JP2002165589A - 原虫生産性培養細胞株、その作製法および抗原性物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 エンセファリトゾーン症動物の生前診断のた
めの抗原性物質を提供する。 【構成】 本発明は、ウサギ由来エンセファリトゾーン
・クニクリが寄生増殖するＲＫ−１３培養細胞株、この
培養細胞株を作製する方法、生産された原虫胞子を処理
することによって得られた抗原、胞子抗原を不溶性担体
に吸着してなる免疫測定試薬である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、原虫エンセファリ
トゾーンを永続的、多産的に生産する培養細胞株、この
寄生細胞株を作製する方法、寄生細胞株で得られた原虫
胞子を処理して得られた抗原およびこの原虫胞子の抗原
からなる免疫測定試薬に関するものである。

【０００２】エンセファリトゾーンは、各種動物に種を
越え広く感染する原虫である。ヒトでは、新しい病原体
として１９９３年に発見されている〔世界保健報告１９
９６年（Ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｐｏ
ｒｔ １９９６）、世界保健機関（１９９６年）〕。こ
の原虫が特に問題となるのは、マウス、ラット、モルモ
ット、ウサギ、イヌであり、実験動物が不顕性に感染し
ている場合、種々の目的で行われる動物実験研究の成績
に重大な影響を与えることから、エンセファリトゾーン
完全フリー動物の供給が求められている。

【０００３】また、ペットの場合、不顕性感染ペットの
供給はヒトへの感染源となり易いことから、小売り前の
健康診断が望まれている。特に、ウサギは感受性が非常
に高く神経症状、腎障害を起こし易いことから、エンセ
ファリトゾーン症検査が獣医療領域において求められて
いる。

【０００４】

【従来の技術】従来の検査法は、感染動物の場合は弊死
後あるいは安楽死後の検体についての病理組織検査法が
最も信頼できる方法であるが、疾病が起こったときの原
因特定にのみ有用である。そこで、生前診断には免疫血
清検査が考えられるが、検査には診断用抗原の原材料に
なるエンセファリトゾーン原虫を必要とする。そのため
の最も安易な方法は実験動物を利用した原虫生産である
が、本原虫は尿中に最終発育体である胞子の形で放出さ
れるため感染実験中の汚染が常に懸念されることから他
の飼育動物からの隔離が問題点となることや、胞子は熱
や薬物あるいは化学的処理に強抵抗性であり通常の消毒
では不活化しないことから実験後の室内洗浄や薫蒸が問
題点となる。

【０００５】また、特殊安全動物実験施設を完備し、動
物による原虫生産が可能であっても病原体と動物を同時
に扱える熟練した技術者を必要とするし、抗原の分離精
製過程で免疫血清検査に影響が強い動物由来の多量の夾
雑物を取り除くことが難しいなどの問題点もある。

【０００６】上記の問題を解決するためには、動物感染
実験に依存しない原虫生産系を開発することであるが、
エンセファリトゾーンは細胞内で増殖する原虫であるこ
とから、培養細胞の利用によって試験管内で原虫を生産
することが可能となる。このような試験管内原虫生産系
が確立されるなら、バイオハザードを予防することがで
きるのみならず、生物学的に均一な原虫の生産、生産の
調整、夾雑物が極めて少ない抗原の分離精製ができる。

【０００７】過去において、エンセファリトゾーンの試
験管内細胞培養に成功したとする多数の報告がある〔キ
ャンニングとロム（Ｃａｎｎｉｎｇ ＆ Ｌｏｍ）著、
脊椎動物のミクロスポリジア（Ｔｈｅ Ｍｉｃｒｏｓｐ
ｏｒｉｄｉａ ｏｆ Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ）、アカ
デミックプレス、１９８５年〕が、寄生細胞を高率に維
持し宿主細胞を死滅させることなく永続的に培養できる
有用な培養細胞はワラー［ワラー（Ｗａｌｌｅｒ）、実
験室動物（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）、
第９巻、６１頁（１９７５年）］のＭＤＣＫ細胞（イヌ
腎臓細胞）の例を見るのみである。ウサギ由来で原虫の
高寄生率を示した細胞はＲＣＰ（脈絡膜叢）細胞であっ
たが感受性が非常に高く継代により死滅しやすいなどの
問題点があった（キャンニングとロム著、同上書）。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかし、ＭＤＣＫ細胞
はイヌ腎臓細胞の樹立細胞系であるため、ヒトの主要な
感染源と目されているウサギを検査対象にした免疫測定
法における抗原の出所としては抗原性に問題があり、特
異性・感度・信頼度の点からもできる限りウサギ由来の
細胞系で生産されたウサギ由来の原虫抗原を用いること
が望ましい。けれども、前記のごとくウサギ由来の原虫
を多産的に安定的に生産するウサギ由来培養細胞につい
てはこれまで報告が見られない。

【０００９】そこで、本発明はウサギ由来エンセファリ
トゾーン原虫の胞子を多産的に、しかも永続的に安定的
に生産するウサギ由来培養細胞株とその作製方法、生産
された原虫胞子を処理することによって得られた抗原お
よびその抗原を用いた免疫測定試薬を提供することを目
的としている。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記目的を達するため
に、本発明者は、先ず典型的なエンセファリトゾーン症
のウサギの腎臓に注目し、この臓器から初代培養法によ
り原虫が寄生した細胞系を増殖させ、この系ではいずれ
宿主細胞が死滅することから、次に生産された原虫胞子
を同種（ウサギ由来）の樹立細胞系に感染させ鋭意研究
した結果、原虫胞子を多産的にしかも永続的に生産する
ことができる培養細胞株を作製することに成功した。次
いで、生産された原虫胞子から抗原を調製し、それを利
用した免疫測定方法を確立し、エンセファリトゾーン症
ウサギの血清診断に有用であることを見出し、本発明を
完成するに至った。

【００１１】

【発明の実施の形態】（１）原虫生産性培養細胞株の作
製法 先ず、エンセファリトゾーン症ウサギから無菌的に腎臓
を摘出し、動物組織のための初代培養法に従いハサミで
十分細切後トリプシン（０．２５％、米国ギブコ社製）
で処理し、その酵素消化物を６０ｍｍプラスチックシャ
ーレ内に接種し、３７℃の温度条件下５％炭酸ガスイン
キュベーターの中で静置培養する。

【００１２】発育してきた腎臓細胞は３〜４週間でシャ
ーレ一杯になるので、その後は１週間に一度の割合でト
リプシン分散処理によって継代を行う。継代３代からは
２５ｃｍ^２プラスチックフラスコ内で培養し、寄生細胞
の有無を倒立顕微鏡で観察する。通常、５〜８代で寄生
細胞が肉眼的に確認されるようになり、８代以後は多数
の原虫胞子が認められるようになる。１１〜１４代で４
０％以上の細胞が寄生細胞になり細胞破壊が進み、多数
の細胞が過寄生のため細胞維持が困難となる。

【００１３】８代前後で、発育してきた原虫がエンセフ
ァリトゾーン・クニクリ（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏ
ｏｎ ｃｕｎｉｃｕｌｉ）であることを公知のＰＣＲ
（ポリメラーゼ連鎖反応）法とダイレクトシークエンシ
ング法による遺伝子診断で確認する。エンセファリトゾ
ーン・クニクリであるなら、例えば精製した胞子ＤＮＡ
の小リボソームＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｒｉｂｏｓｏｍａ
ｌ ＲＮＡ）遺伝子領域の遺伝子配列は遺伝子銀行（Ｇ
ｅｎＢａｎｋ）に登録されているエンセファリトゾーン
・クニクリの遺伝子配列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．
Ｘ９８４６７／Ｌ３９１０７／Ｌ１７０７２／ＡＪ００
５５８１／Ｘ９８４７０／Ｌ０７２５５／Ｘ９８４６９
／ＡＦ０６７１４４）と１００％完全に一致するはずで
ある。発育してきた原虫がエンセファリトゾーン・クニ
クリであることを確認できたら下記の段階に進む。

【００１４】樹立細胞系であるＲＫ−１３細胞（ＡＴＣ
Ｃ番号ＣＣＬ−３７、大日本製薬株式会社より購入でき
る）が予め８０％飽和セルシートになっている２５ｃｍ
^２プラスチックフラスコを用意する。次にこのフラスコ
に適当数（例えば約１×１０^５）の原虫胞子を含む培養
上清（上記１１〜１４代培養上清が良）の沈渣を接種し
て３７℃の温度条件で培養する。第１回目の継代（トリ
プシン分散処理による）は接種後４日目に、第２回目は
初代継代後７日目に行う。

【００１５】第３回目の継代は２代継代後７日目に行う
が、次のように培養温度を変える。すなわち、初めの３
日間の培養は３７℃で、後の４日間の培養は２７℃で行
う。第４回目は継代後初めの３日間は３７℃、次の２日
間は２７℃、残りの２日間は３０℃で培養を行う。第５
回目は初めの３日間の培養は３７℃、後の４日間の培養
は３０℃で行う。

【００１６】通常、５−６代の継代で寄生率は２０〜４
０％なるので過寄生による細胞破壊を防ぐため第６回目
およびそれ以後は培養温度を３７℃に一定にし、１週間
に１回の割合で継代を続ける。この様な方法で、１０〜
３０％の寄生率で安定的に原虫胞子を生産する細胞株を
得ることができる。本方法は他の種例えばラット由来の
エンセファリトゾーン原虫を永続的に生産するラット培
養細胞株の作製の目的にも応用できる。

【００１７】ＲＫ−１３細胞系に用いることのできる増
殖培地は、ペニシリン（５００ｉ．ｕ．／ｍｌ）、スト
レプトマイシン（５００μｇ／ｍｌ）、２ｍＭ Ｌ−グ
ルタミン、１ｍＭ Ｎａ−ピルビン酸および１０％ウシ
胎児血清を含んだイーグルの最小必須培地（Ｅａｇｌ
ｅ′ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄ
ｉｕｍ）（米国ギブコ社製）である。

【００１８】（２）抗原の調製 上記のごとく作製されたＲＫ−１３細胞系の細胞株から
生産された原虫胞子は大きさが１．１〜１．５×２．０
〜２．６μｍであるので、培養液から低速遠心（例えば
３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心）で簡単に回収するこ
とができる。さらに、パーコル密度勾配遠心法などで容
易に分離精製することができ、エンセファリトゾーン抗
原の原材料となる。

【００１９】しかし、エンセファリトゾーン胞子は通常
の動物細胞の破壊法例えばトリトンＸ−１００、ＮＰ−
４０の様な界面活性剤、超音波、凍結融解等による処理
では可溶化が難しく、また、より厳しい条件での処理で
は抗原性が容易に失われるが、２−メルカプトエタノー
ルあるいはジチオスレイトールの様な還元剤とドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下で数分間加熱処理す
ることにより抗原性の保持のまま胞子を破壊し可溶性の
抗原を得ることができる。

【００２０】（３）免疫測定試薬 上記の様に調製された抗原は適当な不溶性担体（プラス
チックプレート、ニトロセルロース膜、ラテックス粒子
など）に固定化して、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ：Ｅｎｚ
ｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ
ａｓｓａｙ）、ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ）法、ラテックス凝集試験法などのための測定
試薬とすることができるほか、イムノクロマトグラフィ
ー法のためには、各種コロイド粒子などの標識物を物理
吸着法あるいは化学結合法により調製抗原あるいはその
構成成分に導入することもできる。

【００２１】（４）免疫測定方法 エンセファリトゾーン抗体検出のための色々な免疫血清
検査法が既に考案されている。例えば、間接蛍光抗体
法、カーボン免疫測定法（ｃａｒｂｏｎ ｉｍｍｕｎｏ
ａｓｓａｙ）、補体結合試験、免疫ペルオキシダーゼ試
験、酵素抗体法、間接粒子凝集試験などである（キャン
ニングとロム著、同上書）が、何れの方法でも非特異的
反応が見られることや、本原虫が広く不顕性に動物界に
感染伝播していることが予想されていることから、非特
異的反応のみならず他の寄生体感染に由来する交差反応
性抗体も可能な限り排除できる測定方法が望ましい。

【００２２】例えば、拮抗酵素抗体法（ｃｏｍｐｅｔｉ
ｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ
ｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）においては、適当量の血
清検体とビオチン、蛍光色素（フルオレッセイン、ロー
ダミン系色素）あるいはアイソトープなどで予め標識さ
れた精製特異抗体を混ぜ、抗原が固定化されている小容
器内で一定時間反応させた後、その抗原に拮抗的に結合
した標識抗体を定量的に測定することにより検体の陽性
・陰性を判定するものである。つまり、拮抗阻害は熱力
学的にほぼ同じ結合定数を有する反応物質の存在によっ
て起こる現象であることから、標識抗体を阻害できる物
質は血清検体中に含まれるエンセファリトゾーン特異抗
体といえる。

【００２３】また、ウエスタンブロット法においては、
先ず、抗原を構成する多種類の成分をＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分子
サイズに従って分別する。次に、電気的にニトロセルロ
ース（ＮＣ）膜などの不溶性の担体に固定化させる。さ
らに、この固定化抗原と血清検体を反応させることによ
ってできる抗原抗体複合体を、酵素試薬や同位元素の利
用により目視可能な着色バンドにし、最終的にバンド形
成の有無やパターンにより検体の陽性・陰性を判定する
ものであり、確認試験法として信頼性が非常に高い。

【００２４】

【実施例１】実施例により本発明をより詳細に説明す
る。 （イ）ＦＦＰ−ＲＫ１３培養細胞株の作製 「原虫生産性培養細胞株の作製法」で述べた様に、ウサ
ギ由来のエンセファリトゾーン原虫をＲＫ−１３細胞に
感染させ、原虫を持続的に生産できる培養細胞株を得
た。本発明者はこの細胞株をＦＦＰ−ＲＫ１３と名づけ
た。ＦＦＰ−ＲＫ１３培養細胞株は以下の特性を持つ。 （ａ）３７℃での培養は宿主細胞の破壊に導くエンセフ
ァリトゾーン原虫の過寄生を抑制し安定した寄生率を維
持するが、より低い温度（例えば３０℃あるいは２７
℃）での培養は寄生率を上げ胞子生産を高める。 （ｂ）生産された原虫は遺伝子診断により属（ｇｅｎｕ
ｓ）がエンセファリトゾーン（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏ
ｚｏｏｎ）、種（ｓｐｅｃｉｅｓ）がクニクリ（ｃｕｎ
ｉｃｕｌｉ）である。 （ｃ）培養液中に放出される原虫胞子の数は２５ｃｍ^２
フラスコ培養液中で１週間培養した場合、最適条件で１
０^６〜１０^７である。 （ｄ）本細胞株は液体窒素の超低温下で凍結保存でき
る。

【００２５】（ロ）ＦＦＰ−ＲＫ１３抗原の調製 ＦＦＰ−ＲＫ１３培養細胞の培養上清から３，０００ｒ
ｐｍ、１０分間遠心して原虫胞子を回収した。さらに、
キリック〔キリック（Ｋｉｌｌｉｃｋ）、分析生化学
（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）、第１１４巻、４６頁（１９８１年）〕の方法に従
ってパーコル密度勾配遠心法により密度１．０５〜１．
０７ｇ／ｍｌ、１．１２ｇ／ｍｌおよび＞１．１４ｇ／
ｍｌの三層に胞子を濃縮し採取後滅菌水で洗浄した。

【００２６】次に、この精製胞子（上記３層から採取し
た胞子を混ぜたもの）を適当量の還元剤（２−メルカプ
トエタノール）を含むレムムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）サン
プルバッファー（米国バイオラッド社製）に懸濁し９５
℃５分間加熱処理、１０，０００ｒｐｍで２分間遠心後
上清を採取、沈渣に同量の上記バッファーを加え同一条
件で再処理し遠心後上清を合わせＮＡＰ５カラム（スエ
ーデン国ファルマシア社製）でゲル炉過脱塩後、診断用
抗原として使用した。

【００２７】（ハ）抗血清の作製 拮抗酵素抗体法では上記のごとく標識特異抗体試薬を必
要とするので、実験用健康ウサギに精製エンセファリト
ゾーン胞子をアジュバンド無添加で静脈注射にて頻回過
免疫し高力価の抗血清を得た（実験は特殊安全動物実験
施設で行った）。

【００２８】（ニ）ビオチン標識抗体の作製 上記高力価抗血清からプロテインＡ−カラムクロマトグ
ラフィーによりＩｇＧ画分を得、次にこの抗体にグレッ
チら〔グレッチら（Ｇｒｅｔｃｈ ｅｔ ａｌ．）、分
析生化学（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）、 第１６３巻、２７０頁（１９８７年）〕の
方法によりビオチニルＮ−ヒドロキシサクシニミドエス
テル（ｂｉｏｔｉｎｙｌ Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ ｓｕｃ
ｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ、米国Ｅ−Ｙラボラトリ
ーズ社製）を反応結合させ、ＮＡＰ−５カラムでゲル濾
過を行った。

【００２９】（ホ）拮抗酵素抗体法の方法 抗原感作ウエル（固相化抗原）に結合した標識抗体量の
測定：５０ｍＭトリス緩衝液に溶解した前記調製抗原
（１μｇ／ｍｌ）２００μｌを未処理マイクロタイター
プレート（９６ウエル・ヌンクプレート、デンマーク国
インターメッド社製）の各ウエルに加え３７℃３時間放
置後、トゥイーン２０（０．５ｍｌ／ｌ）を含むＰＢＳ
（燐酸緩衝食塩水）で３回洗浄し、スーパーブロック
（ブロッキングバッファー、米国ピアス社製）２５０μ
ｌで３７℃３０分間ブロッキングした。次に上記ビオチ
ン標識抗体−被検血清混合液〔トゥイーン２０−ＰＢＳ
液の中にビオチン標識抗体と被検血清がそれぞれ最終濃
度で１２．５μｇ／ｍｌ、１：１００希釈を含む〕２０
０μｌを加え、３７℃３０分間反応させトゥイーン２０
−ＰＢＳで３回洗浄した。さらに、ストレプトアビジン
結合ペルオキシダーゼ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐ
ｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、オランダ国
モレキュラープローブ社製）液（１μｇ／ｍｌ）の２０
０μｌを加え、３７℃３０分間反応後トゥイーン２０−
ＰＢＳで４回洗浄した。基質ＡＢＴＳ液［２，２−アジ
ノジ−（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）−ジ
アンモニウム塩、米国ザイメド社製］２００μｌを加え
波長４１５ｎｍで吸光度をマイクロプレートリーダー
（米国バイオラッド社製、Ｍｏｄｅｌ ５５０、商品
名）で測定した。

【００３０】抗原未感作ウエルに結合した標識抗体量の
測定：抗原不含の緩衝液（５０ｍＭトリス緩衝液）２０
０μｌのみで処理されたウエルを用いた以外は、上記に
記載された同じ試料を用いて同一条件下で反応を行っ
た。

【００３１】拮抗酵素抗体法による結果のモデル図を図
１に示す。

【００３２】

【数１】拮抗阻害率は次式に従って計算した。 阻害率（％）＝（Ｔ−Ｍ）／Ｔ×１００ Ｔ：〔抗原感作ウエルにおける（標識抗体＋陰性対照血
清）の測定値〕−〔未感作ウエルにおける（標識抗体＋
陰性対照血清）の測定値〕 Ｍ：〔抗原感作ウエルにおける（標識抗体＋被検血清）
の測定値〕−〔未感作ウエルにおける（標識抗体＋被検
血清）の測定値〕

【００３３】（ヘ）拮抗酵素抗体法によるエンセファリ
トゾーン症ウサギ野外例の成績 エンセファリトゾーン症を自然発症したウサギ野外例１
０頭からの血清検体と健康な実験用ウサギ２０頭からの
血清検体を拮抗酵素抗体法で検査した結果を表１に示
す。正常ウサギ血清２０検体の阻害率は０％、一方、エ
ンセファリトゾーン症ウサギ血清１０検体の阻害率は３
２．０〜７５．３％を示した。すなわち、感染ウサギ血
清にのみ特異抗体の存在を示す明らかな拮抗阻害作用が
認められた。

【００３４】

【表１】

【００３５】（ト）ウエスタンブロット法の方法 上記拮抗酵素抗体法で使用された抗原の約１００μｇを
還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ミニゲル、２Ｄウエル−
７２ｍｍ（Ｗ）×１ｍｍ、日本バイオラッド社製）で展
開後、ＮＣ（０．２μｍ、ドイツ国シュライシャーシュ
エル社製）膜に電気的に転写させた。検査には、この抗
原吸着ＮＣ膜を適当な幅の短冊にして用いた。スーパー
ブロック（商品名、米国ピアス社製）で処理後、免疫染
色を施した。免疫染色の条件は一次抗体（血清検体１：
１００倍希釈液）が室温２時間、二次抗体（アルカリホ
スファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ（英国バインディング
サイト社の１，０００倍希釈液）が室温２時間であっ
た。洗浄はトゥイーン２０−ＰＢＳで４回行った。基質
は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−フォスフ
ェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢ
Ｔ）（米国ＫＰＩ社製）液を用いた。

【００３６】（チ）ウエスタンブロット法によるエンセ
ファリトゾーン症ウサギ野外例の成績 上記と同様、エンセファリトゾーン症を自然発症したウ
サギ野外例１０頭からの血清検体と健康な実験用ウサギ
２０頭からの血清検体をウエスタンブロット法で検査し
た。拮抗酵素抗体法で阻害作用を示した感染ウサギ血清
１０検体と反応させた抗原吸着短冊のみが、およそ４７
ｋＤａの位置のバンドを中心とする多バンドからなる陽
性パターンを示した。正常ウサギ血清検体と反応させた
抗原吸着短冊ではバンド形成はまったく認められなかっ
た。結果を表１にまとめ、代表的な染色バンドパターン
を図２に示す。

【００３７】以上、ウエスタンブロット法で、拮抗酵素
抗体法による陽性診断を確認する結果を得ることができ
た。つまり、エンセファリトゾーン症ウサギ血清検体中
にはエンセファリトゾーン原虫の種々の抗原性物質に対
する抗体が産生されており、ウエスタンブロットでは着
色バンドとして特異抗体が検出されたことを示す。

【００３８】また、ウエスタンブロット法で、本精製胞
子の有効抗原成分はおよそ４７ｋＤａバンドを主成分と
する多成分であることが示された。つまり、本発明原虫
寄生培養細胞株は血清診断に有用な抗原成分を内包して
いる胞子を生産している。

【００３９】

【発明の効果】本発明培養細胞株は温度に依存した原虫
生産能を有し、ウサギ由来原虫胞子を効率よく生産する
ことができ、その胞子を処理して得られた抗原は血清検
査で特異的に抗体を捕捉できる性質を有する。このこと
から、原虫胞子抗原を免疫測定試薬に用いることによ
り、高精度の免疫測定試薬を提供することができ、ウサ
ギを中心としたペットあるいは実験用動物のエンセファ
リトゾーン症生前診断、健康調査に応用が期待される。

【図面の簡単な説明】

【図１】固相としてマイクロタイタープレートを用いた
拮抗酵素抗体法による結果のモデル図を示す。各ウエル
（小サークル）の色調の度合は基質添加後の色調の変化
を表し、４１５ｎｍでの吸光度は、仮にＡ１測定値＝
１．１；Ａ２測定値＝０．１；Ｂ１測定値＝０．６；Ｂ
２測定値＝０．１；Ｃ１測定値＝０．３；Ｃ２測定値＝
０．１；Ｄ１測定値＝０．２；Ｄ２測定値＝０．１とし
ている。

【図２】ウエスタンブロット法をエンセファリトゾーン
症ウサギ野外例に応用した場合の代表的な陽性染色バン
ドパターンを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 5/06 (Ｃ１２Ｎ 1/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/10 (Ｃ１２Ｎ 5/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エンセファリトゾーン原虫を永続的、多
   産的に生産する培養細胞株。ただし、この培養細胞株は
   寄生が定着後は３７℃で過寄生抑制、より低温下で寄生
   促進が調整可能な特性を有する細胞株であること。
2. 【請求項２】 ＦＦＰ−ＲＫ１３培養細胞株である、請
   求項１記載の培養細胞株。
3. 【請求項３】 請求項１あるいは２に記載の寄生細胞株
   を作製する方法。
4. 【請求項４】 請求項１あるいは２に記載の培養細胞か
   ら生産された原虫胞子を処理することによって得られた
   抗原。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の抗原を固相または化学
   物質に結合してなる免疫測定試薬。
6. 【請求項６】 免疫測定試薬が拮抗酵素抗体法およびウ
   エスタンブロット法の免疫測定試薬である請求項５に記
   載の免疫測定試薬。