JP2002511417A

JP2002511417A - 動脈特異的及び静脈特異的タンパク質並びにその使用方法

Info

Publication number: JP2002511417A
Application number: JP2000543151A
Authority: JP
Inventors: ワン，ハイ，ユー．; チェン，チョウフェン; アンダーソン，デイビッド，ジェイ．
Original assignee: California Institute of Technology
Current assignee: California Institute of Technology
Priority date: 1998-04-13
Filing date: 1999-04-13
Publication date: 2002-04-16
Also published as: WO1999052541A2; US7700297B2; US7741272B2; AU3745999A; JP2014111624A; US20010024650A1; US20060035328A1; JP2010053134A; EP1133310B1; US20050204412A1; US6864227B1; US20030207447A1; AU763483B2; US6916625B2; WO1999052541A3; EP1133310A2; CA2325563A1; US6579683B2

Abstract

(57)【要約】動脈内皮細胞と静脈内皮細胞とは、血管形成の最も初期段階において分子的に区別される。この特徴は、そのレセプターＥｐｈＢ４が静脈細胞で発現される、ＥｐｈｒｉｎＢ２と呼ばれる膜貫通リガンドの動脈細胞における発現により表わされる。ＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子の標的破壊は、毛細管叢から正しい枝状構造への静脈の再構築を妨げる。さらに、それは、動脈の再構築も破壊し、そのため、予め特定された動脈及び静脈内皮細胞間の相互の（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）相互作用が血管形成に必須であることを示唆する。この特徴を用いて、例えば、血管形成を変化させる方法、動脈細胞及び静脈細胞における薬剤の作用を評価する方法ならびに動脈細胞及び（ｎａｄ）静脈細胞を同定及び単離する方法に役立たせうる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願本件出願は、１９９８年５月２２日に出願された米国特許出願第０９／０８３
，５４６号（放棄された）の一部継続出願である、１９９８年５月２８日に出願
された米国特許出願第０９／０８５，８２０号の一部継続出願である。本件出願
は、１９９８年４月１３日に出願された米国特許暫定出願第６０／０８１，７５
７号の利益も主張している。これらの出願のそれぞれの教示は、参照により、全
て本明細書に取り込まれる。

【０００２】発明の背景血管形成のプロセスは、発生と疾患の両方に必須のものである。循環系は、胚
形成の間に発生する最初の器官系であり、発育中の胎児を育てるのに必要なもの
である。冠状動脈疾患等の循環系の疾患は、現代社会における罹患率及び死亡率
の主な原因となっている。従って、血管の増殖を修復し、取り替え、そして促進
することは、臨床研究と薬学の発展の主要な目標である。逆に、発生中の腫瘍へ
新しい毛細管網状構造が内生増殖することは、癌の進行にとって最も重要なこと
である。従って、腫瘍血管新生のこの進行を阻害する薬物の開発は、同じ程度に
重要な治療目的である。どのようにして動脈と静脈がその性質の異なる独自性を
獲得しているのかという問題にはほとんど関心が払われていなかった。事実、多
くの人々は、動脈と静脈との間の解剖学的かつ機能的な違いは、血圧、酸素添加
及び剪断力等の生理学的な影響を反映しているだけであると決めてかかってきた
。どのようにして動脈と静脈がそれぞれの独自性を獲得しているのかというさら
なる知識は、研究と臨床環境の両方において貴重なものであろう。

【０００３】発明の要約本発明は、動脈細胞（動脈内皮細胞）のタンパク質発現であって、かつ静脈細
胞では生じないタンパク質発現に基づき、動脈細胞（動脈内皮細胞を含む）と静
脈細胞とを区別する方法、並びに研究及び臨床環境に有用なものを含み、２つの
細胞型の間で発現が異なることに基づく、広く多様な工程、方法及び物質の組成
物に関する。本明細書に記載されているように、動脈内皮細胞（動脈）と静脈内
皮細胞（静脈）との間に分子的な違いがあり、動脈内皮細胞と静脈内皮細胞は、
特に各細胞型を同定し、分離し、標的にし、操作し、又は他の状態に進行させる
（他から分離される）ことに使用できる分子マーカーを産することが示されてい
る。結果として、動脈と静脈は、今では互いに区別することができ、動脈と静脈
を構成する細胞型を、個々に又は別々に、研究、診断及び治療目的のために、他
の遺伝分子学的な違い又は機能的な違いについて評価して標的にし、操作し、又
は他の状態に進行することができる。

【０００４】本発明は、動脈細胞を静脈細胞と区別し分離する方法、さらに詳しくは、動脈
内皮細胞を静脈内皮細胞とそれぞれの分子マーカーに基づいて区別し分離する方
法；薬物又は薬剤を動脈又は静脈に選択的にターゲティングし或いは送達する方
法；動脈特異的な又は静脈特異的な分子マーカーの機能若しくはそれらの間の相
互作用を変化させる（増強又は阻害する、ここで、「阻害する」とは、部分的又
は完全に阻害することを含む）方法（従って、効果を増強又は阻害することで、
かかる機能又は相互作用が動脈内皮細胞又は静脈内皮細胞に生じる）；並びに動
脈細胞（より詳しくは、動脈内皮細胞）又は静脈細胞（より詳しくは、静脈内皮
細胞）に選択的に作用する薬物についてスクリーニングする方法に関する。

【０００５】本発明は、動脈細胞分子マーカー又は静脈細胞分子マーカーをコードする遺伝
子が、物理的に又は機能的に改変されたトランスジェニックマウス等のトランス
ジェニック非ヒト哺乳動物、及び特に動脈又は静脈のいずれかを明視化し、改変
された分子マーカーの機能を評価し、そしてその機能に影響を与える（増強又は
阻害する）薬物を同定するための「指示マウス（indicator mice) 」としてのそ
れらの使用にも関する。さらに、動脈細胞特異的マーカー又は静脈細胞特異的マ
ーカーを結合する抗体；動脈細胞特異的マーカー又は静脈細胞特異的マーカーを
それぞれ含有し、発現することによって動脈又は静脈を標的とするウイルス又は
他のベクター；さらなる動脈特異的又は静脈特異的遺伝子についてスクリーニン
グ対象のライブラリーを調製するのに有用なｃＤＮＡ、並びに単離された動脈内
皮細胞由来、静脈内皮細胞由来、又は本発明のトランスジェニック動物（例えば
、マウス）由来の不死化細胞株に関する。

【０００６】動脈細胞又は静脈細胞に対する分子マーカーは、これらの細胞型のうちの一方
で発現され、他方で発現されないあらゆる遺伝子産物（タンパク質又はＲＮＡ又
はその組み合わせ）である。かかるマーカーは、動脈内皮細胞特異的（動脈特異
的）な又は静脈内皮細胞特異的（静脈特異的）な産物又はタンパク質であり得る
。特定の態様においては、これらは、それぞれ動脈内皮細胞特異的（動脈特異的
）リガンド及び静脈内皮細胞特異的（静脈特異的レセプターと呼ばれ得る。かか
る分子マーカーは、動脈又は静脈内皮細胞に加えて細胞型で発現され得るが、動
脈及び静脈内皮細胞の両方で発現されない。分子マーカーには、例えば、ｍＲＮ
Ａ、リガンド−レセプター対のメンバー、及び接着タンパク質、転写因子又は両
方の細胞型で発現されない抗原等の他のタンパク質が含まれ得る。一つの態様に
おいて、前記分子マーカーは、動脈又は静脈に作用する増殖因子に対するレセプ
ターである膜レセプターである。他の態様において、前記分子マーカーは、動脈
又は静脈内皮細胞で発現されるが、両方では発現されない内皮細胞表面リガンド
−レセプター対のメンバーである。例えば、本明細書で詳細に記載しているよう
に、Ｅｐｈｒｉｎファミリーのリガンドのメンバー及びそのレセプターであるＥ
ｐｈファミリーのレセプターのメンバーは、それぞれ動脈内皮細胞及び静脈内皮
細胞に対する分子マーカーであり、２つの細胞型を区別するのに有用なものであ
る。動脈内皮細胞で発現されるが、静脈内皮細胞では発現されない任意のＥｐｈ
ｒｉｎファミリーリガンドと、動脈内皮細胞特異的リガンドを結合する静脈内皮
細胞特異的Ｅｐｈファミリーレセプターとを使用して、動脈と静脈とを区別する
ことができる。

【０００７】一つの態様において、本発明は、動脈内皮細胞がＥｐｈｒｉｎファミリーリガ
ンドを発現し、静脈内皮細胞が動脈内皮細胞で発現されるＥｐｈｒｉｎファミリ
ーリガンドのレセプターであるＥｐｈファミリーレセプターを発現するという知
見；動脈細胞（動脈）と静脈細胞（静脈）とを区別又は分離する方法；薬物又は
薬剤を動脈又は静脈に選択的に標的にし送達する方法；Ｅｐｈｒｉｎファミリー
リガンド同種Ｅｐｈファミリーレセプター対のメンバーの少なくとも一つと該方
法に有用な薬物の活性を変化する（増加、低減又は延長する）等により、腫瘍に
おける血管新生を含む血管形成を増強又は阻害する方法；並びに動脈又は静脈に
選択的に作用する薬物についてスクリーニングする方法に関連している。

【０００８】さらに、動脈に印を付けるが静脈に印を付けない、ｔａｕ−ｌａｃＺ（ｔｌａ
ｃＺ）挿入物を含むＥｐｈｒｉｎＢ２ノックアウトマウス、又はレポーター構築
物（例えば、ｌａｃＺ又はアルカリホスファターゼ遺伝子）をＥｐｈＢ４遺伝子
座に含むＥｐｈＢ４ノックアウトマウス等の、Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンド
をコードする改変遺伝子又はＥｐｈファミリーレセプターをコードする改変遺伝
子を有する、トランスジェニックマウス等のトランスジェニック非ヒト哺乳動物
、これらのマウスを「指示マウス」として使用して血管形成プロセス（例えば、
腫瘍血管新生及び虚血関連心臓新生血管形成）を明確にし、可視化する、又はイ
ンビボで動脈又は静脈における血管形成的な又は抗血管形成的な作用について薬
物をスクリーニングする方法；並びにトランスジェニックマウス由来の、不死化
細胞等の細胞に関連する。本発明は、動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎファミリーレセプ
ターを結合する抗体（例えば、ＥｐｒｈｉｎＢ２を結合する抗体）；静脈特異的
Ｅｐｈファミリーレセプターを結合する抗体（例えば、ＥｐｈＢ４を結合する抗
体）；Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンド（例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２）又はＥｐ
ｈファミリーレセプター（例えば、ＥｐｈＢ４）をそれぞれコードするＤＮＡを
含み、発現することにより、脈管特異的遺伝子治療について動脈又は静脈を標的
にするウイルス又は他のベクター；追加の動脈特異的又は静脈特異的遺伝子につ
いてスクリーニング対象のライブラリーを調製するのに有用なｃＤＮＡ（その遺
伝子産物は、順番に、動脈特異的又は静脈特異的薬物標的となりうる）、及び単
離された動脈もしくは静脈内皮細胞、それら由来の不死化細胞株、又はこれらの
細胞から形成された人工血管の移植により、ダメージを受けた動脈又は静脈を修
復又は取り替える方法にも関連する。

【０００９】本明細書に記載され、当業者に公知であるように、Ｅｐｈｒｉｎファミリーリ
ガンドは２つのサブクラス（ＥｐｈｒｉｎＡとＥｐｈｒｉｎＢ）に分類され、Ｅ
ｐｈファミリーレセプターは２つのグループ（ＥｐｈＡとＥｐｈＢ）に分類され
る。また、公知のように、各サブクラス又はグループ内で、個々のメンバーはア
ラビア数字で示される。本発明は、具体的にＥｐｈｒｉｎＢ２とＥｐｈＢ４に関
して明細書に記載されている。しかしながら、同様の動脈特異的な及び静脈特異
的な発現を示す他のＥｐｈｒｉｎファミリーリガンド−Ｅｐｈファミリーレセプ
ター対とそれらの使用も本発明の対象である。同様の動脈特異的及び静脈特異的
対は、当業者に公知の方法によって同定することができる。

【００１０】発明の詳細な説明本明細書に記載されるように、動脈及び静脈は、胚発生の初期段階から遺伝学
的に区別され、動脈と静脈との間の相互の（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）相互作用が
正しい脈管形成に必須であることが示されている。この知見は、胚脈管構造の基
礎個体発生解剖学についてのわれわれの考え方を劇的に変えるだけでなく、動脈
内皮細胞と静脈内皮細胞とを物理的かつ機能的に区別するための手段をも提供す
る。結果として、２つの細胞型を互いに分離する手段；他の動脈特異的又は静脈
特異的遺伝子を同定する手段；動脈又は静脈に対する薬物又は他の薬剤の選択的
な作用を評価し、かくして、動脈特異的又は静脈特異的であるものを同定する手
段；並びにそれぞれの細胞型に物質を選択的に送達又は標的とする手段も利用で
きる。さらに、本明細書に記載された研究は、脈管形成及び血管形成を調節（増
強又は阻害）する或いは制御を可能にし、必要とあれば、動脈特異的又は静脈特
異的な方法でそのようにすること可能にしている。

【００１１】実施例に記載されているように、神経系及び血管系に存在する細胞膜関連リガ
ンドをコードする遺伝子は成体マウスにおいて動脈内皮細胞で発現され、静脈内
皮細胞では発現されないことが示されている。さらに、該リガンドのレセプター
をコードする遺伝子は、静脈内皮細胞で発現されるが、動脈細胞では発現されな
いことが示されている。従って、初め、動脈内皮細胞で見られるマーカー（動脈
特異的マーカー）と静脈内皮細胞（静脈特異的）マーカーが利用可能であり、血
管形成機構のさらなる研究や理解；動脈又は静脈に対する処置又は治療の選択的
ターゲティング（動脈をターゲティングするが逆に静脈をターゲティングしない
）並びに動脈及び／又は静脈の形成、増殖及び生存の選択的調節（増強又は阻害
）等の様々な目的のために動脈と静脈を区別することを可能にしている。

【００１２】さらに、実施例にある研究は、動脈と静脈との間の相互のシグナル伝達が管形
態形成（動脈と静脈の発生／形成）に非常に重要であることを示す。記載されて
いるように、マウスにおけるリガンドをコードする遺伝子の欠失は、動脈と静脈
の両方の血管の正確な発生を妨げた。リガンドは、動脈に存在する（が、静脈に
存在しない）ため、静脈欠損の発生は、静脈が管形態発生について動脈からのシ
グナルを必要としている証拠である。逆に、動脈は変異マウスでも欠損している
ため、リガンドは、静脈にシグナル伝達する役割に加えて、動脈細胞自身に機能
を有する。動脈内皮細胞に存在するリガンドが膜貫通構造であるという事実を考
慮すると、静脈からの相互のシグナルを受けとり、そのシグナルを動脈細胞に変
換するように機能するようである。

【００１３】特に、Ｅｐｈファミリーレセプター相互作用タンパク質のＥｐｈｒｉｎファミ
リーのメンバーであるリガンド（膜貫通リガンドのＥｐｈファミリー）は、動脈
内皮細胞で発現されるが、静脈内皮細胞で発現されないことが示されている。従
って、今ではＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドとレセプター型プロテインチロシ
ンキナーゼのＥｐｈファミリーのメンバーであるそのレセプターの存在又は非存
在に基づいて、動脈と静脈とを区別又は標的にすることが可能である。本明細書
に記載されているように、動脈内皮細胞は、ＥｐｈｒｉｎＢ２を発現することが
示され、静脈内皮細胞はＥｐｈｒｉｎＢ２レセプターであるＥｐｈＢ４を発現す
るこが示されている。ＥｐｈｒｉｎＢ２は静脈内皮細胞で発現されず、ＥｐｈＢ
４は動脈内皮細胞で発現されないので、２つ細胞型を同定又は区別することがで
きる手段、及びそれにより、動脈内皮細胞と静脈動脈細胞が、例えば、お互いに
分離され得、選択的にターゲティングされ又は選択的な様式（例えば、他方を排
除して一方の細胞型に作用する薬物又は薬剤により）で作用され得る方法を提供
する。例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２に又はその細胞外ドメインに結合する抗体は、
蛍光標識したり、細胞の混合物に結合させることができ、次いで、これらを蛍光
活性化セルソーティングに供して混合物から動脈の細胞を選択する。

【００１４】本明細書、特に実施例に記載した研究は、ＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４に
関連している。しかしながら、いかなるＥｐｈｒｉｎ／Ｅｐｈファミリー由来の
リガンド−レセプター対、いかなる他のリガンド−レセプター対又は１つの細胞
型で産生され、もう１つでは産生されないいかなる遺伝子産物（例えば、Ｅｐｈ
ｒｉｎリガンドは動脈内皮細胞で発現されるが、静脈内皮細胞では発現されず、
Ｅｐｈレセプターは静脈内皮細胞で発現されるが、動脈内皮細胞で発現されない
）をも使用して、動脈内皮細胞と静脈内皮細胞とを区別又は同定し、従って、選
択的に作用することができる。

【００１５】ｅｐｈｒｉｎ（リガンド）には２つの構造型があり、それは配列関係に基づい
てさらに分類することができ、機能的には優先的な結合に基づき、それらが２つ
の類似のレセプターサブグループを示す。構造的には、２つの型のｅｐｈｒｉｎ
がある：グリセロホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合で膜固定されたも
のと膜貫通ドメインを経て固定されたもの。慣習的には、リガンドが、ＥｐｈＡ
レセプターに優先的に結合するＧＰＩ結合タンパク質であるＥｐｈｒｉｎ−Ａサ
ブクラス、と通常、ＥｐｈＢレセプターに優先的に結合する膜貫通タンパク質で
あるｅｐｈｒｉｎＢサブクラスとに分類される。

【００１６】Ｅｐｈファミリーレセプターは、エリトロポエチン産生ヒト肝細胞性癌細胞株
での発現について名付けられたレセプター、Ｅｐｈに関連するレセプター型プロ
テインチロシンキナーゼのファミリーである。それらはその細胞外ドメイン配列
との関連及びｅｐｈｒｉｎＡタンパク質又はｅｐｈｒｉｎＢタンパク質に優先的
に結合する能力に基づいて２つのサブグループに分類される。ｅｐｈｒｉｎＡタ
ンパク質と優先的に相互作用するレセプターはＥｐｈＡレセプターであり、ｅｐ
ｈｒｉｎＢタンパク質と優先的に相互作用するレセプターはＥｐｈＢレセプター
である。

【００１７】本明細書で使用されているように、ＥｐｈｒｉｎとＥｐｈという用語は、それ
ぞれリガンドとレセプターを示すように使用されている。それらは、様々な動物
（例えば、哺乳動物／非哺乳動物、ヒトを含む脊椎動物／非脊椎動物）由来もの
であり得る。当該分野の名称は急速に変わってきており、本明細書で使用される
用語は、Ｅｐｈノーメンクラッチャー・コミッティー（Eph Nomenclature Commi
ttee) による研究の結果として提案されているものであり、これはウェブサイト
http://www.eph-nomenclature.com.で以前から使用されている名称に加えて、ア
クセスすることができる。便宜上、ｅｐｈレセプターとそのそれぞれのリガンド
を表に挙げる。

【００１８】

【表１】

【００１９】本明細書に記載された研究は、下記に論じられる多くのリサーチ及び臨床適用が
ある。

【００２０】本明細書で用いられるように、トランスジェニックマウスは、ヒトの操作によ
り、いくつか又は全てのその有核細胞のゲノムに取り込まれた、該マウス又は少
なくとも１種のその祖先に導入されている遺伝子改変を有するものである。トラ
ンスジェニックマウスは、例えば、妊娠マウス卵へのＤＮＡの導入又は胚性幹細
胞へのＤＮＡの導入によりもたらされる。

【００２１】本発明の１つの態様は、その特定の遺伝子型のため、静脈細胞にのみ又は動脈
細胞にのみにおいて、例えば、ＲＮＡのインサイチューハイブリダイゼーション
により、蛍光により、酵素活性の検出により、又は抗体結合と、結合した抗体の
検出系とによる遺伝子産物の検出により、そのＲＮＡ転写物又はポリペプチド遺
伝子産物が検出されうる遺伝子を発現するトランスジェニックマウスである。

【００２２】本発明の特定の態様は、遺伝子型ＥｐｈｒｉｎＢ２^+/-のトランスジェニック
マウスであり、ここで、「マイナス」対立遺伝子は、天然由来の対立遺伝子が、
欠失、改変又は指示遺伝子の挿入を有しうる変異対立遺伝子を含む変異対立遺伝
子で置換された対立遺伝子を示す。かかる「マイナス」対立遺伝子は、野生型、
改変又は非リガンド機能を有するＥｐｈｒｉｎＢ２リガンドをコードしうる。遺
伝子型ＥｐｈｒｉｎＢ２^+/tlacZのマウスは、実施例１に記載されるように生産
されており、動脈内皮細胞と静脈内皮細胞とが発生の初期段階から遺伝学的に異
なること及び血管の２つのタイプ間に、正しい毛細血管床形成に必要な相互の相
互作用が生じることを示すのに用いられた。同じ表現型のトランスジェニックマ
ウスは、当業者に公知の他の方法により生産されうる。かかる方法は、例として
、ＥｐｈｒｉｎＢ２を用いて下記に示されるが、他のいかなる静脈又は動脈特異
的遺伝子に対しても用いられうる。

【００２３】例えば、前記ＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子に挿入、欠失又は１以上の点変異を保持
したベクターも産生できる。ＥｐｈｒｉｎＢ２トランスジーンは、ワグナー（Ｗ
ａｇｎｅｒ）ら、米国特許第４，８７３，１９１号明細書（１９８９）の方法に
より妊娠卵にトランスジーンを導入すること又は胚性幹（ＥＳ）細胞にトランス
ジーンを導入すること〔例えば、キャペッチ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．）、
Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２８８−１２９２、１９８９〕又は他の方法により
、突然変異を起こしたＥｐｈｒｉｎＢ２対立遺伝子を保持したベクターを介して
ゲノムに導入され得る。

【００２４】トランスジェニックノックアウトマウスを構築するのに用いられるＤＮＡの挿
入は、そのなかに、その宿主細胞にＧ４１８に対する耐性を付与するｎｅｏなど
のその存在がただちに試験され得る遺伝子、を有しうる。それは、Ｅｐｈｒｉｎ
Ｂ２^+/-指示マウス（例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２プロモーターの制御下に、マウ
スにより内因的に発現しないいかなる遺伝子でもありうる指示遺伝子を発現しう
るＥｐｈｒｉｎＢ２^+/taulaczの利点である。特に有利な指示遺伝子は、Ｅｐｈ
ｒｉｎＢ２発現の検出をしやすくするものであり、恐らく、例えば、その固有の
吸光性質、発色産物を生じる基質に作用するその能力又はそれ自体が検出可能で
ある指示物又は色素に結合する能力によって、検出可能な遺伝子産物の生産によ
り、野生型対立遺伝子に生じるものであろう。

【００２５】さらに、別法は、例えば、酵母の（ｌｏｘＰ部位に作用する）Ｃｒｅ又は（Ｆ
ＲＴ部位に作用する）ＦＬＰ１などの部位特異的レコンビナーゼにより、静脈又
は動脈において特異的に発現した遺伝子（すなわち、静脈特異的又は動脈特異的
遺伝子）の条件付けノックアウト又は組織特異的ノックアウトを産生するのに利
用できる。

【００２６】バクテリオファージＰ１Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え系は、ＥＳ細胞及びトラン
スジェニックマウスの両方におけるｌｏｘＰ部位特異的組換えを媒介することが
できる。部位特異的レコンビナーゼＣｒｅは、予め確立された細胞系において、
又は発生のある段階でも用いられうる。例えば、Ｔ細胞からＤＮＡポリメラーゼ
β遺伝子セグメントを欠失させた、グ（Ｇｕ，Ｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６５
：１０３−１０６、１９９４を参照のこと；Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換えが、マウス
前頭部における細胞に限定されたツァィエン（Ｔｓｉｅｎ，Ｊ．Ｚ．）ら、Ｃｅ
ｌｌ８７：１３１７−１３２６、１９９６も参照のこと）。ついで、これらの
細胞における変異の影響を解析する。

【００２７】Ｃｒｅレコンビナーゼは、３４ｂｐのｌｏｘＰ認識配列〔ザウワー（Ｓａｕｅ
ｒ，Ｂ）及びヘンダーソン（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５１６６−５１７０、１９８８〕間の組換え
を触媒する。ｌｏｘＰ配列は、〔「フロックス（ｆｌｏｘｅｄ）」遺伝子をつく
る〕目的の遺伝子の１以上のエキソンに隣接するように相同組換えにより胚性幹
細胞のゲノムに挿入される。前記挿入が、遺伝子の正常発現を妨害しないことが
非常に重要である。フロックス遺伝子についてマウス同型接合体は、慣用の技術
により、これらの胚性幹細胞から産生され、組織型又は細胞型特異的転写プロモ
ーターの制御下に、Ｃｒｅトランスジーンを保持する第２世代マウスと交配させ
る。フロックス遺伝子について同型であり、Ｃｒｅトランスジーンを保持する子
孫において、Ｃｒｅ遺伝子関連プロモーターが活性なこれらの細胞型においての
み、フロックス遺伝子はＣｒｅ／ｌｏｘＰ組換えにより欠失されるであろう。

【００２８】静脈特異的又は動脈特異的遺伝子における変異により引き起こされた表現型を
模擬する効果を有するように作用するタンパク質をコードした遺伝子も、静脈特
異的又は動脈特異的遺伝子におけるノックアウトと同様の効果を達成するのに用
いられうる。

【００２９】レセプターへのリガンドの結合を妨げるか、又はかかる結合の機能重要性を妨
げ、それにより静脈又は動脈特異的遺伝子ノックアウト（例えば、ドミナントネ
ガティブ変異体）の表現型を複製する産物をコードする遺伝子における変異がノ
ックアウトへの別法として用いられうる。変異遺伝子は、その機能が阻害される
べきものである組織特異的遺伝子産物に依存して、静脈又は動脈において発現さ
せるべき組織特異的プロモーターの制御下に置かれうる。

【００３０】さらに、誘導に際して、遺伝子機能の阻害効果を研究することができるように
、動脈特異的又は静脈特異的遺伝子の１以上のドミナントネガティブ対立遺伝子
が誘導可能なプロモーターの制御下に置かれうる。ドミナントネガティブ変異体
は、変異導入及びトランスジェニックマウスを作製する方法により単離又は構築
されうる。

【００３１】所望の変異体又は野生型対立遺伝子を同定するための試験又は他の対立遺伝子
を同定するための試験は、適切なプライマーを用いて、単離ゲノムＤＮＡでのＰ
ＣＲ、又は適切なハイブリダイゼーションプローブを用いたサザンブロット、こ
れらの手法の組み合わせ、又は他の方法により行なわれうる。

【００３２】本明細書の実施例に記載された指示マウスの使用に加えて、動脈細胞にしるし
づけすることができる指示遺伝子を有するマウスの使用の１つは、動脈の増殖に
おける薬物の作用を試験する方法である。前記方法は、動脈に特異的に発現され
る遺伝子に挿入された指示遺伝子を有するマウス（例えば、胚、新生児、未成熟
個体、成体、任意の祖先における創傷箇所、腫瘍、虚血病変又は動静脈形成異常
）に薬物を投与すること、及び指示遺伝子を有し、該薬物で処理されてないが同
一の条件下に維持された適切な対照マウスにおける作用に比較して、動脈の増殖
における該薬物の作用を観察することを含みうる。静脈細胞をしるしづけする指
示遺伝子を有する指示マウスにおいて、類似の試験を行なってもよい。前記薬物
の作用は、例えば、増殖を促進すること、増殖を阻害すること又は異常増殖を促
進することでありうる。薬物の投与は、当業者に公知のいかなる適切な経路でも
あり得る。

【００３３】動脈細胞に特異的に発現する遺伝子に挿入された指示遺伝子を有する指示マウ
スは、血管の増殖及び発生におけるその作用を試験するべきものである遺伝子に
おける変異を保持する他の株のマウスと交配させ、動脈細胞に特異的な変異の作
用の容易な可視化を可能にする。前記記載のものに類似した試験において、薬物
の作用は、この交配の型から生じたマウスにおいて、例えば、変異の作用が、該
薬物により軽減されうるかどうかを見るために、評価されうる。同様に、静脈細
胞に特異的に発現する遺伝子に挿入された指示遺伝子を有する指示マウスが、静
脈の増殖におけるその作用が評価対象である変異を有するマウスと交配するのに
用いられ得、得られたハイブリッドは静脈の増殖の研究に用いられる。

【００３４】本明細書に記載された研究の結果、細胞表面の動脈特異的又は静脈特異的遺伝
子産物の存在を利用することにより、動脈内皮細胞（動脈）及び静脈内皮細胞（
静脈）の間を区別することができる。動脈内皮細胞と静脈内皮細胞とは、例えば
、哺乳動物組織試料から動脈又は静脈組織を除くこと、物質に結合していない細
胞から該物質に結合した細胞を分離することを容易にするある性質又は特性（例
えば、標識又はタグを与える分子、又は動脈特異的細胞表面タンパク質及び他の
型の分子の両方に親和性を有する分子）を有する物質に細胞を適切な条件下に結
合させうる細胞を解離することにより、他の組織型の細胞からそれぞれ単離する
ことができる。細胞の分離は、結合した物質の性質を利用することができる。例
えば、前記物質は、動脈内皮細胞に特異的なタンパク質（又は該タンパク質の十
分な抗原性部分）に対して生じさせ、かつフルオロクロム、ビオチン又は他の標
識で標識した抗体（抗血清、ポリクローナル又はモノクローナル）でありうる。
前記物質に結合した細胞の分離は、蛍光標識について蛍光活性化セルソーティン
グ（ＦＡＣＳ）、ビオチン標識についてストレプトアビジンアフィニティーカラ
ム、他のアフィニティーに基づく分離法又は、例えば、抗体結合磁気ビーズ又は
固体支持体によりなされうる。本明細書において用いられる、細胞に関する「単
離」とは、細胞が、開始群と比較して、ある細胞型が富化された群となるように
他の細胞型から分離されることを示し、１つの細胞型を１００％含む群の場合に
限定されない。

【００３５】他の分離手段が、動脈又は静脈特異的タンパク質をコードする遺伝子における
指示挿入物を産する血管細胞に関し利用され得、指示遺伝子産物又は融合タンパ
ク質の部分の性質は、指示挿入物によりコードされる。例えば、緑色蛍光タンパ
ク質部分又は青色蛍光タンパク質部分を有する動脈又は静脈特異的融合タンパク
質を産生する細胞は、セルソーターにより非蛍光細胞から分離されうる。動脈又
は静脈特異的タンパク質部分と指示タンパク質又は結合活性もしくは酵素活性を
有する部分とを有する融合タンパク質を産生する細胞は、融合タンパク質が蛍光
物質、例えば、β−ガラクトシダーゼ又はβ−ラクタマーゼの基質に結合する能
力あるいは細胞における蛍光産物を産生する能力により検出されうる。

【００３６】動脈内皮細胞の単離及び静脈内皮細胞の単離は、培地中におけるこれらの細胞
型の試験に関して、種々の薬物、増殖因子、リガンド、サイトカイン、Ｅｐｈ及
びＥｐｈｒｉｎファミリーのレセプターやリガンドのメンバー、細胞表面タンパ
ク質に結合する分子、又は動脈及び静脈の増殖と発生において作用をもたらしう
る他の分子の作用を評価することを可能にする。１以上のこれらの物質を、培地
に添加することができ、これらの添加物の作用を（例えば、増殖速度又は生存性
の測定、酵素アッセイ、細胞表面成分の存在についてのアッセイ、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ又はタンパク質などの高分子への標識前駆体の取り込みなどにより）評価しう
る。

【００３７】単離された動脈内皮細胞又は単離された静脈内皮細胞は、人工増殖培地におい
て維持され得、不死化細胞株は、培地において細胞を効率よく形質転換すること
が知られているいくつかのウイルスの１つを用いた（例えば、レトロウイルス、
ｖ−ｍｙｃ又はＳＶ４０Ｔ抗原などの不死化オンコジーンの導入による）感染
により、かかる単離細胞型それぞれから生産（すなわち「形質転換」）されうる
。前記ウイルスは、感染性の種特異性（例えば、マウス細胞に対するネズミエコ
トロピックウイルス；ヒト細胞に対する両種性又は偽型ウイルス）に関して選択
されうる。ウイルスによる形質転換の別法として、細胞は、１以上の増殖因子を
含む培地で細胞を増殖させることにより、培地で維持されうる。

【００３８】静脈細胞又は動脈細胞のいずれか由来の不死化細胞株は、これらの組織のそれ
ぞれにおいて盛んに発現した遺伝子の研究を容易にするためのｃＤＮＡライブラ
リーの創出に用いられうる。さらに、かかる細胞株を用いて、細胞において発現
したタンパク質を、例えば、馴化増殖培地又は細胞自体からタンパク質を精製す
ることにより単離及び同定しうる。

【００３９】動脈又は静脈起源の不死化細胞株を用いることの１つの別法として、非動脈も
しくは非静脈起源（例えば、他の組織由来の内皮細胞、又は繊維芽細胞）の細胞
又は細胞株を、（１以上の非内因的に発現した遺伝子の導入により）遺伝学的に
改変して、動脈特異的又は静脈特異的細胞表面タンパク質を発現させることがで
き、レセプター−リガンド相互作用を妨害する物質を検出及び同定する方法に使
用されうる。

【００４０】細胞株への１以上の遺伝子の導入は、１以上の遺伝子の挿入を有するように構
築されたベクターを用いて、形質転換、例えば、エレクトロポレーション、リン
酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン又はリポソームによりなされうる。アウス
ベル（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、補遺４０までの補遺を含む、Ｃｕｒｒｅ
ｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第９
章、Ｆａｌｌ、１９９７、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏ
ｒｋを参照のこと。また、細胞株における発現対象の１以上の遺伝子の導入は、
ウイルス感染、例えば、レトロウイルスにより達成されうる。レトロウイルス遺
伝子転移は、全細胞群に遺伝子をうまく導入するのに用いられており、それによ
りクローン変異に関連する問題を取り除く。

【００４１】静脈及び動脈細胞を区別し単離する能力は、広範種々の目的に対する広範種々
の応用を可能にする。次に、動脈及び静脈に対する、例えば、薬物、診断薬など
の種々の薬剤及び環境／食餌性因子の作用を評価し、観察された作用が、両方の
細胞の型に共通であるか一方の細胞型に特異的であるかを決定することができる
。

【００４２】例えば、血管形成及び抗血管形成因子又は薬物が、同等に動脈及び静脈細胞に
作用することは、もはや仮定できない。本研究により可能にされた、これらの組
織のこれらの細胞型の単離は、動脈又は静脈特異性について、これらの血管形成
及び抗血管形成因子を試験することを可能にし、これは、これらの薬物のより選
択的な臨床適用を提供するであろう。それは、不死化動脈又は静脈内皮細胞株の
高処理量スクリーニングなどによる新規な動脈又は静脈選択的薬物の発見をも可
能にするであろう。また、既存の薬物は、ターゲティングデバイス（例えば、リ
ポソーム又はウイルス表面にタンパク質もしくはその細胞外ドメイン部分を有す
るウイルス賦形剤）として、本明細書に記載のタンパク質を用いることにより、
動脈又は静脈にも選択的に標的化し、薬物（例えば、化学結合剤）を一方の型の
静脈又は他方に送達する。例えば、動脈特異的薬剤を用いて、動脈の側副枝増殖
を促進し、冠状動脈閉塞又は虚血病変を回避しうる。

【００４３】動脈及び静脈における選択的作用〔血管形成性又は抗血管形成性、血管緊張（
ｖａｓｏｔｅｎｓｉｏｎ）に作用する又はアテローム性動脈硬化型斑の形成を阻
害する〕について薬剤をスクリーニングする多くのアプローチがある。例えば、
化合物又は分子の高処理量スクリーニングは、動脈もしくは静脈に選択的に又は
ある場合にはその両方に作用する薬剤又は薬物を同定することが行なわれうる。
動脈又は静脈細胞におけるそれらの作用に関して評価対象の試験薬剤は、合成に
より作製された、組換え技術により作製された、又は天然供給源から単離された
いかなる化学物質（エレメント、分子、化合物）でもあり得る。例えば、試験薬
剤は、ペプチド、ポリペプチド、ペプトイド、糖類、ホルモン類又はアンチセン
ス核酸分子などの核酸分子でありうる。また、試験薬剤は、例えばライブラリー
に集められた、小分子又はコンビナトリアル・ケミストリーにより作製されたよ
り複雑な分子でありうる。これらのライブラリーは、例えば、アルコール類、ハ
ロゲン化アルキル類、アミン類、アミド類、エステル類、アルデヒド類、エーテ
ル類及び他のクラスの有機化合物を含有しうる。また、試験薬剤は、溶解物又は
細胞−−細菌、動物もしくは植物−−の増殖培地から単離された天然産物又は遺
伝子工学産物であり得、あるいは細胞溶解物もしくは増殖培地自体でありうる。
試験系に対する試験化合物の提示は、特に最初のスクリーニングステップにおい
て、単離された型又は化合物の混合物のいずれかでありうる。

【００４４】スクリーニングされる化合物又は分子（集合的に、薬剤又は薬物という）は、
血管形成、抗血管形成活性、抗プラーク活性もしくは血管作用性を有することが
既に公知であるもの、又は作用が未知であるものでありうる。公知の作用を有す
るこれらの薬剤の場合、スクリーニングは、動脈内皮細胞又は静脈内皮細胞に選
択的に作用するこれらの薬物を同定するのに有用であろう。未知の作用を有する
これらの薬剤の場合、スクリーニングは、血管形成、抗血管形成活性、抗プラー
ク活性もしくは血管作用性を有する薬物を新規に同定すること、及びそれらが作
用する細胞型（動脈、静脈）を確立するのに有用である。例えば、動脈又は静脈
起源の不死化細胞株は、化合物のライブラリーをスクリーニングして、動脈又は
静脈特異的薬物作用を有する薬物を同定するのに用いられうる。

【００４５】１つの態様において、アッセイを行ない、不死化細胞への標識リガンド−Ｆｃ
融合タンパク質又はレセプター−Ｆｃ融合タンパク質の結合の阻害により、Ｅｐ
ｈＢ４レセプターへのＥｐｈｒｉｎＢ２の結合などのそのＥｐｈレセプターへの
Ｅｐｈｒｉｎリガンドの結合又はその逆を特異的に阻害する薬物をスクリーニン
グしうる。一方、かかるライブラリーをスクリーニングし、不死化細胞への標識
リガンド−Ｆｃ融合タンパク質又はレセプター−Ｆｃ融合タンパク質の結合の増
強により、そのＥｐｈレセプターへのＥｐｈｒｉｎリガンドの結合を増強するメ
ンバーを同定しうる。ついで、このスクリーニングにより同定された薬物を動物
モデル（例えば、癌、動静脈形成異常又は冠状動脈疾患のモデル）で試験して、
それらのイン・ビボ活性を評価しうる。

【００４６】動脈特異的細胞表面分子（例えば、動脈内皮細胞特異的表面分子）と静脈特異
的細胞表面分子（例えば、静脈内皮細胞特異的表面分子）との相互作用を阻害す
る薬物は、例えば、動脈内皮細胞特異的表面分子及び静脈内皮細胞特異的表面分
子を、細胞特異的分子間の相互作用に適した条件下で、該細胞特異的分子間の相
互作用の阻害能力の評価対象薬物と混合する方法で同定しうる。細胞特異的分子
は、両者が懸濁物中のインタクト細胞（例えば、単離された動脈もしくは静脈内
皮細胞、これら由来の不死化細胞、又は動脈もしくは静脈特異的細胞表面分子を
発現するように改変された細胞）に見出されるように、本アッセイにおいて用い
られてもよい；一方の細胞型は個体支持体に固定され、他方の細胞型に特異的な
他の分子は可溶型で適切な溶液中に存在する；あるいは、他方の細胞型に特異的
な分子は、細胞特異的分子の相互作用を可能にする溶液中において遊離している
ことが見出されるが、一方の細胞型に特異的な分子は固体支持体に固定される。
他の変法は、２つの異なる細胞特異的分子間の相互作用の簡便な評価を可能にし
うる。

【００４７】本アッセイのさらなるステップにおいて、前記薬物の存在下に、及び別の試験
（対照）において、薬物の非存在下に、細胞特異的分子が相互作用する度合いを
決定する。細胞特異的分子の相互作用が評価対象薬物の存在下及び非存在下に生
じる度合いを比較する。細胞特異的分子の相互作用が生じる度合いが、薬物の非
存在下よりも薬物の存在下のほうが、より少ない場合、該薬物は、動脈内皮細胞
特異的分子と静脈内皮細胞特異的分子との相互作用を阻害するものである。細胞
特異的分子の相互作用が生じる度合いが、薬物の非存在下よりも薬物の存在下の
ほうが、より多い場合、該薬物が、動脈内皮細胞特異的分子と静脈内皮細胞特異
的分子との相互作用を増強するものである。

【００４８】２つの細胞表面分子、動脈に特異的な一方のものと静脈に特異的な他方のもの
との相互作用（例えば、リガンドとそれを認識するレセプターとの結合；接着タ
ンパク質間の相互作用；細胞表面タンパク質と細胞表面の炭水化物部分との間の
相互作用）を妨害する物質を同定するアッセイの１つの態様において、細胞表面
分子（例えば、静脈由来細胞株又はＥｐｈレセプターを発現するように遺伝子操
作された他の細胞などのＥｐｈレセプターを発現する細胞）を、標識リガンド（
例えば、ｅｐｈｒｉｎリガンド、その可溶性部分、又は細胞外ドメインとＩｇＧ
のＦｃドメインとの融合物などの可溶性融合タンパク質）か又は標識リガンドプ
ラス試験化合物もしくは試験化合物群かのいずれかと接触させる。細胞に結合し
ている標識リガンドの量を決定する。前記試験化合物（群）と接触させた試料に
おける標識のより少ない量（ここで、該標識は、例えば、放射活性アイソトープ
、蛍光又は発色性標識でありうる）は、該試験化合物（群）が結合を妨害するこ
との指標である。リガンド（例えば、Ｅｐｈｒｉｎリガンド又はその可溶型）を
発現する細胞を用いる相互アッセイを用いて、レセプター又はその可溶性部分の
結合を妨害する物質を試験しうる。

【００４９】動脈特異的及び静脈特異的細胞表面タンパク質間の相互作用を妨害する物質を
同定するアッセイは、固体支持体と結合した、試験化合物と競合しない成分（例
えば、細胞、融合タンパク質及び結合活性を有する部分を含む精製タンパク質）
を用いて行なわれ得る。固体支持体は、いかなる適切な固相；ビーズ、プレート
の壁もしくは他の適切な表面（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）な
どのマトリックス；カラム孔ガラス（ＣＰＧ）又はウェル中などの溶液内に沈め
ることができるピンでもありうる。固体支持体への細胞又は精製タンパク質の結
合は、直接又は１以上のリンカー分子を介するものでありうる。

【００５０】哺乳動物からの動脈特異的又は静脈特異的タンパク質を発現する遺伝子の単離
に際して、該遺伝子は、組換えタンパク質又は融合タンパク質の生産のための発
現系に取り込まれ、その後、単離及びイン・ビトロでの該タンパク質の試験が行
なわれうる。また、単離又は精製タンパク質は、タンパク質に特異的に結合する
薬剤のデザインを可能にするさらなる構造的研究に用いられ得、該タンパク質の
レセプター又はリガンド活性のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用しうる
。

【００５１】１つの態様において、単離又は精製動脈特異的もしくは静脈特異的タンパク質
は、化学架橋又は単離もしくは精製タンパク質に対して生じさせた抗体を介する
ものなどの標準技術により、適したアフィニティーマトリックスに固定化し、固
体支持体に結合させうる。前記マトリックスを、カラム又は他の適切な容器に充
填することができ、タンパク質への該化合物の結合に適した条件下に、試験対象
の１以上の化合物（例えば、混合物）と接触させる。例えば、化合物含有溶液は
、マトリックスを介して流れるようになされうる。前記マトリックスは、適切な
洗浄緩衝液を用いて洗浄して、非結合化合物及び非特異的結合化合物を除くこと
ができる。結合したままの化合物は、適切な溶離緩衝液により、遊離されうる。
例えば、溶離緩衝液のイオン強度又はｐＨにおける変化は、化合物の遊離を導き
うる。一方、溶離緩衝液は、遊離成分又は化合物の結合を破壊するようにデザイ
ンされた成分（例えば、適切な１以上のリガンドもしくはレセプター、あるいは
結合を破壊しうるか又はタンパク質への試験化合物の結合を競合的に阻害しうる
そのアナログ）を含有しうる。

【００５２】本法の他の態様に用いるために、天然に見出されるようなタンパク質において
存在しない第２の部分に連結した動脈特異的もしくは静脈特異的タンパク質の全
部又は一部を含有した融合タンパク質を調製しうる。この目的のために適した融
合タンパク質としては、第２の部分がアフィニティーリガンド（例えば、酵素、
抗原、エピトープ）を含有するものが挙げられる。融合タンパク質は、動脈もし
くは静脈細胞に特異的に発現される遺伝子又はその一部を、アフィニティーリガ
ンドをコードする適切な発現ベクターに挿入することにより産生されうる。発現
ベクターは、発現に適した宿主細胞に導入されうる。宿主細胞を破砕し、アフィ
ニティーマトリックスへの融合タンパク質のアフィニティーリガンド部分の結合
に十分な条件下に、該細胞材料とアフィニティーマトリックスとを接触させるこ
とにより、融合タンパク質を含む細胞材料を適切なアフィニティーマトリックス
に結合しうる。

【００５３】本態様の１つの概念において、融合タンパク質のアフィニティーリガンド部分
をマトリックスに結合するに十分な条件下に、融合タンパク質を適切なアフィニ
ティーマトリックスに固定化し得、結合した融合タンパク質のレセプター又はリ
ガンドタンパク質部分への化合物の結合に適した条件下に、融合タンパク質を試
験対象の１以上の化合物（例えば、混合物）に接触させうる。ついで、結合融合
タンパク質を有するアフィニティーマトリックスを適切な洗浄緩衝液で洗浄し、
特異的に結合した化合物の結合を顕著に破壊することなく、非結合化合物及び非
特異的結合化合物を除去しうる。結合したままの化合物を、それに結合した融合
タンパク質を有するアフィニティーマトリックスと適切な溶離緩衝液（化合物溶
離緩衝液）とを接触させることにより遊離しうる。この概念において、化合物溶
離緩衝液は、アフィニティーマトリックスにより融合タンパク質を保持すること
を可能にするように調製され得るが、融合タンパク質のレセプター又はリガンド
タンパク質部分への試験された化合物の結合を妨害するように調製されうる。例
えば、溶離緩衝液のイオン強度又はｐＨにおける変化は、化合物の遊離を導き、
あるいは該溶離緩衝液が、遊離成分又は融合タンパク質のレセプターもしくはリ
ガンドタンパク質部分への化合物の結合を破壊するようにデザインされた成分（
例えば、１以上のリガンドもしくはレセプター又は融合タンパク質のレセプター
もしくはリガンドタンパク質部分への化合物の結合を破壊しうるそのアナログ）
を含有しうる。

【００５４】固定化は、適宜、融合タンパク質を化合物に接触させる前、同時に又は後に行
いうる。試験される化合物、選択される親和性マトリックス及び溶離緩衝液の組
成などの要因によって方法の種々の変更が可能である。例えば、洗浄工程の後、
化合物が結合した融合タンパク質を、適当な溶離緩衝液（マトリックス溶離緩衝
液）により親和性マトリックスから溶離することができる。融合タンパク質が、
トロンビン切断部位などの切断可能なリンカーを有する場合、親和性リガンドか
らの切断により、化合物が結合した融合タンパク質の一部分が放出されうる。結
合した化合物は、次いで、抽出などの適当な方法により融合タンパク質又はその
切断産物から放出されうる。

【００５５】該方法により一種以上の化合物を同時に試験しうる。化合物の混合物を試験す
る場合、先述の方法により選択される化合物を、（適宜）分離し、適当な方法（
例えば、ＰＣＲ、シークエンシング、クロマトグラフィー）により同定しうる。
コンビナトリアル・ケミストリーによる合成又はその他の方法により製造される
化合物（例えば有機化合物、ペプチド、核酸）のラージ・コンビナトリアル・ラ
イブラリー（Large combinatorial library ）を試験しうる（例えば、Ohlmeyer
, M.H.J.ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-110926 (1993) 及びDeWi
tt, S.H.ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993) これらは標識
化合物に関する；又、Rutter, W.J.ら、米国特許第5,010,175 号公報； Huebner
, V.D.ら、米国特許第5,182,366 号公報；及び Geysen,H.M.、米国特許第4,833,
092 号公報参照のこと）。本発明の方法によってコンビナトリアル・ライブラリ
ーから選択された化合物が特有の標識を有する場合、クロマトグラフィー法によ
る個々の化合物の同定が可能である。化合物が標識を有しない場合、例えば、ク
ロマトグラフィーによる分離、続いて構造を確認するための質量分光測光分析を
、該方法によって選択された個々の化合物を同定するのに使用することができる
。

【００５６】動脈又は静脈に対して選択的に作用する薬物を同定するのに有用なインビボア
ッセイも利用可能である。それは、本明細書に記載されているようなトランスジ
ェニック動物を用いて行われ、それにより血管形成のプロセスを可視化すること
が可能になる。例えば、動脈はすべてマーキングするが静脈はしないｔａｕ−ｌ
ａｃＺ挿入物などのマーカーを含有するＥｐｈｒｉｎＢ２ノックアウトマウスを
、種々のインビボアッセイに使用することができる。使用しうる他のマーカー遺
伝子は、例えば、アルカリホスファターゼ、ブルー蛍光タンパク質又はグリーン
蛍光タンパク質を発現する遺伝子である。マウス又はそれが含有する標的対立形
質を、静脈とは独立して、動脈における腫瘍血管形成及び虚血関連性心臓新生血
管形成などの血管形成のプロセスを研究するのに使用しうる。例えば、腫瘍細胞
を指示マウスに移植することができ、腫瘍内での動脈血管増殖をｌａｃＺ染色に
より可視化することができる。あるいは、標的対立形質を有するマウスを、血管
変性又は新生血管形成などの別の状態のマウスモデルと交雑させて、可視化する
ことができる。該プロセスの動脈特異的局面を、ｌａｃＺ染色により視覚的にモ
ニターすることができる。このタイプのインジケーターも、薬物の血管形成作用
又は抗血管形成作用を評価するのに使用することができる。

【００５７】動脈内皮細胞（動脈）により特異的に産生されるが他の細胞型によっては産生
されない遺伝子産物は、薬物、診断薬剤、タグ用標識、組織学的染色、又は他の
物質の、動脈への特異的ターゲティングを可能にする。同様に、静脈内皮細胞（
静脈）により特異的に産生されるが他の細胞型によっては検出可能に産生されな
いと同定された遺伝子産物は、薬物、診断薬剤、タグ用標識、組織学的染色、又
は他の物質の、静脈への特異的ターゲティング及び送達を可能にする。ターゲテ
ィングビヒクル、標的薬剤及び方法の以下の記載は、動脈内皮細胞により産生さ
れるが静脈細胞によっては産生されない遺伝子産物の例としてＥｐｈｒｉｎＢ２
を、静脈内皮細胞により産生されるが動脈細胞によっては産生されない遺伝子産
物の例としてＥｐｈＢ４を用いて示される。しかしながら、この記載は、これら
の組織の型を同定するのに使用しうる他の動脈特異的遺伝子産物及び静脈特異的
遺伝子産物に対しても充分に等しくあてはまる。

【００５８】動脈におけるＥｐｈｒｉｎＢ２及び静脈におけるＥｐｈ４の示差的発現は、薬
物、診断薬剤、画像形成剤（imaging agent ）、又は他の物質の動脈若しくは静
脈の細胞への特異的ターゲティングを可能にする。ターゲティングビヒクルは、
かかる物質の送達に使用することができる。ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈ４に特
異的に結合するターゲティングビヒクルは、動脈又は静脈のそれぞれの細胞に送
達される物質に結合しうる。該結合は、一以上の共有結合を介して、又は高親和
性の非共有結合により形成されうる。ターゲティングビヒクルは、例えば、抗体
、又は高い特異性でＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈ４のいずれかに結合する他の化
合物でありうる。別の例は、Ｅｐｈ４の細胞外ドメインのアミノ酸配列を有する
水溶性のポリぺプチド、又は該細胞外ドメインの充分な部分（若しくは、Ｅｐｈ
ｒｉｎＢ２への特異的な結合を可能にするに充分類似するコンフォメーションを
与えるアミノ酸配列を有するポリペプチド）であり、それらは、動脈内のＥｐｈ
ｒｉｎＢ２に物質を送達するためのターゲティングビヒクルとして使用しうる。
同様に、ＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列を有する可溶性のポ
リぺプチド、又は該細胞外ドメインの充分な抗原性部分（若しくは、Ｅｐｈ４へ
の特異的な結合を可能にするに充分類似するコンフォメーションを与えるアミノ
酸配列を有するポリペプチド）は、静脈内のＥｐｈ４に物質を標的化するのに使
用しうる。

【００５９】動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎリガンド（例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２）又は静脈特異
的Ｅｐｈレセプター（例えば、ＥｐｈＢ４）に特異的なターゲティングビヒクル
は、インビボ（例えば、治療的及び診断的）適用を有する。例えば、Ｅｐｈｒｉ
ｎＢ２に特異的に結合する抗体は、動脈に標的化される薬物（例えば、抗プラー
ク剤などの治療剤）に結合しうる。あるいは、ＥｐｈＢ４に特異的に結合する抗
体は、薬物を静脈に標的化するのに使用しうる。インビボで検出（例えば、標識
）しうる物質（例えば、放射活性物質）も、動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎリガンド（
例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２）に特異的に結合するターゲティングビヒクルに結合
することができ、コンジュゲートは、動脈を同定するための標識剤として使用し
うる。同様に、検出可能な標識は、静脈特異的Ｅｐｈレセプター（例えば、Ｅｐ
ｈＢ４）に特異的に結合するターゲティングビヒクルに結合して静脈を同定する
ことができる。

【００６０】ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４に特異的なターゲティングビヒクルには、さ
らにインビトロ適用が見出されている。例えば、ＥｐｈＢ４に特異的に結合する
抗体（ポリクローナル又はモノクローナル調製物）などのＥｐｈＢ４特異的ター
ゲティングビヒクルを、組織試料（例えば、ホースラディッシュペルオキシダー
ゼ）のための染色剤として使用することができる物質に結合することができ、試
料中の静脈の同定法が提供される。同様に、ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈｒｉｎ
Ｂ２の細胞外ドメインに特異的に結合する抗体を、動脈の同定において使用する
ことができる。例えば、腫瘍由来又は小児若しくは成人における動静脈形成異常
由来としての生検組織試料において、ＥｐｈｒｉｎＢ２若しくはＥｐｈｒｉｎＢ
２の細胞外ドメインに対する抗体を、動脈組織を同定するため、及び静脈組織と
区別するために使用することができる。

【００６１】形成異常で、痛みを伴うか又は美容的に望ましくない静脈を処理するため、そ
れらに対して作用する薬剤（例えば、抗血管形成因子）を、静脈への局所投与の
ためにＥｐｈＢ４特異的ビヒクルに結合させることができる。例えば、抗血管形
成因子を拡張蛇行静脈内に注射することができる。

【００６２】動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンド（例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２）又
は静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプター（例えば、ＥｐｈＢ４）のいずれかに
指向する標的薬剤も、動脈と静脈の両方に対する作用を生み出すことが望まれる
場合に使用しうる。例えば、抗血管形成薬剤と、ＥｐｈｒｉｎＢ２、ＥｐｈＢ４
のいずれか又は両方に対するターゲティングビヒクルとを含有する標的薬剤の限
定された量を、腫瘍形成の部位又は望ましくない新生血管形成の部位などの、血
管の増殖を阻害することが望まれる血管形成の部位に、並びに血管の増殖及び確
立を増強するために血管新生の増加が望まれる領域に局所的に投与することがで
きる。

【００６３】動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンド（例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２）又
は静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプター（例えば、ＥｐｈＢ４）のアゴニスト
又はアンタゴニストとして作用する物質を、血管形成剤又は抗血管形成剤として
使用することができる。これらの分子を標的化する薬物は、動脈及び静脈の血管
形成に選択的に作用する。例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４に対するモ
ノクロナール抗体は、動脈特異的若しくは静脈特異的な血管形成又は抗血管形成
剤として役立ちうる。ＥｐｈｒｉｎＢ２機能を妨害する薬物（例えば、ブロッキ
ング抗体）を治療の抗血管形成法において使用することができる。Ｅｐｈｒｉｎ
Ｂ２^tlacZ／ＥｐｈｒｉｎＢ２^tlacZ変異マウスにより示される表現型から結論
づけられるように、ＥｐｈｒｉｎＢ２のアンタゴニスト又はＥｐｈＢ４のアンタ
ゴニストは、血管形成を阻害する。ＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４の両方のア
ゴニストである薬剤は、血管形成を促進する。

【００６４】別の例において、ヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合したＥｐｈｒｉｎファミリ
ーリガンドの細胞外ドメイン又はＥｐｈファミリーレセプターの細胞外ドメイン
を含有する可溶性アゴニストを作製することができる。例えば、膜タンパク質の
細胞外ドメインがヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合した、ＥｐｈＢ４又はＥｐｈ
ｒｉｎＢ２のハイブリッドタンパク質を使用することができる（Wang, H.U.及び
D.J.Anderson, Neuron 18:383-396(1997) ）。方法の例については、クラスター
形成したＥｐｈｒｉｎ−Ｂ１／Ｆｃ融合タンパク質に対する細胞の応答に関する
実験に関するStein, E. ら、Genes and Dev. 12:667-678(1998) を参照のこと。
これらのハイブリッド分子の抗ヒトＦｃ抗体とのクラスター形成は、可溶性アゴ
ニスト：Ｅｐｈレセプターに対するＥｐｈｒｉｎ由来「リガンド体（ligand-bod
ies ）」を生じ、逆に、Ｅｐｈｒｉｎに対するＥｐｈ由来「レセプター体」を生
じる。これらのハイブリッド分子の非クラスター形成形態をアンタゴニストとし
て使用することができる。

【００６５】単離された動脈内皮細胞及び単離された静脈内皮細胞のさらなる適用は、単離
された細胞の遺伝的改変、及びこれらの細胞の、該細胞が単離された宿主哺乳動
物への、又は該細胞が適当な種類の血管に取り込まれうる別の適合可能な宿主内
への投与、好ましくは静脈内投与である。このようにして、動脈又は静脈に現れ
る遺伝的欠損の影響は改善されうる。循環する内皮細胞前駆体は、新生血管形成
の部位に移動し、かつ血管に取り込まれうるということが示されている（Asahar
a ら、Science 275:964-967 (1997)）。

【００６６】遺伝子（例えば、変化させた内在性遺伝子、又は由来は異なる生物体から単離
した遺伝子）の細胞への導入は、いくつかの公知の技術のいずれか、例えば、両
種性レトロウイルスによるものなどのようなベクター介在性遺伝子輸送、リン酸
カルシウム、又はリポソーム融合によっても行いうる。

【００６７】宿主哺乳動物において動脈又は静脈に作用を有することを意図した遺伝子を、
単離された動脈細胞又は単離された静脈細胞に、目的の遺伝子をコードする核酸
配列を一種以上含有するウイルスベクターの使用により輸送することができる。
一般に、該核酸配列は、ウイルスベクターのゲノムに組み込まれている。インビ
トロでは、該遺伝子をコードする核酸配列を含むウイルスベクターを細胞と接触
させることができ、感染が起こりうる。次いで、細胞を、例えば、インビトロで
の動脈又は静脈細胞の増殖に対する該遺伝子の作用を研究するために実験的に使
用することができ、あるいは該細胞を治療的使用のために患者に移植することが
できる。遺伝子の導入又は置換により変化する細胞は、患者から得られる生物学
的試料中に存在し、かつ疾患の治療において使用することができ、あるいは、細
胞培養物から得られ、かつインビボ及びインビトロ系における動脈及び静脈の発
生経路を詳細に分析するのに使用できる。

【００６８】目的の遺伝子をコードする核酸配列を含有するウイルスベクターとの接触後、
処理された動脈又は静脈細胞を、当業者に知られた方法に従って患者に戻すか、
又は再投与することができる。かかる治療方法は、エクスビボ治療と呼ばれる場
合がある。エクスビボ遺伝子治療は、例えば、Kasid ら、 Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 87:473 (1990) ； Rosenbergら、New Engl. J. Med. 323:570 (1990)；
Williams ら、 Nature 310476 (1984) ；Dickら、Cell 42:71 (1985) ； Kelle
r ら、 Nature 318:149 (1985)；及びAndersonら、米国特許第5,399,346 号公報
（1994）に記載されている。

【００６９】一般に、治療的及び実験的に使用されうるウイルスベクターが当該技術分野に
おいて知られている。例としては、Srivastava, A.、米国特許第5,252,479 号公
報（1993）； Anderson, W.F. ら、米国特許第5,399,34６号公報（1994）；Ausu
bel ら、"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Inc
.(1998) に記載されたベクターが挙げられる。核酸の細胞への送達のための適切
なウイルスベクターとしては、例えば、複製能欠損レトロウイルス、アデノウイ
ルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）及びコロナウイルスが挙
げられる。レトロウイルスの例としては、ニワトリ白血病−肉腫、哺乳類Ｃ型、
Ｂ型ウイルス、レンチウイルス（Coffin, J.M., "Retroviridae: The Viruses a
nd Their Replication", In: Fundamental Viology、第３版、B.N. Fields ら編
、Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA, (1996) ）が挙げられる。
感染力のメカニズムは、ウイルスベクター及び標的細胞によって異なる。例えば
、ＨｅＬａ細胞のアデノウイルス感染力は、ウイルス表面レセプターへの結合、
続いてレセプター媒介性エンドサイトーシス及び染色体外複製によって生じる（
Horwitz, M.S.,"Adenoviruses" In: Fundamental Virology 、第３版、B.N. Fie
lds ら編、Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA, (1996) ）。

【００７０】本発明を、何ら限定することを意図しない以下の実施例により説明する。

【００７１】実施例実験方法以下の実験方法を、以下の実施例において使用した。

【００７２】ＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子の標的破壊。マウスＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子のＡＴＧ
から開始する２００塩基対プローブ（Bennett, B.D. ら、 Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 92:1866-1870 (1995) ）を、１２９ＳＶＪゲノムライブラリー（Strata
gene）をスクリーニングするのに使用した。いくつかのオーバーラップクローン
の解析により、シグナル配列を含む第一エキソンがＡＴＧの１３１塩基対後方で
終結することが明らかになった。さらに、ファージ解析及びライブラリースクリ
ーニングにより、ＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子の残部は第一エキソンから少なくとも
７塩基対下流に位置することが明らかになった。ターゲティングベクター（Ｆｉ
ｇ．１Ｂ）を構築するため、その３’末端がＡＴＧで終結する３ｋｂのＸｂａＩ
−ＮｃｏＩ断片を５’アームとして使用した。５．３ｋｂのＴａｕ−ｌａｃＺコ
ーディング配列（Mombaerts, P. ら、 Cell 87:675-686 (1996) ）をＡＴＧ後方
にインフレームで融合した。ＰＧＫｎｅｏ遺伝子（Ma, Q.ら、Neuron 20:469-48
2 (1998)）を用いて、第一エキソンの３’側の２．８ｋｂのイントロン配列を置
き換えた。最後に、３．２ｋｂ下流ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片を３’アームと
して使用した。正常な（６ｋｂ）及び標的（９ｋｂ）遺伝子座は、１ｋｂのＨｉ
ｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩゲノム断片でプロービングするとＨｉｎｄＩＩＩ消化によ
り区別される。エレクトロポレーション、選別及びＡＢ−１ＥＳ細胞の胚盤胞
注入を、ＦＩＡＵ選別を省いたこと以外は、本質的に、Ma, Q.ら（Neuron 20:46
9-482 (1998)）に記載のようにして行なった。Ｇ４１８選別を介するＥＳ細胞タ
ーゲティング効率は、１８クローンのうち１クローンであった。ヘテロ接合性雄
におけるＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子座（Ｆｉｇ．１Ｃ）の生殖系列伝達は、１ｋｂ
のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩプローブを用い、成体マウスのテイルＤＮＡのサザ
ンブロッティングにより確認された。続く遺伝子型分類（genotyping）を、ゲノ
ムＰＣＲにより行なった。Ｎｅｏに対するプライマーは、 5'-AAGATGGATTGCACGCAGGTTCTC- 3' （配列番号：１）及び 5'-CCTGATGCTCTTCGTCCAGATCAT- 3' （配列番号：２）である。置き換えたイント
ロンの断片に対するプライマーは、 5'-AGGACGGAGGACGTTGCCACTAAC- 3' （配列番号：３）及び 5'-ACCACCAGTTCCGACGCGAAGGGA- 3' （配列番号：４）である。

【００７３】ＬａｃＺ、ＰＥＣＡＭ−１及び組織学的染色。胚嚢及び卵黄嚢を、Ｅ７．５と
Ｅ１０．０との間で取り出し、冷却した４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで１
０分間固定し、ＰＢＳで２回リンスし、Ｘ−ｇａｌ緩衝液（ＰＢＳ中、１．３ｍ
ｇ／ｍｌのフェロシアン化カリウム、１ｍｇ／ｍｌのフェリシアン化カリウム、
０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭＭｇＣｌ₂、及び１ｍｇ／ｍｌの
Ｘ−ｇａｌ［５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド］、ｐＨ７．２）中で１時間から一晩３７℃で染色した。ＬａｃＺで染色
した胚を後固定し、写真撮影し、又はＰＢＳ中の１５％スクロース及び７．５％
ゼラチンに包埋した後クリオスタット上で薄切した。抗ＰＥＣＡＭ−１抗体（ク
ローンＭＥＣ１３．３、Pharmingen）による全体（whole mount ）又は切片染色
のための方法は、本質的に、Maら（Neuron 20:469-482 (1998)；Fongら、 Natur
e 376:66-70 (1995)）に記載のようにして行なった。ホースラディッシュペルオ
キシダーゼにコンジュゲートした二次抗体をすべてのＰＥＣＡＭ−１染色に使用
した。ＬａｃＺで染色した卵黄嚢をゼラチン中で薄切した後、標準的な方法によ
ってヘマトキシリン対比染色に供した。

【００７４】インサイチューハイブリダイゼーション。凍結切片でのインサイチューハイブ
リダイゼーションを、先に記載（Birrenら Development 119:597-610 (1993) ）
のようにして行なった。全体インサイチューハイブリダイゼーションは、Wilkin
son, D.G. （Whole-mount in situ hybridization of vertebrate embryos. pp.
75-83 In: In Situ Hybridization: A Practical Approach (ed. D.G. Wilkinso
n) IRL Press, Oxford: 75-83 (1992)）によるプロトコルに従った。ＥｐｈＢ２
／Ｎｕｋ及びＥｐｈＢ４／Ｍｙｋ−１のｃＤＮＡを含有するＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔベクター（Stratagene）を、Wang, H.U.及びAnderson, D.J.（Neuron 18:383-
396(1997) ）に記載のようにして作製した。

【００７５】実施例１：マウスにおけるＥｐｈｒｉｎＢ２の標的変異誘発ＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子の標的破壊を、胚幹細胞における相同組換えにより行
なった。ターゲティング計画は、シグナル配列を除去すること及びフレーム内の
Ｔａｕ−ｌａｃＺ指示遺伝子と開始コドンとをインフレームで融合することを含
んだ。ヘテロ接合性（ＥｐｈｒｉｎＢ２^tlacZ/+）胚におけるβ−ガラクトシダ
ーゼの発現パターンは、内在性遺伝子について先に報告されたものと見分けがつ
かない（Bennett, B.D. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1866-1870 (1995)
；Bergemann, A.D. ら、Mol. Cell. Bio. 1995:4921-4929 (1995) ；Wang, H.U.
and Anderson, D.J. Neuron 18:383-396 (1997)）。菱脳及び体節(somites) に
おいて顕著な発現が検出されたが、早くもＥ８．２５で、より低レベルが大動脈
及び心臓において観察された。卵黄嚢における発現は、まずＥ８．５で検出され
た。ヘテロ接合性動物は、表現型としては正常のようであった。ヘテロ接合性胚
において、増殖遅滞がＥ１０で明白であり、Ｅ１１あたりで１００％の浸透度で
致死が生じた。内在性ＥｐｈｒｉｎＢ２ｍＲＮＡの発現は、インサイチューハ
イブリダイゼーションによって検出されず、これは、変異がヌルであることを示
す。体節極性(somite polarity) 、菱脳分割(segmentation)、及び神経冠移動の
体節性パターン化（ここで、ＥｐｈｒｉｎＢ２及び関連リガンドは、以前に、Xu
, W.ら、Development 121:4005-4016 (1995)；Wang, H.U. and Anderson, D.J.
Neuron 18:383-396 (1997)；Krull, C.E. ら、 Curr. Biol. 7:571-580 (1997)
；Smith, A. ら、 Curr. Biol. 7:561-570 (1997) に暗示されている）は、ヘテ
ロ接合性変異胚において、肉眼的には正常のようであった。

【００７６】実施例２：動脈及び静脈におけるＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４の相互発現パ
ターン死につつある変異胚において観察された肥大(enlarged)心臓は、血管系におけ
るＥｐｈｒｉｎＢ２^tlacZの発現の詳細な検査を促した。発現は、動脈において
は一貫して観察されたが、静脈においては観察されなかった。例えば、卵黄嚢に
おいては、卵黄動脈にはつながっているが卵黄静脈にはつながっていない後血管
(posterior vessels) は、該遺伝子を発現し、それはＬａｃＺ染色により検出さ
れた。幹(trunk) において、標識は、背側大動脈、卵黄動脈、臍動脈、及びその
尿嚢脈管叢において検出されたが、臍静脈、前主静脈及び総主静脈（臍静脈は抗
ＰＥＣＡＭ−１抗体で標識される）においては検出されなかった。頭部において
、標識は、内頸動脈の分枝においては見られたが、前主静脈の分枝においてはみ
られなかった。ＥｐｈｒｉｎＢ２ｃＤＮＡプローブとのインサイーチューハイ
ブリダイゼーションにより、動脈におけるｔａｕ−ｌａｃＺの選択発現は、内在
性遺伝子の発現パターンを正確に反映することが確認された。ＥｐｈｒｉｎＢ２
のレセプターである４種のＥｐｈＢファミリー遺伝子並びにＥｐｈＡ４／Ｓｅ
ｋ１（Gale, N.W.ら、 Neuron 17:9-19 (1996)）の発現の検査により、動脈でな
く、卵黄嚢の前部における卵黄静脈及びその分枝を含む静脈におけるＥｐｈＢ４
の相補発現が明らかになった。

【００７７】実施例３：脈管形成は、ＥｐｈｒｉｎＢ２変異胚において正常に起こる幹における主要な血管の形成は、９個の体節胚のｌａｃＺ及びＰＥＣＡＭ−１
の二重染色により検査されたように、ＥｐｈｒｉｎＢ２の欠如により影響されな
かった。ＥｐｈｒｉｎＢ２−ｌａｃＺの発現は背側大動脈及び卵黄動脈において
見られたが、臍主静脈及び後主静脈においてはみられなかった。血管壁にいくら
か拡張及びしわ（wrinkling ）が観察されたが、例えば、背側大動脈、卵黄動脈
、後主静脈及び臍静脈が形成された。同様に、背側大動脈から発生した体節間(i
ntersomitic)血管がこの段階で形成された。Ｅ８．５とＥ９．０との間で、初期
の心内膜が、変異体においてわずかに乱れた(perturb) ようであったが、顕著な
組織破壊がＥ１０で明らかであった。変異卵黄嚢及び胚の両方において、標準的
にはＥ９．５までに赤血球が完全に発生し、循環した。

【００７８】実施例４：ＥｐｈｒｉｎＢ２発現により明らかにされた卵黄嚢動脈及び卵黄嚢静
脈の広範なインターカレーション。卵黄嚢において、卵黄動脈及びその毛細血管網は後部を占有し、そして卵黄静
脈及びその毛細血管網は前部を占有する。始原性毛細血管叢が形成されているが
、再構築がまだ生じていない段階であるＥ８．５では、ヘテロ接合性胚における
ＥｐｈｒｉｎＢ２−ｔａｕｌａｃＺの非対称発現が前部と後部との間の界面で明
白であった。明らかに、静脈の血管から明瞭に分離したより大きな分枝した幹へ
のβ−ガラクトシダーゼ⁺動脈性毛細血管のホモタイプの再構築は、Ｅ９．０と
Ｅ９．５との間で明白であった。この段階では、レセプターＥｐｈＢ４の発現は
、卵黄静脈上で明白に観察されたが、動脈では観察されなかった。従って、動脈
性及び静脈性の内皮毛細血管は、脈管形成の後と血管形成の前では既に分子的に
異なる。

【００７９】卵黄嚢毛細血管叢の模範的な図（Carlson, B.M Patten's Foundations of Emb
ryology (1981)）は、動脈性毛細血管床と静脈性毛細血管床との間に非重複境界
領域を示すが、ＥｐｈｒｉｎＢ２−ｔａｕｌａｃＺの発現は、以前には認識され
ていなかった、卵黄嚢の前後範囲全体にわたる動脈と静脈との間の広範なインタ
ーカレーションの検出を可能にした；これは、ヘテロ接合体において観察された
が、ホモ接合体においては観察されなかった。ちなみにＰＥＣＡＭ及びβ−ガラ
クトシダーゼに対する二重標識により、動脈と静脈との間の境界が、より大きな
血管嵌合を橋渡しする微小血管伸展物間で生じることが明らかになった。

【００８０】実施例５：ＥｐｈｒｉｎＢ２^tlacZ／ＥｐｈｒｉｎＢ２^tlacZ胚の卵黄嚢におけ
る中断された血管形成。卵黄嚢血管形成における欠損は、Ｅ９．０までに出現し、そしてＥ９．５では
明白であった。β−ガラクトシダーゼ染色によって示されるように動脈血管、及
びＰＥＣＡＭ染色によって示されるように嚢の前部の静脈血管の両方について、
毛細管叢段階で再構築が明かにブロックされた。従って、ＥｐｈｒｉｎＢ２リガ
ンド遺伝子の破壊は、ＥｐｈＢ４レセプター発現静脈性細胞における非自立性欠
損、及び動脈自身における自立性欠損の両方を引き起こした。

【００８１】この欠損は、卵黄嚢の前後範囲にわたる動脈及び静脈の両方向の増殖をインタ
ーカレートし得ないことによって達成された。その結果、嚢の中間点でのＥｐｒ
ｈｉｎＢ２発現区域と非発現区域との間に境界が出現した。（しかし、ｌａｃＺ
発現の小さな斑点が前部静脈性叢内で時折観察された。このことは、幾つかの動
脈内皮細胞が、静脈性毛細血管に取り込まれたかもしれないことを示唆する。）
これらの観察は、より大きな血管への毛細血管叢の再構築とこれらの血管のイン
ターカレート増殖との間の密接な関係を暗示する。しかし、胚由来の脈管構造の
卵黄嚢への進入の点で存在する、大きなβ−ガラクトシダーゼ⁺卵黄動脈ならび
に卵黄静脈は、変異体において混乱していないようであった。このことは、変異
が始原性幹脈管構造の形成に影響しないという観察と一致する。また、卵黄嚢表
現型は、内因性血管形成の破壊に起因し、そして胚由来血管の内殖の不全から派
生するものではないことが論じられる。

【００８２】卵黄嚢の切片の組織学的染色（ヘマトキシリン）により、Ｅ１０及びＥ１０．
５で内皮血管と密接に会合した伸長した支持細胞（ｅｌｏｎｇａｔｅｄｓｕｐ
ｐｏｒｔｃｅｌｌ）（間葉細胞又は周皮細胞）の集積が示された。変異卵黄嚢
において、これらの支持細胞はより丸く見えた。このことは、それらの分化にお
ける欠損を示唆する。さらに、ヘテロ接合性卵黄嚢とは対照的に、異なる直径の
血管がＥ９．５で出現し始め、そして血管の直径はＥ１０．５の間に増大し、毛
細血管の直径は、比較的均一であるようであり、そして変異体の年齢に伴って増
大しなかった。Ｅ１０．５で、血管の融合が支持細胞による被包を伴うことなく
生じたかのように、動脈は膨張してみえる。変異体の毛細血管はまた、基底内皮
層から離層し得なかった。

【００８３】実施例６：変異体胚の頭部における、内部頸動脈分枝の不在及び静脈性毛細血管
の欠損した血管形成。卵黄嚢の表現型に類似して、頭部の毛細血管床は、変異体において膨張してい
るようであり、そして始原叢段階で明かに停止した。β−ガラクトシダーゼに対
する染色により、内部頸動脈の最前分枝(anterior-most bracnch) が変異体にお
いて発生し得なかったことが示された。したがって、卵黄嚢の場合とは異なり、
奇形の毛細血管床は、完全に静脈性起始であるにちがいない。しかしながら、前
部の主静脈の前部分枝が形成された。わずかに拡大したが、総合すると、これら
のデータは、頭部において、動脈性毛細血管との正常な相互作用が妨げられる場
合には、静脈性血管形成はブロックされることを示す。頭部及び卵黄嚢において
観察される血管形成欠損は、心臓欠損から派生する結果ではなさそうである（下
記参照）。なぜなら、それらはＥ９．０で始まることが観察されており、そして
胚性血液循環は通常Ｅ９．５まで正常であるようだからである。

【００８４】実施例７：心内膜細胞間のＥｐｈｒｉｎＢ２依存性シグナル伝達は、心筋の小柱
(trabeculae)形成に必要とされる。野生型心臓におけるリガンド及びレセプターの発現の検査は、ＥｐｈｒｉｎＢ
２（ｌａｃＺ染色によって検出される）及びＥｐｈＢ４（インサイチューハイブ
リダイゼーションによって検出される）の両方の心房での発現を示した。リガン
ド及びレセプターの両方の発現をまた、心室において心筋の小柱状伸展物（ｔ
ｒａｂｅｃｕｌａｒｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を裏打ちする内皮細胞にて検出した
。二重標識実験は、リガンド及びレセプターが、異なるが部分的に重複する細胞
群によって発現されることを示唆したが、この方法の解像度では、この重複が、
同一細胞による同時発現又は異なる細胞の密接な会合のどちらを反映するのかを
区別することができない。いずれにせよ、ＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４は、
心臓外の脈管構造とは異なり、心臓の相補的な動脈性（心室性）及び静脈性（心
房性）の区画を規定しない。

【００８５】心臓欠損は、Ｅ９．５で始まり、そしてＥ１０では形態学及び全体量のＰＥＣ
ＡＭ−１染色両方により変異体胚において明かであった。ＥｐｈｒｉｎＢ２発現
心内膜細胞の鎖（ｓｔｒａｎｄ）は依然として観察されたが、切片は心筋の小柱
状伸展物の非存在を示した。従って、リガンドコード遺伝子の変異は、ニューレ
グリン-1遺伝子における変異の作用と同様に、心内膜細胞において非自律的欠損
を引き起こした（Meyer, D. 及びBirchmeier, C, Nature 378:386 〜390 (1995)
）。しかし逆説的に、この場合には、ＥｐｈＢ４レセプターは、ニューレグリン
−１レセプターｅｒｂＢ２及びｅｒｂＢ４の場合と同様に（Lee ら、Nature 378
:394〜398 (1995)；Gassmannら、Nature 378:390〜394(1995) ）、心筋細胞には
発現されず、内心膜細胞において発現される。ＥｐｈｒｉｎＢファミリーリガ
ンド（ＥｐｈＢ１、Ｂ２、Ｂ３及びＡ４）に対する任意の他のレセプターの発
現を、この組織において検出した。このことは、心臓において、内皮細胞間のリ
ガンド−レセプター相互作用が、続いて平滑筋細胞との相互作用に影響しうるこ
とを示唆する。

【００８６】実施例８：ＥｐｈｒｉｎＢ２は、神経管の血管新生に必要とされる。ＥｐｈｒｉｎＢ２^tlacZ／ＥｐｈｒｉｎＢ２^tlacZ胚において、神経管への毛
細血管内殖は生じなかった。代わりに、ＥｐｈｒｉｎＢ２発現内皮細胞は、発生
している脊髄の外部表面と会合したままであった。全内皮ＰＥＣＡＭ−１及びＥ
ｐｈＢ４発現に対するβ−ガラクトシダーゼの比較は、この初期の段階（Ｅ９〜
Ｅ１０）では、ＣＮＳにおいてＥｐｈＢ４を発現する別の静脈性毛細血管網の証
拠を提供しなかった。むしろ、異なるＥｐｈｒｉｎＢ２レセプターであるＥｐｈ
Ｂ２の発現が、以前に報告されたHenkemeyerら、Oncogene 9:1001-1014 (1994
) のように神経管において観察された。ここで、肉眼では形態学的欠損又はパタ
ーンの欠損は検出され得なかった。この場合には、それゆえ、変異は、レセプタ
ー発現細胞において非自律的な表現型を引き起こさず、むしろリガンド発現細胞
における自律的な作用のみを引き起こすようである。

【００８７】実施例９：ＥｐｈｒｉｎＢ２は成体組織においては動脈特異的である。ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２が、動脈特異的様式で成体組織において発現されるかどう
かを決定するために、我々は、ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２^taulacZ／＋ヘテロ接合性マ
ウスにおいてβ−ガラクトシダーゼに対する組織化学的染色を行った。全内皮マ
ーカーであるＰＥＣＡＭ−１に対する抗体染色を、非動脈血管（すなわち、静脈
）を明らかにするために、同一又は隣接した切片において行った。Ｅｐｈｒｉｎ
−Ｂ２は、動脈特異的様式で、心臓、脚部筋、腎臓、肝臓及び脂肪を含む組織に
おいて、成体マウス全体で発現される。発現を、大動脈、細動脈及び最も小さい
直径の毛細血管を含む、あらゆる直径の血管において検出した。以前には、定義
による毛細血管は、動脈及び静脈同一性のいずれをも有さないと考えられていた
。これらの結果は、これが事実ではなく、そして動脈同一性が毛細血管床にまで
拡張されることを示す。

【００８８】成体動脈の切片を、全内皮マーカーとしてＰＥＣＡＭ−１に対する抗体を用い
て、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）に対する組織化学的染色によって二重標
識し、ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−ｔａｕｌａｃＺ発現を明らかにした。ｌａｃＺ（Ｘ
−ｇａｌによる青色）染色は、ｅｐｈｒｉｎＢ２の背部大動脈における発現、下
大静脈における非発現、足骨に隣り合う大腿動脈における発現、大腿静脈におけ
る非発現及び冠状動脈の心外膜動脈における発現、冠状静脈における非発現を明
らかにした。

【００８９】他の切片の同様の染色は、腎臓細動脈、肝臓細動脈及び小筋肉細動脈、ならび
に動脈性毛細血管におけるＥｐｈｒｉｎＢ２の存在を明らかにした。腎臓細静脈
、肝臓静脈及び小筋肉静脈は、ｌａｃＺネガティブであったが、ＰＥＣＡＭ−１
ポジティブであった。

【００９０】腸の脂肪を、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）について染色し、そしてＰＥ
ＣＡＭ−１で標識して、静脈性血管ならびに動脈性血管を明らかにした。Ｅｐｈ
ｒｉｎＢ２は、細動脈及び動脈性毛細血管により細静脈において発現されるが、
ＰＥＣＡＭ−１ポジティブ細静脈において発現されない。さらなる切片は、Ｅｐ
ｈｒｉｎＢ２が、ＰＥＣＡＭ−１ポジティブ非動脈性毛細血管によって包囲され
る動脈性毛細血管によって発現される。

【００９１】実施例１０：Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２は、腫瘍血管新生の間に発現される。腫瘍血管は、後毛細血管（ｐｏｓｔ−ｃａｐｉｌｌａｒｙｖｅｎｕｌｅ）の
細静脈から発生すると考えられていた。ＥｐｈｒｉｎＢ２が腫瘍血管新生の間に
発現されるかどうかという問題に取り組むために、ルイス肺ガンを、ｅｐｈｒｉ
ｎ−Ｂ２^taulacZ／＋ヘテロ接合性雌の背部領域に皮下移植した。１週間後、腫
瘍を取り出し、そして全体量でのβ−ガラクトシダーゼ組織化学のために処理し
た。結果は、ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２が腫瘍血管によって実際に発現されることを明
らかに示す。このことを、β−ガラクトシダーゼ及びＰＥＣＡＭ−１に対する、
このような腫瘍全体の切片の二重染色によって確認した。

【００９２】腫瘍毛細血管によるＥｐｈｒｉｎＢ２発現。ルイス肺ガン（ＬＬＣ）細胞を、
ＥｐｈｒｉｎＢ２−ｔａｕｌａｃＺヘテロ接合性雌の背部領域に皮下移植した。
１週間後、染色のために腫瘍を取り出した。ＥｐｈｒｉｎＢ２ポジティブ動脈性
毛細血管を、末梢の腫瘍組織において観察した。ＰＥＣＡＭ−１での二重標識は
、動脈性毛細血管においてＥｐｈｒｉｎＢ２ｌａｃＺ（青色に染色）及びＰＥ
ＣＡＭ−１（茶色に染色）のシグナルを共存（ｃｏｌｏｃａｒｉｚｅ）させ、そ
してＰＥＣＡＭ−１のみにより標識された非動脈性毛細血管を示す。

【００９３】実施例１１：動脈特異的遺伝子を含有するクローンのスクリーニング使用したスクリーニング手順の要旨を付録Ｉに提供する。手短には、内皮細胞
を、ＰＥＣＡＭ−１に対する抗体（磁気ビーズ又はＦＡＣＳ）でのポジティブ選
択を用いて、分離した胚の卵黄嚢、卵黄動脈又は卵黄静脈から単離した。ｃＤＮ
Ａを、単一の細胞又は少数（約２００）の細胞の溶解物から合成し、そしてＰＣ
Ｒによって増幅した。ｃＤＮＡが、動脈又は静脈の内皮細胞に由来することを確
認するために、各々の細胞プレップから合成したｃＤＮＡを、サザンブロットさ
せ、そして一連のプローブ（チューブリン（遍在して発現される）全内皮プロー
ブＦｌｋｌ及びＦｌｔｌ、及び動脈特異的プローブｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２）を用い
て４つ組でハイブリダイズさせた。Ｆｌｋｌ、Ｆｌｔｌ及びｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２
配列を含むｃＤＮＡを動脈性とみなし、一方、全内皮マーカーを含有するが、ｅ
ｐｈｒｉｎ−Ｂ２を含有しないｃＤＮＡを静脈性と見なした。従って、この手順
におけるｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２プローブの使用は、合成されたｃＤＮＡの動脈特性
対静脈特性を確認するために必須であった。

【００９４】これらのｃＤＮＡからさらなる動脈特異的遺伝子を単離するために、それらを
λファージベクターにクローン化し、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。次いで
、これらのライブラリーに由来するプラークを、単一の細胞又は細胞のプールか
ら作製した動脈又は静脈に特異的なｃＤＮＡプローブを用いて２つ組のフィルタ
ーリフトにおいてスクリーニングした。動脈プローブ対静脈プローブに対して特
質的なハイブリダイゼーションを示したプラークを単離し、そして挿入物を、Ｔ
３〜Ｔ７プライマーを用いて増幅し、そしてｃＤＮＡサザンブロッティングによ
って再分析した。２つの異なる組の動脈−静脈の内皮細胞ｃＤＮＡプローブ（卵
黄の動脈−静脈細胞及び単一の卵黄嚢の動脈及び静脈内皮細胞）をサザンブロッ
トに使用した。ほとんどのクローンが、動脈細胞において強く発現され、そして
静脈細胞によって弱く、又は検出し得ないほどに発現された。最初のスクリーニ
ングは、さらなる動脈特異的遺伝子を単離するために設計された。１２の候補の
動脈特異的クローンを、単一細胞プローブを用いて単離し、一方、１つのクロー
ンを、プールしたプローブを用いて単離した。インビボでのこれらの遺伝子の動
脈特異的発現を、インサイチューハイブリダイゼーション実験によって確認し得
る。これらのような方法は、動脈内皮細胞又は静脈特異的細胞に適用され得る。

【００９５】これらのデータは、単一の内皮細胞から新規の動脈又は静脈に特異的な遺伝子
を単離することが可能であることを示す。このような血管型限定遺伝子は、動脈
内皮細胞と静脈内皮細胞との間の生理学的差異に対する見識を提供し得る。本明
細書中に記載されるような方法は、また、動脈及び静脈に特異的な疾患（例えば
、動脈高血圧症、アテローム性動脈硬化症、深部静脈血栓、及び所定の型の静脈
形成異常）の病因に関連する遺伝子を同定し得る。それらはまた、循環器系のヒ
ト遺伝子障害に関する候補遺伝子を提供しうる。次いで、このような遺伝子の遺
伝子産物は、新規の薬物標的として働き得る。

【００９６】付録Ｉ：新規の動脈又は静脈に特異的な遺伝子を単離するための、単一細胞ＰＣ
Ｒ、３’ｃＤＮＡライブラリー構築及び示差的スクリーニング手順１．形態学的判断基準に基づく、Ｅ１２．５〜Ｅ１４．５の卵黄嚢からの卵黄動
脈及び卵黄静脈の解体。２．３７℃にて４５分間の、コラゲナーゼ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）中での卵黄嚢の
解離。３．以下の方法の内の１つにより、単一又は少数群の内皮細胞（ＥＳ）を単離す
る。ａ）一次抗体としてＰＥＣＡＭ−１を使用する、磁気ビーズに基づく分離。ｂ）ＰＥＣＡＭ−１−ＦＩＴＣ一次抗体を使用する、ＦＡＣＳ精製。ｃ）内皮細胞同定のためのｔｉｅ２−ＧＦＰトランスジェニックマウスに由来す
るＧＦＰ蛍光、続く微細管マウスピペッティング。４．６５℃にて１分間、ＰＣＲチューブ中で単一細胞を溶解させる。５．室温で１〜２分間維持し、オリゴＴをＲＮＡにアニールさせる。６．３７℃にて１５分間の、ＡＭＶ及びＭＭＬＶ酵素を用いた逆転写。７．３７℃にて１５分間の、末端転移酵素及びｄＡＴＰを用いたポリＡ尾部付加
。８．ＰＣＲ反応設定：１００μｌ反応、５倍の通常レベルのｄＮＴＰ混合物、高濃度のＴａｑ。対称な増幅のために、３’末端の２４（Ｔ）を有する単一のＰＣＲプライマー
を使用する。９．各々の細胞プレップに対して増幅したｃＤＮＡにおける、内皮特異的及び動
脈／静脈特異的な３’プローブを用いたｃＤＮＡサザンブロッティング。１０．適切なプローブに対して強いシグナルを生じる少数の良好な細胞を選択す
る。アガロース上で５００ｂｐ〜２ｋｂのｃＤＮＡを単離する。１１．ｃＤＮＡを沈殿させ、そして定量する。１２．λＺＡＰＩＩ（Stratagene;LaJolla, CA）ファージアームにｃＤＮＡライ
ブラリーを連結する。１３．非常に低い密度：１０００ｐｆｕ／プレートでライブラリーをプレーティ
ングする。２つ組のフィルターリフトを取得する。１４．卵黄動脈細胞及び卵黄静脈細胞から作製したプローブを用いて２つ組のフ
ィルターをスクリーニングする。１５．示差的に発現したファージクローンを選出する。卵黄動脈細胞及び卵黄静
脈細胞から作製したプローブでプロービングすることによる、ファージ挿入物の
逆（ｃＤＮＡ）サザンブロット確認。１６．ｃＤＮＡフラグメントの発現パターンを調査するためのインサイチューハ
イブリダイゼーション。

【００９７】実施例１２：ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体
の産生細菌において発現されたｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２のフラグメントに対するポリクロ
ーナルウサギ抗体が以前に報告されたが、このような抗体は、細胞表面上の天然
の形態のタンパク質とは典型的には反応性ではなく、それゆえ、細胞選別、機能
的阻害及び薬物標的化を含む多くの適用には有用ではない。より望ましい結合特
性を有する抗体を産生するために、我々は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞において、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）に連結した形
態としてのｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２の細胞外ドメインを発現させた。ハムスターをこ
れらの細胞で免疫化し、ハイブリドーマをマウス骨髄腫細胞との融合によって調
製し、そして上清をｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−ＧＰＩを発現するＣＯＳ細胞上でスク
リーニングした。

【００９８】クローン＃６Ｅ３は、生存するＣＯＳ細胞上のｅｐｈｒｉｎＢ２に良好に結合
した。ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−ＧＰＩＣＯＳ細胞株は、プールされたＧ４１８選
択細胞群であり、細胞の３０％がｅｐｈｒｉｎＢ２に対してポジティブである。
対照（非トランスフェクション）ＣＯＳ細胞は、同じ抗体で染色した場合にはネ
ガティブであった。

【００９９】実施例１３：数種の抗ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２抗体は、ＥｐｈＢ２−ｅｐｈｒｉｎＢ
２結合相互作用をブロックする抗体がまたブロック機能を有する（すなわち、ｅｐｈｒｉｎＢ−２のそのレセ
プターへのｅｐｈｒｉｎＢ２の結合を阻害する）場合、それらは強力な抗血管形
成剤として使用され得る。このような機能（抗体を阻害する）を同定するアッセ
イを実証するために、我々は、可溶性ＥｐｈＢ２−Ｆｃ融合タンパク質へのＧＰ
Ｉ−ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２（ＣＯＳ細胞において発現される）の結合を減少させる
能力について、１２のハムスター抗ＥｐｈｒｉｎＢ２ハイブリドーマ上清をスク
リーニングした。結合を、¹²⁵Ｉ−標識したヤギ抗ヒトＦｃ抗体によって検出し
た。細胞と種々の上清とのプレインキュベーションにより、これらの上清の全て
が、ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−ＧＰＩに結合する抗体を含むとしても、大多数の抗体
が引き続くレセプター−リガンド結合に対してブロック作用を有さないことが示
された（対照を１００％として）。抗体の１つは、ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−ＧＰＩ
ＣＯＳ細胞へのＥｐｈＢ２−Ｆｃ結合において４０％減少を生じた（Ｆｉｇｕ
ｒｅ２）。

【０１００】均等物本発明は、その好ましい実施態様に関して、特に示され、記載されているが、
添付の請求の範囲で規定されている本発明の意図や範疇から外れることなく、形
式や詳細において種々の変更が本明細書で行われてもよいことが当業者によって
理解されるだろう。当業者であれば、単なる日常的な実験を用いて、本明細書に
詳細に記載された発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確
認することができるだろう。そのような均等物が、特許請求の範囲に含まれるこ
とを意図している。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｆｉｇｕｒｅ１Ａは、Ｅｘｏｎ−１構造を示すＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子の野
生型遺伝子座の図である。黒塗りのボックスは、５’非翻訳領域を示す。網目が
ついたボックスはＡＴＧで開始し、シグナル配列を含む。Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ；
Ｘ＝ＸｂａＩ；Ｎ＝ＮｃｏＩ；Ｅ＝ＥｃｏＲＩ。Ｆｉｇｕｒｅ１Ｂは、ＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子を破壊するのに使用されるタ
ーゲティングベクターの図である。Ｆｉｇｕｒｅ１Ｃは、変異ＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子座を示す概略説明図であ
る。

【図２】Ｆｉｇｕｒｅ２は、ハムスター抗−ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２ハイブリドーマ上清
の存在下でのＧＰＩ−ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２へのＥｐｈＢ２Ｆｃの結合活性を示す
棒グラフである。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年５月１７日（２０００．５．１７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/00 ４Ｃ０８４ 9/10 １０１ 9/10 １０１４Ｃ０８７ 35/00 35/00 ４Ｈ０４５Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｑ 1/04 5/10 1/68 Ａ 15/09 ＺＮＡＧ０１Ｎ 33/48 ＭＣ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/68 5/00 ＥＧ０１Ｎ 33/48 Ｂ (31)優先権主張番号０９／０８５，８２０ (32)優先日平成10年５月28日(1998．5．28) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者チェン，チョウフェンアメリカ合衆国カリフォルニア 91125 パサデナ，ナンバー４，ノースホリストンアベニュー 1317 (72)発明者アンダーソン，デイビッド，ジェイ．アメリカ合衆国カリフォルニア 91001 アルタデナ，グレンビューテラス 2108 Ｆターム(参考） 2G045 AA24 BA13 BB20 CB01 CB17 DA12 DA13 DA14 DA36 DA80 FB02 FB03 FB07 JA03 JA20 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 GA11 GA18 GA27 HA14 HA17 4B063 QA18 QQ02 QQ35 QQ43 QR15 QR32 QR55 QR72 QS02 QS34 QX01 4B065 AA91X AA91Y AB05 CA43 CA44 CA46 4C076 AA95 BB13 BB14 CC11 CC41 EE41 FF68 4C084 AA17 MA66 NA05 NA10 NA13 ZA362 ZA452 ZB262 4C087 AA01 BB65 MA66 NA05 NA10 ZA36 ZA45 ZB26 4H045 AA11 AA20 AA30 CA42 DA50 DA76 EA23 EA34 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】治療上有効量の、動脈特異的細胞表面分子と静脈特異的細胞
表面分子との結合又は相互作用を変化させる薬物を哺乳動物に投与する工程を含
む、哺乳動物の血管形成を変化させる方法。
【請求項２】動脈特異的細胞表面分子が動脈特異的なリガンド又はレセプ
ターであり、かつ静脈特異的細胞表面分子が静脈特異的なレセプター又はリガン
ドである、請求項１記載の方法。
【請求項３】動脈特異的細胞表面分子がＥｐｈｒｉｎファミリーリガンド
であり、かつ静脈特異的細胞表面分子がＥｐｈファミリーレセプターである、請
求項１記載の方法。
【請求項４】血管形成が阻害され、かつ薬物が動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎフ
ァミリーリガンドと静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプターとの結合又は相互作
用を妨げる、請求項３記載の方法。
【請求項５】血管形成が増強され、かつ薬物が動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎフ
ァミリーリガンドとその静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプターとの結合又は相
互作用を増強する、請求項３記載の方法。
【請求項６】薬物が、動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンドのアン
タゴニスト又は静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプターのアンタゴニストである
、請求項３記載の方法。
【請求項７】動脈特異的ＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドがＥｐｈｒｉｎ
Ｂ２であり、かつ静脈特異的ＥｐｈファミリーレセプターがＥｐｈＢ４である、
請求項３記載の方法。
【請求項８】（ａ）薬物、及び（ｂ）動脈特異的細胞表面分子を結合する成分を含有した複合体を、（ｂ）成分が動脈特異的細胞表面分子を結合するのに適し
た条件下で哺乳動物に投与し、それにより該薬物を動脈に送達する工程を含む、
哺乳動物の動脈に薬物を選択的に送達する方法。
【請求項９】動脈特異的細胞表面分子がリガンド又はレセプターである、
請求項８記載の方法。
【請求項１０】動脈特異的細胞表面分子がＥｐｈｒｉｎファミリーリガン
ドである、請求項８記載の方法。
【請求項１１】薬物が抗血管形成剤であり、かつ（ｂ）成分が動脈特異的
Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンドに特異的な抗体、又は動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎ
ファミリーリガンドのレセプターである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】動脈特異的ＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドがＥｐｈｒｉ
ｎＢ２である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】薬物が抗血管形成剤である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】薬物が血管形成剤である、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】薬物がアテローム性動脈硬化班の形成を阻害する、請求項
１２記載の方法。
【請求項１６】（ａ）薬物、及び（ｂ）静脈特異的細胞表面分子を結合する成分を含有した複合体を、（ｂ）成分が静脈特異的細胞表面分子を結合するのに適し
た条件下で哺乳動物に投与し、それにより該薬物を静脈に送達する工程を含む、
哺乳動物の静脈に薬物を選択的に送達する方法。
【請求項１７】静脈特異的細胞表面分子がレセプター又はリガンドである
、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】静脈特異的細胞表面分子が静脈特異的Ｅｐｈファミリーレ
セプターである、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】薬物が抗血管形成剤であり、かつ（ｂ）成分が静脈特異的
Ｅｐｈファミリーレセプターに特異的な抗体、又は静脈特異的Ｅｐｈファミリー
レセプターのリガンドである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】静脈特異的ＥｐｈファミリーレセプターがＥｐｈＢ４であ
る、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】薬物が抗血管形成剤である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】薬物が血管形成剤である、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】動脈細胞で検出可能に発現されるが、静脈細胞では検出可
能に発現されない指示遺伝子を有してなるトランスジェニックマウス。
【請求項２４】指示遺伝子が動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンド
遺伝子に挿入された、請求項２３記載のマウス。
【請求項２５】遺伝子型がＥｐｈｒｉｎＢ２^+/-のトランスジェニックマ
ウス。
【請求項２６】ＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子が全ての動脈を標識するが、静脈
を標識しない挿入物を含有してなる、トランスジェニックマウス。
【請求項２７】遺伝子型がＥｐｈｒｉｎＢ２^taulacZ/+のトランスジェニ
ックマウス。
【請求項２８】指示遺伝子の発現の検出に適した物質でマウスのセクショ
ンを染色する工程を含む、１以上のＥｐｈｒｉｎＢ２対立遺伝子に挿入された指
示遺伝子を有するマウスにおける動脈細胞の同定方法。
【請求項２９】静脈内皮細胞で発現されるが、動脈内皮細胞では発現され
ない指示遺伝子を有してなるトランスジェニックマウス。
【請求項３０】指示遺伝子が静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプター遺伝
子に挿入されている、請求項２９記載のマウス。
【請求項３１】静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプター遺伝子がＥｐｈＢ
４をコードする、請求項３０記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３２】遺伝子型がＥｐｈＢ４^+/-のトランスジェニックマウス。
【請求項３３】指示遺伝子の発現の検出に適した物質でマウスのセクショ
ンを染色する工程を含む、１以上のＥｐｈＢ４対立遺伝子に挿入された指示遺伝
子を有するマウスにおける静脈細胞の同定方法。
【請求項３４】動脈で特異的に発現される遺伝子に挿入された指示遺伝子
を有するマウスに薬物を投与する工程、薬物の作用を観察する工程、及び適切な
対照マウスで呈示されたものと作用を比較する工程を含む、動脈の増殖に対する
薬物の作用の試験方法。
【請求項３５】静脈で特異的に発現される遺伝子に挿入された指示遺伝子
を有するマウスに薬物を投与する工程、薬物の作用を観察する工程、及び適切な
対照マウスで呈示されたものと作用を比較する工程を含む、静脈の増殖に対する
薬物の作用の試験方法。
【請求項３６】ＥｐｈｒｉｎＢ２に結合する分子であって、標識に結合さ
れている分子に組織試料を接触させる工程、及び標識を検出する工程を含み、こ
こで該標識が細胞で検出されれば、該細胞は動脈細胞である、哺乳動物由来の組
織試料中の動脈細胞の同定方法。
【請求項３７】分子が抗体である、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】ＥｐｈＢ４に結合する分子であって、標識に結合されてい
る分子に組織試料を接触させる工程、及び標識を検出する工程を含み、ここで該
標識が細胞で検出されれば、該細胞は静脈内皮細胞である、組織試料中の静脈内
皮細胞の同定方法。
【請求項３９】分子が抗体である、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】ＥｐｈｒｉｎＢ２を結合する部分に結合された物質を含有
した複合体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の動脈へ物質を導入する
方法。
【請求項４１】ＥｐｈＢ４を結合する部分に結合された物質を含有した複
合体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の静脈へ物質を導入する方法。
【請求項４２】動脈特異的細胞表面タンパク質の細胞外ドメインを含有し
た可溶性ポリペプチド、又は静脈特異的細胞表面タンパク質の細胞外ドメインを
含有した可溶性ポリペプチドを哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物におけ
る血管の発生を変化させる方法。
【請求項４３】動脈特異的細胞表面タンパク質がＥｐｈｒｉｎファミリー
リガンドであり、かつ静脈特異的細胞表面タンパク質がＥｐｈファミリーレセプ
ターである、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】ＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドがＥｐｈｒｉｎＢ２であ
り、かつＥｐｈファミリーレセプターがＥｐｈＢ４である、請求項４３記載の方
法。
【請求項４５】（ａ）（１）動脈細胞特異的表面分子、（２）静脈細胞特異的表面分子、及び（３）（１）の分子と（２）の分子との間の相互作用に適した条件下で、（１
）の分子と（２）の分子との間の相互作用を阻害する能力の評価対象の薬物を混合する工程、（ｂ）（１）の分子と（２）の分子とが相互作用する度合いを決定する工程、並
びに（ｃ）（ｂ）で決定した度合いを、（１）の分子と（２）の分子との相互作用が
、評価対象の薬物の非存在下で、かつ（１）の分子と（２）の分子との相互作用
に適した同じ条件下で発生する度合いと比較する工程を含み、（１）の分子と（２）の分子との相互作用が薬物の非存在下よりも薬物
の存在下の方が度合いが小さい場合、薬物が（１）の動脈細胞特異的分子と（２
）の静脈細胞特異的分子との相互作用を阻害するものである、動脈細胞特異的表
面分子と静脈細胞特異的表面分子との相互作用を阻害する薬物の同定方法。
【請求項４６】動脈細胞特異的表面分子がＥｐｈｒｉｎファミリーリガン
ドであり、かつ静脈細胞特異的表面分子がＥｐｈファミリーレセプターである、
請求項４５記載の方法。
【請求項４７】ＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドがＥｐｈｒｉｎＢ２であ
り、かつＥｐｈファミリーレセプターがＥｐｈＢ４である、請求項４６記載の方
法。
【請求項４８】（ａ）（１）動脈細胞特異的表面分子、（２）静脈細胞特異的表面分子、及び（３）（１）の分子と（２）の分子との間の相互作用に適した条件下で、（１
）の分子と（２）の分子との間の相互作用を阻害する能力の評価対象の薬物を混合する工程、（ｂ）（１）の分子と（２）の分子とが相互作用する度合いを決定する工程、並
びに（ｃ）（ｂ）で決定した度合いを、（１）の分子と（２）の分子との相互作用が
評価対象の薬物の非存在下で、かつ（１）の分子と（２）の分子との相互作用に
適した同じ条件下で発生する度合いと比較する工程を含み、（１）の分子と（２）の分子との相互作用が薬物の非存在下よりも薬物
の存在下の方が度合いが大きい場合、薬物が（１）の動脈細胞特異的分子と（２
）の静脈細胞特異的分子との相互作用を増強するものである、動脈細胞特異的表
面分子と静脈細胞特異的表面分子との相互作用を増強する薬物の同定方法。
【請求項４９】動脈細胞特異的表面分子がＥｐｈｒｉｎファミリーリガン
ドであり、かつ静脈細胞特異的表面分子がＥｐｈファミリーレセプターである、
請求項４８記載の方法。
【請求項５０】ＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドがＥｐｈｒｉｎＢ２であ
り、かつＥｐｈファミリーレセプターがＥｐｈＢ４である、請求項４９記載の方
法。
【請求項５１】動脈内皮細胞を含有した組織試料の細胞を分離する工程、
分離した細胞と、動脈内皮細胞で特異的に発現される細胞表面タンパク質に結合
する物質とを接触させる工程、及び該物質を結合した細胞と物質を結合しなかっ
た細胞とを分離する工程を含む、動脈内皮細胞の単離方法。
【請求項５２】動脈内皮細胞を含有した組織試料の細胞を分離する工程、
該細胞と、動脈内皮細胞で特異的に発現される細胞表面タンパク質に結合する物
質であって、固体の支持体に結合されている物質とを接触させる工程、物質に結
合しない細胞を除去する工程、並びに固体の支持体から動脈内皮細胞を放出させ
る工程を含む、動脈内皮細胞の単離方法。
【請求項５３】静脈内皮細胞を含有した組織試料の細胞を分離する工程、
分離した細胞と、静脈内皮細胞で特異的に発現される細胞表面タンパク質に結合
する物質とを接触させる工程、及び該物質を結合した細胞と物質を結合しなかっ
た細胞とを分離する工程を含む、静脈内皮細胞の単離方法。
【請求項５４】静脈内皮細胞を含有した組織試料の細胞を分離する工程、
組織試料の細胞と、静脈内皮細胞で特異的に発現される細胞表面タンパク質に結
合する物質であって、固体の支持体に結合されている物質とを接触させる工程、
物質に結合しない細胞を除去する工程、並びに固体の支持体から静脈内皮細胞を
放出させる工程を含む、動脈内皮細胞の単離方法。
【請求項５５】単離された動脈内皮細胞。
【請求項５６】単離された静脈内皮細胞。
【請求項５７】単離された動脈細胞に１以上の薬物を添加する工程、及び
作用について細胞を観察する工程を含む、動脈に対する１以上の薬物の作用の評
価方法。
【請求項５８】細胞が内皮細胞である、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】単離された静脈内皮細胞に１以上の薬物を添加する工程、
及び作用について細胞を観察する工程を含む、静脈に対する１以上の薬物の作用
の評価方法。
【請求項６０】動脈内皮細胞由来の細胞株。
【請求項６１】静脈内皮細胞由来の細胞株。
【請求項６２】動脈で検出可能に産生されるが、静脈で検出可能に産生さ
れないタンパク質を産生する細胞株。
【請求項６３】静脈で検出可能に産生されるが、動脈で検出可能に産生さ
れないタンパク質を産生する細胞株。
【請求項６４】単離された動脈内皮細胞から作製されたｃＤＮＡライブラ
リー。
【請求項６５】単離された静脈内皮細胞から作製されたｃＤＮＡライブラ
リー。
【請求項６６】示差的な発現についての試験対象の遺伝子に指示挿入遺伝
子を有するトランスジェニックマウスを作製する工程、及び指示挿入遺伝子の発
現を観察する工程を含み、静脈内皮細胞及び動脈内皮細胞での指示挿入遺伝子の
発現の違いが、示差的な発現を示す遺伝子を表すものである、動脈内皮細胞に比
べて静脈内皮細胞において示差的な発現を示す遺伝子の同定方法。
【請求項６７】単離された動脈内皮細胞を遺伝学的に変化させる工程、及
び変化させた細胞を哺乳動物に導入する工程を含む、哺乳動物における動脈の改
変方法。
【請求項６８】単離された静脈内皮細胞を遺伝学的に変化させる工程、及
び変化させた細胞を哺乳動物に導入する工程を含む、哺乳動物における静脈の改
変方法。
【請求項６９】動脈特異的細胞表面分子と静脈特異的細胞表面分子との結
合又は相互作用を変化させる治療上有効量の薬物を哺乳動物に投与する工程を含
む、哺乳動物の腫瘍における血管新生を変化させる方法。
【請求項７０】血管新生が阻害され、かつ薬物が動脈特異的細胞表面分子
と静脈特異的細胞表面分子との結合又は相互作用を妨げる、請求項６９記載の方
法。
【請求項７１】動脈特異的細胞表面分子がＥｐｈｒｉｎファミリーリガン
ドであり、かつ静脈特異的細胞表面分子がＥｐｈファミリーレセプターである、
請求項７０記載の方法。
【請求項７２】ＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドがＥｐｈｒｉｎＢ２であ
り、かつＥｐｈファミリーレセプターがＥｐｈＢ４である、請求項７１記載の方
法。
【請求項７３】ＥｐｈｒｉｎＢ２に結合する薬剤を哺乳動物に投与する工
程を含む、哺乳動物における血管形成の阻害方法。
【請求項７４】ａ）動脈内皮細胞を単離する工程、ｂ）単離された細胞からｃＤＮＡを作製する工程、ｃ）ｃＤＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する工程、ｄ）単離された動脈内皮細胞から作製されたｃＤＮＡライブラリープローブ、及
び単離された静脈内皮細胞から作製されたｃＤＮＡライブラリープローブを用い
てＤＮＡハイブリダイゼーションにより、ライブラリーをスクリーニングする工
程、並びにｅ）単離された動脈内皮細胞から作製されたプローブへの示差的なハイブリダイ
ゼーションにより動脈特異的遺伝子を含むクローンを同定する工程からなる、動脈特異的遺伝子を含むクローンの同定方法。
【請求項７５】ＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞外ドメインに結合する抗体。
【請求項７６】ＥｐｈＢ４の細胞外ドメインに結合する抗体。