吸収強化剤をさらに含有することができる。

【００４３】ＲＳＶのＦ遺伝子またはＧ遺伝子およびベクターは、それらと適合し得る薬学
的に受容可能な賦形剤と混合することができる。そのような賦形剤として、水、
生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合
わせを挙げることができる。免疫原性組成物およびワクチンは、湿潤剤または乳
化剤、ｐＨ緩衝化剤、あるいはそれらの効力を高めるための補助薬などの補助的
な物質をさらに含有することができる。免疫原性組成物およびワクチンは、局所
麻酔による注射部位の前処置の後で可能であるが、皮下注射、静脈内注射、皮内
注射または筋肉内注射によって非経口的に投与することができる。あるいは、本
発明によって得られる免疫原性組成物は、粘膜表面での免疫応答が惹起されるよ
うに配合および送達することができる。従って、免疫原性組成物は、例えば、鼻
腔経路または経口（胃内）経路によって粘膜表面に投与することができる。ある
いは、坐薬および経口配合物を含む他の投与様式が望ましい場合がある。坐薬の
場合、バインダーおよびキャリアには、例えば、ポリアルカレングリコールまた
はトリグリセリドを含むことができる。経口配合物には、通常用いられている賦
形剤を含むことができる。そのような賦形剤は、例えば、製薬規格のサッカリン
、セルロースおよび炭酸マグネシウムなどである。

【００４４】免疫原性調製物およびワクチンは、投薬配合物と適合し得る方法で、そして治
療的に効果的で、保護的かつ免疫原性であるような量で投与される。投与量は、
処置しようとする個体に依存する。これには、例えば、ＲＳＶのＦタンパク質お
よびそれに対する抗体を合成し、そして必要な場合には、細胞媒介型免疫応答を
産生する個体の免疫系の能力が含まれる。投与に必要な有効成分の正確な量は、
実施者の判断に依存する。しかし、好適な用量範囲は、当業者によって容易に決
定することができ、ＲＳＶのＦ遺伝子またはＧ遺伝子およびベクターを約１μｇ
〜約１ｍｇの程度とすることができる。最初の投与用量および追加抗原刺激用量
に関して適切な方法もまた変化し得るが、最初に投与し、その後、引き続く複数
回の投与を含むことができる。投薬もまた、投薬経路に依存する場合があり、そ
して宿主の大きさによって変化する。１つの病原体だけに対して保護するワクチ
ンは、一価のワクチンである。いくつかの病原体の抗原性物質を含有するワクチ
ンは混合ワクチンであり、これもまた本発明に属する。そのような混合ワクチン
は、例えば、様々な病原体、または同じ病原体の様々な株、または様々な病原体
の組み合わせに由来する物質を含有する。

【００４５】本発明の特定の実施形態において、ＲＳＶのＦタンパク質またはＧタンパク質
をコードする第１のヌクレオチド配列を含むベクターは、免疫系の細胞を含む特
定の細胞にベクターを標的化する標的化分子と一緒に送達することができる。

【００４６】ＤＮＡベクターは、様々な手順によって宿主に送達することができる。例えば
、Ｔａｎｇ他（参考文献３９）は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）をコードするＤ
ＮＡでコーティングされた金微粒子をマウスの皮膚に導入することによって、抗
ＢＧＨ抗体がマウスにおいて産生したことを開示し、Ｆｕｒｔｈ他（参考文献４
０）は、ジェット注入器が、生きた動物の皮膚、筋肉、脂肪組織および乳房組織
をトランスフェクションするために使用できることを示した。

【００４７】２．免疫アッセイ本発明のＲＳＶのＦ遺伝子またはＧ遺伝子およびベクターは、酵素結合免疫吸
着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡおよび他の非酵素結合型抗体結合アッセイま
たはこの分野で知られている手順を含む免疫アッセイにおいて使用される抗Ｆ抗
体または抗Ｇ抗体を作製するための免疫源として有用である。ＥＬＩＳＡアッセ
イにおいて、ベクターが、ＲＳＶのＦタンパク質またはＧタンパク質に対して、
あるいは他のパラミクソウイルスのタンパク質に対して特異的な抗体を作製する
ために最初に宿主に投与される。これらのＲＳＶＦ特異的抗体またはＲＳＶＧ特
異的抗体が、特定の表面に、例えば、ポリスチレン製マイクロタイタープレート
のウエルなどの抗体を結合し得る特定の固定化される。完全に吸着していない抗
体を除くために洗浄した後、試験サンプルに関して抗原性的に中性であることが
知られているウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液などの非特異的なタンパク質
をそのような特定の表面に結合させることができる。これにより、固定化表面に
おける非特異的な吸着部位がブロッキングされ、従って、抗血清の表面への非特
異的な結合によって生じるバックグラウンドを減らすことができる。

【００４８】次いで、固定化表面は、免疫複合体（抗原／抗体）の形成が促進される方法で
臨床的材料または生物学的材料などの試験サンプルと接触させられる。この手順
には、ＢＳＡ、ウシγグロブリン（ＢＧＧ）および／またはリン酸緩衝化生理食
塩水（ＰＢＳ）／ツィーンの溶液などの希釈剤でサンプルを希釈することを含む
ことができる。サンプルは、次いで、約２時間〜４時間、約２０℃〜３７℃の程
度などの温度でインキュベーションすることができる。インキュベーション後、
サンプルと接触した表面を洗浄して、免疫複合体を形成しなかった物質が除かれ
る。洗浄手順には、ＰＢＳ／ツィーンまたはホウ酸緩衝液などの溶液で洗浄する
ことを含むことができる。試験サンプルおよび結合したＲＳＶＦ特異的抗体の特
異的な免疫複合体を形成させ、そしてその後の洗浄を行った後、免疫複合体形成
の存在およびその量さえも決定することができる。

【００４９】（生物学的寄託物）ＲＳＶのＦタンパク質をコードする遺伝子を含有し、本明細書中で参照される
いくつかのベクターは、ブタペスト条約に従い、そして本特許出願が行われる前
に、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ
ＴＣＣ）（所在地：１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｏｕｌｅｖａｒｄ、
Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１１０−２２０９、アメリカ）に寄託された。

【００５０】寄託されたプラスミドサンプルは、この米国特許出願に基づいて特許が付与さ
れたときに一般に入手可能になり、そして寄託物の取り扱いに関する制限はその
ときに除かれるであろう。非生存寄託物は取り換えられる。本明細書中に記載さ
れ、そして請求される発明は、寄託されたプラスミドによって範囲が限定される
ものではない：寄託された実施形態は本発明を単に例示するものとして意図され
るからである。本特許出願において寄託されたのと類似または等価な抗原をコー
ドする等価なプラスミドまたは類似するプラスミドはいずれも本発明の範囲に含
まれる。

【００５１】寄託物の一覧プラスミドＡＴＣＣ番号寄託日ｐＭＰ３７９７９０５１９９７年２月２７日ｐＭＰ４２実施例上記の開示は、本発明を一般的に説明している。より完全な理解は、下記の具
体的な実施例を参照することによって得ることができる。これらの実施例は、例
示するために記載されているだけであり、本発明の範囲を限定することを目的と
していない。状況により示唆され、あるいは役に立つ均等物の形態および代替に
おける様々な変化は包含される。特定の用語が本明細書中で用いられているが、
そのような用語は、説明的な意味で意図されており、限定するためのものではな
い。

【００５２】本開示およびこれらの実施例において使用されているが、明確に記載されてい
ない分子遺伝学、タンパク質生化学および免疫学の方法は、科学的文献に詳細に
報告されており、そして当業者の能力の範囲に十分含まれる。

【００５３】実施例１本実施例は、図１Ａ〜１Ｂに概略されているように、短縮化されたＲＳＶのＦ
遺伝子を含有するセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）のＤＮＡ発現ベクターを構
築するためのスキームを記載する。

【００５４】プラスミドＶＲ１０１２をＰｓｔＩで制限消化し、次いで、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼを用いて平滑末端にした。β−グロビンのイントロンＩＩをベクターｐＳ
Ｇ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から切り出し、そしてプラスミドＶＲ１０１２に
連結してプラスミドｐＩＩＥを作製した。次いで、プラスミドｐＩＩＥをＳａｌ
ＩおよびＥｃｏＲＶで制限消化して、下記のヌクレオチド配列を有するＰＣＲフ
ラグメントに連結した：ＴＣＧＡＣＡＴＧＧＣＧＧＡＴＧＴＧＴＧＡＣＡＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＣＡＡ
ＡＡＧＡＴＴＴＴＧＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＴＡＣＧＣ
ＧＡＧＡＧＡＴＴＡＡＣＣＡＣＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＧＣＣＡＡＡＧＴＧＣＡ
ＴＧＴＴＧＡＴＡＴＴＧＡＧＧＣＴＧＡＣＡＧＣＣＣＡＴＴＣＡＴＣＡＡＧＴＣ
ＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＴＴＴＣＣＧＴＣＧＴＴＣＧＡＧＧＴＧＧＡＧＴＣ
ＡＴＴＧＣＡＧＧＴＣＡＣＡＣＣＡＡＡＴＧＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧＣＣＡＧ
ＡＧＣＡＴＴＴＴＣＧＣＡＣＣＴＧＧＣＴＡＣＣＡＡＡＴＴＧＡＴＣＧＡＧＣＡ
ＧＧＡＧＡＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＡＴ（配列番号
７）。この配列は、ヌクレオチド配列５秩|ＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＡＧＡＴＡＴ
ＣＣＡＡＧＡＴＧＡＧＴＧＴＧ（配列番号５）を有するプライマーＳＡＬ−ＳＦ
Ｖと、ヌクレオチド配列５秩|ＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＣＡＡＧＡ
ＴＧＡＧＴＧＴＧ（配列番号６）を有するプライマーＥＣＯ−ＳＦＶとを用いて
ｐＳＦＶＩから得られた。次いで、得られたプラスミドｐＭＰ３８をＥｃｐＲＶ
およびＢａｍＨＩで制限消化し、次いで脱リン酸化した。次いで、プラスミドｐ
ＳＶＦＩｌｉｎｋ（同時係属中の特許出願第（ｂ／ｏ１０３８−７６
６）を参照のこと）をＳｐｅＩで制限消化して、芟^肝炎リボザイム（図５、配
列番号２および配列番号３）に連結した。次いで、連結反応物をＥｃｏＲＶで制
限消化して、ＳＦＶ−ＲＳＶＦの大部分＋リボザイムのフラグメントを取り出し
た。次いで、このフラグメントを、ＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩで制限消化したｐＭ
Ｐ３８に連結してｐＭＰ４１を作製した。

【００５５】実施例２本実施例は、図２に概略されているように、プラスミドｐＭＰ４４を構築する
ための代わりのスキームを記載する。

【００５６】プラスミドＶＲ１０１２をＰｓｔＩで制限消化し、次いで、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼを用いて平滑末端にした。β−グロビンのイントロンＩＩをベクターｐＳ
Ｇ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から切り出し、そしてプラスミドＶＲ１０１２に
連結してプラスミドｐＩＩＥを作製した。次いで、プラスミドｐＩＩＥをＳａｌ
ＩおよびＥｃｏＲＶで制限消化して、下記のヌクレオチド配列を有するＰＣＲフ
ラグメントに連結した：ＴＣＧＡＣＡＴＧＧＣＧＧＡＴＧＴＧＴＧＡＣＡＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＣＡＡ
ＡＡＧＡＴＴＴＴＧＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＴＡＣＧＣ
ＧＡＧＡＧＡＴＴＡＡＣＣＡＣＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＧＣＣＡＡＡＧＴＧＣＡ
ＴＧＴＴＧＡＴＡＴＴＧＡＧＧＣＴＧＡＣＡＧＣＣＣＡＴＴＣＡＴＣＡＡＧＴＣ
ＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＴＴＴＣＣＧＴＣＧＴＴＣＧＡＧＧＴＧＧＡＧＴＣ
ＡＴＴＧＣＡＧＧＴＣＡＣＡＣＣＡＡＡＴＧＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧＣＣＡＧ
ＡＧＣＡＴＴＴＴＣＧＣＡＣＣＴＧＧＣＴＡＣＣＡＡＡＴＴＧＡＴＣＧＡＧＣＡ
ＧＧＡＧＡＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＡＴ（配列番号
７）。この配列は、ヌクレオチド配列５秩|ＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＡＧＡＴＡＴ
ＣＣＡＡＧＡＴＧＡＧＴＧＴＧ（配列番号５）を有するプライマーＳＡＬ−ＳＦ
Ｖと、ヌクレオチド配列５秩|ＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＣＡＡＧＡ
ＴＧＡＧＴＧＴＧ（配列番号６）を有するプライマーＥＣＯ−ＳＦＶとを用いて
ｐＳＦＶＩから得られた。次いで、得られたプラスミドｐＭＰ３８をＥｃｐＲＶ
およびＢａｍＨＩで制限消化し、次いで脱リン酸化した。次いで、プラスミドｐ
ＳＶＦＩｌｉｎｋ（同時係属中の特許出願第（ｂ／ｏ１０３８−７６
６）を参照のこと）をＳｐｅＩで制限消化して、δ肝炎リボザイム（図５、配列
番号２および配列番号３）に連結した。

【００５７】次いで、連結反応生成物をＥｃｏＲＶで制限消化して、ＳＦＶレプリコン＋図
６Ａ〜６Ｃに概略されるヌクレオチド配列を有するリボザイムを取り出した。次
いで、このフラグメントを、ＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩで制限消化したｐＭＰ３８
に連結してｐＭＰ４２を作製した。ＲＳＶのＦ遺伝子フラグメントをＢａｍＨＩ
による制限消化によってｐＭＰ３７から取り出し、そしてこのフラグメントをｐ
ＭＰ４２のＢａｍＨＩ部位に連結して、ｐＭＰ４４を作製した。ｐＭＰ４４のヌ
クレオチド配列を図３Ａ〜３Ｅに示す。

【００５８】実施例３本実施例は、ｐＭＰ４４によるマウスの免疫化および得られた免疫原性の結果
を記載する。

【００５９】ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、プラスミドｐＭＰ４４を用いて筋肉内（ｉ．ｍ．）経
路によって免疫化した。６匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスの前脛骨筋に、１００μｇの
プラスミドｐＭＰ４４をそれぞれ両側に注射した。この量は、コピー数に基づい
て、従来型ベクターの約９４μｇに等しい。これらのマウスは、４週間後に同一
の方法で追加免疫された。コントロール群は、本出願人による上記の米国特許出
願第０８／９２３，５５８号に記載されているように２５μｇのＳＦＶ−ＲＳＶ
ＦのＲＮＡで２回免疫化されたが、筋肉はカルジオトキシンによる前処理は行わ
れなかった。免疫化プロトコルを下記の表１に示す：

【００６０】

【表１】

【００６１】マウスは下記のように接種された：１．２５μｇのＲＮＡを、５０μｌのＰＢＳで、それぞれの後ろ脚の筋肉に注
射した。

【００６２】２．１００μｇのＤＮＡを、５０μｌのＰＢＳで、それぞれの後ろ脚の筋肉に
注射した。

【００６３】血清を、４週間目および６週間目のマウスから採取した。これらの血清におい
ける抗ＲＳＶＦ抗体力価（ＩｇＧ）を、実施例３に記載されているように、酵素
結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。

【００６４】ＢＡＬＢ／Ｃマウスの血清における抗ＲＳＶＦのＩｇＧ抗体の応答を図４にま
とめる。ＤＮＡ構築物（ｐＭＰ４４）で免疫化されたマウスは、ＳＦＶ−ＲＳＶ
ＦのＲＮＡで免疫化されたマウスよりも大きな抗Ｆ力価を有していた。

【００６５】２回目の免疫化を行った２週間後、マウスに、１０⁴プラーク形成単位（ｐｆ
ｕ）のＲＳＶのＡ１株（ＢＧ−４Ａ）を鼻腔内に免疫原投与した。４日後、動物
を屠殺した。肺を無菌的に取り出し、重量を測定し、そして２ｍＬの完全な培養
培地でホモジネーションした。肺のホモジネーション化物におけるウイルス力価
を、以前の記載（参考文献４１）に従ってｖｅｒｏ細胞を使用して二連で測定し
た。

【００６６】下記の表２から理解されるように、ｐＭＰ４４のＤＮＡによるマウスの免疫化
によって、マウス（５／６）は生ＲＳＶの抗原投与に対して保護されたが、これ
は、ＳＦＶ−ＲＳＶＦのＲＮＡによる免疫化が得られたときに保護が得られなか
ったこととは対照的であった。この結果は、カルジオトキシンによる前処置の後
で保護が得られるという結果が示される米国特許出願第０８／９２３，５５８号
、同第０８／４７６，３９７号および同第０８／８９６，５００号に記載されて
いるように、ＳＦＶ−ＲＳＶＦのＲＮＡを使用して得られる完全な保護と対比さ
れる。

【００６７】

【表２】

【００６８】実施例４本実施例は、抗ＲＳＶＦ抗体力価の測定を記載する。

【００６９】Ｎｕｎｃ−ＭａｘｉＳｏｒｐプレートのウエルを、一晩、室温で、０．０５Ｍ
の炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈した２．５ｎｇの免疫アフィニ
ティー精製したＲＳＶのＦタンパク質でコーティングした。ウエルの非特異的結
合に対するブロッキングを、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳを室温で３０分間加え、そ
の後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ＋０．１％ツィーン２０の洗浄緩衝液で２回洗浄
することによって行った。２倍または４倍の連続希釈列のマウス血清をウエルに
加えた。１時間のインキュベーションを室温で行った後、プレートを洗浄緩衝液
で５回洗浄して、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識結合物を洗浄緩衝
液での適切な最適希釈度で加えた。すべてのＩｇＧアッセイには、Ｊａｃｋｓｏ
ｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒｔｏｒｙＩｎｃ．（Ｂａｌ
ｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、アメリカ）から得られるＦ（ａｂ’）₂ヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ（Ｈ＋Ｌ特異的）−ＨＲＰを使用した。Ｓｅｒｏｔｅｃ（Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｏ
ｎｔａｒｉｏ、カナダ）から得られるヒツジ抗マウスＩｇＧ１−ＨＲＰをＩｇＧ
１アッセイにおいて使用し、そしてＣａｌｔａｇＬａｂｏｒｔｏｒｉｅｓ（Ｓ
ａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、アメリカ）から得られるヤギ抗マウスＩｇＧ
２ａをＩｇＧ２ａアッセイにおいて使用した。室温で１時間のインキュベーショ
ンを行った後、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄して、過酸化水素（基質）をテ
トラメチルベンジジンの存在下で加えた。反応を、２Ｍ硫酸を加えることによっ
て停止させた。発色を、ＭｕｌｔｉｓｃａｎＴｉｔｅｒｔｅｋプレート読み取
り装置により４５０ｎｍの光学密度（ＯＤ）で読み取った。力価は、ＯＤが約２
倍になった最終希釈度の逆数とした。このＯＤは、開始希釈度におけるアッセイ
の陰性コントロールよりも大きくなければならない。各動物の免疫化前の血清を
陰性コントロールとして使用した。

【００７０】（開示の要約）本開示を要約すると、本発明は、ＲＳＶのＦタンパク質またはＲＳＶのＧタン
パク質、あるいは他のパラミクソウイルスのタンパク質をコードする遺伝子を含
有するいくつかの新規なアルファウイルス由来のＤＮＡベクター、およびそのよ
うなベクターを使用する免疫化方法、およびそのようなベクターを使用する診断
方法を提供する。改変もまた本発明の範囲内であり得る。

【００７１】

【表３】

【００７２】

【表４】

【００７３】

【表５】

【００７４】

【表６】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】ベクターｐＭＰ４４の構築の手順の図解を示す。

【図１Ｂ】ベクターｐＭＰ４４の構築の手順の図解を示す。

【図２Ａ】ベクターｐＭＰ４４の構築の手順の図解を示す。

【図２Ｂ】ベクターｐＭＰ４４の構築の手順の図解を示す。

【図３Ａ】プラスミドｐＭＰ４４のヌクレオチド配列（配列番号：１）を含むものである
。

【図３Ｂ】プラスミドｐＭＰ４４のヌクレオチド配列（配列番号：１）を含むものである
。

【図３Ｃ】プラスミドｐＭＰ４４のヌクレオチド配列（配列番号：１）を含むものである
。

【図３Ｄ】プラスミドｐＭＰ４４のヌクレオチド配列（配列番号：１）を含むものである
。

【図３Ｅ】プラスミドｐＭＰ４４のヌクレオチド配列（配列番号：１）を含むものである
。

【図４】開始後４週および追加免疫後２週で採られたマウスの血清の抗ＲＳＶＦタイ
ターを示す。

【図５】肝炎デルタリボザイムを符号化する合成オリゴヌクレオチドに対するヌクレオ
チド配列（配列番号：２、３）を示す。

【図６Ａ】図５のリボザイムに結合したＳＦＶＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩ断片に対するヌク
レオチド配列を示す。

【図６Ｂ】図５のリボザイムに結合したＳＦＶＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩ断片に対するヌク
レオチド配列を示す。

【図６Ｃ】図５のリボザイムに結合したＳＦＶＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩ断片に対するヌク
レオチド配列を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年７月１１日（２０００．７．１１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【化１】のプラスミドｐＭＰ４４の特性を有する請求項１〜１１のいずれかに記載のベクター。

【化２】のプラスミドｐＭＰ４４の特性を有する請求項１４に記載のワクチンの製造方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/135 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者リー、シャオマオカナダ国エル４ジェイ３イー５オンタリオ州トーンヒルグレンマノーウェイ 106 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA32 CA01 CA07 CA10 DA02 DA03 EA02 EA04 FA02 FA20 GA11 HA17 4C085 AA03 BA57 DD62 DD63 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB09 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA01 DA86 EA31 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくともアルファウイルスＲＮＡゲノムの部分に相補的で
あり、ｉｎｖｉｖｏで複製を可能にする完全なアルファウイルスＲＮＡゲノム
複製領域の補体を有する第１ＤＮＡ配列；およびパラミキソウイルスと特異的に反応する抗体を発生するパラミキソウイルス蛋
白質または蛋白質断片を符号化する第２ＤＮＡ配列、第２ＤＮＡ配列は複製に本
質的でない第１ＤＮＡ配列の領域に挿入され、第１および第２ＤＮＡ配列はプロ
モータの転写制御下にあることからなる、ベクター。
【請求項２】パラミキソウイルス蛋白質がパラインフルエンザウイルス（
ＰＩＶ）および呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）からなる群から選ばれる、請求項
１のベクター。
【請求項３】ＰＩＶ蛋白質がＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２、ＰＩＶ−３および
ＰＩＶ−４からなる群から選ばれる、請求項２のベクター。
【請求項４】前記ＰＩＶ蛋白質がＰＩＶ−３のＨＮおよびＦ糖蛋白質から
なる群から選ばれる請求項３のベクター。
【請求項５】ＲＳＶ蛋白質がＲＳＶのＦまたはＧ蛋白質からなる群から選
ばれる、請求項４のベクター。
【請求項６】第２ヌクレオチド配列が全長ＲＳＶＦまたはＲＳＶＧ蛋
白質を符号化する、請求項１のベクター。
【請求項７】第２ヌクレオチド配列が経膜アンカおよび細胞質テールを欠
く切断ＲＳＶＦまたはＲＳＶＧ蛋白質を符号化する、請求項１のベクター。
【請求項８】アルファウイルスがセムリキ森林ウイルスである、請求項１
のベクター。
【請求項９】第１ＤＮＡ配列がプラスミドｐＳＦＶ１に含まれるセムリキ
森林ウイルス配列である、請求項１のベクター。
【請求項１０】プロモータ配列が即刻早期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ
）プロモータである、請求項１のベクター。
【請求項１１】宿主中のベクターからｉｎｖｉｖｏで発現するときパラ
ミキソウイルス蛋白質の免疫保護能力を強化するために第２ＤＮＡ配列に隣接し
て配置された第３ＤＮＡ配列からさらになる、請求項１のベクター。
【請求項１２】第３ヌクレオチド配列がｉｎｖｉｖｏで実質的にベクタ
ー領域投与からの全ての転写ＲＮＡがＲＳＶ蛋白質を符号化する、異所性ｍＲＮ
Ａスプライシングを防ぐために一対のスプライス部位からなる、請求項１１のベ
クター。
【請求項１３】第３ヌクレオチド配列が第１ヌクレオチド配列とプロモー
タ配列の間に配置される、請求項１２のベクター。
【請求項１４】前記第３ヌクレオチド配列がウサギβ−グロビンイントロ
ンＩＩのものである、請求項１３のベクター。
【請求項１５】前記プロモータ配列が即刻早期サイトメガロウイルス（Ｃ
ＭＶ）プロモータであり、ヒトサイトメガロウイルスイントロンＡ配列がプロモ
ータの下流および第３ヌクレオチド配列の上流に提供される、請求項１０のベク
ター。
【請求項１６】第１ヌクレオチド配列の３’末端でｉｎｖｉｖｏで適当
な開裂を保証するために第１ヌクレオチド配列の３’末端で第４ヌクレオチド配
列からさらになる、請求項１５のベクター。
【請求項１７】前記第４ヌクレオチド配列が肝炎デルタウイルスリボザイ
ム配列である、請求項１６のベクター。
【請求項１８】図２Ｄに示されるプラスミドｐＭＰ４４の同定特性を有す
る、請求項１のベクター。
【請求項１９】配列番号：１を有する、請求項１のベクター。
【請求項２０】請求項１に請求されたようなベクターの有効量を宿主に投
与することからなる、パラミキソウイルスによる感染で生じた疾患に対して宿主
に免疫形成する方法。
【請求項２１】前記ベクターが図２Ｄに示されるプラスミドｐＭＰ４４の
同定特性を有する、請求項２１の方法。
【請求項２２】前記ベクターが配列番号：１を有する、請求項２１の方法
。
【請求項２３】前記遺伝子を分離すること；少なくともアルファウイルスＲＮＡゲノムの部分に相補的であり、前記遺伝子
およびＤＮＡ配列がプロモータの転写制御下にある、ベクターを形成するために
複製に本質的でない前記ＤＮＡ配列の領域で完全なアルファウイルスＲＮＡゲノ
ム複製領域の補体を有すること；および宿主にベクターを導入することからなる、ＲＳＶＦもしくはＧ蛋白質または呼吸系発疹ウイルスによる感染で生じた疾
患に対して宿主を保護するためにＲＳＶＦもしくはＧ蛋白質と特異的に反応す
る抗体を発生することができるＲＳＶＦもしくはＧ蛋白質の断片を符号化する
遺伝子を用いる方法。
【請求項２４】ＲＳＶＦ蛋白質を符号化する前記遺伝子が経膜領域を欠
くＲＳＶＦ蛋白質を符号化する、請求項２３の方法。
【請求項２５】前記プロモータが即刻早期サイトメガロウイルスプロモー
タからなる、請求項２４の方法。
【請求項２６】前記宿主において前記ＲＳＶＦ蛋白質への強化した免疫
保護を生じるために免疫保護強化配列に前記遺伝子を操作的に結合する段階を含
む、請求項２５の方法。
【請求項２７】前記免疫保護強化配列が前記制御配列と前記遺伝子の間の
前記ベクターに導入される、請求項２６の方法。
【請求項２８】前記免疫保護強化配列がそれによって実質的にそままの転
写ｍＲＮＡがＲＳＶＦ蛋白質を符号化する、異所性ｍＲＮＡスプライシングを
防ぐために一対のスプライス部位からなる、請求項２７の方法。
【請求項２９】前記免疫保護強化配列がウサギβ−グロビンイントロンＩ
Ｉのものである、請求項２８の方法。
【請求項３０】前記ベクターがプラスミドｐＭＰ４４である、請求項２３
の方法。
【請求項３１】前記ベクターが配列番号：１を有する、請求項２３のベク
ター。
【請求項３２】ＲＳＶまたはＧ蛋白質を符号化する第１ＤＮＡ配列を分離
し、それから経膜アンカおよび細胞質テールが欠如すること；少なくともアルファウイルスＲＮＡゲノムの部分に相補的であり、前記第１お
よび第２ＤＮＡ配列がプロモータの転写制御下にあるベクターを形成するために
複製に本質的でない前記第２ＤＮＡ配列の領域に完全なアルファウイルスゲノム
複製領域を有する、第２ＤＮＡ配列に前記第１ＤＮＡ配列を操作的に結合するこ
と；およびｉｎｖｉｖｏ投与のためのワクチンとしてベクターを調剤することからなる
、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）による感染で生じた疾患に対する宿主の保護の
ためのワクチンの生産の方法。
【請求項３３】前記ベクターが図２Ｄに示されたｐＭＰ４４の同定特性を
有する、請求項３２の組成物。
【請求項３４】前記ベクターが配列番号：１を有する、請求項３２の方法
。
【請求項３５】請求項３２の方法により生産された、ヒト宿主を含む、宿
主への投与のためのワクチン。
【請求項３６】請求項１のベクターの免疫有効量からなる、免疫原組成物
。
【請求項３７】前記ベクターが図２ＤのｐＭＰ４４の同定特性を有する、
請求項３６の組成物。
【請求項３８】前記ベクターが配列番号：１を有する、請求項３６の組成
物。