JP2002512048A - ＩκＢと強化グリーン蛍光との融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＩκＢとグリーン蛍光タンパク質とを含む融合タンパク質を提供する。さらに、このタンパク質をコードするＤＮＡと、このようなＤＮＡを発現するベクターと、ＩκＢとグリーン蛍光タンパク質とを含む融合タンパク質の種々な使用方法とを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は一般的にタンパク質化学と生化学アッセイ及び試薬との分野に関する
。さらに詳しくは、本発明は修飾蛍光タンパク質及びそれらの使用方法に関する
。

【０００２】関連技術の説明 クラゲ、エクオリア ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）か
らのグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、遺伝子発現とタンパク質局在化との
測定におけるレポーターとして広く用いられている（１−４）。ＧＦＰｃＤＮＡ
は、基質又は補因子の不存在下で容易に検出される蛍光を有する種々な細胞又は
生物において発現されることができる（５）。

【０００３】 ＧＦＰは、２３８アミノ酸の２７ｋＤａ単鎖ポリペプチドである（６）。Ｎ末
端近くのアミノ酸６５〜６７におけるＳｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙの鍵配列はＧＦＰ
発蛍光団として機能する（７）。これらの３アミノ酸は自然酸化を受けて、ＧＦ
Ｐの蛍光の原因となる環化発色団を形成する（８）。強化ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）は
蛍光が３５倍に増強した、ＧＦＰの突然変異体である（９−１１）。この変異体
はアミノ酸６５におけるＳｅｒからＴｈｒへと、位置６４におけるＰｈｅからＬ
ｅｕへの突然変異を有し、最適化ヒトコドンを有する遺伝子によってコードされ
る（１０）。

【０００４】 クラゲ、エクオリア ビクトリアからのグリーン蛍光タンパク質は、その容易
に検出可能なグリーン蛍光のために、遺伝子発現及びタンパク質局在化の研究の
ために広く用いられている。ＧＦＰ蛍光は基質又は補因子を必要としない；それ
故に、非常に多くの種及び非常に多様な細胞においてこのレポーターを用いるこ
とが可能である。ＧＦＰは非常に安定なタンパク質であり、蓄積する可能性があ
るので；ＧＦＰは哺乳動物細胞にとってしばしば有害である。

【０００５】 最近、野生型ＧＦＰと突然変異ＧＦＰ Ｓ６５Ｔとの結晶学的構造は、ＧＦＰ
の三次構造がバレルに類似することを明らかにしている（Ｏｒｍｏ等（１９９６
）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１３９２〜１３９５；Ｙａｎｇ，Ｆ．，Ｍｏｓｓ，
Ｌ．Ｇ．及びＰｈｉｌｌｉｐｓ，Ｇ．Ｎ．Ｊｒ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ １４：１２４６〜１２５１）。このバレルはコンパクトな逆平行
構造のβシートから成る。このバレルの中心においては、発色団を含有するαヘ
リックスがバレルによって保護されている。このコンパクト構造はＧＦＰを、例
えばプロテアーゼ処理のような、種々な及び／又は厳しい条件下において非常に
安定にする。

【０００６】 ＧＦＰの性質を改良して、多様な研究目的のために有用なＧＦＰ試薬を製造す
るために、非常に多くの研究が現在行われている。タンパク質産物が哺乳動物細
胞における合成の増加とフォールディング改良とを享受している“ヒト化(human
ized)”ＧＦＰ ＤＮＡを含めた、新しいバージョンのＧＦＰが突然変異によっ
て開発されている（Ｃｏｒｍａｃｋ，Ｂ．Ｐ．，Ｖａｌｄｉｖｉａ，Ｒ．Ｈ．及
びＦａｌｋｏｗ，Ｓ．（１９９６）Ｇｅｎｅ １７３，３３〜３８；Ｈａａｓ，
Ｊ．，Ｐａｒｋ，Ｅ．Ｃ．及びＳｅｅｄ，Ｂ．（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ ６，３１５〜３２４；及びＹａｎｇ，Ｔ．Ｔ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｌ
．，Ｋａｉｎ，Ｓ．Ｒ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ ２４，４５９２〜４５９３を参照のこと）。このようなヒト化タンパク
質の１つは、“強化グリーン蛍光タンパク質”（ＥＧＦＰ）である。ＧＦＰに対
する他の突然変異はブルー蛍光及びレッド蛍光発光バージョンを生じている。

【０００７】 細胞は、その産物が広範囲な効果を生物学的プロセスに及ぼす特定の遺伝子の
発現を活性化又は抑制することによって、種々な刺激に応答することができる。
このような刺激は熱ショック、ステロイド・ホルモン、成長因子、サイトカイン
等を包含する。遺伝子発現は転写後レベルにおいて調節することができるが、遺
伝子転写自体のプロセスは調節のための主要なポイントである。外部シグナル又
は刺激は、シグナル伝達と呼ばれるプロセスにおける転写因子の調節を介して遺
伝子発現に影響を及ぼすことができる。外部シグナルは例えばこれらの因子にコ
ンホメーション変化を誘導する、又はこれらを化学的に修飾する、又はリガンド
／タンパク質複合体の形成を導くことによって影響を及ぼす。シグナル伝達経路
の詳細な分析は薬物発見及び設計のための重要な情報を与える。

【０００８】 多くの重要なシグナル伝達経路は転写因子ＮＦ−κＢの活性化を必要とする。
ＮＦκＢの活性化に影響を及ぼす化合物は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、イン
ターロイキン１β（ＩＬ−１）、リポ多糖（ＬＰＳ）、及びホルボールエステル
（ＰＭＡ）を包含する。ＮＦ−κＢの活性化は、その産物が例えば細胞増殖、ア
ポトーシス、炎症及び免疫応答のような、多様な重要生物学的プロセスに寄与す
る、大きな遺伝子列の誘導を招く。ＮＦκＢはダイマー転写因子のファミリーの
プロトタイプである。これはｐ５０（ＮＦκＢ１）、ｐ５２（ＮＦκＢ２）、Ｒ
ｅｌＡ（ｐ６５）、ＲｅｌＢ、ｃ−Ｒｅｌから成る。タンパク質のＲｅｌ／ＮＦ
κＢファミリーは、ＤＮＡに結合する約３００アミノ酸Ｒｅｌ領域を共有し、互
いに相互作用し、その抑制因子、ＩκＢを結合する。ＮＦκＢ／Ｒｅｌタンパク
質と結合することが確認されているＩκＢタンパク質が少なくとも６種存在する
。全てのＩκＢタンパク質は、各々約３０アミノ酸の長さを有する、５〜７個の
アンキリンリピート・ドメインを有し、これらのドメインはＮＦκＢ Ｒｅｌ領
域と相互作用する。

【０００９】 ＮＦκＢ活性化のメカニズムは充分に実証されている。ＮＦκＢは細胞質中に
不活性形で存在し、そこでＩκＢに結合する。多様なインデューサーに応答した
細胞活性化はＩκＢからのＮＦκＢの迅速な放出を生じる。この活性化はタンパ
ク質合成には依存しない。多様な刺激に応答して、タンパク質キナーゼ活性の細
胞内カスケードが誘発され、ＩκＢは２個のセリン（Ｓｅｒ３２とＳｅｒ３６）
において特異的にリン酸化され、２６Ｓプロテアソームによって迅速に分解され
る。複合体化していないＮＦκＢは迅速に核に移動して、そこで遺伝子発現の転
写活性化が数分間内に生ずる。

【００１０】 ＮＦκＢを活性化する又は阻害することができるアゴニスト又はアンタゴニス
トの探求は製薬会社の重大な薬物ターゲットである。遺伝子発現の活性化の研究
に用いられる２つの非常に一般的な方法は、レポーターのｉｎ ｖｉｖｏ転写誘
導を含むｉｎ ｖｉｔｒｏゲルシフト・アッセイ（単数又は複数種類）である。
ＮＦκＢ活性化のメカニズムが充分に確認されているので、活性化経路に基づく
多くのアッセイが設計されて、ＮＦκＢ誘導遺伝子発現をモニターするために用
いられている。これらのアッセイはＩκＢのリン酸化、ＩκＢの分解及びＩκＢ
のユビキチン化の測定を包含する。これらのアッセイは研究実験室においてしば
しば用いられるが；大規模な薬物スクリーニングのためには、これらのアッセイ
は時間がかかるか又は冗長である。

【００１１】 先行技術は、ＩκＢの分解を測定するための容易な高スループット・アッセイ
の方法及び研究ツールに欠けている。本発明は当該技術分野におけるこの長い間
存続する必要性を満たす。

【００１２】 発明の概要 本発明のＩκＢとヒト化グリーン蛍光タンパク質とから成る融合タンパク質は
、ＩκＢの分解を直接方法で測定するための研究ツールを提供する。この融合タ
ンパク質を発現する細胞は、ＩκＢの分解が誘発されない限り、ＧＦＰ誘導蛍光
を維持する。しかし、ＩκＢ分解を誘発するＩκＢのリン酸化を外部因子が誘導
するや否や、融合タンパク質のＩκＢ部分は分解され、融合タンパク質のＧＦＰ
部分は蛍光発光することを止める。したがって、ＩκＢ−ＥＧＦＰ融合タンパク
質はＩκＢ分解の直接視覚アッセイのためのツールを提供する。このようなアッ
セイは高スループット・フォーマットに適用可能である。

【００１３】 本発明は、ＩκＢＥＧＦＰ融合タンパク質の蛍光が、完全である該融合タンパ
ク質のＩκＢ部分に依存するＩκＢＥＧＦＰ融合タンパク質を提供する。１実施
態様では、ＧＦＰに融合したＩκＢを含む融合タンパク質を提供する。

【００１４】 本発明のさらに他の態様では、ＩκＢ／ＧＦＰ融合タンパク質の蛍光が、完全
である該融合タンパク質のＩκＢ部分に依存するＩκＢ／ＧＦＰ融合タンパク質
をコードする単離ＤＮＡ分子を提供する。本発明のこの態様の１実施態様では、
融合タンパク質のＧＦＰ部分をコードする単離ＤＮＡ分子をヒト化する。さらに
、本発明は、ＩκＢ／ＧＦＰ融合タンパク質の蛍光が、完全である該融合タンパ
ク質のＩκＢ部分に依存するＩκＢ／ＧＦＰ融合タンパク質をコードする単離Ｄ
ＮＡ分子を発現することができるベクターを提供する。このベクターの１実施態
様では、ベクターは誘導可能なプロモーターを含有する。本発明の他の実施態様
では、本発明のＩκＢ／ＧＦＰ融合タンパク質を発現するＤＮＡによって安定に
トランスフェクトされた哺乳動物細胞を提供する。

【００１５】 本発明のさらに他の態様では、本発明は、ＩκＢの分解を測定することによっ
て、ＮＦκＢを活性化する又は阻害する、アゴニスト又はアンタゴニストのいず
れであるかを決定するためのアッセイを提供する。この態様の１実施態様では、
ＩκＢ−ＧＦＰ融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子を発現するベクター
を細胞中に導入する工程と；前記細胞に問題の化合物を接触させる工程と；ＧＦ
Ｐ誘導蛍光の量を測定する工程とを含む、前記問題の化合物によるＮＦκＢの活
性化を測定する方法であって、前記化合物によるＧＦＰ誘導蛍光の減少によって
、前記化合物がＮＦκＢを活性化することが示される前記方法を提供する。一般
に、ＧＦＰ誘導蛍光の減少はＩκＢの分解に直接比例する。

【００１６】 本発明の上記特徴、利益及び目的、並びに今後明らかになるであろう他のこ
とが達成され、詳細に理解されうるように、上記で簡単に要約した本発明を、添
付図面に例示するそのある一定の実施態様を参照して、さらに詳しく説明するこ
とにする。これらの図面は本明細書の一部を形成する。しかし、添付図面が本発
明の好ましい実施態様を例示するものであるので、それらの範囲を限定するもの
と見なすべきでないことを留意すべきである。

【００１７】 発明の詳細な説明 本発明は、ＩκＢ／ＧＦＰから成る融合タンパク質と、この融合タンパク質を
用いて細胞の蛍光を測定することによってＮＦκＢ活性化をモニターするための
アッセイとを提供する。ＩκＢ／ＧＦＰ融合タンパク質を発現する結果として、
これらの細胞における蛍光は完全のＩκＢの存在と直接対応し、次に、このＩκ
Ｂの存在はＮＦκＢ活性化の状態に直接対応する。これらの細胞が、ＩκＢの分
解を誘導する種々な刺激に暴露されると、融合タンパク質のＧＦＰ部分の分解も
同様に誘発される。融合タンパク質の分解は、トランスフェクトされた細胞の蛍
光の変化を測定することによって、直接測定することができる。

【００１８】 本明細書で用いる限り、“ＧＦＰ”なる用語は、より大きな蛍光又は種々な色
での蛍光発光(fluoresce)を生じるように工作された(engineered)先行技術バー
ジョンのＧＦＰを含めた、エクオリア ビクトリアからの塩基性グリーン蛍光タ
ンパク質を意味する。Ａ．ビクトリアＧＦＰの配列はＰｒａｓｈｅｒ Ｄ．Ｃ．
等（１９９２）Ｇｅｎｅ １１１：２２９〜３３に開示されている。

【００１９】 本明細書で用いる限り、“ＥＧＦＰ”なる用語は、Ｋａｉｎ等（１９９５）Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９（４）：６５０〜５５に報告されているように
、“ヒト化された”ＧＦＰを意味する。“ヒト化された”とは、ヒト細胞におけ
るタンパク質の発現に関してコドンを最適化するようにＧＦＰ核酸配列になされ
た変化を意味する。

【００２０】 本明細書で用いる限り、“半減期”なる用語は、細胞中に発現された蛍光タン
パク質からの蛍光シグナルの半分が消失して、半分が残る時間を意味する。

【００２１】 本明細書で用いる限り、“ヒト化された”なる用語は、コドンが高等真核生物
における翻訳のために最適化されるように、タンパク質をコードするＤＮＡ配列
を工作することを意味する。

【００２２】 本発明によると、慣用的な分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡ技法を当該
技術の熟練の範囲内で用いることができる。このような技法は文献に詳しく説明
されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＳａｍｂｒｏｏｋ
，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ”（１９８２）；“ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｉ及びＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編集，１９８５）；
“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ
編集，（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ”（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓとＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集，（１９８５））；“
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”（Ｂ．Ｄ．Ｈ
ａｍｅｓとＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集，（１９８４））；“Ａｎｉｍａｌ Ｃ
ｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集，（１９８６））；
“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ”（ＩＲＬ
Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８４）を参照
のこと。

【００２３】 “ベクター”は、他のＤＮＡセグメントが、付着セグメントの複製をもたらす
ように付着することができる、例えばプラスミド、ファージ又はコスミドのよう
なレプリコンである。

【００２４】 “ＤＮＡ分子”とは、一本鎖形又は二本鎖らせんのいずれかのポリマー（高分
子）形のデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン又はシトシン
）を意味する。この用語は分子の一次又は二次構造のみを意味し、この分子構造
を如何なる特定の三次形にも限定しない。したがって、特に線状ＤＮＡ分子（例
えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド及び染色体中に見出される二
本鎖ＤＮＡを包含する。

【００２５】 ＤＮＡ“コーディング配列”は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて適当な調節配列の制
御下に置かれたときに転写され、ポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。
このコーディング配列の境界は５’（アミノ）末端における開始コドンと、３’
（カルボキシル）末端における翻訳終止コドンによって決定される。コーディン
グ配列は、非限定的に、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核
生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列及び合成ＤＮＡ配列を
包含することができる。ポリアデニル化シグナルと転写終止配列はコーディング
配列の３’側に位置することができる。

【００２６】 転写及び翻訳制御配列は、宿主細胞におけるコーディング配列の発現を生じる
及び／又は調節する、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグ
ナル、ターミネイター等のようなＤＮＡ調節配列である。

【００２７】 “プロモーター配列”は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼと結合して、下流（３
’方向）コーディング配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である
。一般に、プロモーター配列はその３’末端において転写開始部位によって境界
を付けられ、上流（５’方向）に伸長して、バックグラウンドを超えて検出可能
なレベルにおいて転写を開始するために必要な、最少数の塩基又は要素(element
s)を包含する。プロモーター配列内には、転写開始部位と、ＲＮＡポリメラーゼ
を結合する責任を負うタンパク質結合ドメインとが見出される。真核生物プロモ
ーターはしばしば、但し常にではなく、“ＴＡＴＡ”ボックス及び“ＣＡＴ”ボ
ックスを含有する。誘導プロモーターを含めた、種々なプロモーターを用いて、
本発明の種々なベクターを駆動することができる。

【００２８】 本明細書で用いる限り、“制限エンドヌクレアーゼ”及び“制限酵素”なる用
語は、各々が特異的なヌクレオチド配列において又はその近くで二本鎖ＤＮＡを
切断する細菌酵素を意味する。

【００２９】 外因性又は異種ＤＮＡが細胞内に導入されているときに、細胞はこのようなＤ
ＮＡによって“形質転換”されている又は“トランスフェクト”されている。形
質転換用ＤＮＡは細胞のゲノムに組み込まれる（共有結合する）ことができても
できなくてもよい。例えば、原核生物、酵母及び哺乳動物細胞において、形質転
換用ＤＮＡは例えばプラスミドのようなエピソーム要素上に維持されることがで
きる。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、形質転換用ＤＮＡが染
色体複製を介して娘細胞によって遺伝されるように、形質転換用ＤＮＡが染色体
に組み込まれている細胞である。この安定性は、この真核細胞が形質転換用ＤＮ
Ａを含有する娘細胞集団から成る細胞系又はクローンを確立することができるこ
とによって実証される。“クローン”は、単細胞又は共通先祖から有糸分裂によ
って誘導される細胞集団である。“細胞系”は、多くの世代にわたってｉｎ ｖ
ｉｔｒｏで着実に増殖することができる一次細胞のクローンである。

【００３０】 ＤＮＡ構築体の“異種(heterologous)”領域は、大きいＤＮＡ分子に関連して
本来は見出されない、この大きいＤＮＡ分子内のＤＮＡの同定可能なセグメント
である。したがって、異種領域が哺乳動物遺伝子をコードするときに、この遺伝
子は通常、ソース(source)生物のゲノム中の哺乳動物ゲノムＤＮＡに隣接してい
ないＤＮＡによって隣接される。他の例では、異種ＤＮＡは、２種類の異なるソ
ースからの遺伝子部分が融合タンパク質産物を作製するように一緒になっている
構築体中のコーディング配列を包含する。対立遺伝子変化（allelic variation)
又は天然生成突然変異イベントは、本明細書で定義したようなＤＮＡの異種領域
を生じない。

【００３１】 本明細書で用いる限り、“プロモーター”なる用語は、その調節が本発明のグ
リーン蛍光タンパク質の発現と産生とに影響を及ぼす、任意の核酸配列を意味す
る。

【００３２】 転写及び翻訳制御配列は、宿主細胞におけるコーディング配列の発現を生じる
、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネータ
ー等のようなＤＮＡ調節配列である。

【００３３】 本明細書に述べたアミノ酸は“Ｌ”異性体形であることが好ましい。しかし、
“Ｄ”異性体形である残基が、免疫グロブリン結合の望ましい機能的性質がポリ
ペプチドによって保有されている限り、任意のＬ−アミノ酸残基に代わることが
できる。ＮＨ₂はポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を意味する
。 ＣＯＯＨはポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を意味す
る。標準ポリペプチド命名法、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２〜
５９（１９６９）に一致して、アミノ酸残基の略号を下記対応表に示す：

【００３４】 Ｙ Ｔｙｒ チロシン Ｇ Ｇｌｙ グリシン Ｆ Ｐｈｅ フェニルアラニン Ｍ Ｍｅｔ メチオニン Ａ Ａｌａ アラニン Ｓ Ｓｅｒ セリン Ｉ Ｉｌｅ イソロイシン Ｌ Ｌｅｕ ロイシン Ｔ Ｔｈｒ トレオニン Ｖ Ｖａｌ バリン Ｐ Ｐｒｏ プロリン Ｋ Ｌｙｓ リシン Ｈ Ｈｉｓ ヒスチジン Ｑ Ｇｌｎ グルタミン Ｅ Ｇｌｕ グルタミン酸 Ｗ Ｔｒｐ トリプトファン Ｒ Ａｒｇ アルギニン Ｄ Ａｓｐ アスパラギン酸 Ｎ Ａｓｎ アスパラギン Ｃ Ｃｙｓ システイン

【００３５】 本明細書では、全てのアミノ酸残基配列を左と右の配向がアミノ末端からカル
ボキシ末端への慣用的な方向である式によって表す。さらに、アミノ酸残基配列
の最初又は最後におけるダッシュが１個以上のアミノ酸残基の他の配列へのペプ
チド結合を意味することに注目すべきである。上記表は、本明細書に交互に出現
しうる三文字表記法と一文字表記法とを関連付けるために提示する。

【００３６】 本発明は、ＩκＢとグリーン蛍光タンパク質とを含む融合タンパク質を開示す
る。１態様において、このタンパク質は野生型グリーン蛍光タンパク質である。
他の態様では、このタンパク質はヒト化グリーン蛍光タンパク質である。好まし
くは、このタンパク質は強化グリーン蛍光タンパク質である。

【００３７】 本発明はまた、ＩκＢ／ＧＦＰ融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子に
も関する。さらに、本発明はこの単離ＤＮＡ分子を発現することができるベクタ
ーを述べる。さらに、本発明はこのベクターによってトランスフェクトされた細
胞系に関する。

【００３８】 本発明はまた、ＩκＢ−ＧＦＰ融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子を
発現するベクターを細胞中に導入する工程と；前記細胞に問題の化合物を接触さ
せる工程と；ＧＦＰ誘導蛍光の量を測定する工程とを含む、前記問題の化合物に
よるＮＦκＢの活性化を測定する方法であって、前記化合物によるＧＦＰ誘導蛍
光の減少によって、前記化合物がＮＦκＢを活性化することが示される前記方法
に関する。ＧＦＰ誘導蛍光の減少はＩκＢの分解に直接比例する。

【００３９】 次の実施例は、本発明の種々な実施態様を例示するために提供するものであり
、如何なる形式でも本発明を限定することを意味しない。

【００４０】 実施例１ＩκＢα−ＥＧＦＰ融合タンパク質の作製 ＩκＢαとＥＧＦＰとをコードするｃＤＮＡｓをＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ
によって増幅させた。ＩκＢαは、５’末端にＳａｃＩＩ認識配列を組み込み、
３’末端にＢａｍＨＩ配列を組み込むプライマーによって増幅させた。ＥＧＦＰ
と共にオープンリーディングフレームを作製するために、ＩκＢαの終止コドン
をＰＣＲ増幅中に欠失させた。ＥＧＦＰは、５’末端にＢａｍＨＩ認識配列を組
み込み、３’末端にＥｃｏＲＩ配列を組み込むプライマーによって増幅させた。
増幅したＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩ部位においてライゲートさせ、得られた融合
構築体（ＩκＢα−ＥＧＦＰ）を、テトラサイクリン（Ｔｃ）調節発現系に用い
るためにｐＴＲＥ発現ベクターのＳａｃＩＩ部位とＥｃｏＲＩ部位にクローニン
グした（Ｇｏｓｓｅｎ Ｍ．とＢｕｊａｒｄ Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９，５５４７〜５５５１）。

【００４１】 実施例２融合タンパク質を発現するＨｅｌａ細胞系の確立 安定な細胞系を作製するために、ＤＮＡ構築体をＨｅｌａ Ｔｅｔ−オフ（ｏ
ｆｆ）細胞中にｐＴＫ−Ｈｙｇと共に同時トランスフェクトさせた。Ｈｅｌａ
ｔｅｔ−オフ細胞は、ｔｅｔ−リプレッサーとヘルペス単純ウイルスＶＰ１６（
ｔＴＡ）との融合タンパク質によって前トランスフェクトされた(pre-transfect
ed)Ｈｅｌａ細胞である。この前トランスフェクションはｐＴＲＥベクター上の
遺伝子発現を可能にし（ＧｏｓｓｅｎとＢｕｊａｒｄ，同上）、次には、これが
ｔｅｔ−リプレッサー結合要素により修飾ＣＭＶプロモーターに結合することに
よって、転写を開始する。この結合はテトラサイクリンによって阻止することが
できるので；発現をテトラサイクリンによって制御することができる。トランス
フェクトされた細胞をハイグロマイシン含有培地中で培養して、薬物耐性細胞を
選択した。次に、薬物耐性コロニーを蛍光顕微鏡下でグリーン蛍光クローンに関
してスクリーニングした。蛍光クローンを選択して、移した。

【００４２】 実施例３蛍光分析 蛍光顕微鏡下での観察を可能にするために、細胞をカバー−スリップの上部で
培養した。トランスフェクション後に、細胞をカバースリップ上で３７℃におい
て２４時間インキュベートし、次に、４％パラホルムアルデヒドによって３０分
間固定した。このカバー−スリップをＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ Ｍｏｄｅ
ｌ ５０蛍光顕微鏡による蛍光検査のためにガラススライド上に取り付けた。タ
ンパク質ターンオーバー(turnover)を測定するために、パラホルムアルデヒド固
定の前に細胞を種々な時間にわたってＴＮＦによって処理した。トランスフェク
トされた細胞をＥＤＴＡ処理によって回収し、細胞ペレットを０．５ｍｌのＰＢ
Ｓ中に再懸濁させた。この細胞懸濁液をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイト
メーター(flow cytometer)（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ
Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて蛍光強度に関して分析した。ＥＧＦＰを４８８ｎｍ
において励起させ、発光を５１０／２０帯域通過フィルターを用いて検出した。

【００４３】 ＦＡＣＳ分析のために、トランスフェクトされた細胞をＥＤＴＡ処理によっ
て回収し、細胞ペレットを０．５ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。この細胞懸濁
液をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｓ
ａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて蛍光強度に関して分析した。ＥＧＦＰを４８８
ｎｍにおいて励起させ、発光を５１０／２０帯域通過フィルターを用いて検出し
た。

【００４４】 実施例４ウェスタン・ブロット分析 ウェスタン・ブロット分析のために、トランスフェクトされた対照細胞をＰＢ
Ｓ中に回収し、音波処理して、細胞溶解物(lysate)を調製した。タンパク質をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ＩκＢα−ＥＧＦＰ融合タンパク質を膜上に
移した後に、ＩκＢα−ＥＧＦＰ融合タンパク質をＧＦＰに対するモノクローナ
ル抗体によって検出した。この検出を化学発光検出キット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）
によって可視化した。

【００４５】 実施例５ＩκＢαＥＧＦＰの特徴付け ｐＴＲＥ−ＩκＢαＥＧＦＰ構築体とｐＴＫ−ハイグロマイシン構築体とを同
時トランスフェクトし、耐性コロニーを選択し、蛍光顕微鏡下で蛍光に関してス
クリーニングすることによって、ＩκＢα−ＥＧＦＰ融合タンパク質を発現する
安定な細胞系を確立した。２つのクローンが選択されたが、各クローンは単一コ
ロニーに由来するので、全ての単細胞が蛍光発光することになる。このことは観
察と検出とを非常に容易にする。

【００４６】 蛍光の制御をさらに注意深く試験するために、細胞をＴＮＦによって０、２０
、４０、６０及び８０分間処理し、細胞のアリコートを種々な時点において蛍光
強度に関してモニターした。蛍光は処理後に、２０分間後にも迅速に減衰した。
したがって、ＴＮＦ処理の時間を短縮して、実験を繰り返した。細胞をＴＮＦに
よって０、１０、２０及び３０分間処理した、０分間又は１０分間処理した細胞
では蛍光が観察されたが、２０分間及び３０分間処理した細胞では観察されなか
った。これらの結果は、融合タンパク質の蛍光の半減期が約１０〜２０分間であ
ることを示唆する。

【００４７】 次に、フローサイトメトリーを用いて、蛍光の半減期を定量的に分析した。こ
の研究では、細胞をＴＮＦによって０、１０、２０、３０、４０及び５０分間処
理して、分析のために回収した。蛍光は２０分間処理後に基底レベルにまで減衰
し、これは蛍光顕微鏡によって得られた観察と一致した。

【００４８】 融合タンパク質の蛍光半減期をさらに正確に測定するために、細胞をＴＮＦに
よって０、５、１０、１５及び２０分間処理した。結果は、融合タンパク質の蛍
光の半減期が１５分間であり、ＴＮＦ処理Ｈｅｌａ細胞中で測定されたＩκＢタ
ンパク質の半減期に非常に近似することを実証した。ＥＧＦＰタグはＩκＢのＴ
ＮＦ仲介制御もその半減期も変化させない。それ故、融合タンパク質ＩκＢαＥ
ＧＦＰを用いて、ＩκＢ分解をモニターすることができる。

【００４９】 ＴＮＦ仲介ＩＧ分解が細胞増殖依存性であるか否かを試験するために、ＩＧク
ローンの細胞を通常の血清培地中で一晩培養した。細胞を洗浄し、培地を血清を
含まない培地と交換した。次に、増殖停止細胞をＴＮＦによって３０分間処理し
た。増殖停止細胞の蛍光は増殖する細胞に比べて劇的に変化しなかった。蛍光は
まだＴＮＦ処理に敏感であり、このことはＴＮＦ仲介ＩκＢ分解が細胞増殖に無
関係であることを示唆する。

【００５０】 実施例６ＩκＢαＥＧＦＰのさらなる特徴付け 蛍光変化がタンパク質レベルの変化を表し、蛍光に影響を及ぼすと考えられる
外部因子の影響を表さないことを確証するために、組換えＧＦＰに対するモノク
ローナル抗体によるウェスタン・ブロット分析によってタンパク質変化を測定し
た。細胞をＴＮＦαによって０、５、１０、１５及び２０分間処理した。ＩκＢ
αＥＧＦＰ融合タンパク質の分子サイズは、予測された通りに、約６５ｋＤａで
ある。融合タンパク質の存在は、ＴＮＦ処理時間の増大と共に減衰した。１０分
間の処理後に、融合タンパク質の半量以上が消失し、このことは蛍光を測定して
得られた結果、即ち、融合タンパク質の半減期が１５分間未満であることを確証
した。

【００５１】 下記参考文献を本明細書に引用した： l. Chalfie, M., Euskirchen, G., Ward, W. W., and Prasher, D. C. (1994)
Science 263, 802-805. 2. Marshall, J., Molloy, R., Moss, G. W., Howe, J. R. and Hughes, T. E.
(1995) Neuron 14, 211-215. 3. Chalfie, M. (1995) Photochemistry and Photobiology 60, 651-656. 4. Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., an
d Tsien R. Y. (1995) Trends Biochem 20, 448-455. 5. Heim, R., Prasher, D. C., Tsien, R. Y. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 91, 12501-12504. 6. Inouge, S., and Tsuji, F. I. (1994) FEBS Letters 351, 211-214. 7. Cormack, B. P., Valdivia, R. H., and Falkow, S. (1996) Gene 173, 33-
38. 8. Haas, J., Park., E. C., and Seed, B. (1996) Current Biology 6, 315-3
24. 9. Yang, T. T., Cheng, L., Kain, S. R. (1996) Nucleic Acids Research 24
, 4592-4593. 10. Ormo, M., Cubitt, A. B., Kallio, K., Gross, L. A., Tsien, R. Y., Re
mingtonS. J. (1996) Science 273, 1392-1395. 11. Yang, F., Moss, L. G., and Phillips, G. N., Jr. (1996) Nature Biote
chnology 14, 1246-1251. 12. Prasher, D. C. Eckenrode, V. K. Ward, W. W., Prendergast, F. G. and
Cormier, M. J. (1992) Gene 111, 229-233. 14. Lybarger, L., Dempsey, D., Franek, K. J., Chervenak, R. (1996) Cyto
metry 25, 211-220. 15. Rogers, S. R., Wells, R., and Rechsteiner, M. (1986) Science 234, 3
64-368. 16. Ghoda, L., Van Daalen Wetters, T., Macrase, M., Ascherman D., and C
offino, P. (1989) Science 243, 1493-1495. 17. Papavassiliou, A. G., Treier, M., Chavrier, C., and Bohmann, D. (19
92) Science 258, 1941-1944. 18. Scheffner, M., Werness, B. A., Huibregtse, J. M., Levine, A. J., an
d Howley, P. M. (1990) Cell 63, 1129-1136. 19. Li, X., and Coffino, P. (1992) Mol. Cell. Biol. 12, 3556-3562. 20. Goldberg, A. L., and Rock, K. L., (1992) Nature 357, 375-379. 21. Gottesman, S., and Maurizi, M. R. (1992) Microbiol. Rev. 56, 592-62
1. 22. Hershko, A., and Ciechanover, A. (1992) Annu. Rev. Biochem. 61, 761
-807. 23. Rechsteiner, M., Hoffman, L., and Dubiel, W. (1993) J. Biol. Chem.
268, 6065-6068. 24. Bercovich, Z., Rosenberg-Hasson, Y., Ciechanover, A., and Kahana, C
., (1989) J. Biol. Chem. 264, 15949-15952. 25. Rosenberg-Hasson, Y., Bercovich, Z., Ciechanover, A., and Kahana, C
. (1989) Eur. J. Biochem. 185, 469-474. 26. Murakami, Y., Matsufuji, S., Kameji, T., Hayashi, S., Igarashi, K.,
Tamura, T., Tanaka, K., Ichihara, A. (1992) Nature 360, 597-599. 27. Ghoda, L., Phillips, M.A., Bass, K. E., Wang, C. C., and Coffino, P
. (1990) J. Biol. Chem. 265, 11823-11826. 28. Phillips, M.A., Coffino, P., and Wang, C. C. (1987) J. Biol. Chem.
262, 8721-8727. 29. Gossen M., and Bujard H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89,
5547-5551. 30. Ghoda, L., Sidney, D., Macrae, M., and Coffino, P. (1992) Mol. Cell
. Biol. 12, 2178-2185. 31. Li, X., and Coffino, P. (1993) Mol. Cell. Biol. 13, 2377-2383. 32. Loetscher, P., Pratt, G., Rechsteiner, M. (1991) J. Biol. Chem. 266
, 11213-11220. 33. Li, X., Stebbins, B., Hoffman, L., Pratt, G., Rechsteiner, M., and C
offino, P. (1996) J. Biol. Chem. 271, 4441-4446. 34. Li, X., and Coffino, P. (1996) J. Biol. Chem. 271, 4447-4451. 35. Li, X., and Coffino, P. (1994) Mol. Cell. Biol. 14, 87-92.

【００５２】 本明細書に挙げたいずれの特許又は刊行物も、本発明が属する技術分野に熟練
した人々のレベルを示している。これらの特許及び刊行物は、あたかも各刊行物
が特別に、個別に援用されることが示されるかのごとくと同程度に、本明細書に
援用される。

【００５３】 本明細書に挙げた課題を実施し、本明細書に挙げた並びに本明細書に固有の目
的及び利益を得るために、本発明が良好に適合することを、当業者は容易に理解
するであろう。本発明の実施例は、本明細書に述べた方法、手法、処理、分子及
び特定の化合物と共に、現在好ましい実施態様を代表し、例示的であり、本発明
の範囲に対する限定を意図しないものである。特許請求の範囲内によって定義し
た本発明の要旨内に包括されるような、これらにおける変化及び他の用途は当業
者に思いつかれるであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のＩκＢ／ＧＦＰ融合タンパク質の１実施態様を発現するベクターの概
略図を示す。

【図２】 ＩκＢ／ＧＦＰ融合タンパク質を発現するベクターによって安定にトランスフ
ェクトされたＨｅｌａ ｔｅｔ−オフ細胞におけるＴＮＦαによる処理後の蛍光
の減少を例示する。細胞をＴＮＦ−αで処理し、０、１０、２０及び３０分間目
に試験した。０分間及び１０分間処理した細胞では蛍光が観察されたが、２０分
間又は３０分間処理した細胞では観察されなかった。

【図３】 ＩκＢ／ＧＦＰ融合タンパク質を発現するベクターによって安定にトランスフ
ェクトされたＨｅｌａ ｔｅｔ−オフ細胞のフローサイトメトリー分析の結果を
示す。この場合も、細胞をＴＮＦαによって処理し、アリコートを指定時点にお
いて蛍光に関して試験した。結果は、ＩκＢＥＧＦＰ融合タンパク質の半減期が
約１５分間であることを示す。

【図４】 ＧＦＰに対するモノクローナル抗体を用いた、ＩκＢ／ＧＦＰ融合タンパク質
を発現するベクターによって安定にトランスフェクトされたＨｅｌａ ｔｅｔ−
オフ細胞からのタンパク質抽出物のウェスタン・ブロットである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/543 ５７５ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＩκＢとグリーン蛍光タンパク質とを含む融合タンパク質。
2. 【請求項２】 タンパク質が野生型グリーン蛍光タンパク質である、請求項
   １記載のグリーン蛍光タンパク質。
3. 【請求項３】 タンパク質がヒト化グリーン蛍光タンパク質である、請求項
   １記載のグリーン蛍光タンパク質。
4. 【請求項４】 タンパク質が強化グリーン蛍光タンパク質である、請求項１
   記載のグリーン蛍光タンパク質。
5. 【請求項５】 請求項１記載のＩκＢ／ＧＦＰ融合タンパク質をコードする
   単離ＤＮＡ分子。
6. 【請求項６】 請求項５記載の単離ＤＮＡ分子を発現することができるベク
   ター。
7. 【請求項７】 請求項６記載のベクターによってトランスフェクトされた細
   胞系。
8. 【請求項８】 ＩκＢ−ＧＦＰ融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子
   を発現するベクターを細胞中に導入する工程と；前記細胞に問題の化合物を接触
   させる工程と；ＧＦＰ誘導蛍光の量を測定する工程とを含む、前記問題の化合物
   によるＮＦκＢの活性化を測定する方法であって、前記化合物によるＧＦＰ誘導
   蛍光の減衰によって、前記化合物がＮＦκＢを活性化することが示される前記方
   法。
9. 【請求項９】 ＧＦＰ誘導蛍光の減衰がＩκＢの分解に直接比例する、請求
   項８記載の方法。