JP2002281998A - 微生物の簡易迅速測定法 - Google Patents
微生物の簡易迅速測定法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】微生物の検査において微生物を溶菌させること
なく微生物、その成分および／またはその活性（核酸、
呼吸活性やエステラーゼ活性等）を簡易かつ迅速に検出
することである。 【解決手段】細菌を捕捉するろ過膜と、マイクロタイタ
ープレートのようなデバイスとシグナルを電気信号に換
えて読み取る装置を組み合わせることにより、目視計測
による労力や測定者間の誤差に問題のある蛍光顕微鏡を
必要とせず、同時に複数の検体について簡易かつ迅速に
微生物を検出する。
なく微生物、その成分および／またはその活性（核酸、
呼吸活性やエステラーゼ活性等）を簡易かつ迅速に検出
することである。 【解決手段】細菌を捕捉するろ過膜と、マイクロタイタ
ープレートのようなデバイスとシグナルを電気信号に換
えて読み取る装置を組み合わせることにより、目視計測
による労力や測定者間の誤差に問題のある蛍光顕微鏡を
必要とせず、同時に複数の検体について簡易かつ迅速に
微生物を検出する。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、例えば環境衛生検
査または食品、衛生、医療関連品若しくはそれらを取扱
う現場等の衛生検査の分野において被検材料中の微生物
を容易に検出する方法に関する。
査または食品、衛生、医療関連品若しくはそれらを取扱
う現場等の衛生検査の分野において被検材料中の微生物
を容易に検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】例えば環境衛生検査または食品、衛生、
医療関連品若しくはそれらを取扱う現場等の衛生衛生検
査は、被検材料を寒天平板培地で直接培養する方法やメ
ンブレンフィルターを培養し、出現するコロニー等を肉
眼または実態顕微鏡等で見定めながら検査を行う方法が
一般的に利用されている。
医療関連品若しくはそれらを取扱う現場等の衛生衛生検
査は、被検材料を寒天平板培地で直接培養する方法やメ
ンブレンフィルターを培養し、出現するコロニー等を肉
眼または実態顕微鏡等で見定めながら検査を行う方法が
一般的に利用されている。
【０００３】しかし、上記培養方法では、検査に時間を
要し、操作も煩雑であることが問題であった。さらに、
環境中には生存しているにもかかわらず、一般的に用い
られている培地中で培養が困難な微生物があり、これら
の培養困難な微生物はこのような検査では検出されない
が、該微生物の一部が周囲の温度や栄養分の変化によっ
て増殖能を取り戻すこと、また、感染能や毒素産性能を
保持していることが次第に明らかになり、問題となって
いる。一方、すでに死滅した菌であっても、産生された
毒素が残存している場合もあり、この場合には死菌であ
っても検出することが重要である。
要し、操作も煩雑であることが問題であった。さらに、
環境中には生存しているにもかかわらず、一般的に用い
られている培地中で培養が困難な微生物があり、これら
の培養困難な微生物はこのような検査では検出されない
が、該微生物の一部が周囲の温度や栄養分の変化によっ
て増殖能を取り戻すこと、また、感染能や毒素産性能を
保持していることが次第に明らかになり、問題となって
いる。一方、すでに死滅した菌であっても、産生された
毒素が残存している場合もあり、この場合には死菌であ
っても検出することが重要である。
【０００４】このような微生物を培養することなく、迅
速かつ簡便に検出する方法として、微生物を蛍光染色し
て検出する方法（蛍光染色法）が知られている。蛍光染
色した後の蛍光シグナルを解析する手段として、蛍光顕
微鏡、レーザー顕微鏡、フローサイトメーターなどが用
いられる。例えばこのような目的に使用される装置とし
て、フローサイトメーターの原理を応用したChemFlow
（商品名、グンゼ産業販売）や、蛍光染色した微生物の
細胞数を自動的に計測するChemScan（商品名、グンゼ産
業販売）などが挙げられる。さらに、ろ過膜上で捕捉し
た微生物を、ＰＣＲの手法を用いて測定する方法も報告
されている。
速かつ簡便に検出する方法として、微生物を蛍光染色し
て検出する方法（蛍光染色法）が知られている。蛍光染
色した後の蛍光シグナルを解析する手段として、蛍光顕
微鏡、レーザー顕微鏡、フローサイトメーターなどが用
いられる。例えばこのような目的に使用される装置とし
て、フローサイトメーターの原理を応用したChemFlow
（商品名、グンゼ産業販売）や、蛍光染色した微生物の
細胞数を自動的に計測するChemScan（商品名、グンゼ産
業販売）などが挙げられる。さらに、ろ過膜上で捕捉し
た微生物を、ＰＣＲの手法を用いて測定する方法も報告
されている。
【０００５】しかし、フローサイトメーターを用いる方
法やＰＣＲの手法を用いる方法は、装置が高価であり、
操作も煩雑である。操作が簡便でコストも安価である蛍
光顕微鏡、レーザー顕微鏡を用いる方法は、目視計測に
よる労力や測定者間の誤差が問題である。また、上記各
検査方法によれば１度に１検体を読み取ることしかでき
ず、限られた時間内では少数の検体についてしか処理で
きないという問題もある。
法やＰＣＲの手法を用いる方法は、装置が高価であり、
操作も煩雑である。操作が簡便でコストも安価である蛍
光顕微鏡、レーザー顕微鏡を用いる方法は、目視計測に
よる労力や測定者間の誤差が問題である。また、上記各
検査方法によれば１度に１検体を読み取ることしかでき
ず、限られた時間内では少数の検体についてしか処理で
きないという問題もある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、微生
物の検査において微生物を溶菌させることなく微生物、
その成分および／またはその活性（核酸、呼吸活性やエ
ステラーゼ活性等）を簡易かつ迅速に検出することであ
る。
物の検査において微生物を溶菌させることなく微生物、
その成分および／またはその活性（核酸、呼吸活性やエ
ステラーゼ活性等）を簡易かつ迅速に検出することであ
る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、微生物をシグナ
ル発生物質により解析する手段として、細菌を捕捉する
ろ過膜と、例えばマイクロタイタープレートのようなデ
バイスとシグナルを電気信号に換えて読み取る装置を組
み合わせることにより、目視計測による労力や測定者間
の誤差に問題のある蛍光顕微鏡を必要とせず、同時に複
数の検体について簡易かつ迅速に微生物を検出する方法
を見出した。
題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、微生物をシグナ
ル発生物質により解析する手段として、細菌を捕捉する
ろ過膜と、例えばマイクロタイタープレートのようなデ
バイスとシグナルを電気信号に換えて読み取る装置を組
み合わせることにより、目視計測による労力や測定者間
の誤差に問題のある蛍光顕微鏡を必要とせず、同時に複
数の検体について簡易かつ迅速に微生物を検出する方法
を見出した。
【０００８】すなわち本発明は、 １．被検材料をろ過膜でろ過し、該被検材料中の微生物
を該ろ過膜に捕捉し、捕捉した微生物をシグナル発生物
質と反応させ、得られるシグナルを光学的に読み取る手
法により被検材料中の微生物を検査する方法において、
(a)ろ過膜上で被検材料中の微生物とシグナル発生物質
が反応しており、(b)(a)のろ過膜がデバイス上にあるか
若しくはデバイスと一体となっており、(b)のデバイス
に適合した装置を用いてシグナルの強度を電気的信号に
換えて読み取ることを特徴とする微生物検査方法、 ２．同時に複数の検体を測定することを特徴とする前項
１に記載の微生物検査方法、 ３．被検材料とシグナル発生物質を反応させた後にろ過
膜でろ過することを特徴とする前項１または２に記載の
微生物検査方法、 ４．被検材料をデバイス上でろ過し、その後シグナル発
生物質を反応させることを特徴とする前項１または２に
記載の微生物検査方法、 ５．微生物を溶菌させることなくシグナル発生物質と反
応させることを特徴とする前項１〜４のいずれか１に記
載の微生物検査方法、 ６．シグナルが蛍光シグナルであることを特徴とする前
項１〜５のいずれか１に記載の微生物検査方法、 ７．微生物が生菌と死菌の両方または生菌を検査するこ
とを特徴とする前項１〜６のいずれか１に記載の微生物
検査方法、 ８．前項１〜７のいずれか１に記載の方法に必要な試薬
をキット化または単品で構成してなる試薬、 ９．前項１〜７のいずれか１に記載の方法に必要な測定
装置、 １０．前項１〜７のいずれか１に記載の微生物検査方法
で検査して評価された物質、からなる。
を該ろ過膜に捕捉し、捕捉した微生物をシグナル発生物
質と反応させ、得られるシグナルを光学的に読み取る手
法により被検材料中の微生物を検査する方法において、
(a)ろ過膜上で被検材料中の微生物とシグナル発生物質
が反応しており、(b)(a)のろ過膜がデバイス上にあるか
若しくはデバイスと一体となっており、(b)のデバイス
に適合した装置を用いてシグナルの強度を電気的信号に
換えて読み取ることを特徴とする微生物検査方法、 ２．同時に複数の検体を測定することを特徴とする前項
１に記載の微生物検査方法、 ３．被検材料とシグナル発生物質を反応させた後にろ過
膜でろ過することを特徴とする前項１または２に記載の
微生物検査方法、 ４．被検材料をデバイス上でろ過し、その後シグナル発
生物質を反応させることを特徴とする前項１または２に
記載の微生物検査方法、 ５．微生物を溶菌させることなくシグナル発生物質と反
応させることを特徴とする前項１〜４のいずれか１に記
載の微生物検査方法、 ６．シグナルが蛍光シグナルであることを特徴とする前
項１〜５のいずれか１に記載の微生物検査方法、 ７．微生物が生菌と死菌の両方または生菌を検査するこ
とを特徴とする前項１〜６のいずれか１に記載の微生物
検査方法、 ８．前項１〜７のいずれか１に記載の方法に必要な試薬
をキット化または単品で構成してなる試薬、 ９．前項１〜７のいずれか１に記載の方法に必要な測定
装置、 １０．前項１〜７のいずれか１に記載の微生物検査方法
で検査して評価された物質、からなる。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の方法に用いられるろ過膜
は、細菌や放線菌等の原核生物、酵母やカビ等の真菌類
などの微生物を捕捉しうるものであれば特に限定されな
い。このような膜の素材としては、例えば、パルプ濾
紙、酢酸セルロース膜、ナイロン膜、ポリカーボネイト
膜、ポリテトラフルオロエチレン膜、ガラスフィルタ
ー、ニトロセルロース膜、ポリフッ化ビニリデン膜、銀
フィルター、酢酸セルロース／硝酸セルロースブレンド
膜、エチレン酢酸ビニル共重合体膜、エチレン酢酸ビニ
ル共重合体の加水分解物からなる膜、ポリエーテルスル
ホン膜、ポリビニルアセタール、ポリスルホン膜、再生
セルロース膜、ポリアクリロニトリル膜、ポリエチレン
フィルター、ポリプロピレンフィルターなどが挙げられ
る。また該ろ過膜の孔径は、微生物を膜の表面に捕捉す
るために少なくとも試験対象とする微生物よりも小さい
ことが要求される。具体的には、1.0μｍ以下、好まし
くは0.4μｍ以下、より好ましくは0.25μｍ以下であ
る。
は、細菌や放線菌等の原核生物、酵母やカビ等の真菌類
などの微生物を捕捉しうるものであれば特に限定されな
い。このような膜の素材としては、例えば、パルプ濾
紙、酢酸セルロース膜、ナイロン膜、ポリカーボネイト
膜、ポリテトラフルオロエチレン膜、ガラスフィルタ
ー、ニトロセルロース膜、ポリフッ化ビニリデン膜、銀
フィルター、酢酸セルロース／硝酸セルロースブレンド
膜、エチレン酢酸ビニル共重合体膜、エチレン酢酸ビニ
ル共重合体の加水分解物からなる膜、ポリエーテルスル
ホン膜、ポリビニルアセタール、ポリスルホン膜、再生
セルロース膜、ポリアクリロニトリル膜、ポリエチレン
フィルター、ポリプロピレンフィルターなどが挙げられ
る。また該ろ過膜の孔径は、微生物を膜の表面に捕捉す
るために少なくとも試験対象とする微生物よりも小さい
ことが要求される。具体的には、1.0μｍ以下、好まし
くは0.4μｍ以下、より好ましくは0.25μｍ以下であ
る。
【００１０】本発明におけるシグナル発生物質は特に限
定されず、一般的な微生物の検出用途に応じた種々の物
質が用いられる。このようなシグナル発生物質から得ら
れるシグナルの例として、例えば吸光度、蛍光強度、発
光強度、放射活性、ＥＳＲ強度などが挙げられる。
定されず、一般的な微生物の検出用途に応じた種々の物
質が用いられる。このようなシグナル発生物質から得ら
れるシグナルの例として、例えば吸光度、蛍光強度、発
光強度、放射活性、ＥＳＲ強度などが挙げられる。
【００１１】具体的には、例えば蛍光強度を測定する場
合の蛍光染色法が挙げられ、検出用途に応じた種々の蛍
光染色剤が用いられる。微生物の検出に用いられる蛍光
染色剤としてFITC, Lucifer Yellow CH, Rhodamine 12
3, Acridine orange, PyroninY, 7-Amino Actinomycin
D, Chromomycin A, Mithramycin, Olivomycin, 4',6-di
amidine-2-phenylindole (DAPI), Hoechst 33258, Hoec
hst 33342, Ethidiumbromide, Propidium iodide, Ethi
dium homodimer, BOBO-1, POPO-1, TOTO-1, YOYO-1, Fl
uorescein diacetate(FDA), Carboxyfluorescein diace
tate(CFDA), Carboxyfluorescein diacetateacetoxymet
hylester(CFDA-AM), 5-Cyano-2,3-ditolyl tetrazolium
chloride(CTC), Tetramethylrhodamine isothiocyanat
e(TRITC), Sulforhodamine 101 acid chloride(Texas R
ed), Cy3, 2-Hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanili
de phosphate(HNPP)等が挙げられる。
合の蛍光染色法が挙げられ、検出用途に応じた種々の蛍
光染色剤が用いられる。微生物の検出に用いられる蛍光
染色剤としてFITC, Lucifer Yellow CH, Rhodamine 12
3, Acridine orange, PyroninY, 7-Amino Actinomycin
D, Chromomycin A, Mithramycin, Olivomycin, 4',6-di
amidine-2-phenylindole (DAPI), Hoechst 33258, Hoec
hst 33342, Ethidiumbromide, Propidium iodide, Ethi
dium homodimer, BOBO-1, POPO-1, TOTO-1, YOYO-1, Fl
uorescein diacetate(FDA), Carboxyfluorescein diace
tate(CFDA), Carboxyfluorescein diacetateacetoxymet
hylester(CFDA-AM), 5-Cyano-2,3-ditolyl tetrazolium
chloride(CTC), Tetramethylrhodamine isothiocyanat
e(TRITC), Sulforhodamine 101 acid chloride(Texas R
ed), Cy3, 2-Hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanili
de phosphate(HNPP)等が挙げられる。
【００１２】例えば、微生物の二本鎖核酸を検出部位と
する蛍光染色剤として、4',6'-diamidine-2-phenylindo
le(DAPI), Ethidium bromideなどが用いられる。この場
合には、二本鎖核酸を有する微生物であれば、生菌、死
菌の区別なく検出が可能である。また、エステラーゼ活
性を持つ微生物検出用染色剤として、Fluorescein diac
etate(FDA), 6-carbixyfluorescein diacetate(6CFDA)
などが用いられ、更に、呼吸活性を有する微生物の検出
には5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride(CTC)
が用いられる。これらの染色剤を使用した場合は、微生
物の生理活性に基づいた生菌を検出することができる。
する蛍光染色剤として、4',6'-diamidine-2-phenylindo
le(DAPI), Ethidium bromideなどが用いられる。この場
合には、二本鎖核酸を有する微生物であれば、生菌、死
菌の区別なく検出が可能である。また、エステラーゼ活
性を持つ微生物検出用染色剤として、Fluorescein diac
etate(FDA), 6-carbixyfluorescein diacetate(6CFDA)
などが用いられ、更に、呼吸活性を有する微生物の検出
には5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride(CTC)
が用いられる。これらの染色剤を使用した場合は、微生
物の生理活性に基づいた生菌を検出することができる。
【００１３】本発明の方法に用いられるデバイスとは、
デバイス上で微生物とシグナル発生物質を反応させて、
得られたシグナルを自動読取装置に読み取らせることが
可能なものをいう。具体的には公知のマイクロタイター
プレートを利用することができる。例えば、複数のウェ
ルを有するマイクロタイタープレートを利用する場合
は、一度に複数の検体を処理することが可能である。ウ
ェルの数、大きさは、特に限定されないが、一般には６
〜９６ウェルのプレートが用いられる。９６ウェルのプ
レートをデバイスとして使用した場合には、最大９６検
体について、同時に読み取ることが可能となる。また、
ウェルの大きさは、被検材料や検体の量により適宜選択
することができる。ウェルの大きさは、例えば直径2.5m
m〜50mmのものが使用される。
デバイス上で微生物とシグナル発生物質を反応させて、
得られたシグナルを自動読取装置に読み取らせることが
可能なものをいう。具体的には公知のマイクロタイター
プレートを利用することができる。例えば、複数のウェ
ルを有するマイクロタイタープレートを利用する場合
は、一度に複数の検体を処理することが可能である。ウ
ェルの数、大きさは、特に限定されないが、一般には６
〜９６ウェルのプレートが用いられる。９６ウェルのプ
レートをデバイスとして使用した場合には、最大９６検
体について、同時に読み取ることが可能となる。また、
ウェルの大きさは、被検材料や検体の量により適宜選択
することができる。ウェルの大きさは、例えば直径2.5m
m〜50mmのものが使用される。
【００１４】ろ過操作から読取りまでの一態様として、
被検材料を公知のろ過装置を用いてろ過後、該ろ過膜を
デバイス上に置き、捕捉した微生物とシグナル発生物質
を反応させ、検査を行うことができる。例えば、デバイ
スがウェルを有するマイクロタイタープレートの場合に
は、ろ過後のろ過膜をウェル内に置き、該ウェル内でろ
過膜に捕捉された微生物とシグナル発生物質を反応さ
せ、該マイクロタイタープレートから得られるシグナル
強度を装置を用いて読取ることにより検査することがで
きる。
被検材料を公知のろ過装置を用いてろ過後、該ろ過膜を
デバイス上に置き、捕捉した微生物とシグナル発生物質
を反応させ、検査を行うことができる。例えば、デバイ
スがウェルを有するマイクロタイタープレートの場合に
は、ろ過後のろ過膜をウェル内に置き、該ウェル内でろ
過膜に捕捉された微生物とシグナル発生物質を反応さ
せ、該マイクロタイタープレートから得られるシグナル
強度を装置を用いて読取ることにより検査することがで
きる。
【００１５】また、別の態様として、デバイスと一体に
なったろ過膜を使用してろ過することもできる。本発明
におけるデバイスと一体になったとろ過膜とは、例え
ば、マイクロタイタープレートのようなウェルを有する
プレートのウェル底面が貫通しており、該底面に組み込
まれて一体となったろ過膜が挙げられる。また、別の例
として、デバイスが複数のウェルを有する部材を二層張
り合わせた構造を含み、該二層の部材の間にろ過膜がは
さまれて、デバイスと一体となったろ過膜が挙げられ
る。上記デバイスと一体となったろ過膜は、デバイス本
体に固定されていても良く、またデバイス本体から取り
外すことが可能な構造をしていても良い。
なったろ過膜を使用してろ過することもできる。本発明
におけるデバイスと一体になったとろ過膜とは、例え
ば、マイクロタイタープレートのようなウェルを有する
プレートのウェル底面が貫通しており、該底面に組み込
まれて一体となったろ過膜が挙げられる。また、別の例
として、デバイスが複数のウェルを有する部材を二層張
り合わせた構造を含み、該二層の部材の間にろ過膜がは
さまれて、デバイスと一体となったろ過膜が挙げられ
る。上記デバイスと一体となったろ過膜は、デバイス本
体に固定されていても良く、またデバイス本体から取り
外すことが可能な構造をしていても良い。
【００１６】例えば、デバイスと一体となったろ過膜を
用いて被検材料をろ過し、該ろ過膜上の捕捉微生物とシ
グナル発生物質を反応させ、該デバイスを装置に設置
し、検査することができる。また、被検材料をろ過した
デバイスと一体になったろ過膜を該デバイス本体から取
り外し、別のデバイス上に置き、シグナル発生物質を反
応させ、検査することもできる。
用いて被検材料をろ過し、該ろ過膜上の捕捉微生物とシ
グナル発生物質を反応させ、該デバイスを装置に設置
し、検査することができる。また、被検材料をろ過した
デバイスと一体になったろ過膜を該デバイス本体から取
り外し、別のデバイス上に置き、シグナル発生物質を反
応させ、検査することもできる。
【００１７】さらに別の態様として、被検材料を予めシ
グナル発生物質と反応させたものをろ過し、デバイス上
にシグナル発生物質と反応した微生物を捕捉したろ過膜
を置き、検査することも可能である。デバイスと一体と
なったろ過膜で、被検材料を予めシグナル発生物質と反
応させたものをろ過し、シグナル発生物質と反応した微
生物を捕捉したものを検査することも可能である。
グナル発生物質と反応させたものをろ過し、デバイス上
にシグナル発生物質と反応した微生物を捕捉したろ過膜
を置き、検査することも可能である。デバイスと一体と
なったろ過膜で、被検材料を予めシグナル発生物質と反
応させたものをろ過し、シグナル発生物質と反応した微
生物を捕捉したものを検査することも可能である。
【００１８】本発明の方法に使用される測定装置は、吸
光度、蛍光強度、発光強度、放射活性、ＥＳＲ強度など
微生物と反応して得たシグナルを、目的に応じて電気信
号に換えて読み取る装置であってデバイスに適合するも
のであれば、公知の測定機器を利用することができる。
デバイスに適合する装置とは、例えばデバイスがマイク
ロタイタープレートの場合には、該プレートを装置に設
置して目的とするシグナルを読み込むことができる装置
をいう。例えば、シグナルが蛍光の場合には、マイクロ
タイタープレート用自動蛍光分析装置を使用することが
できる。
光度、蛍光強度、発光強度、放射活性、ＥＳＲ強度など
微生物と反応して得たシグナルを、目的に応じて電気信
号に換えて読み取る装置であってデバイスに適合するも
のであれば、公知の測定機器を利用することができる。
デバイスに適合する装置とは、例えばデバイスがマイク
ロタイタープレートの場合には、該プレートを装置に設
置して目的とするシグナルを読み込むことができる装置
をいう。例えば、シグナルが蛍光の場合には、マイクロ
タイタープレート用自動蛍光分析装置を使用することが
できる。
【００１９】本発明の方法は、ろ過して捕捉された被検
材料を目的に応じて複数のシグナル発生物質を反応させ
て行うことができる。具体的には、例えば二本鎖核酸を
検出部位とする蛍光染色剤と、エステラーゼ活性を持つ
微生物検出用染色剤または呼吸活性を有する微生物の検
出用の染色剤を組合わせて使用することができる。また
用途によっては、これらを適宜組合わせることもでき
る。分析は、各蛍光染色剤に応じて適切な励起波長およ
び測定波長を選択して行うことができ、各目的に応じた
シグナルを得ることができる。
材料を目的に応じて複数のシグナル発生物質を反応させ
て行うことができる。具体的には、例えば二本鎖核酸を
検出部位とする蛍光染色剤と、エステラーゼ活性を持つ
微生物検出用染色剤または呼吸活性を有する微生物の検
出用の染色剤を組合わせて使用することができる。また
用途によっては、これらを適宜組合わせることもでき
る。分析は、各蛍光染色剤に応じて適切な励起波長およ
び測定波長を選択して行うことができ、各目的に応じた
シグナルを得ることができる。
【００２０】本発明の方法は、ろ過膜に捕捉した微生物
を溶菌させないで測定することができる。
を溶菌させないで測定することができる。
【００２１】本発明の検査の対象として、例えば、河川
水や飲用水などで衛生上問題となるものが挙げられ、例
えば細菌や放線菌等の原核生物、酵母やカビ等の真菌類
などの微生物が挙げられる。代表的な細菌として、大腸
菌、サルモネラ菌、腸炎ビブリオ、カンピロバクター、
リステリア菌、レジオネラ菌などが挙げられる。
水や飲用水などで衛生上問題となるものが挙げられ、例
えば細菌や放線菌等の原核生物、酵母やカビ等の真菌類
などの微生物が挙げられる。代表的な細菌として、大腸
菌、サルモネラ菌、腸炎ビブリオ、カンピロバクター、
リステリア菌、レジオネラ菌などが挙げられる。
【００２２】被検試料は、微生物を検査するために採取
または調製されたものであれば特に限定されないが、た
とえば食品、衛生、医療関連品若しくはそれらを取扱う
現場や環境衛生検査のために採取された試料等が挙げら
れる。具体例として、河川水、風呂水、飲用水、殺菌
水といった水を主体とするもの、牛乳、ジュース、炭
酸飲料水などの飲用物、牛、豚、鶏肉などの肉類や魚
類、その他食品全般、厨房や食品工場などで使用する
調理器具等のふき取り液、衛生用品、化粧品、医薬部
外品類などが挙げられる。本発明の方法は、１度に複数
の検体を検査することが可能となるため、特に大量の被
検試料を処理する場合に有用であり、例えば各被検試料
の１次的な検査を行う場合に利用することができる。
または調製されたものであれば特に限定されないが、た
とえば食品、衛生、医療関連品若しくはそれらを取扱う
現場や環境衛生検査のために採取された試料等が挙げら
れる。具体例として、河川水、風呂水、飲用水、殺菌
水といった水を主体とするもの、牛乳、ジュース、炭
酸飲料水などの飲用物、牛、豚、鶏肉などの肉類や魚
類、その他食品全般、厨房や食品工場などで使用する
調理器具等のふき取り液、衛生用品、化粧品、医薬部
外品類などが挙げられる。本発明の方法は、１度に複数
の検体を検査することが可能となるため、特に大量の被
検試料を処理する場合に有用であり、例えば各被検試料
の１次的な検査を行う場合に利用することができる。
【００２３】本発明は、上記に示した微生物の検査方法
に用いられる試薬をキット化または単品で構成してなる
試薬も含む。また、本発明の方法に使用される測定装置
も含む。さらに、本発明は上記に示した微生物の検査方
法で検査して評価された物質も含む。ここに、検査して
評価された物質とは、実際に検査に供して評価された物
質の他、該検査によって評価されたひとつの集団に含ま
れる物質で、実質的に評価されたもの、たとえば実際に
評価された物質と同一ロットに含まれる物質をも包含さ
れるものである。
に用いられる試薬をキット化または単品で構成してなる
試薬も含む。また、本発明の方法に使用される測定装置
も含む。さらに、本発明は上記に示した微生物の検査方
法で検査して評価された物質も含む。ここに、検査して
評価された物質とは、実際に検査に供して評価された物
質の他、該検査によって評価されたひとつの集団に含ま
れる物質で、実質的に評価されたもの、たとえば実際に
評価された物質と同一ロットに含まれる物質をも包含さ
れるものである。
【００２４】
【実施例】以下に、実施例を示して本発明をさらに具体
的に説明するが、これらは単なる例示であって本発明を
限定するものではない。
的に説明するが、これらは単なる例示であって本発明を
限定するものではない。
【００２５】
【実施例１】大腸菌（Escherichia coli）を、終濃度が
108,107,106,105,104 cell/mLとなるように、リン酸緩
衝液を用いて調製したものを、各々蛍光染色剤 SYBER G
reenI（Molecular Probes社製）を室温にて５分間染色
し、検体とした。
108,107,106,105,104 cell/mLとなるように、リン酸緩
衝液を用いて調製したものを、各々蛍光染色剤 SYBER G
reenI（Molecular Probes社製）を室温にて５分間染色
し、検体とした。
【００２６】ポリカーボネート製ろ過膜（直径25mm、孔
径0.2μm、黒色、ADVANTEC社製）に、各検体を200μLず
つトラップさせた。この条件で、ろ過膜あたり2×107,
2×106, 2×105, 2×104, 2×103cellのE. coliがトラ
ップされており、これは倍率1000倍の蛍光顕微鏡１視野
（0.1mm×0.1mm）あたり約1000, 100, 10, 1, 0.1 cell
に相当する密度となる。
径0.2μm、黒色、ADVANTEC社製）に、各検体を200μLず
つトラップさせた。この条件で、ろ過膜あたり2×107,
2×106, 2×105, 2×104, 2×103cellのE. coliがトラ
ップされており、これは倍率1000倍の蛍光顕微鏡１視野
（0.1mm×0.1mm）あたり約1000, 100, 10, 1, 0.1 cell
に相当する密度となる。
【００２７】E. coliがトラップされた各ろ過膜および
トラップされていないろ過膜を６ウェルのプレートにセ
ットし、自動蛍光分析装置（CYTOFLUOR II, PerSeptive
Biosystemys製）を用いて測定した。測定は、励起波長
494nm、測定波長521nmの条件で行った。その結果を図１
に示した。
トラップされていないろ過膜を６ウェルのプレートにセ
ットし、自動蛍光分析装置（CYTOFLUOR II, PerSeptive
Biosystemys製）を用いて測定した。測定は、励起波長
494nm、測定波長521nmの条件で行った。その結果を図１
に示した。
【００２８】
【発明の効果】以上説明したように、微生物を溶菌させ
ることなく微生物、その成分および／またはその活性
（核酸、呼吸活性やエステラーゼ活性等）を簡易かつ迅
速に検出することができた。本発明の方法を採用するこ
とにより、大量の被検試料について迅速に検査すること
が可能となるため、特に１次的な衛生微生物検査を行う
場合に有用である。
ることなく微生物、その成分および／またはその活性
（核酸、呼吸活性やエステラーゼ活性等）を簡易かつ迅
速に検出することができた。本発明の方法を採用するこ
とにより、大量の被検試料について迅速に検査すること
が可能となるため、特に１次的な衛生微生物検査を行う
場合に有用である。
【図１】大腸菌数と蛍光強度の関係を示した説明図であ
る。（実施例１）
る。（実施例１）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:19 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｍ 1/34 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｑ 1/44 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 池田 昌郁 兵庫県神戸市西区室谷１丁目１−２ 国際 試薬株式会社研究開発センター内 Ｆターム(参考） 2G045 AA28 BB05 BB24 CB21 FA16 FA26 FA29 FB12 GC10 GC15 GC22 4B029 AA07 BB02 FA11 4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ32 QQ42 QR66 QS12 QS22 QS28 QX01
Claims (10)
- 【請求項１】被検材料をろ過膜でろ過し、該被検材料中
の微生物を該ろ過膜に捕捉し、捕捉した微生物をシグナ
ル発生物質と反応させ、得られるシグナルを光学的に読
み取る手法により被検材料中の微生物を検査する方法に
おいて、(a)ろ過膜上で被検材料中の微生物とシグナル
発生物質が反応しており、(b)(a)のろ過膜がデバイス上
にあるか若しくはデバイスと一体となっており、(b)の
デバイスに適合した装置を用いてシグナルの強度を電気
的信号に換えて読み取ることを特徴とする微生物検査方
法。 - 【請求項２】同時に複数の検体を測定することを特徴と
する請求項１に記載の微生物検査方法。 - 【請求項３】被検材料とシグナル発生物質を反応させた
後にろ過膜でろ過することを特徴とする請求項１または
２に記載の微生物検査方法。 - 【請求項４】被検材料をデバイス上でろ過し、その後シ
グナル発生物質を反応させることを特徴とする請求項１
または２に記載の微生物検査方法。 - 【請求項５】微生物を溶菌させることなくシグナル発生
物質と反応させることを特徴とする請求項１〜４のいず
れか１に記載の微生物検査方法。 - 【請求項６】シグナルが蛍光シグナルであることを特徴
とする請求項１〜５のいずれか１に記載の微生物検査方
法。 - 【請求項７】微生物が生菌と死菌の両方または生菌を検
査することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１に記
載の微生物検査方法。 - 【請求項８】請求項１〜７のいずれか１に記載の方法に
必要な試薬をキット化または単品で構成してなる試薬。 - 【請求項９】請求項１〜７のいずれか１に記載の方法に
必要な測定装置。 - 【請求項１０】請求項１〜７のいずれか１に記載の微生
物検査方法で検査して評価された物質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001088128A JP2002281998A (ja) | 2001-03-26 | 2001-03-26 | 微生物の簡易迅速測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001088128A JP2002281998A (ja) | 2001-03-26 | 2001-03-26 | 微生物の簡易迅速測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002281998A true JP2002281998A (ja) | 2002-10-02 |
Family
ID=18943265
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001088128A Withdrawn JP2002281998A (ja) | 2001-03-26 | 2001-03-26 | 微生物の簡易迅速測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002281998A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005103371A (ja) * | 2003-09-29 | 2005-04-21 | Fuji Electric Holdings Co Ltd | メタン発酵処理方法 |
| WO2007010641A1 (ja) | 2005-07-21 | 2007-01-25 | Kyushu University | 微生物検出法及び微生物検出キット |
| JP7774757B1 (ja) * | 2025-04-17 | 2025-11-21 | アサヒ飲料株式会社 | バックグラウンド蛍光の低減方法及び微生物の検出方法 |
-
2001
- 2001-03-26 JP JP2001088128A patent/JP2002281998A/ja not_active Withdrawn
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005103371A (ja) * | 2003-09-29 | 2005-04-21 | Fuji Electric Holdings Co Ltd | メタン発酵処理方法 |
| WO2007010641A1 (ja) | 2005-07-21 | 2007-01-25 | Kyushu University | 微生物検出法及び微生物検出キット |
| US8026079B2 (en) | 2005-07-21 | 2011-09-27 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Method for detection of microorganism and kit for detection of microorganism |
| US8143018B2 (en) | 2005-07-21 | 2012-03-27 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Method for preparing a measurement sample for detecting live cells of a microorganism in a test sample |
| US8241866B2 (en) | 2005-07-21 | 2012-08-14 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Method for detection of microorganism and kit for detection of microorganism |
| JP7774757B1 (ja) * | 2025-04-17 | 2025-11-21 | アサヒ飲料株式会社 | バックグラウンド蛍光の低減方法及び微生物の検出方法 |
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