JP2002114710A - 抗腫瘍剤と共にモノクローナル抗体を用いた治療剤 - Google Patents
抗腫瘍剤と共にモノクローナル抗体を用いた治療剤Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
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-
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-
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-
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-
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトＥＧＦレセプターを発現し且つＥＧＦに
よって細胞分裂促進を刺激されるヒト腫瘍細胞をもつヒ
ト癌患者を治療する治療剤を提供すること。 【解決手段】 ヒトＥＧＦレセプターを発現し且つＥＧ
Ｆによって細胞分裂促進を刺激されるヒト腫瘍細胞をも
つヒト癌患者を治療するために抗腫瘍剤と共に用いる有
効量のモノクローナル抗体を有すると共に、（ｉ）該抗
体は該腫瘍細胞のヒトＥＧＦレセプターの細胞外ドメイ
ンに結合し、（ｉｉ）該抗体は該抗腫瘍剤に結合せず、
且つ（ｉｉｉ）該抗体はＥＧＦのヒトＥＧＦレセプター
への結合を阻害することを特徴とする治療剤によって達
成される。 【効果】 ヒトＥＧＦレセプターと抗腫瘍剤とを併用す
ることによってこれらの薬剤のそれぞれの単独使用から
は予測され得なかった相乗効果を達成し得る。
よって細胞分裂促進を刺激されるヒト腫瘍細胞をもつヒ
ト癌患者を治療する治療剤を提供すること。 【解決手段】 ヒトＥＧＦレセプターを発現し且つＥＧ
Ｆによって細胞分裂促進を刺激されるヒト腫瘍細胞をも
つヒト癌患者を治療するために抗腫瘍剤と共に用いる有
効量のモノクローナル抗体を有すると共に、（ｉ）該抗
体は該腫瘍細胞のヒトＥＧＦレセプターの細胞外ドメイ
ンに結合し、（ｉｉ）該抗体は該抗腫瘍剤に結合せず、
且つ（ｉｉｉ）該抗体はＥＧＦのヒトＥＧＦレセプター
への結合を阻害することを特徴とする治療剤によって達
成される。 【効果】 ヒトＥＧＦレセプターと抗腫瘍剤とを併用す
ることによってこれらの薬剤のそれぞれの単独使用から
は予測され得なかった相乗効果を達成し得る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なハイブリッ
ドセルライン、特にヒトＥＧＦレセプターを発現するヒ
ト腫瘍細胞の成長（増殖）を阻止することができる上皮
細胞成長因子（epidermal growth factor)（ＥＧＦ）に
対するヒトレセプターに特異性をもつモノクローナル抗
体の産生のためのハイブリッドセルライン及びそのよう
にして産生された抗体及びその抗体を有効成分として含
有する医薬、そして特にそのＥＧＦレセプター抗体と抗
腫瘍剤とを含有する医薬に関する。
ドセルライン、特にヒトＥＧＦレセプターを発現するヒ
ト腫瘍細胞の成長（増殖）を阻止することができる上皮
細胞成長因子（epidermal growth factor)（ＥＧＦ）に
対するヒトレセプターに特異性をもつモノクローナル抗
体の産生のためのハイブリッドセルライン及びそのよう
にして産生された抗体及びその抗体を有効成分として含
有する医薬、そして特にそのＥＧＦレセプター抗体と抗
腫瘍剤とを含有する医薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞の生育は可溶性の成長因子と細胞膜
レセプターとの相互作用により制御されている。
レセプターとの相互作用により制御されている。
【０００３】上皮細胞の細胞分裂刺激（mitogenic stim
ulation)の最初のステップは上皮細胞成長因子レセプタ
ー（ＥＧＦレセプター）として知られる膜のグリコプロ
ティンに上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）が特異的に結合す
ることである。（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，
Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ，Ａ
ｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏ
ｌ．４８，１９３−２１６（１９７９））。ＥＧＦレセ
プターは１，１８６個のアミノ酸からなっており、それ
は６２１個の残基からなる細胞外の部分と５４２個の残
基からなる細胞質内の部分とに分けられ、それらは２３
個の残基からなる単一の疎水性の細胞膜を横断するセグ
メントによって結合されている。（Ｕｌｌｒｉｃｈ，ｅ
ｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏ
ｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ｃＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅ ａ
ｎｄ Ａｂｅｒｒａｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ａ−４
３１ ＥｐｉｄｅｒｍｏｉｄＣａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅ
ｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３０９，４１８−４２
５（１９８６））。ＥＧＦレセプターの細胞外の部分は
４個のドメインに分けることができる。最近、２個のシ
ステインのドメインによってその側面を接した残基３３
３から４６０のドメインIII がレセプターのＥＧＦ結合
部分を含んでいるらしいことが示された。（Ｌａｘ，ｅ
ｔ ａｌ．，Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｍ
ｙｊｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍ
ａｉｎｆｏｒ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆ
ａｃｔｏｒ ｂｙ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌａｂｅｌｌｉ
ｎｇ，Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．
８，１８３１−１８３４（１９８８））。ＥＧＦのドメ
インIII への結合は多面的発現反応（ｐｌｅｉｏｔｒｏ
ｐｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）を引き起こし、ＤＮＡ合
成及び細胞増殖に導く。
ulation)の最初のステップは上皮細胞成長因子レセプタ
ー（ＥＧＦレセプター）として知られる膜のグリコプロ
ティンに上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）が特異的に結合す
ることである。（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，
Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ，Ａ
ｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏ
ｌ．４８，１９３−２１６（１９７９））。ＥＧＦレセ
プターは１，１８６個のアミノ酸からなっており、それ
は６２１個の残基からなる細胞外の部分と５４２個の残
基からなる細胞質内の部分とに分けられ、それらは２３
個の残基からなる単一の疎水性の細胞膜を横断するセグ
メントによって結合されている。（Ｕｌｌｒｉｃｈ，ｅ
ｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏ
ｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ｃＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅ ａ
ｎｄ Ａｂｅｒｒａｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ａ−４
３１ ＥｐｉｄｅｒｍｏｉｄＣａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅ
ｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３０９，４１８−４２
５（１９８６））。ＥＧＦレセプターの細胞外の部分は
４個のドメインに分けることができる。最近、２個のシ
ステインのドメインによってその側面を接した残基３３
３から４６０のドメインIII がレセプターのＥＧＦ結合
部分を含んでいるらしいことが示された。（Ｌａｘ，ｅ
ｔ ａｌ．，Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｍ
ｙｊｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍ
ａｉｎｆｏｒ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆ
ａｃｔｏｒ ｂｙ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌａｂｅｌｌｉ
ｎｇ，Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．
８，１８３１−１８３４（１９８８））。ＥＧＦのドメ
インIII への結合は多面的発現反応（ｐｌｅｉｏｔｒｏ
ｐｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）を引き起こし、ＤＮＡ合
成及び細胞増殖に導く。
【０００４】ヒト腫瘍細胞がＥＧＦレセプターを過剰に
発現していることが各種のヒト腫瘍細胞において見出さ
れてきた。例えば膀胱の腫瘍の癌様の細胞は比較的多数
のＥＧＦレセプターを持っていることが示されている。
（Ｎｅａｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒ
ｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎＨｕ
ｍａｎ Ｂｌａｄｄｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ：Ｃｏｍｐａ
ｒｉｓｏｎ ｏｆＩｎｖａｓｉｖｅ ａｎｄ Ｓｕｐｅ
ｒｆｉｃｉａｌ Ｔｕｍｏｒｓ，Ｌａｎｃｅｔ，Ｖｏ
ｌ．１，３６６−３６７（１９８５））。乳癌細胞はＥ
ＧＦレセプター密度と腫瘍の大きさとの間に正の相互関
係を持ち、分化の程度とは負の相互関係を持つことを示
している。（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｐ
ｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｏｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃ
ｅｒ，Ｌａｎｃｅｔ，Ｖｏｌ．１，３６４−３６６（１
９８５）；Ｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ
Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒａｓ
ａｎ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ Ｐｏｏｒ Ｐｒｏ
ｇｎｏｓｉｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｂ
ｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔ
ｈ．，Ｖｏｌ．３８，１２２５−１２２８；Ｅｐｉｄｅ
ｒｍａｌ−Ｇｒｏｗｔｈ−Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ Ｓｔａｔｕｓ ａｓ Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｏｆ
Ｅａｒｌｙ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ Ｄｅａ
ｔｈ Ｆｒｏｍ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌａｎ
ｃｅｔ，Ｖｏｌ．１，１３９８−１４００（１９８
７））。異なったレベルのＥＧＦレセプターを有する無
胸腺マウスにヒト外陰部類表皮癌（ｈｕｍａｎ ｖｕｌ
ｖａｌ ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄｃａｒｃｉｎｏｍａ）
（Ａ４３１）のクローン化変異株を移植しての一連の腫
瘍形成性の観察の結果、腫瘍形成性は直接にＥＧＦレセ
プターの発現レベルに相互関係を持つことが見出され
た。（Ｓａｎｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ
ｏｆ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏ
ｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ ＴｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆＡ４３１ Ｃ
ｅｌｌｓ ｉｎ Ｎｕｄｅ Ｍｉｃｅ，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４６，４７０１−４７００（１９８
６））。こうして、ＥＧＦレセプターの過剰な発現は、
癌細胞の腫瘍形成のもととなる役割をはたしているとさ
れてきている。
発現していることが各種のヒト腫瘍細胞において見出さ
れてきた。例えば膀胱の腫瘍の癌様の細胞は比較的多数
のＥＧＦレセプターを持っていることが示されている。
（Ｎｅａｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒ
ｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎＨｕ
ｍａｎ Ｂｌａｄｄｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ：Ｃｏｍｐａ
ｒｉｓｏｎ ｏｆＩｎｖａｓｉｖｅ ａｎｄ Ｓｕｐｅ
ｒｆｉｃｉａｌ Ｔｕｍｏｒｓ，Ｌａｎｃｅｔ，Ｖｏ
ｌ．１，３６６−３６７（１９８５））。乳癌細胞はＥ
ＧＦレセプター密度と腫瘍の大きさとの間に正の相互関
係を持ち、分化の程度とは負の相互関係を持つことを示
している。（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｐ
ｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｏｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃ
ｅｒ，Ｌａｎｃｅｔ，Ｖｏｌ．１，３６４−３６６（１
９８５）；Ｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ
Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒａｓ
ａｎ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ Ｐｏｏｒ Ｐｒｏ
ｇｎｏｓｉｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｂ
ｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔ
ｈ．，Ｖｏｌ．３８，１２２５−１２２８；Ｅｐｉｄｅ
ｒｍａｌ−Ｇｒｏｗｔｈ−Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ Ｓｔａｔｕｓ ａｓ Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｏｆ
Ｅａｒｌｙ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ Ｄｅａ
ｔｈ Ｆｒｏｍ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌａｎ
ｃｅｔ，Ｖｏｌ．１，１３９８−１４００（１９８
７））。異なったレベルのＥＧＦレセプターを有する無
胸腺マウスにヒト外陰部類表皮癌（ｈｕｍａｎ ｖｕｌ
ｖａｌ ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄｃａｒｃｉｎｏｍａ）
（Ａ４３１）のクローン化変異株を移植しての一連の腫
瘍形成性の観察の結果、腫瘍形成性は直接にＥＧＦレセ
プターの発現レベルに相互関係を持つことが見出され
た。（Ｓａｎｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ
ｏｆ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏ
ｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ ＴｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆＡ４３１ Ｃ
ｅｌｌｓ ｉｎ Ｎｕｄｅ Ｍｉｃｅ，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４６，４７０１−４７００（１９８
６））。こうして、ＥＧＦレセプターの過剰な発現は、
癌細胞の腫瘍形成のもととなる役割をはたしているとさ
れてきている。
【０００５】ＥＧＦレセプター密度の癌細胞の生物的な
ふるまいに及ぼす影響というものは、該レセプターとの
リンガド ― すなわち、ＥＧＦまたはトランスホーミ
ング成長因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔ
ｈ ｆａｃｔｏｒ）（ＴＧＦ）との相互作用によって仲
介されうる。大部分の細胞において、ＥＧＦがＥＧＦレ
セプターの特定の領域に結合した場合、細胞はその分裂
刺激を受ける。腫瘍性の細胞の上皮細胞成長因子レセプ
ターにモノクローナル抗体を結合させることによりヌー
ドマウスに異種移植した腫瘍細胞Ａ４３１のｉｎ ｖｉ
ｖｏでの生長阻害をなしたことを二つのグループが報告
している。Ｍａｓｕｉ，ｅｔ ａｌ．はＥｇＧ２ａ及び
ＩｇＧ１イソタイプの抗−ＥＧＦレセプターモノクロー
ナル抗体による処置によって、無胸腺マウスに皮下移植
されたＡ４３１細胞の腫瘍形成を完全に阻止したこと
を、その処理を腫瘍細胞の接種した日から始めて示めし
た。（Ｍａｓｕｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎ
ｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ Ｃ
ｅｌｌｓ ｉｎ Ａｔｈｙｍｉｃ Ｍｉｃｅ ｂｙＡｎ
ｔｉ−Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏ
ｒ ＲｅｃｅｐｔｏｒＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４
４，１００２−１００７（１９８４年）；Ｍｅｃｈａｎ
ｉｓｍ ｏｆＡｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｉｎ Ｍｉｃｅ ｆｏｒ Ａｎｔｉ−Ｅｐｉｄｅｒｍａ
ｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｗｉｔ
ｈ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｉｓｏｔｙｐｅｓ，Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４６，５５９２−５５９８
（１９８６））。Ｒｏｄｅｃｋ，ｅｔ ａｌはＭａｓｕ
ｉのＩｇＧ２ａのイソタイプのものと異なるモノクロー
ナル抗体を使用し、それはＡ４３１細胞のＥＧＦレセプ
ターに結合し、マウスに異種移植されたＡ４３１細胞の
腫瘍の生育を完全に阻止した。（Ｒｏｄｅｃｋ，ｅｔ
ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｏｄｕｌａｔｉ
ｏｎ ｂｙ ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ ｔｏｔｈｅ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ
Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｉｃａｌｌｙ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｄ Ｅｆｆｅ
ｃｔｏｒ Ｃｅｌｌ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｆｆ
ｅｃｔｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４７，３
６９２−３６９６（１９８７））。
ふるまいに及ぼす影響というものは、該レセプターとの
リンガド ― すなわち、ＥＧＦまたはトランスホーミ
ング成長因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔ
ｈ ｆａｃｔｏｒ）（ＴＧＦ）との相互作用によって仲
介されうる。大部分の細胞において、ＥＧＦがＥＧＦレ
セプターの特定の領域に結合した場合、細胞はその分裂
刺激を受ける。腫瘍性の細胞の上皮細胞成長因子レセプ
ターにモノクローナル抗体を結合させることによりヌー
ドマウスに異種移植した腫瘍細胞Ａ４３１のｉｎ ｖｉ
ｖｏでの生長阻害をなしたことを二つのグループが報告
している。Ｍａｓｕｉ，ｅｔ ａｌ．はＥｇＧ２ａ及び
ＩｇＧ１イソタイプの抗−ＥＧＦレセプターモノクロー
ナル抗体による処置によって、無胸腺マウスに皮下移植
されたＡ４３１細胞の腫瘍形成を完全に阻止したこと
を、その処理を腫瘍細胞の接種した日から始めて示めし
た。（Ｍａｓｕｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎ
ｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ Ｃ
ｅｌｌｓ ｉｎ Ａｔｈｙｍｉｃ Ｍｉｃｅ ｂｙＡｎ
ｔｉ−Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏ
ｒ ＲｅｃｅｐｔｏｒＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４
４，１００２−１００７（１９８４年）；Ｍｅｃｈａｎ
ｉｓｍ ｏｆＡｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｉｎ Ｍｉｃｅ ｆｏｒ Ａｎｔｉ−Ｅｐｉｄｅｒｍａ
ｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｗｉｔ
ｈ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｉｓｏｔｙｐｅｓ，Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４６，５５９２−５５９８
（１９８６））。Ｒｏｄｅｃｋ，ｅｔ ａｌはＭａｓｕ
ｉのＩｇＧ２ａのイソタイプのものと異なるモノクロー
ナル抗体を使用し、それはＡ４３１細胞のＥＧＦレセプ
ターに結合し、マウスに異種移植されたＡ４３１細胞の
腫瘍の生育を完全に阻止した。（Ｒｏｄｅｃｋ，ｅｔ
ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｏｄｕｌａｔｉ
ｏｎ ｂｙ ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ ｔｏｔｈｅ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ
Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｉｃａｌｌｙ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｄ Ｅｆｆｅ
ｃｔｏｒ Ｃｅｌｌ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｆｆ
ｅｃｔｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４７，３
６９２−３６９６（１９８７））。
【０００６】しかしながら、現在までヒト口部類上皮癌
（ｈｕｍａｎ ｏｒａｌ ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ ｃａ
ｒｃｉｎｏｍａ）（ＫＢ）あるいはヒト乳房上皮細胞
（ｈｕｍａｎ ｍａｍｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａ
ｌ）（１８４Ａ１Ｎ４及び１８４Ａ１Ｎ４−Ｔ ― 併
せて「１８４」という）のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ
ｖｉｖｏでの生育を阻止することを誰一人としていな
い。ＫＢ及び１８４細胞は共にＥＧＦ−レセプターに関
連した研究に用いられていた。
（ｈｕｍａｎ ｏｒａｌ ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ ｃａ
ｒｃｉｎｏｍａ）（ＫＢ）あるいはヒト乳房上皮細胞
（ｈｕｍａｎ ｍａｍｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａ
ｌ）（１８４Ａ１Ｎ４及び１８４Ａ１Ｎ４−Ｔ ― 併
せて「１８４」という）のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ
ｖｉｖｏでの生育を阻止することを誰一人としていな
い。ＫＢ及び１８４細胞は共にＥＧＦ−レセプターに関
連した研究に用いられていた。
【０００７】ＫＢ及び１８４細胞は実質的にＡ４３１細
胞とは異なっている。特にそれらは上皮細胞成長因子に
対する生育応答において異なっている。ＫＢ及び１８４
細胞は高濃度の上皮細胞成長因子により生育刺激される
が、Ａ４３１細胞は高濃度の上皮細胞成長因子によって
は生育の阻害を受ける。
胞とは異なっている。特にそれらは上皮細胞成長因子に
対する生育応答において異なっている。ＫＢ及び１８４
細胞は高濃度の上皮細胞成長因子により生育刺激される
が、Ａ４３１細胞は高濃度の上皮細胞成長因子によって
は生育の阻害を受ける。
【０００８】これらの違い並びに抗−ＥＧＦ−レセプタ
ー抗体がｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍の生育を阻止するとこ
ろのメカニズムの完全な理解がなされていないことは、
Ａ４３１細胞のＥＧＦレセプターに結合し、そしてヌー
ドマウスに異種移植されたＡＳ４３１細胞に抗腫瘍活性
を示したモノクローナル抗体が同様にヌードマウスに異
種移植されたＫＢ細胞あるいは１８４細胞に対し抗腫瘍
活性を示すのかどうか正確に決定することをさまたげて
いる。
ー抗体がｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍の生育を阻止するとこ
ろのメカニズムの完全な理解がなされていないことは、
Ａ４３１細胞のＥＧＦレセプターに結合し、そしてヌー
ドマウスに異種移植されたＡＳ４３１細胞に抗腫瘍活性
を示したモノクローナル抗体が同様にヌードマウスに異
種移植されたＫＢ細胞あるいは１８４細胞に対し抗腫瘍
活性を示すのかどうか正確に決定することをさまたげて
いる。
【０００９】加えて、ヒトの腫瘍細胞はまた上皮細胞成
長因子によって生育刺激を受けることから、ＫＢ及び１
８４細胞は、Ａ４３１細胞よりもよりＥＧＦに対する応
答において代表的なパターンを提供するものであり、事
実ＥＧＦレセプターを発現するヒト腫瘍細胞モデルとし
て使用されている。（Ｗｉｌｌｉｎｇｔｏｎ，ｅｔａ
ｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．９４，２０７
−２１２（１９８２））。
長因子によって生育刺激を受けることから、ＫＢ及び１
８４細胞は、Ａ４３１細胞よりもよりＥＧＦに対する応
答において代表的なパターンを提供するものであり、事
実ＥＧＦレセプターを発現するヒト腫瘍細胞モデルとし
て使用されている。（Ｗｉｌｌｉｎｇｔｏｎ，ｅｔａ
ｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．９４，２０７
−２１２（１９８２））。
【００１０】腫瘍治療の第一目標は腫瘍細胞をすべて殺
すことである。細胞を殺してしまう治療用剤は、細胞毒
（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ）として定義されている。細胞を
殺すというよりは単に細胞の増殖を妨害する治療用剤
は、細胞増殖抑制剤（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ）として定
義されている。
すことである。細胞を殺してしまう治療用剤は、細胞毒
（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ）として定義されている。細胞を
殺すというよりは単に細胞の増殖を妨害する治療用剤
は、細胞増殖抑制剤（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ）として定
義されている。
【００１１】ＥＧＦレセプターに結合するモノクローナ
ル抗体単独による処置は単に細胞が増えることを阻止し
ているだけで、これからもモノクローナル抗体は細胞増
殖抑制剤として作用している。モノクローナル抗体の細
胞増殖抑制作用を持つのみということを克服するため、
ヒト上皮細胞成長因子レセプターの細胞外のドメインに
特異性を有するモノクローナル抗体をマクロファージあ
るいはマウスの補体と組み合わせ、Ａ４３１細胞に対す
る細胞毒反応を得ている。（Ｍａｓｕｉ，ｅｔａｌ．，
Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｃ
ｔｉｖｉｔｙｉｎ Ｍｉｃｅ ｆｏｒ Ａｎｔｉ−Ｅｐ
ｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓｗｉｔｈ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｉｓｏｔｏｐｅ
ｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４６，
５５９２−５５９８（１９８６））。
ル抗体単独による処置は単に細胞が増えることを阻止し
ているだけで、これからもモノクローナル抗体は細胞増
殖抑制剤として作用している。モノクローナル抗体の細
胞増殖抑制作用を持つのみということを克服するため、
ヒト上皮細胞成長因子レセプターの細胞外のドメインに
特異性を有するモノクローナル抗体をマクロファージあ
るいはマウスの補体と組み合わせ、Ａ４３１細胞に対す
る細胞毒反応を得ている。（Ｍａｓｕｉ，ｅｔａｌ．，
Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｃ
ｔｉｖｉｔｙｉｎ Ｍｉｃｅ ｆｏｒ Ａｎｔｉ−Ｅｐ
ｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓｗｉｔｈ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｉｓｏｔｏｐｅ
ｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４６，
５５９２−５５９８（１９８６））。
【００１２】それ自体投与して用いられる抗腫瘍剤ある
いは化学療法剤は細胞毒剤として有用である。例えばド
キソルビシン（アドリアマイシン）及びシスプラチンの
ような抗腫瘍剤の利用は当該分野でよく知られている。
しかしながらこれらのものは単独で用いた場合患者に対
して毒性がある又は副作用があるような量でのみ効果が
ある。シスプラチンは４週間おきに１回１００ｍｇ／ｍ
2 の量を静脈内に投与されそしてアドリアマイシンは２
１日おきに１回６０−７５ｍｇ／ｍ2 の量を静脈内に投
与される。
いは化学療法剤は細胞毒剤として有用である。例えばド
キソルビシン（アドリアマイシン）及びシスプラチンの
ような抗腫瘍剤の利用は当該分野でよく知られている。
しかしながらこれらのものは単独で用いた場合患者に対
して毒性がある又は副作用があるような量でのみ効果が
ある。シスプラチンは４週間おきに１回１００ｍｇ／ｍ
2 の量を静脈内に投与されそしてアドリアマイシンは２
１日おきに１回６０−７５ｍｇ／ｍ2 の量を静脈内に投
与される。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒトＥＧＦ
レセプターを発現し且つＥＧＦによって細胞分裂促進を
刺激されるヒト腫瘍細胞をもつヒト癌患者を治療するた
めに抗腫瘍剤と共に用いる有効量のモノクローナル抗体
を有すると共に、（ｉ）該抗体は該腫瘍細胞のヒトＥＧ
Ｆレセプターの細胞外ドメインに結合し、（ｉｉ）該抗
体は該抗腫瘍剤に結合せず、且つ（ｉｉｉ）該抗体はＥ
ＧＦのヒトＥＧＦレセプターへの結合を阻害することを
特徴とする治療剤を提供する。
レセプターを発現し且つＥＧＦによって細胞分裂促進を
刺激されるヒト腫瘍細胞をもつヒト癌患者を治療するた
めに抗腫瘍剤と共に用いる有効量のモノクローナル抗体
を有すると共に、（ｉ）該抗体は該腫瘍細胞のヒトＥＧ
Ｆレセプターの細胞外ドメインに結合し、（ｉｉ）該抗
体は該抗腫瘍剤に結合せず、且つ（ｉｉｉ）該抗体はＥ
ＧＦのヒトＥＧＦレセプターへの結合を阻害することを
特徴とする治療剤を提供する。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、新規なハイブ
リドーマセルライン（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌｌ
ｉｎｅｓ）、ＡＴＣＣ ＨＢ９７６３及び９７６４、に
関し、それらはそれぞれその生育培地の上清液の成分と
して高い特異性を有するモノクローナル抗体、９６及び
１０８を与える。セルラインＡＴＣＣ ＨＢ９７６３及
び９７６４は、１９８８年７月２５日にＡｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ，１２３０ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ ２０８５２に寄託された。この寄
託はブタペスト条約に基づいてなされた。該カルチャー
は試料の分類に係る最新の請求のあった後すくなくとも
５年間及びいかなる場合であってもこの寄託の日の後３
０年間は継続して入手しうる。本発明は、ヒトＥＧＦレ
セプターを発現するヒト腫瘍細胞の細胞膜上に見出され
るＥＧＦレセプターに特異的に結合することにより該腫
瘍細胞の生育を阻止する新規なモノクローナル抗体を産
生するセルラインを提供するものである。
リドーマセルライン（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌｌ
ｉｎｅｓ）、ＡＴＣＣ ＨＢ９７６３及び９７６４、に
関し、それらはそれぞれその生育培地の上清液の成分と
して高い特異性を有するモノクローナル抗体、９６及び
１０８を与える。セルラインＡＴＣＣ ＨＢ９７６３及
び９７６４は、１９８８年７月２５日にＡｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ，１２３０ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ ２０８５２に寄託された。この寄
託はブタペスト条約に基づいてなされた。該カルチャー
は試料の分類に係る最新の請求のあった後すくなくとも
５年間及びいかなる場合であってもこの寄託の日の後３
０年間は継続して入手しうる。本発明は、ヒトＥＧＦレ
セプターを発現するヒト腫瘍細胞の細胞膜上に見出され
るＥＧＦレセプターに特異的に結合することにより該腫
瘍細胞の生育を阻止する新規なモノクローナル抗体を産
生するセルラインを提供するものである。
【００１５】更に、本発明は、 （ｉ）マウスをヒトＥＧＦレセプターを発現する細胞で
免疫し； （ｉｉ）該マウスから脾臓を取り出し、脾臓細胞の懸濁
物を作成し； （ｉｉｉ）融合促進剤の存在下該脾臓細胞とマウスミエ
ローマ細胞（ｍｏｕｓｅｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ）
とを融合せしめ； （ｉｖ）融合しなかったミエローマ細胞が生育できない
培地を含む分離ウエル中で融合細胞を希釈培養し； （ｖ）ハイブリドーマを含有する各ウエル中の上清液中
のヒトＥＧＦレセプターに対する抗体の存在を測定し； （ｖｉ）ヒトＥＧＦレセプターの細胞外のドメインに結
合する抗体を産生するハイブリドーマを選別しクローン
化し；そして （ｖｉｉ）該クローン上にある上清液から抗体を回収す
る工程からなることを特徴とするヒトＥＧＦレセプター
の細胞外のドメインに結合し、そしてヒトＥＧＦレセプ
ターを発現すると共にＥＧＦにより細胞分裂刺激を受け
るヒト癌細胞の生育を阻止することのできるモノクロー
ナル抗体の製造法に関する。
免疫し； （ｉｉ）該マウスから脾臓を取り出し、脾臓細胞の懸濁
物を作成し； （ｉｉｉ）融合促進剤の存在下該脾臓細胞とマウスミエ
ローマ細胞（ｍｏｕｓｅｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ）
とを融合せしめ； （ｉｖ）融合しなかったミエローマ細胞が生育できない
培地を含む分離ウエル中で融合細胞を希釈培養し； （ｖ）ハイブリドーマを含有する各ウエル中の上清液中
のヒトＥＧＦレセプターに対する抗体の存在を測定し； （ｖｉ）ヒトＥＧＦレセプターの細胞外のドメインに結
合する抗体を産生するハイブリドーマを選別しクローン
化し；そして （ｖｉｉ）該クローン上にある上清液から抗体を回収す
る工程からなることを特徴とするヒトＥＧＦレセプター
の細胞外のドメインに結合し、そしてヒトＥＧＦレセプ
ターを発現すると共にＥＧＦにより細胞分裂刺激を受け
るヒト癌細胞の生育を阻止することのできるモノクロー
ナル抗体の製造法に関する。
【００１６】本発明は、また上記した工程（ｖｉｉ）を
省き、さらなる工程 （ｖｉｉｉ）該クローンをマウス腹腔内に移植し、 （ｉｘ）該マウスから腫瘍化した腹水または血清を採取
し、そして該腹水または血清は所望の抗体を含んでいる
を含むことを特徴とするモノクローナル抗体の製造法に
関する。
省き、さらなる工程 （ｖｉｉｉ）該クローンをマウス腹腔内に移植し、 （ｉｘ）該マウスから腫瘍化した腹水または血清を採取
し、そして該腹水または血清は所望の抗体を含んでいる
を含むことを特徴とするモノクローナル抗体の製造法に
関する。
【００１７】本発明はまた、ヒトＥＧＦレセプターを発
現し且つヒトＥＧＦによって細胞分裂刺激を受けるヒト
腫瘍細胞の生育を阻止するのに有効な量の新規モノクロ
ーナル抗体のいづれか一つと共に医薬担体を含んでなる
治療用組成物及びその製造にも関する。
現し且つヒトＥＧＦによって細胞分裂刺激を受けるヒト
腫瘍細胞の生育を阻止するのに有効な量の新規モノクロ
ーナル抗体のいづれか一つと共に医薬担体を含んでなる
治療用組成物及びその製造にも関する。
【００１８】また、驚くべきことにモノクローナル抗体
のいずれか一つとドキソルビシン又はシスプラチンのよ
うな抗腫瘍剤とを併用すると、ヒトＥＧＦレセプターを
発現し且つヒトＥＧＦにより細胞分裂促進の刺激を受け
るヒト癌細胞の成長（増殖）を阻止するという点で、抗
腫瘍剤又はモノクローナル抗体を単独で用いるよりも著
しく有効であることを発見した。本発明者らによる新規
なモノクローナル抗体を用いてのこの配合しての処置法
は、それが２種の抗癌剤を組み合わせたもので、それぞ
れは異なったメカニズムによって作用し、ヒトの腫瘍細
胞に細胞毒性を発揮することから優れたものである。こ
のような方法は、一方では薬物に対する抵抗性を増大さ
せるとか、一方では腫瘍細胞を抗体に反応しないように
するその腫瘍細胞の抗原性における変化とかのような臨
床上生起する問題を解決することができる。さらにま
た、驚くべきことにその抗腫瘍剤はそれが単独で投与さ
れた時に治療に必要な量であるが患者にとって有毒なあ
るいは副作用のある量よりも実質的に少ない量で投与し
うることが見出された。ドキソルビシンあるいはシスプ
ラチン以外のタキソール、ゲムシタビン、ブレオマイシ
ン硫酸塩、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ク
ロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）及びシクロ
ホスフアミドヒドロキシウレアのような抗腫瘍剤もまた
新規モノクローナル抗体と一緒に使用することができ
る。上記であげたものは、単に例としてあげたものであ
って、本発明の範囲を限定することを意図したものでは
ない。
のいずれか一つとドキソルビシン又はシスプラチンのよ
うな抗腫瘍剤とを併用すると、ヒトＥＧＦレセプターを
発現し且つヒトＥＧＦにより細胞分裂促進の刺激を受け
るヒト癌細胞の成長（増殖）を阻止するという点で、抗
腫瘍剤又はモノクローナル抗体を単独で用いるよりも著
しく有効であることを発見した。本発明者らによる新規
なモノクローナル抗体を用いてのこの配合しての処置法
は、それが２種の抗癌剤を組み合わせたもので、それぞ
れは異なったメカニズムによって作用し、ヒトの腫瘍細
胞に細胞毒性を発揮することから優れたものである。こ
のような方法は、一方では薬物に対する抵抗性を増大さ
せるとか、一方では腫瘍細胞を抗体に反応しないように
するその腫瘍細胞の抗原性における変化とかのような臨
床上生起する問題を解決することができる。さらにま
た、驚くべきことにその抗腫瘍剤はそれが単独で投与さ
れた時に治療に必要な量であるが患者にとって有毒なあ
るいは副作用のある量よりも実質的に少ない量で投与し
うることが見出された。ドキソルビシンあるいはシスプ
ラチン以外のタキソール、ゲムシタビン、ブレオマイシ
ン硫酸塩、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ク
ロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）及びシクロ
ホスフアミドヒドロキシウレアのような抗腫瘍剤もまた
新規モノクローナル抗体と一緒に使用することができ
る。上記であげたものは、単に例としてあげたものであ
って、本発明の範囲を限定することを意図したものでは
ない。
【００１９】本発明は、また有効量の抗腫瘍剤及び有効
量の新規モノクローナル抗体のいづれか一つを、ヒトＥ
ＧＦレセプターを発現し且つヒトＥＧＦにより細胞分裂
刺激を受けるヒト腫瘍細胞を持つヒト癌患者に投与し、
そしてそこで該抗体は腫瘍細胞のヒトＥＧＦレセプター
の細胞外のドメインに結合して、抗原−抗体複合体を形
成することからなる該腫瘍細胞の生育阻止方法を提供す
る。
量の新規モノクローナル抗体のいづれか一つを、ヒトＥ
ＧＦレセプターを発現し且つヒトＥＧＦにより細胞分裂
刺激を受けるヒト腫瘍細胞を持つヒト癌患者に投与し、
そしてそこで該抗体は腫瘍細胞のヒトＥＧＦレセプター
の細胞外のドメインに結合して、抗原−抗体複合体を形
成することからなる該腫瘍細胞の生育阻止方法を提供す
る。
【００２０】次なるより詳細な説明を、添附された図面
と一緒に参照して本発明をよりよく理解すれば本発明及
び多くのそれに付随した利点のより完全な認識が容易に
得られよう。
と一緒に参照して本発明をよりよく理解すれば本発明及
び多くのそれに付随した利点のより完全な認識が容易に
得られよう。
【００２１】この記載は本発明を特定のものに限定する
ためと解すべきでなく、当業者がなしうるような変形も
本発明の範囲内であると考えられるべきものである。
ためと解すべきでなく、当業者がなしうるような変形も
本発明の範囲内であると考えられるべきものである。
【００２２】
【実施例】実施例Ｉモノクローナル抗体の産生 Ａ．免疫及び体細胞のハイブリッド化 Ｂａｌｂ／ｃマウスをＣＨ７１細胞またはＣＨ７１細胞
膜調製物の腹腔内への注射により免疫した。ＣＨ７１細
胞はＥＧＦ−Ｒ ｃＤＮＡの切断されたかたちのもの
（ＥＧＦ−Ｒの細胞内のドメインの大部分が欠失したも
の）を有するプラスミドでトランスフェクトされたチャ
イニーズハムスター卵巣細胞である。（Ｌｉｎｖｎｅ
ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏ
ｌ．２６０，１２４９０（１９８６））。このトランス
フェクトされた細胞は、ほぼ１０6 個の変異ＥＧＦ−Ｒ
分子／細胞を発現する。ＣＨ−７１細胞を選ぶことによ
り、ＥＧＦ−Ｒの細胞外のドメインに対する抗体を分泌
するハイブリドーマのみを最初のスクリーニング試験で
選択できそしてヒトＥＧＦ−Ｒ分子に結合しているヒト
に特異的な糖類に対して向けられた抗体を選択すること
を避けることができる。
膜調製物の腹腔内への注射により免疫した。ＣＨ７１細
胞はＥＧＦ−Ｒ ｃＤＮＡの切断されたかたちのもの
（ＥＧＦ−Ｒの細胞内のドメインの大部分が欠失したも
の）を有するプラスミドでトランスフェクトされたチャ
イニーズハムスター卵巣細胞である。（Ｌｉｎｖｎｅ
ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏ
ｌ．２６０，１２４９０（１９８６））。このトランス
フェクトされた細胞は、ほぼ１０6 個の変異ＥＧＦ−Ｒ
分子／細胞を発現する。ＣＨ−７１細胞を選ぶことによ
り、ＥＧＦ−Ｒの細胞外のドメインに対する抗体を分泌
するハイブリドーマのみを最初のスクリーニング試験で
選択できそしてヒトＥＧＦ−Ｒ分子に結合しているヒト
に特異的な糖類に対して向けられた抗体を選択すること
を避けることができる。
【００２３】マウスを第０日目、第１３日目及び第３２
日目の３回免疫した。２匹の最も応答性の良いマウスそ
れぞれに３回ＣＨ７１細胞を３日続けて融合前に腹腔内
注射して免疫を促進増強した。次に６５日目にマウスの
脾臓細胞をＮＳ１ミエローマ細胞（比率５／１）と、融
合剤としてＰＥＧ４０００（Ｍｅｒｃｋ）を用い、Ｋｏ
ｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの一般法に従って融合せ
しめた。（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．６，５１１−５１
９（１９７６））。
日目の３回免疫した。２匹の最も応答性の良いマウスそ
れぞれに３回ＣＨ７１細胞を３日続けて融合前に腹腔内
注射して免疫を促進増強した。次に６５日目にマウスの
脾臓細胞をＮＳ１ミエローマ細胞（比率５／１）と、融
合剤としてＰＥＧ４０００（Ｍｅｒｃｋ）を用い、Ｋｏ
ｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの一般法に従って融合せ
しめた。（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．６，５１１−５１
９（１９７６））。
【００２４】Ｂ．ハイブリドーマの選別及び生育 融合生成物をヒポキサンチン−アミノプリテン−チミジ
ン（ＨＡＴ）選択培地の代わりにヒポキサンチン−アザ
セリン（ＨＡ）選択培地（Ｇ．Ｂｕｔｔｉｎ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖ
ｏｌ．８１，２７−３６（１９７８））で希釈し、９６
ウエルプレートに分けて入れた。
ン（ＨＡＴ）選択培地の代わりにヒポキサンチン−アザ
セリン（ＨＡ）選択培地（Ｇ．Ｂｕｔｔｉｎ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖ
ｏｌ．８１，２７−３６（１９７８））で希釈し、９６
ウエルプレートに分けて入れた。
【００２５】最初にラジオイムノアッセイによって生育
しているハイブリドーマのウエル中の培地の中に特異抗
体があるか否か分析した。ＥＧＦレセプターを発現して
いる細胞あるいはＥＧＦレセプターを発現していない細
胞を９６ウエルプレート中に入れた。集密状態下、それ
らを１回結合培地（ＤＭＥＭ、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，
０．２％ＢＳＡ）で洗滌し、異なった生育ハイブリドー
マから得られた１００μｌのカルチャーの上清と一緒に
し室温で９０分間インキュベートした。次に細胞を結合
培地で３回洗滌し、１００μｌのヨウ素化したヤギの抗
マウス免疫グロブリン（２５０，０００ｃｐｍ／１００
μｌ）液と共にさらに室温で６０分間インキュベートし
た。ＰＢＳ（リン酸塩緩衝塩液、ｐＨ７．５）で３回洗
った後、細胞をウエルからこすり取り、それらの表面に
結合した放射活性をガンマ線カウンターを用いて測定し
た。抗体のＥＧＦレセプターを発現している細胞（ヒト
ＥＧＦ−Ｒ ＤＮＡ構築物でトランスフェクトされたＡ
４３１、ヒト繊維芽細胞またはマウス３Ｔ３細胞）の表
面への特異的な結合能をこの方法で測定し、さらにＥＧ
Ｆ−Ｒを発現していない細胞（マウス３Ｔ３細胞の特定
のクローン）への結合能と比較した。陽性のハイブリド
ーマを限界希釈をしてクローン化し、さらに異なった種
（ヒト、マウス、ニワトリ）のセルラインのライゼート
から得られた 35Ｓメチオニンまたは32Ｐで標識されたＥ
ＧＦ−Ｒを免疫沈殿させうるかどうかを測定して調べ
た。このために、ヤギ抗マウス免疫グロブリンを、プロ
テインＡ−セファロースに、ヤギ抗マウス抗体溶液とプ
ロテインＡ−セファロースビーズとを室温で３０分間イ
ンキュベートすることにより結合させた。次にこれを３
回２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．４で洗った。次にさ
らにヤギマウスＩｇコートしたプロテインＡ−セファロ
ースビーズを３０分間室温でハイブリドーマのカルチャ
ーの上清液と共にインキュベートし、ＨＮＴＧ緩衝液
（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．
１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％グリセロー
ル）で３回洗滌し、そして、可溶化緩衝液（１％ Ｔｒ
ｉｔｏｎ Ｘ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍ
Ｍ Ｈｅｐｅｓ、１．５ｍＭ ＥＧＴＡ、１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、１０％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤
としてアプロチニン、ロイペプチン及びＰＭＳＦ）でも
って細胞の単層を溶菌化し、ライゼートを遠心して核ペ
レットを除去して得られたいろいろな細胞ライゼートと
４℃で１時間インキュベートした。32Ｐで標識するた
め、免疫沈殿物をＨＮＴＧで３回洗い、次に１５分間32
Ｐ ＡＴＰ溶液（５ｍＭ ＭｎＣｌ2 及び３μＣｉ／32
Ｐ ＡＴＰ試料を含むＨＮＴＧ）と共にインキュベート
した。次に電気泳動試料用緩衝液を加え、７．５％ Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにかける前に試料を１０
分間９５℃で煮沸した。モノクローナル抗体１０８、９
６及び４２はすべてヒトＥＧＦ−Ｒに対し特異性を持つ
ことが見出された。これらの抗体はまたＥＧＦ−Ｒを発
現している細胞の表面にヨウ素化されたＥＧＦが結合す
るのを阻害する能力について調べられた。これら３種の
抗体はＥＧＦの該レセプターへの結合を阻害するが、そ
の阻害の程度は９６＞１０８＞４２というものであっ
た。
しているハイブリドーマのウエル中の培地の中に特異抗
体があるか否か分析した。ＥＧＦレセプターを発現して
いる細胞あるいはＥＧＦレセプターを発現していない細
胞を９６ウエルプレート中に入れた。集密状態下、それ
らを１回結合培地（ＤＭＥＭ、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，
０．２％ＢＳＡ）で洗滌し、異なった生育ハイブリドー
マから得られた１００μｌのカルチャーの上清と一緒に
し室温で９０分間インキュベートした。次に細胞を結合
培地で３回洗滌し、１００μｌのヨウ素化したヤギの抗
マウス免疫グロブリン（２５０，０００ｃｐｍ／１００
μｌ）液と共にさらに室温で６０分間インキュベートし
た。ＰＢＳ（リン酸塩緩衝塩液、ｐＨ７．５）で３回洗
った後、細胞をウエルからこすり取り、それらの表面に
結合した放射活性をガンマ線カウンターを用いて測定し
た。抗体のＥＧＦレセプターを発現している細胞（ヒト
ＥＧＦ−Ｒ ＤＮＡ構築物でトランスフェクトされたＡ
４３１、ヒト繊維芽細胞またはマウス３Ｔ３細胞）の表
面への特異的な結合能をこの方法で測定し、さらにＥＧ
Ｆ−Ｒを発現していない細胞（マウス３Ｔ３細胞の特定
のクローン）への結合能と比較した。陽性のハイブリド
ーマを限界希釈をしてクローン化し、さらに異なった種
（ヒト、マウス、ニワトリ）のセルラインのライゼート
から得られた 35Ｓメチオニンまたは32Ｐで標識されたＥ
ＧＦ−Ｒを免疫沈殿させうるかどうかを測定して調べ
た。このために、ヤギ抗マウス免疫グロブリンを、プロ
テインＡ−セファロースに、ヤギ抗マウス抗体溶液とプ
ロテインＡ−セファロースビーズとを室温で３０分間イ
ンキュベートすることにより結合させた。次にこれを３
回２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．４で洗った。次にさ
らにヤギマウスＩｇコートしたプロテインＡ−セファロ
ースビーズを３０分間室温でハイブリドーマのカルチャ
ーの上清液と共にインキュベートし、ＨＮＴＧ緩衝液
（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．
１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％グリセロー
ル）で３回洗滌し、そして、可溶化緩衝液（１％ Ｔｒ
ｉｔｏｎ Ｘ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍ
Ｍ Ｈｅｐｅｓ、１．５ｍＭ ＥＧＴＡ、１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、１０％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤
としてアプロチニン、ロイペプチン及びＰＭＳＦ）でも
って細胞の単層を溶菌化し、ライゼートを遠心して核ペ
レットを除去して得られたいろいろな細胞ライゼートと
４℃で１時間インキュベートした。32Ｐで標識するた
め、免疫沈殿物をＨＮＴＧで３回洗い、次に１５分間32
Ｐ ＡＴＰ溶液（５ｍＭ ＭｎＣｌ2 及び３μＣｉ／32
Ｐ ＡＴＰ試料を含むＨＮＴＧ）と共にインキュベート
した。次に電気泳動試料用緩衝液を加え、７．５％ Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにかける前に試料を１０
分間９５℃で煮沸した。モノクローナル抗体１０８、９
６及び４２はすべてヒトＥＧＦ−Ｒに対し特異性を持つ
ことが見出された。これらの抗体はまたＥＧＦ−Ｒを発
現している細胞の表面にヨウ素化されたＥＧＦが結合す
るのを阻害する能力について調べられた。これら３種の
抗体はＥＧＦの該レセプターへの結合を阻害するが、そ
の阻害の程度は９６＞１０８＞４２というものであっ
た。
【００２６】実施例ＩＩセルラインの培養 Ａ．ヒト口部類表皮癌細胞（ＫＢ細胞）の培養 口部類表皮癌から誘導されたＫＢ腫瘍セルラインはＡｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手された。その細胞
は、５６℃で３０分間インキュベートすることにより補
体活性をなくした１０％ウシ胎児血清を補なったＤｕｌ
ｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ培地中で生育させ、そして
グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びピル
ビン酸ナトリウム中３７℃、５％ ＣＯ2 ；９５％空気
下に生育させた。
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手された。その細胞
は、５６℃で３０分間インキュベートすることにより補
体活性をなくした１０％ウシ胎児血清を補なったＤｕｌ
ｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ培地中で生育させ、そして
グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びピル
ビン酸ナトリウム中３７℃、５％ ＣＯ2 ；９５％空気
下に生育させた。
【００２７】Ｂ．ヒト乳房上皮細胞（１８４細胞）及び
ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−４６８細胞）の培養 １８４Ａ１Ｎ４及び１８４Ａ１Ｎ４−Ｔヒト乳房上皮細
胞はＭａｒｔｈａ Ｓｔａｍｐｆｅｒ，Ｌａｗｒｅｎｃ
ｅ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｅｒ
ｋｅｌｅｙ，ＣＡ．により提供された。１８４Ａ１Ｎ４
細胞は、グルタミン（０．６ｍｇ／ｍｌ）、ウシ胎児血
清（０．５％）、ヒドロコルチゾン（０．５μｇ／ｍ
ｌ）、インシュリン（５μｇ／ｍｌ）及びＥＧＦ（１０
ｎｇ／ｍｌ）を補なった１ＭＥＭ及び５％ ＣＯ2 中で
３７℃で保持された。１８４Ａ１Ｎ４−Ｔは、グルタミ
ン（０．６ｍｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（４０ｍｇ／
ｍｌ）及び１０％ウシ胎児血清を補なった１ＭＥＭ（Ｂ
ｉｏｆｌｕｉｄｓ，Ｒｏｃｋｒｉｌｌｅ，ＭＤ）及び５
％ ＣＯ2 中３７℃で保持された。ＭＤＡ−４６８細胞
は、１８４Ａ１Ｎ４−Ｔ細胞と同じ条件及び培地中で培
養された。
ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−４６８細胞）の培養 １８４Ａ１Ｎ４及び１８４Ａ１Ｎ４−Ｔヒト乳房上皮細
胞はＭａｒｔｈａ Ｓｔａｍｐｆｅｒ，Ｌａｗｒｅｎｃ
ｅ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｅｒ
ｋｅｌｅｙ，ＣＡ．により提供された。１８４Ａ１Ｎ４
細胞は、グルタミン（０．６ｍｇ／ｍｌ）、ウシ胎児血
清（０．５％）、ヒドロコルチゾン（０．５μｇ／ｍ
ｌ）、インシュリン（５μｇ／ｍｌ）及びＥＧＦ（１０
ｎｇ／ｍｌ）を補なった１ＭＥＭ及び５％ ＣＯ2 中で
３７℃で保持された。１８４Ａ１Ｎ４−Ｔは、グルタミ
ン（０．６ｍｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（４０ｍｇ／
ｍｌ）及び１０％ウシ胎児血清を補なった１ＭＥＭ（Ｂ
ｉｏｆｌｕｉｄｓ，Ｒｏｃｋｒｉｌｌｅ，ＭＤ）及び５
％ ＣＯ2 中３７℃で保持された。ＭＤＡ−４６８細胞
は、１８４Ａ１Ｎ４−Ｔ細胞と同じ条件及び培地中で培
養された。
【００２８】Ｃ．９６ＩｇＭ及び１０８ＩｇＧ２ａハイ
ブリドーマセルラインの培養 １０８ＩｇＧ２ａハイブリドーマセルラインはＥＧＦレ
セプターを発現しているＣＨ７１細胞でマウスを免疫し
て生成させ、ＫＢセルラインと同じ条件下に培養した。
９６ＩｇＭハイブリドーマセルラインは、１０８ＩｇＧ
２ａハイブリドーマセルラインに対して記載したのと同
じ方法で生成させた。
ブリドーマセルラインの培養 １０８ＩｇＧ２ａハイブリドーマセルラインはＥＧＦレ
セプターを発現しているＣＨ７１細胞でマウスを免疫し
て生成させ、ＫＢセルラインと同じ条件下に培養した。
９６ＩｇＭハイブリドーマセルラインは、１０８ＩｇＧ
２ａハイブリドーマセルラインに対して記載したのと同
じ方法で生成させた。
【００２９】実施例ＩＩＩ Ａ．動物からのモノクローナル抗体１０８の精製 １０８ＩｇＧ２ａハイブリドーマ細胞を注射した動物の
腹水を４℃で１０分間ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒ
ｉｆｕｇｅ中で遠心して澄んだ液とした。４℃で飽和硫
酸アンモニウムをゆっくりと添加してｐＨ７．５で２４
時間かけて最後には４５％（Ｖ／Ｖ）の濃度までにしモ
ノクローナル抗体を沈殿させた。沈殿を１５分間１０，
０００ｇで遠心して集め、５０％Ｖ／Ｖの硫酸アンモニ
ウム液、ｐＨ７．５、４℃で２回洗滌した。さらに０．
１４Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．０中のセファロースＣＬ
プロテインＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のアフィニティク
ロマトグラフィーによって精製し、０．１Ｍクエン酸塩
緩衝液、ｐＨ３．０で溶出し、次にＰＢＳに対して徹底
的に透析してモノクローナル抗体１０８を得た。
腹水を４℃で１０分間ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒ
ｉｆｕｇｅ中で遠心して澄んだ液とした。４℃で飽和硫
酸アンモニウムをゆっくりと添加してｐＨ７．５で２４
時間かけて最後には４５％（Ｖ／Ｖ）の濃度までにしモ
ノクローナル抗体を沈殿させた。沈殿を１５分間１０，
０００ｇで遠心して集め、５０％Ｖ／Ｖの硫酸アンモニ
ウム液、ｐＨ７．５、４℃で２回洗滌した。さらに０．
１４Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．０中のセファロースＣＬ
プロテインＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のアフィニティク
ロマトグラフィーによって精製し、０．１Ｍクエン酸塩
緩衝液、ｐＨ３．０で溶出し、次にＰＢＳに対して徹底
的に透析してモノクローナル抗体１０８を得た。
【００３０】Ｂ．動物からのモノクローナル抗体９６の
精製 ９６ＩｇＭハイブリドーマ細胞を注射した動物の腹水を
４℃で１５分間３０００ＲＰＭでｌｏｗ ｓｐｅｅｄ
ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ中で遠心して澄んだ液とした。４
℃で飽和硫酸アンモニウム液をゆっくりと加え、ｐＨ
７．５で２４時間かけて最後には４５％（Ｖ／Ｖ）の濃
度までにしてモノクローナル抗体を沈殿させた。沈殿を
１０，０００ｇで１５分間遠心して集め、ｐＨ７．５、
４℃で５０％Ｖ／Ｖの硫酸アンモニウム液で２回洗滌し
た。次に沈殿を溶解し、５０ｍＭトリスｐＨ８、０．５
Ｍ ＮａＣｌに対して徹底的に透析した。５０ｍＭトリ
ス、ｐＨ７．８、０．５Ｍ ＮａＣｌ中で平衡化したセ
ファクリルＳ−３０００を使用してゲル濾過によってこ
のものを精製した。モノクローナル抗体ｍＡｂ ９６を
含有するピークをプールして、ＰＢＳに対して透析し
た。
精製 ９６ＩｇＭハイブリドーマ細胞を注射した動物の腹水を
４℃で１５分間３０００ＲＰＭでｌｏｗ ｓｐｅｅｄ
ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ中で遠心して澄んだ液とした。４
℃で飽和硫酸アンモニウム液をゆっくりと加え、ｐＨ
７．５で２４時間かけて最後には４５％（Ｖ／Ｖ）の濃
度までにしてモノクローナル抗体を沈殿させた。沈殿を
１０，０００ｇで１５分間遠心して集め、ｐＨ７．５、
４℃で５０％Ｖ／Ｖの硫酸アンモニウム液で２回洗滌し
た。次に沈殿を溶解し、５０ｍＭトリスｐＨ８、０．５
Ｍ ＮａＣｌに対して徹底的に透析した。５０ｍＭトリ
ス、ｐＨ７．８、０．５Ｍ ＮａＣｌ中で平衡化したセ
ファクリルＳ−３０００を使用してゲル濾過によってこ
のものを精製した。モノクローナル抗体ｍＡｂ ９６を
含有するピークをプールして、ＰＢＳに対して透析し
た。
【００３１】実際例ＩＶモノクローナル抗体１０８のＦ（ａｂ）’2 及びＦ（ａ
ｂ）’フラグメントの精製、比活性及び免疫反応性 モノクローナル抗体１０８（５ｍｇ／ｍｌ）の０．１Ｍ
酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．９の溶液を３７℃で７時
間４％Ｗ／Ｗペプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ
Ｊｅｒｓｅｙ）存在下消化した。２ＭトリスでｐＨを
８．０にあわせて消化を止め、次に４℃でＰＢＳに対し
て透析した。残りの未反応のＩｇＧ分子をプロテインＡ
アフィニティクロマトグラフィーによって除去した。Ｆ
ｃ部及びより小さなフラグメントをセファロースＧ−１
００のゲル濾過により除去した。単価Ｆａｂ’フラグメ
ントを調製するため、Ｆ（ａｂ）’2 （２ｍｇ／ｍｌ）
を３７℃で１時間２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．２中
で１０ｍＭジチオスレイトールで還元した。３７℃で３
０分間４０ｍＭヨードアセトアミド液でアルキル化し、
次に４℃でＰＢＳに対して徹底的に透析した。ドデシル
硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ、第１図参照）によっていろいろなフラグ
メントの純度及び消化が完結していることを分析した。
モノクローナル抗体１０８の 125Ｉ−標識化をクロラミ
ンＴ法（Ｈｕｎｔｅｒ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ 131Ｉｏｄｉｎｅ Ｌ
ａｂｅｌｌｅｄ ＨｕｍａｎＧｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏ
ｎｄ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｃｔｉｖ
ｉｔｙ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．１９６，４６５−６，
（１９６２））によって行った。通常約３×１０6 ｃｐ
ｍ／μｇ ＩｇＧの比活性のものが得られた。 1 25Ｉ標
識１０８のＫＢ細胞上に現われたＥＧＦレセプターへの
結合と競合しうる点で天然のままのモノクローナル抗体
１０８と比較してモノクローナル抗体１０８のＦ（ａ
ｂ）’2 及びＦ（ａｂ）フラグメントは充分に免疫反応
性を有していた（第２図参照）。
ｂ）’フラグメントの精製、比活性及び免疫反応性 モノクローナル抗体１０８（５ｍｇ／ｍｌ）の０．１Ｍ
酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．９の溶液を３７℃で７時
間４％Ｗ／Ｗペプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ
Ｊｅｒｓｅｙ）存在下消化した。２ＭトリスでｐＨを
８．０にあわせて消化を止め、次に４℃でＰＢＳに対し
て透析した。残りの未反応のＩｇＧ分子をプロテインＡ
アフィニティクロマトグラフィーによって除去した。Ｆ
ｃ部及びより小さなフラグメントをセファロースＧ−１
００のゲル濾過により除去した。単価Ｆａｂ’フラグメ
ントを調製するため、Ｆ（ａｂ）’2 （２ｍｇ／ｍｌ）
を３７℃で１時間２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．２中
で１０ｍＭジチオスレイトールで還元した。３７℃で３
０分間４０ｍＭヨードアセトアミド液でアルキル化し、
次に４℃でＰＢＳに対して徹底的に透析した。ドデシル
硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ、第１図参照）によっていろいろなフラグ
メントの純度及び消化が完結していることを分析した。
モノクローナル抗体１０８の 125Ｉ−標識化をクロラミ
ンＴ法（Ｈｕｎｔｅｒ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ 131Ｉｏｄｉｎｅ Ｌ
ａｂｅｌｌｅｄ ＨｕｍａｎＧｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏ
ｎｄ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｃｔｉｖ
ｉｔｙ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．１９６，４６５−６，
（１９６２））によって行った。通常約３×１０6 ｃｐ
ｍ／μｇ ＩｇＧの比活性のものが得られた。 1 25Ｉ標
識１０８のＫＢ細胞上に現われたＥＧＦレセプターへの
結合と競合しうる点で天然のままのモノクローナル抗体
１０８と比較してモノクローナル抗体１０８のＦ（ａ
ｂ）’2 及びＦ（ａｂ）フラグメントは充分に免疫反応
性を有していた（第２図参照）。
【００３２】実施例Ｖモノクローナル抗体１０８の結合性 Ａ．細胞表面ＥＧＦレセプターに対するモノクローナル
抗体の結合活性 ハイブリドーマ１０８の上清液の抗体結合活性を間接螢
光免疫分析法により測定した。ＫＢ細胞（試料当り２×
１０6 個）をアッセイ前に２４時間トリプシン処理し、
試験管（Ｆａｌｃｏｎ，ポリスチレン製丸底試験管）に
入れた。アッセイ前に、ＫＢ細胞懸濁液を冷ＰＢＳで洗
滌し、４℃で４５分間１０８ハイブリドーマの上清と共
にインキュベートした。１％ウシ血清アルブミンを含有
するＰＢＳで洗った後、４℃で４５分間フルオレツセイ
ン標識したウサギ抗マウスＩｇＧと共にその細胞をイン
キュベートした。細胞試料をＰＢＳに懸濁し、螢光セル
ソーター（ＦＡＣＳ ＩＩ、Ｂｅｃｔｉｎ Ｄｉｃｋｅ
ｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ，Ｃａ，ＵＳＡ）
でもって分析した（第３図参照）。レセプター発現の均
一性を、ヒトＢ型肝炎ウイルスに対して作製されたハイ
ブリドーマ（７Ｈ０１）の上清で観察された染色がない
ということと比較して少なくとも９６％の細胞において
陽性の染色があることによって示した。４℃での抗体結
合パラメーターのＳｃａｔｃｈａｒｄ分析は平均２×１
０5 結合部位／細胞及び１．８×１０ -9Ｍ-1のＫＤを示
した。
抗体の結合活性 ハイブリドーマ１０８の上清液の抗体結合活性を間接螢
光免疫分析法により測定した。ＫＢ細胞（試料当り２×
１０6 個）をアッセイ前に２４時間トリプシン処理し、
試験管（Ｆａｌｃｏｎ，ポリスチレン製丸底試験管）に
入れた。アッセイ前に、ＫＢ細胞懸濁液を冷ＰＢＳで洗
滌し、４℃で４５分間１０８ハイブリドーマの上清と共
にインキュベートした。１％ウシ血清アルブミンを含有
するＰＢＳで洗った後、４℃で４５分間フルオレツセイ
ン標識したウサギ抗マウスＩｇＧと共にその細胞をイン
キュベートした。細胞試料をＰＢＳに懸濁し、螢光セル
ソーター（ＦＡＣＳ ＩＩ、Ｂｅｃｔｉｎ Ｄｉｃｋｅ
ｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ，Ｃａ，ＵＳＡ）
でもって分析した（第３図参照）。レセプター発現の均
一性を、ヒトＢ型肝炎ウイルスに対して作製されたハイ
ブリドーマ（７Ｈ０１）の上清で観察された染色がない
ということと比較して少なくとも９６％の細胞において
陽性の染色があることによって示した。４℃での抗体結
合パラメーターのＳｃａｔｃｈａｒｄ分析は平均２×１
０5 結合部位／細胞及び１．８×１０ -9Ｍ-1のＫＤを示
した。
【００３３】Ｂ．上皮細胞成長因子とモノクローナル抗
体及びそのフラグメントとの競合ラジオイムノアッセイ ＫＢ細胞（２４ウエルプレート中の１０5 個／ウエル；
ＮＵＮＣ）を２４時間生育させ、ＰＢＳで洗滌し、４
℃、あるいは室温で１時間１％ウシ血清アルブミンを含
有するＤＭＥＭ中天然のままの抗体またはそのフラグメ
ントの各種の濃度のものと、 125Ｉモノクローナル抗体
１０８（約１×１０6 ｃｐｍ／ｍｌ）存在下にインキュ
ベートした。次に細胞を洗滌し、０．５Ｎ ＮａＯＨ液
で可溶化し、その放射活性をカウンター（Ｋｏｎｔｏ
ｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で測定した。非特異的な
結合は、１００倍過剰量の非標識モノクローナル抗体を
加えて測定した。結果を、非標識抗体と共にインキュベ
ートした細胞に結合した放射活性の、冷抗体を加えるこ
となしにインキュベートした細胞に結合した放射活性に
対するパーセンテイジとして表わした。
体及びそのフラグメントとの競合ラジオイムノアッセイ ＫＢ細胞（２４ウエルプレート中の１０5 個／ウエル；
ＮＵＮＣ）を２４時間生育させ、ＰＢＳで洗滌し、４
℃、あるいは室温で１時間１％ウシ血清アルブミンを含
有するＤＭＥＭ中天然のままの抗体またはそのフラグメ
ントの各種の濃度のものと、 125Ｉモノクローナル抗体
１０８（約１×１０6 ｃｐｍ／ｍｌ）存在下にインキュ
ベートした。次に細胞を洗滌し、０．５Ｎ ＮａＯＨ液
で可溶化し、その放射活性をカウンター（Ｋｏｎｔｏ
ｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で測定した。非特異的な
結合は、１００倍過剰量の非標識モノクローナル抗体を
加えて測定した。結果を、非標識抗体と共にインキュベ
ートした細胞に結合した放射活性の、冷抗体を加えるこ
となしにインキュベートした細胞に結合した放射活性に
対するパーセンテイジとして表わした。
【００３４】ＥＧＦは、最大で約７０％まで抗体のレセ
プターへの結合と競合している。（第２図参照）。
プターへの結合と競合している。（第２図参照）。
【００３５】Ｃ．ｉｎ ｖｉｖｏでの放射能標識された
モノクローナル抗体１０８の分布 ＫＢ細胞（４×１０6 個）をヌードマウス（５−６週
令）の背部に皮下接種した。１４日後腫瘍が約１．２ｃ
ｍの直径に達した時 125Ｉモノクローナル抗体１０８を
静脈内あるいは腹腔内に注射した（５×１０6 ｃｐｍ：
３×１０6 ｃｐｍ／μｇ）。コントロールとしてヒトＢ
型肝炎ウイルスに対する 125Ｉ−モノクローナル抗体７
Ｈ０１ ＩｇＧ２ａを用いた。抗体を投与して４日たっ
てから動物を殺して、各種組織中の放射活性を測定し
た。少なくとも各群あたり４匹の動物の平均を示した。
（第４図参照）。
モノクローナル抗体１０８の分布 ＫＢ細胞（４×１０6 個）をヌードマウス（５−６週
令）の背部に皮下接種した。１４日後腫瘍が約１．２ｃ
ｍの直径に達した時 125Ｉモノクローナル抗体１０８を
静脈内あるいは腹腔内に注射した（５×１０6 ｃｐｍ：
３×１０6 ｃｐｍ／μｇ）。コントロールとしてヒトＢ
型肝炎ウイルスに対する 125Ｉ−モノクローナル抗体７
Ｈ０１ ＩｇＧ２ａを用いた。抗体を投与して４日たっ
てから動物を殺して、各種組織中の放射活性を測定し
た。少なくとも各群あたり４匹の動物の平均を示した。
（第４図参照）。
【００３６】標識化したモノクローナル抗体１０８の静
脈及び腹腔内への投与では共に抗体は腫瘍部分に集まっ
ていた。コントロールＩｇＧの投与の場合静脈内投与で
は腫瘍部では何らの濃度もなかったが、腹腔内投与の方
では腫瘍の縁部に少し存在していた。静脈内投与後９６
時間での腫瘍部に蓄積した投与物のパーセンテージはそ
れぞれモノクローナル抗体１０８で７．８±１．１、モ
ノクローナル抗体７Ｈ０１（コントロール抗体）で０．
８±０．１であり、腹腔内投与ではそれぞれモノクロー
ナル抗体１０８で７．５＋０．４、モノクローナル抗体
７Ｈ０１で１．８±０．２であった。
脈及び腹腔内への投与では共に抗体は腫瘍部分に集まっ
ていた。コントロールＩｇＧの投与の場合静脈内投与で
は腫瘍部では何らの濃度もなかったが、腹腔内投与の方
では腫瘍の縁部に少し存在していた。静脈内投与後９６
時間での腫瘍部に蓄積した投与物のパーセンテージはそ
れぞれモノクローナル抗体１０８で７．８±１．１、モ
ノクローナル抗体７Ｈ０１（コントロール抗体）で０．
８±０．１であり、腹腔内投与ではそれぞれモノクロー
ナル抗体１０８で７．５＋０．４、モノクローナル抗体
７Ｈ０１で１．８±０．２であった。
【００３７】実施例ＶＩモノクローナル抗体９６の結合性 Ａ．上皮細胞生長因子とモノクローナル抗体９６との競
合ラジオイムノアッセイ ２４−ウエルプレート中の洗滌され集密的ＭＤＡ−４６
８細胞単層を４℃で２．５時間各種濃度の結合緩衝液
（ＩＭＥＭ、０．１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ Ｈｅｐｅ
ｓ）中の抗体または非標識ＥＧＦと共にあるいはそれら
なしにインキュベートした。〔 125Ｉ〕ＥＧＦ（Ｓ．
Ａ．８０−１６０μＣｉ／μｇ、ＩＧＮ Ｒａｄｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ，ＣＡ）を終濃度１ｎＭとなるよう加
えた。インキュベーション後、単層細胞を洗滌し、溶菌
用緩衝液（１０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５
％ ＳＤＳ、ｐＨ７．４）でもって可溶化し、放射活性
をガンマ線カウンター（ＬＫＢ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
を用いて測定した。４種の抗体すべて標識化したＥＧＦ
の結合を阻害することができたが、非特異的なＩｇＧま
たはＩｇＭは無効であった。細胞の生長を阻害するのに
最も有効であった２種の抗体（１２５ＩｇＭ及び２２５
ＩｇＧ）もまた〔 125Ｉ〕ＥＧＦの結合を阻害するのに
最も効果があった。これらの抗体は非標識ＥＧＦよりも
多くの程度まで〔 125Ｉ〕ＥＧＦの結合を阻害すること
ができた。（第１７図参照）
合ラジオイムノアッセイ ２４−ウエルプレート中の洗滌され集密的ＭＤＡ−４６
８細胞単層を４℃で２．５時間各種濃度の結合緩衝液
（ＩＭＥＭ、０．１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ Ｈｅｐｅ
ｓ）中の抗体または非標識ＥＧＦと共にあるいはそれら
なしにインキュベートした。〔 125Ｉ〕ＥＧＦ（Ｓ．
Ａ．８０−１６０μＣｉ／μｇ、ＩＧＮ Ｒａｄｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ，ＣＡ）を終濃度１ｎＭとなるよう加
えた。インキュベーション後、単層細胞を洗滌し、溶菌
用緩衝液（１０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５
％ ＳＤＳ、ｐＨ７．４）でもって可溶化し、放射活性
をガンマ線カウンター（ＬＫＢ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
を用いて測定した。４種の抗体すべて標識化したＥＧＦ
の結合を阻害することができたが、非特異的なＩｇＧま
たはＩｇＭは無効であった。細胞の生長を阻害するのに
最も有効であった２種の抗体（１２５ＩｇＭ及び２２５
ＩｇＧ）もまた〔 125Ｉ〕ＥＧＦの結合を阻害するのに
最も効果があった。これらの抗体は非標識ＥＧＦよりも
多くの程度まで〔 125Ｉ〕ＥＧＦの結合を阻害すること
ができた。（第１７図参照）
【００３８】実施例ＶＩＩ モノクローナル抗体１０８の有用性 Ａ．ＫＢ細胞のコロニー阻害アッセイ ＫＢ細胞を２×１０2 細胞／皿の濃度でペトリ皿（５０
×１５ｎＭ2 、ＮＵＮＣ）中にまいた。１６〜２４時間
後、培地を、ＥＧＦを含むあるいは含まないモノクロー
ナル抗体１０８の天然のものあるいはフラグメント化し
たものの各種濃度のものを含有する新鮮なもので置きか
えた。６日目にカルチャーを上記の成分を含有する新鮮
な培地に再び植えた。１５日目にＰＢＳで洗滌し、４％
Ｖ／ＶホルムアルデヒドのＰＢＳ液で１５分間固定し、
ヘマトキシリンで染色した。次に形成されたコロニー数
（２５細胞）を測定した。
×１５ｎＭ2 、ＮＵＮＣ）中にまいた。１６〜２４時間
後、培地を、ＥＧＦを含むあるいは含まないモノクロー
ナル抗体１０８の天然のものあるいはフラグメント化し
たものの各種濃度のものを含有する新鮮なもので置きか
えた。６日目にカルチャーを上記の成分を含有する新鮮
な培地に再び植えた。１５日目にＰＢＳで洗滌し、４％
Ｖ／ＶホルムアルデヒドのＰＢＳ液で１５分間固定し、
ヘマトキシリンで染色した。次に形成されたコロニー数
（２５細胞）を測定した。
【００３９】第４図はＫＢ細胞に及ぼす増加する濃度の
ＥＧＦ及びモノクローナル抗体１０８の効果を示してい
る。ＫＢ細胞をＥＧＦ（１６０ｎＭ）にさらすと、その
成長因子なしでインキュベートされた細胞に比較して植
えた後１５日して（処理を開始してから１４日後）測定
したコロニー数は１５０％まで増加していた。加えてＥ
ＧＦはＫＢ細胞のコロニーの大きさを増加させた。同様
の実験をモノクローナル抗体１０８（１．６μＭ）の存
在下行なうと、細胞のコロニー数はコントロール値の３
０％にまで減少させた。さらに、コロニー数を５０％増
大させるような濃度のＥＧＦと共に１００倍過剰量のモ
ノクローナル抗体１０８ではそのコロニー数をコントロ
ール値の２０％にまで減少させた。同じ条件下では、モ
ノクローナル抗体１０８のＦ（ａｂ）’2 フラグメント
ではＫＢのコロニー数に何の影響も与えなかった。しか
し、ＥＧＦに対して１００倍過剰な量を用いた時、Ｆ
（ａｂ）’2 フラグメントは形成されたコロニーの数に
及ぼすＥＧＦの効果を打ち消すことができた（１５０％
〜１０３％）。同じ濃度のジニトロフェニル（ＤＮＰ）
に対するモノクローナル抗体とのインキュベートでは形
成されたコロニー数に何らの影響もなかった。（第５図
参照）。
ＥＧＦ及びモノクローナル抗体１０８の効果を示してい
る。ＫＢ細胞をＥＧＦ（１６０ｎＭ）にさらすと、その
成長因子なしでインキュベートされた細胞に比較して植
えた後１５日して（処理を開始してから１４日後）測定
したコロニー数は１５０％まで増加していた。加えてＥ
ＧＦはＫＢ細胞のコロニーの大きさを増加させた。同様
の実験をモノクローナル抗体１０８（１．６μＭ）の存
在下行なうと、細胞のコロニー数はコントロール値の３
０％にまで減少させた。さらに、コロニー数を５０％増
大させるような濃度のＥＧＦと共に１００倍過剰量のモ
ノクローナル抗体１０８ではそのコロニー数をコントロ
ール値の２０％にまで減少させた。同じ条件下では、モ
ノクローナル抗体１０８のＦ（ａｂ）’2 フラグメント
ではＫＢのコロニー数に何の影響も与えなかった。しか
し、ＥＧＦに対して１００倍過剰な量を用いた時、Ｆ
（ａｂ）’2 フラグメントは形成されたコロニーの数に
及ぼすＥＧＦの効果を打ち消すことができた（１５０％
〜１０３％）。同じ濃度のジニトロフェニル（ＤＮＰ）
に対するモノクローナル抗体とのインキュベートでは形
成されたコロニー数に何らの影響もなかった。（第５図
参照）。
【００４０】Ｂ．ヌードマウスにおけるモノクローナル
抗体１０８及びそのフラグメントの抗腫瘍活性 ＫＢ細胞（２×１０6 ）をヌードマウスに皮下注射し、
次に腫瘍細胞の注射の後第１日目から始めて１回または
数回間隔をおいたモノクローナル抗体１０８の投与を行
なった。腫瘍パラメーターを週に２回カリパスでもって
測定し、その容積を次式に従って計算した： 腫瘍容積（ｎＭ3 ）＝長さ×幅×高さ。 測定値を確認するため、動物を殺した時に腫瘍の容積と
腫瘍の重量との相互関係を評価した。
抗体１０８及びそのフラグメントの抗腫瘍活性 ＫＢ細胞（２×１０6 ）をヌードマウスに皮下注射し、
次に腫瘍細胞の注射の後第１日目から始めて１回または
数回間隔をおいたモノクローナル抗体１０８の投与を行
なった。腫瘍パラメーターを週に２回カリパスでもって
測定し、その容積を次式に従って計算した： 腫瘍容積（ｎＭ3 ）＝長さ×幅×高さ。 測定値を確認するため、動物を殺した時に腫瘍の容積と
腫瘍の重量との相互関係を評価した。
【００４１】ヌードマウスにおけるＫＢ細胞の生育の阻
止能をその抗体について測定した。（第６図参照）。腫
瘍接種後第１日目、第５日目、第１２日目及び第１８日
目に動物は１ｍｇのモノクローナル抗体１０８あるいは
コントロールのジニトロフェニルに対するモノクローナ
ル抗体のいずれかを受けた。フラグメントＦ（ａｂ）’
2 及びＦａｂ’は抗体と等価の量投与された。コントロ
ールのモノクローナル抗体で処理された群と比較してモ
ノクローナル抗体１０８で処理された群は顕著に腫瘍の
拡大及び生育を阻害した（Ｐ＜０．０１７、スチューデ
ントテスト）。Ｆ（ａｂ）’2 は腫瘍の生育に影響を及
ぼすことが見出されたが、全抗体よりも効果が劣ってい
た（Ｐ＜０．０５、第１２日目、第１７日目、第２２日
目及び第２５日目のスチューデントテスト）。Ｆａｂ’
フラグメントは腫瘍の生育に何の影響も与えなかった。
腫瘍細胞の注射後第１日目に天然のままのモノクローナ
ル抗体１０８の２ｍｇの１回の投与は、腫瘍の接種後第
１日目、第５日目、第１２日目及び第１８日目にそれぞ
れ１ｍｇづつ計４回処理されたものと同じ効果を有して
いることが見出された。別の実験において、動物を０．
６６ｍｇのＦ（ａｂ）’2 フラグメントで１回投与処理
した時、抗腫瘍効果はわずかに劣るけれども、コントロ
ール群と処理群との間には顕著な差異がＭａｎｎ Ｗｈ
ｉｔｎｅｙ分析法（第９日目、第１２日目、第１４日
目、第１７日目でＰ＜０．０３）及びスチューデントテ
スト（ｓｔｕｄｅｎｔ ｔｅｓｔ）（第９日目、第１２
日目でＰ＜０．０５）を用いて見出された。動物を殺し
た時に腫瘍は測定され、次に重量測定のため取り出され
た。腫瘍の容積と腫瘍の重量との間の関係係数は０．９
５（Ｐ＜０．０００１）であった。
止能をその抗体について測定した。（第６図参照）。腫
瘍接種後第１日目、第５日目、第１２日目及び第１８日
目に動物は１ｍｇのモノクローナル抗体１０８あるいは
コントロールのジニトロフェニルに対するモノクローナ
ル抗体のいずれかを受けた。フラグメントＦ（ａｂ）’
2 及びＦａｂ’は抗体と等価の量投与された。コントロ
ールのモノクローナル抗体で処理された群と比較してモ
ノクローナル抗体１０８で処理された群は顕著に腫瘍の
拡大及び生育を阻害した（Ｐ＜０．０１７、スチューデ
ントテスト）。Ｆ（ａｂ）’2 は腫瘍の生育に影響を及
ぼすことが見出されたが、全抗体よりも効果が劣ってい
た（Ｐ＜０．０５、第１２日目、第１７日目、第２２日
目及び第２５日目のスチューデントテスト）。Ｆａｂ’
フラグメントは腫瘍の生育に何の影響も与えなかった。
腫瘍細胞の注射後第１日目に天然のままのモノクローナ
ル抗体１０８の２ｍｇの１回の投与は、腫瘍の接種後第
１日目、第５日目、第１２日目及び第１８日目にそれぞ
れ１ｍｇづつ計４回処理されたものと同じ効果を有して
いることが見出された。別の実験において、動物を０．
６６ｍｇのＦ（ａｂ）’2 フラグメントで１回投与処理
した時、抗腫瘍効果はわずかに劣るけれども、コントロ
ール群と処理群との間には顕著な差異がＭａｎｎ Ｗｈ
ｉｔｎｅｙ分析法（第９日目、第１２日目、第１４日
目、第１７日目でＰ＜０．０３）及びスチューデントテ
スト（ｓｔｕｄｅｎｔ ｔｅｓｔ）（第９日目、第１２
日目でＰ＜０．０５）を用いて見出された。動物を殺し
た時に腫瘍は測定され、次に重量測定のため取り出され
た。腫瘍の容積と腫瘍の重量との間の関係係数は０．９
５（Ｐ＜０．０００１）であった。
【００４２】Ｃ．腹腔内での腫瘍の成長 転移形態のＫＢ腫瘍を細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）に注射
することによって得ることができた。１．５×１０6 個
のＫＢ細胞を注射されたマウスは、その移植後４−６週
間で肺に腫瘍結節を作った。この腫瘍モデルは、腫瘍細
胞で内部器官に浸透していくという臨床上の条件に似た
ものである。このことは癌治療の上での主要の問題点で
ある。ＫＢ細胞の注射につづいて、その腫瘍の注射の後
第６日目、第９日目及び第１３日目に．５ｍｇのモノク
ローナル抗体１０８を計３回静脈内注射した。実験の終
りに、肺を取り出し、４％ホルムアルデヒドで固定し、
パラフィンに埋め込んだ。４−５μｍの厚さに連続して
スライスし、ヘマトキシリンで染色した。肺を通るいろ
いろな深さの転移性の結節の数が光顕微鏡検査分析法に
より得られた。動物が有していた肺の腫瘍から３種の転
移性細胞クローンを単離し、そのレセプターレベルをア
ッセイし、レセプターの発現があることがわかった。抗
体による処理は肺の腫瘍の結節の数を、それぞれのコン
トロールの１５％にまで減少させた。（Ｐ＜０．０５
Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ分析法）。（第８図参照）
することによって得ることができた。１．５×１０6 個
のＫＢ細胞を注射されたマウスは、その移植後４−６週
間で肺に腫瘍結節を作った。この腫瘍モデルは、腫瘍細
胞で内部器官に浸透していくという臨床上の条件に似た
ものである。このことは癌治療の上での主要の問題点で
ある。ＫＢ細胞の注射につづいて、その腫瘍の注射の後
第６日目、第９日目及び第１３日目に．５ｍｇのモノク
ローナル抗体１０８を計３回静脈内注射した。実験の終
りに、肺を取り出し、４％ホルムアルデヒドで固定し、
パラフィンに埋め込んだ。４−５μｍの厚さに連続して
スライスし、ヘマトキシリンで染色した。肺を通るいろ
いろな深さの転移性の結節の数が光顕微鏡検査分析法に
より得られた。動物が有していた肺の腫瘍から３種の転
移性細胞クローンを単離し、そのレセプターレベルをア
ッセイし、レセプターの発現があることがわかった。抗
体による処理は肺の腫瘍の結節の数を、それぞれのコン
トロールの１５％にまで減少させた。（Ｐ＜０．０５
Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ分析法）。（第８図参照）
【００４３】実際例ＶＩＩＩモノクローナル抗体９６の有用性 Ａ．１８４Ａ１Ｎ４及びＭＤＡ−４６８細胞の生育の９
６による阻止 １８４Ａ１Ｎ４及びＭＤＡ−４６８細胞を３本の２４−
ウエルプレートのウエルの中に入れ（５，０００／ウエ
ル）、抗体を加える前に付着させておいた。１８４Ａ１
Ｎ４の生育培地は１ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ及びＥＧＦと共
に同時に生育培地中に加えられたいろいろな量のＥＧＦ
Ｒ抗体を含んでいた。ＭＤＡ−４６８の生育培地はどん
なＥＧＦも含んでいなかった。生育培地を４８時間後に
交換し、４日後に細胞を測定した。生育実験の最後に細
胞をトリプシン−ＥＤＴＡでもって収穫し、Ｐａｒｔｉ
ｃｌｅ Ｄａｔａセルカウンター（Ｐａｒｔｉｃｌｅ
Ｄａｔａ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｍｈｕｒｓｔ，ＩＬ）を用い
て測定した。コントロール細胞数％（平均±ＳＤ）で示
した。９６ＩｇＭ（●）、４２ＩｇＭ（○）、非特異的
なＩｇＭ（△）、２２５ＩｇＧ（■）、１０８ＩｇＧ
（□）、非特異的なＩｇＧ（▲）。（第１３図参照）。
６による阻止 １８４Ａ１Ｎ４及びＭＤＡ−４６８細胞を３本の２４−
ウエルプレートのウエルの中に入れ（５，０００／ウエ
ル）、抗体を加える前に付着させておいた。１８４Ａ１
Ｎ４の生育培地は１ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ及びＥＧＦと共
に同時に生育培地中に加えられたいろいろな量のＥＧＦ
Ｒ抗体を含んでいた。ＭＤＡ−４６８の生育培地はどん
なＥＧＦも含んでいなかった。生育培地を４８時間後に
交換し、４日後に細胞を測定した。生育実験の最後に細
胞をトリプシン−ＥＤＴＡでもって収穫し、Ｐａｒｔｉ
ｃｌｅ Ｄａｔａセルカウンター（Ｐａｒｔｉｃｌｅ
Ｄａｔａ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｍｈｕｒｓｔ，ＩＬ）を用い
て測定した。コントロール細胞数％（平均±ＳＤ）で示
した。９６ＩｇＭ（●）、４２ＩｇＭ（○）、非特異的
なＩｇＭ（△）、２２５ＩｇＧ（■）、１０８ＩｇＧ
（□）、非特異的なＩｇＧ（▲）。（第１３図参照）。
【００４４】Ｂ．１８４Ａ１Ｎ４細胞に対する９６のコ
ロニー阻止アッセイ １８４Ａ１Ｎ４−Ｔ細胞を０．４％ Ｂａｃｔｏ−Ａｇ
ａｒ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＩＭＥ
Ｍ、１０％ＦＢＳ及び処置を含有する半固体寒天培地中
に懸濁した。細胞を３本の１ｍｌ ＩＭＥＭ、０．６％
寒天及び１０％ＦＢＳを含有する３５ｍｍ培養皿に入れ
た（１０，０００個／皿）。１０−１４日間３７℃で５
％ ＣＯ2 中で２０ｎＭ ａＥＧＦＲまたは２０ｎＭ非
特異的な抗体の存在下そしてＥＧＦの濃度を大きくしな
がらその皿をインキュベートした。６０μｍより大きな
コロニーの数を平均（±ＳＤ）で示した。Ａ）ＩｇＧ：
２２５ＩｇＧ（●）、１０８ＩｇＧ（○）、非特異的な
ＩｇＧ（△）。Ｂ）ＩｇＭ：９６ＩｇＭ（○）、４２Ｉ
ｇＭ（●）、非特異的なＩｇＭ（△）。直径が６０μｍ
より大きな細胞のコロニーはＢａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍ
ｂコロニーカウンターを用いて測定した。（第１５図参
照）
ロニー阻止アッセイ １８４Ａ１Ｎ４−Ｔ細胞を０．４％ Ｂａｃｔｏ−Ａｇ
ａｒ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＩＭＥ
Ｍ、１０％ＦＢＳ及び処置を含有する半固体寒天培地中
に懸濁した。細胞を３本の１ｍｌ ＩＭＥＭ、０．６％
寒天及び１０％ＦＢＳを含有する３５ｍｍ培養皿に入れ
た（１０，０００個／皿）。１０−１４日間３７℃で５
％ ＣＯ2 中で２０ｎＭ ａＥＧＦＲまたは２０ｎＭ非
特異的な抗体の存在下そしてＥＧＦの濃度を大きくしな
がらその皿をインキュベートした。６０μｍより大きな
コロニーの数を平均（±ＳＤ）で示した。Ａ）ＩｇＧ：
２２５ＩｇＧ（●）、１０８ＩｇＧ（○）、非特異的な
ＩｇＧ（△）。Ｂ）ＩｇＭ：９６ＩｇＭ（○）、４２Ｉ
ｇＭ（●）、非特異的なＩｇＭ（△）。直径が６０μｍ
より大きな細胞のコロニーはＢａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍ
ｂコロニーカウンターを用いて測定した。（第１５図参
照）
【００４５】Ｃ．ＭＤＡ−４６８細胞に対する９６のコ
ロニー阻止アッセイ ＭＤＡ−４６８細胞を０．４％ Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ
（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＩＭＥＭ、１
０％ＦＢＳ及び処置を含有する半固体寒天培地中に懸濁
した。細胞を３本の１ｍｌ ＩＭＥＭ、０．６％寒天及
び１０％ＦＢＳを含有する３５ｍｍ培養皿中に入れた
（１０，０００個／皿）。１０−１４日間３７℃で５％
ＣＯ2 中で２０ｎＭ ａＥＧＦＲまたは２０ｎＭ非特
異的な抗体の存在下そしてＥＧＦの濃度を大きくしなが
らその皿をインキュベートした。６０μｍより大きなコ
ロニーの数を平均（±ＳＤ）で示した。Ａ）ＩｇＧ：２
２５ＩｇＧ（●）、１０８ＩｇＧ（△）、非特異的なＩ
ｇＧ（▲）、ＥＧＦ単独（○）。Ｂ）ＩｇＭ：９６Ｉｇ
Ｍ（△）、４２ＩｇＭ（●）、非特異的なＩｇＭ
（▲）、ＥＧＦ単独（○）。直径が６０μｍより大きな
細胞のコロニーはＢａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂコロニー
カウンターを用いて測定した。（第１６図参照）。
ロニー阻止アッセイ ＭＤＡ−４６８細胞を０．４％ Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ
（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＩＭＥＭ、１
０％ＦＢＳ及び処置を含有する半固体寒天培地中に懸濁
した。細胞を３本の１ｍｌ ＩＭＥＭ、０．６％寒天及
び１０％ＦＢＳを含有する３５ｍｍ培養皿中に入れた
（１０，０００個／皿）。１０−１４日間３７℃で５％
ＣＯ2 中で２０ｎＭ ａＥＧＦＲまたは２０ｎＭ非特
異的な抗体の存在下そしてＥＧＦの濃度を大きくしなが
らその皿をインキュベートした。６０μｍより大きなコ
ロニーの数を平均（±ＳＤ）で示した。Ａ）ＩｇＧ：２
２５ＩｇＧ（●）、１０８ＩｇＧ（△）、非特異的なＩ
ｇＧ（▲）、ＥＧＦ単独（○）。Ｂ）ＩｇＭ：９６Ｉｇ
Ｍ（△）、４２ＩｇＭ（●）、非特異的なＩｇＭ
（▲）、ＥＧＦ単独（○）。直径が６０μｍより大きな
細胞のコロニーはＢａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂコロニー
カウンターを用いて測定した。（第１６図参照）。
【００４６】実施例ＩＸモノクローナル抗体１０８のドキソルビシンと共に投与
した場合の有用性 ＫＢ細胞を注射して皮下に腫瘍をつくった。腫瘍を注射
した後２４時間目及び３−４日の間隔を置いて３回、
０．４５ｍｇのモノクローナル抗体１０８と３７．５μ
ｇのドキソルビシン（アドリアマイシン）を計４回投与
した。腫瘍の容積をコントロールと比較した：リン酸塩
緩衝液、抗体単独あるいは薬剤単独。（第９図参照）
した場合の有用性 ＫＢ細胞を注射して皮下に腫瘍をつくった。腫瘍を注射
した後２４時間目及び３−４日の間隔を置いて３回、
０．４５ｍｇのモノクローナル抗体１０８と３７．５μ
ｇのドキソルビシン（アドリアマイシン）を計４回投与
した。腫瘍の容積をコントロールと比較した：リン酸塩
緩衝液、抗体単独あるいは薬剤単独。（第９図参照）
【００４７】モノクローナル抗体１０８のシスプラチン
と共に投与した場合の有用性 ａ）１．８ｍｇのモノクローナル抗体１０８及び１００
μｇシスプラチンでもって皮下に２×１０6 個のＫＢ細
胞を接種後２４時間して１回投与処理した。結果を第１
０図に示す。 ｂ）腫瘍の移植後２０時間目に１．９ｍｇのモノクロー
ナル抗体１０８と０．１μｇのシスプラチンを別々の注
射器で静脈内に１回投与処理した。配合治療の場合には
それぞれのもの単独による治療に比して顕著に優れてい
た（Ｐ＜０．０２、スチューデントテスト、Ｐ＜０．０
０７ Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ分析法）。（第１１図
参照）
と共に投与した場合の有用性 ａ）１．８ｍｇのモノクローナル抗体１０８及び１００
μｇシスプラチンでもって皮下に２×１０6 個のＫＢ細
胞を接種後２４時間して１回投与処理した。結果を第１
０図に示す。 ｂ）腫瘍の移植後２０時間目に１．９ｍｇのモノクロー
ナル抗体１０８と０．１μｇのシスプラチンを別々の注
射器で静脈内に１回投与処理した。配合治療の場合には
それぞれのもの単独による治療に比して顕著に優れてい
た（Ｐ＜０．０２、スチューデントテスト、Ｐ＜０．０
０７ Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ分析法）。（第１１図
参照）
【図１】図１はモノクローナル抗体の１０８のＦ（ａ
ｂ）’2 及びＦ（ａｂ）調製物のドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。
非還元条件下でゲル泳動はなされた。ａ）未処理モノク
ローナル抗体１０８、ｂ）未精製Ｆ（ａｂ）’2 フラグ
メント調製物、ｃ）精製Ｆ（ａｂ）’2 、ｄ）Ｆａｂフ
ラグメント、ｅ）分子量マーカー、ＫＤ。
ｂ）’2 及びＦ（ａｂ）調製物のドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。
非還元条件下でゲル泳動はなされた。ａ）未処理モノク
ローナル抗体１０８、ｂ）未精製Ｆ（ａｂ）’2 フラグ
メント調製物、ｃ）精製Ｆ（ａｂ）’2 、ｄ）Ｆａｂフ
ラグメント、ｅ）分子量マーカー、ＫＤ。
【図２】図２はＫＢ細胞への 125Ｉモノクローナル抗体
１０８及びそのフラグメントとＥＧＦとの競合結合を示
す。ＫＢ細胞は３×１０-9Ｍの 125Ｉモノクローナル抗
体（１×１０6 ｃｐｍ／ｍｌ）の存在下、異なった濃度
ＥＧＦ（●）、非標識モノクローナル抗体１０８
（○）、そのＦ（ａｂ）’2 、フラグメント（▲）ある
いはＦａｂ’フラグメント（■）の存在下に培養した。
（３個の独立した測定値の平均）。
１０８及びそのフラグメントとＥＧＦとの競合結合を示
す。ＫＢ細胞は３×１０-9Ｍの 125Ｉモノクローナル抗
体（１×１０6 ｃｐｍ／ｍｌ）の存在下、異なった濃度
ＥＧＦ（●）、非標識モノクローナル抗体１０８
（○）、そのＦ（ａｂ）’2 、フラグメント（▲）ある
いはＦａｂ’フラグメント（■）の存在下に培養した。
（３個の独立した測定値の平均）。
【図３】図３はモノクローナル抗体１０８のＫＢ細胞へ
の結合をセルソーター分析したものである。
の結合をセルソーター分析したものである。
【図４】図４はヌードマウスに移植されたＫＢ細胞に対
する 125Ｉモノクローナル抗体１０８の付着を示す。
する 125Ｉモノクローナル抗体１０８の付着を示す。
【図５】図５はＫＢ細胞のコロニー形成におけるＥＧＦ
及びモノクローナル抗体１０８の及ぼす効果を示す。コ
ロニー形成のアッセイは実施例に記載されているように
して異なった濃度のＥＧＦ（●）及びモノクローナル抗
体１０８（■）の存在下に行われた。
及びモノクローナル抗体１０８の及ぼす効果を示す。コ
ロニー形成のアッセイは実施例に記載されているように
して異なった濃度のＥＧＦ（●）及びモノクローナル抗
体１０８（■）の存在下に行われた。
【図６】図６は、ヌードマウスに移植されたＫＢ細胞に
対するモノクローナル抗体１０８及びそのフラグメント
の抗腫瘍活性を示している。各群は少なくとも６匹のマ
ウスからなっていた。マウスは腫瘍の接種の後第１日
目、第５日目、第１２日目及び第１８日目にその静脈内
に、１ｍｇのモノクローナル抗体１０８（■）、１ｍｇ
のＤＮＰに対するモノクローナル抗体（○）、０．６６
ｍｇのモノクローナル抗体１０８のＦ（ａｂ）’2 、フ
ラグメント（▲）、あるいはＦａｂ’フラグメント
（◆）を投与して処理された。また、腫瘍細胞を注射し
た後１日に２ｍｇのモノクローナル抗体１０８で１回処
理した（●）。
対するモノクローナル抗体１０８及びそのフラグメント
の抗腫瘍活性を示している。各群は少なくとも６匹のマ
ウスからなっていた。マウスは腫瘍の接種の後第１日
目、第５日目、第１２日目及び第１８日目にその静脈内
に、１ｍｇのモノクローナル抗体１０８（■）、１ｍｇ
のＤＮＰに対するモノクローナル抗体（○）、０．６６
ｍｇのモノクローナル抗体１０８のＦ（ａｂ）’2 、フ
ラグメント（▲）、あるいはＦａｂ’フラグメント
（◆）を投与して処理された。また、腫瘍細胞を注射し
た後１日に２ｍｇのモノクローナル抗体１０８で１回処
理した（●）。
【図７】図７はヌードマウスの腹腔内に移植されたＫＢ
細胞に対する１０８ｍＡｂの抗腫瘍活性を示すものであ
る。７匹のマウスは腫瘍の接種の後第１日目、第４日目
及び第７日目にその静脈内に０．５ｍｇのモノクローナ
ル抗体１０８（−−−）またはＤＮＰに対する抗体（８
匹のマウス）を投与して処理された。
細胞に対する１０８ｍＡｂの抗腫瘍活性を示すものであ
る。７匹のマウスは腫瘍の接種の後第１日目、第４日目
及び第７日目にその静脈内に０．５ｍｇのモノクローナ
ル抗体１０８（−−−）またはＤＮＰに対する抗体（８
匹のマウス）を投与して処理された。
【図８】図８はヌードマウスの静脈内に注射されたＫＢ
細胞に対する１０８ｍＡｂの抗腫瘍活性を示すものであ
る。ａ）微小転移巣を示している１．５×１０6 個のＫ
Ｂ細胞を静脈内に注射した後６日後の肺の組織：×２５
０倍。ｂ）マウスは腫瘍の接種後第６日目、第９日目及
び第１３日目に０．５ｍｇのモノクローナル抗体１０８
を静脈内投与されて処置された。それぞれの点は、動物
の肺を通して異なった深さ採取された一連の部分の分析
を示している。
細胞に対する１０８ｍＡｂの抗腫瘍活性を示すものであ
る。ａ）微小転移巣を示している１．５×１０6 個のＫ
Ｂ細胞を静脈内に注射した後６日後の肺の組織：×２５
０倍。ｂ）マウスは腫瘍の接種後第６日目、第９日目及
び第１３日目に０．５ｍｇのモノクローナル抗体１０８
を静脈内投与されて処置された。それぞれの点は、動物
の肺を通して異なった深さ採取された一連の部分の分析
を示している。
【図９】図９は、皮下に移植されたＫＢ細胞に対する１
０８ｍＡｂのドキソルビシンと組み合わせた場合の抗腫
瘍活性を示している。０．４５ｍｇのモノクローナル抗
体１０８と３７．５μｇのドキソルビシンを４回すなわ
ち、腫瘍の注入後２４時間して及び３〜４日の間隔をお
いて３回これを繰り返して投与した。
０８ｍＡｂのドキソルビシンと組み合わせた場合の抗腫
瘍活性を示している。０．４５ｍｇのモノクローナル抗
体１０８と３７．５μｇのドキソルビシンを４回すなわ
ち、腫瘍の注入後２４時間して及び３〜４日の間隔をお
いて３回これを繰り返して投与した。
【図１０】図１０は皮下に移植されたＫＢ細胞に対する
１０８ｍＡｂのシスプラチンと組み合わせた場合の抗腫
瘍活性を示している。図１０においては１．８ｍｇのモ
ノクローナル抗体１０８及び１００μｍのシスプラチン
を含有するもので１回投与処置された。各物質は別々に
注射された。ＰＢＳ（●）、モノクローナル抗体
（▲）、シスプラチン（■）、及びモノクローナル抗体
＋シスプラチン（◆）。
１０８ｍＡｂのシスプラチンと組み合わせた場合の抗腫
瘍活性を示している。図１０においては１．８ｍｇのモ
ノクローナル抗体１０８及び１００μｍのシスプラチン
を含有するもので１回投与処置された。各物質は別々に
注射された。ＰＢＳ（●）、モノクローナル抗体
（▲）、シスプラチン（■）、及びモノクローナル抗体
＋シスプラチン（◆）。
【図１１】図１１は皮下に移植されたＫＢ細胞に対する
１０８ｍＡｂのシスプラチンと組み合わせた場合の抗腫
瘍活性を示している。図１１では、マウスは腫瘍の移植
後２０時間して１回、静脈内に、１９ｍｇのモノクロー
ナル抗体１０８及び０．１ｍｇのシスプラチン（Ａｂｉ
ｃ，Ｒａｍａｔ−Ｇａｎ，Ｉｓｒａｅｌ）を投与処理さ
れた。各物質は別々に注射された。ＰＢＳ（●）、モノ
クローナル抗体（▲）、シスプラチン（■）、及びモノ
クローナル抗体＋シスプラチン（◆）。
１０８ｍＡｂのシスプラチンと組み合わせた場合の抗腫
瘍活性を示している。図１１では、マウスは腫瘍の移植
後２０時間して１回、静脈内に、１９ｍｇのモノクロー
ナル抗体１０８及び０．１ｍｇのシスプラチン（Ａｂｉ
ｃ，Ｒａｍａｔ−Ｇａｎ，Ｉｓｒａｅｌ）を投与処理さ
れた。各物質は別々に注射された。ＰＢＳ（●）、モノ
クローナル抗体（▲）、シスプラチン（■）、及びモノ
クローナル抗体＋シスプラチン（◆）。
【図１２】図１２は細胞の生育に及ぼすＥＧＦの効果を
示している。Ａ）１８４Ａ１Ｎ４細胞。Ｂ）ＭＤＡ−４
６８細胞。１８４Ａ１Ｎ４細胞は３本の２４−ウエルプ
レートのウエルに入れられ（５，０００個／ウエル）、
ＥＧＦを加えられた。ＭＤＡ−４６８細胞は３本の２４
−ウエルプレートのウエルに入れられ（５，０００個／
ウエル）、１晩付着させておかれた。次の日にＥＧＦを
加えた。培地を４８時間後に交換し、４日後に細胞を数
えた。平均（±ＳＤ）細胞数を示した。
示している。Ａ）１８４Ａ１Ｎ４細胞。Ｂ）ＭＤＡ−４
６８細胞。１８４Ａ１Ｎ４細胞は３本の２４−ウエルプ
レートのウエルに入れられ（５，０００個／ウエル）、
ＥＧＦを加えられた。ＭＤＡ−４６８細胞は３本の２４
−ウエルプレートのウエルに入れられ（５，０００個／
ウエル）、１晩付着させておかれた。次の日にＥＧＦを
加えた。培地を４８時間後に交換し、４日後に細胞を数
えた。平均（±ＳＤ）細胞数を示した。
【図１３】図１３は、付着依存性の細胞の生育の抗−Ｅ
ＧＦレセプター抗体（ａＥＧＰＲ）の阻害を示すもので
ある。１８４Ａ１Ｎ４細胞（Ａ及びＢ）及びＭＤＡ−４
６８細胞（Ｃ及びＤ）は３本の２４−ウエルプレートの
ウエルに入れられ（５，０００個／ウエル）、抗体を加
える前に付着させておかれた。１８４Ａ１Ｎ４の生育培
地は１ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを含有していた。４８時間後
生育培地を交換し、４日後に細胞を数えた。細胞数（平
均±ＳＤ）のコントロールに対する％を示した。９６Ｉ
ｇＭ（●）、４２ＩｇＭ（○）、非特異的なＩｇＭ
（△）、２２５ＩｇＧ（■），１０８ＩｇＧ（□）、非
特異的なＩｇＧ（▲）。
ＧＦレセプター抗体（ａＥＧＰＲ）の阻害を示すもので
ある。１８４Ａ１Ｎ４細胞（Ａ及びＢ）及びＭＤＡ−４
６８細胞（Ｃ及びＤ）は３本の２４−ウエルプレートの
ウエルに入れられ（５，０００個／ウエル）、抗体を加
える前に付着させておかれた。１８４Ａ１Ｎ４の生育培
地は１ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを含有していた。４８時間後
生育培地を交換し、４日後に細胞を数えた。細胞数（平
均±ＳＤ）のコントロールに対する％を示した。９６Ｉ
ｇＭ（●）、４２ＩｇＭ（○）、非特異的なＩｇＭ
（△）、２２５ＩｇＧ（■），１０８ＩｇＧ（□）、非
特異的なＩｇＧ（▲）。
【図１４】図１４は、ＥＧＦによる付着依存性の細胞の
生育のａＥＧＦＲ阻害の逆転を示すものである。細胞は
３本の２４−ウエルプレートのウエルの中に入れられた
（５，０００個／ウエル）。１８４Ａ１Ｎ４細胞（Ａ及
びＢ）はＥＧＦ及び抗体を加える前にＥＧＦを含まない
培地中で４時間付着させておかれた。ＭＤＡ−４６８細
胞（Ｃ及びＤ）は一晩置いておかれた。抗体を２０ｎＭ
の終濃度となるように加えた。培地を４８時間後交換
し、４日後に細胞を数えた。細胞数を平均（±ＳＤ）で
示した。９６ＩｇＭ（●）、４２ＩｇＭ（○）、非特異
的なＩｇＭ（△）、２２５ＩｇＧ（■），１０８ＩｇＧ
（□）、非特異的なＩｇＧ（△）。
生育のａＥＧＦＲ阻害の逆転を示すものである。細胞は
３本の２４−ウエルプレートのウエルの中に入れられた
（５，０００個／ウエル）。１８４Ａ１Ｎ４細胞（Ａ及
びＢ）はＥＧＦ及び抗体を加える前にＥＧＦを含まない
培地中で４時間付着させておかれた。ＭＤＡ−４６８細
胞（Ｃ及びＤ）は一晩置いておかれた。抗体を２０ｎＭ
の終濃度となるように加えた。培地を４８時間後交換
し、４日後に細胞を数えた。細胞数を平均（±ＳＤ）で
示した。９６ＩｇＭ（●）、４２ＩｇＭ（○）、非特異
的なＩｇＭ（△）、２２５ＩｇＧ（■），１０８ＩｇＧ
（□）、非特異的なＩｇＧ（△）。
【図１５】図１５は、モノクローナルａＥＧＦＲによる
１８４Ａ１Ｎ４−Ｔのコロニー形成の阻害を示すもので
ある。細胞は実施例ＶＩＩＩ（Ｂ）に記載したように軟
寒天中で、２０ｎＭ ａＥＧＦＲまたは２０ｎＭ非特異
的な抗体の存在下ＥＧＦ濃度を増大させながら生育させ
た。６０μｍより大きいコロニーの数を平均（±ＳＤ）
で示した。Ａ）ＩｇＧ：２２５ＩｇＧ（●）、１０８Ｉ
ｇＧ（○）、非特異的なＩｇＧ（△）。Ｂ）ＩｇＭ：９
６ＩｇＭ（○）、４２ＩｇＭ（●）、非特異的なＩｇＭ
（△）。
１８４Ａ１Ｎ４−Ｔのコロニー形成の阻害を示すもので
ある。細胞は実施例ＶＩＩＩ（Ｂ）に記載したように軟
寒天中で、２０ｎＭ ａＥＧＦＲまたは２０ｎＭ非特異
的な抗体の存在下ＥＧＦ濃度を増大させながら生育させ
た。６０μｍより大きいコロニーの数を平均（±ＳＤ）
で示した。Ａ）ＩｇＧ：２２５ＩｇＧ（●）、１０８Ｉ
ｇＧ（○）、非特異的なＩｇＧ（△）。Ｂ）ＩｇＭ：９
６ＩｇＭ（○）、４２ＩｇＭ（●）、非特異的なＩｇＭ
（△）。
【図１６】図１６は、ＭＤＡ−４６８コロニーの形成に
及ぼすａＥＧＦＲの効果を示すものである。細胞は実施
例ＶＩＩＩ（Ｃ）に記載したように軟寒天中で、２０ｎ
ＭのａＥＧＦＲまたは非特異的な抗体の存在下ＥＧＦ濃
度を増大させながら生育させた。細胞はまたＥＧＦ単独
下でも生育させた。６０μｍより大きいコロニーの数を
平均（±ＳＤ）で示した。Ａ）ＩｇＧ：２２５ＩｇＧ
（●）、１０８ＩｇＧ（△）、非特異的なＩｇＧ
（▲）、ＥＧＦ単独（○）。Ｂ）ＩｇＭ：９６ＩｇＭ
（△）、４２ＩｇＭ（●）、非特異的なＩｇＭ（▲）、
ＥＧＦ単独（○）。
及ぼすａＥＧＦＲの効果を示すものである。細胞は実施
例ＶＩＩＩ（Ｃ）に記載したように軟寒天中で、２０ｎ
ＭのａＥＧＦＲまたは非特異的な抗体の存在下ＥＧＦ濃
度を増大させながら生育させた。細胞はまたＥＧＦ単独
下でも生育させた。６０μｍより大きいコロニーの数を
平均（±ＳＤ）で示した。Ａ）ＩｇＧ：２２５ＩｇＧ
（●）、１０８ＩｇＧ（△）、非特異的なＩｇＧ
（▲）、ＥＧＦ単独（○）。Ｂ）ＩｇＭ：９６ＩｇＭ
（△）、４２ＩｇＭ（●）、非特異的なＩｇＭ（▲）、
ＥＧＦ単独（○）。
【図１７】図１７は、ＭＤＡ−４６８細胞に結合する
〔 125Ｉ〕ＥＧＦに及ぼすａＥＧＦＲの効果を示すもの
である。２４−ウエルプレート中の集密的ＭＤＡ−４６
８細胞をヨウ素化したＥＧＦ（１ｎＭ）及び非標識抗体
またはＥＧＦの濃度を大きくしながら２．５時間４℃で
インキュベートした。２または３つの別々の実験から二
つの測定の平均（±ＳＤ）を示した。Ａ）２２５ＩｇＧ
（△）、１０８ＩｇＧ（◇）、非特異的なＩｇＧ
（▽）、ＥＧＦ単独（●）。Ｂ）ＩｇＭ：９６ＩｇＭ
（●）、４２ＩｇＭ（△）、非特異的なＩｇＭ（▼）、
ＥＧＦ単独（○）。
〔 125Ｉ〕ＥＧＦに及ぼすａＥＧＦＲの効果を示すもの
である。２４−ウエルプレート中の集密的ＭＤＡ−４６
８細胞をヨウ素化したＥＧＦ（１ｎＭ）及び非標識抗体
またはＥＧＦの濃度を大きくしながら２．５時間４℃で
インキュベートした。２または３つの別々の実験から二
つの測定の平均（±ＳＤ）を示した。Ａ）２２５ＩｇＧ
（△）、１０８ＩｇＧ（◇）、非特異的なＩｇＧ
（▽）、ＥＧＦ単独（●）。Ｂ）ＩｇＭ：９６ＩｇＭ
（●）、４２ＩｇＭ（△）、非特異的なＩｇＭ（▼）、
ＥＧＦ単独（○）。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｋ 16/30 Ｃ０７Ｋ 16/30 (72)発明者 デビッド ギボル イスラエル リホボット ハナシ ハリソ ン ストリート （番地なし） ヨーロッ パ ハウス アパートメント ８ (72)発明者 リチャード クリス アメリカ合衆国ペンシルベニア州 ランス デール ジャビス レーン 1157 (72)発明者 フランコイズ ベロット アメリカ合衆国ペンシルベニア州 ジェフ ァーソンビル ビー ウイローブルック ドライブ 348 Ｆターム(参考） 4C084 AA17 ZB262 4C085 AA14 AA26 CC04 CC29 DD63 4C086 AA01 AA02 DA32 EA10 HA12 HA28 ZB26 4H045 AA30 CA40 DA76 EA28 FA72
Claims (12)
- 【請求項１】 ヒトＥＧＦレセプターを発現し且つＥＧ
Ｆによって細胞分裂促進を刺激されるヒト腫瘍細胞をも
つヒト癌患者を治療するために抗腫瘍剤と共に用いる有
効量のモノクローナル抗体を有すると共に、（ｉ）該抗
体は該腫瘍細胞のヒトＥＧＦレセプターの細胞外ドメイ
ンに結合し、（ｉｉ）該抗体は該抗腫瘍剤に結合せず、
且つ（ｉｉｉ）該抗体はＥＧＦのヒトＥＧＦレセプター
への結合を阻害することを特徴とする治療剤。 - 【請求項２】 抗腫瘍剤と合体される請求項１記載の治
療剤。 - 【請求項３】 モノクローナル抗体と抗腫瘍剤とを別々
に投与する請求項１記載の治療剤。 - 【請求項４】 抗腫瘍剤がドキソルビシンである請求項
１記載の治療剤。 - 【請求項５】 抗腫瘍剤がシスプラチンである請求項１
記載の治療剤。 - 【請求項６】 モノクローナル抗体が抗原−抗体複合体
中のヒト口部類表皮癌（ＫＢ）細胞のヒトＥＧＦレセプ
ターの細胞外ドメインに結合することによって該ＫＢ細
胞の成長を阻害する能力をもつ請求項１記載の治療剤。 - 【請求項７】 (i) 抗腫瘍剤及び抗体がそれぞれ異なる
作用機構を介して働きヒト腫瘍細胞に対して細胞毒応答
を生じ、且つ(ii)抗体が抗腫瘍剤に結合しない請求項１
記載の治療剤。 - 【請求項８】 (i) 抗体及び抗腫瘍剤の併合作用がそれ
ぞれ単独作用から予測されたものよりも大きく、且つ(i
i)抗体が抗腫瘍剤に結合しない請求項１記載の治療剤。 - 【請求項９】 (i) 抗腫瘍剤及び抗体がそれぞれ異なる
作用機構を介して働きヒト腫瘍細胞に対して細胞毒応答
を生じ、 (ii) 抗体及び抗腫瘍剤の併合作用がそれぞれ
の単独作用から予測されたものよりも大きく、且つ(ii
i) 抗体が抗腫瘍剤に結合しない請求項１記載の治療
剤。 - 【請求項１０】 (i) 抗体がＥＧＦレセプターに関して
拮抗剤として作用し、且つ (ii) 抗体が抗腫瘍剤に結合
しない請求項１記載の治療剤。 - 【請求項１１】 (i) 抗体がＥＧＦレセプターに関して
拮抗剤として作用し、(ii)抗体及び抗腫瘍剤の併合作用
がそれぞれの単独作用から予測されたものよりも大き
く、且つ(iii) 抗体が抗腫瘍剤に結合しない請求項１記
載の治療剤。 - 【請求項１２】 抗体が腫瘍細胞のヒトＥＧＦレセプタ
ーの細胞外ドメインに結合したヒト特異的炭水化物に結
合しない請求項１記載の治療剤。
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|---|---|---|---|
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| US244737 | 1988-09-15 | ||
| US31910989A | 1989-03-03 | 1989-03-03 | |
| US319109 | 1989-03-03 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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| JP2001243418A Expired - Lifetime JP3732426B2 (ja) | 1988-09-15 | 2001-08-10 | 抗腫瘍剤と共にモノクローナル抗体を用いた治療剤 |
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
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| ES (2) | ES2174859T3 (ja) |
| LU (4) | LU91116I2 (ja) |
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| JP2008519757A (ja) * | 2004-11-12 | 2008-06-12 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | 抗ｅｇｆｒ抗体の固形物 |
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