JP2002193817A - 整腸剤 - Google Patents
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- lactobacillus helveticus
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- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
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- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ヒト等に投与することにより、排便回数を増加
させる等の効果をもたらし、腸内環境の改善に有用な整
腸剤の提供。 【解決手段】ラクトバチルス・ヘルベティカス菌種に属
する菌株の生菌体及び発酵物を含有する整腸剤。本菌株
は、胆汁酸耐性試験において、乾燥胆汁固形物による最
少生育阻止濃度０．８％以上、好ましくは１．３％以上
を示す菌株を好ましい。
させる等の効果をもたらし、腸内環境の改善に有用な整
腸剤の提供。 【解決手段】ラクトバチルス・ヘルベティカス菌種に属
する菌株の生菌体及び発酵物を含有する整腸剤。本菌株
は、胆汁酸耐性試験において、乾燥胆汁固形物による最
少生育阻止濃度０．８％以上、好ましくは１．３％以上
を示す菌株を好ましい。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ラクトバチルス・
ヘルベティカス生菌体を用いた整腸剤に関する。
ヘルベティカス生菌体を用いた整腸剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトや動物の腸管内には各種の微生物が
定着しており、微生物叢を形成していることが知られて
いる。このような微生物には宿主に対して有害な作用を
もたらす有害菌と呼ばれる微生物と、宿主に対して有益
な作用をもたらす有用菌がある。そして、これらの微生
物は共生または括抗関係を保っている。有害菌として
は、アンモニア、硫化水素、アミン等の有害産物を生産
し、これにより肝機能に過剰な負担をかけたり、発癌に
関連したりするもの等が挙げられ、具体的な菌種として
は例えばクロストリジウム属のもの等が挙げられる。
定着しており、微生物叢を形成していることが知られて
いる。このような微生物には宿主に対して有害な作用を
もたらす有害菌と呼ばれる微生物と、宿主に対して有益
な作用をもたらす有用菌がある。そして、これらの微生
物は共生または括抗関係を保っている。有害菌として
は、アンモニア、硫化水素、アミン等の有害産物を生産
し、これにより肝機能に過剰な負担をかけたり、発癌に
関連したりするもの等が挙げられ、具体的な菌種として
は例えばクロストリジウム属のもの等が挙げられる。
【０００３】腸内微生物叢の改善を通して宿主にもたら
す有益な効果として、下痢、便秘を中心とする消化器
症状の改善、免疫賦活を介しての癌予防、感染抵抗等
の向上、有害微生物代謝産物及び有害酵素の抑制等、
宿主が健康な生活を維持するために必要な、良好な腸内
環境をもたらすことにつながる各種の効果が挙げられ
る。そして、微生物叢を宿主の健康のために有効に利用
しようとするのが、いわゆるプロバイオティックスの考
え方である。
す有益な効果として、下痢、便秘を中心とする消化器
症状の改善、免疫賦活を介しての癌予防、感染抵抗等
の向上、有害微生物代謝産物及び有害酵素の抑制等、
宿主が健康な生活を維持するために必要な、良好な腸内
環境をもたらすことにつながる各種の効果が挙げられ
る。そして、微生物叢を宿主の健康のために有効に利用
しようとするのが、いわゆるプロバイオティックスの考
え方である。
【０００４】プロバイオティックスとは、腸内フローラ
の制御を通して、宿主に有益な影響をもたらす微生物及
び物質(Parker, R.B: An. Nutr. Health, 29, 4-8(197
4))、腸内フローラのバランスを改善することにより、
宿主に有益な作用をもたらす生きた微生物(Fullar, R.:
J. Appl. Bacteriol., 66, 365-378(1989))、単菌また
は混合培養菌で宿主の腸内フローラのバランスに関係す
る要因を改善することによって、宿主に有益な作用をも
たらすもの(Havenaar, R. and Huis in't Veld,J.H.J.:
A genral view, In The Lactic Acid Bacteria in Heal
th and Disease/Wood, B.J.B.ed., pp.151-170 (1992)
Elsevier, London)、生菌及びそれらの増殖促進物質
で、動物のみならず植物や食物の固有のフローラに有益
な影響をもたらすもの(Fullar, R.: Probiotics: Their
Development and Use, In Old Herborn University Se
miner Monograph 8/van der Waaij, D., Heidt, P.J. a
nd Rush, V.C. eds., pp.1-8 (1995) Institute for Mi
crobiology and Biochemistry,Herborn-Dill)などの定
義が提案されている(栄養学雑誌Vol.55 No.4 167〜177:
1997)が、いずれにせよ、いわゆるプロバイオティック
スと呼ばれるものは、いずれも整腸剤としての機能を有
する。
の制御を通して、宿主に有益な影響をもたらす微生物及
び物質(Parker, R.B: An. Nutr. Health, 29, 4-8(197
4))、腸内フローラのバランスを改善することにより、
宿主に有益な作用をもたらす生きた微生物(Fullar, R.:
J. Appl. Bacteriol., 66, 365-378(1989))、単菌また
は混合培養菌で宿主の腸内フローラのバランスに関係す
る要因を改善することによって、宿主に有益な作用をも
たらすもの(Havenaar, R. and Huis in't Veld,J.H.J.:
A genral view, In The Lactic Acid Bacteria in Heal
th and Disease/Wood, B.J.B.ed., pp.151-170 (1992)
Elsevier, London)、生菌及びそれらの増殖促進物質
で、動物のみならず植物や食物の固有のフローラに有益
な影響をもたらすもの(Fullar, R.: Probiotics: Their
Development and Use, In Old Herborn University Se
miner Monograph 8/van der Waaij, D., Heidt, P.J. a
nd Rush, V.C. eds., pp.1-8 (1995) Institute for Mi
crobiology and Biochemistry,Herborn-Dill)などの定
義が提案されている(栄養学雑誌Vol.55 No.4 167〜177:
1997)が、いずれにせよ、いわゆるプロバイオティック
スと呼ばれるものは、いずれも整腸剤としての機能を有
する。
【０００５】乳酸菌の中には、このようなプロバイオテ
ィックな性質を持つものがいくつか報告されている。具
体的には、ラクトバチルス・ブルガリカス、ストレプト
コッカス・サーモフィラス、ラクトバチルス・アシドフ
ィラス、各種ビフィズス菌、ラクトバチルス・カゼイ、
及びラクトバチルス・ガッセリの各菌種のある株が、プ
ロバイオティックな性質を有することが知られている。
より具体的には、ラクトバチルス・プランタラム299DSM
6595、ラクトバチルス・カゼイ SSPラムノサス271DSM6
594(特許第2742962号)、ラクトバチルス・アシドフィル
スPN-RI-2-4(特開平5-292947号公報)、ラクトバチルス
・アシドフィルスF-133(特許3052208号)、ビフィズス菌
BB536株、及びラクトバチルス・カゼイ シロタ株が、プ
ロバイオティックな性質を有することが知られている。
ィックな性質を持つものがいくつか報告されている。具
体的には、ラクトバチルス・ブルガリカス、ストレプト
コッカス・サーモフィラス、ラクトバチルス・アシドフ
ィラス、各種ビフィズス菌、ラクトバチルス・カゼイ、
及びラクトバチルス・ガッセリの各菌種のある株が、プ
ロバイオティックな性質を有することが知られている。
より具体的には、ラクトバチルス・プランタラム299DSM
6595、ラクトバチルス・カゼイ SSPラムノサス271DSM6
594(特許第2742962号)、ラクトバチルス・アシドフィル
スPN-RI-2-4(特開平5-292947号公報)、ラクトバチルス
・アシドフィルスF-133(特許3052208号)、ビフィズス菌
BB536株、及びラクトバチルス・カゼイ シロタ株が、プ
ロバイオティックな性質を有することが知られている。
【０００６】特に、ラクトバチルス属の乳酸菌について
は、現在、L.アシドフィラス、L.アジリス、L.アビアリ
ス、L.アミロボラス、L.ブレビス、 L.カゼイ、 L.クリ
スパタス、 L.デルブルッキ サブスピーシーズ ブル
ガリクス、 L.ガリナラム、 L.ガッセリ、 L.ジョンソ
ニ、 L.ムリヌス、 L.ハムステリ、 L.インテスティナ
リス、 L.プランタルム、L.ロイテリ、 L.ルミニス、
L.サリバリウスの18種の菌種が、プロバイオティックな
性質を有するとされている(Probiotics A Critical Rev
iew : Gerald W. Tannock(1997) p47)。
は、現在、L.アシドフィラス、L.アジリス、L.アビアリ
ス、L.アミロボラス、L.ブレビス、 L.カゼイ、 L.クリ
スパタス、 L.デルブルッキ サブスピーシーズ ブル
ガリクス、 L.ガリナラム、 L.ガッセリ、 L.ジョンソ
ニ、 L.ムリヌス、 L.ハムステリ、 L.インテスティナ
リス、 L.プランタルム、L.ロイテリ、 L.ルミニス、
L.サリバリウスの18種の菌種が、プロバイオティックな
性質を有するとされている(Probiotics A Critical Rev
iew : Gerald W. Tannock(1997) p47)。
【０００７】ところで、ラクトバチルス・ヘルベティカ
スは、タンパク質分解活性が高く、それゆえペプチド
生成能が高いラクトバチルス・ヘルベティカス発酵乳
には血圧降下作用が見られるなどの効果が報告されてい
る(特許第3028411号)。従って、ラクトバチルス・ヘル
ベティカスで乳を発酵させて得た菌体外産生物を、乳酸
酸度上昇が抑制された乳酸菌醗酵乳材料(特開平10-9901
8号公報)、インターフェロンの生産増強(特開昭57-1237
号公報)、脂質代謝改善剤(特開平10-229841号公報)など
に用いることが知られている。しかしながら、ラクトバ
チルス・ヘルベティカスを生きた菌体としてヒト等の宿
主に投与し、プロバイオティックな機能を有する整腸剤
として用いることについては知られていない。
スは、タンパク質分解活性が高く、それゆえペプチド
生成能が高いラクトバチルス・ヘルベティカス発酵乳
には血圧降下作用が見られるなどの効果が報告されてい
る(特許第3028411号)。従って、ラクトバチルス・ヘル
ベティカスで乳を発酵させて得た菌体外産生物を、乳酸
酸度上昇が抑制された乳酸菌醗酵乳材料(特開平10-9901
8号公報)、インターフェロンの生産増強(特開昭57-1237
号公報)、脂質代謝改善剤(特開平10-229841号公報)など
に用いることが知られている。しかしながら、ラクトバ
チルス・ヘルベティカスを生きた菌体としてヒト等の宿
主に投与し、プロバイオティックな機能を有する整腸剤
として用いることについては知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヒト
等に投与することにより、排便回数を増加させる等の効
果をもたらし、腸内環境の改善に有用な整腸剤を提供す
ることにある。
等に投与することにより、排便回数を増加させる等の効
果をもたらし、腸内環境の改善に有用な整腸剤を提供す
ることにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明によればラクトバ
チルス・ヘルベティカス菌種に属する菌株の生菌体を含
有する整腸剤が提供される。
チルス・ヘルベティカス菌種に属する菌株の生菌体を含
有する整腸剤が提供される。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明の整腸剤は、ラクトバチル
ス・ヘルベティカス菌種に属する菌株の生菌体を含有す
る。
ス・ヘルベティカス菌種に属する菌株の生菌体を含有す
る。
【００１１】前記ラクトバチルス・ヘルベティカス菌種
に属する菌株は、好ましくは、胆汁酸に対する耐性を有
する。具体的には、胆汁酸耐性試験において、乾燥胆汁
固形物による最少生育阻止濃度0.8%以上、好ましくは1.
3%以上を示す菌株を好ましく用いることができる。
に属する菌株は、好ましくは、胆汁酸に対する耐性を有
する。具体的には、胆汁酸耐性試験において、乾燥胆汁
固形物による最少生育阻止濃度0.8%以上、好ましくは1.
3%以上を示す菌株を好ましく用いることができる。
【００１２】前記乾燥胆汁固形物による最少生育阻止濃
度とは、前記菌株の生育を阻止しうる乾燥胆汁固形物の
最少濃度であり、具体的には例えば、前記ラクトバチル
ス・ヘルベティカス菌種に属する菌株が生育しうる液体
培地（例えばMRS培地）に、様々な濃度の乾燥胆汁固形
物（例えば0, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0%）
を添加したものにおいて、菌株を培養し、一定時間経過
後（例えば0, 4, 8, 12時間後）における濁度（例えば6
50nmにおいて）を吸光光度計等で測定することにより対
数増殖期における比増殖度（OD/時間)を求め、さらに胆
汁固形物濃度と比増殖度との関係から比増殖度がゼロに
なる胆汁固形物濃度を外挿して求めることにより測定す
ることができる。なお、前記乾燥胆汁固形物としては、
具体的には例えば、Bacto-oxgall（商品名、Difco社
製）等を用いることができる。
度とは、前記菌株の生育を阻止しうる乾燥胆汁固形物の
最少濃度であり、具体的には例えば、前記ラクトバチル
ス・ヘルベティカス菌種に属する菌株が生育しうる液体
培地（例えばMRS培地）に、様々な濃度の乾燥胆汁固形
物（例えば0, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0%）
を添加したものにおいて、菌株を培養し、一定時間経過
後（例えば0, 4, 8, 12時間後）における濁度（例えば6
50nmにおいて）を吸光光度計等で測定することにより対
数増殖期における比増殖度（OD/時間)を求め、さらに胆
汁固形物濃度と比増殖度との関係から比増殖度がゼロに
なる胆汁固形物濃度を外挿して求めることにより測定す
ることができる。なお、前記乾燥胆汁固形物としては、
具体的には例えば、Bacto-oxgall（商品名、Difco社
製）等を用いることができる。
【００１３】前記ラクトバチルス・ヘルベティカス菌種
に属する菌株は、好ましくは、前記菌株が腸管上皮細胞
接着試験において、底面積１．８ｃｍ2の円筒ウェル中
に単層培養したCaco-2細胞に２．８×１０6cells/ウェ
ル以上、好ましくは４．５×１０6cells/ウェル以上接
着する菌株である。
に属する菌株は、好ましくは、前記菌株が腸管上皮細胞
接着試験において、底面積１．８ｃｍ2の円筒ウェル中
に単層培養したCaco-2細胞に２．８×１０6cells/ウェ
ル以上、好ましくは４．５×１０6cells/ウェル以上接
着する菌株である。
【００１４】腸管上皮細胞に対する接着性は、具体的に
は例えば、GreeneとKlaenhammerの方法(Greene, J.D. a
nd Klaenhammer, T.R. Applied and Environmental Mic
robiology 60, 4487-4494 (1994))に準じて試験するこ
とができる。具体的には例えば底面積１．８ｃｍ2の円
筒形のウェルに細胞数１×１０5/mlのCaco-2細胞の培養
液1mlを入れ、単層となるまで培養したCaco-2細胞に対
して、ウェル当たり所定個数以上の細胞が接着する菌株
を、前記菌株として好ましく用いることができる。
は例えば、GreeneとKlaenhammerの方法(Greene, J.D. a
nd Klaenhammer, T.R. Applied and Environmental Mic
robiology 60, 4487-4494 (1994))に準じて試験するこ
とができる。具体的には例えば底面積１．８ｃｍ2の円
筒形のウェルに細胞数１×１０5/mlのCaco-2細胞の培養
液1mlを入れ、単層となるまで培養したCaco-2細胞に対
して、ウェル当たり所定個数以上の細胞が接着する菌株
を、前記菌株として好ましく用いることができる。
【００１５】前記ラクトバチルス・ヘルベティカス菌種
に属する菌株は、ヒトに1.0×1011cellsを投与した際
に、糞便中より4.0×107cells以上回収される菌株であ
ることが好ましい。
に属する菌株は、ヒトに1.0×1011cellsを投与した際
に、糞便中より4.0×107cells以上回収される菌株であ
ることが好ましい。
【００１６】前記菌株の糞便中における回収量の測定
は、例えば、前記菌株に定法に従ってリファンピシン耐
性等の抗生物質耐性を付与した後、ヒト被験者に投与
し、投与後の糞便を回収し、糞便中の菌数を抗生物質耐
性等を利用して観察することにより行うことができる。
または例えば、糞便中の前記菌株に由来する遺伝子を、
定法に従って検出することによっても測定することがで
きる。
は、例えば、前記菌株に定法に従ってリファンピシン耐
性等の抗生物質耐性を付与した後、ヒト被験者に投与
し、投与後の糞便を回収し、糞便中の菌数を抗生物質耐
性等を利用して観察することにより行うことができる。
または例えば、糞便中の前記菌株に由来する遺伝子を、
定法に従って検出することによっても測定することがで
きる。
【００１７】前記ラクトバチルス・ヘルベティカス菌種
に属する菌株としては、ラクトバチルス・ヘルベティカ
スCP53株(工業技術院生命工学工業技術研究所寄託番号:
FERMBP-5770)、等、種々の菌株が使用可能であるが、特
にラクトバチルス・ヘルベティカスCP53株を好ましく用
いることができる。
に属する菌株としては、ラクトバチルス・ヘルベティカ
スCP53株(工業技術院生命工学工業技術研究所寄託番号:
FERMBP-5770)、等、種々の菌株が使用可能であるが、特
にラクトバチルス・ヘルベティカスCP53株を好ましく用
いることができる。
【００１８】本発明の整腸剤の剤型は、特に限定されな
いが、粉末状、顆粒状、錠剤等の固体；及びペースト
状、ゲル状、液状等の流体のいずれであってもよい。
いが、粉末状、顆粒状、錠剤等の固体；及びペースト
状、ゲル状、液状等の流体のいずれであってもよい。
【００１９】本発明の整腸剤における前記菌株の生菌体
の含有量は、特に限定されないが、１回の投与で生菌体
を1.0×1011個以上摂取できる量とすることが好まし
い。具体的には例えば、1.0×106個／ｇ〜1.0×1011個
／ｇ、好ましくは1.0×108個／ｇ〜1.0×1011個／ｇと
することができる。
の含有量は、特に限定されないが、１回の投与で生菌体
を1.0×1011個以上摂取できる量とすることが好まし
い。具体的には例えば、1.0×106個／ｇ〜1.0×1011個
／ｇ、好ましくは1.0×108個／ｇ〜1.0×1011個／ｇと
することができる。
【００２０】本発明の整腸剤の製造方法は、特に限定さ
れないが、獣乳を、ラクトバチルス・ヘルベティカスに
属する菌株により発酵させ、ラクトバチルス・ヘルベテ
ィカスに属する菌株の生菌体を得ることにより製造する
ことができる。具体的には例えば、前記発酵により得た
発酵物をそのまま、又は他の添加剤、食品素材等と配合
して、さらに必要に応じて粉末状、顆粒状、錠剤等の剤
型に加工して、本発明の整腸剤として利用することがで
きる。また、前記発酵又は他の方法により培養したラク
トバチルス・ヘルベティカスの生菌体を培地から回収
し、それをそのまま、又は他の添加剤、食品素材等と配
合して、さらに必要に応じて粉末状、顆粒状、錠剤等の
剤型に加工して、本発明の整腸剤として利用することが
できる。
れないが、獣乳を、ラクトバチルス・ヘルベティカスに
属する菌株により発酵させ、ラクトバチルス・ヘルベテ
ィカスに属する菌株の生菌体を得ることにより製造する
ことができる。具体的には例えば、前記発酵により得た
発酵物をそのまま、又は他の添加剤、食品素材等と配合
して、さらに必要に応じて粉末状、顆粒状、錠剤等の剤
型に加工して、本発明の整腸剤として利用することがで
きる。また、前記発酵又は他の方法により培養したラク
トバチルス・ヘルベティカスの生菌体を培地から回収
し、それをそのまま、又は他の添加剤、食品素材等と配
合して、さらに必要に応じて粉末状、顆粒状、錠剤等の
剤型に加工して、本発明の整腸剤として利用することが
できる。
【００２１】本発明の整腸剤の投与対象は、特に限定さ
れないが、ヒト及びその他の動物に投与することができ
る。
れないが、ヒト及びその他の動物に投与することができ
る。
【００２２】本発明の整腸剤の投与量は、例えばヒトに
対して投与する場合、生菌体の個数として１日あたり1.
0×1011個以上とすることができる。投与は、単回投与
でもよく、複数回投与してもよい。
対して投与する場合、生菌体の個数として１日あたり1.
0×1011個以上とすることができる。投与は、単回投与
でもよく、複数回投与してもよい。
【００２３】本発明の整腸剤は、ヒトに投与した場合、
排便回数増加又は排便量の増加等の示す整腸作用をもた
らすことができる。
排便回数増加又は排便量の増加等の示す整腸作用をもた
らすことができる。
【００２４】
【発明の効果】本発明の整腸剤は、ヒト等に投与するこ
とにより、排便回数を増加させる等の効果をもたらし、
腸内環境の改善に有用である。
とにより、排便回数を増加させる等の効果をもたらし、
腸内環境の改善に有用である。
【００２５】
【実施例】以下、本発明を実施例を参照してより詳細に
説明するが、本発明はこれらに限定されない。
説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００２６】なお、以下の実施例において、Caco-2細胞
に対する接着性は、以下の通り試験した。Caco-2細胞に対する接着性試験 Caco-2への接着活性の測定は、GreeneとKlaenhammerの
方法に準じて行った。American Type Culture Collecti
onから入手したCaco-2細胞(HTB-37)を、55℃30分間加熱
により不活性化した仔牛血清(Gibco Bethesda Research
Laboratory)を5%添加したMEM培地(Gibco BRL)で、5%CO
2インキュベーターにおいて37℃で培養した。細胞数を
１×105/mlとした培養液1mlを24ウェルの培養プレート
(住友ベークライト社製、商品名MS-80240)に移し、48時
間ごとに培地交換を行い単層となるまで培養した。20%
グルタルアルデヒド(和光純薬)を0.1ml添加し、細胞を
培養プレートに固定した。プレートを室温に30分静置し
た後、PBSで2回洗浄し、アイソトープラベルした試験対
象の菌体の菌液0.5ml(1×109cells)を添加した。37°C
で1時間培養後、3回洗浄により遊離の菌体を除去した。
200μlの1%SDS、1N NaOHを添加し30分間放置後、ウェル
よりCaco-2細胞と菌体の混合物を回収し、シンチレータ
ーカクテル(Scintisol EX-H,和光純薬)に懸濁して、液
体シンチレーションカウンターLSC-900(アロカ)により
放射活性を測定した。接着した菌体の菌数はあらかじめ
計数した菌体の比放射能に基づいて計算した。測定は二
回行い、平均を測定結果とした。
に対する接着性は、以下の通り試験した。Caco-2細胞に対する接着性試験 Caco-2への接着活性の測定は、GreeneとKlaenhammerの
方法に準じて行った。American Type Culture Collecti
onから入手したCaco-2細胞(HTB-37)を、55℃30分間加熱
により不活性化した仔牛血清(Gibco Bethesda Research
Laboratory)を5%添加したMEM培地(Gibco BRL)で、5%CO
2インキュベーターにおいて37℃で培養した。細胞数を
１×105/mlとした培養液1mlを24ウェルの培養プレート
(住友ベークライト社製、商品名MS-80240)に移し、48時
間ごとに培地交換を行い単層となるまで培養した。20%
グルタルアルデヒド(和光純薬)を0.1ml添加し、細胞を
培養プレートに固定した。プレートを室温に30分静置し
た後、PBSで2回洗浄し、アイソトープラベルした試験対
象の菌体の菌液0.5ml(1×109cells)を添加した。37°C
で1時間培養後、3回洗浄により遊離の菌体を除去した。
200μlの1%SDS、1N NaOHを添加し30分間放置後、ウェル
よりCaco-2細胞と菌体の混合物を回収し、シンチレータ
ーカクテル(Scintisol EX-H,和光純薬)に懸濁して、液
体シンチレーションカウンターLSC-900(アロカ)により
放射活性を測定した。接着した菌体の菌数はあらかじめ
計数した菌体の比放射能に基づいて計算した。測定は二
回行い、平均を測定結果とした。
【００２７】
【実施例１】L.ヘルベティカスCP53株 ラクトバチルス・ヘルベティカスCP53株は、菌体内にプ
ラスミドDNAであるpCP53を持つことが知られている(Yam
amoto, N. and Takano, T.: Biosci. Biotech.Bioche
m., 60 (12), 2069-2070 (1996))。ラクトバチルス・ヘ
ルベティカスCP53株を、種々の濃度の粉末胆汁固形物(B
acto-oxgall (Difco))を含むMRS培地で培養し、最少生
育阻止濃度を測定したところ、1.31%であった。また、C
aco-2細胞に対する接着性を試験したところ、4.5×106c
ells/ウェル以上接着することが確認された。リファンピシン耐性の付与 摂食試験の際糞便より分離回収するため、CP53株に、定
法に従って抗生物質リファンピシンに対する耐性を付与
した。100μg/mlの濃度でリファンピシンを添加したMRS
平板培地にCP53株を塗り広げ、37°Cで2日間培養した。
この平板培地で生育するリファンピシン耐性株をCP53-R
株として選択した。CP53-R株の性質 CP53-R株を、リファンピシンを含まないMRS培地で７代
継代培養した。この継代培養株を、種々の濃度の粉末胆
汁固形物を含むMRS培地で培養し、最少生育阻止濃度を
測定したところ、0.86％であった。また、Caco-2細胞に
対する接着性を試験したところ、2.8×106cells/ウェル
以上の接着性が確認された。さらに、この継代培養株
は、プラスミドpCP53を保有していることも確認され
た。ボランティアによる摂食回収試験 MRS培地(Difco)で培養したCP53-R株を遠心分離により集
菌し、PBSによって二回洗浄したのち、1×1011cell/100
mlとなるように牛乳に懸濁した。このCP53-R株を懸濁し
た牛乳を、摂食回収試験の摂食試料とした。摂食回収試
験は25歳から41歳の7人の健康な被験者に100mlの前記摂
食試料を単回飲用させ、その後5日間に排便された糞便
をすべて回収することで行なった。前記摂食試料の摂取
後の各被験者の排便回数、排便量及び便の硬さを記録し
た。結果を表１に示す。回収された糞便は直ちに4°Cに
冷蔵し、翌日には、それぞれの分析を以下に記載する通
り行なった。L.ヘルベティカスの生残性 リファンピシンを含むMRS平板培地を用い、糞便試料中
に含まれる生菌数であってリファンピシン耐性を有する
ものの菌数を計数し、回収された全ての糞便に含まれる
菌数を求めた。その結果、被験者１人あたりの回収菌数
の平均は1.2×108細胞であった。なお、リファンピシン
を含むMRS平板培地に生育した菌はすべてプラスミドpCP
53を保持していることを確認し、CP53-R株であることを
確認した。L.ヘルベティカスの腸内増殖 CP53株菌体をPBSで二回洗浄したのち、10mg/mlリゾチー
ム(生化学工業)と1mg/mlのムタノリシン(生化学工業)を
用いたアルカリ溶菌法に供し、pCP53プラスミドDNAを調
製した。これをCsCl密度勾配による超高速遠心分離で精
製し、[α-32P]dCTP(222TBq/mmol,NEW Life Products I
nc.)を用いてRandom Promer DNA Labeling Kit ver 2.0
(宝酒造)により、ラジオアイソトープラベルを行い、32
Pで放射標識したpCP53プラスミドDNAを得た。
ラスミドDNAであるpCP53を持つことが知られている(Yam
amoto, N. and Takano, T.: Biosci. Biotech.Bioche
m., 60 (12), 2069-2070 (1996))。ラクトバチルス・ヘ
ルベティカスCP53株を、種々の濃度の粉末胆汁固形物(B
acto-oxgall (Difco))を含むMRS培地で培養し、最少生
育阻止濃度を測定したところ、1.31%であった。また、C
aco-2細胞に対する接着性を試験したところ、4.5×106c
ells/ウェル以上接着することが確認された。リファンピシン耐性の付与 摂食試験の際糞便より分離回収するため、CP53株に、定
法に従って抗生物質リファンピシンに対する耐性を付与
した。100μg/mlの濃度でリファンピシンを添加したMRS
平板培地にCP53株を塗り広げ、37°Cで2日間培養した。
この平板培地で生育するリファンピシン耐性株をCP53-R
株として選択した。CP53-R株の性質 CP53-R株を、リファンピシンを含まないMRS培地で７代
継代培養した。この継代培養株を、種々の濃度の粉末胆
汁固形物を含むMRS培地で培養し、最少生育阻止濃度を
測定したところ、0.86％であった。また、Caco-2細胞に
対する接着性を試験したところ、2.8×106cells/ウェル
以上の接着性が確認された。さらに、この継代培養株
は、プラスミドpCP53を保有していることも確認され
た。ボランティアによる摂食回収試験 MRS培地(Difco)で培養したCP53-R株を遠心分離により集
菌し、PBSによって二回洗浄したのち、1×1011cell/100
mlとなるように牛乳に懸濁した。このCP53-R株を懸濁し
た牛乳を、摂食回収試験の摂食試料とした。摂食回収試
験は25歳から41歳の7人の健康な被験者に100mlの前記摂
食試料を単回飲用させ、その後5日間に排便された糞便
をすべて回収することで行なった。前記摂食試料の摂取
後の各被験者の排便回数、排便量及び便の硬さを記録し
た。結果を表１に示す。回収された糞便は直ちに4°Cに
冷蔵し、翌日には、それぞれの分析を以下に記載する通
り行なった。L.ヘルベティカスの生残性 リファンピシンを含むMRS平板培地を用い、糞便試料中
に含まれる生菌数であってリファンピシン耐性を有する
ものの菌数を計数し、回収された全ての糞便に含まれる
菌数を求めた。その結果、被験者１人あたりの回収菌数
の平均は1.2×108細胞であった。なお、リファンピシン
を含むMRS平板培地に生育した菌はすべてプラスミドpCP
53を保持していることを確認し、CP53-R株であることを
確認した。L.ヘルベティカスの腸内増殖 CP53株菌体をPBSで二回洗浄したのち、10mg/mlリゾチー
ム(生化学工業)と1mg/mlのムタノリシン(生化学工業)を
用いたアルカリ溶菌法に供し、pCP53プラスミドDNAを調
製した。これをCsCl密度勾配による超高速遠心分離で精
製し、[α-32P]dCTP(222TBq/mmol,NEW Life Products I
nc.)を用いてRandom Promer DNA Labeling Kit ver 2.0
(宝酒造)により、ラジオアイソトープラベルを行い、32
Pで放射標識したpCP53プラスミドDNAを得た。
【００２８】15mlの遠心チューブに5mlの30%ショ糖溶
液、2mlの20%ショ糖溶液、2mlの10%ショ糖溶液を静かに
重層し、不連続ショ糖密度勾配液を得た。この不連続シ
ョ糖密度勾配の上に、前記の被験者から回収した糞便試
料を蒸留水で20倍(w/w)に懸濁した懸濁液0.5mlを重層し
た。これを1,500×gで5分間遠心分離し、10%と20%ショ
糖画分を回収し、滅菌水により二回洗浄の上、Leenhout
sらの方法(Leenhouts, K.J., Kok, J., and Venema, G.
(1990) Appl. Environ. Microbiol., 56, 2726-2735)
によりDNA画分を調製した。得られたDNA画分を10mM Tri
sCl pH8.0, 1mM EDTAに溶解し、さらに同じ緩衝液で10
倍と100倍の希釈物も調製した。このDNA画分を3分間加
熱した後、10μlずつナイロンメンブレン(Hybond-N+, A
mersham Phermacia Biotech)にドットブロットした。ブ
ロットしたナイロンメンブレンは蒸留水で洗浄した後、
乾燥させてDNAを固定した。
液、2mlの20%ショ糖溶液、2mlの10%ショ糖溶液を静かに
重層し、不連続ショ糖密度勾配液を得た。この不連続シ
ョ糖密度勾配の上に、前記の被験者から回収した糞便試
料を蒸留水で20倍(w/w)に懸濁した懸濁液0.5mlを重層し
た。これを1,500×gで5分間遠心分離し、10%と20%ショ
糖画分を回収し、滅菌水により二回洗浄の上、Leenhout
sらの方法(Leenhouts, K.J., Kok, J., and Venema, G.
(1990) Appl. Environ. Microbiol., 56, 2726-2735)
によりDNA画分を調製した。得られたDNA画分を10mM Tri
sCl pH8.0, 1mM EDTAに溶解し、さらに同じ緩衝液で10
倍と100倍の希釈物も調製した。このDNA画分を3分間加
熱した後、10μlずつナイロンメンブレン(Hybond-N+, A
mersham Phermacia Biotech)にドットブロットした。ブ
ロットしたナイロンメンブレンは蒸留水で洗浄した後、
乾燥させてDNAを固定した。
【００２９】このメンブレン上の固定したDNAに、Mania
tisらの方法(Maniatis, T., Frish,E.F. and Sambrook,
J. (1987) Molecular cloning; a laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbo
r)に従い、前述の放射標識したpCP53プラスミドDNAをハ
イブリダイゼーションさせた。この時、非特異的なハイ
ブリダイゼーションを抑制するために、ホルムアミドと
別途調製したCP53株を含まない糞便中の細菌類染色体DN
Aをそれぞれ50%(W/W)と10μg/mlとなるように添加し
た。
tisらの方法(Maniatis, T., Frish,E.F. and Sambrook,
J. (1987) Molecular cloning; a laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbo
r)に従い、前述の放射標識したpCP53プラスミドDNAをハ
イブリダイゼーションさせた。この時、非特異的なハイ
ブリダイゼーションを抑制するために、ホルムアミドと
別途調製したCP53株を含まない糞便中の細菌類染色体DN
Aをそれぞれ50%(W/W)と10μg/mlとなるように添加し
た。
【００３０】pCP53プラスミドDNAの定量のために、ハイ
ブリダイゼーション後のメンブレンをオートラジオグラ
フイにかけ、各サンプルドット部分(0.5×0.5mm)を切り
抜いて液体シンチレーションカウンタLSC-900(アロカ)
により放射活性を測定した。
ブリダイゼーション後のメンブレンをオートラジオグラ
フイにかけ、各サンプルドット部分(0.5×0.5mm)を切り
抜いて液体シンチレーションカウンタLSC-900(アロカ)
により放射活性を測定した。
【００３１】別途、検量線を作成するために8.5×103か
ら2.0×105cellsの範囲でCP53株菌体を糞便に混合し、
これを糞便試料として前述の方法でDNA画分を調製し、
ドットブロットし、放射標識したpCP53プラスミドDNAと
反応させた。結合した放射能は糞便中に混合したCP53株
菌数に8.5×103から2.0×105cells/g(糞便重量)の範囲
で直線的に比例しており、検量線を得ることができた。
この検量線を用いて摂食回収試験被験者の糞便試料中の
CP53株菌数測定を1×104から2.0×105cells/g(糞便重
量)の範囲で決定した。
ら2.0×105cellsの範囲でCP53株菌体を糞便に混合し、
これを糞便試料として前述の方法でDNA画分を調製し、
ドットブロットし、放射標識したpCP53プラスミドDNAと
反応させた。結合した放射能は糞便中に混合したCP53株
菌数に8.5×103から2.0×105cells/g(糞便重量)の範囲
で直線的に比例しており、検量線を得ることができた。
この検量線を用いて摂食回収試験被験者の糞便試料中の
CP53株菌数測定を1×104から2.0×105cells/g(糞便重
量)の範囲で決定した。
【００３２】その結果、７人の被験者から回収した糞便
試料の全てにおいてCP53株が検出された。各被験者にお
ける総糞便試料中の総CP53株菌数は、それぞれ、4.0×1
09、1.0×109、3.0×109、1.0×109、1.0×109、4.0×1
07、及び4.0×108 cellsであった。さらに、各被験者に
おいて、前記摂食試料の摂取後１回目、２回目、及び３
回目の排便における糞便試料の全てにおいてCP53株が検
出され、さらに３回目以降の排便における糞便試料にお
けるCP53株の菌数が、１回目、２回目の排便における糞
便試料中より多かった。このことから、CP53株は糞便中
では生育が困難であっても消化管においては生育が可能
であり、消化管内で増殖していると考えられる。
試料の全てにおいてCP53株が検出された。各被験者にお
ける総糞便試料中の総CP53株菌数は、それぞれ、4.0×1
09、1.0×109、3.0×109、1.0×109、1.0×109、4.0×1
07、及び4.0×108 cellsであった。さらに、各被験者に
おいて、前記摂食試料の摂取後１回目、２回目、及び３
回目の排便における糞便試料の全てにおいてCP53株が検
出され、さらに３回目以降の排便における糞便試料にお
けるCP53株の菌数が、１回目、２回目の排便における糞
便試料中より多かった。このことから、CP53株は糞便中
では生育が困難であっても消化管においては生育が可能
であり、消化管内で増殖していると考えられる。
【００３３】なお、CP53-R生菌体を摂取していない被験
者の糞便を糞便試料として用いて同様に調製したDNA画
分と、精製したpCP53プラスミドDNAとを、同様にドット
ブロットし、放射標識したpCP53プラスミドDNAと反応さ
せたところ、放射標識pCP53プラスミドDNAは、精製した
pCP53プラスミドDNAとは強く反応したが、CP53-R生菌体
を摂取していない被験者の糞便試料由来のDNA画分とは
全く反応しなかった。
者の糞便を糞便試料として用いて同様に調製したDNA画
分と、精製したpCP53プラスミドDNAとを、同様にドット
ブロットし、放射標識したpCP53プラスミドDNAと反応さ
せたところ、放射標識pCP53プラスミドDNAは、精製した
pCP53プラスミドDNAとは強く反応したが、CP53-R生菌体
を摂取していない被験者の糞便試料由来のDNA画分とは
全く反応しなかった。
【００３４】
【比較例１】摂食試料として、実施例１において調製し
た摂食試料を加熱殺菌したものを被験者に飲用させた他
は、実施例１と同様に操作し、各被験者の排便回数、排
便量及び便の硬さを記録した。結果を表１に示す。
た摂食試料を加熱殺菌したものを被験者に飲用させた他
は、実施例１と同様に操作し、各被験者の排便回数、排
便量及び便の硬さを記録した。結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
【００３６】*：比較例１に対して傾向あり(p＜0.1、Wi
lcoxonの符号付順位検定) a)：１；硬い、２；普通、３；柔らかいの３段階で評価
し、平均を求めた。
lcoxonの符号付順位検定) a)：１；硬い、２；普通、３；柔らかいの３段階で評価
し、平均を求めた。
【００３７】
【処方例１】脱脂粉乳（よつば乳業（株）社製）１．４
８５ｋｇを精製水８．４１５ｋｇで還元し、９５℃で３
０分間加熱殺菌した後に、速やかに３２℃まで冷却し
た。得られた殺菌済み還元脱脂乳にラクトバチルス・ヘ
ルベティカスCP53株のバルクスターター０．１ｋｇを無
菌的に添加し、良く撹拌した後に３２℃で１６〜２０時
間発酵した。発酵は、発酵乳の酸度（乳酸の重量％）が
１．５〜２．１の範囲にあることを確認して終了した。
発酵乳を、発酵終了後１０℃以下に速やかに冷却するこ
とにより、原料用発酵乳１０ｋｇを得た。この時、CP５
３株の生菌数は、少なくとも１ｇあたり１５億個に達し
ていた。
８５ｋｇを精製水８．４１５ｋｇで還元し、９５℃で３
０分間加熱殺菌した後に、速やかに３２℃まで冷却し
た。得られた殺菌済み還元脱脂乳にラクトバチルス・ヘ
ルベティカスCP53株のバルクスターター０．１ｋｇを無
菌的に添加し、良く撹拌した後に３２℃で１６〜２０時
間発酵した。発酵は、発酵乳の酸度（乳酸の重量％）が
１．５〜２．１の範囲にあることを確認して終了した。
発酵乳を、発酵終了後１０℃以下に速やかに冷却するこ
とにより、原料用発酵乳１０ｋｇを得た。この時、CP５
３株の生菌数は、少なくとも１ｇあたり１５億個に達し
ていた。
【００３８】別途にグラニュ糖０．８ｋｇとペクチンYM
115-H（コペンハーゲンペクチン製）０．０３ｋｇを粉
粉混合し、７０℃に加温した精製水４．１７ｋｇに溶解
した。さらにこの溶液に９５°数秒の殺菌を施した後、
速やかに１０℃以下に冷却して殺菌済み糖・安定剤溶液
５ｋｇを得た。
115-H（コペンハーゲンペクチン製）０．０３ｋｇを粉
粉混合し、７０℃に加温した精製水４．１７ｋｇに溶解
した。さらにこの溶液に９５°数秒の殺菌を施した後、
速やかに１０℃以下に冷却して殺菌済み糖・安定剤溶液
５ｋｇを得た。
【００３９】殺菌済み糖・安定剤溶液５ｋｇに対し原料
用発酵乳５ｋｇを無菌的に加え、ラボラトリーホモゲナ
イザー（形式：15M-8BA、APVゴーリン社製）を用いて、
均質化圧１５MPa、処理流量２．５L／分で、無菌的に均
質化することにより、乳製品乳酸菌飲料現役１０ｋｇを
得た。得られた乳製品乳酸菌飲料原液を２００ｇ容ポリ
スチレンボトルに無菌的に充填し、ポリエチレンアルミ
ラミネートフィルムをヒートシールして、品質保持期間
が要冷蔵（１０℃以下）で１４日間の、乳製品乳酸菌飲
料製品とした。
用発酵乳５ｋｇを無菌的に加え、ラボラトリーホモゲナ
イザー（形式：15M-8BA、APVゴーリン社製）を用いて、
均質化圧１５MPa、処理流量２．５L／分で、無菌的に均
質化することにより、乳製品乳酸菌飲料現役１０ｋｇを
得た。得られた乳製品乳酸菌飲料原液を２００ｇ容ポリ
スチレンボトルに無菌的に充填し、ポリエチレンアルミ
ラミネートフィルムをヒートシールして、品質保持期間
が要冷蔵（１０℃以下）で１４日間の、乳製品乳酸菌飲
料製品とした。
【００４０】得られた製品は、１ｇあたり少なくとも
７．５億個のCP53株を含有し、１０℃以下で保存した場
合、製造後１４日目でも１ｇあたり５億個の生菌数を維
持することができた。従って、本製品２００ｇを飲用し
た場合、１０００億個以上のCP５３株の生菌を摂取する
ことができる。
７．５億個のCP53株を含有し、１０℃以下で保存した場
合、製造後１４日目でも１ｇあたり５億個の生菌数を維
持することができた。従って、本製品２００ｇを飲用し
た場合、１０００億個以上のCP５３株の生菌を摂取する
ことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:225） Ｃ１２Ｒ 1:225） (72)発明者 金子 京子 神奈川県相模原市淵野辺５−11−10 カル ピス株式会社基盤技術研究所内 (72)発明者 池田 なぎさ 神奈川県相模原市淵野辺５−11−10 カル ピス株式会社商品開発研究所内 (72)発明者 石田 優 神奈川県相模原市淵野辺５−11−10 カル ピス株式会社基盤技術研究所内 (72)発明者 楠田 大輔 神奈川県相模原市淵野辺５−11−10 カル ピス株式会社基盤技術研究所内 (72)発明者 篠田 直 神奈川県相模原市淵野辺５−11−10 カル ピス株式会社基盤技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B001 AC02 AC03 AC06 AC31 BC14 EC05 4B065 AA30X BB24 BD36 BD38 CA44 4C087 AA01 AA02 BC56 MA01 NA05 ZA73
Claims (6)
- 【請求項１】 ラクトバチルス・ヘルベティカス菌種に
属する菌株の生菌体を含有する整腸剤。 - 【請求項２】 前記菌株が、胆汁酸耐性試験において、
乾燥胆汁固形物による最少生育阻止濃度0.8%以上を示す
菌株である請求項１の整腸剤。 - 【請求項３】 前記菌株が腸管上皮細胞接着試験におい
て、底面積１．８ｃｍ2の円筒ウェル中に単層培養したC
aco-2細胞に２．８×１０6cells/ウェル以上接着する菌
株である請求項１又は２記載の整腸剤。 - 【請求項４】 前記菌株が、ヒトに1.0×1011cellsを投
与した際に、糞便中より4.0×107cells以上回収される
菌株である請求項１〜３のいずれか１項記載の整腸剤。 - 【請求項５】 前記菌株が、ラクトバチルス・ヘルベテ
ィカスCP53株(工業技術院生命工学工業技術研究所寄託
番号FERM BP-5770)である請求項１〜４のいずれか１項
記載の整腸剤。 - 【請求項６】 獣乳の、ラクトバチルス・ヘルベティカ
ス菌種に属する菌株による発酵物を含む、請求項１〜５
のいずれか１項記載の整腸剤。
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000401035A JP2002193817A (ja) | 2000-12-28 | 2000-12-28 | 整腸剤 |
| CNB018229247A CN1269489C (zh) | 2000-12-28 | 2001-12-25 | 整肠剂 |
| KR1020037008681A KR100845238B1 (ko) | 2000-12-28 | 2001-12-25 | 정장제 |
| US10/250,382 US7029670B2 (en) | 2000-12-28 | 2001-12-25 | Medicines for relieving intestinal disorders |
| PCT/JP2001/011347 WO2002053163A1 (en) | 2000-12-28 | 2001-12-25 | Medicines for relieving intestinal disorders |
| EP01994994A EP1354592B1 (en) | 2000-12-28 | 2001-12-25 | Medicines for relieving intestinal disorders |
| BR0116636-0A BR0116636A (pt) | 2000-12-28 | 2001-12-25 | Remédios para alìvio de distúrbios intestinais |
| AT01994994T ATE399015T1 (de) | 2000-12-28 | 2001-12-25 | Arzneimittel zur linderung von darmerkrankungen |
| ES01994994T ES2305132T3 (es) | 2000-12-28 | 2001-12-25 | Medicamentos para aliviar trastornos intestinales. |
| DE60134576T DE60134576D1 (de) | 2000-12-28 | 2001-12-25 | Arzneimittel zur linderung von darmerkrankungen |
| TW090132929A TWI285109B (en) | 2000-12-28 | 2001-12-28 | Medicines for relieving intestinal disorders |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000401035A JP2002193817A (ja) | 2000-12-28 | 2000-12-28 | 整腸剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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