JP2002017369A - コレシストキニンａ受容体遺伝子多型による肥満の危険因子の検出法 - Google Patents
コレシストキニンａ受容体遺伝子多型による肥満の危険因子の検出法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 肥満の危険因子の検出法の提供。
【解決手段】 ヒト由来コレシストキニンＡ受容体遺伝
子の特定の塩基配列の特定の２種類の塩基番号の塩基に
相当する塩基の多型であるコレシストキニンＡ受容体遺
伝子多型を解析し、解析結果に基づいて肥満の危険因子
の有無を検出する。
子の特定の塩基配列の特定の２種類の塩基番号の塩基に
相当する塩基の多型であるコレシストキニンＡ受容体遺
伝子多型を解析し、解析結果に基づいて肥満の危険因子
の有無を検出する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、肥満の危険因子の
検出法に関する。
検出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】肥満は体脂肪が著しく蓄積した状態であ
る。肥満の成因においては、多くの遺伝的素因が関与し
ていることが知られている。1994年にフリードマンらに
よって飽食因子であるレプチンが発見されて以来、脳と
臓器とを結びつける食欲調節ホルモンの研究が進歩を遂
げている。肥満のメカニズムが明らかになるに従って、
糖尿病発症との関係から多くの遺伝子の多型が、遺伝的
素因を解明するために調べられている。
る。肥満の成因においては、多くの遺伝的素因が関与し
ていることが知られている。1994年にフリードマンらに
よって飽食因子であるレプチンが発見されて以来、脳と
臓器とを結びつける食欲調節ホルモンの研究が進歩を遂
げている。肥満のメカニズムが明らかになるに従って、
糖尿病発症との関係から多くの遺伝子の多型が、遺伝的
素因を解明するために調べられている。
【０００３】ラットでは、コレシストキニンＡ受容体の
発現のないことが肥満に関係することが報告されている
（Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 787-796 (199
5);Gene 197, 169-175 (1997)）。
発現のないことが肥満に関係することが報告されている
（Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 787-796 (199
5);Gene 197, 169-175 (1997)）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、肥満の危険
因子の検出法を提供することを目的とする。
因子の検出法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、これまで
不明であったコレシストキニンＡ受容体（以下「CCKA
R」と略す）遺伝子の転写開始部位の決定を試みたとこ
ろ、それによって判明したプロモーター領域に肥満と関
連している二つの塩基変化が存在することを見出し、本
発明を完成した。
不明であったコレシストキニンＡ受容体（以下「CCKA
R」と略す）遺伝子の転写開始部位の決定を試みたとこ
ろ、それによって判明したプロモーター領域に肥満と関
連している二つの塩基変化が存在することを見出し、本
発明を完成した。
【０００６】本発明は、CCKAR遺伝子の多型を解析し、
解析結果に基づいて肥満の危険因子の有無を検出するこ
とを含み、遺伝子多型は配列番号１に示す塩基配列の塩
基番号453及び500の塩基に相当する塩基の多型であるこ
とを特徴とする肥満の危険因子を検出する方法（以下、
「本発明検出法」という）を提供する。
解析結果に基づいて肥満の危険因子の有無を検出するこ
とを含み、遺伝子多型は配列番号１に示す塩基配列の塩
基番号453及び500の塩基に相当する塩基の多型であるこ
とを特徴とする肥満の危険因子を検出する方法（以下、
「本発明検出法」という）を提供する。
【０００７】本発明検出法において、好ましくは、遺伝
子多型の解析は、配列番号２及び３に示す塩基配列の少
なくとも一部をそれぞれ有するミスマッチプライマーを
用いるPCR-RFLP法で行われる。ミスマッチプライマーが
それぞれ配列番号２及び３に示す塩基配列を有し、PCR-
RFLP法における制限酵素消化が、塩基配列GANTC（Nは
A、G、TまたはC）を認識する制限酵素による消化である
ことがさらに好ましい。
子多型の解析は、配列番号２及び３に示す塩基配列の少
なくとも一部をそれぞれ有するミスマッチプライマーを
用いるPCR-RFLP法で行われる。ミスマッチプライマーが
それぞれ配列番号２及び３に示す塩基配列を有し、PCR-
RFLP法における制限酵素消化が、塩基配列GANTC（Nは
A、G、TまたはC）を認識する制限酵素による消化である
ことがさらに好ましい。
【０００８】また、本発明検出法においては、CCKAR遺
伝子の多型の解析結果とβ３アドレナリン受容体遺伝子
の多型の解析結果とを組み合わせて肥満の危険因子の有
無を検出することが好ましい。
伝子の多型の解析結果とβ３アドレナリン受容体遺伝子
の多型の解析結果とを組み合わせて肥満の危険因子の有
無を検出することが好ましい。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。
て説明する。
【００１０】本発明の検出法は、CCKAR遺伝子の特定の
多型を少なくとも解析し、解析の結果に基づいて肥満の
危険因子の有無を検出することを特徴とする。
多型を少なくとも解析し、解析の結果に基づいて肥満の
危険因子の有無を検出することを特徴とする。
【００１１】特定のCCKAR遺伝子多型とは、配列番号１
に示す塩基配列の塩基番号453及び500の塩基に相当する
塩基の多型である。一般に塩基配列には個体間で遺伝子
の発現に影響しない相違があり得ることが知られてお
り、そのような相違を有する塩基配列において、配列番
号１に示す塩基配列の塩基番号453及び500の塩基に相当
する塩基を特定することは当業者にとって容易である。
以下、それぞれの塩基をNt. 453及びNt. 500ともいう。
Nt. 453の多型はG/T（野生型／変異型）であり、Nt. 50
0の多型はA/G（野生型／変異型）である。
に示す塩基配列の塩基番号453及び500の塩基に相当する
塩基の多型である。一般に塩基配列には個体間で遺伝子
の発現に影響しない相違があり得ることが知られてお
り、そのような相違を有する塩基配列において、配列番
号１に示す塩基配列の塩基番号453及び500の塩基に相当
する塩基を特定することは当業者にとって容易である。
以下、それぞれの塩基をNt. 453及びNt. 500ともいう。
Nt. 453の多型はG/T（野生型／変異型）であり、Nt. 50
0の多型はA/G（野生型／変異型）である。
【００１２】CCKAR遺伝子多型の解析の方法は、上記の
多型の判別ができる限り、特に限定されない。遺伝子多
型の解析方法として公知の方法を用いることができる。
例えば、対象から採取した血液等の試料から、DNAを抽
出し、これを鋳型として、目的とする多型を含む部分を
増幅できるように設定したプライマーを用いたPCRを行
い、得られたPCR産物の塩基配列を解析することによっ
ても行うことができる。また、PCR産物の塩基配列の解
析においては、必ずしも完全な塩基配列を決定する必要
はなく、制限酵素を利用した方法（例えば制限断片長多
型の解析）を用いても解析を行える。
多型の判別ができる限り、特に限定されない。遺伝子多
型の解析方法として公知の方法を用いることができる。
例えば、対象から採取した血液等の試料から、DNAを抽
出し、これを鋳型として、目的とする多型を含む部分を
増幅できるように設定したプライマーを用いたPCRを行
い、得られたPCR産物の塩基配列を解析することによっ
ても行うことができる。また、PCR産物の塩基配列の解
析においては、必ずしも完全な塩基配列を決定する必要
はなく、制限酵素を利用した方法（例えば制限断片長多
型の解析）を用いても解析を行える。
【００１３】上記のPCRを用いるCCKAR遺伝子多型を解析
する方法としては、例えば、変異型であるときに塩基配
列GANTC（NはA、G、TまたはC）がPCR産物の塩基配列の
一部に含まれるように設計したミスマッチプライマーを
用いるPCR-RFLP（制限断片長多型）法を用いることがで
きる。ヒトCCKAR遺伝子の上流域にある２ヶ所の多型
は、塩基配列GANTC（NはA、G、TまたはC）を認識する制
限酵素（例えばHinfI）と、これらのプライマーとを用
いることで、２ヶ所の多型を同時に、さらに対立遺伝子
毎に解析することが可能となる。従って、この態様によ
れば、１回の制限酵素処理で２ヶ所の多型を判別でき、
さらにこの多型の組み合わせまで解析することができる
ので有利である。すなわち、これらのプライマーを用い
て増幅されたPCR産物は、塩基配列GANTC（NはA、G、Tま
たはC）を認識する制限酵素（例えばHinfI）で消化しア
クリルアミドゲル電気泳動で分析することにより、２ヶ
所の多型を対立遺伝子毎に解析することができる。
する方法としては、例えば、変異型であるときに塩基配
列GANTC（NはA、G、TまたはC）がPCR産物の塩基配列の
一部に含まれるように設計したミスマッチプライマーを
用いるPCR-RFLP（制限断片長多型）法を用いることがで
きる。ヒトCCKAR遺伝子の上流域にある２ヶ所の多型
は、塩基配列GANTC（NはA、G、TまたはC）を認識する制
限酵素（例えばHinfI）と、これらのプライマーとを用
いることで、２ヶ所の多型を同時に、さらに対立遺伝子
毎に解析することが可能となる。従って、この態様によ
れば、１回の制限酵素処理で２ヶ所の多型を判別でき、
さらにこの多型の組み合わせまで解析することができる
ので有利である。すなわち、これらのプライマーを用い
て増幅されたPCR産物は、塩基配列GANTC（NはA、G、Tま
たはC）を認識する制限酵素（例えばHinfI）で消化しア
クリルアミドゲル電気泳動で分析することにより、２ヶ
所の多型を対立遺伝子毎に解析することができる。
【００１４】上記ミスマッチプライマーの設計は、ヒト
CCKAR遺伝子の公知の塩基配列に基づいて行うことがで
きる（例えば、Genbank Accession No. D85606参照）。
このようなプライマーの例としては、配列番号２及び３
に示す塩基配列の少なくとも一部をそれぞれ有するも
の、特には、配列番号２及び３に示す塩基配列を有する
ものが挙げられる。配列番号２に示す塩基配列は、配列
番号１に示す塩基配列の塩基番号418〜452に対応し、塩
基番号450の塩基がミスマッチである。配列番号３に示
す塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号52
0〜501に対応し、塩基番号503の塩基がミスマッチであ
る。この例の場合、Nt. 453及びNt. 500がそれぞれ変異
型のとき、PCR産物は上記制限酵素により切断される。
CCKAR遺伝子の公知の塩基配列に基づいて行うことがで
きる（例えば、Genbank Accession No. D85606参照）。
このようなプライマーの例としては、配列番号２及び３
に示す塩基配列の少なくとも一部をそれぞれ有するも
の、特には、配列番号２及び３に示す塩基配列を有する
ものが挙げられる。配列番号２に示す塩基配列は、配列
番号１に示す塩基配列の塩基番号418〜452に対応し、塩
基番号450の塩基がミスマッチである。配列番号３に示
す塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号52
0〜501に対応し、塩基番号503の塩基がミスマッチであ
る。この例の場合、Nt. 453及びNt. 500がそれぞれ変異
型のとき、PCR産物は上記制限酵素により切断される。
【００１５】解析の結果に基づく肥満の危険因子の有無
の検出は、解析により判明した遺伝子型が、Nt. 453及
びNt. 500がそれぞれT及びGである遺伝子型である場合
に、危険因子があると判定することによって行うことが
できる。
の検出は、解析により判明した遺伝子型が、Nt. 453及
びNt. 500がそれぞれT及びGである遺伝子型である場合
に、危険因子があると判定することによって行うことが
できる。
【００１６】危険因子の有無の検出は、上記の特定の多
型の解析結果とCCKAR遺伝子の他の多型や他の遺伝子の
多型の解析結果との組み合わせに基づいて行ってもよ
い。他の遺伝子の多型としては、β３アドレナリン受容
体遺伝子の多型（Codon 64, TGG(Trp)/CGG(Arg)）が挙
げられる。この多型については、Trp/Trp型が正常、Arg
/Trp型及びArg/Arg型が肥満リスク大と判断される（Yos
hida, T., Sakane, N. etal. Lancet, 346, 1433-1434
(1995); Shuldiner, Alen, R. WO 96/36641）。
型の解析結果とCCKAR遺伝子の他の多型や他の遺伝子の
多型の解析結果との組み合わせに基づいて行ってもよ
い。他の遺伝子の多型としては、β３アドレナリン受容
体遺伝子の多型（Codon 64, TGG(Trp)/CGG(Arg)）が挙
げられる。この多型については、Trp/Trp型が正常、Arg
/Trp型及びArg/Arg型が肥満リスク大と判断される（Yos
hida, T., Sakane, N. etal. Lancet, 346, 1433-1434
(1995); Shuldiner, Alen, R. WO 96/36641）。
【００１７】本発明は如何なる理論に拘束されるもので
はないが、ヒトCCKAR遺伝子の上流域に存在する遺伝子
多型は、CCKARの遺伝子発現量に影響を及ぼし、これに
よって、コレシストキニンのシグナル伝達能力に差が生
じ、体脂肪増加の誘因になるものと考えられる。
はないが、ヒトCCKAR遺伝子の上流域に存在する遺伝子
多型は、CCKARの遺伝子発現量に影響を及ぼし、これに
よって、コレシストキニンのシグナル伝達能力に差が生
じ、体脂肪増加の誘因になるものと考えられる。
【００１８】
【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明す
るが、下記実施例は本発明について具体的な認識を得る
一助としてのみ挙げたものであり、これによって本発明
の範囲が何ら限定されるものではない。
るが、下記実施例は本発明について具体的な認識を得る
一助としてのみ挙げたものであり、これによって本発明
の範囲が何ら限定されるものではない。
【００１９】
【実施例１】 ヒトCCKAR遺伝子の転写開始部位の決定
及び多型の検出 インフォームドコンセントを得た膵臓の腺癌の患者から
摘出された正常な胆嚢を試料として用いた。摘出後直ち
に一部を組織化学的に検査し、残部を−８０℃で保存し
た。用いた試料は全て、組織化学的検査で異常や炎症の
徴候は認められなかった。試料から全RNAを、酸−グア
ニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム法
におり抽出した。RNAの量及び純度を260及び280 nmの吸
光度により測定した。分解の徴候のない試料を、ヒトCC
KAR遺伝子のコーディング領域のcDNAプローブ（New Eng
l. J. Med. 334, 292-295 (1999)、NIHのS.A. Wank博士
より恵与）及びβ-アクチンcDNAのcDNAプローブ（和光
純薬工業（株）製）を用いるノザントランスファー分析
に用いた。
及び多型の検出 インフォームドコンセントを得た膵臓の腺癌の患者から
摘出された正常な胆嚢を試料として用いた。摘出後直ち
に一部を組織化学的に検査し、残部を−８０℃で保存し
た。用いた試料は全て、組織化学的検査で異常や炎症の
徴候は認められなかった。試料から全RNAを、酸−グア
ニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム法
におり抽出した。RNAの量及び純度を260及び280 nmの吸
光度により測定した。分解の徴候のない試料を、ヒトCC
KAR遺伝子のコーディング領域のcDNAプローブ（New Eng
l. J. Med. 334, 292-295 (1999)、NIHのS.A. Wank博士
より恵与）及びβ-アクチンcDNAのcDNAプローブ（和光
純薬工業（株）製）を用いるノザントランスファー分析
に用いた。
【００２０】ヒトゲノムDNAライブラリー(Stratagene社
製)を、ヒトCCKAR遺伝子のコーディング領域のcDNAプロ
ーブを用いてスクリーニングした。標準のプラークハイ
ブリダイゼーション条件で、約1000000のファージクロ
ーンが得られた。14の陽性クローンを単離し、サザンブ
ロット分析及び制限マッピングによりさらに分析した。
CCKAR遺伝子のコーディング領域のcDNAプローブとハイ
ブリダイズするDNA断片をラムダH24及びラムダH14ファ
ージクローンから単離し、ショットガン配列決定法のた
めにM13 mp19にサブクローニングした。得られた配列デ
ータを遺伝配列分析システム（Perkin-Elmer社製）によ
り連結した。
製)を、ヒトCCKAR遺伝子のコーディング領域のcDNAプロ
ーブを用いてスクリーニングした。標準のプラークハイ
ブリダイゼーション条件で、約1000000のファージクロ
ーンが得られた。14の陽性クローンを単離し、サザンブ
ロット分析及び制限マッピングによりさらに分析した。
CCKAR遺伝子のコーディング領域のcDNAプローブとハイ
ブリダイズするDNA断片をラムダH24及びラムダH14ファ
ージクローンから単離し、ショットガン配列決定法のた
めにM13 mp19にサブクローニングした。得られた配列デ
ータを遺伝配列分析システム（Perkin-Elmer社製）によ
り連結した。
【００２１】ヒトCCKAR mRNAの転写開始部位を決定する
ため、キャップサイトハンティング(Capsite Hunting)
法を日本ジーン社製キットを用いて製造者のプロトコル
に従って以下の通り行った。5'末端m7GpppNキャップ構
造を、タバコヌクレオチド酸性ピロホスファターゼのピ
ロホスホリシス反応により除去し、配列番号４に示す塩
基配列を有する35merの特異的オリゴヌクレオチド（rOl
igo）の3'末端でRNAリガーゼ反応により再キャッピング
した。再キャッピングしたmRNAから、モロニーマウス白
血病ウイルス逆転写酵素及びランダムプライマーを用い
た第１鎖cDNAの合成により一本鎖cDNAライブラリーを調
製した。一本鎖cDNAライブラリーからCCKARに特異的な
転写物を増幅するために、ネステッドPCRを行った。第
１回目のPCRには、配列番号５に示す塩基配列を有する
ターゲット遺伝子特異的なプライマー１（TGS-1）と、
配列番号６に示す塩基配列を有する、rOligoに相補的な
センスDNAプライマー（RC1）を用いた。第２回目のPCR
には、配列番号７に示す塩基配列を有するターゲット遺
伝子特異的なプライマー２（TGS-2）と、配列番号８に
示す塩基配列を有する、rOligoに相補的なセンスDNAプ
ライマー（RC2）との組み合わせを用いた。第２回目のP
CRの産物の単一バンドを単離し、pGEM-Tベクターにクロ
ーニングし、二つの独立したクローンの配列決定を行っ
た。転写開始部位を、rOligoとCCKAR mRNA配列の間の境
界配列を特定することにより決定した。
ため、キャップサイトハンティング(Capsite Hunting)
法を日本ジーン社製キットを用いて製造者のプロトコル
に従って以下の通り行った。5'末端m7GpppNキャップ構
造を、タバコヌクレオチド酸性ピロホスファターゼのピ
ロホスホリシス反応により除去し、配列番号４に示す塩
基配列を有する35merの特異的オリゴヌクレオチド（rOl
igo）の3'末端でRNAリガーゼ反応により再キャッピング
した。再キャッピングしたmRNAから、モロニーマウス白
血病ウイルス逆転写酵素及びランダムプライマーを用い
た第１鎖cDNAの合成により一本鎖cDNAライブラリーを調
製した。一本鎖cDNAライブラリーからCCKARに特異的な
転写物を増幅するために、ネステッドPCRを行った。第
１回目のPCRには、配列番号５に示す塩基配列を有する
ターゲット遺伝子特異的なプライマー１（TGS-1）と、
配列番号６に示す塩基配列を有する、rOligoに相補的な
センスDNAプライマー（RC1）を用いた。第２回目のPCR
には、配列番号７に示す塩基配列を有するターゲット遺
伝子特異的なプライマー２（TGS-2）と、配列番号８に
示す塩基配列を有する、rOligoに相補的なセンスDNAプ
ライマー（RC2）との組み合わせを用いた。第２回目のP
CRの産物の単一バンドを単離し、pGEM-Tベクターにクロ
ーニングし、二つの独立したクローンの配列決定を行っ
た。転写開始部位を、rOligoとCCKAR mRNA配列の間の境
界配列を特定することにより決定した。
【００２２】この結果、開始ATGの205bp上流（配列番号
１に示す塩基配列の塩基番号581）が転写開始部位であ
ることが判明した。
１に示す塩基配列の塩基番号581）が転写開始部位であ
ることが判明した。
【００２３】プロモーター領域の多型を以下の様にして
調べた。白血球ゲノムDNAについて、配列番号９に示す
塩基配列を有するセンスプライマー及び配列番号１０に
示す塩基配列を有するアンチセンスプライマーを用いる
PCRクローニング法を行った。PCR産物を単離しM13にク
ローニングし、10の独立したクローンを配列決定した。
その結果、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号453の
塩基のGからTの変化および同塩基番号500の塩基のAから
Gの変化の二つの配列の変化が検出された。
調べた。白血球ゲノムDNAについて、配列番号９に示す
塩基配列を有するセンスプライマー及び配列番号１０に
示す塩基配列を有するアンチセンスプライマーを用いる
PCRクローニング法を行った。PCR産物を単離しM13にク
ローニングし、10の独立したクローンを配列決定した。
その結果、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号453の
塩基のGからTの変化および同塩基番号500の塩基のAから
Gの変化の二つの配列の変化が検出された。
【００２４】
【実施例２】 ヒトCCKAR遺伝子の上流域に存在する多
型の検出 抗凝固剤として50 mM EDTA2Naを含む全血よりDNA抽出キ
ット（Qiagen）にてDNAを抽出した。次に、配列番号２
と配列番号３のプライマーを用いて、抽出したDNAを鋳
型にPCR反応を行った。PCRの反応液は、抽出したDNA 20
0μg、配列番号２及び配列番号３に示す塩基配列を有す
るプライマーをそれぞれ20 pmol、Taq DNAポリメラーゼ
1 U、2.0 mM各dNTPを2.5μl、10×緩衝液（100 mM Tris
-HCl, pH 8.3、500 mM KCl、15 mM MgCl2）を2.5μl
に、滅菌超純水を加え、最終液量25μlとした。反応条
件は、95℃３分間の後、94℃0.5分間、63℃0.5分間及び
72℃１分間のサイクルを35サイクル行い、最後に72℃3
分間とした。
型の検出 抗凝固剤として50 mM EDTA2Naを含む全血よりDNA抽出キ
ット（Qiagen）にてDNAを抽出した。次に、配列番号２
と配列番号３のプライマーを用いて、抽出したDNAを鋳
型にPCR反応を行った。PCRの反応液は、抽出したDNA 20
0μg、配列番号２及び配列番号３に示す塩基配列を有す
るプライマーをそれぞれ20 pmol、Taq DNAポリメラーゼ
1 U、2.0 mM各dNTPを2.5μl、10×緩衝液（100 mM Tris
-HCl, pH 8.3、500 mM KCl、15 mM MgCl2）を2.5μl
に、滅菌超純水を加え、最終液量25μlとした。反応条
件は、95℃３分間の後、94℃0.5分間、63℃0.5分間及び
72℃１分間のサイクルを35サイクル行い、最後に72℃3
分間とした。
【００２５】反応終了後、制限酵素処理を行った。制限
酵素処理の反応液は、PCR反応終了液を5μl、10×緩衝
液（制限酵素に添付された緩衝液、ロシュダイアグノシ
ス）を4μl、制限酵素HinfI（20 U/μl）を1μlに、滅
菌超純水を加え、最終液量40μlとした。反応条件は、3
7℃で1.5時間とした。
酵素処理の反応液は、PCR反応終了液を5μl、10×緩衝
液（制限酵素に添付された緩衝液、ロシュダイアグノシ
ス）を4μl、制限酵素HinfI（20 U/μl）を1μlに、滅
菌超純水を加え、最終液量40μlとした。反応条件は、3
7℃で1.5時間とした。
【００２６】反応終了後、反応液の一部を12％のポリア
クリルアミドゲル電気泳動により分離し、ゲルスター
（宝酒造）染色後、対立遺伝子毎の多型解析（多型パタ
ーン解析）を行った。
クリルアミドゲル電気泳動により分離し、ゲルスター
（宝酒造）染色後、対立遺伝子毎の多型解析（多型パタ
ーン解析）を行った。
【００２７】増幅される領域内には多型が２ヶ所（Nt.
453及びNt. 500）存在するので、対立遺伝子の組み合わ
せも考慮すると１０通りのパターンが考えられる。多型
の塩基の組み合わせとそれらに対応する泳動パターンを
図１に示す。
453及びNt. 500）存在するので、対立遺伝子の組み合わ
せも考慮すると１０通りのパターンが考えられる。多型
の塩基の組み合わせとそれらに対応する泳動パターンを
図１に示す。
【００２８】
【実施例３】 健常人の多型頻度解析 健常人ボランティア２２４人の末梢血由来DNAを鋳型DNA
として、実施例２の方法に従って、多型の検出を行っ
た。結果を表１に示す。
として、実施例２の方法に従って、多型の検出を行っ
た。結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】本遺伝子の多型は、理論的には１０通りに
分類されるが、健常人ボランティア２２４人の解析で
は、６通りのパターンが見い出された。
分類されるが、健常人ボランティア２２４人の解析で
は、６通りのパターンが見い出された。
【００３１】
【実施例４】 CCKAR遺伝子多型と肥満との関連 インフォームドコンセントを得た被験者1316人（男646
人、女650人、年齢40〜79）について、Nt. 453及びNt.
500の多型と肥満関連因子との相関を検討した。多型の
検出は実施例２の方法により実施した。体脂肪の割合
は、air displacement plethysmograph（Body Composit
ion System, Life Measurement Instruments）と二重エ
ネルギーＸ線吸収測定法（DXA）を用いて行った。絶食
時血清レプチン及びインスリンは、ラジオイムノアッセ
イ法（それぞれLINCO社製キット及びDinabot社製キッ
ト)で測定した。体格指数は、体重を身長の二乗で除算
して算出した。その結果を表２に示す。多型の区分は、
変異型のホモ接合体とそれ以外に分けて統計処理を行っ
た。
人、女650人、年齢40〜79）について、Nt. 453及びNt.
500の多型と肥満関連因子との相関を検討した。多型の
検出は実施例２の方法により実施した。体脂肪の割合
は、air displacement plethysmograph（Body Composit
ion System, Life Measurement Instruments）と二重エ
ネルギーＸ線吸収測定法（DXA）を用いて行った。絶食
時血清レプチン及びインスリンは、ラジオイムノアッセ
イ法（それぞれLINCO社製キット及びDinabot社製キッ
ト)で測定した。体格指数は、体重を身長の二乗で除算
して算出した。その結果を表２に示す。多型の区分は、
変異型のホモ接合体とそれ以外に分けて統計処理を行っ
た。
【００３２】
【表２】 表２ CCKAR遺伝子多型と肥満関連因子との関連 ──────────────────────────────────── 野生型(G/G,A/A) ホモ接合体(T/T,G/G) P値 及びヘテロ接合体 (n=1271) (n=25) ──────────────────────────────────── 体格指数 22.8(0.09) 23.9(0.78) 0.076 血清レプチン(ng/ml) 5.7(0.14) 8.8(2.18) 0.003 血清インスリン(μU/mL) 7.9(0.13) 9.8(1.32) 0.038 DXA脂肪(%) 26.3(0.20) 29.3(1.67) 0.041 ──────────────────────────────────── 値は平均値（括弧内は標準偏差）。２群間の比較の評価
には、スチューデントt-検定を用いた。
には、スチューデントt-検定を用いた。
【００３３】表２に示される通り、ホモ接合体では、そ
の他と比較して、体脂肪の割合と血清レプチン量及び血
清インスリン量が有意（P値<0.05）に高値であった。血
清インスリンの高値は、体脂肪の増加によるインスリン
耐性によるものと考えられる。
の他と比較して、体脂肪の割合と血清レプチン量及び血
清インスリン量が有意（P値<0.05）に高値であった。血
清インスリンの高値は、体脂肪の増加によるインスリン
耐性によるものと考えられる。
【００３４】以上より、本多型は、40才以降の脂肪の蓄
積を予知する肥満（体脂肪増加）の危険因子であること
が統計学的に有意であることが示された。
積を予知する肥満（体脂肪増加）の危険因子であること
が統計学的に有意であることが示された。
【００３５】
【発明の効果】本発明によれば、CCKAR遺伝子の新たな
遺伝子多型に基づく、肥満の危険因子の検出法が提供さ
れる。肥満の危険因子の検出は、生活習慣病の発症予防
に有用である。
遺伝子多型に基づく、肥満の危険因子の検出法が提供さ
れる。肥満の危険因子の検出は、生活習慣病の発症予防
に有用である。
【００３６】
【配列表】 <110> 株式会社三菱化学ビーシーエル(Mitsubishi Kagaku Bio-Clinical Labora tories, Inc.) <120> コレシストキニンＡ受容体遺伝子多型による肥満の危険因子の検出法 <130> P-7614 <160> 10 <210> 1 <211> 990 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gtgctgaatg caaggcttca tgaatgaaga ggaaatctca ctaacgtctt ttgtaataag 60 gacccaggta cctatgttca aaagtgcctc aatcctagtt aacaagggca gagaccacga 120 gaaacaacac tgtgtttagt agcaacttaa caaccagcca gcagttctgt ccacacacac 180 accaccgggc atggttccaa agctaaaaag gcactaattg cttttctata aggaggtaga 240 acacagtccc tccgtgttct ttaggcctga tggtctgcat tatcggatct gttaccgtgt 300 taattgttcc tgtctcacac agccggtttg ggctttcttc tgcatatgtc tgggatggtg 360 acgggttcct atatagagga gtactgggga agcctctgtg tgtgtgtgtg tgtccgtgca 420 tatgtacaca tgtgtgtaaa aagcagccac acgctgagaa tggttaacgg gtagccaggc 480 tgtctgtact cagggcccta agactggccc aggaaagggc cgggggaggt ggggcggggt 540 gaaggtggag cgggcttggc ttgtgctcac tgccttttcc acaacaggag tacaaatgct 600 ggagtgagtg aggtgaactc aagtcgcctt taggaatggc tgaaaaagcc cacacctgga 660 aatcactccc tccctgctcc tccacggcag gttgcatctg cgagacgctt cggtcattag 720 aggaatgagc cgggagtgag caattcacca gctctccagc acttggtgga aagcagcagg 780 caaggatgga tgtggttgac agccttcttg tgaatggaag caacatcact cctccctgtg 840 aactcgggct cgaaaatgag acgcttttct gcttggatca gccccgtcct tccaaaggta 900 agtgtcggaa gctgttattt taattcagga aactattgag ttgtgggaga aatcagcaaa 960 ggcaaggctg ataaaaaata tatataacca 990 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcatatgtac acatgtgtgt aaaaagcagc cagac 35 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gccctttcct gggccagact 20 <210> 4 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for recapping mRNA <400> 4 gaugcuagcu gcgagucaag ucgacgaagu gcagg 35 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gtgatgacca gcgtgtttcc c 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gatgctagct gcgagtcaag tc 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cacgctgagc aggaatatca ag 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cgagtcaagt cgacgaagtg c 21 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ttctaagctt aaggaggtag aacacagtcc 30 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ttctgaattc gctgctttcc accaagtgct gg 32
【図１】 多型の塩基の組み合わせとそれらに対応する
PCR-RFLP法による泳動パターンを示す。
PCR-RFLP法による泳動パターンを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 下方 浩史 愛知県名古屋市千種区穂波町１丁目59番地 (72)発明者 高田 豊 福岡県福岡市西区拾六町２−７−15 (72)発明者 瀧口 総一 福岡県春日市紅葉ヶ丘東８−71 (72)発明者 片岡 和宏 茨城県つくば市小野川12−16 クレスコー トＩ−102 (72)発明者 松末 公彦 福岡県福岡市東区箱松２−16−10 レジデ ンス三嶋407 (72)発明者 河野 彬 福岡県福岡市南区寺塚１−７−８ (72)発明者 松本 英郎 東京都板橋区志村三丁目30番１号 株式会 社三菱化学ビーシーエル内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA04 CA20 HA09 4B063 QA01 QA12 QQ02 QQ08 QQ42 QR14 QR32 QR62 QS16 QS25
Claims (4)
- 【請求項１】 コレシストキニンＡ受容体遺伝子の多型
を解析し、解析結果に基づいて肥満の危険因子の有無を
検出することを含み、遺伝子多型は配列番号１に示す塩
基配列の塩基番号453及び500の塩基に相当する塩基の多
型であることを特徴とする肥満の危険因子を検出する方
法。 - 【請求項２】 遺伝子多型の解析をミスマッチプライマ
ーを用いるPCR-RFLP法で行い、ミスマッチプライマーは
それぞれ配列番号２及び３に示す塩基配列の少なくとも
一部を有する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 ミスマッチプライマーがそれぞれ配列番
号２及び３に示す塩基配列を有し、PCR-RFLP法における
制限酵素消化が、塩基配列GANTC（NはA、G、TまたはC）
を認識する制限酵素による消化である請求項２記載の方
法。 - 【請求項４】 コレシストキニンＡ受容体遺伝子の多型
の解析結果とβ３アドレナリン受容体遺伝子の多型の解
析結果とを組み合わせて肥満の危険因子の有無を検出す
る請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000206806A JP4578633B2 (ja) | 2000-07-07 | 2000-07-07 | コレシストキニンａ受容体遺伝子多型による肥満の危険因子の検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000206806A JP4578633B2 (ja) | 2000-07-07 | 2000-07-07 | コレシストキニンａ受容体遺伝子多型による肥満の危険因子の検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002017369A true JP2002017369A (ja) | 2002-01-22 |
| JP4578633B2 JP4578633B2 (ja) | 2010-11-10 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000206806A Expired - Fee Related JP4578633B2 (ja) | 2000-07-07 | 2000-07-07 | コレシストキニンａ受容体遺伝子多型による肥満の危険因子の検出法 |
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|---|---|
| JP (1) | JP4578633B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005035793A3 (en) * | 2003-10-09 | 2005-06-09 | Decode Genetics Ehf | Cckar markers and haplotypes associated with extreme weight conditions |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996036641A1 (en) * | 1995-05-19 | 1996-11-21 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Susceptibility gene for obesity and type ii diabetes mellitus |
-
2000
- 2000-07-07 JP JP2000206806A patent/JP4578633B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|---|---|---|---|
| WO2005035793A3 (en) * | 2003-10-09 | 2005-06-09 | Decode Genetics Ehf | Cckar markers and haplotypes associated with extreme weight conditions |
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