JP2002017352A - 核酸試料検出用具及び電気化学的検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 電極表面に、ペプチド核酸が結合固定されて
なる、特定の塩基配列部分を有するＤＮＡ断片などで代
表される核酸試料の検出用具を提供する。 【解決手段】 電極表面に共有結合によりペプチド核酸
を固定する。この共有結合によるペプチド核酸の固定
は、ペプチド核酸に導入された活性水素含有基と電極表
面に導入されたビニルスルホニル基もしくはその反応性
前駆体基を含む反応性基との反応により形成するか、電
極に導入された活性水素含有基とペプチド核酸に導入さ
れたビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基を
含む反応性基との反応により形成することが望ましい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生体高分子物質の
構造の解析に有用な検出用具に関し、特に遺伝子の発
現、変異、多型等の効率的な解析に有用な、電気化学的
検出方法に有利に利用される核酸試料の検出用具に関す
る。本発明は特に、核酸試料の塩基配列の解析に有用
な、該核酸試料に相補性を有する化合物を電極表面に高
密度に整列固定させた高密度アレイ型検出用具、そして
該高密度アレイ型検出用具を用いた電気化学的検出方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】多彩な生物の遺伝子機能を効率的に解析
するための技術開発が進んでおり、それらのＤＮＡもし
くはＤＮＡ断片の塩基配列の解析のために、ＤＮＡチッ
プとよばれる、多数のＤＮＡ断片あるいは合成オリゴヌ
クレオチドなどのヌクレオチド誘導体を固相担体の表面
に固定した検出用具が用いられている。このような固相
担体の表面に結合固定されたヌクレオチド誘導体など
の、ＤＮＡもしくはその断片あるいは合成オリゴヌクレ
オチドのような検出用分子はプローブ分子とも呼ばれ
る。代表的なＤＮＡチップは、スライドガラス等の固相
担体に多数のプローブ分子を整列固定させたマイクロア
レイである。このＤＮＡチップの製造、そしてその使用
に関するＤＮＡチップ関連技術は、ＤＮＡ以外の生体分
子の検出にも利用可能であると考えられ、従って、創薬
研究、疾病の診断や予防法の開発等に新しい手段を提供
するものとして期待されている。

【０００３】ＤＮＡチップ関連技術が具体化してきたの
は、ＤＮＡの塩基配列をオリゴヌクレオチドとのハイブ
リダイゼーションによって決定する方法が考案されたこ
とに始まる。この方法は、ゲル電気泳動を用いる塩基配
列決定法の限界を克服できる方法ではあったが、当初は
実用化には至らなかった。

【０００４】その後、上記の構成のＤＮＡチップと、そ
の作製技術が開発され、遺伝子の発現、変異、多型等を
短時間で効率よく調べることが可能となった。すなわ
ち、作製されたＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片もしくはオ
リゴヌクレオチドに相補性を示すＤＮＡ断片試料（標的
ＤＮＡ断片ともいわれる）は、一般的には、ＤＮＡチッ
プ上のＤＮＡ断片もしくはオリゴヌクレオチドと、標識
したＤＮＡ断片試料とのハイブリダイゼーションを利用
して検出される。

【０００５】ＤＮＡチップ作製技術を実用化するために
は、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを固相担体
表面に高密度に、かつ安定に整列させるための技術が必
要とされる。

【０００６】ＤＮＡチップの作製方法としては、固相担
体表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法（「オ
ン・チップ法」という。）と、予め調製用意したＤＮＡ
断片あるいはオリゴヌクレオチドを固相担体表面に結合
固定する方法とが知られている。オン・チップ法として
は、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導
体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術および固
相合成技術とを組み合わせ、所定の微少なマトリックス
領域でのオリゴヌクレオチドの選択的な合成を行なう方
法（「マスキング技術」という）が代表的である。

【０００７】予め調製用意したＤＮＡ断片やオリゴヌク
レオチドを固相担体表面に結合固定する方法としては、
ＤＮＡ断片の種類や固相担体の種類に応じて下記の方法
が知られている。

【０００８】（１）固定するＤＮＡ断片がｃＤＮＡ（ｍ
ＲＮＡを鋳型にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産
物（ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断
片）である場合には、ｃＤＮＡあるいはＰＣＲ産物を、
ＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッタ装置によ
り、ポリ陽イオン化合物（ポリリシン、ポリエチレンイ
ミン等）で表面処理した固相担体の表面に点着し、ＤＮ
Ａ断片の持つ電荷を利用して固相担体に静電結合させ
る。なお、固相担体表面の処理方法としては、アミノ
基、アルデヒド基、あるいはエポキシ基等を有するシラ
ンカップリング剤を用いる方法も利用されている。この
シランカップリング剤を用いた表面処理では、アミノ
基、アルデヒド基等は、共有結合により固相担体表面に
固定されるため、ポリ陽イオン化合物による表面処理の
場合と比較して、安定に固相担体表面に固定される。

【０００９】上記のＤＮＡ断片の電荷を利用する方法の
変法として、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ
（標準食塩−クエン酸緩衝液）に懸濁させ、これをシリ
ル化したスライドガラス表面に点着し、インキュベート
した後、水素化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱
処理を順に行なう方法が報告されている。しかし、この
固定方法では必ずしも充分なＤＮＡ断片の固定安定度が
得られ難いという問題がある。ＤＮＡチップ技術では、
検出限界が重要となる。すなわち、固相担体表面に充分
な量で（すなわち、高密度に）、かつ安定にＤＮＡ断片
が結合固定することは、ＤＮＡ断片プローブと標識した
試料核酸断片とのハイブリダイゼーションの検出限界の
向上に直接影響する。

【００１０】（２）固定するオリゴヌクレオチド（プロ
ーブ分子）が合成オリゴヌクレオチドである場合には、
まず反応性基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、
予め反応性基を形成させるように表面処理した固相担体
に該オリゴヌクレオチドを点着して、該オリゴヌクレオ
チドを固相担体表面に共有結合により結合固定させる方
法も知られている。例えば、表面にアミノ基を導入した
スライドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオ
シアネート）の存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチ
ドを反応させる方法、および該スライドガラスに、アル
デヒド基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知
られている。これらの二つの方法は、前記（１）のＤＮ
Ａ断片の電荷を利用した静電結合による固定方法と比べ
ると、オリゴヌクレオチドが固相担体表面に安定に結合
固定されるという利点がある。しかし、ＰＤＣを存在さ
せる方法は、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチド
との反応が遅く、またアルデヒド基導入オリゴヌクレオ
チドを用いる方法では、反応生成物であるシッフ塩基の
安定性が低い（従って、加水分解が起こり易い）という
問題点がある。

【００１１】なお、近年、ＤＮＡチップのプローブ分子
として、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド
（合成されたオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオ
チド及びＤＮＡ分子やＤＮＡ断片、そしてＲＮＡ分子や
ＲＮＡ断片をも包含する）の代りに、ＰＮＡ（ペプチド
核酸）と呼ばれるオリゴヌクレオチド類縁体を用いる技
術も提唱されている。このＰＮＡを固相担体に共有結合
により固定する方法として、アビジンとビオチンとを組
み合わせて用いる方法も知られている（特開平１１−３
３２５９５号公報）。この公開公報には、固相基板とし
て、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサを利用
することが記載されている。表面プラズモン共鳴バイオ
センサ上にプローブ分子が固定されたＤＮＡチップを用
いて、その表面にハイブリダイゼーションを介して結合
固定されたＤＮＡ断片は、表面プラズモン共鳴現象を利
用して検出することができる。

【００１２】特開平４−２２８０７６号公報（米国特許
第５３８７５０５号明細書に対応）には、ビオチン分子
を付けた標的ＤＮＡを、アビジン分子を表面に固定した
基体に結合させて、標的ＤＮＡを分離する技術が記載さ
れている。

【００１３】特公平７−４３３８０号公報（米国特許第
５０９４９６２号明細書に対応）には、リガンド−受容
体アッセイに用いる検出用具であって、表面に反応活性
基を有する微孔質ポリマー粒子の表面に受容体分子を結
合させた分析用具が記載されている。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規な反応
性電極、そして、ペプチド核酸をプローブ分子として固
定した核酸試料検出用具を提供することを、その課題と
する。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明は、電極と該電極
表面に共有結合により固定された一群のペプチド核酸と
からなる核酸試料検出用具にある。

【００１６】本発明におけるペプチド核酸と電極との共
有結合は、ペプチド核酸に導入された活性水素含有基と
電極表面に導入されたビニルスルホニル基もしくはその
反応性前駆体基を含む反応性基との反応により形成され
ていることが望ましい。あるいは、ペプチド核酸と電極
との共有結合を、電極に導入された活性水素含有基とペ
プチド核酸に導入されたビニルスルホニル基もしくはそ
の反応性前駆体基を含む反応性基との反応により形成す
ることもできる。

【００１７】本発明の核酸試料検出用具はまた、電極、
該電極表面に共有結合により固定された一群のペプチド
核酸、そして該一群のペプチド核酸のそれぞれを互いに
電極表面と平行な平面に沿って空間的に分離する配置に
て電極表面に固定された一群のスペーサ基からなる構成
を有していていもよい。

【００１８】スペーサ基は、電荷を有していないことが
好ましく、またスペーサ基の電極に固定されている側と
は反対側の末端が疎水性基であることが好ましい。そし
て、電極表面に固定された一群のペプチド核酸と一群の
スペーサ基とのモル比が１：１乃至１：２００の範囲に
あることが望ましく、特に１：２乃至１：１００、さら
には１：５乃至１：５０の範囲に有ることが望ましい。

【００１９】本発明はまた、導電性基を有する縫い込み
型インターカレータ及び水性媒体の存在下、核酸試料を
上記のペプチド核酸が固定された核酸試料検出用具に接
触させることにより、該インターカレータが挿入された
核酸試料とペプチド核酸とのハイブリッド複合体を形成
させ、次いで、核酸試料検出用具の電極に電位を印加
し、該検出用具の電極と外部電極との間をインターカレ
ータの導電性基を介して流れる電流を測定することを特
徴とするペプチド核酸に相補性を有する核酸試料の検出
方法にもある。

【００２０】本発明はまた、導電性基を有するカチオン
性分子及び水性媒体の存在下、核酸試料を上記のペプチ
ド核酸が固定された核酸試料検出用具に接触させること
により、該カチオン性分子がイオン結合した核酸試料と
ペプチド核酸とのハイブリッド複合体を形成させ、次い
で、核酸試料検出用具の電極に電位を印加し、該検出用
具の電極と外部電極との間をカチオン性分子の導電性基
を介して流れる電流を測定することを特徴とするペプチ
ド核酸に相補性を有する核酸試料の検出方法にもある。

【００２１】上記の検出方法において、基質およびその
基質との反応によって還元型に変化する酸化酵素をハイ
ブリッド複合体生成の反応系に存在させることによっ
て、ＰＮＡ固定電極と導電性基との間を流れる電流を、
還元型に変化した酸化酵素と電極との間の電子移動によ
って増幅させて測定することもできる。以下、この測定
法を増感型測定法という。

【００２２】本発明はまた、電極の表面に、一群のビニ
ルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基がそれぞれ
連結基を介して共有結合により固定されてなる反応性電
極にもある。

【００２３】本発明の反応性電極は、その電極の表面に
一群のビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基
がそれぞれ連結基を介して共有結合により固定され、さ
らに該一群のビニルスルホニル基もしくはその反応性前
駆体基を互いに電極表面と平行な平面に沿って空間的に
分離する配置にて電極表面に固定された一群のスペーサ
基からなるものであることが好ましい。

【００２４】本発明で用いるビニルスルホニル基もしく
はその反応性前駆体基と連結基との連結体が下記の式
（１）により表わされるものであることが望ましい。

【００２５】

【化６】−Ｌ−ＳＯ₂−Ｘ …（１）

【００２６】［上記の式において、Ｘは、−ＣＲ¹＝Ｃ
Ｒ²Ｒ³または−ＣＨＲ¹−ＣＲ²Ｒ³Ｙを表わし；Ｒ¹、Ｒ
²及びＲ³は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１
乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリー
ル基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する
合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群
より選ばれる原子もしくは基を表わし；Ｙは、ハロゲン
原子、−ＯＳＯ₂Ｒ¹¹、−ＯＣＯＲ¹²、−ＯＳＯ₃Ｍ、及
び四級ピリジニウム基からなる群より選ばれる原子もし
くは基を表わし；Ｒ¹¹は、炭素原子数が１乃至６のアル
キル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭
素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子
数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる
基を表わし；Ｒ¹²は、炭素原子数が１乃至６のアルキル
基および炭素原子数が１乃至６のハロゲン化アルキル基
からなる群より選ばれる基を表わし；Ｍは、水素原子、
アルカリ金属原子およびアンモニウム基からなる群より
選ばれる原子もしくは基を表わし；そして、Ｌは連結基
を表わす］。

【００２７】上記式（１）において、Ｘは、−ＣＨ＝Ｃ
Ｈ₂で表わされるビニル基であることが望ましい。そし
てＬは、−ＮＨ−、−Ｓ−、および−Ｏ−からなる群か
ら選ばれる連結部位を有する連結基であることが望まし
く、特に−（Ｌ¹）_n−ＮＨＣＨ₂ＣＨ₂−［但し、Ｌ¹は
連結基を表わし、そしてｎは０もしくは１である］で表
わされる連結基であることが望ましい。

【００２８】本発明の反応性電極は、表面に反応性基が
導入された電極に、下記式（２）：

【００２９】

【化７】 Ｘ¹−ＳＯ₂−Ｌ²−ＳＯ₂−Ｘ² …（２）

【００３０】［上記の式において、Ｘ¹およびＸ²は互い
に独立に、−ＣＲ¹＝ＣＲ²Ｒ³、または−ＣＨＲ¹−ＣＲ
²Ｒ³Ｙを表わし；Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は、互いに独立に、
水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原
子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃
至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６
のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基
を表わし；Ｙは、ハロゲン原子、−ＯＳＯ₂Ｒ¹¹、−Ｏ
ＣＯＲ¹²、−ＯＳＯ₃Ｍ、及び四級ピリジニウム基から
なる群より選ばれる原子もしくは基を表わし；Ｒ¹¹は、
炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃
至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアル
キル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキ
ル基からなる群より選ばれる基を表わし；Ｒ¹²は、炭素
原子数が１乃至６のアルキル基および炭素原子数が１乃
至６のハロゲン化アルキル基からなる群より選ばれる基
を表わし；Ｍは、水素原子、アルカリ金属原子およびア
ンモニウム基からなる群より選ばれる原子もしくは基を
表わし；そして、Ｌ²は連結基を表わす］で表わされる
ジスルホン化合物を接触させることにより有利に製造す
ることができる。

【００３１】また、本発明のスペーサ基付きの反応性電
極は、電極表面にビニルスルホニル基もしくはその反応
性前駆体基と反応する基を導入する際に、一方の端部に
電極表面に反応する基を備え、他方の端部にビニルスル
ホニル基もしくはその反応性前駆体基と反応しない（或
は、反応しにくい）基を備えたスペーサ化合物（例、１
−ヘキサンチオール、６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチ
オール）を存在させることによって製造することができ
る。そして、このようにして製造したスペーサ基付きの
反応性電極に、一端に反応性基を備えたＰＮＡを接触さ
せることによって、電極表面にスペーサ基により互いに
空間的に隔離された状態でＰＮＡが共有結合により固定
されたＰＮＡ固定電極を得ることができる。

【００３２】あるいは、本発明のスペーサ基付きの反応
性電極は、電極表面に、まず多数の反応性基を導入し、
次いで、この表面に反応性基を持つ電極に、一方の端部
に該反応性基と反応する基を備え、他方の端部にはＰＮ
Ａの反応性基と反応する基を備えた、ジビニルスルホン
化合物などのジスルホン化合物、そして、一方の端部に
電極の反応性基と反応する基を備え、他方の端部にＰＮ
Ａの反応性基と反応しない（或は、反応しにくい）基を
備えたスペーサ化合物を同時に接触させることによって
も作成することができる。そして、このようにして製造
したスペーサ基付きの反応性電極に、一端に反応性基を
備えたＰＮＡを接触させることにより、電極表面にスペ
ーサ基により互いに空間的に隔離された状態でＰＮＡが
共有結合により固定されたＰＮＡ固定電極を得ることが
できる。

【００３３】上記のようにして作製されたスペーサ基を
介して複数個のＰＮＡが互いに隔離された状態で電極表
面に固定された核酸試料検出用電極は、特に優れた感度
を示す。

【００３４】上記の式（２）で表わされるジスルホン化
合物の代表的な例としては、１，２−ビス（ビニルスル
ホニルアセトアミド）エタンを挙げることができる。

【００３５】上記の電極表面に導入される反応性基は、
アミノ基、メルカプト基もしくはヒドロキシル基である
ことが望ましい。

【００３６】

【発明の実施の形態】本発明の反応性電極は、好ましく
は、電極の表面に、一群のビニルスルホニル基もしくは
その反応性前駆体基がそれぞれ連結基を介して共有結合
により結合固定された構成を有している。このような電
極は、予め表面に反応性基を導入した電極を用意し、こ
の電極と、この電極表面に備えられた反応性基と反応し
て共有結合を形成する反応性基を一方の端部もしくは端
部附近に有し、かつ他方の端部もしくは端部附近にビニ
ルスルホニル基もしくはビニルスルホニル基の反応性前
駆体基を有する化合物とを接触させることにより製造す
ることができる。

【００３７】［電極］本発明の反応性電極の製造に用い
る電極としては、従来より電気化学的検出方法に利用さ
れるＤＮＡ断片検出用電極の製造に一般的に用いられて
いる金電極、あるいはＤＮＡ断片検出用電極の製造用と
して提案されている各種の電極が好ましく利用すること
ができる。

【００３８】電極は通常、外部に出力する端子を備えて
いるものを用いる。電極の材料としては、金以外にも、
グラファイト、グラシーカーボン等の炭素電極、白金、
パラジウム、ロジウム等の貴金属電極、酸化チタン、酸
化スズ、酸化マンガン、酸化鉛等の酸化物電極、Ｓｉ、
Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ等の半導体電極、チタンなどの電
子伝導体を挙げることができるが、金もしくはグラシー
カーボンを用いることが特に好ましい。これらの電子伝
導体は、導電性高分子によって被覆されていても、単分
子膜によって被覆されていてもよい。電極は、例えば、
電極がグラシーカーボンである場合には、電極を過マン
ガン酸カリウムで処理するなどの方法で表面処理してお
くことが好ましい。電極が導電性を持たない基板上に配
置された複数の電極である場合には、電極表面のそれぞ
れに、互いに異なる種類のＰＮＡを固定することが好ま
しい。

【００３９】本発明で用いられる電極は、導電性を持た
ない基板上に複数の電極が配置されたものであることが
好ましい。その場合、電極は、導電性を持たない基板上
に、互いに接しないように、かつ規則的に配置されてい
ることが好ましい。

【００４０】導電性を持たない基板としては、電気絶縁
性の疎水性担体、あるいは電気絶縁性の低親水性の担体
であることが好ましい。また、その表面が凹凸を有する
平面性の低いものであっても好ましく用いることができ
る。基板の材質としては、ガラス、セメント、陶磁器等
のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチ
レンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノール
Ａのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタ
クリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガ
ラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活
性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィ
ルター等の多孔質物質などを挙げることができるが、各
種ポリマー、ガラスもしくはシリコンであることが特に
好ましい。これは、表面処理の容易さや電気化学的方法
による解析の容易さによるものである。基板の厚さは、
特に限定されないが、板状である場合には、１００乃至
１００００μｍの範囲にあることが好ましい。

【００４１】導電性を持たない基板上に複数の電極が配
置されたものとしては、導電性を持たない基板の表面を
上記の電子伝導体で処理したものを用いることが好まし
く、金を蒸着したものを用いることが特に好ましい。基
板は、電子伝導体で表面処理をする前に、基板上に電荷
を有する親水性の高分子物質からなる層や架橋剤からな
る層を設けてもよい。このような層を設けることによっ
て基板の凹凸を軽減することができる。また、基板によ
っては、その基板中に電荷を有する親水性の高分子物質
を含ませることも可能であり、このような処理を施した
基板も好ましく用いることができる。

【００４２】導電性を持たない基板上に複数の電極が配
置されたものとしては、文献（Sosnowski,R.G. et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 94, 1119-1123(1997))に記
載の、核酸が未固定のシリコンチップも好ましく用いる
ことができる。また、プリント配線基板のように、が基
板上に印刷されてなるものであってもよい。

【００４３】電極の表面には、予め区画あるいは想定さ
れた多数の領域が設定されており、各領域毎に、ジビニ
ルスルホン化合物などの二官能性反応性化合物と反応す
ることができる反応性基、例、アミノ基（−ＮＨ₂）、
メルカプト基（−ＳＨ）、あるいはヒドロキシル基（−
ＯＨ）、を導入する。

【００４４】反応性基を備えた電極は、ジビニルスルホ
ン化合物などの二官能性反応性化合物と接触することに
よって、その反応性基と二官能性反応性化合物とが反応
し、共有結合が形成され、電極の反応性基部分が延長さ
れ、その先端もしくは先端附近にビニルスルホニル基も
しくはその反応性前駆体基を持つ反応性鎖が形成され
て、本発明の反応性電極が生成する。

【００４５】本発明の反応性電極において、電極表面に
導入されるビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆
体基と連結基との連結体は、下記の式（１）により表わ
されるものであることが望ましい。

【００４６】

【化８】 −Ｌ−ＳＯ₂−Ｘ −−− （１）

【００４７】上記の式（１）において、Ｘは、−ＣＲ¹
＝ＣＲ²Ｒ³または−ＣＨＲ¹−ＣＲ²Ｒ³Ｙ（反応性前駆
体基）を表わす。Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、それぞれ互い
に独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル
基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、あるいは炭
素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子
が７乃至２６のアラルキル基を表わす。炭素原子数が１
乃至６のアルキル基の例としては、メチル基、エチル
基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、及びｎ−ヘキシル
基を挙げることができ、メチル基であることが特に好ま
しい。アリール基としては、フェニル基及びナフチル基
を挙げることができる。Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は共に水素原
子であることが好ましい。

【００４８】Ｙは、−ＯＨ、−ＯＲ⁰、−ＳＨ、ＮＨ₃、
ＮＨ₂Ｒ⁰（但し、Ｒ⁰は、水素原子を除く、アルキル基
などの基である）などの求核試薬によって置換される
基、あるいは塩基によって「ＨＹ」として脱離する基を
表わし、その例としては、ハロゲン原子、−ＯＳＯ₂Ｒ
¹¹、−ＯＣＯＲ¹²、−ＯＳＯ₃Ｍ、あるいは四級ピリジ
ニウム基を表わす（Ｒ¹¹は、炭素原子数が１乃至６のア
ルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、ある
いは炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭
素原子数が７乃至２６のアラルキル基を表わし；Ｒ
¹²は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基あるいは炭素
原子数が１乃至６のハロゲン化アルキル基を表わし；Ｍ
は、水素原子、アルカリ金属原子あるいはアンモニウム
基を表わす）を挙げることができる。

【００４９】Ｌは、電極もしくは電極に結合している連
結基と、上記−ＳＯ₂−Ｘ基とを連結している二価もし
くはそれ以上の連結基を表わす。ただし、Ｌは単結合で
あってもよい。二価の連結基としては、炭素原子数が１
乃至６のアルキレン基、炭素原子数が３乃至１６の脂肪
族環基、炭素原子数が６乃至２０のアリーレン基、Ｎ、
ＳおよびＰからなる群より選ばれるヘテロ原子を１乃至
３個含む炭素原子数が２乃至２０の複素環基、−Ｏ−、
−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ₂−、−ＳＯ₃−、−ＮＲ
¹¹−、−ＣＯ−およびこれらの組み合わせから群より選
ばれる基を一つあるいは複数個組み合わせてなる基であ
ることが好ましい。Ｒ¹¹は、水素原子、炭素原子数が１
乃至１５のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリ
ール基、あるいは炭素原子数が１乃至６のアルキル基を
有する炭素原子が７乃至２１のアラルキル基であること
が好ましく、水素原子もしくは炭素原子数が１乃至６の
アルキル基であることがさらに好ましく、水素原子、メ
チル基もしくはエチル基であることが特に好ましい。

【００５０】Ｌが−ＮＲ¹¹−、−ＳＯＮＲ¹¹−、−ＣＯ
ＮＲ¹¹−、−ＮＲ¹¹ＣＯＯ−、および−ＮＲ¹¹ＣＯＮＲ
¹¹−からなる群より選ばれる基を二個以上組み合わせて
なる基である場合には、それらのＲ¹¹同士が結合して環
を形成していてもよい。

【００５１】Ｒ¹¹のアルキル基、Ｒ¹¹のアリール基、お
よびＲ¹¹のアラルキル基は、置換基を持っていてもよ
い。このような置換基としては、水酸基、炭素原子数が
１乃至６のアルコキシ基、炭素原子数が１乃至６のアル
ケニル基、炭素原子数が２乃至７のカルバモイル基、炭
素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が２乃至
７のアラルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール
基、スルファモイル基（もしくはそのＮａ塩、Ｋ塩
等）、スルホ基（もしくはそのＮａ塩、Ｋ塩等）、カル
ボン酸基（もしくはそのＮａ塩、Ｋ塩等）、ハロゲン原
子、炭素原子数が１乃至６のアルケニレン基、炭素原子
数が６乃至２０のアリーレン基、スルホニル基、および
これらの組み合わせからなる群より選ばれる原子もしく
は基を挙げることができる。

【００５２】上記「−Ｘ」基の好ましい具体例を以下に
示す。また、「−Ｌ−ＳＯ₂−Ｘ」として使用できる基
の例についても、その後に示す。

【００５３】

【化９】

【００５４】

【化１０】

【００５５】「−Ｘ」は、上記具体例中、（Ｘ１）、
（Ｘ２）、（Ｘ３）、（Ｘ４）、（Ｘ７）、（Ｘ８）、
（Ｘ１３）、あるいは（Ｘ１４）であることが好まし
く、（Ｘ１）あるいは（Ｘ２）であることがさらに好ま
しい。特に好ましいのは（Ｘ１）で表わされるビニル基
である。

【００５６】Ｌの好ましい具体例を以下に示す。但し、
ａは、１乃至６の整数であり、１もしくは２であること
が好ましく、１であることが特に好ましい。ｂは、０乃
至６の整数であり、２もしくは３であることが好まし
い。

【００５７】

【化１１】

【００５８】Ｌとしては、上記記載の二価の連結基の他
に、上記式のアルキレン基の水素原子が−ＳＯ₂ＣＨ＝
ＣＨ₂基によって置換されてなる基も好ましい。

【００５９】前記の式（１）で表わされるビニルスルホ
ニル基もしくは反応性前駆体基が共有結合により固定さ
れた電極を得るために利用される二官能反応性化合物と
しては、下記の式（２）で表わされるジスルホン化合物
が有利に利用できる。

【００６０】

【化１２】 Ｘ¹−ＳＯ₂−Ｌ²−ＳＯ₂−Ｘ² −−− （２）

【００６１】［上記の式において、Ｘ¹およびＸ²は互い
に独立に、−ＣＲ¹＝ＣＲ²Ｒ³、または−ＣＨＲ¹−ＣＲ
²Ｒ³Ｙ（反応性前駆体基）を表わし；Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³
は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６の
アルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及
び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素
原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ば
れる原子もしくは基を表わし；Ｙは、ハロゲン原子、−
ＯＳＯ₂Ｒ¹¹、−ＯＣＯＲ¹²、−ＯＳＯ₃Ｍ、及び四級ピ
リジニウム基からなる群より選ばれる原子もしくは基を
表わし；Ｒ¹¹は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、
炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数
が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃
至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる基を表わ
し；Ｒ¹²は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基および
炭素原子数が１乃至６のハロゲン化アルキル基からなる
群より選ばれる基を表わし；Ｍは、水素原子、アルカリ
金属原子およびアンモニウム基からなる群より選ばれる
原子もしくは基を表わし；そして、Ｌ²は連結基を表わ
す］。

【００６２】すなわち、上記の式（２）で表わされるジ
スルホン化合物を、前記の反応性基を備えた電極と、例
えば水性雰囲気にて接触させることによって、本発明の
反応性電極を容易に製造することができる。

【００６３】本発明で好ましく用いるジスルホン化合物
の代表例を下記に示す。なお、ジスルホン化合物は、二
種類以上を混合して用いてもよい。

【００６４】

【化１３】

【００６５】

【化１４】

【００６６】上記の式（２）で表わされるジスルホン化
合物の代表的な例としては、１，２−ビス（ビニルスル
ホニルアセトアミド）エタン［上記のＳ１に相当する］
を挙げることができる。

【００６７】本発明で用いるジスルホン化合物の合成法
については、たとえば、特公昭４７−２４２９号、同５
０−３５８０７号、特開昭４９−２４４３５号、同５３
−４１５５１号、同５９−１８９４４号等の各種公報に
詳細が記載されている。

【００６８】上記のようにして得られた反応性電極を利
用して、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ断片、あるいはＲＮＡ
断片などの天然起源のポリヌクレオチドあるいはオリゴ
ヌクレオチドなどの核酸試料の検出固定のための本発明
のペプチド核酸固定検出具を作製するためには、上記の
反応性電極を、その担体表面上のビニルスルホニル基も
しくはその反応性前駆体基と反応して共有結合を形成す
るアミノ基などの反応性基を備えたペプチド核酸と接触
させる方法が利用される。そして、このようにして所望
のペプチド核酸からなるプローブ分子を備えた検出具を
作製することができる。

【００６９】本発明の電極表面にビニルスルホニル基も
しくはその反応性前駆体基は、加水分解に対して高い抵
抗性を有しているため、容易に安定に保存することがで
き、また、アミノ基を予め備えているか、あるいはアミ
ノ基などの反応性基が導入されているかペプチド核酸
（ＰＮＡ）の反応性基と迅速に反応して、安定な共有結
合を形成することができる。

【００７０】［ＰＮＡ］本発明で好ましく用いられるＰ
ＮＡは、下記一般式（３）で表される化合物である。

【００７１】

【化１５】（３）

【００７２】式中、Ｂ¹¹は、リガンドであって、天然の
核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、もしくはＵ）あるいは
塩基類似体を表す。Ｂ¹¹は、天然に見出される位置、即
ち、アデニン、グアニンもしくはイノシンを含むプリン
については、９位において、チミン、ウラシルもしくは
シトシンを含むピリミジンについては、１位において結
合している。塩基類似体とは、天然に存在しない核酸塩
基に類似の有機塩基をいい、プリン環やピリミジン環の
一部がＣからＮへ、もしくはＮからＣへ置換された化合
物、またはプリン環やピリミジン環の一部に新たな修飾
を施された化合物（スルフヒドリル基やハロゲン原子が
導入された化合物）をいう。また、Ｂ¹¹は、核酸塩基を
含まない芳香族部分、炭素原子数が１乃至４のアルカノ
イル基、水酸基あるいは水素原子であってもよい。塩基
類似体としては、７−デアザアデニン、６−アザウラシ
ルおよび５−アザシトシンを挙げることができる。

【００７３】典型的な核酸塩基リガンド及び例示的合成
リガンドについては、ＷＯ９２／２０７０２に図示され
ており、５−プロピルチミンおよび３−デアザウラシル
は、ＤＮＡ断片への結合親和性を増加させることが知ら
れている（特開平１１−２３６３９６号公報）。他の有
用な天然にない核酸塩基としては、６−チオグアニンや
ピラゾロ［４，３ｄ］−ピリミジンが有用である（国際
出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４７９５）。

【００７４】さらに、Ｂ¹¹は、ＤＮＡインターカレー
タ、レポーターリガンド（例えば、フルオロフォア）、
ハプテンやビオチンのタンパク質標識、スピン標識、あ
るいは放射性標識であってもよい。Ｂ¹¹は、核酸塩基
（Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧもしくはＵ）であることが特に好まし
い。

【００７５】Ｒ¹¹は、水素原子、もしくは天然のα−ア
ミノ酸の側鎖を表す基を表す。天然のα−アミノ酸の側
鎖を表す基としては、炭素原子数が１乃至６のアルキル
基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、炭素原子数
が１乃至６のアルキル基を含む炭素原子数が７乃至２６
のアラルキル基、炭素原子数が６乃至２０のヘテロアリ
ール基、水酸基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ
基、炭素原子数が１乃至６のアルキルチオ基、−ＮＲ¹³
Ｒ¹⁴基、−ＳＨ基、および炭素原子数が１乃至６のアル
キル基からなる群より選ばれる基であることが好まし
い。炭素原子数が１乃至６のアルキル基は、さらに、水
酸基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基もしくは炭
素原子数が１乃至６のアルキルチオ基で置換されていて
もよい。Ｒ¹³およびＲ¹⁴は、互いに独立に、水素原子、
炭素原子数が１乃至３のアルキル基、炭素原子数が１乃
至３のアルコキシ基、炭素原子数が１乃至３のアルキル
チオ基および水酸基からなる群より選ばれる原子もしく
は水酸基を表す。天然のα−アミノ酸の側鎖を表す基
は、Ｒ¹¹が結合している炭素原子の水素原子と一緒にな
って脂環あるいは複素環を形成していてもよい。

【００７６】Ｌ¹¹は、連結基を表し、−ＣＯ−基もしく
は−ＣＯ−ＮＲ¹²−基であることが好ましく、−ＣＯ−
基であることが特に好ましい。Ｒ¹²は、水素原子、炭素
原子数が１乃至４のアルキレン基、水酸基、炭素原子数
が１乃至４のアルコキシ基およびアミノ基からなる群よ
り選ばれる原子もしくは基を表す。炭素原子数が１乃至
４のアルキレン基、炭素原子数が１乃至４のアルコキシ
基およびアミノ基は、何れも炭素原子数が１乃至４のア
ルキル基、炭素原子数が１乃至４のアルコキシ基もしく
は水酸基で置換されていてもよい。

【００７７】ｄは、１乃至６０の整数を表す。ｄは、１
乃至４０の整数であることが好ましい。ａ、ｂおよびｃ
は、それぞれ独立に０乃至５の整数を表す。ａ、ｂおよ
びｃは、何れも１であることが好ましい。

【００７８】本発明で用いるＰＮＡは、下記一般式(４)
で表される化合物であることが特に好ましい。式中、Ｂ
¹¹およびｄは、それぞれ、上記式（３）のＢ¹¹とｄとを
表わす。

【００７９】

【化１６】(４)

【００８０】なお、ペプチド核酸（ＰＮＡ）はアミノ基
を有しているため、通常は、改めて別に反応性基を導入
する必要はない。ただし、必要に応じて、ペプチド核酸
の一方の末端には、前記のビニルスルホニル基もしくは
その反応性前駆体基と反応して共有結合を形成する反応
性基を導入する。反応性基は、アミノ基、イミノ基、ヒ
ドラジノ基、カルバモイル基、ヒドラジノカルボニル
基、もしくはカルボキシイミド基であることが好まし
く、アミノ基であることが特に好ましい。ペプチド核酸
には、必要により、クロスリンカを介してこれらの反応
性基が結合される。クロスリンカとしては、たとえば、
アルキレン基あるいはＮ−アルキルアミノ−アルキレン
基が利用されるが、ヘキシレン基あるいはＮ−メチルア
ミノ−ヘキシレン基であることが好ましく、ヘキシレン
基であることが特に好ましい。

【００８１】ＰＮＡの電極表面への固定は通常、ＰＮＡ
を含む水性液を、前記の反応性電極上に点着して行な
う。具体的には、反応性基を備えたペプチド核酸を水性
媒体に溶解あるいは分散して水性液としたのち、その水
性液を、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレート
に分注し、分注した水性液をスポッター装置等を用いて
電極表面上に滴下して行なうことが好ましい。

【００８２】点着後、所定の温度でそのまま数時間放置
すると、電極表面にて共有結合反応が進行し、ＰＮＡの
一端が電極表面にて固定される。点着の条件は、使用す
る電極の種類、電極の大きさなどによって異なる。点着
は、マニュアル操作によっても行うことができるが、汎
用されているＤＮＡチップ作製装置に装備されたスポッ
タを用いて行うことも好ましい。点着後は、インキュベ
ーションを行うことも好ましい。インキュベート後、固
定されていないＰＮＡを洗浄して除去することが好まし
い。

【００８３】点着後のペプチド核酸の乾燥を防ぐため
に、ペプチド核酸が溶解あるいは分散してなる水性液中
に、高沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質とし
ては、点着後のペプチド核酸が溶解あるいは分散してな
る水性液に溶解し得るものであって、検出対象の核酸断
片試料（標的核酸断片）などの試料とのハイブリダイゼ
ーションを妨げることがなく、かつ粘性があまり大きく
ない物質であることが好ましい。このような物質として
は、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホ
キシドおよび低分子の親水性ポリマーを挙げることがで
きる。親水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、
ポリエチレングリコール、そしてポリアクリル酸ナトリ
ウム等を挙げることができる。このポリマーの分子量
は、１０³乃至１０⁶の範囲にあることが好ましい。高沸
点の物質としては、グリセリンあるいはエチレングリコ
ールを用いることがさらに好ましく、グリセリンを用い
ることが特に好ましい。高沸点の物質の濃度は、ペプチ
ド核酸の水性液中、０．１乃至２容量％の範囲にあるこ
とが好ましく、０．５乃至１容量％の範囲にあることが
特に好ましい。

【００８４】また、同じ目的のために、ペプチド核酸を
点着した後の電極を、９０％以上の湿度および２５乃至
５０℃の温度範囲の環境に置くことも好ましい。

【００８５】反応性基を有するペプチド核酸を点着後、
紫外線、水素化ホウ素ナトリウムあるいはシッフ試薬に
よる後処理を施してもよい。これらの後処理は、複数の
種類を組み合わせて行ってもよく、特に加熱処理と紫外
線処理を組み合わせて行うことが好ましい。点着後は、
インキュベーションを行うことも好ましい。インキュベ
ート後は、未反応のペプチド核酸を洗浄して除去するこ
とが好ましい。

【００８６】ペプチド核酸の固定量（数）は、電極表面
に対して、１０²乃至１０⁵種類／ｃｍ²の範囲にあるこ
とが好ましい。ペプチド核酸の量は、１乃至１０^-15モ
ルの範囲にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが
好ましい。点着によって、ペプチド核酸の水性液は、電
極表面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、
ほとんど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子
発現の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要で
ある。それぞれのドット間の距離は、０乃至１．５ｍｍ
の範囲にあることが好ましく、１００乃至３００μｍの
範囲にあることが特に好ましい。一つのドットの大きさ
は、直径が５０乃至３００μｍの範囲にあることが好ま
しい。電極表面に点着するペプチド核酸の量は、１００
ｐＬ乃至１μＬの範囲にあることが好ましく、１乃至１
００ｎＬの範囲にあることが特に好ましい。

【００８７】図１と図２に、本発明の代表的な態様であ
る反応性電極の製造方法、および代表的なペプチド核酸
（ＰＮＡ）固定電極の製造方法と構成を模式的に示す。

【００８８】図１は、アミノ基が表面に導入された電極
に、１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エ
タンに代表される、両端部のそれぞれにビニルスルホニ
ル基を備えた反応性化合物（ＣＨ₂＝ＣＨ−ＳＯ₂−Ｌ−
ＳＯ₂−ＣＨ＝ＣＨ₂）を接触させて、先端に反応性のＬ
−ＳＯ₂−ＣＨ＝ＣＨ₂を備えた反応性電極を製造したの
ち、次いでこの反応性電極にアミノ基を備えたＰＮＡ
（ペプチド核酸）を接触させて、ＰＮＡを共有結合によ
り電極に固定させる工程を示している。

【００８９】図２は、電極表面に、複数個のＰＮＡのそ
れぞれを複数個のスペーサ基により隔離して固定するた
めの工程を模式的に示している。すなわち、たとえば、
予め表面に反応性基（Ｘ）を備えた電極に、一方の端部
に反応性基Ｘと反応する反応性基Ｙを有し、他方の端部
に該反応性基と反応しない（或は、反応しにくい）不活
性基Ｚとを備えたスペーサ導入化合物と、両方の端部に
反応性基Ｙを備えた化合物とを一緒に接触させることに
より、表面に不活性基Ｚと反応性基Ｙの双方が固定され
た反応性電極を得て、次いでこれに一方の端部に反応性
基Ｘを備えたＰＮＡを接触させることによって、スペー
サ基を介して互いに隔離された状態で電極表面に固定さ
れたＰＮＡ（ペプチド核酸）固定電極を得ることができ
る。

【００９０】本発明の検出用電極の検出対象となる核酸
試料としては、通常、その配列や機能が未知であるＤＮ
Ａ断片試料あるいはＲＮＡ断片試料などの核酸試料が用
いられる。

【００９１】核酸試料は、遺伝子発現を調べる目的で
は、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが
好ましい。試料がゲノムならば、赤血球を除く任意の組
織サンプルから単離することが好ましい。赤血球を除く
任意の組織は、抹消血液リンパ球、皮膚、毛髪、精液等
であることが好ましい。試料がｍＲＮＡならば、ｍＲＮ
Ａが発現される組織サンプルから抽出することが好まし
い。ｍＲＮＡは、逆転写反応により標識ｄＮＴＰ（「ｄ
ＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、
グアニン（Ｇ）もしくはチミン（Ｔ）であるデオキシリ
ボヌクレオチドを意味する。）を取り込ませて標識ｃＤ
ＮＡとすることが好ましい。ｄＮＴＰとしては、化学的
な安定性のため、ｄＣＴＰを用いることが好ましい。一
回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡ量は、点
着する液量や標識方法によって異なるが、数μｇ以下で
ある。なお、ペプチド核酸固定電極上のＰＮＡが低分子
のものである場合には、核酸断片試料は低分子化してお
くことが望ましい。原核生物の細胞では、ｍＲＮＡの選
択的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを標識することが好
ましい。

【００９２】核酸試料は、遺伝子の変異や多型を調べる
目的では、標識プライマーもしくは標識ｄＮＴＰを含む
反応系において標的領域のＰＣＲを行なって得ることが
好ましい。

【００９３】ハイブリダイゼーションは、９６穴もしく
は３８４穴プラスチックプレートに分注しておいた、標
識した核酸試料が溶解あるいは分散してなる水性液を、
本発明のペプチド核酸固定電極上に点着することによっ
て実施することが好ましい。点着の量は、１乃至１００
ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼーシ
ョンは、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして６乃至２
０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイ
ゼーションの終了後に、界面活性剤と緩衝液との混合溶
液を用いて洗浄を行い、未反応の核酸断片試料を除去す
ることが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液
としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝
液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができ
るが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。

【００９４】ペプチド核酸を固定した電極を用いるハイ
ブリダイゼーションの特徴は、標識した核酸断片試料の
使用量を非常に少なくできることである。そのため、電
極に固定するペプチド核酸の鎖長や標識した核酸試料の
種類により、ハイブリダイゼーションの最適条件を設定
する必要がある。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝
子も十分に検出できるように、長時間のハイブリダイゼ
ーションを行うことが好ましい。一塩基変異の検出に
は、短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ま
しい。

【００９５】［導電性基で標識された縫い込み型インタ
ーカレータ］ハイブリダイゼーション操作の実施に際し
て用いられる、導電性基を有する縫い込み型インターカ
レータとしては、特開平９−２８８０８０号公報および
文献（J.Chem.Soc.Commun.,1111(1998)）に記載のイン
ターカレータを用いることが特に好ましい。

【００９６】さらに、該インターカレータとしては、下
記式（５）で表されるものも好ましく用いることができ
る。下記の式（５）で表されるインターカレータは、印
加電圧が４００乃至６００ｍＶの範囲にピーク電流値を
有する特徴を持つ。

【００９７】

【化１７】（５）

【００９８】上記の式（５）において、Ｎ−置換−イミ
ノ基は、縫い込み型インターカレータに可溶性を付与す
る基であり、ＲおよびＲ¹は、互いに独立に、水素原
子、そして、置換基を有していてもよい炭素原子数が１
乃至３のアルキル基、炭素原子数が２乃至４のアシル
基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基および炭素原
子数が１乃至３のアルキル基を有する炭素原子数が７乃
至２３のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もし
くは基を表す。炭素原子数が１乃至３のアルキル基とし
ては、メチル基もしくはエチル基であることが好まし
く、メチル基であることが特に好ましい。炭素原子数が
２乃至４のアシル基としては、アセチル基であることが
好ましい。炭素原子数が６乃至２０のアリール基として
は、フェニル基もしくはナフチル基であることが好まし
く、フェニル基であることが特に好ましい。炭素原子数
が１乃至３のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至２
３のアラルキル基としては、ベンジル基であることが好
ましい。ＲおよびＲ¹は、同一の原子もしくは基である
ことが好ましく、メチル基であることが特に好ましい。

【００９９】置換基としては、ヒドロキシル基、ハロゲ
ン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ等）、カルボキシル基、炭素原
子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が１乃至６の
アルキルアミノ基、炭素原子数が１乃至６のハロゲン化
アルキル基、炭素原子数が６乃至１２のアリール基、お
よび炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基からなる群よ
り選ばれる原子もしくは基を挙げることができる。置換
基の数は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原
子数が１乃至６のアルキルアミノ基、炭素原子数が１乃
至６のハロゲン化アルキル基、あるいは炭素原子数が１
乃至６のアルコキシ基については、１乃至１２個である
ことが好ましく、１乃至３個であることさらに好まし
く、１個であることが特に好ましい。炭素原子数が６乃
至１２のアリール基については、その数は１乃至７個で
あることが好ましく、１乃至３個であることがさらに好
ましく、１個であることが特に好ましい。

【０１００】ＹおよびＹ¹は、互いに独立に、−ＮＨ−
ＣＯ−基もしくは−ＣＯ−ＮＨ−基を表し、−ＮＨ−Ｃ
Ｏ−基であることが好ましい。これらの基のカルボニル
基もしくはイミノ基が、それぞれ、ＥおよびＥ¹と結合
する。

【０１０１】ＥおよびＥ¹は、互いに独立に、一つの結
合手を有するフェロセンを表す。当該フェロセンは、置
換基を有していても有していなくてもよい。置換基を有
している場合には、同一であることが好ましい。以下
に、置換基を有するフェロセンの具体例を示す。置換基
の位置は、シクロペンタジエニル基の何れの位置であっ
てもよい。

【０１０２】

【化１８】

【０１０３】ＸおよびＺは、互いに独立に、水素原子、
ハロゲン原子、あるいは炭素原子数１乃至６のアルキル
基を表すが、水素原子であることが好ましい。炭素原子
数１乃至６のアルキル基の好ましい例としては、前記記
載のＲ（もしくはＲ¹）と同様である。

【０１０４】ｍ、ｎ、ｋおよびｐは、縫い込み型インタ
ーカレータのリンカー部分の長さを決定するものであ
り、各々、１乃至６の整数を表す。但し、ｍとｎとの
和、およびｋとｐとの和は、各々、４乃至８である。ｍ
とｋ、およびｎとｐとは、それぞれ、同一の数であるこ
とが好ましく、ｍ、ｎ、ｋおよびｐは、何れも３である
ことが特に好ましい。

【０１０５】上述の導電性基で標識された縫い込み型イ
ンターカレータは、例えば、特開平９−２８８０８０号
公報に記載の方法によって簡便に収率良く製造すること
ができる。

【０１０６】本発明のＰＮＡ固定電極を用いる核酸試料
の検出に際しては、下記の式（６）で表わされる導電性
基で標識された縫い込み型インターカレータを用いるこ
とが特に好ましい。下記の式（６）で表されるインター
カレータは、印加電圧１００乃至４００ｍＶの範囲にピ
ーク電流値を有する性質を持つ。

【０１０７】

【化１９】Ｅ_a−Ｌ_a−Ｘ−Ｌ_b−Ｅ_b −− （６）

【０１０８】［ただし、Ｅ_aおよびＥ_bは、互いに独立
に、酸化還元活性を示し、かつ共役系を含む基を表わ
し、Ｘは二価の環状基を表わし、そしてＬ_aおよびＬ
_bは、互いに独立に、それぞれがＥ_aおよびＥ_bの共役系
が延長される共役系を形成することのない連結基であっ
て、少なくとも一方の連結基が、本化合物に水溶性を付
与する部位を有する連結基もしくは水溶性を付与する部
位に変換し得る部位を有する連結基である。］

【０１０９】上記式（６）において、Ｅ_aとＥ_b、そして
Ｌ_aとＬ_bとが、それぞれ、互いに同一の基であることが
好ましい。また、Ｌ_a−Ｘ−Ｌ_bで表わされる連結部の主
鎖の最短の結合路を構成する原子の数が１０乃至１００
の間、なかでも１５乃至７０の間、特に２０乃至５０の
間にあることが好ましい。なお、この連結部の主鎖の最
短の結合路を構成する原子の数の計算を、前記のフェロ
センカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
に適用すると、その原子の数は３２となる。

【０１１０】また、Ｅ_aおよびＥ_bは、互いに独立に、そ
れぞれ置換基を有していてもよい、一もしくは二以上の
結合手を持つメタロセン、２，２’−ビピリジン錯体、
シクロブタジエン錯体、シクロペンタジエニル錯体、
１，１０−フェナントロリン錯体、トリフェニルホスフ
ィン錯体、カテコールアミンおよびビオローゲンからな
る群より選ばれる酸化還元活性基であることが好まし
い。

【０１１１】上記式（６）の化合物は、特に下記式
（７）で表わされる化合物であることが好ましい。

【０１１２】

【化２０】 Ｅ_a−Ｌ_1a−Ｌ_2a−Ｘ−Ｌ_2b−Ｌ_1b−Ｅ_b −− （７）

【０１１３】［但し、Ｅ_aおよびＥ_bは、互いに独立に、
酸化還元活性を有し、かつ共役系を含む基を表わし、Ｌ
_1aおよびＬ_1bは、互いに独立に、それぞれがＥ_aおよび
Ｅ_bの共役系が延長される共役系を形成しない基を表わ
し、Ｌ_2aおよびＬ_2bは、互いに独立に、水溶性を付与す
る部位を有する連結基もしくは水溶性を付与する部位に
変換し得る部位を有する連結基を表わし、そしてＸは二
価の環状基を表わす。］

【０１１４】Ｌ_1aおよびＬ_1bは、互いに独立に、置換基
を有していてもよい炭化水素基、特に、置換基を有して
いてもよい炭素原子数が１乃至６のアルキレン基あるい
は置換基を有していてもよい炭素原子数が１乃至６のア
ルケニレン基であることが好ましい。

【０１１５】Ｌ_2aおよびＬ_2bは、互いに独立に、炭素元
素以外の元素（例、Ｎ、Ｏ、もしくはＳ）を含む連結基
であることが好ましく、特に、置換基を有していてもよ
い、アミド結合基、エステル結合基、エーテル結合基、
チオエーテル結合基、ジイミド結合基、チオジイミド結
合基、チオアミド結合基、イミノ結合基、カルボニル結
合基、チオカルボニル結合基および１，４−ピペラジニ
ル基からなる群より選ばれる基を含む連結基であること
が好ましい。最も好ましいのは、−ＮＨＣＯ−基、もし
くは−ＣＯＮＨ−基である。なお、Ｅ_aとＥ_b、Ｌ_1aとＬ
_1b、そしてＬ_2aとＬ_2bとが、それぞれ、互いに同一の基
であることが有利である。

【０１１６】上記式（６）および（７）の縫い込み型イ
ンターカレータを用いると、核酸断片の検出操作におい
て電極基板付与する電位として、１００乃至４００ｍＶ
の範囲内の相対的に低い電位が利用できる。

【０１１７】式（６）および式（７）において、Ｘは、
置換基を有していてもよい二価の環状基を表す。二価の
環状基としては、平面性を有する環状基であることが好
ましく、二つの窒素原子に結合手を有するナフタレンジ
イミド基、２位と６位、もしくは１位と５位（好ましく
は２位と６位）とに結合手を有するアントラセン基、ア
ントラセン基と同じ位置に結合手を有するアントラキノ
ン基、２位と６位とに結合手を有するフルオレン基、２
位と６位とに結合手を有するビフェニレン基、２位と７
位とに結合手を有するフェナントレン基、および２位と
７位とに結合手を有するピレン基からなる群より選ばれ
る環状基であることが好ましく、二つの窒素原子に結合
手を有するナフタレンジイミド基であることが特に好ま
しい。置換基としては、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、
Ｃｌ、Ｂｒ等）、あるいは炭素原子数１乃至６のアルキ
ル基であることが好ましいが、水素原子であることが好
ましい。炭素原子数１乃至６のアルキル基としては、メ
チル基、エチル基、もしくはｎ−プロピル基であること
が好ましい。

【０１１８】前記式（６）において、Ｌ_aおよびＬ_bは、
互いに独立に、それぞれがＥ_aおよびＥ_bの共役系が延長
される共役系を形成することのない連結基であって、少
なくとも一方の連結基が、本化合物に水溶性を付与する
部位を有する連結基もしくは水溶性を付与する部位に変
換し得る部位を有する連結基である。ここで、「水溶性
を付与する部位に変換し得る部位」とは、たとえば、メ
チル基を置換基として有するイミノ基のように、硫酸な
どの酸と接触した場合に、硫酸塩部位に変換され、水溶
性を示すように変化する部位を有する。勿論、「本化合
物に水溶性を付与する部位」に塩部分のような荷電部分
を持っていてもよい。

【０１１９】Ｌ_aおよびＬ_bは、互いに独立に、Ｅ_aおよ
びＥ_bに隣接する側に、置換基を有していてもよい炭化
水素基（前記式（７）のＬ_1aとＬ_1bに相当する基）を有
し、一方、Ｘに隣接する側に炭素元素以外の元素を含む
連結基（前記式（７）のＬ_2aとＬ_2bに相当する基）とか
らなる連結基であることが好ましい。従って、Ｌ_aおよ
びＬ_bは、それぞれ、前記式（７）の−Ｌ_1a−Ｌ_2a−、
そして−Ｌ_2b−Ｌ_1b−に該当する連結基であることが望
ましい。ここで、Ｌ_1aとＬ_1bは、互いに独立に、置換基
を有していてもよい炭素原子数が１乃至６のアルキレン
基あるいは置換基を有していてもよい炭素原子数が２乃
至６のアルケニレン基であることが好ましく、一方、Ｌ
_2aとＬ_2bとは、互いに独立に、Ｎ、Ｏ、もしくはＳを含
む連結基であることが望ましい。

【０１２０】Ｌ_1aおよびＬ_1bの置換基としては、ヒドロ
キシル基、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、
シアノ基、ニトロ基、ホルミル基、ホルミルアミノ基、
炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が１乃
至６のアルキルアミノ基、炭素原子数が１乃至６のハロ
ゲン化アルキル基、炭素原子数が５乃至７のシクロアル
キルアミノ基、炭素原子数が２乃至１２のジアルキルア
ミノ基、炭素原子数が６乃至１２のアリール基、炭素原
子数が１乃至６のアルキル基を有する炭素原子数が７乃
至１８のアラルキル基、１乃至６のアルキル基を有する
炭素原子数が７乃至１８のアラルキルアミノ基、炭素原
子数が２乃至７のアルカノイル基、炭素原子数が２乃至
７のアルカノイルアミノ基、炭素原子数が３乃至１０の
Ｎ−アルカノイル−Ｎ−アルキルアミノ基、アミノカル
ボニル基、炭素原子数が２乃至７のアルコキシカルボニ
ル基、Ｓ、ＮおよびＯからなる群より選ばれるヘテロ原
子を１乃至４個含む炭素原子数２乃至１０の複素環基、
並びに置換基として炭素原子数１乃至６のアルキル基、
炭素原子数１乃至６のアルコキシ基、もしくはハロゲン
原子を１乃至５個有していてもよい環構成炭素原子数の
数が６乃至１２のアリール基からなる群より選ばれる原
子もしくは基である。置換基の数は、炭素原子数が１乃
至６のアルキレン基では、１乃至１２個であることが好
ましく、１乃至３個であることが特に好ましい。炭素原
子数が１乃至６のアルケニレン基については、その数は
１乃至１０個であることが好ましく、１乃至３個である
ことが特に好ましい。

【０１２１】Ｌ_2aとＬ_2bとは、互いに独立に、それぞ
れ、置換基を有していてもよい、アミド結合基、エステ
ル結合基、エーテル結合基、チオエーテル結合基、ジイ
ミド結合基、チオジイミド結合基、チオアミド結合基、
イミノ結合基、カルボニル結合基、チオカルボニル結合
基および１，４−ピペラジニル基からなる群より選ばれ
る基を一個もしくは複数個含む連結基であることが好ま
しく、特に好ましいのはアミド基（−ＮＨＣＯ−基、も
しくは−ＣＯＮＨ−基）である。

【０１２２】Ｌ_2aとＬ_2bの置換基の例としては、炭素原
子数が１乃至３のアルキル基、炭素原子数が２乃至４の
アシル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基および
炭素原子数が１乃至３のアルキル基を有する炭素原子数
が７乃至２３のアラルキル基からなる群より選ばれる基
で置換されていてもよい。炭素原子数が１乃至３のアル
キル基としては、メチル基もしくはエチル基であること
が好ましく、メチル基であることが特に好ましい。炭素
原子数が２乃至４のアシル基としては、アセチル基であ
ることが好ましい。炭素原子数が６乃至２０のアリール
基としては、フェニル基もしくはナフチル基であること
が好ましく、フェニル基であることが特に好ましい。炭
素原子数が１乃至３のアルキル基を有する炭素原子数が
７乃至２３のアラルキル基としては、ベンジル基である
ことが好ましい。

【０１２３】Ｌ_2aとＬ_2bがイミノ結合基である場合、そ
の置換基としては、メチル基であることが特に好まし
い。従って、Ｌ_2aとＬ_2bは、それぞれ独立に、Ｎ−メチ
ル−ジ（ｎ−プロピレニル）イミノ基、１，４−ジ（ｎ
−プロピレニル）−ピペラジニル基であることがさらに
好ましく、Ｎ−メチル−ジ（ｎ−プロピレニル）イミノ
基であることが特に好ましい。

【０１２４】Ｅ_aおよびＥ_bは、酸化還元活性を有し、こ
れによって導電性を付与する基であり、互いに独立に、
置換基を有していてもよい、一つ以上の結合手を持つメ
タロセン、２，２’−ビピリジン錯体、シクロブタジエ
ン錯体、シクロペンタジエニル錯体、１，１０−フェナ
ントロリン錯体、トリフェニルホスフィン錯体、カテコ
ールアミン、あるいはビオローゲンなどであることが好
ましい。置換基を有していてもよい一つの結合手を持つ
フェロセンであることが特に好ましい。Ｅ_aおよびＥ_bは
互いに同一の基であることが好ましい。次に、置換基を
有するフェロセンの具体例を示す。置換基の位置は、シ
クロペンタジエニル基の何れの位置であってもよい。

【０１２５】

【化２１】

【０１２６】上記の式（６）および（７）の縫い込み型
インターカレータとして有利に用いることのできる化合
物は、例えば、公知のジアミン化合物を原料として、公
知の方法（特開平９−２８８０８０号公報）に準じる製
造方法によって簡便に製造することができる。

【０１２７】また式（６）および（７）の化合物は、公
知のジアミン化合物を出発物質とする下記の式で代表さ
れる合成ルートによっても安価に、かつ収率良く製造す
ることができる。

【０１２８】

【化２２】

【０１２９】［導電性基で標識されたカチオン性分子］
ハイブリダイゼーション操作の実施に際しては、上記の
縫い込み型インターカレータの代わりに、導電性基を持
つカチオン性分子を用いてもよい。このカチオン性分子
は、核酸試料の負電荷を持ったリン酸エステル基との静
電気的な相互作用によって、核酸試料とイオン複合体を
形成する。本発明で用いるカチオン性分子は、正電荷を
有しているものであれば、高分子化合物であっても、あ
るいは低分子化合物であってもよい。ハイブリダイゼー
ションで用いる核酸試料の負電荷を中和するため、核酸
試料が有するすべての負電荷に対応するべく、核酸塩基
の数以上の正電荷を有する分子であることが好ましい。
従って、導電性基で標識されたカチオン性分子は、導電
性基を有し、かつカチオン性基を有するポリマーである
ことが好ましい。

【０１３０】導電性基を有し、かつカチオン性基を有す
るポリマーは、カチオン性基と導電性基を有するモノマ
ーのポリマー（ＭＰ）であっても、カチオン性基を有す
るモノマーと導電性基を有するモノマーとのコポリマー
（ＣＰ）であってもよい。モノマーのポリマー（ＭＰ）
およびコポリマー（ＣＰ）は、それぞれ、カチオン性基
や導電性基を持たないモノマー（ＮＭ）とのコポリマー
をさらに形成してもよい。この場合、コポリマー中のＭ
Ｐの割合およびコポリマー中のＣＰの割合は、それぞ
れ、１乃至９９質量％の範囲にあることが好ましく、５
乃至９５質量％の範囲にあることが特に好ましい。

【０１３１】導電性基を有し、かつカチオン性基を有す
るポリマーは、公知の方法によって製造することができ
る。例えば、エチレン系不飽和結合を有する化合物を用
いてラジカル重合によって製造することができる。導電
性基およびカチオン性基は、モノマーの段階で導入して
も、重合後にポリマーに導入してもよく、あるいは、導
電性基やカチオン性基に誘導される反応性基の前駆体を
モノマーに導入しておき、重合後に、対応する導電性基
や対応するカチオン性基に変換したものであってもよ
い。導電性基やカチオン性基を重合後に導入する場合に
は、デンプン、セルロース、デキストラン、アガロー
ス、ゼラチン、プルラン等の天然高分子を用いてもよ
い。

【０１３２】好ましいモノマーの具体例を以下に示す。
アクリル酸、メタクリル酸およびそのエステル類として
は、例えば、アクリル酸、メチルアクリレート、ブチル
アクリレート、ベンジルアクリレート、ヒドロキシエチ
ルアクリレート、−ＣＨ₂＝ＣＨＣＯＯ（ＣＨ₂ＣＨ
₂Ｏ）_nＲ²²（Ｒ²²は、水素原子もしくは炭素原子数が１
乃至６のアルキル基を表し；ｎは、１以上の整数を表
す）、メタクリル酸、メチルメタクリレート、エチルメ
タクリレート、ベンジルメタクリレート、ヒドロキシエ
チルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレー
ト、２−メトキシエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルアミノエチルメタクリレート、２−スルホエチルメ
タクリレート等を挙げることができる。

【０１３３】エチレン系不飽和カルボン酸のアミド類と
しては、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アク
リロイルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミ
ド、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン
酸（もしくはその塩）等を挙げることができる。アミン
類としては、アリルアミン、エチルイミン、ビニルアミ
ン等を挙げることができる。ポリオルニチン、ポリリジ
ンなどのポリアミノ酸も好ましい。芳香族類としては、
スチレン、ビニルトルエン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、
ｐ−ビニル安息香酸、ビニルナフタレン等を挙げること
ができる。また、他のビニル系モノマーとして、エチレ
ン、プロピレン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、トリフ
ロロエチレン、トリフロロクロロエチレン、酢酸ビニ
ル、プロピオン酸ビニル、ビニルアルコール、Ｎ−ビニ
ルピロリドン、Ｎ−ビニルアセトアミド、アクリロニト
リル、メタクリロニトリル等を用いることもできる。

【０１３４】カチオン性基は、ポリマーの側鎖に存在す
ることが好ましく、側鎖の末端に存在することが特に好
ましい。好ましいカチオン性基としては、アンモニウム
カチオン性基（−Ｎ⁺Ｒ³¹Ｈ₂、−Ｎ⁺Ｒ³¹Ｒ³²Ｈ、−Ｎ⁺
Ｒ³¹Ｒ³²Ｒ³³）、オキソニウムカチオン性基（−Ｏ⁺Ｒ
³¹Ｈ、−Ｏ⁺Ｒ³¹Ｒ³²）、スルホニウムカチオン性基
（−Ｓ⁺Ｒ³¹Ｈ、−Ｓ⁺Ｒ³¹Ｒ³²）、セレノニウムカチオ
ン性基（−Ｓｅ⁺Ｒ³¹Ｈ、−Ｓｅ⁺Ｒ³¹Ｒ³²）、（−Ｐ⁺
Ｒ³¹Ｈ₂、−Ｐ⁺Ｒ³¹Ｒ³²Ｈ、−Ｐ⁺Ｒ³¹Ｒ³²Ｒ³³）、ア
ルソニウムカチオン性基（−Ａｓ⁺Ｒ³¹Ｈ、−Ａｓ⁺Ｒ³¹
Ｒ³²）、スチボニウムカチオン性基（−Ｓｂ⁺Ｒ³¹Ｈ、
−Ｓｂ⁺Ｒ³¹Ｒ³²）、クロロニウムカチオン性基（−Ｃ
ｌ⁺Ｒ³¹）、ブロモニウムカチオン性基（−Ｂｒ⁺Ｒ³¹）
およびヨードニウムカチオン性基（−Ｉ⁺Ｒ¹¹）を挙げ
ることができるが、アンモニウムカチオン性基、オキソ
ニウムカチオン性基、ホスホニウムカチオン性基もしく
はスルホニウムカチオン性基であることがより好まし
く、アンモニウムカチオンであることが特に好ましい。

【０１３５】Ｒ³¹、Ｒ³²およびＲ³³は、互いに独立に、
水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原
子数が１乃至６のアルコキシ基、炭素原子数が６乃至２
０のアリール基、および炭素原子数が１乃至６のアルキ
ル基を有する炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基か
らなる群より選ばれる原子もしくは基であることが好ま
しく、炭素原子数が１乃至６のアルキル基であることが
特に好ましい。これらの基は、さらに置換されていても
よい。Ｒ³¹、Ｒ³²およびＲ³³は、共同してそれらが付い
ているヘテロ原子等と一緒に環を形成する原子群であっ
てもよい。例えば、モルホリニウム基、ピリジニウム
基、ピロリウム基、イミダゾリウム基、ピラゾリウム
基、２−ピロリニウム基、ピロリジウム基、２−イミダ
ゾリジニウム基、ピペリジニウム基およびインドリニウ
ム基を挙げることができる。

【０１３６】炭素原子数が１乃至６のアルキル基として
は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル
基、ｎ−ペンチル基、シクロペンチル基、ｎ−ヘキシル
基もしくはシクロヘキシル基であることが好ましく、メ
チルであることが特に好ましい。

【０１３７】標識は、ピーク電流値が印加する電位に依
存するような互いに異なる二種類以上の導電性基を用い
て行なってもよい。導電性基としては、結合手を有す
る、下記に記載の有機金属化合物と、金属原子を含まな
いが導電性を有する物質とを挙げることができる。尚、
下記には、結合手を持たない構造を示す。

【０１３８】有機金属化合物としては、配位子から中心
金属原子の電子供与に加えて、中心金属原子の軌道から
配位子の原子の空軌道へ電子がπ結合を通じて供与され
るタイプのπ錯体を用いることが好ましい。また、有機
金属化合物としては、繰り返し単位同士が配位結合によ
って互いに結合している配位高分子も好ましく用いるこ
とができる。π錯体は、金属原子に対する配位が、単座
配位、二座配位、多座配位もしくは架橋配位の何れの配
位によるものであってもよい。π錯体の具体例として
は、下記式に示すメタロセン錯体をあげることができ
る。Ｍは、金属原子を表す。

【０１３９】

【化２３】

【０１４０】メタロセン錯体の金属原子は、Ｆｅ、Ｎ
ｉ、Ｃｏ、Ｍｏ、Ｚｎ、Ｃｒ、Ｔｌ、Ｔａ、Ｔｉ、Ｃ
ｕ、Ｍｎ、Ｗ、Ｖ、ＲｕもしくはＯｓであることが好ま
しく、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｒｕ、Ｏｓ、ＶもしくはＣｒ
であることがさらに好ましく、Ｆｅ（このとき、メタロ
セン錯体は、フェロセンである）であることが特に好ま
しい。

【０１４１】π錯体としては、下記の式で表されるシク
ロブタジエン錯体、シクロペンタジエニル錯体、フェナ
ントロリン錯体、ビピリジル錯体もしくはトリフェニル
ホスフィン錯体も好ましく用いることができる。フェナ
ントロリン錯体としては、トリス（フェナントロリン）
亜鉛錯体、トリス（フェナントロリン）ルテニウム錯
体、トリス（フェナントロリン）コバルト錯体、ジ（フ
ェナントロリン）亜鉛錯体、ジ（フェナントロリン）ル
テニウム錯体、ジ（フェナントロリン）コバルト錯体お
よびフェナントロリンプラチナ錯体を挙げることができ
る。ビピリジル錯体としては、ビピリジルプラチナ錯
体、トリス（ビピリジル）亜鉛錯体、トリス（ビピリジ
ル）ルテニウム錯体、トリス（ビピリジル）コバルト錯
体、ジ（ビピリジル）亜鉛錯体、ジ（ビピリジル）ルテ
ニウム錯体、およびジ（ビピリジル）コバルト錯体を挙
げることができる。

【０１４２】導電性化合物として、クロロフルオロヘ
ム、クロロフィリド、クロロフィル、ヘム、ビタミンＢ
₁₂等のポルフィリン系錯体も好ましく用いることができ
る。

【０１４３】金属原子を含まない導電性化合物として
は、下記の式で表されるビオロゲン、２，２’−ビピリ
ジン、１，１０−フェナントロリン、カテコールアミン
等を挙げることができる。但し、Ｒ^A、Ｒ^Bは、互いに独
立に、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数
が１乃至６のアルコキシ基、炭素原子数が６乃至１２の
アリール基、並びにＮ、ＯおよびＳからなる群より選ば
れるヘテロ原子を１乃至４個含む炭素原子数が２乃至１
２の複素環基からなる群より選ばれる基であることが好
ましい。上記のアルキル基、アルコキシ基、アリール基
及び複素環基は、何れも炭素原子数が１乃至６のアルキ
ル基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基および炭素
原子数が６乃至１０のアリール基からなる群より選ばれ
る基で置換されていてもよい。Ｒ^A、Ｒ^Bは、何れも、炭
素原子数が１乃至６のアルキル基もしくは炭素原子数が
６乃至１２のアリール基であることがさらに好ましく、
フェニル基であることが特に好ましい。

【０１４４】

【化２４】

【０１４５】導電性基で標識されたカチオン性分子は、
公知の方法、例えば、カチオン性分子が有するアミノ基
と導電性物質が有するカルボン酸との脱水縮合によって
容易に合成することができる。

【０１４６】［酸化酵素および基質］本発明の増感型測
定法において酸化酵素として用いる酵素は、酸素から過
酸化水素を生じる二電子還元を行なう酵素であれば特に
制限されない。グルコースオキシダーゼ、コレステロー
ルオキシダーゼ、ウリカーゼ、アミンオキシダーゼ等を
好ましく使用することができる。グルコースオキシダー
ゼによって過酸化水素を発生する基質としては、グルコ
ースを使用する。コレステロールオキシダーゼの場合に
は、基質としてコレステロールを使用する。

【０１４７】グルコースオキシダーゼは、Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒもしくはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕ
ｍ ｎｏｔａｔｕｍ由来のものを用いることが好まし
い。コレステロールオキシダーゼは、Ｎｏｃａｒｄｉａ
ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｒｉｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ、スエヒロタケ等から得られたものを用いるこ
とが好ましい

【０１４８】［標識量の検出］電流量の測定は、電極上
のＰＮＡ断片と試料核酸との二本鎖が固定された電極と
導電性基との間を流れる電流量が測定できる方法であれ
ば如何なる方法であってもよい。サイクリックボルタモ
グラフィー（ＣＶ）、デファレンシャルパルスボルタモ
グラフィー（ＤＰＶ）、リニアスィープボルタモグラフ
ィー、ポテンショスタット等を用いることが好ましい。
カウンター電極と二本鎖固定電極とを電解質溶液に浸漬
し、一対の電解系を形成させ、デファレンシャルパルス
ボルタモグラフィーを測定することが特に好ましい。

【０１４９】

【実施例】［実施例１］導電性基で標識した縫い込み型
インターカレータを用いる相補性ＤＮＡ断片の検出
〈１〉 （１）ＰＮＡ断片の合成 下記式で表されるＰＮＡ−Ｈ₂Ｎ−Ｌｙｓ−Ｔ₁₀−Ｈ
（以下「ＰＮＡ−Ｔ₁₀」という。Ｔは、チミンを表わ
す。）を、文献（P.E.Nielsen et al., Journal ofAmer
ican Chemical Society,114,1895-1897(1992)および11
4,9677-9678(1992)）に記載の方法に従って合成した。

【０１５０】

【化２５】

【０１５１】（２）ＰＮＡ固定金電極の作製 表面に一群のメルカプト基を有する面積が２．２５ｍｍ
²の金電極に、１，２−ビス（ビニルスルホニルアセト
アミド）エタンのリン酸緩衝液を滴下して、該金電極の
表面に１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）
エタンを共有結合により固定させ、自由端部にビニルス
ルホニル基を持つ反応性金電極を作成した。次いで、こ
の反応性金電極表面に、１００ピコモル／１μＬのＰＮ
Ａ−Ｔ₁₀の水溶液（２μＬ）を滴下し、室温にて１時間
放置してＰＮＡ固定金電極を作製した。

【０１５２】（３）試料ＤＮＡ断片の調製 試料ＤＮＡ断片として、アデニンの１０量体（ＤＮＡ−
Ａ₁₀）を特開平９−２８８０８０号公報に記載の方法に
従って調製した。

【０１５３】（４）相補性ＤＮＡ断片の検出 〈バックグラウンド値の測定〉下記の式で表されるフェ
ロセン標識電気化学活性縫い込み型インターカレータ
（５０μＭを含む０．１Ｍ塩化カリウム−０．１Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ５．６））溶液に、３８℃にて、前記
（２）で作製したＰＮＡ固定電極を浸漬し、１００乃至
７００ｍＶの範囲で電圧を印加し、デファレンシャル・
パルス・ボルタンメトリー（ＤＰＶ）を実施した。次い
で、印加電圧２６０ｍＶでの応答電流値（バックグラウ
ンド値）測定したところ、−１．２μＡであった。この
測定は、パルス振幅５０ｍＶ、パルス幅５０ｍＳおよび
スキャン速度１００ｍＶ／秒にて行なった。

【０１５４】

【化２６】

【０１５５】〈相補性ＤＮＡ断片の検出〉前記（２）で
作製したＰＮＡ固定電極の上に、前記（３）で得たＤＮ
Ａ−Ａ₁₀（７０ピコモル）を含む１０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．５）溶液２μＬを滴下し、２５℃にて３０分
間インキュベートした。次いで、インキュベート後のＰ
ＮＡ固定電極の表面を０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム
−リン酸水素二ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）にて洗
浄し、未反応のＤＮＡ−Ａ₁₀を除去した。そして、上記
のバックグラウンド値の測定と同様の操作を行って、応
答電流値（ＰＮＡと試料ＤＮＡ断片との複合体形成後の
電流値）を測定したところ、−２．８μＡであった。ま
た、バックグランド値に対する応答電流値の変化の割合
は、１３３％であった。

【０１５６】実施例１の結果より、ＰＮＡプローブが固
定されたＰＮＡ固定電極は、低いバックグラウンド値を
示すことが分かる。また、バックグラウンド値が低いた
め、感度よく相補性ＤＮＡ断片を検出できることが分か
る。

【０１５７】［実施例２］導電性基で標識したカチオン
性基を有する縫い込み型インターカレータを用いる相補
性ＤＮＡ断片の検出〈２〉 実施例１で用いたフェロセン標識縫い込み型インターカ
レータの代わりに、下記式で表されるカチオン性のフェ
ロセン標識縫い込み型インターカレータを用いる以外は
実施例１と同様にして、バックグラウンド値、複合体の
電流値および変化の割合を求めたところ、それぞれ−
１．５μＡ、−５．２μＡ、２４７％であった。

【０１５８】

【化２７】

【０１５９】［実施例３］導電性基で標識したカチオン
性ポリマーを用いる相補性ＤＮＡ断片の検出〈３〉 〈バックグラウンド値の測定〉実施例１で作製したＰＮ
Ａ固定電極の上に、下記式で表されるフェロセン標識ポ
リアリルアミン（約１ナノモル）を含む水溶液２μＬを
滴下し、２５℃にて３０分間放置し、ＰＮＡ固定電極の
表面を蒸留水で洗浄した。次いで、０．１Ｍ塩化カリウ
ム−０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）溶液に、３８℃
にて、洗浄後のＰＮＡ固定電極を浸漬し、１００乃至７
００ｍＶの範囲で電圧を印加し、デファレンシャル・パ
ルス・ボルタンメトリー（ＤＰＶ）を実施した。次い
で、印加電圧４６０ｍＶでの応答電流値（バックグラウ
ンド値）測定したところ、−０．９μＡであった。測定
は、パルス振幅５０ｍＶ、パルス幅５０ｍＳおよびスキ
ャン速度１００ｍＶ／秒にて行った。

【０１６０】

【化２８】

【０１６１】上記のフェロセンで標識したポリアリルア
ミンは、ＷＳＣＤ（１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド）の塩酸塩の存在下で、
ポリアリルアミン（日東紡績（株）製、分子量：約１０
０００）とフェロセンカルボン酸とを反応させることに
よって合成した。フェロセン標識ポリアリルアミンの分
子量は、約１２０００であった。

【０１６２】〈相補性ＤＮＡ断片の検出〉実施例１で作
製したＰＮＡ固定電極に、試料ＤＮＡ断片としてアデニ
ンの１０量体（ＤＮＡ−Ａ₁₀）（７０ピコモル）を含む
１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）溶液２μＬを滴下
し、２５℃にて３０分間インキュベートした。次いで、
インキュベート後のＰＮＡ固定電極の表面を０．１Ｍリ
ン酸二水素ナトリウム−リン酸水素二ナトリウム水溶液
（ｐＨ７．０）で洗浄し、未反応のＤＮＡ−Ａ₁₀を除去
した。そして、上記のバックグラウンド値の測定と同様
の操作を行って、応答電流値（ＰＮＡと試料ＤＮＡ断片
との複合体形成時の電流値）を測定したところ、−２．
０μＡであった。また、バックグランド値に対する応答
電流値の変化の割合は、１２２％であった。

【０１６３】実施例３の結果より、ＰＮＡプローブが固
定されたＰＮＡ修飾電極では、バックグラウンド値が低
いことが分かる。また、バックグラウンド値が低いた
め、感度よくＤＮＡ断片を検出できることが分かる。

【０１６４】［実施例４］導電性基で標識した縫い込み
型インターカレータを用いる相補性ＤＮＡ断片の検出
（増感型検出） 試料ＤＮＡ断片（ＤＮＡ−Ａ₁₀、２８６ピコモル）、下
記の式で表されるフェロセン標識縫い込み型インターカ
レータ（５０μＭ）、グルコース（１０ｍＭ）およびグ
ルコースオキシダーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉ
ｇｅｒ由来、和光（株）製、２００Ｕ）とを含む０．１
Ｍ酢酸−酢酸カリウム水溶液（ｐＨ５．６）と０．１Ｍ
塩化カリウム水溶液との混合液に、実施例１の（２）で
作製したＰＮＡ修飾電極、白金電極および銀／塩化銀参
照電極を浸積して三電極を形成させ、１００乃至７００
ｍＶの範囲で電圧を印加し、掃引速度１０ｍＶ／ｓにお
いて測定を行ない、ＰＮＡ固定電極のサイクリックボル
タモグラムを得た。印加電圧５１４ｍＶにおける電流値
は−３．２μＡであった。また、グルコースおよびグル
コースオキシダーゼを存在させなかった以外は上記と同
様にして、印加電圧５１４ｍＶでの電流値を測定したと
ころ、−０．２μＡであった。

【０１６５】

【化２９】

【０１６６】従って、グルコースおよびグルコースオキ
シダーゼを存在させると、これらを存在させない場合に
比べると、約１６倍に電流値が増幅されることが分か
る。

【０１６７】［実施例５］スペーサ基付きＰＮＡ固定電
極を用いる相補性ＤＮＡ断片の検出 （１）スペーサ基付きＰＮＡ固定金電極の作製 表面積が２．２５ｍｍ²の金電極に、６−アミノ−１−
ヘキサンチオール（０．１ｍＭ）と６−ヒドロキシ−１
−ヘキサンチオール（１ｍＭ）の混合水溶液（２μＬ）
を滴下し、混合水溶液が急速に乾燥しないように、４５
℃で２時間放置して、該金電極の表面に、アミノ基を自
由末端部に有する反応性基とヒドロキシル基を自由末端
部に有するスペーサ基とを固定させた。このように処理
した電極の表面に、１，２−ビス（ビニルスルホニルア
セトアミド）エタンの３％リン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
を滴下して、室温で放置して、表面にスペーサ基を介し
て、１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エ
タンを共有結合により固定されたスペーサ基付き反応性
金電極を作成した。

【０１６８】次いで、このスペーサ基付き反応性金電極
表面に、１００ピコモル／１μＬのＰＮＡ−Ｔ₁₀の水溶
液（実施例１で調製したもの）を２μＬ滴下し、室温に
て１時間放置し、超純水で洗浄し、次いで乾燥すること
のより、スペーサ基付きＰＮＡ固定金電極を作製した。

【０１６９】（２）バックグラウンド値測定、および相
補性ＤＮＡ断片の検出 上記のスペーサ基付きＰＮＡ固定金電極を用いる以外
は、実施例１に記載の方法に従って、バックグラウンド
値、ハイブリッド複合体の電流値および変化の割合を求
めたところ、それぞれ、−１．３μＡ、−３．９μＡ、
そして２００％であった。

【０１７０】（３）測定再現性の評価 上記のスペーサ基付きＰＮＡ固定金電極を同一の方法で
１０個製造し、それぞれのスペーサ基付きＰＮＡ固定金
電極を用いて、上記と同じ方法で、バックグラウンド値
の測定と相補性ＤＮＡ断片の検出操作を実施したとこ
ろ、変動係数（ＣＶ、Ｎ＝１０）は６．５％であり、測
定値の再現性が非常に高いことが確認された。

【０１７１】

【発明の効果】本発明のＰＮＡ固定電極を用いるＤＮＡ
断片などのようなアニオン性基を有する核酸試料の検出
方法では、プローブ分子のＰＮＡ断片と核酸試料との間
の電気的な反発が発生しないため、効率のよいハイブリ
ダイゼーションが可能となる。また、本発明の検出方法
は、ハイブリッドを形成していないＰＮＡ断片と縫い込
み型インターカレータとの結合も回避できるために、よ
り感度のよい検出を実現できる。さらに、カチオン性の
縫い込み型インターカレータおよびカチオン性分子は、
核酸試料の負電荷の中和によって、ノニオン性の縫い込
み型インターカレータよりもさらに、効率のよいハイブ
リダイゼーションや、より高い感度を達成することがで
きる。

【０１７２】また、本発明の核酸使用の検出方法に増感
型の検出工程を組み合わせることによって、増感工程を
利用しない検出（非増感型検出）の場合と比較すると、
約２０倍〜１００倍の範囲（条件の設定によっては、１
００倍以上）の高い検出感度を達成することができる。
従って、検出目的の核酸試料の濃度が数１０^-18乃至数
１０^-12モルの範囲の量であっても、充分に検出・定量
が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の反応性電極の製造方法および代表的な
ペプチド核酸（ＰＮＡ）固定電極の製造方法と構成を模
式的に示す。

【図２】本発明のスペーサ基が固定された反応性電極の
製造方法、および該スペーサ基で互いに隔離された状態
でペプチド核酸（ＰＮＡ）が固定された電極の製造方法
と構成を模式的に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 27/416 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ 37/00 １０２ Ｇ０１Ｎ 27/46 ３３６Ｇ (72)発明者 小川 雅司 東京都港区西麻布２丁目26番30号 富士写 真フイルム株式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 DA12 DA13 DA14 FB05 4B024 AA11 AA19 CA01 CA09 CA11 CA20 HA11 HA12 4B029 AA07 AA23 BB20 CC01 CC03 CC08 FA12 FA15 4B063 QA01 QA13 QA17 QQ41 QR31 QR38 QR55 QR84 QR90 QS34 QX04

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 電極と該電極表面に共有結合により固定
   された一群のペプチド核酸とからなる核酸試料検出用
   具。
2. 【請求項２】 ペプチド核酸と電極との共有結合が、ペ
   プチド核酸に導入された活性水素含有基と電極表面に導
   入されたビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体
   基を含む反応性基との反応により形成されている、請求
   項１に記載の核酸試料検出用具。
3. 【請求項３】 電極表面に導入された反応性基が、下記
   の式により表わされるものである、請求項２に記載の核
   酸試料検出用具： 【化１】−Ｌ−ＳＯ₂−Ｘ ［上記の式において、Ｘは、−ＣＲ¹＝ＣＲ²Ｒ³または
   −ＣＨＲ¹−ＣＲ²Ｒ³Ｙを表わし；Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は、
   互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアル
   キル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭
   素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子
   数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる
   原子もしくは基を表わし；Ｙは、ハロゲン原子、−ＯＳ
   Ｏ₂Ｒ¹¹、−ＯＣＯＲ¹²、−ＯＳＯ₃Ｍ、及び四級ピリジ
   ニウム基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わ
   し；Ｒ¹¹は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素
   原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１
   乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２
   ６のアラルキル基からなる群より選ばれる基を表わし；
   Ｒ¹²は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基および炭素
   原子数が１乃至６のハロゲン化アルキル基からなる群よ
   り選ばれる基を表わし；Ｍは、水素原子、アルカリ金属
   原子およびアンモニウム基からなる群より選ばれる原子
   もしくは基を表わし；そして、Ｌは連結基を表わす］。
4. 【請求項４】 Ｘが、−ＣＨ＝ＣＨ₂で表わされるビニ
   ル基である、請求項３に記載の核酸試料検出用具。
5. 【請求項５】 Ｌが、−ＮＨ−、−Ｓ−、および−Ｏ−
   からなる群から選ばれる連結部位を有する連結基であ
   る、請求項３に記載の核酸試料検出用具。
6. 【請求項６】 Ｌが、−（Ｌ¹）_n−ＮＨＣＨ₂ＣＨ₂−
   ［但し、Ｌ¹は連結基を表わし、そしてｎは０もしくは
   １である］で表わされる連結基である、請求項３に記載
   の核酸試料検出用具。
7. 【請求項７】 電極が金から形成されている、請求項１
   に記載の核酸試料検出用具。
8. 【請求項８】 ペプチド核酸と電極との共有結合が、ペ
   プチド核酸に導入されたビニルスルホニル基もしくはそ
   の反応性前駆体基を含む反応性基と電極表面に導入され
   た活性水素含有基との反応により形成されている、請求
   項１に記載の核酸試料検出用具。
9. 【請求項９】 導電性基を有する縫い込み型インターカ
   レータ及び水性媒体の存在下、核酸試料を請求項１に記
   載のペプチド核酸が固定された核酸試料検出用具に接触
   させることにより、該インターカレータが挿入された核
   酸試料とペプチド核酸とのハイブリッド複合体を形成さ
   せ、次いで、核酸試料検出用具の電極に電位を印加し、
   該検出用具の電極と外部電極との間をインターカレータ
   の導電性基を介して流れる電流を測定することを特徴と
   するペプチド核酸に相補性を有する核酸試料の検出方
   法。
10. 【請求項１０】 導電性基を有するカチオン性分子及び
    水性媒体の存在下、核酸試料を請求項１に記載のペプチ
    ド核酸が固定された核酸試料検出用具に接触させること
    により、該カチオン性分子がイオン結合した核酸試料と
    ペプチド核酸とのハイブリッド複合体を形成させ、次い
    で、核酸試料検出用具の電極に電位を印加し、該検出用
    具の電極と外部電極との間をカチオン性分子の導電性基
    を介して流れる電流を測定することを特徴とするペプチ
    ド核酸に相補性を有する核酸試料の検出方法。
11. 【請求項１１】 電極、該電極表面に共有結合により固
    定された一群のペプチド核酸、そして該一群のペプチド
    核酸のそれぞれを互いに電極表面と平行な平面に沿って
    空間的に分離する配置にて電極表面に固定された一群の
    スペーサ基からなる核酸試料検出用具。
12. 【請求項１２】 ペプチド核酸と電極との共有結合が、
    ペプチド核酸に導入された活性水素含有基と電極表面に
    導入されたビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆
    体基を含む反応性基との反応により形成されている、請
    求項１１に記載の核酸試料検出用具。
13. 【請求項１３】 電極表面に導入された反応性基が、下
    記の式により表わされるものである、請求項１２に記載
    の核酸試料検出用具： 【化２】−Ｌ−ＳＯ₂−Ｘ ［上記の式において、Ｘは、−ＣＲ¹＝ＣＲ²Ｒ³または
    −ＣＨＲ¹−ＣＲ²Ｒ³Ｙを表わし；Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は、
    互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアル
    キル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭
    素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子
    数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる
    原子もしくは基を表わし；Ｙは、ハロゲン原子、−ＯＳ
    Ｏ₂Ｒ¹¹、−ＯＣＯＲ¹²、−ＯＳＯ₃Ｍ、及び四級ピリジ
    ニウム基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わ
    し；Ｒ¹¹は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素
    原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１
    乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２
    ６のアラルキル基からなる群より選ばれる基を表わし；
    Ｒ¹²は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基および炭素
    原子数が１乃至６のハロゲン化アルキル基からなる群よ
    り選ばれる基を表わし；Ｍは、水素原子、アルカリ金属
    原子およびアンモニウム基からなる群より選ばれる原子
    もしくは基を表わし；そして、Ｌは連結基を表わす］。
14. 【請求項１４】 Ｘが、−ＣＨ＝ＣＨ₂で表わされるビ
    ニル基である、請求項１３に記載の核酸試料検出用具。
15. 【請求項１５】 スペーサ基が電荷を有していない、請
    求項１１に記載の核酸試料検出用具。
16. 【請求項１６】 スペーサ基の電極に固定されている側
    とは反対側の末端が疎水性基である、請求項１１に記載
    の核酸試料検出用具。
17. 【請求項１７】 電極表面に固定された一群のペプチド
    核酸と一群のスペーサ基とのモル比が１：１乃至１：２
    ００の範囲にある、請求項１１に記載の核酸試料検出用
    具。
18. 【請求項１８】 導電性基を有する縫い込み型インター
    カレータ及び水性媒体の存在下、核酸試料を請求項１１
    に記載のペプチド核酸が固定された核酸試料検出用具に
    接触させることにより、該インターカレータが挿入され
    た核酸試料とペプチド核酸とのハイブリッド複合体を形
    成させ、次いで、核酸試料検出用具の電極に電位を印加
    し、該検出用具の電極と外部電極との間をインターカレ
    ータの導電性基を介して流れる電流を測定することを特
    徴とするペプチド核酸に相補性を有する核酸試料の検出
    方法。
19. 【請求項１９】 導電性基を有するカチオン性分子及び
    水性媒体の存在下、核酸試料を請求項１１に記載のペプ
    チド核酸が固定された核酸試料検出用具に接触させるこ
    とにより、該カチオン性分子がイオン結合した核酸試料
    とペプチド核酸とのハイブリッド複合体を形成させ、次
    いで、核酸試料検出用具の電極に電位を印加し、該検出
    用具の電極と外部電極との間をカチオン性分子の導電性
    基を介して流れる電流を測定することを特徴とするペプ
    チド核酸に相補性を有する核酸試料の検出方法。
20. 【請求項２０】 電極の表面に、一群のビニルスルホニ
    ル基もしくはその反応性前駆体基がそれぞれ連結基を介
    して共有結合により固定されてなる反応性電極。
21. 【請求項２１】 ビニルスルホニル基もしくはその反応
    性前駆体基と連結基との連結体が下記の式により表わさ
    れるものである請求項２０に記載の反応性電極： 【化３】−Ｌ−ＳＯ₂−Ｘ ［上記の式において、Ｘは、−ＣＲ¹＝ＣＲ²Ｒ³または
    −ＣＨＲ¹−ＣＲ²Ｒ³Ｙを表わし；Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は、
    互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアル
    キル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭
    素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子
    数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる
    原子もしくは基を表わし；Ｙは、ハロゲン原子、−ＯＳ
    Ｏ₂Ｒ¹¹、−ＯＣＯＲ¹²、−ＯＳＯ₃Ｍ、及び四級ピリジ
    ニウム基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わ
    し；Ｒ¹¹は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素
    原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１
    乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２
    ６のアラルキル基からなる群より選ばれる基を表わし；
    Ｒ¹²は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基および炭素
    原子数が１乃至６のハロゲン化アルキル基からなる群よ
    り選ばれる基を表わし；Ｍは、水素原子、アルカリ金属
    原子およびアンモニウム基からなる群より選ばれる原子
    もしくは基を表わし；そして、Ｌは連結基を表わす］。
22. 【請求項２２】 Ｘが、−ＣＨ＝ＣＨ₂で表わされるビ
    ニル基である請求項２１に記載の反応性電極。
23. 【請求項２３】 Ｌが、−ＮＨ−、−Ｓ−、および−Ｏ
    −からなる群から選ばれる連結部位を有する連結基であ
    る請求項２１に記載の反応性電極。
24. 【請求項２４】 Ｌが、−（Ｌ¹）_n−ＮＨＣＨ₂ＣＨ₂−
    ［但し、Ｌ¹は連結基を表わし、そしてｎは０もしくは
    １である］で表わされる連結基である請求項２１に記載
    の反応性電極。
25. 【請求項２５】 電極が金から形成されている、請求項
    ２０に記載の反応性電極。
26. 【請求項２６】 電極の表面に一群のビニルスルホニル
    基もしくはその反応性前駆体基がそれぞれ連結基を介し
    て共有結合により固定され、さらに該一群のビニルスル
    ホニル基もしくはその反応性前駆体基を互いに電極表面
    と平行な平面に沿って空間的に分離する配置にて電極表
    面に固定された一群のスペーサ基からなる反応性電極。
27. 【請求項２７】 ビニルスルホニル基もしくはその反応
    性前駆体基と連結基との連結体が下記の式により表わさ
    れるものである請求項２６に記載の反応性電極： 【化４】−Ｌ−ＳＯ₂−Ｘ ［上記の式において、Ｘは、−ＣＲ¹＝ＣＲ²Ｒ³または
    −ＣＨＲ¹−ＣＲ²Ｒ³Ｙを表わし；Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は、
    互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアル
    キル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭
    素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子
    数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる
    原子もしくは基を表わし；Ｙは、ハロゲン原子、−ＯＳ
    Ｏ₂Ｒ¹¹、−ＯＣＯＲ¹²、−ＯＳＯ₃Ｍ、及び四級ピリジ
    ニウム基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わ
    し；Ｒ¹¹は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素
    原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１
    乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２
    ６のアラルキル基からなる群より選ばれる基を表わし；
    Ｒ¹²は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基および炭素
    原子数が１乃至６のハロゲン化アルキル基からなる群よ
    り選ばれる基を表わし；Ｍは、水素原子、アルカリ金属
    原子およびアンモニウム基からなる群より選ばれる原子
    もしくは基を表わし；そして、Ｌは連結基を表わす］。
28. 【請求項２８】 Ｘが、−ＣＨ＝ＣＨ₂で表わされるビ
    ニル基である請求項２７に記載の反応性電極。
29. 【請求項２９】 スペーサ基が電荷を有していない、請
    求項２６に記載の反応性電極。
30. 【請求項３０】 スペーサ基の電極に固定されている側
    とは反対側の末端が疎水性基である、請求項２６に記載
    の反応性電極。
31. 【請求項３１】 電極表面に固定された一群のペプチド
    核酸と一群のスペーサ基とのモル比が１：１乃至１：２
    ００の範囲にある、請求項２６に記載の反応性。
32. 【請求項３２】 電極が金から形成されている、請求項
    ２６に記載の反応性電極。
33. 【請求項３３】 表面に反応性基が導入された電極に、
    下記式： 【化５】Ｘ¹−ＳＯ₂−Ｌ²−ＳＯ₂−Ｘ² ［上記の式において、Ｘ¹およびＸ²は互いに独立に、−
    ＣＲ¹＝ＣＲ²Ｒ³、または−ＣＨＲ¹−ＣＲ²Ｒ³Ｙを表わ
    し；Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は、互いに独立に、水素原子、炭
    素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至
    ２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキ
    ル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル
    基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし；Ｙ
    は、ハロゲン原子、−ＯＳＯ₂Ｒ¹¹、−ＯＣＯＲ¹²、−
    ＯＳＯ₃Ｍ、及び四級ピリジニウム基からなる群より選
    ばれる原子もしくは基を表わし；Ｒ¹¹は、炭素原子数が
    １乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリ
    ール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有す
    る合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる
    群より選ばれる基を表わし；Ｒ¹²は、炭素原子数が１乃
    至６のアルキル基および炭素原子数が１乃至６のハロゲ
    ン化アルキル基からなる群より選ばれる基を表わし；Ｍ
    は、水素原子、アルカリ金属原子およびアンモニウム基
    からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし；そし
    て、Ｌ²は連結基を表わす］で表わされるジスルホン化
    合物を接触させることを特徴とする反応性電極の製造方
    法。