JP2002105099A - 自己会合型アミロイドβ蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 アルツハイマー病等の患者の生体内に存在す
る自己会合型アミロイドβ蛋白質と同等の濃度で神経系
細胞に細胞死を誘導する、高い活性を有する自己会合型
アミロイドβ蛋白質を提供する。 【解決手段】 アミロイドβ蛋白質を含む水溶液を対流
させて一定時間処理して自己会合を惹起させたのち、さ
らに分画を行うことによって得られる、高い神経細胞死
活性を有する自己会合型アミロイドβ蛋白質、及び該自
己会合型アミロイドβ蛋白質の調製方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、高い毒性を有する
自己会合型アミロイドβ蛋白質、及び該蛋白質の調製方
法に関する。また、該蛋白質を用いた神経細胞死抑制作
用を有する物質のスクリーニング方法、並びに該方法で
得られた神経細胞死抑制作用を有する物質、及び該物質
を有効成分として含むアルツハイマー病の予防及び／又
は治療のための医薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】アルツハイマー病、パーキンソン病、ハ
ンチントン舞踏病、プリオン病等の加齢に伴って発症す
る複数の神経変性疾患において、現在「異常構造蛋白
質」が共通の発症機構として注目され、その分子実体の
探索が行われている。アルツハイマー病については、ア
ミロイドβ蛋白質（Aβ）を主成分とする老人斑（Annu.
Rev. Neurosci., 12, 463-490 (1989); Glenner, G.
G. and Wong, C. W., Biochem. Biophys. Res. Commu
n., 120 (3), 885-890 (1984)）と、リン酸化されたタ
ウ蛋白質を主成分とする神経原線維変化（Paired Helic
al Filament; PHF）（J.Biochem., 99, 1807-1810 (198
6); Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 83, 4913-4917 (19
86)）の二種の線維性凝集体が脳に沈着することが病理
学的特徴として報告されている。また近年、複数の多様
な病因により発症すると考えられてきたアルツハイマー
病研究において、アミロイドβ蛋白質の沈着が全てに共
通な発症経路であろうと考えられるようになってきた。
アミロイドβ蛋白質は、その前駆体物質（Amyloid Prec
ursor Protein; APP）から４０残基（Aβ_1-40）ないし
は４２残基（Aβ_1-42）の分子種として切り出されて生
じるペプチドであり、アルツハイマー病におけるアミロ
イドβ蛋白質の沈着は、切り出しの過程、又は分解の過
程での脱制御の結果であると考えられる。

【０００３】このような代謝産物の沈着は細胞死を招く
ことが多いが、アミロイドβ蛋白質の場合には積極的に
神経毒として作用して神経細胞死を引き起こすため、こ
れがアルツハイマー病の進行性痴呆の原因となる選択的
な神経細胞脱落の機構であると考えられている。また、
アミロイドβ蛋白質は水溶性のペプチドとして細胞外に
放出された状態では神経細胞死活性（以下、本明細書中
において神経細胞死活性を「毒性」と称することがあ
る）を示さず、自己会合しアミロイドβ線維を形成して
初めて毒性を獲得することが報告されている（Lorezo,
A. and Yankner,B. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,
91, 12243-12247 (1994)）。このアミロイドβ線維を
含む毒性アミロイドβ蛋白質含有液を神経系の培養細胞
に高濃度で添加すると、これらの細胞を死に至らしめる
ことが知られているため、アルツハイマー病においては
このアミロイドβ線維が神経細胞死を誘発している本体
であると考えられてきた。

【０００４】従って、このアミロイドβ線維を含む毒性
アミロイドβ蛋白質の添加により神経系細胞等に細胞死
を誘発する実験系は、アルツハイマー病における神経細
胞死を反映していると見なされ、神経細胞死抑制剤のス
クリーニング等に多く用いられてきた。しかし近年、
（１）上記したＬｏｒｅｚｏらのアミロイドβ線維を含
む毒性アミロイドβ蛋白質含有液で神経細胞死を誘導す
るのに必要な濃度は数十μＭであり、アルツハイマー病
患者の脳に存在するアミロイドβ蛋白質濃度の１０００
倍以上の濃度である、（２）アルツハイマー病患者の脳
においてアミロイドβ線維の沈着と神経細胞脱落の部位
が必ずしも一致していない、（３）ＡＰＰ過剰発現マウ
スの脳においてアミロイドβ線維の沈着以前、又は沈着
なしに学習行動異常が生じる、（４）アルツハイマー病
患者の脳における水溶性アミロイドβ蛋白質プールの増
加は沈着よりも１０年以上先行する、等、アミロイドβ
蛋白質の毒性の本体がアミロイドβ線維ではないことを
示唆する事実が報告されるようになってきた。

【０００５】一方では、上記の方法において調製され用
いられている毒性アミロイドβ蛋白質含有液は、実際に
はモノマーから線維までの複数のアミロイドβ蛋白質の
構造体を含んでいることが報告され、アミロイドβ蛋白
質の毒性の本体は線維形成の中間体であるとの仮説が提
唱されて、インビトロで線維状構造体Ｐｒｏｔｏｆｉｂ
ｒｉｌ（Hartley, D. M. et al., J. Neurosci., 19 (2
0), 8876-8884 (1999)）と球状構造体ＡＤＤＬｓ（Aβ-
derived diffusible ligands; Lambert, M. P.et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 95, 6448-6453 (199
8)）がそれぞれ同定された。形態は全く異なるがこの二
つの分子種は共に線維形成の過程で一過的に形成される
中間体とされ、β-ｓｈｅｅｔ構造をとる構造物であ
る。線維構造を形成するためにはβ-ｓｈｅｅｔ構造が
必須であるため、その点においては線維形成の中間構造
物であることが示唆されるが、しかし、どちらも複数サ
イズの構造物の集合体であり、毒性の本体が特定されて
いるとはいえない。また、細胞膜上に特異的な受容体が
存在するのかどうかなど、これらの構造物が神経細胞死
を引き起こす作用機構も不明である上、アルツハイマー
病の患者脳やＡＰＰ過剰発現マウス等の疾患モデルにお
いて実際にこれらに相当する構造物は見つかっていな
い。

【０００６】さらにアミロイドβ蛋白質は、その機能は
未だ明らかではないが本来生理的物質として健常者にお
いても生成されることが確認されており、痴呆を伴わず
に老化したヒトの脳においてアミロイドβ蛋白質の沈着
が広範に認められるケースも存在する。このように、今
までに報告されてきた線維あるいはその中間構造物とは
異なる分子種が発症に関わっている可能性が示唆され、
アミロイドβ蛋白質の毒性本体の解明、及び毒性本体の
分子種の調製が望まれていた。

【０００７】本発明者らは、先に、アルツハイマー病等
の患者の生体内に存在する自己会合したアミロイドβ蛋
白質と同等の濃度で神経系細胞に細胞死を誘導する、高
い活性を有する自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液、
及びその調製方法を提案している（特願２０００−０６
４９８３号）。この自己会合型アミロイドβ蛋白質含有
液についても、線維状構造物を除いてもその毒性が維持
されることからアミロイドβ線維以外の毒性の本体が含
まれていることが示唆されていたが、その実体は明らか
になっていなかった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、アミロイド
β蛋白質の毒性の本体を明らかにし、特に高い毒性を有
する自己会合型アミロイドβ蛋白質、及び該蛋白質含有
液を提供するためになされたものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を達成するために鋭意検討を進めた結果、アミロイドβ
蛋白質を含む水溶液を対流させて一定時間処理して自己
会合を惹起させたのち、グリセロール密度勾配遠心法に
より分画を行うことによって、特に高い神経細胞死活性
を有する自己会合型アミロイドβ蛋白質を提供できるこ
とを見いだした。また、このようにして特に高い神経細
胞死活性を有する画分を分画することが可能になれば、
得られた画分を解析することにより、毒性アミロイドβ
蛋白質の毒性本体を解明することが可能になる。本発明
はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。

【００１０】すなわち本発明は、粒状の形態を有し、蛋
白質濃度１μｇ／ｍｌ以下で神経系細胞に細胞死を誘導
する活性を有することを特徴とする自己会合型アミロイ
ドβ蛋白質を提供するものである。この発明の好ましい
態様によれば、粒径が１０〜２０ｎｍの範囲、又はグリ
セロール密度勾配遠心法により分画したときに、グリセ
ロール濃度が１５％以上の画分に得られる、上記の自己
会合型アミロイドβ蛋白質が提供される。

【００１１】この発明の別の態様によれば、高い毒性を
有する自己会合型アミロイドβ蛋白質の製造方法であっ
て、アミロイドβ蛋白質を含む水溶液を対流させる工程
及び対流させた水溶液中の自己会合型アミロイドβ蛋白
質を分画する工程を含むことを特徴とする方法、及び、
自己会合型アミロイドβ蛋白質の分画がグリセロール密
度勾配遠心法により行われ、グリセロール濃度が１５％
以上の画分に得られる自己会合型アミロイドβ蛋白質を
回収する工程を含む上記の方法が提供される。また、本
発明によって、上記の自己会合型アミロイドβ蛋白質を
含む試薬が提供される。更に、本発明によって、上記の
自己会合型アミロイドβ蛋白質を用いて、神経系細胞に
細胞死を誘導する方法が提供される。

【００１２】また別の観点からは、神経細胞死抑制作用
を有する薬剤のスクリーニング方法であって、下記の工
程； （１）上記自己会合型アミロイドβ蛋白質及び被検物質
の存在下で神経系細胞又は神経系器官を培養する工程、
又は上記自己会合型アミロイドβ蛋白質及び被検物質を
動物に投与する工程、及び（２）上記神経系細胞、神経
系器官又は動物の神経系細胞の細胞死が抑制された場合
に、上記被検物質が神経細胞死に対して抑制作用を有す
ると判定する工程を含む方法が本発明により提供され
る。

【００１３】更に、神経細胞死抑制作用を有する薬剤の
スクリーニング方法であって、下記の工程； （１）アミロイドβ蛋白質及び被検物質を含む水溶液を
対流させる工程、（２）水溶液中の自己会合型アミロイ
ドβ蛋白質生成の有無又はその程度を解析する工程、及
び（３）上記アミロイドβ蛋白質の生成が抑制された場
合に、上記被検物質が神経細胞死に対して抑制作用を有
すると判定する工程を含む方法、及び、下記の工程； （１）アミロイドβ蛋白質を含む水溶液を対流させて生
成した自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液に、被検物
質を添加する工程、（２）上記アミロイドβ蛋白質の存
在の有無又は程度を解析する工程、及び（３）上記アミ
ロイドβ蛋白質が消失又は存在量が減少した場合に、上
記被検物質が神経細胞死に対して抑制作用を有すると判
定する工程を含む方法が提供される。

【００１４】更に別の観点からは、上記の方法により得
られた神経細胞死抑制作用を有する物質、及び、上記の
物質を有効成分として含む、アルツハイマー病の予防及
び／又は治療のための医薬が本発明により提供される。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明を更に詳細に説明す
る。（１）自己会合型アミロイドβ蛋白質の物性 まず、本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質の物性に
ついて説明する。

【００１６】本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質
は、アミロイドβ蛋白質が自己会合し、粒状の形態を有
するものである。「粒状の形態」とは粒状を呈していれ
ばいかなる形状でもよく、顆粒状、細粒状、結晶、凝集
塊等をすべて含む。粒径は、通常１０〜２０ｎｍ、好ま
しくは１０〜１８ｎｍ、より好ましくは１２〜１４ｎ
ｍ、特に好ましくは約１４ｎｍ付近である。また、本発
明の自己会合型アミロイドβ蛋白質は蛋白質濃度１μｇ
／ｍｌ以下、好ましくは０．４５μｇ／ｍｌ以下で神経
系細胞に細胞死を誘導する高い神経細胞死活性を有す
る。また、かかる物性を有する自己会合型アミロイドβ
蛋白質は、グリセロール密度勾配遠心法により分画した
ときに、グリセロール濃度が１５％以上の画分に得られ
る。

【００１７】（２）自己会合型アミロイドβ蛋白質の調
製方法 上記物性を有する本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白
質は、次の通り製造することができる。まず、アミロイ
ドβ蛋白質を含む水溶液を対流させ（第一の工程）、次
に対流させた水溶液中の自己会合型アミロイドβ蛋白質
を分画する（第二の工程）ことにより、調製することが
できる。

【００１８】ここで「アミロイドβ蛋白質」とは、約４
０のアミノ酸残基からなる蛋白質であり、生体において
はアミロイド前駆体蛋白質（APP）からプロテアーゼに
よるプロセッシングで産生される。このプロテアーゼの
種類やその後の修飾によって様々な種類が存在すること
が知られているが、分泌直後にはC末端のアミノ酸残基
の長さの違いによりアミロイドβ４０（Aβ_1-40：配列
番号１）とアミロイドβ４２（Aβ_1-42：配列番号２）
が存在する。本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質の
調製には、例えば、分泌直後のアミロイドβ蛋白質の全
長分子種であるAβ_X-40もしくはAβ_X-42、又はそれらの
変異体あるいは誘導体が好ましく用いられるが、その中
でも特にAβ_1-40が好ましい。また、アミロイドβ蛋白
質は、ペプチド合成機等を用いて合成したもの、市販の
もの、又は生体試料から抽出精製したものなど、いかな
るものを用いてもよい。アミロイドβ蛋白質として合成
ペプチドを用いる場合、その合成、抽出精製方法は、そ
れ自体公知の通常用いられている方法を用いることがで
きる。また、合成ペプチドの精製度は高速液体クロマト
グラフィーにおいて単一のピークが得られる程度行えば
十分であるが、精製方法としては、例えば、ゲル濾過、
高速液体クロマトグラフィー等が用いられる。

【００１９】本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質調
製方法の第一の工程は、通常、このようにして得られた
アミロイドβ蛋白質を、滅菌精製水に溶解し、得られた
溶液に対流を惹起して維持することにより行われる。溶
解に用いる滅菌精製水の量は、アミロイドβ蛋白質が溶
解する範囲であればよいが、好ましくは水溶液中のアミ
ロイドβ蛋白質の濃度が５０ｎＭ〜２ｍＭ、より好まし
くは１μＭ〜１ｍＭ、さらに好ましくは１００〜７００
μＭとなる範囲である。この溶液を適当な塩濃度に調節
することが望ましい。塩濃度は、アミロイドβ蛋白質が
溶解される範囲であればいかなるものでもよいが、例え
ば、最終ｐＨが３〜１２、好ましくは５〜１０で、塩濃
度が１Ｍ以下であることが好ましい。このような塩濃度
に調節する方法として、例えば、ＰＢＳ（-）をアミロ
イドβ蛋白質水溶液と等量加える方法が用いられる。溶
解の方法はアミロイドβ蛋白質が適当な量の適当な塩濃
度の溶液に完全に溶解する方法であれば特に制限はな
い。

【００２０】上記水溶液中のアミロイドβ蛋白質を自己
会合させるために上記水溶液を対流させるが、対流の流
速及び維持時間は、水溶液中のアミロイドβ蛋白質が自
己会合し、アルツハイマー病の患者の生体内における毒
性アミロイドβ蛋白質と同等の濃度で神経細胞死を誘導
する活性を有するようになるものであれば特に制限はな
い。ここで、アミロイドβ蛋白質の自己会合とは、該蛋
白質の２分子以上が共有結合以外の分子間相互作用によ
って結合し、１個の分子のように行動する現象を意味し
ており、通常は、さらに多数の分子が会合することによ
り、上記（１）に記載の物性を示す粒状の形態を有する
分子が形成され、その結果としてアミロイドβ蛋白質の
毒性が獲得される。

【００２１】例えば、アミロイドβ蛋白質水溶液を適当
な容器に充填し、これに適当な温度範囲中で一定時間、
適当な速度で回転を加え続ける方法が有効である。ま
た、アミロイドβ蛋白質水溶液が常に対流し、かつ疎水
性の界面に接触する状態を維持させてもよい。例えば、
超音波分散機やスターラー等で該水溶液を攪拌する方
法、又はアミロイドβ蛋白質水溶液を適当な流速で疎水
性チューブ内で対流させる方法等も用いることができ
る。

【００２２】容器に回転を加え続ける方法としては、ア
ミロイドβ蛋白質水溶液を含む容器を回転培養機、攪拌
機、振とう機等を用いて回転させる方法が用いられる
が、この中で回転培養器を用いるのが最も好ましい。回
転速度は、通常２００ｒｐｍ以下、好ましくは５〜５０
ｒｐｍ、さらに好ましくは２０〜４０ｒｐｍで行われ
る。また、回転を維持する時間は、水溶液中のアミロイ
ドβ蛋白質が自己会合して十分な神経細胞死活性を獲得
するまで行われるが、具体的には回転の速度等の条件に
より４時間〜７日程度行われる。

【００２３】アミロイドβ蛋白質水溶液を充填する容器
としては、アミロイドβ蛋白質以外の蛋白質の混入が防
げるものであればいかなるものでもよいが、一般的に
は、蛋白質が吸着しない材質の容器が望ましい。具体的
には、プラスチック容器や、市販のエッペンドルフチュ
ーブ等がさらに望ましい。容量にも特に制限はない。ま
た、他の蛋白質の混入を防ぐために、容器をあらかじめ
オートクレーブ等を用いて滅菌しておくことは効果的で
ある。容器に充填するアミロイドβ蛋白質水溶液の量
は、容器中でアミロイドβ蛋白質水溶液に十分な対流を
惹起させ、その対流を一定に維持することができる量で
あることが望ましい。具体的には、容器の全容積の３０
〜９０％、さらには５０〜８０％が望ましい。

【００２４】また、アミロイドβ蛋白質を自己会合させ
る第一の工程として、アミロイドβ蛋白質水溶液中にア
ミロイドβ蛋白質の凝集媒体を添加する方法を用いるこ
ともできる。凝集媒体を添加し、１Ｍ以下程度の適当な
塩濃度の存在下で静置することによる方法等が挙げられ
る。アミロイドβ蛋白質の自己会合を誘起する凝集媒体
としては、一般的に蛋白質の結晶化を誘起する物質を用
いることができる。例えば、塩化リチウム、塩化ナトリ
ウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウ
ム、ギ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸ア
ンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、硝酸
アンモニウム、硝酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、
硫酸ナトリウム、硫酸リチウムセチルトリメチルアンモ
ニウム塩、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムなどの無
機塩類；ＰＥＧ１００、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６００
０、ＰＥＧ１００００などのポリエチレングリコール
類；アセトニトリル、アセトン、イソプロパノール、エ
タノール、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ブタノ
ール、１，３-ブチロラクトン、１，３-プロパンジオー
ル、２，５-ヘキサンジオール、メタノール、２-メチル
-２，４-ペンタンジオール等の有機溶媒を挙げることが
できる。凝集媒体の添加方法としては、一般的に蛋白質
の結晶化に用いられる添加方法を採用することができ
る。これらの技術については、例えば、「生命科学のた
めの結晶解析入門-タンパク質結晶解析のてびき（平山
令明著、丸善株式会社）」等に記載されている。

【００２５】対流を維持する、あるいは凝集媒体を加え
て静置する等の方法でアミロイドβ蛋白質を自己会合さ
せる際には、一定温度を維持することが望ましいが、そ
の温度範囲はアミロイドβ蛋白質が変性しない範囲であ
れば特に制限はない。具体的には４〜５０℃、好ましく
は４〜４０℃、さらに好ましくは４〜３７℃の範囲が挙
げられる。

【００２６】このようにして得られた自己会合型アミロ
イドβ蛋白質は、このままでも神経系細胞に細胞死を誘
導する活性を有し、薬理学や生化学の実験等に供するこ
とが可能であるが、第二の工程として分画を行い、さら
に高い神経細胞死活性を有する画分を得ることができ
る。分画の方法としては、遠心分離法、クロマトグラフ
ィー法、フィルター濾過法等を用いることができるが、
中でも遠心分離法を用いるのが好ましい。遠心分離法と
しては、密度勾配遠心法、平衡密度勾配遠心法、及び通
常の分画遠心法等が挙げられ、この中でも密度勾配遠心
法が特に好ましい。

【００２７】密度勾配遠心法は、前もって作成した密度
勾配の上に試料溶液を重層して遠心する方法であって、
それ自体公知の通常用いられている方法で行うことがで
きる。密度勾配を作製する機器としては、安定な密度勾
配を作製することができるものであれば、市販のもので
も、公知の方法に従って任意の装置を組み合わせたもの
でもよい。密度勾配を形成する溶媒としては、グリセロ
ール、ショ糖、重水（D₂O）、無機塩類溶液等が用いら
れるが、中でもグリセロールが好ましく用いられる。グ
リセロールの濃度は、上記の自己会合型アミロイドβ蛋
白質を安定的かつ十分に分離できる濃度であれば特に制
限はなく、一般的には、５〜５０％程度の密度勾配で行
われ、中でも１５〜３０％の密度勾配で行うのが好まし
い。また、溶媒と混合する緩衝液としては、自己会合型
アミロイドβ蛋白質の失活を防ぎ、安定に保つことので
きるものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＢ
Ｓ（−）と水を等量混合した溶液等を用いることができ
る。

【００２８】密度勾配遠心法を行う遠心機の種類として
は、超遠心機、小型超遠心機、高速遠心機等を用いるこ
とができ、この中で小型超遠心機を用いるのが好まし
い。遠心機内に設置して用いるローターとしては、スイ
ングローター、アングルローター、垂直ローター等が挙
げられ、通常スイングローターが好ましく用いられる。
密度勾配遠心法を行う際に用いられる容器としては、自
己会合型アミロイドβ蛋白質の分画が安定的に行えるも
のであればいずれのものでもよいが、一般的には、高い
回転速度と長い遠心時間に耐えうる強靱な性質であって
蛋白質が吸着しない材質のものが望ましく、遠心管等が
好ましく用いられる。材質としては、ポリアロマー（Ea
stman Chemical Company）やポリエチレン、ポリプロピ
レン、ポリカーボネート等のプラスチック、ガラス、ス
テンレス鋼などが挙げられ、中でもポリアロマー製の遠
心管が好ましく用いられる。また、容量には特に制限は
なく、試料や用いる遠心機、遠心管の容量等に応じて選
択することができるが、具体的には、０．２〜５ｍｌ、
好ましくは約２ｍｌの遠心管中に密度勾配を形成させて
実験に供することができる。密度勾配を形成した溶液に
対して、試料の体積は一般に１／１０以下で行われるの
が望ましい。

【００２９】遠心機の回転速度は、溶液中の自己会合型
アミロイドβ蛋白質が十分に分離される速度であって、
遠心機本体、ローター、遠心管のいずれにも許容される
速度であればよいが、通常２５０００ｒｐｍ以上、好ま
しくは３００００ｒｐｍ以上、より好ましくは３６００
０ｒｐｍ付近で行われる。遠心を行う時間は、溶液中の
自己会合型アミロイドβ蛋白質が十分に分離される時間
であれば特に制限はないが、具体的には、回転速度等の
条件により１〜２０時間程度、好ましくは１６時間程度
行うことができる。また、遠心を行っている間の温度は
自己会合型アミロイドβ蛋白質の活性が保たれる範囲で
あればよい。一般的には室温以下、より具体的には４〜
３７℃の範囲で行われるのが好ましいが、遠心機の冷却
装置により一定に保たれているのがさらに望ましく、具
体的には、４℃付近に保たれているのが最も望ましい。

【００３０】密度勾配遠心を行ったのち、遠心管から試
料の分画を行う。上記（１）に示した形態及び物性を有
する本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質を含む画分
は、溶媒としてグリセロールを用いた場合、グリセロー
ル濃度が１５％以上の画分を取得することによって得ら
れる。分画は、密度勾配回収器、注射器、ピペット等を
用いて行うことができるが、密度勾配全体を連続的に分
画するためには密度勾配回収器を用いるのが好ましい。
密度勾配回収器は、安定的に分画を行うことができるも
のであれば、市販のものでも、公知の方法に従って任意
の装置を組み合わせたものでもよい。また、試料の分画
は、遠心管底部より行う方法、遠心管上部より行う方
法、及び遠心管側面より目的の画分のみを分取する方法
等が挙げられるが、遠心管底部より行う方法が好まし
い。

【００３１】分画した試料は、一般的な容器等に回収す
ることができるが、異物の混入が防げるものであって、
蛋白質が吸着しない材質の容器が望ましく、具体的に
は、プラスチック容器や、市販のエッペンドルフチュー
ブ等がさらに望ましい。

【００３２】かくして高い神経細胞死活性を有する自己
会合型アミロイドβ蛋白質含有液が得られる。この含有
液は必要に応じて、後述する方法により物性の解析、神
経細胞死活性を測定したあと、所望により濃縮等の処理
を行って、所望する薬剤のスクリーニング用等の試薬と
して用いることができる。

【００３３】（３）自己会合型アミロイドβ蛋白質の物
性の解析方法 次に、上記した自己会合型アミロイドβ蛋白質の物性の
解析方法について説明する。本発明の自己会合型アミロ
イドβ蛋白質は、上記の方法に従って分画を行うことに
より複数の画分を得ることができるが、さらにそれらの
画分に含まれる自己会合型アミロイドβ蛋白質の物性を
解析することにより、各画分に含まれる自己会合型アミ
ロイドβ蛋白質の神経細胞死活性を確認することができ
る。

【００３４】物性としては、粒度分布、粒径、沈降係
数、濃度、会合度、電気泳動度、立体構造等が挙げられ
るが、その中でも粒度分布及び粒径の解析は、神経細胞
死活性の高い自己会合型アミロイドβ蛋白質を得るため
の手段として有効である。粒度分布及び粒径は、電子顕
微鏡観察による方法、ふるい分け法、クロマトグラフィ
ー法、沈降法等により求めることができるが、中でも電
子顕微鏡観察による方法が好ましい。電子顕微鏡観察に
より粒度分布及び粒径を求める方法としては、具体的に
は、ネガティブ染色法等が好ましく用いられる。ネガテ
ィブ染色法は、通常用いられる公知の方法に従って行う
ことができ、観察される視野中の自己会合型アミロイド
β蛋白質の粒径を直接得ることができる。また、同視野
中の粒子数を測定することにより各画分の粒度分布を得
ることができる。このようにして測定される粒径が１０
〜２０ｎｍ、好ましくは１０〜１８ｎｍ、より好ましく
は１２〜１４ｎｍ、特に好ましくは約１４ｎｍ付近であ
る自己会合型アミロイドβ蛋白質を含む画分であること
を確認し、高い神経細胞死活性を有する画分を取得す
る。

【００３５】また、各画分のアミロイドβ蛋白質の蛋白
質濃度及び収率の測定は、通常用いられる公知の方法を
用いて行うことができるが、その中でも、アミロイドβ
蛋白質が極微量である場合にはウエスタンブロット法に
よって得られた結果から間接的に求める方法が好まし
い。ウエスタンブロット法は、それ自体公知の通常用い
られる方法に従って行うことができる。例えば、Ｔｒｉ
ｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ系ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法等を用いて各画分及び分画前の自己会合型アミロイド
β蛋白質の電気泳動を行い、通常用いられる蛋白質転写
装置、例えばタンク式ブロッター等により、通常蛋白質
の転写に用いられる膜、例えばニトロセルロース膜等に
転写する。一般に用いられる方法に従ってこの膜に抗ア
ミロイドβ蛋白質抗体を反応させて免疫染色を行い、化
学発光シグナルを検出する。得られた各画分に含まれる
アミロイドβ蛋白質のシグナル強度と分画前のアミロイ
ドβ蛋白質のシグナル強度とを比較して、各画分のアミ
ロイドβ蛋白質の存在量及び収率を間接的に知ることが
できる。

【００３６】（４）自己会合型アミロイドβ蛋白質の神
経細胞死活性の測定方法 次に、上記した自己会合型アミロイドβ蛋白質の神経細
胞死活性の測定方法について説明する。

【００３７】本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質含
有液を用いた神経細胞死の誘導は、神経系の細胞等の培
養液に本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液を
添加し、通常の方法に従って培養することにより行うこ
とができる。本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質に
より誘導される細胞死は、アポトーシス又はネクローシ
スのいずれでもよい。また、用いられる細胞としては、
神経系細胞であれば特に制限はなく、哺乳動物（ヒト、
ラット、マウス、サル、ブタ等）由来の神経系細胞や、
これらの細胞に分化が可能な細胞等でもよい。また、初
代培養細胞又は樹立培養株のいずれでもよい。初代培養
細胞としては、上記した動物の海馬、及び前脳基底野等
から取得したものが好ましく、樹立培養株としては、例
えば、ＰＣ-１２細胞（ATCC CRL-1721）、Ｂ１０３（Sc
hubert, D. et al., Nature, 249(454), 224-227 (197
4)）、Ｎ１Ｅ−１１５（Amano, T. et al., Proc. Nat
l.Acad. Sci. USA., 69, 258-263 (1972)）等が好まし
い。また上記動物の海馬等の器官を培養したものをその
まま用いることも可能である。

【００３８】これらの細胞や器官は、通常の培養法に従
って培養することができる。具体的には、神経系細胞の
初代培養、及び神経系樹立細胞株の培養方法としては、
Hoshi, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93,
2719-2723 (1996)、及び Schubert, D. et al., Natur
e, 249 (454), 224-227 (1974) に記載されている方法
等を用いることができ、器官培養は、Gary Banker and
Kimbery Goslin, Culturing nerve cells, 2^nd Editio
n, MIT Press, Cambridge (1998) に記載されている方
法等を用いることができる。このようにして培養された
神経系の細胞、及び器官に細胞死を誘導するために添加
する本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質の量は適宜
選択可能であるが、通常、アルツハイマー病等の患者の
生体内に存在する毒性アミロイドβ蛋白質と実質的に同
等の濃度で細胞死を誘導できる。例えば、本発明の自己
会合型アミロイドβ蛋白質は、前記のとおり、初代培養
細胞に対して培養液中のアミロイドβ蛋白質濃度１μｇ
／ｍｌ以下、さらに好ましくは０.４５μｇ／ｍｌ以下
等の量で細胞死を誘導することができる。もっとも、上
記の濃度は例示のためのものであり、この量に限定され
ることはない。

【００３９】本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質に
よって誘導される神経系細胞の細胞死は、通常の場合、
本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質の有効量を添加
した後、約６時間程度から起こり、４８時間程度の後に
は顕著な細胞死の様子が観察できる。これらの細胞死活
性を測定する方法としては、通常用いられる細胞死検出
法を用いることができる。具体的には、ＭＴＴ活性測定
法（Mossman, T., J.Immunol. Methods, 65, 55 (198
3)）、プロピディウムイオダイド（Ankarcrona,M. et a
l., Neuron, 15, 961 (1995)）等による染色法、又はト
リパンブルーダイエクスクルージョン法（Woo, K. B.,
Funkhouser, W. K., Sullivan, C. andAlabaster, O.,
Cell Tissue Kinet., 13 (6), 591-604 (1980)）等が用
いられるが、ＭＴＴ活性測定法及びプロピディウムイオ
ダイド等による染色法が特に好ましい。プロピディウム
イオダイド等による染色法は、死細胞を選択的に染色す
るプロピディウムイオダイドのみによる単一染色でもよ
いし、他の複数の染色色素と組み合わせて行ってもよ
い。組み合わせられる染色色素としては、具体的には、
生細胞を選択的に染色するＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（Mole
cular Probes社製）、全細胞を染色するＨｏｅｃｈｓｔ
３３２５８（H33258; Bisbenzimide H33258）等が好ま
しい。

【００４０】また、本発明の自己会合型アミロイドβ蛋
白質含有液を用いた神経細胞死の誘導は、本発明の自己
会合型アミロイドβ蛋白質を動物個体に直接投与するこ
とにより行うこともできる。本発明の自己会合型アミロ
イドβ蛋白質により誘導される細胞死は、アポトーシス
又はネクローシスのいずれでもよい。また、用いられる
動物としては、哺乳動物（マウス、ラット等）等の神経
系細胞を有する動物であれば特に制限はない。また、投
与方法は、脳等の神経系細胞の存在する部位に直接投与
する方法の他、経口投与法、静脈注射法、腹腔投与法等
の通常薬物の投与に用いられる方法を用いることができ
る。脳等の神経系細胞の存在する部位に直接投与する方
法としては、具体的には、例えば、ラットあるいはマウ
ス等の脳組織の場合、オスモティックポンプを用いて目
標部位近傍の脳室内に投与する方法、マイクロピペット
等を用いて目標部位の脳実質にマイクロフュージョンす
る方法等が用いられ、一定期間投与した後、投与部位周
辺の組織を速やかに取り出し、組織切片を作製して、神
経細胞死の有無を検証することができる。神経細胞死の
有無の検証は、組織染色法やウェスタンブロット法等に
よって行うことができ、組織染色法としては、ＴＵＮＮ
ＥＬ染色、又は抗Ｃａｓｐａｓｅ抗体等による免疫染色
等が挙げられる。

【００４１】本発明の神経系細胞に細胞死を誘導する活
性を有する自己会合型アミロイドβ蛋白質は、神経系細
胞等に細胞死を誘導する活性を有する試薬として用いる
ことができる。試薬としての形状は、自己会合型アミロ
イドβ蛋白質の活性を安定的に維持できる形状であれば
特に制限はなく、水溶液、懸濁液等のいかなる形状であ
ってもよい。

【００４２】（５）自己会合型アミロイドβ蛋白質を用
いた薬剤のスクリーニング方法 神経系細胞又は神経系器官の培養液に本発明の自己会合
型アミロイドβ蛋白質を添加することによりこれらの神
経細胞死を誘導する系は、例えば、毒性アミロイドβ蛋
白質による神経系細胞の細胞死に対して抑制作用を有す
る薬剤のスクリーニングに用いることが可能である。

【００４３】このようなスクリーニングは、例えば、神
経系細胞又は組織培養液に予め被検物質を添加した後に
本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質を添加し、ある
いは神経系細胞又は組織培養液に本発明の自己会合型ア
ミロイドβ蛋白質を添加した後に被検物質を添加して、
上記（４）に記載の方法により該神経系細胞や組織の細
胞死が被検物質により抑制されるか否かを検出すること
により行うことができる。上記の培養系に被検物質を添
加し、神経系細胞又は神経系器官の細胞死が抑制された
場合には、その被検物質が神経細胞死に対する抑制作用
を有すると判定することができる。

【００４４】また、毒性を有する自己会合型アミロイド
β蛋白質の生成の有無を指標として、試験管等の容器内
で毒性アミロイドβ蛋白質による神経細胞死に対して抑
制作用を有する薬剤のスクリーニングを行うことができ
る。このようなスクリーニングは、例えば、試験管等の
容器内でアミロイドβ蛋白質及び被検物質を含む水溶液
を対流させて溶液中に生成する自己会合型アミロイドβ
蛋白質の有無又は程度を解析する、あるいは、アミロイ
ドβ蛋白質水溶液を対流させて生成させた自己会合型ア
ミロイドβ蛋白質含有液に被検物質を添加して、溶液中
の自己会合型アミロイドβ蛋白質の有無又は程度を解析
することによって、行うことができる。上記の方法で溶
液中の自己会合型アミロイドβ蛋白質が消失又は減少し
た場合には、その被検物質が神経細胞死に対する抑制作
用を有すると判定することができる。溶液中の自己会合
型アミロイドβ蛋白質の解析は、上記（３）及び／又は
（４）に記載の方法により行えばよい。

【００４５】本発明のスクリーニング方法により神経細
胞死に対して抑制作用を有すると判定された物質は、ア
ルツハイマー病の予防及び／又は治療のための医薬の有
効成分として有用である。ここで「物質」とは、合成
物、天然物、低分子化合物、蛋白質、糖質等のいかなる
ものでもよく、生理学的に許容されるそれらの塩、水和
物並びに溶媒和物等であってもよい。生理学的に許容さ
れる塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩などの鉱酸類
の塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、p-トルエンスルホン酸
塩などの有機酸の塩、グリシンなどのアミノ酸の塩等を
挙げることができる。

【００４６】本発明により提供される医薬は、本発明の
スクリーニング方法により神経系細胞の細胞死に対して
抑制作用を有すると判定された物質を有効成分として含
み、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための医
薬として用いることができる。本発明のスクリーニング
方法により神経細胞死に対して抑制作用を有すると判定
された物質は、それ自体を医薬として患者に投与しても
よいが、一般には、これらの有効成分の１種又は２種以
上を含む医薬組成物を製造して患者に投与することが好
適である。このような医薬組成物として、錠剤、カプセ
ル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、丸剤、トローチ、舌下
剤、又は液剤などの経口投与の製剤、あるいは注射剤、
座剤、軟膏、貼付剤などの非経口投与用の製剤を例示す
ることができる。

【００４７】経口投与用の錠剤又はカプセル剤は、通常
は単位投与物として提供され、結合剤、充填剤、希釈
剤、打錠剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、香味剤及び湿潤
剤のような通常の製剤用担体を添加して製造することが
できる。錠剤は、この当業界で周知の方法に従って、例
えば、腸溶性コーティング剤等を用いてコーティングす
ることができ、例えばセルロース、マンニトール、又は
ラクトース等の充填剤；澱粉、ポリビニルポリピロリド
ン、澱粉誘導体、又はナトリウム澱粉グリコラート等の
崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；ラウリ
ル硫酸ナトリウム等の湿潤剤を用いて製造してもよい。

【００４８】経口投与用の液剤は、例えば水性又は油性
懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ剤又はエリキシ
ル剤等の他、使用前に水又は適当な媒体により再溶解さ
れうる乾燥製剤として提供される。このような液剤に
は、通常の添加剤、例えばソルビトール、シロップ、メ
チルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロー
ス、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミ
ニウムゲル又は水素化食用脂肪のような沈殿防止剤、レ
シチン、ソルビタンモノオレート、アラビアゴムのよう
な乳化剤、アーモンド油、精製ココナッツ油、油状エス
テル（例えばグリセリンのエステル）、プロピレングリ
コール、エチルアルコールのような（食用油も包含しう
る）非水性媒体、p-ヒドロキシ安息香酸のメチルエステ
ル、エチルエステル、もしくはプロピルエステル、又は
ソルビン酸のような保存剤及び必要に応じて通常の香味
剤又は着色剤を配合することができる。

【００４９】経口投与剤の製剤は、混合、充填、又は打
錠などの当業界で周知の方法により製造することができ
る。また、反復配合操作を用いて多量の充填剤等を使用
した製剤中に有効成分を分布させてもよい。非経口投与
用の製剤は、一般には有効成分である化合物と滅菌媒体
とを含有する液体担体投与量製剤として提供される。非
経口投与用の溶剤は、通常、化合物を媒体に溶解させて
滅菌濾過し、次に適当なバイアル又はアンプルに充填し
て密封することにより製造される。安定性を高めるため
に組成物を凍結させた後にバイアル中に充填し、水を真
空下で除去してもよい。非経口懸濁液は実質的に非経口
溶液の場合と同じ方法で製造されるが、有効成分を媒体
に懸濁させてエチレンオキシド等により滅菌することに
より好適に製造できる。また、有効成分が均一分布とな
るように必要に応じて界面活性剤、湿潤剤等を添加して
もよい。

【００５０】有効成分である物質の投与量は、物質の活
性の強度、治療や予防の目的、患者の症状、体重、年齢
や性別等を考慮して適宜決定すればよい。また、１日あ
たり１〜数回に分けて投与するのが望ましい。

【００５１】

【実施例】以下、実施例により本発明を説明するが、本
発明はこれの実施例より何ら限定されるものではない。
なお、下記の実施例において、「ＰＢＳ」は「Ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ」、「Ｔ
ＴＢＳ」は「Ｔｗｅｅｎ−Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ
Ｓａｌｉｎｅ」、「ＨＲＰ」は「Ｈｏｒｓｅｒａｄｉ
ｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ」を示す。

【００５２】実施例１ 自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液の調製 （１）アミロイドβ（Aβ_1-40：配列番号１）樹脂の製
造 Ｆｍｏｃ-Ｖａｌ樹脂３４２ｍｇ（アミン含量０．７３
ｍｍｏｌ／ｇ樹脂）をパーキンエルマーアプライドバイ
オシステムズ社製Ａ４３３型自動ペプチド合成機にセッ
トし、これにＦｍｏｃ-Ｖａｌ-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｇｌｙ-
ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｇｌｙ-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｖａｌ-ＯＨ，
Ｆｍｏｃ-Ｍｅｔ-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｌｅｕ-ＯＨ，Ｆｍｏ
ｃ-Ｇｌｙ-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｉｌｅ-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｉ
ｌｅ-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ａｌａ-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｇｌｙ-
ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ａ
ｓｎ（Ｔｒｔ）-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｓｅｒ（ｔＢｕ）-Ｏ
Ｈ，Ｆｍｏｃ-Ｇｌｙ-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｖａｌ-ＯＨ，Ｆ
ｍｏｃ-Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｇｌｕ
（ＯｔＢｕ）-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ａｌａ-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-
Ｐｈｅ-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｐｈｅ-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｖａｌ
-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｌｅｕ-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｌｙｓ（Ｂｏ
ｃ）-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）-ＯＨ，Ｆｍｏ
ｃ-Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｈｉｓ（Ｔｒ
ｔ）-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｖａｌ-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｇｌｕ
（ＯｔＢｕ）-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｔｙｒ（ｔＢｕ）-Ｏ
Ｈ，Ｆｍｏｃ-Ｇｌｙ-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｓｅｒ（ｔＢ
ｕ）-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）-ＯＨ，Ｆｍ
ｏｃ-Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ａｒｇ（Ｐｍ
ｃ）-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｐｈｅ-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ｇｌｕ
（ＯｔＢｕ）-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-Ａｌａ-ＯＨ，Ｆｍｏｃ-
Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）-ＯＨを供給し、ＨＢＴＵ［２-（１
Ｈ-Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ-１-ｙｌ）-１，１，
３，３，-ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ ｈ
ｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ］を縮合剤とし
て順次縮合させて側鎖保護アミロイドβ（Aβ_1-40）樹
脂１．５１５ｇを得た。

【００５３】（２）トリフルオロ酢酸処理 上記（１）で得た側鎖保護アミロイドβ（Aβ_1-40）樹
脂中の３０４ｍｇを採取し、これにフェノール０．７５
ｍｌとチオアニソール０．５ｍｌとトリフルオロ酢酸
８．２５ｍｌとエタンジチオール０．２５ｍｌと蒸留水
０．５ｍｌを加え、氷冷下５分、続いて室温で１．５時
間反応させた。反応終了後、氷冷したジエチルエーテル
２００ｍｌを加えてペプチドを沈殿させた。全内容物を
グラスフィルターで濾取し、冷ジエチルエーテルで洗浄
した後、３５％のアセトニトリルを含む０．１％トリフ
ルオロ酢酸（約２００ｍｌ）で抽出処理してＨ-Ａｓｐ-
Ａｌａ-Ｇｌｕ-Ｐｈｅ-Ａｒｇ-Ｈｉｓ-Ａｓｐ-Ｓｅｒ-
Ｇｌｙ-Ｔｙｒ-Ｇｌｕ-Ｖａｌ-Ｈｉｓ-Ｈｉｓ-Ｇｌｎ-
Ｌｙｓ-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｐｈｅ-Ｐｈｅ-Ａｌａ-Ｇｌｕ-
Ａｓｐ-Ｖａｌ-Ｇｌｙ-Ｓｅｒ-Ａｓｎ-Ｌｙｓ-Ｇｌｙ-
Ａｌａ-Ｉｌｅ-Ｉｌｅ-Ｇｌｙ-Ｌｅｕ-Ｍｅｔ-Ｖａｌ-
Ｇｌｙ-Ｇｌｙ-Ｖａｌ-Ｖａｌ-ＯＨで表される粗ペプチ
ド１９１ｍｇを得た。

【００５４】（３）ペプチドの精製 この粗ペプチドを３５％のアセトニトリルを含む０．１
％トリフルオロ酢酸（４０ｍｌ）に溶解しＯＤＳ（オク
タデシルシラン）をシリカに結合した逆相系のカラム
（内径２ｃｍ、長さ２５ｃｍ）を用いたＨＰＬＣにより
精製した。溶出は０．１％トリフルオロ酢酸中、アセト
ニトリル濃度を２２％から４２％へ直線的に２０分間で
上昇させることにより行った。精製物の収量は３５ｍｇ
であった。本物質の構造はＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析
により確認された。測定値［Ｍ＋Ｈ］＋４３３０．９９
に対して、計算値は（Ｃ₁₉₄Ｈ₂₉₅Ｎ₅₃Ｏ₅₈Ｓ₁＋Ｈ）４
３３０．８９であった。

【００５５】（４）自己会合型アミロイドβ蛋白質含有
液の調製 上記（３）で精製を行ったアミロイドβ蛋白質０．４μ
ｍｏｌを１．５ｍｌ容量のエッペンドルフチューブに入
れ、これに５３２μｌの超純水と５３２μｌのＰＢＳ
（−）（ナカライテスク社製）を順次加え、アミロイド
β蛋白質を完全に溶解させた。このアミロイドβ蛋白質
水溶液の入ったエッペンドルフチューブをダックロータ
ー（TAITEC社製、ローター：RT50）に取り付け、３７℃
において３５ｒｐｍの速度で７日間回転させた。

【００５６】（５）グリセロール密度勾配遠心法による
自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液の分画 密度勾配作製器（Pharmacia社製）を用いて、容量２．
２ｍｌのポリアロマー製遠心管（Beckman社製）中に全
量２ｍｌの１５−３０％グリセロール密度勾配を作製し
た。緩衝液としては、ＰＢＳ（−）と水を等量混和した
もの（以下、「ＰＢＳ（−）／Ｗａｔｅｒ」と表記する
ことがある）を用いた。作製した１５−３０％グリセロ
ール密度勾配上に、上記（４）で調製した自己会合型ア
ミロイドβ蛋白質含有液を１００μｌ重層し、これを小
型卓上超遠心機（Beckman社製）にスイングローターを
設置したものを用いて、３６０００ｒｐｍで１６時間、
４℃で遠心した。遠心後、試料を遠心管底部の方からペ
リスタポンプを用いて流速を一定に保ちながら流出させ
て分取し、１２の画分に分画して、遠心管底部に近い画
分から順にフラクション１〜１２（Ｆｒ０１〜１２）と
した。遠心管最下部に残った沈殿は、最初に用いた試料
と同量の１００μｌのＰＢＳ（−）／Ｗａｔｅｒで懸濁
して回収した。また、コントロールとして、ＰＢＳ
（−）／Ｗａｔｅｒを１００μｌ用いて同様の実験を行
った。

【００５７】実施例２ 自己会合型アミロイドβ蛋白質の粒子解析 （１）電子顕微鏡観察及び写真撮影 直径１８ｃｍのシャーレに３０〜４０℃の蒸留水を入れ
てその水面にコロジオン１．５％（ｗ／ｖ）酢酸イソア
ミル溶液を３０μｌ滴下し、直ちに溶媒が揮発して生じ
る薄膜を得た。この支持膜をグリッドに張り付けて乾燥
させたのち、カーボンを真空蒸着してグロー放電による
親水化処理装置を用いて表面を親水化した。次に、支持
膜を張り付けたグリッド面を下にして実施例１の（４）
及び（５）で調製した各自己会合型アミロイド蛋白質含
有液の小滴（数μｌ）を触れさせ、直ちに濾紙で余分な
水分を吸い取ってから、酢酸ウラニウム溶液を添加して
観察を行った。電子顕微鏡は安定させた１００〜１２０
ｋＶの高圧加速で使用し、汚染防止用のトラップには液
体窒素を充填した。試料の電子線による損傷を極力防ぐ
ためにグリッドの端等を利用して非点収差補正を行った
のち、電子線損傷低減法を用いて観察及び写真撮影を行
った。

【００５８】（２）電子顕微鏡写真を用いた粒子解析 写真撮影はランダムに複数の視野を選ぶようにして行
い、得られた顕微鏡写真を用いて粒子解析を行った。ネ
ガ上で粒状構造物の赤道面を通るところで各粒状構造物
の直径を測定して、粒径及び粒度分布を求めた。粒子解
析は直接ネガを用いて行っても、スキャナー等で画像デ
ータとして取り込んで行っても同程度の解析精度が得ら
れた。図３には、実施例１の（５）で調製したＦｒ０２
の粒度分布を示した。この結果より、Ｆｒ０２中の粒状
構造物は約１４ｎｍ付近をピークとする粒度分布を示す
ことが解った。

【００５９】実施例３ 自己会合型アミロイドβ蛋白質
の濃度及び収率の解析 （１）自己会合型アミロイドβ蛋白質のウエスタンブロ
ット 上記の実施例１の（５）で調製した沈殿画分以外の各自
己会合型アミロイド蛋白質含有液をそれぞれ１０μｌず
つ、また、沈殿画分及び実施例１の（４）で調製した分
画前の自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液は２μｇず
つ、１０−２０％クラディエントのＴｒｉｓ−Ｔｒｉｃ
ｉｎｅ系ポリアクリルアミドゲルで電気泳動（NOVEX社
製キット使用）し、タンク式ブロッター（NOVEX社製）
を用いて１００Ｖで２時間、厚さ０．２μｍのニトロセ
ルロース膜（Schleicher&Schull社製）に転写した。転
写後の膜を５％スキムミルク／０．０５％ＴＴＢＳで１
時間ブロッキングしたのち、１μｇ／ｍｌの抗アミロイ
ドβ蛋白質抗体「４Ｇ８」（Senetek社製）に浸し、湿
潤箱中で一晩、４℃で反応させた。膜を０．０５％ＴＴ
ＢＳで洗浄し、二次抗体として１μｇ／ｍｌのＨＲＰ−
Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ
（Zymed社製）を１時間反応させてから、０．０５％Ｔ
ＴＢＳで洗浄して未反応の二次抗体を除去した。この膜
をＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ−Ｄｕｒａ（Pier
ce社製）に浸して５分間インキュベーションしたのち、
イメージアナライザー「ＬＡＳ−１０００ ｐｌｕｓ」
（富士写真フィルム社製）で化学発光シグナルの検出及
び画像データの取り込みを行った。

【００６０】（２）画像解析 上記（１）で得た画像データをＬＡＳ−１０００ ｐｌ
ｕｓにより解析し、実施例１の（５）で調製した分画後
の各自己会合型アミロイド蛋白質含有液の値を、実施例
１の（４）で調製した濃度既知の自己会合型アミロイド
β蛋白質含有液の値と比較することにより、相対的に濃
度及び収率を求めた。求めた収率を「回収率」として図
１に示した。

【００６１】実施例４ 自己会合型アミロイドβ蛋白質
の細胞死活性の測定 （１）初代培養細胞の調製 ラット１８日胎児の前脳基底野より分散培養によって初
代培養細胞を調製した。調製した初代培養細胞は、次に
行う細胞死活性測定法に応じてそれぞれ適切なコーティ
ングを行った培養プレート等に播種して培養した。すな
わち、ＭＴＴ活性測定に用いる場合は、ポリエルリジン
（ナカライテスク社製）によりコーティングした２４ウ
ェルプラスチック製細胞培養プレートに播種して培養し
た。三重染色法による細胞死の検定に用いる場合は、シ
リコンゴム製のウェルを作製できるＦｌｅｘｉｐｅｒｍ
（Heraeus Instruments GmbH社製）をグリッド付きカバ
ーガラスに接着させて組み合わせ、この組み立てた培養
プレートをポリエチレンイミン（Sigma社製）によりコ
ーティングしたものに播種して培養した。コーティング
は、０．１％ポリエルリジン／０．１５Ｍホウ酸バッフ
ァー（ｐＨ８．３）のポリエルリジン溶液、又は０．０
１％ポリエチレンイミン／０．１５Ｍホウ酸バッファー
（ｐＨ８．３）のポリエチレンイミン溶液に培養プレー
ト等を１晩浸漬した後、滅菌精製水で洗浄し、自然乾燥
させて行った。初代培養細胞の密度は、ＭＴＴ活性測定
に用いる場合は培養プレートの底面積に対して３×１０
⁵ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²、三重染色法による細胞死の検定に
用いる場合は２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²となるよう
に、５％牛胎児血清（ハイクローン社製）／５％馬血清
（ライフテックオリエンタル社製）／１ｍＭ Ｐｙｒｕ
ｖａｔｅ／５０μｇ／ｍｌ Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ラ
イフテックオリエンタル社製）／ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ
ｇｌｕｃｏｓｅ培地（ライフテックオリエンタル社製）
で調製して播種した。培養は３７℃、１０％ＣＯ₂中で
３日間行った。

【００６２】（２）自己会合型アミロイドβ蛋白質の添
加 上記（１）で調製した初代培養細胞について、培養液を
無血清培地（０．５ｍＭ Ｌ-Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ／５
０μｇ／ｍｌ Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ライフテックオ
リエンタル社製）／Ｂ２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ラ
イフテックオリエンタル社製）／Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ
ｍｅｄｉｕｍ（ライフテックオリエンタル社製））に
交換した。培地交換後、３７℃、１０％ＣＯ₂中で３日
間さらに培養を行った。この培養細胞に対し、実施例１
の（４）で得られた分画前の自己会合型アミロイドβ蛋
白質含有液を最終アミロイドβ蛋白質濃度が５μＭとな
るように１ウェルの細胞外液に添加した。実施例１の
（５）で分画した自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液
はそれぞれ１０μｌ、１ウェルずつに添加した。またコ
ントロールとして、実施例１の（５）で自己会合型アミ
ロイドβ蛋白質含有液と同様に分画したＰＢＳ（−）／
Ｗａｔｅｒの各画分をそれぞれ１０μｌ、１ウェルずつ
に添加し、さらに全体のコントロールとして、ＰＢＳ
（−）／Ｗａｔｅｒ １０μｌを２ウェルに添加した。
添加後、ＭＴＴ活性測定に用いる場合は１６時間、三重
染色法による細胞死の検定に用いる場合は４０時間、３
７℃、１０％ＣＯ₂中で培養を行った。

【００６３】（３）ＭＴＴ活性測定 上記（２）で何も処理を行っていない１ウェルにＴｒｉ
ｔｏｎＸ-１００を最終濃度が０．１％となるように添
加し、３７℃、１０％ＣＯ₂中で１０分間培養した。こ
のようにして、分画前及び分画後の自己会合型アミロイ
ドβ蛋白質含有液を添加したウェル、コントロールのウ
ェル、及びＴｒｉｔｏｎＸ-１００を添加してウェル内
の培養細胞を死滅させたウェルについて、それぞれ培地
中に５０μｌの５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ（Sigma社製）／
ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃、１０％ＣＯ₂中で３時
間培養した。培養後、２０％ ＳＤＳ／５０％ ＤＭＦ
（dimethylformamide）／Ｈ₂Ｏ（ｐＨ３．５）を５０μ
ｌ添加して、さらに３７℃、１０％ＣＯ₂中で２時間静
置して細胞を完全に融解させた。この各ウェルの細胞融
解液について５７０ｎｍの吸光度を測定し、Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ-１００を加えて細胞を死滅させたウェルにおける
値をバックグラウンドとして他のウェルにおける値から
差し引いて、各試料の値とした。この値を用いて、コン
トロールのウェルの値から分画前及び分画後の自己会合
型アミロイドβ蛋白質含有液を添加したウェルの値をそ
れぞれ差し引き、さらにコントロールの値で除して１０
０を乗じて、各試料の細胞死活性（ＭＴＴ活性を阻害す
る活性）のコントロールに対する比率（％）として図１
に示した。

【００６４】（４）三重染色法による細胞死の検定 （Ｉ）培養細胞の染色及び固定 上記（２）で調製した培養細胞の培養液を吸引除去し、
ＰＢＳ（−）で洗浄したのち、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭの
最終濃度が１μｇ／ｍｌ、プロピディウムイオダイドの
最終濃度が５μｇ／ｍｌになるように無血清培地（０．
５ｍＭ Ｌ-Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ／５０μｇ／ｍｌ Ｇ
ｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ライフテックオリエンタル社製）
／Ｂ２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ライフテックオリエ
ンタル社製）／Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ
（ライフテックオリエンタル社製））中に混合したもの
を添加して、３７℃、１０％ＣＯ₂中で３０分間培養し
た。培養後Ｆｌｅｘｉｐｅｒｍを剥離したスライドガラ
スを１０％中性ホルマリン中に浸漬して、４℃で３０分
間処理して固定し、ＰＢＳ（−）で洗浄したのち、０．
５μｇ／ｍｌ Ｈ３３２５８（Molecular Probes社製）
を室温で５分間作用させて染色した。

【００６５】（II）蛍光画像の処理及び細胞死活性の解
析 上記（Ｉ）で調製した試料に、蛍光顕微鏡（オリンパス
社製）下で、注目する蛍光波長だけを取得できるように
バンドパスフィルターを設定して目的の蛍光色素にふさ
わしい励起レーザーを照射し、励起された蛍光をＣＣＤ
カメラで検出して画像を取り込み、画像データとして保
存した。各蛍光色素の励起波長はそれぞれ、Ｃａｌｃｅ
ｉｎ−ＡＭは４６０−４９０ｎｍ、プロピディウムイオ
ダイドは５１０−５５０ｎｍ、Ｈ３３２５８は３６４ｎ
ｍで行った。また、各蛍光色素についてそれぞれ画像デ
ータを保存したのち、ノマルスキー微分干渉画像を取り
込み、最後に各蛍光色素及びノマルスキー微分干渉画像
をすべて重ね合わせて画像を再構築した。蛍光の検出、
画像の取り込み、及び画像の解析はすべて「ＩＰＬａｂ
Ｓｐｅｃｔｒｕｍ」（日本ローパー社製）を用いて行
った。ランダムに４つの視野を選んで上記の画像処理を
行ったのち、得られた画像データについて、Ｈ３３２５
８で染色された全細胞数及びプロピディウムイオダイド
で染色された死細胞数を計数した。１つの試料につき計
数した全細胞数は平均でおよそ１０００〜１２００個程
度であった。得られた死細胞数を全細胞数で除して１０
０を乗じた値を細胞死活性（％）とし、図１に示した。
なお、「死細胞」はプロピディウムイオダイドで染色さ
れた細胞で核の分断や萎縮などのアポトーシス様変化を
呈した細胞とした。

【００６６】（５）分画前及び分画後の自己会合型アミ
ロイドβ蛋白質含有液の活性の比較 上記（３）及び（４）の結果を用いて、分画前の自己会
合型アミロイドβ蛋白質含有液の神経細胞死活性と、分
画後の自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液の神経細胞
死活性を比較し、それぞれ表１及び表２に示した。分画
後の画分としては、Ｆｒ０２及び沈殿画分を用いた。

【００６７】

【表１】自己会合型アミロイドβ蛋白質の神経細胞死活
性の比較（ＭＴＴ活性測定法による解析） 使用濃度（μg/ml） 細胞死活性（％） 比活性（unit/μg/ml） 分画前 ２２ ３２ １．５ Ｆｒ０２ ０．４５ ３０ ６７

【００６８】

【表２】自己会合型アミロイドβ蛋白質の神経細胞死活
性の比較（三重染色法による解析） 使用濃度（μg/ml） 細胞死活性（％） 比活性（unit/μg/ml） 分画前 ２２ １６ ０．７ 沈殿画分 １８ ２ ０．１ Ｆｒ０２ ０．４５ ２５ ５６

【００６９】表１及び表２から明らかなように、分画前
の自己会合型アミロイドβ蛋白質に対して、分画後の画
分（Ｆｒ０２）の比活性はＭＴＴ活性測定法による解析
では４０倍以上、三重染色法による解析では８０倍以上
に上昇していることが解り、分画によってより神経細胞
死活性の高い自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液を調
製できることが確認された。また、自己会合型アミロイ
ドβ蛋白質の神経細胞死活性は線維等が含まれる沈殿画
分よりも、粒径１４ｎｍ付近の粒状構造物を多く含有す
る画分（Ｆｒ０２）においてより高いことが確認でき
た。なお、使用濃度とは細胞外液中に加えた各自己会合
型アミロイドβ蛋白質の最終濃度であり、比活性の単位
中の「ｕｎｉｔ」とはＭＴＴ活性測定法による解析では
「１％のＭＴＴ活性を阻害する細胞死活性＝１ｕｎｉ
ｔ」、三重染色法による解析では「一定の視野あたり１
％の細胞死を起こす活性＝１ｕｎｉｔ」として定義し
た。

【００７０】

【発明の効果】本発明により、高い神経細胞死活性を有
する自己会合型アミロイドβ蛋白質が安定的に供給され
る。また、本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質を培
養神経系細胞、培養神経系器官又は動物脳等に作用させ
ることにより、患者生体内で見られる神経細胞死を簡便
かつ生体内環境に近い状態で再現することができ、この
系を用いて神経細胞死抑制作用を有する物質のスクリー
ニングを精度良く行うことができる。

【００７１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Chemical Corporation <120> Highly toxic amyloid β protein <130> J05920 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> PRT <213> Human <400> 1 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40 <210> 2 <211> 42 <212> PRT <213> Human <400> 2 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40

【００７２】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質につい
て、分画された各画分におけるアミロイドβ蛋白質回収
率、ＭＴＴ活性測定法によって求めた神経細胞死活性、
及び三重染色法によって求めた神経細胞死活性をそれぞ
れ示した図である。図中、「ＢＧ」はバックグラウン
ド、「Ｂ」は分画前の自己会合型アミロイドβ蛋白質、
「Ｐｔ」は沈殿画分を示す。「Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｎｕ
ｍｂｅｒ」は遠心管底部に近い画分から順にＦｒ０１〜
１２としてつけたフラクション番号である。

【図２】本発明の方法で分画された自己会合型アミロイ
ドβ蛋白質について、各フラクションの電子顕微鏡写真
である。写真中、「Ｐｔ」は沈殿画分を示す。

【図３】本発明の方法で分画された自己会合型アミロイ
ド蛋白質の、フラクション２（Ｆｒ０２）の粒度分布図
である。縦軸の「出現頻度」とは、ある一定の電子顕微
鏡の視野あたりに見られた粒状自己会合型アミロイドβ
蛋白質の個数である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｚ (72)発明者 佐藤 一紀 東京都町田市南大谷11号 株式会社三菱化 学生命科学研究所内 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB10 DA36 FB03 4B063 QA01 QA18 QQ61 QQ67 QQ79 QR48 QR66 QR77 QS36 QS39 QX02 4C084 AA17 NA14 ZA162 ZB212 4H045 AA10 AA20 AA30 BA19 EA21 EA50 FA34 GA05 GA15 GA25 HA03

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 粒状の形態を有し、蛋白質濃度１μｇ／
   ｍｌ以下で神経系細胞に細胞死を誘導する活性を有する
   ことを特徴とする、自己会合型アミロイドβ蛋白質。
2. 【請求項２】 粒径が１０〜２０ｎｍの範囲、又はグリ
   セロール密度勾配遠心法により分画したときに、グリセ
   ロール濃度が１５％以上の画分に得られる、請求項１に
   記載の自己会合型アミロイドβ蛋白質。
3. 【請求項３】 高い毒性を有する自己会合型アミロイド
   β蛋白質含有液の製造方法であって、アミロイドβ蛋白
   質を含む水溶液を対流させる工程及び対流させた水溶液
   中の自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液を分画する工
   程を含むことを特徴とする方法。
4. 【請求項４】 自己会合型アミロイドβ蛋白質の分画が
   グリセロール密度勾配遠心法により行われ、グリセロー
   ル濃度が１５％以上の画分に得られる自己会合型アミロ
   イドβ蛋白質を回収する工程を含む、請求項３に記載の
   方法。
5. 【請求項５】 請求項１又は２に記載の自己会合型アミ
   ロイドβ蛋白質を含む試薬。
6. 【請求項６】 請求項１又は２に記載の自己会合型アミ
   ロイドβ蛋白質を用いて、神経系細胞に細胞死を誘導す
   る方法。
7. 【請求項７】 神経細胞死抑制作用を有する薬剤のスク
   リーニング方法であって、下記の工程； （１）請求項１又は２に記載のアミロイドβ蛋白質及び
   被検物質の存在下で神経系細胞又は神経系器官を培養す
   る工程、又は請求項１又は２に記載のアミロイドβ蛋白
   質及び被検物質を動物に投与する工程、及び（２）上記
   神経系細胞、神経系器官又は動物の神経系細胞の細胞死
   が抑制された場合に、上記被検物質が神経細胞死に対し
   て抑制作用を有すると判定する工程を含む方法。
8. 【請求項８】 神経細胞死抑制作用を有する薬剤のスク
   リーニング方法であって、下記の工程； （１）アミロイドβ蛋白質及び被検物質を含む水溶液を
   対流させる工程、（２）水溶液中の自己会合型アミロイ
   ドβ蛋白質生成の有無又はその程度を解析する工程、及
   び（３）上記自己会合型アミロイドβ蛋白質の生成が抑
   制された場合に、上記被検物質が神経細胞死に対して抑
   制作用を有すると判定する工程を含む方法。
9. 【請求項９】 神経細胞死抑制作用を有する薬剤のスク
   リーニング方法であって、下記の工程； （１）アミロイドβ蛋白質を含む水溶液を対流させて生
   成した自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液に、被検物
   質を添加する工程、（２）上記自己会合型アミロイドβ
   蛋白質の存在の有無又は程度を解析する工程、及び
   （３）上記自己会合型アミロイドβ蛋白質が消失又は存
   在量が減少した場合に、上記被検物質が神経細胞死に対
   して抑制作用を有すると判定する工程を含む方法。
10. 【請求項１０】 請求項７〜９のいずれか一項に記載の
    方法により得られた、神経細胞死抑制作用を有する物
    質。
11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の物質を有効成分と
    して含む、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のた
    めの医薬。