JP2002508749A

JP2002508749A - 感染または病原性の予防に有用な化合物のスクリーニング法

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Publication number: JP2002508749A
Application number: JP54839598A
Authority: JP
Inventors: フレデリックエム．オスベル; ローレンスジー．ラム; マン−ワタン; ゲイリービー．ラフクン; シャリナマハジャン−ミクロス; アンネイエンブロークス; ロナルドエイチ．エー．プラスターク; ジョルグジャンダー; ジャクラインハード
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1997-05-08
Filing date: 1998-05-08
Publication date: 2002-03-19
Also published as: NO995438D0; CA2287774A1; DE69835376T2; CN1261810A; AU7369198A; DE69835376D1; IL132477A0; EP1047454A1; KR20010012334A; AU752575B2; TR199902742T2; NZ500508A; WO1998050080A1; US7166270B1; ATE333903T1; NO995438L; PL337576A1; EP1047454A4; EP1047454B1

Abstract

(57)【要約】感染または病原性を阻害する有用化合物を同定するスクリーニング法および病原性ビルレンス因子を同定する方法について開示する。

Description

【発明の詳細な説明】感染または病原性の予防に有用な化合物のスクリーニング法発明の背景本願は1997年5月8日に出願された係属中の米国特許出願第08/852,927号の一部継続出願であり、この一部継続出願は、1995年3月28日に出願された係属中の米国特許出願第08/411,560号の一部継続出願である。本発明は、真核宿主生物における感染もしくは疾病を阻害する化合物を識別するスクリーニング法、または宿主の病原性防御メカニズムを誘導もしくは刺激するスクリーニング法に関する。本発明はまた、抗病原体としての前記化合物の使用に関する。さらに本発明は、病原性ビルレント因子を識別する方法に関する。細菌、原虫、真菌、線虫およびウイルスなどの微生物病原体は、動物および植物に感染できる大量かつ多様な生物群を含む。感染の開始は、感染生物が病原性である場合に生じ、その宿主は病原性侵襲を受けやすい。感染を受けやすい宿主細胞もしくは組織と接触すると、病原体はその宿主から栄養を得て病原体自身の生存を促進する。感染プロセス中、病原体は分子、生化学および生理学的プロセスのカスケードを活性化するが、その結果は宿主にとって有害な物質の放出であり、疾病の発症である（例えば、Scientific American Medicine，W.H．Freeman and Co.，Ca，San Francisco，1995;Agrios，G.N.，Plant Pathology，Academi c Press，1988参照）。微生物の病原性影響は多様な方法で生じる。ある病原体は分泌された生成物により作用する。例えば、ジフテリアは、細菌ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）によって引き起こされる。この生物は宿主により吸入され、上気道に感染する。この細菌それ自体が血流を侵襲する訳ではなく、その強力な毒素が侵襲するのである。これらの毒素は次いで体細胞により吸収され、酵素機能を損傷させ、そして宿主細胞を破壊する。その他の病気は病原体に対する身体反応の結果である。例えば、肺炎は肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）によって起こる病気であるが、その場合、感染は肺の気嚢へ体液および細胞の流出を起こして呼吸を妨げる。同様に皮膚の真菌感染はそうした炎症反応から生じる。その上、他の細菌は日和見病原体である。例えば、緑膿菌（Pseudomonas aeru ginosa）は、熱傷患者や免疫不全患者、さもなければ免疫障害のある患者に感染する。緑膿菌感染は、角膜潰瘍や中耳炎の場合のように急性で局在化する可能性があり、膿胞性繊維症患者の肺におけるように慢性であったり、または引き続いて血流に侵入すると全身性となる可能性がある。植物病原性疾患もまた問題となる。これらが植物および植物産物に損傷を起こすからである。植物性病原体は、(1)宿主細胞栄養を消費する；(2)毒素、酵素もしくは成長調節剤により宿主細胞を死滅させたり崩壊させる；(3)萎黄病（例えば、葉緑体を退緑させることにより）を起こして光合成に影響を与える；および (4)導管組織をブロックし正常な生理プロセスを妨げることを含む、多数の方法により、植物の病気を引き起こす。農作物、観賞用植物、樹木および灌木類は、細菌、真菌、ウイルスおよび線虫による病気には特に脆弱である。植物の病原性細菌は、例えば、葉斑病や葉枯れ病、腐敗病、立枯れ病、異常成長、黒星病、胴枯れ病を含む、多数の病的症候を発現する。細菌病は、馬鈴薯や人参、玉葱、アヤメ、ヒヤシンスなどの、多肉性の貯蔵組織をもつ野菜類（および時には観葉植物）に最も普通に起こる病的異常である。こうした病的異常は多肉性の果実をもつ植物（キュウリ、カボチャ類、ナスもしくはトマトなど）ならびに葉もの植物（キャベツ、セロリ、レタス、ホウレン草など）にも生じる可能性がある。植物の細菌病は世界中で発生しており、農場、輸送および保存において、重大な作物被害の原因となっている。植物病因のメカニズムは多数かつ多様である。例えば、細菌性植物病原体の一つ、エルウィニア(Erwinia)は、傷もしくは入り込めそうな正常な開口部から植物に入り込み、腐敗病や腐爛病のような植物疫病を起こす。一旦内部に入り込むと、細菌は、植物の中層を破壊する酵素を分泌して、組織を分解しついには細胞を死滅させてしまう。他の細菌、例えば、ある種のシュードモナス属株は、植物内部の木質を崩壊させることにより水の転流を妨げる可能性がある。シュードモナスは根や葉柄の木質に侵入し、そして一旦中に入るや、その植物を破壊する酵素や毒素を分泌する。さらにアグロバクテリウムやコリネバクテリウムのような他の植物病原性細菌は、患部組織の細胞分割および細胞肥大を刺激する。これは、根や葉柄もしくはその他組織（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）による根頭菌えい病）における、または、感染した組織の増殖中（例えば、Agrobacterium rhizogenesによって起こる毛根病（ hairy root））の不規則な異常成長、菌こぶ、腫瘍の発生に至るのが普通である。原因菌を速やかに同定することは、抗病原菌剤を適切に選択するため、そしてヒトへの感染および農業感染を成功裡に管理するために必須である。しかしながら、スルホンアミドやテトラサイクリン、アンピシリン、セファロスポリン、アミノグリコシドなどの抗病原菌剤を広範に使用することは、医学および農業の両方において、耐性微生物種の選択に非常に好都合であった。これは、伝染性耐性プラスミドをもつ菌株については正にその通りである。例えば、セラチア、クレブシエラ、シユードモナス、アシネトバクター、エンテロバクターおよびストレプトコッカスの高耐性菌による院内感染の発生は、重大かつ頻発する問題となっている。過去数十年にわたって耐性菌を選択した結果、重大で解決の難しい臨床上の病原体として、病院内で10%〜20%の感染を起こしている緑膿菌が浮上してきた。現在のところ、緑膿菌に対してはいくつかのアミノグリコシドや第三世代のセファロスポリンが有効であるが、緑膿菌も比較的簡単に耐性を獲得すると見られていることから、考えられる後継薬もしくは代替治療薬として新しい化合物の探求が必要である。発明の概要本発明者らは、動物および植物宿主両方の感染および病原性に共通の病原性ビルレンス因子が関わっていることを発見した。そのような宿主依存性ビルレンス因子を同定することにより、動物もしくは植物またはその両方における病原性を阻害するのに有用な治療薬を評価・同定するためにデザインされた改良スクリーニング法が容易になった。さらに、本発明者らの発見は、多様な新規ビルレンス因子を同定するのに有用なスクリーニング法の根拠を提供する。そのようなビルレンス因子の同定はまた、抗病原菌剤として使用する標的薬剤の開発を容易にするものである。従って、本発明は、第一の局面において、真核宿主生物の病原体を阻害できる化合物を同定する方法を特徴とする。本方法は、(a)少なくとも2つの異なる真核宿主生物であって、該生物の少なくとも1つは非齧歯類である真核宿主生物を、少なくとも1つの候補化合物の存在下、単一の病原体に暴露し、（連続してまたは同時に、）そして(b)前記真核宿主生物のそれそれにおいて病原体を阻害する化合物を同定することを含む。好ましい態様において、前記病原体は細菌(例えば、緑膿菌UCBPP-PA14)であり ;前記真核宿主生物は脊椎動物(例えば、非齧歯類)と植物、脊椎動物と無脊椎動物、または無脊椎動物と植物、を含む。好ましくは、無脊椎動物は線虫(例えば、Caenorhabditis属の線虫)または昆虫(例えば、鱗翅類または双翅類)であり；そして前記植物はアブラナ科の植物(例えば、Arabidopsis属の植物)である。さらに他の好ましい態様によれば、前記真核宿主生物は、植物であり；脊椎動物であり；または無脊椎動物である。第二の局面において、本発明は一般に、非齧歯類真核宿主生物の病原体を阻害できる化合物を同定する方法を特徴とする。本方法は、(a)少なくとも1つの候補化合物の存在下、非齧歯類の真核宿主生物を単一の病原体に暴露し、そして(b) 前記真核宿主生物において病原体を阻害する化合物を同定することを含む。好ましい一態様において、前記病原体は細菌(例えば、緑膿菌UCBPP-PA14)であり;前記非齧歯類の真核宿主生物は線虫(例えば、Caenorhabditis属の線虫)であり；そして前記植物はアブラナ科の植物(例えば、Arabidopsis属の植物)である。第二の好ましい態様において、前記病原体は細菌(例えば、緑膿菌UCBPP-PA14) であり、前記非齧歯類の真核宿主生物は植物(例えば、Arabidopsis属の植物)である。第三の局面において、本発明は一般に、病原性ビルレンス因子を同定する方法を特徴とする。本方法は、(a)少なくとも2つの異なる真核宿主生物であって、該生物の少なくとも1つは非齧歯類である真核宿主生物に感染できる病原体を同定する段階；(b)該病原体の変異体を生成する段階；(c)前記生物のそれぞれを前記変異病原体に暴露(連続してまたは同時に)する段階；(d)前記変異された病原体が前記生物のそれぞれにおいて病気を引き起こすことができるかどうかを決定し、野生型病原体によって起こる病気に比べ前記生物の両方における病気の減少が前記病原性ビルレンス因子における変異を示す段階；そして(e)病原性ビルレンス因子を同定するマーカーとして前記変異を用いる段階を含む。第四の局面において、本発明は一般に、病原性ビルレンス因子の変異方法を特徴とする。本方法は、(a)少なくとも2つの異なる真核宿主生物であって、該生物の少なくとも1つが非齧歯類である真核宿主生物に感染できる病原体を同定する段階；(b)該病原体の変異体を生成する段階；(c)前記生物のそれぞれを前記変異病原体に暴露(連続してまたは同時に)する段階；および(d)前記変異された病原体が前記生物のそれぞれにおいて病気を引き起こすことができるかどうかを決定し、野生型病原体によって起こる病気に比べ前記生物の両方における病気の減少が前記病原性ビルレンス因子における変異を示す段階を含む。第五の局面において、本発明は一般に、病原体のビルレンス因子を減弱する方法を特徴とする。本方法は、(a)少なくとも2つの異なる真核宿主生物であって、該生物の少なくとも1つが非齧歯類である真核宿主生物に感染することができる病原体を同定する段階；(b)該病原体の変異体を生成する段階；(c)前記生物のそれぞれを前記変異病原体に暴露(連続してまたは同時に)する段階；そして(d)前記変異された病原体が前記生物のそれぞれにおいて病気を引き起こすことができるかどうかを決定し、野生型病原体によって起こる病気に比べ前記生物の両方における病気の減少が前記病原性ビルレンス因子における変異を示す段階を含む。本発明の上記局面のいずれに対しても好ましい態様において、本発明の方法は線虫急速死滅アッセイを利用することができる。さらに、そのような方法には、ある化合物に対する浸透度を高めた線虫、例えば、P-糖タンパク質変異をもつC ．elegans線虫を使用することができる。第六の局面において、本発明は一般に、昆虫(例えば、ガまたはハエ)を使って病原性ビルレンス因子を同定する方法を特徴とする。本方法は、(a)昆虫に感染できる病原体を選択する段階；(b)該病原体の変異体を生成する段階；(c)昆虫を前記変異病原体に暴露する段階；(d)前記変異された病原体が前記昆虫に疾病を起こすことができるかどうかを決定し、野生型病原体によって起こる病気に比べ前記昆虫における病気の減少が前記病原性ビルレンス因子における変異を示す段階を含む。好ましい態様によれば、変異の同定は、病原性ビルレンス因子を同定するマーカーとして用いられ、前記病原体は細菌（例えば、シュードモナス）もしくは真菌(例えば、フザリウム)である。他の好ましい態様によれば、本発明はさらに、病原体のLD₅₀を算出すること、マウス死亡率測定における変異病原体を試験すること、もしくはその両方を含む。「病原体の阻害」とは、真核宿主生物における病原体媒介疾病もしくは感染の発症もしくは進行を漸減、抑制、減弱、減少または抑止する、候補化合物の能力を意味する。そのような阻害とは、適切な病原性測定(例えば、本明細書に記載の各種測定)において、候補化合物の不存在下における症状に比べて、好ましくは少なくとも5%、さらに好ましくは少なくとも25%、最も好ましくは少なくとも5 0%、病原性を減少させる場合である。特定の一実施例によれば、供試化合物もしくは抽出物に暴露した宿主生物の病的状態をモニターすることによって、阻害を測定することができる。すなわち、該化合物に暴露されていない宿主生物における病原性症状のレベルと比較した病態レベルの減少は化合物による病原体の阻害を示す。「非齧歯類」とは、マウス、ラット、モルモットもしくはハムスターではない生物をいう。「急速死滅」アッセイとは、検体数の50%を超える線虫が約36時間よりも短時間内で死滅する検定をいう。好ましい態様において、そのような死滅は約12〜24 時間以内に達成される。さらに好ましい態様において、死滅は約4時間で達成される。「病原性ビルレンス因子」とは、細胞成分なしではその病原体が真核宿主生物の病気もしくは感染を起こすことができない細胞成分(例えば、転写因子のようなタンパク質)をいう。本発明は、微生物病原体に対する化合物の効果を識別・評価するのに用いられる広範な標準スクリーニング法より優れた、待望の利点を提供するものである。例えば、本明細書に記載のスクリーニング法は、簡単なインビボスクリーニングによって、宿主の毒性ならびに抗病原菌剤の効果を同時に評価することができる。その上、本発明の方法は、微生物の病原性を阻害する化合物の能力を評価できると同時に、病的侵襲に対する宿主の応答を刺激・強化する化合物の能力を評価することができる。従って、本発明の方法は、真核宿主生物において安全に使用できる化合物(すなわち、生物の正常な発育や生理に悪影響を与えない化合物)であって病原性微生物に効果のある(すなわち、病原体のビルレンスを抑制することによって)化合物を同定する簡便な手段を提供するものである。さらに、本発明の方法は、高得量、高感度そして簡単に抗病原効果をもつ化合物を実質的にどんな数でも分析する方法を提供する。本方法はまた、精製または粗製抽出物いずれかの形で見出された少量の活性化合物を比較的安価に分析できる方法である。さらにまた、本明細書に開示の方法は、真核細胞膜と交差(crossing)する能力をもち、かつ、インビボ投与法で治療効果を維持する抗病原性化合物を同定する方法を提供する。本発明のその他の特徴および利点は、以下に記載する本発明の好ましい態様および請求の範囲から明らかである。詳細な説明まず図面について説明する。図面図1は、シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）と緑膿菌によってアブラナ科植物(Arabidopsis)（生態型Llagostera(L1)）の葉に生じた症状を示すカラー写真である。模擬接種(左)；Pseudomonas syringae pv．maculicol a ES4326株(中央)；緑膿菌UCBPP-PA14株(右)。図2A〜2Dは、アブラナ科植物の葉におけるシュードモナス・シリンガエ（Pseu domonas syringae）および緑膿菌の成長を示すグラフである。図2Aは、生態型Ll agosteraでのPseudomonas syringae pv．maculicola ES4326株(□)、緑膿菌UCBP P-PA14株(○)および緑膿菌UCBPP-PA29株(△)の成長を示すグラフである。図2Bは、3つのアブラナ科植物生態型：コロンビア(■)、Argentat(●)およびベンシャイム(▲)における緑膿菌UCBPP-PA14株の成長を示すグラフである。図2Cは、緑膿菌UCBPP-PA14株(●)および同系のplcS(□)とtoxA(◇)変異株の成長を示すグラフである。図2Dは、生態型Llagosteraにおける緑膿菌UCBPP-PA14株(●)、同系のga cA(◇)とdegP(□)変異株の成長を示すグラフである。アブラナ科植物葉の菌数カウントは、本明細書に記載の通りに行われた。4個の試料±SDの平均値を示す。3 回別々の実験で同様な結果が得られた。植物の培養条件は下記表Iに示した実験とと同じであった。図3は、野生型緑膿菌UCBPP-PA14株と同系degP変異株で成長するCaenorhabdit is elegansの死亡率比較を示すグラフである。図4は、野生型緑膿菌UCBPP-PA14株および同系gacA変異株で成長するCaenorhab ditis elegansの死亡率を比較したグラフである。図5は、線虫の急速および緩徐死滅アッセイの速度を示す。緑膿菌は、NGM寒天培地よりも低リン酸ペプトン−グルコース(PG)寒天培地で成長させた場合、より速やかにL4蠕虫を殺虫した。L4蠕虫40匹をPG(○)かまたはNGM(□)で成長させたP A14に暴露した。死滅率%は3回行った測定の平均値として示す。図6A〜6Hは、急速および緩徐死滅が異なるメカニズムを利用していることを示すグラフである。急速(左側パネル)および緩徐(右側パネル)死滅について、緑膿菌変異株であるlasR(図6A、6B)、gacA(図6C、6D)、degP(図6E、6F)および49H2( 図6G、6H)を親の野生型PA14と比較した。緩徐死滅では野生型PA14(△)に比べると、lasR(△)もgacA(○)もその殺虫能力が減少したが、急速死滅条件下(図6A、6 C)ではその病原性は両方とも減弱されなかった。これに対し、degP遺伝子(◇)の変異株は緩徐死滅を遅らせ(図6F)急速死滅を減少させる(図6E)ことがわかった。変異株49H2(▽)はgacA、lasR変異株とは逆の効果を示した。49H2は緩徐死滅では野生型と区別できない(図6H)が、急速死滅では劇的な減少を示した(図6G)。各データ点は、３回行った測定の平均値±SDを表す。急速死滅実験では、PGS寒天培地(図6Aおよび6G)かまたはPG寒天培地(図6Cおよび6E)のいずれかで細菌を成長させた。緩徐死滅実験はすべてNGM寒天培地で行った。図7A〜7Cは、急速死滅の効力が種および株依存性であることを示すグラフである。図7Aは、近縁の蛍光性シュードモナス間で急速死滅性を比較したものである。P．fluorescens 2-79株(◇)は緑膿菌PA14株（□）と同程度の病原性を示すが、P．syringaepv．syringae 4326株は病原性を示さない。図7Bは、異なる緑膿菌株のビルレンスを比較したものである。PA14は調べた株のうち最も毒性が強い。 PA14に暴露した蠕虫の80%が12時間後に死滅した。12時間の時点で、PAK、PAO1-R 、PO37およびPA29株は20%より低い蠕虫死亡率であった。図7Cは、PAO1変異株の病原性を比較したものである。異なる実験室で得られたPAO1間に有意な差は見られなかった。各データ点は、3回行った測定の平均値±SDを表す。これらの実験は2回行ったが同様な結果が得られた。図8A〜8Fは、C．elegansの緑膿菌媒介死滅に影響するファクター：蠕虫発生段階のファクター(図8A)および環境ファクター(図8B〜8F)を示すグラフである。特記しない限り、実験はすべて20℃で増殖させたL4段階の野生型N2 C．elegansの同時培養液を用いて行った。死滅率%は4回測定の平均値±SDである。全プレートに蠕虫40匹を入れて、25℃に維持した。図8Aは、PGS寒天培地で増殖させたPA14 に暴露したL4(□)あるいは1日成虫(◇)の死滅速度を示すグラフである。図8Bは、急速死滅応答における浸透性効果：0.15Mソルビトール添加(■)、0.1Mソルビトール添加(▲)またはソルビトール無添加(●)のペプトン−グルコース培地で増殖させたPA14に暴露したL4の死滅速度を示すグラフである。0.15Mのソルビトールの添加によって、死滅率は0.1Mソルビトール添加またはソルビトール無添加の場合よりも上昇した。平均値±SDは4回繰り返し測定により得られた。図8Cは、急速死滅反応における鉄濃度の効果を示すグラフである。L4蠕虫は、鉄無添加( ■)、100μM FeCl₃添加(―・―○―・―)または鉄キレート剤EDTA 400μM添加( …□…)PGSで調べた。追加鉄無添加または鉄キレート剤を添加したプレートに比べ、死滅率は有意に減少した。この実験は3回行われ同様な結果が得られた。図8 Dは、急速死滅応答に対する温度の作用を示すグラフである。PA14は、1日成虫を入れる前に、20℃(□)、25℃(◇)、30℃(○)または37℃(△)で36時間、PGS寒天プレートで増殖させた。低い温度に比べ、37℃での増殖では死滅率が減少することがわかった。上記温度でPA14を24時間増殖させた第二実験でも同様な傾向であった。図8Eおよび8Fは、急速死滅反応に対する炭素源の効果を示すグラフである。1%グリセロール添加PGS培地(■)から1%グルコースを置き換えた（■□）ところ、野生型PA14(図8E)の死滅率は減少した。しかしながら、rpn7-lasR株(●)は、炭素源としてグルコースの代わりにグリセロールを用いた場合に野生型PA14よりも、さらに早く死滅することがわかった(図8F)。rpn7-lasRもまた、炭素源としてグリセロールを用いた野生型PA14よりも大量にピオシアニン(pyocyanin)を産生することがわかった。図9A〜9Bは、急速死滅が熱安定な拡散ファクターによって媒介されることを示すヒストグラムである。PA14培養液は、実験処理に先だって24時間PGS寒天プレートで増殖させた。20℃で増殖させたL4段階野生型N2動物の同時培養液を全実験で使用した。死滅率%は3回繰り返した実験の平均値±SDとして示す。図9Aは、急速死滅反応に生菌は不要であることを示す。生菌PA14を含むプレートおよび死菌プレートのL4蠕虫死亡率は暴露(HPE)4時間後に測定した。生菌またはクロロホルム殺大腸菌DH5αを使用してクロロホルム処理用の対照とした。生菌PA14またはクロロホルム殺PA14を含むプレートは死滅について同じ効力を示した。生菌またはクロロホルム殺大腸菌を含むプレートでは蠕虫は1匹も死ななかった。図9Bは、死滅を媒介する主なファクターが熱安定性であることを示す。末加熱プレート(0 分)で4時間HPEに暴露したときの死滅効果は、65℃に30分間あるいは60分間加熱したPA14含有プレートと比較した。両方とも加熱処理プレートは、蠕虫を入れる前に室温まで冷却した。3通りの処理の間に死滅効果の有意差は見られなかった。これは死滅の因って来るファクターは少なくとも65℃で1時間安定であることを示唆している。図10A〜10Bは、P-糖タンパク質蠕虫変異体が急速死滅には非常に高い感受性を示すが、緩徐死滅にはそうでないことを示すグラフである。急速死滅PG培地(図1 0A)および緩徐死滅NGM培地(図10B)において、L4段階のP-糖タンパク質二重欠失株NL130[pgp-1(pk17);pgp-3(pk18)](○)の生存率を親N2系統(□)と比較した。実験では両方とも20℃で増殖させたL4段階蠕虫の同時培養液を使用した。死滅率% を3回繰り返した実験の平均値±SDとして示す。約40匹のL4蠕虫を各プレートに加え、プレートはすべて25℃でインキュベートした。独立に行った2セットの実験で同様の結果が得られた。図11A〜11Bは、急速死滅にアルギン酸は重要でないことを示すグラフである。急速死滅条件下(図11A)および緩徐死滅条件下(図11B)、degP挿入変異体PA14degP (■)、algDインフレーム欠失変異体PA14algDΔ4(●)および二重変異体PA14degPa lgDΔ4(▲)の生存率をPA14(□)と比較した。各プレートには約40匹のL4N2蠕虫を加えた。急速死滅にはPGS寒天培地を、緩徐死滅にはNGM寒天培地を使用した。死滅率%を3回繰り返した実験の平均値±SDとして示す。図12は、リン酸が急速死滅率を低下させることを示すグラフである。20mM無機リン酸(Pi)添加(◇)またはPi無添加(□)のPYS寒天上増殖させたPA14の死滅率を比較した。PA14に暴露8時間後のL4死滅率%(3回繰り返した実験の平均値±SD)はリン酸制限条件下よりも高かった。独立に行った2回の実験で同様の結果が得られた。図13A〜13Bは、急速死滅耐性とパラコート(除草剤)耐性との相関を示すグラフである。急速死滅条件下、C．elegans株TJ1052，age-1(hx546)II;TK22，mev-1(k nl)III;PH13およびrad-8(mnl63)Iを野生型N2系統と比較した。生存率%を3回繰り返した実験の平均値士SDとして示す。図13Aは、age-1遺伝子の変異がPA14急速死滅耐性を与えることを示している。L4age-1(hx546)(△)蠕虫の生存率はN2(□)に比し有意に高かった。図13Bは、mev-1遺伝子とrad-8遺伝子の変異がPA14急速死滅感受性を増強することを示す。成虫mev-1(kn1)およびrad-8(mn163)の生存率を PA14とOP50両方で調べた。OP50対照は酸素毒性による死亡率に対する対照として使用した。これらの変異体は、酸素に対する感受性を高めることがわかった。2 株(◆および●)ともOP50による死亡は無視できる程度であった。mev-1(kn1)(◇) もrad-8(mn163)(○)も変異成虫は、その親野生型N2系統(□)に比べ、急速死滅に高い感受性を示すことがわかった。図14は、G．mellonellaでのF．oxysporumの死滅曲線を示すグラフである。図15は、PA14によるOr^Rハエ死滅を示すグラフである。細菌病原体は植物、動物双方に、また線虫に病気を生じさせることができること、そして、植物、動物および線虫に生じる微生物病原性疾病を起こすビルレンス因子は重複していることを示す実験的証拠について以下に記載する。これらの実験例は例示にとどまるものであり、本発明の請求範囲を限定するものではない。植物および動物における緑膿菌の病原性に必要な共通ビルレンス因子の同定多数の宿主ビルレンス因子を同定するため、本発明者らはまず植物および動物病原性モデルの両方で病気を発症できる細菌病原体を探索した。シロイヌナズナ (Arabidopsis thaliana)葉の病原性浸潤系を用いて、種々の緑膿菌分離物のスクリーニングを行った。次いで、マウスの全厚皮膚火傷(full-thickness skin bur n)モデルおよび線虫飼育アッセイにより、シロイヌナズナに病的症状を生じる分離物の病原性を調べた。具体的に述べると、本発明者らはまず収集した緑膿菌株をスクリーニングした。これにはヒト臨床分離物30個、土壌分離物20個、そして植物分離物25個(バークレイのカリホルニア大学、植物病原学部から入手)が含まれている。これら分離物をそれぞれ別々に4種の異なるシロイヌナズナ生態型(陸生種または野生取得 )葉に注入してその分離物が植物病原体であるかどうかを調べた。数種のシロイヌナズナ生態型では適当な病原体を同定する可能性が高いことが測定された。シロイヌナズナ病原体を含む植物病原体は、典型的に高レベルの宿主栽培変種すなわち、生態型特異性を示すからである。（実験室で創った人工的な環境においてのみ植物に感染できる人工的な病原体よりもむしろ）生態型特異性を示す緑膿菌は真正な植物病原体であることが多いため、多重宿主アッセイも行った。シロイヌナズナ葉病原性浸潤系を用いて、以下のようにスクリーニング実験を行った。ルリアブロス(LB)培地中37℃で緑膿菌株を増殖させ、10mM MgSO₄で2回洗った後、光学濃度600[OD₆₀₀]=0.2の10mM MgSO₄中に再浮遊させ、1:100に希釈( 細菌濃度10³cfu/cm²に相当)して6週齢のシロイヌナズナ植物葉に注入した。植物は、実験期間中28〜30℃、相対湿度90〜100%の増殖チェンバーに維持した。5日間にわたって病態および増殖を毎日モニターした。注入5日後に生じた状態は、無症状の場合「なし」；注入部位周辺組織の局所的な弱い水浸み込みと白化(黄化)を「弱」；注入部位周辺に柔化組織の大部分をもつ中程度の水浸み込みと白化を「中程度」；そして、注入2〜3日後注入部位周辺における水浸反応領域に特徴的な注入葉全体の激しい腐敗病と白化を「重症」として表した。腐敗病は注入 4〜5日後には葉一面に広がった。5日目に細菌を含む葉細胞間液を採取し、標準的な方法(例えば、Dong et al．(1991)Plant Cell 3:61参照)により菌数を決定した。試料1個につき円盤状葉2枚を用いてそれぞれ異なる試料を4個取った。3回の別々の各実験で同様の結果が得られた。10mM MgSO₄を与えた対照用植物は実験期間中何の症状も示さなかった。他の対照実験では、遺伝子的に特性化された緑膿菌PAK、PAO1、PO37株のいずれも、テストしたシロイヌナズナ生態型に感知できるほどの症状を生じることはなかった。これらの菌株はテストした生態型では非病原性であるが、培養液中では病原性であることがわかった。スクリーニングした75個の緑膿菌のうち大部分はシロイヌナズナ葉に何の症状も生じなかったが、いくつかの菌株は、注入部位周辺組織の白化および水浸により特徴づけられる、弱ないし中程度の腐敗病症状を生じた。UCBPP-PA14(ヒトの臨床分離物)およびUCBPP-PA29(植物分離物)の2菌株は、試験した生態型のあるものに重症の腐敗病症状を起こした。それは高いビルレントをもつ植物細菌病原性に典型的な症状である。表1は、感染5日後の緑膿菌UCBPP-PA14株およびUCBPP-PA 29の増殖と、これらの緑膿菌株が異なるシロイヌナズナ生態型に起こした病的症状を示すものである。特に、UCBPP-PA14株は、Llagostera(Ll)およびコロンビア (Col)シロイヌナズナ生態型の両方に重症の腐敗病を生じたが、生態型Argentat( Ag)では無症状であり、生態型ベンシャイム(Be)において中程度の症状を生じるに止まった。表Iは、UCBPP-PA29がLlに重症状態を引き起こし、Colに弱い症状がでたが、AgやBeでは無症状であった。図1に示すように、UCBPP-PA14(右端)によって生じた重症状態は、水浸反応ゾーンおよび白化により特徴づけられ、感染4〜5日後葉は完全にふやけて崩壊した (左端の対照参照)。これらの状態は、強い毒性をもつシロイヌナズナ病原性Pseu domonas syringae pv．maculicola ES4326株(中央の写真)によって生じる状態と本質的に区別できなかった。病態の重篤度が細菌の増殖と相関していることを確認するため、上記したように、数日間にわたり、シロイヌナズナ葉でUCBPP-PA14およびUCBPP-PA29両菌株の増殖を測定した。図2Aに示すように、UCBPP-PA14(○)およびUCBPP-PA29(△)菌株は生態型Llで5日までに約10⁷細胞/cm²葉面積の最高菌濃度となり、これは最初の接種から10⁴倍の増加に相当する。Llにおけるこれら菌株の増殖プロフィルはビルレントなシロイヌナズナ病原性P．syringae pv．maculicola ES4326株(図2A、□) と同様であった。生態型Col(図2B、■；表I)ではUCBPP-PA14株も増殖した。これに対し、BeおよびAgの葉では、UCBPP-PA14はそれぞれ、10³および10²倍しか増えなかった(図2B、それぞれ▲および●；表I)。またUCBPP-PA29は生態型Col、AgおよびBe(表I)で10²〜6x10²倍に増えただけであった(表I)。それぞれのケースにおいて、葉の減少菌数は重篤な症状発現がより少なくなることを反映していた。従って、これら緑膿菌株はそれぞれ、生態型特異的方法で病気を起こす能力という点では他の植物病原性細菌と類似していた。次いで、シロイヌナズナに病的症状を起こすことがわかったUCBPP-PA14および UCBPP-PA29分離物について、マウス全厚皮膚火傷傷害測定試験を行った。これは、腹部皮膚を伸ばした場所に作ったネズミ体表面積の5%を含む(Stevens et al． (1994)J．of Burn Care and Rehabil．15:232)。このモデルで、損傷した表皮および真皮は凝固壊死を生じるが、皮下の腹直(RA)筋は損傷を受けない。感染がない場合、動物はすべて生存する。本病原性測定を行うため、緑膿菌接種菌を焼痂の中線皺襞へ皮内注入した。細菌は火傷中で増殖し、菌株のいくつかは正常な皮下RA筋へ侵入することがある。病原性の高い菌株は血管系にも侵入する可能性がある。24時間後皮下の火傷周辺 RA筋に見つかった細菌数は局所侵入の定量的指標であり、死亡率は局所性および全身性両方の侵入を示す。マウス全厚皮膚火傷の検討は以下の通り行った。体重25〜35グラムで6週齢の雄のCD-1マウス(Charles River Animal Farms)を動物火傷モデル(前記Stevensら )後の全実験に使用した。マウスに〜5x10³細胞を注入した。細菌注入直後または他の実験で見せかけの傷をつけた動物の皮下RA筋から生存細菌細胞は回収されなかった。死亡率の検討では、火傷直後マウスに細胞10²個を注入し、10日間毎日、肺血症で死亡した動物数をモニターした。(i)火傷をおっているがUCBPP-PA14 注入なしのマウスおよび(ii)加熱殺菌したUCBPP-PA14を注入したマウスからなる対照動物2群の死亡率は0であった。表II(下記)に示すデータは、マウス全厚皮膚火傷モデルで緑膿菌株が増殖することを示す。表IIは、十分特性化生態型緑膿菌ヒト分離物であるPO37、PAKおよび PAO1と同様、UCBPP-PA14およびUCBPP-PA29が増殖しRA筋に侵入したことを示す。火傷部位および感染部位の直下から採取したRA筋生体組織片において、全菌株は、組織1グラムあたり1.8x10⁸〜3.6x10⁸cfuの力価に達した(表II)。さらに、火傷周辺から採取したRA筋生体組織片において、全菌株は、組織1グラムあたり4.0x1 0⁷〜8.2x10⁷cfuの力価に達した(表II)。また、通常の組織学用に処理した組織試料から、UCBPP-PA14菌株がP037菌株と同程度筋肉へ侵入したことが明らかになった。上記のとおりマウス全厚皮膚火傷モデルで死亡率の検討を行うことにより、UC BPP-PA14およびUCBPP-PA29菌株のビルレンスもP037に比べて検定した。火傷および感染10日後、UCBPP-PA14、UCBPP-PA29およびP037は、それぞれ77%(17/22)、6% (1/16)および22%(2/9)の死亡率となった(表III)。追加実験によれば、本モデルにおいて、PAO1およびPAK菌株はUCBPP-PA14よりも有意に低い死亡率を示した。 UCBPP-PA14菌株が、病原性の結果を定量出来る植物、動物両方の病原性モデルに感染性であること、そしてこれらモデルにおけるビルレンス濃度が公知の植物および動物の病原体に匹敵することから、UCBPP-PA14菌株をさらに追加研究用に選択した。具体的に述べると、本発明者らは、両宿主の病原性に要求されるUCBP P-PA14菌株に共通のビルレンス決定因子があるかどうかの測定を試みた。そのストラテジーは、異なる遺伝子4個、すなわち、動物宿主において緑膿菌のビルレンス決定因子であることがわかっている遺伝子2個、植物宿主において植物病原性細菌のビルレンス決定因子であることがわかっている遺伝子1個、そして動物宿主において数種の動物細菌病原体のビルレンス決定因子であることがわかっている遺伝子1個に挿入突然変異を生じるUCBPP-PA14変異体を生成するマーカー交換法を使用することであった。緑膿菌の動物ビルレンス遺伝子2個とは、それぞれエクスポートされたタンパク質のホスホリパーゼCとエキソトキシンAとをコードする plcSおよびtoxAであつた(Ohman et al．(1980)Infect．Immun．28:899;Ostroff et al．(1987)J．Bacteriol．169:4597)。エキソトキシンAはタンパク質Gをリボシル化し、ホスホリパーゼCは真核細胞のリン脂質を優先的に分解する(Iglewski et al．(1975)Proc．Natl．Acad．Sci．72:2284;Berka et al．(1982)J．Bacte riol．152:239)。植物病原体ビルレンス決定因子は、非病原性土壌細菌P．fluor escensに分泌される抗真菌因子の広範な調節因子として同定されたgacAであった (Laville et al．(1992)Proc．Natl．Acad．Sci．89:1562;Gaffney et al．(199 4)Mol．Plant-Microbe Interact．7:455)。植物病原体P．syringae pv．syringa eおよびP．cichoriiにおいて、gacAは病原性にからむ細胞外生成物をコードする転写調節因子として作用するようである(Rich et al．(1994)J．Bacteriol．176 :7468)。もうひとつの動物ビルレンス決定因子、degP(htrAとしても知られている)は、ブルセラおよびサルモネラの不正に折り畳まれた細胞周辺のタンパク質を分解する原因であるストレス応答プロテアーゼとして同定されている(Elzer e t al．(1994)Infection and Immunity 62:4135;Johnson et al．(1991)Mol．Mic robiol．5:410)。 plcSおよびtoxAのUCBPP-PA14相同体は、緑膿菌株PAKのplcSおよびtoxA遺伝子に対応するクローニングされたDNAフラグメントをハイブリダイゼーションプローブとして用い、UCBPP-PA14菌株のゲノムコスミドライブラリーで同定された。 UCBPP-PA14菌株のゲノムライブラリーは、コスミドクローニングベクターpJSR1 において標準的な方法に従って作った。このベクター自体は、pHC79(例えば、Ho hn et al．(1980)Gene 11:29参照)のバクテリオファージλcosサイトを含む1.6k b BglIIフラグメントをpRR54(例えば、Roberts et al．(1990)J．Bacteriol．17 2:6204)のBglIIサイトにライゲーションして構築した。toxA遺伝子を含むプラスミドpMS150から分離された1.7kb BamH1フラグメント(例えば、Lory et al．(198 3)Gene 22:95参照)およびplcS遺伝子を含むプラスミドpSL2から分離された3.0kb BamH1-PstIフラグメント(例えば、Lory et al．(1988)J．Bacteriol．170:714 参照 )を用いて、pJSR1でUCBPP-PA14ゲノムライブラリーをプローブした。 gacAのUCBPP-PA14相同体は、P．fluorescensgacA遺伝子の保存領域に対応する PCR増幅生成物を用いて、同じコスミドライブラリーで標準方法により同定した。gacA遺伝子配列に基づき、オリゴヌクレオチド5'-GCTAGTAGTCGATGACC-3'(配列番号1)および5'-GCTGGCATCAACCATGC-3'(配列番号2)をデザインし(Laville et al ．（1992）Proc．Natl．Acad．Sci．89:1562)、蛍光菌(Pseudomonas fluorescen s)のgacA遺伝子を含む625塩基対生成物の増幅に使用した。これは次いで上記pJS R1におけるUCBPP-PA14ゲノムライブラリーをプローブするのに使用した。Pseudo monas syringae pv．maculicolaのdegP遺伝子をプローブとして用い、UCBPP-PA1 4コスミドライブラリーでdegP遺伝子のUCBPP-PA14相同体を同定した。 4個の遺伝子を全部サブクローニングし、標準方法を用いてゲンタマイシン耐性をコードするカセットを挿入することにより突然変異を誘発した。さらに、UCBPP-PA14菌株のplcS遺伝子を含むコスミドクローンから分離した6k b BamHIフラグメントをpJSR-1由来のコスミドからpBR322のBamHI部位にサブクローニングした。plcS遺伝子のXhoI部位にゲンタマイシンをコードするDNAカセットを挿入することにより、得られたクローンpLGR101の突然変異を誘発させてpLG R201を構築した。ゲンタマイシン耐性遺伝子カセットはプラスミドpH1JIの1.8kb BamHIフラグメントである(例えば、Rubin(1987)Plasmid 18，84参照)。toxA遺伝子を含む1.6kb BamHIフラグメントをpJSR1由来のコスミドからpBR322へサブクローニングしてpLGR102を構築した後、toxA遺伝子のBglII部位にゲンタマイシンカセットを導入することにより突然変異を誘発させてプラスミドpLGR202を構築した。そして、緑膿菌のUCBPP-PA14菌株gacA遺伝子を含む2.5kb HindIII-EcoRI フラグメントをpJSR1由来のコスミドからpBR322へサブクローニングしてpLGR103 を構築した。推定gacA遺伝子を一部シークエンシングしてUCBPP-PA14 gacAがクローニングされていることを確認した。ケンタマイシンカセットをgacAのSalI部位へ挿入することにより、プラスミドpLGR103を構築した。degP遺伝子の一部を含む1.6Pst Iフラグメントを、UCBPP-PA14菌株のコスミドクローンpH126誘導体であるpPY201からpUC19のpstI部位へサブクローニングしてpNASを構築した。ゲンタマイシンカセットを含む1.6kb SalIフラグメントを、pNASのdegP遺伝子のXh oI部位に挿入してpNASGmを構築した。次に、pNASGmベクターから3.2kb SphI/XhoIフラグメントを分離し、pCVD442のSphI/XhoI部位へサブクローニングしてpPY206を構築した。このものは突然変異したdegP遺伝子を含んでいる。常法のマーカー交換手法を用いて、突然変異遺伝子をUCBPP-PA14ゲノムに移した。得られたマーカー交換突然変異の構造は、DNAブロット分析により確認した。こうして、二重クロスオーバー現象をスクリーニングするゲンタマイシン30mg /mLおよびベクター損失をスクリーニングするカルベニシリン300mg/mLを用い、R ahmeらに記載の方法(J．Bacteriol．170:575，1991)により、プラスミドpLGR201 、pLGR202、pLGR203およびpPY206をそれぞれplcS、toxA、gacAおよびdegP遺伝子の遺伝子交換に使用した。これら4つの突然変異はいずれも、栄養強化培地かまたは最小栄養培地の野生型に比べ、細菌増殖に検出できるほどの効果はなかった。生態型シロイヌナズナLlに突然変異菌株を浸み込ませることにより、シロイヌナズナモデルにおけるUCBPP-PA14の病原性に及ぼすplcS、toxA、gacAおよびdegP 突然変異の効果を調べた。野生型のUCBPP-PA14と異なり、突然変異体のいずれも葉のふやけや崩壊を起こさなかった。具体的に説明すると、同系toxA変異体は、弱い腐敗病と白化状態を起こしたが、UCBPP-PA14に特徴的な患部組織のふやけを伴うことはなかった。plcS、gacAおよびdegP変異体の症状はもっと弱い白化が起こっただけである。そうした弱毒化症状と一致するのであるが、5日後のtoxA、p lcS、gacAおよびdegP変異体の発育は、野生型に比べて、それそれ約10倍、10²倍、5x10³倍、10²倍も低かった(図2C、2D)。試験した3変異体(plcS、toxAおよびgacA)をプラスミドにある対応野生型遺伝子で相補化すると、これら変異体の増殖と症状は植物の野生型レベルまで完全に回復した。これは、UCBPP-PA14菌株のplcSRオペロンを含むゲノムライブラリーのコスミドクローンpB85の6kb BamHIフラグメントをプラスミドpRR54のBamHI部位にサブクローニングしてpLG301を構築することにより達成された。プラスミド pLG301は次いでplcS変異体の遺伝子相補を検討するために使用した。PAK菌株のt oxA遺伝子を含むプラスミドpMS150から分離した2.4kb EcoRI/EcoRVフラグメントをプラスミドpBR322のEcoRI/EcoRV部位にサブクローニングしてpLGR106を構築した。toxAを含むSphI/PstIフラグメントをpLGR106からpRR54のSphI/PStI部位にクローニングしてpLRG206を構築した。gacA遺伝子を含む1.2kbのHindIII/XhoIフラグメントをコスミドクローンpH106から分離し、プラスミドpRR54のHindIII/SalI部位にサブクローニングしてpLRG204を構築した。pLRG206およびpLRG204は、次いで、toxAおよびgacA変異体の遺伝子相補を検討するために使用した。表IIIは、マウス全厚皮膚火傷モデルにおけるこれら3種の変異体緑膿菌株に対応する致死率検討を示す。このような致死率検討において、火傷してplcSまたは toxA変異体のどちらかに感染したマウスは、野生型菌株に感染した場合(77%)に比べ、有意に低い死亡率(両方の変異体で40%)を示した。gacAおよびdegP変異体は両方とも死亡なしであった(表III)。変異体と野生型における死亡率の差は95% 以上の信頼値で統計学的に有意であった。死亡データの統計学的有意性は、イエーツあるとされた。変異体はすべて統計学的な有意を示した(plcSおよびtoxA，P=0.0 5;gacA，P=0.00005)。上記結果は、plcS、toxA、gacAおよびdegPが植物、動物両方の病原性に関係していること、また、病気発症に必要な病原体の機構の一部が動物宿主、植物宿主に共通かまたは共有されていることを示している。共有ビルレンス因子の一つであるgacAは調節レベルにおいて活性であり、ビルレンス因子の調節メカニズムが植物および動物病原体間に保存されていることを示している。plcSおよびtoxA遺伝子産物は、おそらく植物細胞、動物細胞両方において、それぞれ膜を攻撃してタンパク質合成を阻害する特異的なビルレンス決定因子である。これらの結果を第三の宿主系へ広げるため、線虫飼育アッセイで緑膿菌UCBPP- PA14の病原性を測定した。飼育アッセイは以下のように行った。まず、緑膿菌UC BPP-PA14を一昼夜培養した培養液またはdegPもしくはgacA突然変異をもつ緑膿菌 UCBPP-PA14同系菌株の5μlをNGM寒天プレートの中央に接種し、37℃で24時間培養した。室温で数時間冷却後、Caenorhabditis elegans L4段階の蠕虫8匹をプレートに入れた。次にプレートは暗所25℃でインキュベートして、死亡した蠕虫を 6時間毎に数えた。蠕虫は、動きを止め、咽頭の上下運動を示さなくなり、排便行動を示さなくなった時に死亡と判定する。図3および4は、UCBPP-PA14とそのdegPおよびgacA同系変異体をそれぞれ用いた、線虫飼育致死アッセイの結果を示す。図3、4に記載の結果は、緑膿菌UCBPP-PA 14がC．elegansを死滅させることを示している。この結果はまた、degPあるいは gacA遺伝子のいずれかを機能不全にする挿入をもつ緑臓菌UCBPP-PA14の同系変異体が線虫およびマウス全厚皮膚火傷測定両方のビルレンスで有意に減少したことも示している(図3、4；表III)。gacAは植物宿主におけるP．syringaeのビルレンス決定因子であることがわかっており、degPはP．syringae、Salmonella typhim urium両方のビルレンス因子であることが知られている。以下説明するように、本発明者らは、線虫およびシロイヌナズナで病原性の減弱を示す数種の変異体を同定するこれらのスクリーニング法を使用した。本発明者らが単離した変異体のうち三つはマウスにおいて低病原性であることが判明した。本明細書に記載のマルチ宿主動物/植物病原体系にはいくつかの実用上の問題がある。これらの結果は、例えば、病原性の分子的原理が植物および動物において極めて類似していることを示している。従って、以下説明するように、本マルチ宿主病原体系は、新規なビルレンス因子の同定と研究に使用することができる。特に全緑膿菌ゲノムは、例えば、本明細書に記載のシロイヌナズナあるいは線虫アッセイ法を用い、異なる宿主生物で個別に突然変異を誘発した緑膿菌を調べることにより、病原性関連遺伝子についてスキャンニング可能である。この手法で同定した遺伝子は、次いでマウス全厚皮膚火傷モデルで試験することができる。この系もまた細菌病原体の宿主特異性について分子的原理の解明を容易にするものである。このモデル系を使って同定したビルレンス因子は、医学および農業における病原菌病に対する新世代の化学療法を開発するための目標を提供するものである。共通のビルレンス遺伝子を同定するスクリーニングシステム緑膿菌ビルレンス因子群が3種類の異なる宿主の病原性に関係していること、そして、これらの共通ビルレンス決定因子が宿主依存性の細菌病原性の基本的な特徴を定めていることを示す上記結果に基づいて、本発明者らは、植物および動物の病原性に重要なビルレンス決定因子を同定する方法を開発した。このスクリーニング法は、マルチ宿主動物/植物病原体(例えば、緑膿菌UCBPP-PA14)を利用し、実質上どんな宿主生物においてもランダムに生成した数千個の細菌変異体を迅速にスクリーニングできることを利用するものである。有用な真核宿主生物としては、線虫(例えば、Caenorhabditis elegans)、植物(例えば、シロイヌナズナの種子や葉)、酵母もしくはその他の真菌類、魚類(例えば、ゼブラダニオ)、ハエ(例えば、キイロショウジョウバエ)、マウスなどがあるが、これらの例示には限定されない。一般に、微生物病原体は当技術分野に公知の常法により突然変異を行った後、宿主生物に対する病気発症力の測定を行う。弱毒化された病原性をもつことがわかっているかまたは非病原性とされた突然変異誘発病原体は本発明の方法に有用である。そのような変異病原体は次いで、当技術分野に公知の方法により、病原性の原因となる宿主依存性または宿主非依存性のビルレンス因子同定に使用される。以下は、3種類の異なるモデル：マウス皮膚全厚火傷モデル、C．elegans線虫飼育モデル、そしてシロイヌナズナ葉浸潤モデルに感染性であることがわかったヒト臨床分離物緑膿菌UCBPP-PA14を利用するビルレンス因子線虫スクリーニングの実施例である。シュードモナスのようなヒトあるいは植物の病原菌を調べるために宿主として線虫を使用する利点は、線虫における非病原性シュードモナスの同定が比較的簡単な点である。例えば、C．elegansのスクリーニングは、緑膿菌変異体を植えた場所にL4段階の蠕虫2匹をおき、5日後の生存蠕虫を目視することを含む。緑膿菌UCBPP-PA14のような病原菌を、常法、例えば、標準的なインビボまたはインビトロの挿入突然変異誘発法(例えば、Kleckner et al．(1977)J．Mo l．Biol．116:125)により突然変異させる。他の方法、例えば、化学的突然変異誘発も利用することができる。野生型の病原性細菌を植菌したプレートでは、ほとんどまたはすべての蠕虫が5日目まで生存できないのに対し、大腸菌もしくは非病原性変異体を植菌したプレートでは、最初2匹だった雌雄同体蠕虫の数百から数千に増えた子孫が生存している。こうして、突然変異緑膿菌の存在下発育する蠕虫は、病原性の原因となる遺伝子が不活化されたことを示すものである。不活化突然変異の位置をマッピングすると、突然変異ビルレンス因子がクローニングされ同定される(例えば、ヌクレオチドシークエンシングにより）。病原性に関係する遺伝子を同定するため、本発明者らはトランスポゾン突然変異誘発の標準的手法(例えば、Manoil et al．(1985)Proc．Natl．Acad．Sci．82 :8129;Taylor et al．(1989)J．Bacteriol．171:1870)を用いて、緑膿菌UCBPP-P A14の変異体を生成した。8000個を超える変異体が生成した。次に、上記C．eleg ans飼育アッセイ法を用いて、これら変異体のうち1900個の病原性を検定した。表IVに示すように、本発明者らはC．elegansで弱毒化された病原性を示すUCBPP- PA14変異体8個を分離した。さらに、常法(例えば、Cho et al．(1975)Phytopathology 65:425参照)を用いてレタス葉病原性アッセイにおいてトランスポゾン突然変異誘発により生成した他の変異体コレクションについてもその病原性を調べた。このアッセイ法を用い、本発明者らはレタス葉で弱毒化された病原性をもつUCBPP-PA14変異体2900個を分離した。次に、上記方法に従い、これらの変異体をシロイヌナズナ葉病原性アッセイにより調べた。表IVに示すとおり、本発明者らは、シロイヌナズナにおいて弱毒化された病原性を示すUCBPP-PA14変異体12個を分離した。次に、C．elegans飼育アッセイおよびマウス全厚皮膚火傷アッセイの両方で、シロイヌナズナ浸潤アッセイで同定したUCBPP-PA14変異体1個の病原性を調べた。このUCBPP-PA14変異体の病原性は、野生型UCBPP-PA14菌株に比べ、両方の系で低いことが判明した。さらに、本発明者らは、シロイヌナズナバイオアッセイで同定した2個の変異体について、その病原性をマウス全厚皮膚火傷アッセイで調べた。野生型UCBPP-PA14菌株に比べ、これら変異体の病原性もマウスでは低いことがわかった。これらの結果は共に、植物および動物の病原性に共通のビルレンス因子が存在するという更なる証拠を提供するものである。上記結果は、緑膿菌UCBPP-PA14とC．elegansとの間に病原性相互作用が起こることを示している。UCBPP-PA14菌株はC．elegansを死滅させる。UCBPP-PA14はまた、シロイヌナズナ葉浸潤アッセイ(図1、2；表I)でもマウス全厚皮膚火傷モデル(表II、III)においても感染性である。本発明者らはさらに、UCBPP-PA14degP およびgacA遺伝子における無効な突然変異が3モデルすべてにおいて有意に病原性を減少させることを示した。従って本発明者らは、植物、動物両方の病原性に共通のビルレンス因子が存在する証拠を初めて提供したものである。そのようなビルレンス因子は、ビルレンス因子機能と緩衝し合う化合物の単離を可能にし( 例えば、病原性の直接的減少または宿主応答の増加により)、簡単な実験システム(例えば、Caenorhabditis)でこれら化合物の同定を可能にする。線虫「急速死滅」アッセイを用いる共通ビルレンス遺伝子同定のスクリーニング系上記証拠は、PA14叢をNGM寒天で増殖させる場合、緑膿菌UCBPP-PA14菌株が2.5 〜5日間でC．elegansを死滅させることを示している。こうした条件下で観察された死滅率を「緩徐死滅」と定義する。簡単に説明すると、緩徐死滅条件下、PA 14を一昼夜培養した培養液5μlをNGM(もしくはM9)寒天プレートの中央に播種し、37℃で24時間増殖した。次いで数時間室温まで冷却した。上記寒天に第4幼虫段階(L4)の蠕虫4匹を加えたが、細菌叢とは非接触にした。蠕虫は普通菌叢に向かって移動し食餌を開始する。これに対し、より高い浸透度の高栄養培地であるペプトン-グルコース-ソルビトール(PGS)でPA14蠕虫を発育させると、異なる結果が得られた。L4蠕虫をPGSプレートに置くと、蠕虫の動きは緩慢になり、次いで麻痺状態となって4〜24時間で死に至った(図5)。蠕虫の何匹かは既に菌叢と直接接触する前に死亡した。PGS寒天におけるこのより早い死滅を「急速死滅」と称する。急速死滅と緩徐死滅における速度の差が内在するメカニズムの差によるものか、あるいは、急速死滅が緩徐死滅に見られるプロセスの単なる迅速化に過ぎないのかを調べるため、これらの条件においてPA14細菌変異株の影響を調べた。図6A 〜6Hに選択した死滅曲線を示し、そのデータを表Vに示す。図6A〜6Hに示すように、PA14 gacA遺伝子またはlasR遺伝子は両遺伝子とも細胞外ビルレンス因子の転写調節因子である(Gambello et al．(1993)Infection & Immunity 61:1180-1184;Rahme et al．(1995)，Science 268:1899-1902)が、これら遺伝子の突然変異は緩徐死滅を完全に壊滅させたが急速死滅には何の影響も与えなかった(図6A〜6D)。逆に、細胞周辺のプロテアーゼをコードするPA14 deg P遺伝子の突然変異および特性化されていない遺伝子のTnphoA挿入(TnphoA変異体 49H2)は急速死滅を劇的に減少させたが、緩徐死滅は遅延させただけである(図6E 〜6H)。図6A〜6Hおよび表Vに示すデータは、その細菌が増殖する培地に依存する C．elegansの死滅にPA14が異なるメカニズムを使っているという仮説と最も調和するものである。シュードモナスの他の種および菌株の病原性大腸菌と同様、蛍光菌(菌株55、2-79およびWCS365)とP．syringae pv．maculi cola ES4326菌株は上記緩徐死滅条件下ではC．elegansを死滅させないことが示されている。細菌ローンは完全に消費され、線虫は正常に発生し繁殖する。これに対し、大腸菌、P．syringae pv．maculicola ES4326および蛍光菌55も急速死滅条件下では非病原性であり、急速死滅条件下では蛍光菌2-79(図7A)および蛍光菌WCS365(データ図示せず)は緑膿菌PA14と同程度にビルレントであった。蛍光菌 2-79およびWCS365は両方とも効率のよい子孫コロニー形成剤(root-colonizers) であり、その真菌感染抑制力について熱心な研究が行われつつある(Mazzola et al．(1992)Appl．Environ．Microiol．58:2616-2624)。緑膿菌の菌株が異なれば異なる量の細胞外ビルレンス因子を生成する(Hamood et al．(1992)Infection & Immunity 60:510-517)ため、急速死滅条件下、緑膿菌の異なる菌株のビルレンスも検討した。図7Bに示すように、急速死滅条件下試験した他の緑膿菌株はいずれもPA14と同程度にビルレントではなかった。Presto nら(Infect．Immun．63:3497-3501，1995)は、別々の実験室で維持された同じ親 PAO1株の変異体がマウス角膜感染のビルレンスに有意差をしめすことを報告した。従って本発明者らも別々の実験室から集めたPAO1菌株を試験した。しかしながら、試験したPAO1変異体はすべてPA14よりもビルレント性は低く、これらの間に有意差はなかった(図7C)。他の緑月農菌株はPA14のようにビルレントではないため、本発明者らは以下の補足実験ではすべてPA14を使用した。緑膿菌媒介C．elegans急速死滅に影響するファクター蠕虫の発生段階本発明者らは、成虫が緩徐死滅条件下L4蠕虫よりも早く死亡することを示した。そこで急速死滅に対する感受性について蠕虫発生段階の影響を調べた。図8Aに示すように、L4蠕虫は、1日令雌雄同体成虫よりもさらに急速死滅を受けやすかった。例えば、緑膿菌PA14に曝露後12時間目にはL4蠕虫の90%以上が死亡したのに対し、同等の条件下1日令の成虫で死亡したのはたった10%にも満たなかった( 図8A)。細菌ファクター細菌には、環境刺激の変化に対応して遺伝子発現を調節する途方もない能力がある。このタイプの調節は、物理的環境の変化に対する順応および/またはビルレンス因子の発現に必須なのであろう。細菌の遺伝子発現を調節する既知のファクターの中には浸透度、温度、鉄およびリン酸の濃度、そして炭素源がある。緩徐死滅培地(NGMまたはM9)はリン酸が高濃度であるのに対し、急速死滅培地はリン酸濃度が低い。本発明者らは、M9寒天の浸透度、発育温度、鉄濃度そして炭素源を変更した場合緩徐死滅の速度に及ぼす影響を調べた。鉄の増加がわずかな死滅遅延を生じる、増殖培地の鉄濃度を除いて、その他のパラメーターはどれも緩徐死滅に有意な影響を与えなかった。これは驚くにあたらない。緩徐死滅は蠕虫消化管内における細菌の樹立と増殖の結果であり、インビトロ発育条件よりもインビボ条件のほうが緑膿菌病原性に影響を与える可能性が高いからである。浸透度ペプトン−グルコース培地(PS)の死滅率はより乾燥したプレートでは相当高かった。死滅におけるこの増加が浸透度の増加作用によるものかどうかを調べるため、ソルビトールを用いて、電解質濃度を増加させることなく浸透度を高めた。ソルビトール非含有（PG）または0.1Mもしくは0.15Mソルビトール含有(PSG)のペプトン-グルコース培地を使用した。PA14の増殖率はPG培地でもPGS培地でも同じであった。しかしながら、図8Bに示すように、培地の浸透度が高くなるにつれて、C．elegansの死亡率有意に高くなり、死滅はさらに急速となることが観察された。これは、浸透度により調整されるビルレンス因子の産生が増えることを示唆するものである。浸透度が細菌のビルレンス因子に影響するとの仮説と一致するのであるが、Aeromonas hydrophilaについて、もう一つの日和見ヒト病原体、すなわち、高い浸透度で増殖する細胞は、低浸透度の培地で増殖する細胞に比べ、溶血性、細胞毒性およびカゼイン溶解活性が増加し、魚類およびマウス病原性モデルではさらにビルレントになる病原体が報告されている(Aguilar et al．(199 7)Infect．Immn．65:1245-1250)。これに代わる仮説は、高浸透度培地での急速死滅高速化は線虫の耐性低下によるというものである。実際本発明者らは、大腸菌または非病原性PA14菌株を含有する高浸透性寒天培地(0.15Mソルビトール添加 PG)にL4 C．elegansを入れた場合、線虫は最初麻痺を起こすがその後回復することを観察した。鉄鉄の利用性は、ビルレンス因子の発現を誘発する多くの病原性細菌によって使用される重要な刺激である。鉄制限条件下ではトキシンA、アルカリプロテアーゼおよびエラスターゼの合成増加が促進される(Bjorn et al．(1978)Infection & Immunity 19:785-791;Bjorn et al．(1979)J．Bacteriol．138:193-200)。これら細胞外生成物の多くは緑膿菌病原性のビルレンスの原因となっている。この結果と一致するのであるが、緑膿菌PAO1菌株は、高鉄濃度培地で増殖させた場合に生じる損傷にくらべ、低濃度鉄培地で増殖させた場合、有意に角膜損傷が増加する(Woods et al．(1982)Infection & Immunity 35:461-464)。しかし関連するビルレンス因子は未だ報告されていない。C．elegans急速死滅に関係するビルレンス因子のいずれかが鉄調節であるかどうかを確認するため、鉄制限条件下および鉄リッチ条件下においてPA14死滅効率を調べた。図8Cに示すように、鉄キレート剤(EDDA400μM)を添加した場合、急速死滅に有意な影響はなかったのに対し、 FeCl₃を100μM添加すると死滅は有意に減少した。以上の観察からいくつかの結論を導くことができる。第一に、PGS培地はおそらく鉄制限性であるから、鉄キレート剤を添加しても利用可能な鉄濃度に有意なインパクトはなかった。第二に、鉄リッチ条件での死滅減少は、C．elegans死滅に関係するサブセット要因が生じて鉄が抑制される(転写調節)かまたは高鉄濃度で1以上の要因の活性が低下することを示唆している。温度 20℃、25℃、30℃および37℃で36時間野生型PA14ローンを増殖させることにより、PGS培地の急速死滅に及ぼす増殖温度の影響を調べた。1日令の成虫を播種後、全プレートを25℃でインキュベートした。図8Dに示すように、200℃、25℃または30℃で増殖した細菌については蠕虫死亡率に有意差は見られなかった。しかしながら、これら3種の温度で増殖したPA14は、37℃で増殖したPA14よりも有意にビルレントであった。さらに敏感なL4段階を使用した場合、死亡率における温度差は明らかではなかった(データ図示せず)。A．hydrophilaについても同様のビルレンス増加が報告されている。37℃で培養した細胞に比べ、20℃で増殖した細胞は魚類およびマウスではさらにビルレントであり、さらに高い細胞外活性を示した(Merino et al．(1992)Infect．Immun．60:4343-4349)。緑膿菌PA103菌株では、少なくとも1つのビルレンス因子が温度で調節されることがわかっている。toxA座のPA103染色体に組み込んだtoxA-lacZプロモーター融合を用いる研究においては、β-ガラクトシダーゼ産生が25℃で最高となり、温度が上昇すると減少した(Vasil et al．(1989)Mol．Microbiol．3:371-381)。しかしながら、一般に、37℃の産生に比べ、20〜30℃の上昇レベルで特定の緑膿菌ビルレンス因子が生じるかどうかは今後の検討課題である。C．elegansモデルに関連して、37℃で細胞を増殖させる場合にビルレンス低下の下にあるメカニズムを解明することは、多数のビルレンス因子をもつにも拘わらず、至適体温が37℃であるヒトおよびその他の哺乳類において緑膿菌が日和見菌であり続ける不思議な事実に一つのヒントを提供する可能性がある。炭素源多数の病原性細菌によるビルレンス決定因子の発現は増殖に使用した炭素源により支配される。PA14ビルレンスに及ぼす炭素源の効果を調べるため、最終総容量(PGS)1%のグルコースを同一濃度のグリセロールで置換することにより、PGS培地を改変した(PYS)。図8Eに示すように、炭素源としてグリセロール(PYS)の代わりにグルコース(PGS)を添加したペプトン−ソルビトールでPA14を増殖させた場合、C．elegansのPA14急速死滅はより効果的であった。PA14が両方の培地条件下で十分増殖したことから、死滅効果の差は、異なる炭素源における細菌増殖率によるものではなかった(データ図示せず)。野生型PA14はグリセロール培地でよりもグルコース培地でのほうがより効果的な死滅を示したが、lasR遺伝子にTnphoAの挿入(rpn7-lasR株)を含むPA14変異体は、炭素源としてグルコースよりもグリセロールを使用したPYSでの親株PA14よりもさらに早い死滅を示した(図8F)。rpn-lasR菌株と野生型PA14間の死滅速度は PGSでは区別できなかった。興味深いことであるが、PYSで増殖したrpn-lasR菌株は寒天の強い青緑色染色を示す。本発明者らはPYS液体培地でrpn7-lasRとPA14両方を増殖させ、野生型PA14に比べて、rpn7-lasRでのピオシアニン産生が3〜5倍に増加することを示した。その他の色素もしくは化合物の過産生は除外しなかったが、この結果は死滅率増加とピオシアニン産生増加の間に相関があることを示した。 PA14媒介急速死滅に関係する細菌ファクター急速死滅および何匹かの蠕虫は細菌と接触する前にすでに死亡したという観察は、拡散性毒素が急速死滅に重要な役割を果たすかどうかについて調べる動機となった。増殖後、細菌ローンを寒天表面から掻き取り、残留細菌にクロロホルムの蒸気をあてて殺した以外は、前記試験のように同じ条件下PGS寒天培地で緑膿菌を増殖させた。蠕虫を加える前に、ガスフード中で1時間プレートを通気することにより、残留クロロホルムを除いた。蠕虫の処理効果対照として大腸菌DH5 αを用いた。図9Aに示すように、PA14生菌存在下でも不存在下でも死滅効果は同じであった。クロロホルム処理したDH5αプレートでは蠕虫は1匹も死亡しなかったので、クロロホルム処理は線虫に何ら不利な影響を与えなかった。UV照射によるPA14死滅で同様な結果が得られた(データ図示せず)。これらの結果は、PGS寒天での細菌増殖期間後、寒天に拡散していた1またはそれ以上の化合物が急速死滅に十分であることを示した。緩徐死滅培地であるNG寒天培地で増殖させた細菌について同じクロロホルム実験を行ったが、蠕虫は1匹も死亡しなかった。これは、NGM寒天すべてにあるとすれば、拡散性毒素が非常に低濃度であるため緩徐死滅条件下の死滅には大きな影響を与えないことを示唆している。急速死滅の原因となる化合物が高温で不活化される可能性があるかどうかを調べるため、PA14細菌ローンを含むプレートを65℃に30分間または60分間加熱した。図9Bに示すように、加熱プレートと非加熱対照との間に有意な死滅差はなかった。これは急速死滅の主要ファクターが比較的熱安定性であることを示唆している。拡散性毒素が急速死滅に関係しているとの仮説をさらに裏付けるため、PA14媒介急速死滅に対するC．elegans P-糖タンパク質変異体(NL130[pgp-1(pk17);pgp- 3(pk18)])の感受性を調べた。P-糖タンパク質はATP結合膜トランスポーターの進化保存された科に属し、細胞から外因性毒素を活発に追い出すことによって細胞を毒素から保護すると考えられている(Higgins(1995)Cell 82:693-696)。NL130 菌株は欠失したpgp-1およびpgp-3遺伝子をもっており、細胞毒性剤コルヒチンおよび抗マラリア/抗原虫剤クロロキンに対して高い感受性をもつことがわかっている(Broeks et al．(1995)EMBO J．14:1858-1866)。NL130も真菌毒素フモニシンB₁に高い感受性を示す。PGS寒天で増殖したPA14に対するNL130菌株のL4段階蠕虫感受性を、親野生型N2菌株のそれと比較した。並行して、緩徐死滅条件下でNL 130とN2両方の試験も行った。図10Aに示すように、PA14algΔD4は、急速死滅は拡散性毒素により伝達されるという仮説と一致するのであるが、急速死滅条件下 PA14に4時間暴露した後もN2蠕虫の70%はなお生存していたのに対し、NL130では5 %未満しか生存していなかった。これに対し、死滅メカニズムが蠕虫消化管内で細菌のコロニー化と増殖に関係しているらしい緩徐死滅条件下ではNL130についてそのように劇的な感受性増加は観察されなかった(図10B)。急速死滅にアルギン酸は重要ではない上記のように、PA14 degP変異体は、急速死滅を生じるその能力に重大な損傷を受けた。弱毒化病原性表現型に加えて、PA14 degP変異体は、細胞外多糖類アルギン酸の過産生により、PGS寒天では野生型よりもさらに有意にムコイド状である。ムコイド状表現型と調和するのであるが、UCBPP-PA14 degP遺伝子のDNA配列分析ならびに、Boucherら(J．Bacteriol．178:511-523，1996)による異なる緑膿菌株の別のDNA配列分析によれば、degPは、アルギン酸の調節に関係することがわかっている4つの他の遺伝子と密なクラスターを形成している。PA14 degP変異体の弱毒化病原性表現型が単にアルギン酸の過産生によるものかどうかという疑問に注目して、二重PA14 degP algD変異体を構築し、C．elegansの急速および緩徐死滅条件下、試験を行った。algD遺伝子はアルギン酸生合成の初期段階を触媒する酵素GDPマンノースデヒドロゲナーゼをコードする(Deretic et al．(1987)Nucleic Acids Res．15:4567-4581;LightfootおよびJ.L.(1993)Mol．Microbiol．8:771- 782)。algDインフレーム欠失をPA14の野生型algD遺伝子とマーカー交換することによって、PA14algDΔ4を構築した。PA14algDΔ4は、アルギン酸の不存在を確認するシユードモナス分離寒天(PIA)のムコイドではなかった(Yorgey and Ausubel ，未発表)。図11A、11Bに示すように、急速死滅、緩徐死滅の両アッセイにおいて野生型PA14と同じ死滅率でC．elegansを殺虫した。これは、急速死滅にも緩徐死滅にもアルギン酸は不要であることを示している。さらに、PA14 deg PalgDD4 二重変異体は、急速死滅、緩徐死滅の両アッセイにおいてdegP変異体と同じ弱毒化病原性表現型を示した。これは、アルギン酸のほかに、degPがその他のビルレンス関連因子の調節に関係している可能性があることを示している。これらのデータに加えて、さらに2個のPA14変異体、toxA変異体とplcS変異体も急速死滅アッセイでは野生型と区別できなかった（表5）。従って、急速死滅には溶血ホスホリパーゼC(plcSによりコードされる)もエキソトキシンA(toxAによりコードされる)も必須ではない。フェナジン類は急速死滅過程に寄与する以下の物質および方法の項で詳述するように、急速死滅に欠陥のあるPA14::Tn phoAトランスポゾン挿入変異体を分離するスクリーニングを行った。これにより、野生型PA14親対照菌株に比べて弱毒化された急速死滅表現型を示す、スクリーニングされた合計2400個の中から4個の変異体を同定した。これらのPA14変異体およびその他のPA14変異体を分析したところ、PA14による急速死滅は多因子性であること、そしてこれら因子の1つはフェナジン類と総称される色素群に属していることが示唆された。 800bp IPCR生成物3'から得られた、変異体の一つである3E8のTnphoA挿入までのDNA配列をクローニングした後シークエンシングした。DNA配列の予備的分析により、変異体3E8はphZB様遺伝子におけるTnphoA挿入を規定することが明らかである。TnphoA挿入のすぐ下流にある177bpの配列は、密接に関連する蛍光菌2-79 菌株(NRRL B-15132)におけるフェナジン類の生合成に関係する遺伝子の一つ、ph zB 遺伝子とヌクレオチドレベルで69%の同一性を示した。緑膿菌もフェナジン類産生菌であり、緑膿菌により産生される最もよく特性化されたフェナジンであるピオシアミンは、動物病原性に重要な役割を果たすと示唆されている(Sorensen an d Joseph(1993)Phenazine pigments in Pseudomonas aeruginosa Infection．In Pseudomonas aeruginosa as an opportunistic pathogen(緑膿菌感染におけるフェナジン色素：日和見病原菌としての緑膿菌において)，Campa，BendenelliおよびFriedman編(ニューヨーク、Plenum Press)，pp．43-57)。重要なことは、急速死滅で低下するPA14変異体3E8もまたピオシアニン産生を欠いており、野生型レベルの50%を合成するにすぎない点である(表VI)。急速死滅プロセスにフェナジン類が関係していることを示すさらなる裏付けは、さらに2個のPA14TnphoA変異体、34B12と49H2の分析から得られた。PA14 Tnpho A変異体34B12は、ピオシアニンの野生型レベルのわずか3%を産生するだけであるが、植物病原性を弱毒化したPA14変異体のスクリーニングにより分離され、急速死滅に有意な損傷を与えた(表V)。変異体34B12は、PGS培地に特徴的な染色されないコロニーを形成した。ピオシアニン野生型レベルの11%を産生するTnphoA変異体 49H2は、これもまた染色されないコロニーを形成し、かつ、レタスに弱毒化症状を示す事実によって同定された。49H2が急速死滅でも損傷をうけたことは重要である(表5)。3E8、34B12、49H2および野生型PA14について暴露12時間後の平均死滅率は、それぞれ10%、5%、0%および87%であった(表VI)。急速死滅においてピオシアニン(およびその他のフェナジン類)が重要な役割を果たしているとの結論をさらに裏付けるため、同時転写phnA遺伝子およびphnB遺伝子の重複領域に挿入したゲンタマイシンカセットをもつPA14 phnAphnB菌株を構築した。phnA遺伝子およびphnB遺伝子は、ピオシアニン合成に必要なアントラニル酸シンターゼのαサブユニットとβサブユニットをコードする(Essar et al ．(1990)J．Bcteriol．172:884-900)。PA14 phnAphnBは、中間レベルのピオシアニンを産生し、また中間の急速死滅表現型も示した(表VI)。最後に、リン酸欠損は緑膿菌によるピオシアニン合成の引き金になること、そして高濃度のリン酸がピオシアニン産生を阻害することが知られている(Inglede w and Campbell(1969)Can．J．Microbiol．15:595-598)。従って、本発明者らは、20mMのリン酸(Pi)添加または無添加のPY寒天中PA14急速死滅試験を行った。2 種類の培地間でPA14の増殖速度に差はなかった。従前の報告と一致するのであるが、リン酸豊富な培地においてはピオシアニンの産生が少なく、これは急速死滅の弱毒化に対応している。Piリッチ培地の24%に対し、16HPEでは、Pi欠乏培地で増殖したPA14についてその平均死亡率は62%であった(図13A、13B)。急速死滅に対する宿主応答：急速死滅耐性は酸化ストレス耐性と相関する本発明者らは、酸化ストレス耐性またはより酸化ストレスを受けやすいことがこれまでわかっているC．elegans変異体を利用して、フェナジン類がPA14媒介急速死滅に重要な毒素である証拠をさらに提供する。そのようなピオシアニンおよびフェナジン-1-カルボン酸などのあるフェナジン類は、酸化還元活性化合物である。例えば、好気性条件下、ピオシアニンは自然に電子1個の還元を受け、O₂ から・O₂(スーパーオキシドアニオン)へ同時一価還元を伴う再酸化を受ける(Hass an and Fridovich(1980)J．Bacteriol．141:1556-163;Hassett et al．(1992)In fect．Immun．60:328-336)。従って、適当な還元ソースの存在下、ピオシアニンは宿主組織に細胞毒性の・O₂およびH₂O₂の流れを継続して生成することができる。シデロフォア-鉄複合体であるフェリピオケリンの存在下、これらの反応性酸素種( ROS)をさらに高毒性のヒドロキシルラジカルに変換した(Coffman et al．(1990) J．clin．Invest．86:1030-1037;Britigan et al．(1992)J．clin．Invest．90: 2187-2196)。全部ではない(Baron et al．(1989)Curr．Microbiol．18:223参照) がいくつかの研究(Hassan and Fridovich(1980)J．Bacteriol．141:1556-163;Ha ssett et al．(1992)Infect．Immun．60:328-336)により、ピオシアニンは、標的細胞においてROS生成を誘導する能力により、もう一つのスーパーオキシド発生剤であるパラコート(メチルビオローゲン)の細胞毒性に類似する、その細胞毒性を発揮することが示唆されている。長命表現型という理由でC．elegansの1齢(hx546)の変異株が同定された(Johns on，1990，Science 249:908-912)。次に、カタラーゼとスーパーオキシドジスムターゼの産生を増加することから、この変異株はH₂O₂耐性であることがわかった (Larsen（1993）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:8905-8909;Vanfleteren(1993) Biochemical Journal 292:605-608)。メチルビオローゲンに高い感受性をもつ変異株も同定され、この中にはmev-1およびrad-8が含まれる(Ishii et al．(1990) Mutation Res．237:165-171;Ishii et al．(1993)Mechanism of Aging and Deve lopment 68:1-10)。本発明者らは、緑膿菌急速死滅がピオシアニンまたは他の酸化還元活性フェナジン(類)により媒介されているとすれば、第1世代の変異株はその増加した酸化ストレス耐性ゆえに、酸化ストレス耐性でなければならないと推論した。図13Aに示すように、第1世代(hx546)はその親株N12よりもPA14による殺虫に対して有意に高い耐性を示した。逆に、メチルビオローゲン感受性の変異株mev-1(kn-1)およびrad-8(mn163)はPA14死滅に対し非常に高い感受性を示した( 図13B)。これらの結果は、緑膿菌死滅に対する線虫感受性が線虫のROS生成化合物耐性と強く相関していることを証明した。急速死滅アッセイ結果の要約緑膿菌は見事な宿主範囲をもっており、単一宿主内においてそれが感染する組織に依存する広範な病気を起こすことができる。ヒトでは、緑膿菌は火傷や外科的傷、尿路管、胃腸管、呼吸器管、目、耳そして髄膜に感染することができる(B altch and Smith(1994)Pseudomonas aeruginosa:infections and treatment. (New York:Marcel Dekker，Inc.))。特定の組織に病気を起こさせるには多数の異なるビルレンス決定因子が必要であるが、要因群は組織のタイプにより互いに違っている可能性がある。例えば、溶血ホスホリパーゼCは、火傷マウスの死亡を引き起こす重要なビルレンス因子である(Rahme et al．(1995)Science 268:18 99-1902)が、マウスの角膜感染には必須ではない(Preston et al．(1995)Infect ．Immun．63:3497-3501)。異なる細菌変異株の分析は、緑膿菌によるC．elegans 死滅にも多数の因子があることを示唆している。急速死滅に必要な因子の発現は、鉄、炭素源、温度そして浸透度により調節されているようである。急速死滅の場合、上記のデータは、ビルレンス決定因子の少なくともいくつかは熱安定な拡散性毒素であることを示している。しかしながら、PA14の同系のto xA、plcSおよびalgD変異株を調べることによって、２個の公知の毒素、溶血ホスホリパーゼCとエンドトキシンA、ならびにアルギン酸エキソポリサッカリドは、急速死滅条件下の死滅に必須ではないことが判明した。さらに、細胞外ビルレンス発現の重要な転写調節剤であるlasRに突然変異をもつ菌株は急速死滅条件下なお完全にビルレントであることを証明した。このことから、lasRによって積極的に調節される、アルカリホスファターゼ(Gambello et al．(1993)Infection & I mmunity 61:1180-4)、溶血プロテアーゼ(Toder et al．(1991)Mol．Microbiol． 5:2003-10)およびエラスターゼ(Gambello and Iglewski(1991)J．Bacteriol．17 3:3000-9)もまた急速死滅に必須ではないと結論した。さらに、ビルレンス因子は、65℃60分までの加熱により、クロロホルムにより、またはUV照射によって不活化されないことを明らかにした。これは非タンパク質性の小分子が関係していることを示唆している。フェナジン類が急速死滅に関係している証拠上記結果は、急速死滅に関係する毒素の一つがフェナジンであることを示している。これらの結果は以下の通りである。 PA14 変異株はピオシアニン産生に影響を及ぼす。急速死滅で弱毒化された変異株の一つ、3E8菌株を分析したところ、phzB様遺伝子の中央にTnphoA挿入があった。phzB遺伝子は、蛍光菌2-79菌株におけるフェナジン生合成に関係する酵素をコードすると考えられている。このことに一致するのであるが、本発明者らは、3EB菌株のphxB様遺伝子におけるTnphoA挿入が緑膿菌で最も特性化されたフェナジンであるピオシアニンの産生を50%低下させたことを示した。同様に、34B12菌株にリンクしていない遺伝子におけるTnphoA挿入は、急速死滅の減弱とピオシアニン産生における劇的な低下の両方をもたらした。ピオシアニン欠損と急速死滅減弱との相関は49H2菌株についても示された。しかしながら、49H2の突然変異が34B12か3E8の突然変異に対して対立遺伝子であり得る可能性は除外されていない。リン酸はピオシアニン産生と急速死滅との両方に影響を与える増殖培地における高濃度リン酸がピオシアニン産生を阻害することの証明に加えて、リン酸リッチ培地では、リン酸制限培地に比べると、急速死滅もまた低下することが判明した。毒素の熱安定性急速死滅に必要な拡散性化合物が熱安定性であり、クロロホルムやUVによって不活化されないという事実は、その毒素がフェナジン類であるか、1化合物としてフェナジン類をもっているとの結論と一致した。フェナジン類は熱安定性である(Dakhama et al．(1993)J．Appl．Phycology 5:297-306)。 C ．elegans変異体ピオシアニンは、スーパーオキシド類の産生を誘導することによって毒性を生じると考えられている(Hassan and Fridovich(1980)J．Bacteriol．141:1556-16 3;Hassett et al．(1992)Infect．Immun．60:328-336)。上記のように、スーパーオキシド発生剤パラコートにより耐性である蠕虫変異体第１世代(hx546)もPA1 4による急速死滅に対してはさらに高い耐性を示した。逆に、リンクしていないC ．elegans遺伝子mev-1(kn-1)またはrad-8(mn163)での突然変異はパラコートに対する感受性増強(Ishii et al.，1990，Mutation Res．237:165-171;Ishii et al ．(1993)Mechanism of Aging and Development 68:1-10)およびPA14急速死滅の増強をもたらした。急速死滅におけるピオシアニン以外のフェナジン類の役割以上要約した結果を合わせると、これらは、少なくともフェナジン類の一つ、ピオシアニンが急速死滅に重要な役割を果たすという抗い難い証拠を提供する。しかしながら、ピオシアニンは緑膿菌におけるフェナジン生合成の最終生成物である(Byng et al．(1979)J．Bacteriol．138:846-852)。ピオシアニンの他に、緑膿菌が産生する他のフェナジン類としてはオキシクロロラフィン、フェナジン -1-カルボン酸、クロロラフィン、1-ヒドロキシフェナジンおよびピオルビン（もしくはエルギノシンAおよびB）がある(Turner and Messenger(1986)Adv．Micr obial Physiol．27:211-273)。多数の緑膿菌株が1以上のフェナジンを産生することが報告されており(Byngetal．(1979)J．Bacteriol．138:846-852)、相対産生量は発育条件により影響された(Chang and Blackwood(1969)Can．J．Bacterio l．15:439-444)。上記いずれの実験でもPA14により産生される他のフェナジン類が同定あるいは定量されたことがない以上、他のフェナジン類がピオシアニンとは独立またはピオシアニンと共同して、死滅に関与している可能性がある。さらに、ピオシアニン測定はすべてKA培地で行ったが、死滅に使用した培地はPGSであった。ピオシアニンおよびその他フェナジン類の産生量が多種多様な要因に影響される以上、培地の変化が以上の結果に寄与している可能性がある。 C．elegans死滅には他のフェナジン類が重要である可能性もある。まず、以上検討したとおり、緑膿菌はピオシアニン以外のフェナジン類を産生する。緑膿菌 PAO1菌株は、たとえそれがPA14とほぼ同量のピオシアニンおよびピオルビンを産生したとしても、急速死滅条件下のPA14に比べると、有意に低い毒性であることは上記した。緑饋菌がフェナジン-1-カルボン酸や1-ヒドロキシフェナジンなど複数の他のフェナジン類を産生することがわかっている以上、PAO1の弱毒化ビルレンスは、他のフェナジン類が存在しないか、あるいは減少したその量によるとも考えられる。さらに、蛍光菌2-79菌株およびWCS365はC．elegansを殺虫することを示したが、これらの菌株はピオシアニンを産生しなかった。これらの菌株は、フザリウム立ち枯れ病や麦立ち枯れ病(それぞれF．oxysporum F．sp．liniおよびGaeumannomyces graminis var．triticiによって生じる)に対する有効なバイオ防除剤である。バイオ防除剤としての蛍光菌2-79菌株の有効性は、フェナジン抗生物質であり、緑膿菌が産生するフェナジン類の一つ、フェナジン-1-カルボン酸によるものである(Thomashaw and Weller(1988)j．Bacteriol．170:3499- 3508)。興味深いことに、ピオシアニンと同様フェナジン-1-カルボン酸もまた酸化還元循環能をもっており(Turner and Messenger(1986)Adv．Microbiol Physiol．27:21 1-273)、従ってC．elegansに対する毒性に重要なのかもしれない。 C．elegansと細菌との相互作用は拮抗性である。C．elegansが餌として細菌を利用する以上、ある種の細菌がこの捕食者に対し自分を保護するメカニズムを進化させたことは驚くことではない。上記の結果は、一般にフェナジン類、特にピオシアニンがC．elegansに対して緑膿菌が使用する拡散性毒素のうちのいくつかであることを示している。化学的な武器としてのフェナジン類の配備は、他の微生物に対し、また、アメーバなどの原虫に対してはさらに早く進化していた可能性がある。ピオシアニンの抗生物質作用もその自然環境における競合微生物の排除を助けているのかもしれない(Hassan and Fridovich(1980)J．Bacteriol．141 :1556-163)。フェナジン産生により得られる選択的な利点が非常に大きいため、ある種では発育の犠牲を払ってもなおこれを保持している。例えば、フェナジン産生菌Pseudomonas phenaziniumは、非産生変異株に比べてより小さい集落を形成し、最高細胞濃度はより低くなっている(しかし増殖速度は遅くない)。さらに、非産生変異体は栄養制限培地の産生親株よりも生存率が高い。その上、一緒に育成すると、産生親株は非産生変異株より長く生存し(Messenger and Turner(19 81)Soc．Gen．Microbiol．Quaterly 8:2263-264)、これを広げていくと、他種のその他の非産生競合菌よりも長く生存するはずである。ピオシアニンおよび他のフェナジン類を産生する緑膿菌株を用いたいくつかの研究により、これらの細菌を飲み込んだアメーバは被嚢するか死ぬかのいずれかであることが示された。フェナジン細菌が食べられていない場合もある(Singh(1945)Br．J．Expt．Pathol ．26:316-325;Groscop and Brent(1964)Can．J．Microbiol．10:579-584)。本明細書に記載の結果から、フェナジン類の死滅効果要件もまた、蛍光菌および緑膿菌がフェナジンを産生することによって、細菌食線虫に対する生存を手助けすることを示唆している。単純な真核生物生存用として最初に発明された二次的代謝物は進化の過程で吸収され、C．elegansのような食菌線虫や哺乳類感染中の貪食細胞から緑膿菌を保護している。実際、マウス火傷感染モデルでは、ピオシアニン欠損変異体である49H2、34B12および3E8も病原性が弱毒化される。材料および方法菌株およびプラスミド使用した菌株およびプラスミドを表VIIに掲記する。線虫系統および培養条件食餌源として大脳菌OP50を添加したNG寒天に系統を維持・処理した(Sulston a nd Hodgkin(1988)Methods．In The nematode Caenorhabditis elegans，Wood編( Cold Spring Harbor，NY:Cold Spring Harbor Laboratory)，pp.587-606；Lewis and Fleming(1995)Basic culture methods．In Caenorhabditis elegans:Moder n Biological Analysis of an Organism，Vol．48，Epstein and Shakes編(San Diego，CA:Academic Press)，pp．4-31)。遺伝子の命名はHorvitzら(Mol．Gen． Genet．175:129-133，1979)に記載のガイドラインによる。本明細書に使用したブリストル線虫系統は、野生型N2系(Brenner(1974)Genetics 77:71-94)および以下の系統：TJ1052、age-1(hx546)II;TK22，mev-1(kn1)III;PH13，rad-8(mn163)I を含む。これらの系はCaenorhabditisジェネティクスセンターにより提供された。培地と抗生物質細菌の培養・維持用完全培地はルリアブロス(LB)およびキングブロス(KB)(Kin g et al．(1954)J．Lab．Clin．Med．44:301-307;Miller，1972，Experiments i n Moelcular Genetics(Cold Spring Harbor，New York:Cold Spring Harbor Lab oratory))、最小栄養培地はM9(Miller(1972)Experiments in Moelcular Genetic s(Cold Spring Harbor，New York:Cold Sptring Harbor Laboratory))であった。シュードモナス分離寒天(PIA)はDifco社から入手した。NGM培地はSulstonおよびHodgkin(1988，Methods．In The nematode Caenorhabditis elegans，Wood編( Cold Spring Harbor，NY:Cold Spring Harbor Laboratory)，pp．587-606)に記載されている。ペプトン−ソルビトール(PGS)は、特記しない限り、急速死滅に使用した培地であった。この培地は1%バクトペプトン(Difco)、1% NaCl、1%グルコース、0.15Mソルビトール(Fischer Scientific)および1.7%バクトアガー(Difc o)からなる。緑膿菌PA14に用いた抗生物質濃度はリファンピシン100μg/ml、ネオマイシン200μg/ml、カルベニシリン300μg/mlであった。線虫死滅アッセイ緑膿菌による殺虫をプレートアッセイで行った。急速死滅アッセイについては、供試菌株であるPA14をキングB(King et al．(1954)J．Lab．Clin．Med．44:30 1-307)で一昼夜培養した培養液5μlをPGSまたはPG寒天を含む直径3.5cmのプレートに播種した。37℃で24時間インキュベーション後、直径約2cmの細菌ローンをプレートの中央で増殖させた。室温に冷却後(37℃のインキュベーターから取り出した後4〜12時間の範囲)、寒天に蠕虫40匹を加えた。特記しない限り、蠕虫はすべて20℃で培養し、第4幼虫(L4)段階を使用した。実験は1系統あたり3〜4回行った。ブリストルN2を野生型系として、陰性対照用に大脳菌OP50を使用した。蠕虫をまいたプレートは25℃でインキュベートした。様々な時点で死滅率を測定した。まつげピックで軽く触れたとき動きが検出できなかった場合、蠕虫は死んだと判断した。緩徐死滅アッセイは大体上記のように行った。死滅に影響するファクターＡ．浸透度の影響ペプトン-グルコース(PG)培地、または0.1Mおよび0.15Mソルビトール(Fisher) をさらに含む高浸透度PG培地を含む寒天プレートにPA14の一昼夜培養液をおいた。 B．鉄の影響鉄制限条件については、400μMのEDDA(Ankenbauer et al．(1986)J．Bacterio l．167:7-11)を添加して遊離鉄がなお利用可能であればすべてキレート化した。一方鉄リッチ条件下では鉄補助剤として100μMのFeCl₃(Meyer et al．(1996)Inf ect．Immun．64:518-523)を添加した。PGS対照に対してこれらを調べた。 C．発育温度の影響 PA14の一昼夜培養液をPGS寒天におき、20℃、25℃、30℃および37℃で36時間生育した。蠕虫を播いた後、全プレートは25℃に放置した。 D．炭素源の影響 PGSは1%のグルコース(v/v)を含む。培地のグルコース成分だけをグリセロール 1%(v/v)に置き換えてペプトン-グリセロール-ソルビトール寒天(PYS)を作った。急速死滅における欠損PA14::TnphoA変異株のスクリーニング大腸菌SM101pir菌株にTnphoA(ネオマイシン耐性Nm^rを与える)をもつ、広い宿主レンジのカルベニシリン耐性(Cb^r)自殺ベクターpRT733(Taylor(1989)J．Bacte r iol．171:1870-1878)を用いて、2つの独立PA14::TnphoA変異株ライブラリーを作った。この菌株を用いてTnphoAをPA14へ移動した。キングB培地(King et al．(1 954)J．Lab．Clin．Med．44:301-307)で接合を行い、LB培地よりも高い頻度のトランスコンジュガントを得た。候補変異株を調べるために、以下を除けば急速死滅アッセイと同じ条件を使用した。PA14::TnphoA変異株個々のクローンを平板におき、それぞれに5匹のL4蠕虫を加えた。陽性対照として野生型PA14を使用した。24時間後なお3〜5匹の生存蠕虫を含む変異株を腐敗弱毒化変異株と定義し、上記急速死減アッセイに使用した。野生型の親PA14に対し一貫して有意に低い死滅率を与えた変異株を次の特性化用に選択した。線虫急速死滅アッセイの利用緩徐死滅アッセイと同様、線虫急速死滅アッセイは病因となる微生物のビルレンス因子を同定するのに有用である。さらに、病原性を阻止したり病原性に対する生物の抵抗力を増強する治療剤を同定するのに有用である。好ましい態様において、急速死滅アッセイは、ある化合物、例えばコルヒチンなどの毒素に対する浸透度を高めた線虫系を用いて行う。そのような高浸透度をもつ線虫の例としては、P-糖タンパク質、例えば、PGP-1、PGP-3もしくはMRP-1に突然変異をもつ動物があるが、これらの例示には限定されない。そのような変異体線虫は、増加した膜浸透度のために毒素に対するその感受性が高められているため、急速死滅アッセイに有用である。この特性は、毒性化合物に対する完全感受性と完全耐性との間に著しい差があるアッセイをもたらす。一実施例において、急速死滅耐性を与えるC．elegans遺伝子の突然変異同定に F2突然変異スクリーニングを使用した。約5000個の一倍体ゲノムをスクリーニングすることによって変異体6個を同定した。これらの変異体は、急速死滅のメカニズムについての情報を提供するばかりでなくC．elegans免疫情報提供にも有用である。病原性ビルレンス因子を同定する他の宿主大型ハチミツガ（Galleria mellonella）本発明者らは、単独または上記スクリーニングアッセイのいずれかと組み合わせて、例示した生物、緑膿菌およびFusarium oxysporumの病原性ビルレンス因子を同定するのに、Galleria mellonella(大型ハチミツガ)の幼虫も有用であることを発見した。緑膿菌ハチミツガにおける緑膿菌の病原性を調べるため、以下のようにしてハチミツガの幼虫に細菌を注入した。緑膿菌の培養液をキングB培地(King et al．(1954) J．Lab．Clin．Med．44:301-307)で一昼夜増殖させた。次いでこの培養液を同じ培地で1:100に希釈した後培養した。増殖2時間後、遠心分離によって培養液を採取し、細胞を等量の10mM MgSO₄に再浮遊させた。次に各培養液をOD₆₀₀で0.1(約1 0³個/ml)まで希釈した。ハミルトン注射器を用いて、5μlの連続10倍希釈液(10⁰ 〜10⁶)をハチミツガの腹部亜脚(abdominal parapodia)の1本に注入した(Lysenko (1963)Journal of Insect Pathology，5:78-82)。常法のプレーティングにより菌数を計測した。ハチミツガの幼虫はオハイオ州セントメリーのVan der Horst Wholesaleから購入した。細菌注入後、ハチミツガの幼虫をペトリ皿におき、25℃でインキュベートした。死亡率は各幼虫の色変化(白色から黒色へ)をモニターし、幼虫の動きを判定することにより、48時間後に目視判定した。それぞれ1匹の動かない黒色幼虫を死亡とした。48時間後もなお生存している幼虫はアッセイ時間を延長しても一般に死亡することはなかった。 LD₅₀を調べるため、幼虫に細菌の系列希釈液を注入した。幼虫の死亡を判定し、そのデータをグラフにプロットした(注入菌数に対する死亡幼虫の%)。曲線の式：死亡%=A+(1-A)/(1+exp(B-G x log(菌数))) （式中Aは対照注入により死亡する幼虫のフラクション、BおよびGはその曲線に合わせて変化するパラメーターである)は、Systat Ver．5.2コンピュータープログラムを用いたデータと一致した(Systat Version 5.2 for Macintosh computer ，Systat Inc.，1992，Evanston，Illinois)。このプログラムを用い、コンピューター計算誘導ベストフィットを使用して、BおよびGを決定し、次いで以下の式に従いLD₅₀を計算した。 LD₅₀=exp（B/G）x(1-2xA)＾(1/G) ハチミツガの幼虫に変異緑膿菌(上記植物および線虫スクリーニングを用いて単離されたもの、もしくは先にクローニングした遺伝子を用いて構築したもの)を注入し、LD₅₀値を計算した。これらの実験結果を表VIII(下記)に示す。これは、ハチミツガにおけるLD₅₀値の比較と異なる2つの細菌濃度におけるマウス死滅%を示す。表VIIIの結果は、ハチミツガで増加したLD₅₀とマウスモデル系で減少した死亡との間に有意な相関があることを明らかにした。ハチミツガとマウスにおける緑膿菌のビルレンスに観察された統計的相関は、ハチミツガで減少したLD₅₀をもつ細菌分離物をスクリーニングすることによって咄乳類のビルレンス決定因子を同定できることを示す。そのようなスクリーニングが緑膿菌から広げて昆虫と哺乳動物両方にビルレントな他の病原体をも含むことができる。考えられる2個の候補は、病院感染の重大な原因であるばかりでなくハチミツガでも高い病原性を示すセラチア属およびプロテウス属の細菌である (Chadwick(1967)Federation Proceedings 26:1675-1679)。Serratia marcescens の臨床分離物の場合、ヒト表皮細胞とハチミツガの増加LD₅₀の間には相関がある (Chadwick et al．(1990)Journal of Invertebrate Pathology 55:133-134)。上記の線虫および植物スクリーニング系のように、ハチミツガ幼虫スクリーニング系は哺乳類の感染に必要な緑膿菌のビルレンス因子を同定するのに使用することができる。一実施例において、ハチミツガにおいて逓減ビルレンスをもつ緑膿菌の変異体分離物は、上記注入法を用いて同定される。常法に従って、減弱ビルレンスをもつ変異細菌のライブラリーを作り、次いで変異体分離物の培養液を 5μl中100〜1000個の細菌となるまで希釈する。次に、この量をハチミツガ幼虫に注入する。特定の変異体分離物がこの濃度でハチミツガを死滅させることができない場合、追加注入を行ってハチミツガ変異系のLD₅₀を決定する。緑膿菌の哺乳類ビルレンス因子を同定する研究をさらに行うため、昆虫モデル系でビルレンス低下を示す細菌分離物を候補として採取する。ハチミツガスクリーニング系もまた、昆虫および哺乳類の両方に感染する他の病原体と一緒に用いることができる。例えば、ハチミツガで特定病原体の野生型に対するLD₅₀を求めた後、病原体の変異誘導分離物を野生型分離物のLD₅₀よりも有意に多い量で注入する。この高い用量で死滅しない変異体が病原体ビルレンス因子の同定用候補である。フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）緑膿菌感染用モデルとしてのハチミツガ幼虫使用に成功したことが、この系で真菌であるフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）の感染をも調べる動機となった。ハチミツガにおけるフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）の病原性は以下のように決定した。F．oxysporumの胞子1個を使って、常法に従い、馬鈴薯デキストローズ寒天(Difco)プレートでF．oxysporumの培養を開始した。プレート表面をアームストロングフザリウム培地(Armstrong and Armstrong(194 8)phytopathology 38:808-826)2mlで洗浄し、同じ培地25mlを添加した小フラスコにこれらの2mlを加えた。室温に2日間保った後、F．oxysporumの不透明な胞子培養物が生じ、これを注入実験に使用した。この胞子培養物を微少遠心管でペレット化し、次にこの胞子を5mg/mlカルベニシリン添加10mM MgSO₄に再浮遊させた。カルベニシリンは、F．oxysporumに襲われる前にハチミツガ幼虫が細菌感染で死んでしまわないように含有させたものである。同じ培地で胞子培養の10倍系列希釈を作り、ハミルトン注射器を用いて、希釈液(10⁰、10^-1、10^-2および10^-3) の5μl試料をハチミツガの幼虫に注入した。常法、例えば、アームストロングフザリウム培地に希釈系列のアリコートをプレーティングし、出てきた胞子数を数えることにより、各希釈液中の胞子数を求めた。幼虫の追加セットには対照として、5mg/mlカルベニシリン添加10mM MgSO₄も注入した。注入した幼虫はペトリ皿に置いた(皿あたり10個）。25℃に7日間保った後、死亡した幼虫を数えた。死んだ幼虫は黒色に変色しており、綿毛状の白いカビで被覆されていることが多かった。 systatプログラムを使用して上記した式に幼虫死滅データをはめ込むことにより、ハチミツガにおけるF．oxysporumのLD₅₀を計算した。2つの独立した注入実験の結果を下記表IXに示す。代表的な死滅曲線は図14に示す。Systatコンピュータープログラムを使用して上記のように曲線をデータ点に合わせた(式中b=4.51 ，g=1.11)。ハチミツガにおけるF．oxysporumのLD₅₀は60個の胞子であると計算された。以上の実験により求めたハチミツガにおけるF．oxysporumのLD₅₀(約60個の胞子)は、この系が、F．oxysporumのビルレンス因子を同定するようデザインされたスクリーニングに有用であることを示した。一実施例において、常法(Kuspa a nd Loomis(1994)Genetics 138:665-674;Tang et al．(1992)Mol．Microbiol．6: 1663-1671，1992;Lu，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:12649-12653，1994;Bolk er(1995)Mol．Gen．Genet．248:547-552)に従い、制限酵素媒介組込み(REMI)によりF．oxysporumの突然変異誘導を行う。次に、ハチミツガ幼虫への注入によって低下したビルレンスについて、この方法で変異誘導した真菌ライブラリーのスクリーニングを行う。常法、例えば、挿入DNAを用いる逆PCR後隣接する真菌DNA のシークエンシングにより、ビルレンスに影響する真菌遺伝子を同定する。次いで、ハチミツガで低下ビルレンスをもつF．oxysporumを植物および高等動物において低下したビルレンスについて調べ、共通のビルレンス因子を同定する。スクリーニング系としてハチミツガを使用すれば、重要な真菌ビルレンス因子を比較的迅速かつ安価に同定できる。ハチミツガスクリーニング系の利点ハチミツガの使用は、緑膿菌、F．oxysporumおよびその他病原体の哺乳類ビルレンス因子を同定する宿主系として有利である。上記したように、この系により提供される重要な利点の一つは、変異病原体分離物が迅速かつ安価にスクリーニングできることである。種々の実験において、1時間あたり250匹までのハチミツガに緑膿菌試料を注入した。この迅速な処理量は、比較的短時間で多数の変異病原体をアッセイ可能にする。さらに、病原体のLD₅₀をハチミツガにより決定することができる。そのような決定法は異なる病原性分離物の相対的ビルレンスの測定を容易にする。さらに他の利点として、緑膿菌によるマウスの死亡は、従来使われてきた他のモデル生物よりもハチミツガのビルレンスに対してさらに良い相関を示す。従って、この系を用いて病原体変異体をスクリーニングすれば、哺乳類(例えば、ヒト)のビルレンス決定因子を同定できる可能性が高い。最後に、ハチミツガを使用すると、他のマルチ宿主スクリーニングで見つけられないビルレンス因子を同定することが可能になる。コナガ(Plutella xylostella) 本発明者らはさらに、緑膿菌の病原性ビルレンス因子を同定するのにPlutella xylostella(コナガ)の幼虫が有用であることも発見した。コナガにおける緑膿菌の病原性は、幼虫マスタードグリーン飼育アッセイを用いて測定した。以下のように緑膿菌をしみ込ませたマスタード(カラシナ)葉をコナガの幼虫に与えた。緑膿菌をキングB培地(King et al．(1954)J．Lab．Clin． Med．44:301-307)で培養した。一昼夜培養液を微少遠心管でペレット化し、次いで2回10mM MgSO₄で洗浄した。次に、細胞を10mM MgSO₄に再懸濁し、OD₆₀₀=0.1に希釈した。常法(Shelton et al．(1991)J．Ent．Sci.，26:17-26)に従い、コナガ幼虫を半合成コムギ麦芽ベース食餌で飼育した。マスタードグリーン(マサチューセッツ州ケンブリッジ、Canlbridge Natural Foodsより)を約10cm²片にカットし、緑膿菌含有10mM MgSO₄中に沈めた。沈めた葉を真空下においた後、急激に放圧すると葉の中に細菌液が浸み込む。対照として、10mM MgSO₄だけを葉に浸み込ませた。浸み込んだ葉材料を20匹のコナガ幼虫と一緒にペトリ皿にいれ23℃でインキュベートした。幼虫は自由に食餌をとった。48時間後死亡した幼虫を数えた。ピペット先端で触れた後動かない幼虫は死んだものとして計数した。野生型緑膿菌PA14株およびPAO1株はコナガ幼虫のほぼ100%を死滅させた。しかしながら、PA14の3変異体分離物では死亡率は非常に低下した。これらの結果は、(1)緑膿菌は昆虫の幼虫に消化された後致死性になること、(2)緑膿菌PA14株の変異株分離物はこのモデル系では低下したビルレンスをもつことを示した。これら結果を表X(下記)に要約する。 Drosophila melanogaster( ミバエ) さらに他の実施例において、本発明者らはミバエ、すなわち、Drosophila mel anogasterが緑膿菌の病原性評価に有用であることを発見した。ミバエにおける緑膿菌の病原性は、以下の腹部刺突(abdomen pricking)アッセイを使って測定した。標準条件下、オレゴンR、すなわち、黄白色(yw)に標識したミバエをコーンミール培地で培養した。ある菌株は細菌攻撃に対して高い感受性を示すことが明らかにされている(Lemaitre et al．(1996)Cell 86:973-983) ので、2つの異なる遺伝的背景を調べた。緑膿菌PA14株と対照として大腸菌DH5α の培養液を一昼夜キングB(King et al．(1954)J．Lab．Clin．Med．44:301-307) で培養した。一昼夜培養後、細胞を1/10に希釈し、さらに4〜5時間増殖させた。次いで細胞を2回洗浄し、蒸留水に再浮遊させた後、下記4濃度での腹部刺突用に使用した。希釈なし、1/10希釈、10倍濃縮、100倍濃縮。細菌攻撃は、異なる濃度のPA14またはDH5αに浸した細い針で麻酔した成虫ハエの腹部を刺して行った。細菌攻撃後、ハエを28℃に保ってモニターし、動かない場合には死亡したものと判定した。各細菌濃度で18〜20匹のハエを測定し、ハエ死亡の平均値と標準偏差を計算した。本発明者らは、PA14が用量依存的な方法で効果的にミバエ成虫を死滅させることを見出した。対照DH5α株の実験では死亡はほとんど観察されなかった。OrR菌株を用いたこれら実験の結果を図15にまとめる。同様の結果はyw遺伝的背景でも観察された。上述の通り、簡単な針刺突を使って成虫ハエの腹部に緑膿菌を入れるアッセイにより、緑膿菌は効果的にミバエを死滅させることがわかった。緑膿菌の正確な量を入れる他の方法として、直接注入および摂食(例えば、緑膿菌をハエ生育培地に添加することにより)があるが、これらの例示には限定されない。所望であれば、病原性実験には幼虫ハエを使ってもよい。ミバエを使う利点の一つは、このモデル生物によって容易となった多分子および遺伝的アプローチを用いて細菌病原性を調べることができる点である。ミバエは、先天免疫応答を調べる優れたモデルであり、この応答に関係する遺伝子の多くは、この昆虫からクローニングされている(Hoffmann(1995)Curr．Biol．7:4-1 0)。これら遺伝子の突然変異は、緑膿菌の多様な宿主を含むスクリーニングにより単離された細菌ビルレンス因子の突然変異と連係して使用してもよく、これらビルレンス因子の作用形式について価値ある情報を提供することができる。治療剤または植物保護剤を同定するためのスクリーニングシステム上記のように、本発明の実験結果は、一組の緑膿菌ビルレンス因子が3つの異なる宿主の病原性に関連していること、そしてこれら共通のビルレンス決定因子が宿主依存性の細菌病原性の基本的特徴を決めることを示している。この発見に基づいて、本発明者らは、動物(例えば、ヒト患者)または植物(例えば、取引対象の穀類植物)いずれかに独立して感染することができる病原性阻止に使用できる治療化合物(例えば、抗病原性薬剤)を同定するスクリーニング法を開発した。一般に、該方法は、本明細書に記載のマルチ宿主動物/植物病原体(例えば、緑膿菌UCBPP-PA14)系を使用して、治療上または農業上の活性剤用化合物を相当数スクリーニングすることを含む。植物、マウスおよび線虫の病原性に共通のビルレンス因子があるという本発明の実験に基づき、線虫のそのようなビルレンス因子機能を妨げる化合物は哺乳類(例えば、ヒト患者)や植物に有効な治療剤も提供することが容易に理解できるであろう。現在医療や農業で使われているほとんどの抗生物質は、殺菌性か制菌性のいずれかであり、従って菌株や変異株は抗生物質耐性である方が好ましいが、本明細書に記載のスクリーニング法(例えば、線虫系)で同定される化合物は細菌を殺さず、その代わりに細菌を被病原性にする。さらに、本発明のスクリーニング法はインビボで行われるから、同定された化合物が真核宿主生物に対し高い毒性を示すこともまたあり得ない。従って、本発明の方法は、細菌、真菌、ウイルス、環形動物、線虫、扁形動物および原虫によって生じる病気を含む、病原性疾病を治療する薬剤や植物保護剤などの活性剤の評価、同定および開発を簡単にするものである。一般に、本発明のスクリーニング法は、大量の個体数(これはさらに評価され少数の選り抜かれた活性物質へと絞り込まれる)から、目的の天然物抽出物あるいは化合物を選択する軽快な手段を提供する。このプール構成物質は次いで精製され、その抗病原性を測定する本発明の方法により評価される。以下、抗病原性物質としての化合物の効能を評価するスクリーニング法について詳述する。3実施例は本発明の請求範囲を例示的に説明するものであり、限定するものではない。試験抽出物および化合物一般に、新規な抗病原性薬剤や植物保護剤は、当技術分野に公知の方法に従い、天然物あるいは合成（もしくは半合成）抽出物の大きいライブラリーまたは化学ライブラリーから同定されている。供試抽出物もしくは化合物の正確な出所は本発明のスクリーニング法にとって重要でないことが薬剤の発見と開発分野の専門家には理解できるであろう。従って、本明細書に記載の方法を使用すれば、実際に相当多数の化学抽出物や化合物をスクリーニングすることができる。そのような抽出物または化合物の例としては、以下の例示に限定されることなく、植物、真菌、真核もしくは動物をもとにした抽出物、発酵ブロスおよび合成化合物ならびに既存化合物を改変したものがある。多くの方法は、相当数の化学的化合物のランダムもしくは指定の合成(例えば、半合成、一貫合成)に利用でき、こうした化学化合物としては、以下の例示に限定されることなく、糖類、脂質、ペプチドおよび核酸ベースの化合物が含まれる。合成化合物ライブラリーはブランドン・アソシエイツ(Merrimack，NH)およびアルドリッチ・ケミカル(Milwaukee，WI) から販売されている。あるいは、天然化合物のライブラリーは細菌、真菌、植物および動物抽出物の形で、バイオティクス(Sussex，UK)、ゼノバ(Slough，UK)、ハーバー・ブランチ・オーシャングラフィクス・インスティチュート(Ft．Pierc e，FL)およびファルママーUSA(Cambridge，MA)を含む多数のソースから販売されている。さらに、所望ならば、天然および合成ライブラリーは、当技術分野に公知の方法、例えば、標準的な抽出および分画法によって作られる。さらに所望ならば、標準の化学的、物理的もしくは生化学的方法を用いて、いかなるライブラリーも化合物も容易に改変される。さらに、抗病原性作用について既に知られている物質の同型もしくは反復をデレプリケーションする(例えば、分類学的デレプリケーション、生物学的デレプリケーション、および化学的デレプリケーション、またはその組合せ)、すなわち、除去する方法は、可能な場合はいつでも使用すべきであり、薬剤の発見と開発分野の専門家は容易にこれを理解している。粗抽出物に抗病原性作用があると判明した場合、陽性の結果を示す有力な抽出物については、観察された効果の元である化学的成分を単離するため、さらに分画することが必要である。従って、抽出、分画、精製法のゴールは、抗病原性作用をもつ粗抽出物の化学物質を注意深く特性化し同定することである。そのような不均一抽出物の分画・精製法は当技術分野において公知である。望ましい場合には、病原性の治療に有用な物質であることがわかった化合物は当技術分野に公知の方法に従って化学的に修飾する。病原体に対する耐性を促進するかあるいは病原体を阻害する分子もしくは化合物の効果を評価するのに有用な大量処理システムを以下に例示する。これらの例は、本発明を例示するものであり、限定ではない。線虫バイオアッセイシステム効率的系統的な方法による、大量の天然物、抽出物または化合物の大量スクリーニングを可能にするには、半自動操作および完全自動化データ収集を促進して、Caenorhabditis elegans L4雌雄同体幼虫をマイクロプレートのウエルで培養する。上記したように、本発明者らは、緑膿菌UCBPP-PA14がC．elegansに感染しこれを死滅させるのに対し、突然変異誘導ビルレンス遺伝子をもつ緑膿菌UCBPP- PA14は非病原性であることを発見した。病原体が病原性を減弱すれば、L4蠕虫は生存し、雌雄同体成虫になり、数千の生存子孫を産む。従って、C．elegansをその病原体とインキュベートすれば、緑膿菌の病原性を低下させる化合物が存在しない限り、蠕虫は死んでしまう。そのような生存子孫の存在は、標準的な顕微鏡による目視スクリーニングを含め、様々な方法を用いて容易に検出される。宿主の病原体耐性を助長したり、病原体の病原性を抑える供試化合物もしくは抽出物の能力を評価するには、病原体、例えば、緑膿菌UCBPP-PA14の一昼夜培養液を適量まいたNGM寒天に、供試化合物もしくは抽出物を適量接種する。所望なら、多様な濃度の供試化合物もしくは抽出物を接種して宿主および病原体両方の用量効果を評価することができる。対照ウエルには、供試化合物もしくは抽出物の不存在下(陽性対照)、非病原性細菌(陰性対照)もしくは病原体を接種する。プレートは次に37℃で24時間インキュベートして病原体の増殖を行う。次いでマイクロタイター皿を25℃まで冷却する。2匹のC．elegans雌雄同体幼虫を前記プレートに加え、C．elegansの正常な生理学的に無傷状態の上限である25℃でインキュベートする。適当な時間、例えば、4〜5日の間をおき、例えば、動き検出器を用いて蠕虫の動きをモニターすることにより、ウエルの生存子孫を調べる。処理幼虫と対照幼虫とを比較検討して、病原体に対する宿主耐性を促進するか、または病原体のビルレンスを阻害する供試分子または化合物の相対的効果を決定する。病原体に対する宿主耐性を効果的に刺激し、増強し、高め、増やし、もしくは促進する、または、病原体の病原性を阻害し、不活化し、抑制し、制圧し、制御し、正常な生理、繁殖あるいは蠕虫発生には悪影響を与えない、供試化合物は、本発明に有用である。植物バイオアッセイシステム効率的系統的な方法による、大量の天然物、抽出物または化合物の大量スクリーニングを可能にするには、半自動操作および完全自動化データ収集を促進して、宿主植物(例えば、種子、実生、苗木、胚子、成熟植物もしくは葉)をマイクロプレートのウエルで培養する。本バイオアッセイに有用である適当な植物宿主の特定の例としては、以下の例示に限定されることなく、ペチュニア、トマト、馬鈴薯、タバコ、シロイヌナズナ、大豆、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、コメ、オオムギ、または商業的もしくは農業的に重要なその他植物がある。植物を栽培する方法は当技術分野に公知である(例えば、Vasil，I.K.，Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants Vol．I，II，III，Laboratory Procedures a nd Their Applications，Academic Press，New York，1984;Dixon R.A.，Plant Cell Culture-A Practical Approach，IRL Press Oxford University，1985参照 )。上記したように、本発明者らは、緑膿菌UCBPP-PA14がArabidopsis thaliana( シロイヌナズナ)に感染しこれを死滅させるのに対し、突然変異誘導ビルレンス遺伝子をもつ緑膿菌UCBPP-PA14は非病原性であることを発見した。従って、病原体が病原性を減弱すれば、植物は症状を発症せず、あるいは、対照植物に対して弱毒化された症状を示すはずである。シロイヌナズナをその病原体とインキュベートすれば、緑膿菌の病原性を低下させる化合物が存在しない限り、植物は死んでしまうか様々な病気の症状(例えば、白化や腐敗病)を発症する。そのような生存実生の存在およびその随伴病気症状は、目視スクリーニングを含む様々な方法を用いて容易に検出される。宿主(例えば、シロイヌナズナ)の病原体に対する耐性を助長したり、病原体の病原性を抑える供試化合物もしくは抽出物の能力を評価するには、供試化合物もしくは抽出物を組織培養培地(例えば、固体寒天ベースの培地)に適量接種する。さらに所望なら、宿主植物は、例えば、実生もしくは小植物に供試化合物含有溶液を噴霧できる常法により、候補植物保護剤や抗病原菌化合物で前処理することができる。宿主植物は、常法の病原性スクリーニング系、例えば、上記のアラビドプシス(Arabidopsis)およびレタス葉浸潤アッセイを用いて、すなわち、常法の真空浸潤手法によりアッセイする。例えば、常法に従って、真空下病原体を宿主実生に浸み込ませる。真空浸潤後、当技術分野に公知の方法(例えば、Arabido psisの培養法は、Methods in Arabidopsis Research，Koncz，C.，Chua，N.-H. ，Schell，J.編、World Scientific Publishing Co．Pte．Ltd.，Singapore，19 92に記載されている)で実生を培養する。必要に応じて、多様な濃度の供試化合物もしくは抽出物を接種して宿主および病原体両方について用量効果を評価することができる。対照実生には非病原性細菌を浸み込ませる(陰性対照)か、もしくは供試化合物もしくは抽出物の不存在下病原菌を浸み込ませる(陽性対照)。適当な間隔、例えば、3〜5日の間をおき、病気症状について実生を調べる。処理実生と対照実生とを比較検討して、病原菌に対する宿主耐性を促進するか、または病原菌のビルレンスを阻害する供試分子または化合物の相対的効果を決定する。病原体に対する宿主耐性を効果的に刺激し、増強し、高め、増加し、もしくは促進する、または、病原体の病原性を阻害し、不活化し、抑制し、制圧し、制御し、正常な生理、再生あるいは実生発生には悪影響を与えない、供試化合物は、本発明に有用である。用途本発明の方法は、微生物のビルレンス因子および、病原性を阻害することができるかまたは病原体に対する生物の抵抗力を高めることができる化合物を同定する簡単な方法を提供する。従って、本明細書に記載の方法を用いて医療的あるいは農業的価値があると判明した化学物質は、例えば、合理的なドラッグデザインにより、薬剤、植物保護剤として、もしくは、既存の抗病原性化合物を構造的に修飾する情報として、有用である。そのような方法は、細菌、ウイルス、真菌、環形動物、線虫、扁形動物および原虫を含む、ただしこれらには限定されない、多種多彩な病原体に効果をもつ化合物をスクリーニングするのに有用である。病原性細菌の例としては、以下の例示に限定されることなく、アエロバクター(Aer obacter)、アエロモナス(Aeromonas)、アシネトバクター(Acinetobacter)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、バチルス(Bacillus)、バクテロイデス(Bacter oides)、バルトネラ(Bartonella)、ボルテラ(Bortella)、ブルセラ(Brucella)、カリマトバクテリウム(Calymmatobacterium)、カンピロバクテリウム(Campyloba cterium)、シトロバクター(Citrobacter)、クロストリジウム(Clostridium)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、エンテロバクター(Enterobacter)、エシェリキア(Eschericia)、フランシセラ(Francisella)、ヘモフィリス(Haemophilu s)、ハフニア(Hafnia)、ヘリコバクター(Helicobacter)、クレブシエラ(Clebsie lla)、レジオネラ(Legionella)、リステリア(Listeria)、モルガネラ(Morganell a)、モラクセラ(Moraxella)、プロテウス(Proteus)、プロビデンシア(Providenc ia)、シュードモナス(Pseudomonas)、サルモネラ(Salmonella)、セラチア(Serra tia)、シゲラ(Shigella)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、トレポネーマ(Treponema)、キサントモナス(Xanthomoa s)、ビブリオ(Vibrio)およびエルシニア(Yersinia)がある。治療に使用するには、本明細書に開示の方法を用いて同定した組成物もしくは薬剤を、例えば、生理食塩水のような薬学的に許容される緩衝液に配合して全身投与することができる。好ましい投与経路は、患者に継続的持続薬剤濃度を与える、例えば、皮下、静注、腹腔内、筋注もしくは皮内投与を含む。ヒト患者またはその他動物の治療は、生理学的に許容できる担体中治療有効量の抗病原性薬剤を用いて行われることになろう。適当な担体およびその組成は、例えば、マーティン（E.W.Martin）による「レミントンの製薬科学（Pharmaceutical Sciences ）」に記載されている。投与される抗病原性薬剤の量は、投与方法、患者の年齢および体重に応じて、また疾病のタイプおよびその病気の広がり程度により変化する。用量は、化合物の高い特異性により低用量が必要な場合もあるが、一般的には、他の微生物性疾病の治療に用いられるその他薬剤に使用する範囲内である。化合物は、微生物の増殖を阻害する用量を投与する。例えば、全身投与の場合、化合物は典型的には体重1kgあたり、0.1ng〜10gの範囲で投与される。農業に使用するには、本明細書に開示の方法を用いて同定した組成物もしくは薬剤を、植物の葉に噴霧剤もしくは粉剤として与える薬品として使用することができる。典型的には、感染を予防するため、病原体より前に、そのような薬剤を植物表面へ与えるのがよい。種子、球根、根、塊茎および球茎にもまた、これらに運ばれる病原体を制御することにより、あるいは、植裁場所の土壌に存在させて、植裁後の病原菌攻撃を予防する処理を行う。野菜、観賞用植物、灌木もしくは木を植える予定の土壌も、多様な微生物病原体を抑制する化学薫蒸剤で処理することができる。処理は、植裁の数日から数週間前に行うのが好ましい。薬剤は、機械化経路、例えば、トラクターを使って、あるいは手動的に与えることができる。さらに、本発明のアッセイ法を用いて同定した薬剤は、滅菌剤として使用することができる。本明細書に記載の文献および特許はすべて、各文献または特許それぞれが具体的かつ個別的に示されて引用により組み込まれると同じ程度に、参照として本明細書に組み入れられるものである。以上の記載から、当業者は本発明の基本的な特徴を容易に確認することができ、本発明について種々の変更および改変を行ってそれを様々な用途および条件に適応させることができる。従って、他の態様もまた本発明の請求の範囲に含まれる。寄託緑膿菌UCBPP-PA14株は、1995年3月22日、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、寄託番号ATCC No．55664をもっている。本出願人らは、本発明について本件特許が成立しその期間満了前に生存喪失に至った場合この菌株を取り替える義務および寄託が公衆に利用可能となるそのような特許発行についてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに通知する義務を認められている。それ以前、CFR§1.14および35USC§112に従い、特許庁長官は本寄託を利用することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ラムローレンスジー. アメリカ合衆国マサチューセッツ州ブルックリンウィンチェスターストリート 184 (72)発明者タンマン−ワアメリカ合衆国マサチューセッツ州サマービルモーガンストリート５ (72)発明者ラフクンゲイリービー. アメリカ合衆国マサチューセッツ州ニュートンヘリックロード 120 (72)発明者マハジャン−ミクロスシャリナアメリカ合衆国マサチューセッツ州ウエストロックスバリーオリオルストリート 61 (72)発明者ブロークスアンネイエンオランダ国アムステルダムヴァンホードザド 22ビー (72)発明者プラスタークロナルドエイチ．エー. オランダ国ブッサム２ワルトウェグ５ (72)発明者ジャンダージョルグアメリカ合衆国マサチューセッツ州ケンブリッジソーンダイクストリート 97 １／２ (72)発明者ハードジャクラインアメリカ合衆国カリフォルニア州サンラマンワトソンカイノンコート＃227 745

Claims

【特許請求の範囲】 1．下記の段階を含む、真核生物において病原体を阻害することができる化合物を同定する方法： (a) 少なくとも1つの候補化合物の存在下、少なくとも一つの真核生物が線虫である少なくとも2つの異なる真核生物を病原体に暴露する段階であって、該病原体および該候補化合物に対する該線虫の暴露が急速死滅条件を含む段階；および (b) 該真核生物のそれぞれにおいて該病原体を阻害する化合物を同定する段階。 2．前記真核生物が (a)線虫および植物； (b)線虫および脊椎動物； (c)線虫および無脊椎動物；または (d)線虫および昆虫のいずれかを含む、請求項1記載の方法。 3．下記の段階を含む、真核生物において病原体を阻害することができる化合物を同定する方法： (a) 少なくとも1つの候補化合物の存在下で線虫を病原体に暴露する段階であって、該病原体および該候補化合物に対する該線虫の暴露が急速死滅条件を含む段階；および (b) 該病原体を阻害する化合物を同定する段階であって、該化合物の同定は、該化合物が真核生物において病原体を阻害することができることの指標となる段階。 4．前記病原体が細菌である、請求項1または3記載の方法。 5．前記細菌が緑膿菌UCBPP-PA14である、請求項4記載の方法。 6．前記線虫がセノルハブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）である、請求項1または3記載の方法。 7．前記2つの真核生物のうちのもう一方が植物または哺乳類である、請求項1または3記載の方法。 8．前記植物がアラビドプシス（Arabidopsis）である、請求項7記載の方法。 9．下記の段階を含む、病原性ビルレンス因子を同定する方法： (a) 少なくとも1つが線虫である少なくとも2つの異なる真核生物に感染することができる病原体を同定する段階； (b) 該病原体の変異体を生成させる段階； (c) 該真核生物および該線虫を該変異病原体に暴露する段階であって、該線虫が急速死滅条件下で該病原体に暴露される段階；および (d) 該変異病原体が該生物のそれぞれにおいて病気を引き起こすことができるかどうかを決定する段階であって、野生型病原体によって引き起こされる病気に比べて該生物の両方における病気の減少により、該病原性ビルレンス因子における変異が示される段階；および (e) 該病原性ビルレンス因子を同定するマーカーとして該変異を使用する段階。 10．前記急速死滅条件がP-糖タンパク質変異をもつ線虫の使用を含む、請求項1 、3または9記載の方法。 11．下記の段階を含む、病原性ビルレンス因子を同定する方法： (a) 昆虫に感染することができる病原体を選択する段階； (b) 該病原体の変異体を生成させる段階； (c) 該昆虫を該変異された病原体に暴露する段階；および (d) 該変異病原体が該昆虫に病気を引き起こすことができるかどうかを決定する段階であって、野生型病原体によって引き起こされる病気に比べ病気の減少により、該病原性ビルレンス因子における変異が示される段階。 12．前記変異の同定が前記病原性ビルレンス因子を同定するマーカーとして使用される、請求項11記載の方法。 13．前記昆虫がガまたはハエである、請求項12記載の方法。 14．前記ガがハチミツガ（Galleria mellonella）またはコナガ（Plutella xylo stella）であり、前記ハエがミバエ（Drosophila melanogaster）である、請求項13記載の方法。 15．前記病原体が細菌または真菌である、請求項11記載の方法。 16．前記細菌がシュードモナス属の一つであるか、または前記真菌がフザリウム属の一つである、請求項15記載の方法。 17．段階(d)が病原体のLD₅₀を算定することをさらに含む、請求項11記載の方法。 18．マウス死亡率アッセイにおいて前記変異病原体の試験を行うことをさらに含む、請求項11記載の方法。 19．下記の段階を含む、真核生物において病原体を阻害することができる化合物を同定する方法： (a) 少なくとも1つの候補化合物の存在下で昆虫を病原体に暴露する段階；および (b) 該病原体を阻害する化合物を同定する段階であって、該化合物の同定は、該化合物が真核生物において病原体を阻害することができる指標となる段階。 20．前記昆虫がガまたはハエである、請求項19記載の方法。 21．前記ガがハチミツガ（Galleria mellonella）またはコナガ（Plutella xylo stella）であり、前記ハエがミバエ（Drosophila melanogaster）である、請求項20記載の方法。 22．前記病原体が細菌または真菌である、請求項19記載の方法。 23．細菌がシュードモナス属（Pseudomonas）の一つであり、真菌がフザリウム属（Fusarium）の一つである、請求項22記載の方法。