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JP2001521369A - 細胞巨大分子合成の阻害が減少したアルファウイルスベクター - Google Patents

細胞巨大分子合成の阻害が減少したアルファウイルスベクター

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JP2001521369A JP53651297A JP53651297A JP2001521369A JP 2001521369 A JP2001521369 A JP 2001521369A JP 53651297 A JP53651297 A JP 53651297A JP 53651297 A JP53651297 A JP 53651297A JP 2001521369 A JP2001521369 A JP 2001521369A
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Abstract

(57)【要約】 単離された核酸分子が開示され、これは、組換えアルファウイルス粒子、真核生物重層ベクター開始系、またはRNAベクターレプリコンに作動可能に組み込まれた場合に、野生型と比較して減少したレベルのベクター特異的RNA合成を有し、そして野生型組換えアルファウイルス粒子と比較して同一またはより大きいレベルの、ウイルス連結領域プロモーターから転写されたRNAによりコードされるタンパク質を有する、アルファウイルス非構造タンパク質遺伝子を含む。上記の核酸分子を含む、RNAベクターレプリコン、アルファウイルスベクター構築物、および真核生物重層ベクター開始系もまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞巨大分子合成の阻害が減少したアルファウイルスベクター政府の利権の記載 本発明は、部分的に、国立衛生研究所により認可された助成金番号AI 17377の 下での政府の援助でなされた。政府は、本発明において一定の権利を有し得る。発明の技術分野 本発明は、一般的に組換えDNA技術に関する；さらに詳細には、１つ以上の異 種遺伝子産物の発現を指向するために有用な組換えベクターの開発に関する。発明の背景 アルファウイルスは、トガウイルス科の一群の血清学的に関連した、節足動物 に運搬されるウイルスを含む。これらのウイルスは全世界に分布しており、そし て自然界では蚊から脊椎動物へのサイクルを介して存続する。鳥、齧歯類、馬、 霊長類およびヒトは、アルファウイルス脊椎動物病原性物質保有者(reservoir) ／宿主として規定されるものの仲間である。 赤血球凝集阻害（HI）アッセイを利用して、アルファウイルス属内で、26の公 知のウイルスおよびウイルスサブタイプが分類されている。このアッセイは26の アルファウイルスを３つの大きな複合種(complex)に分ける：ヴェネズエラウマ 脳炎（Venezuelan equine encephalitis）(VEE)複合種、セムリキ森林（Semliki Forest）(SF)複合種、そして西部ウマ脳炎（westerne quine encephalitis）(W EE)複合種。さらに、HI血清学的アッセイに基づき、４つの他のウイルス、東部 ウマ脳炎(eastern equine encephalitis)（EEE）、バーマー森林(Barmah Forest )、ミッデルブルグ(Middelburg)、およびヌヅム(Ndumu)が、個々に分類されてい る。 アルファウイルス属のメンバーはまた、ヒトにおけるそれらの相対的な臨床的 特徴に基づき分類される：主に脳炎に関連するアルファウイルス、および主に発 熱、発疹そして多発性関節炎に関連するアルファウイルス。前者の群に含まれる のは、VEEおよびWEE複合種、ならびにEEEである。一般的にこの群による感染は 、永続的な後遺症（行動変化および学習障害を含む）、または死に至り得る。後 者の群ではSF複合種であり、個々のアルファウイルスであるセムリキ森林、シン ドビス、ロスリバー、チクングンヤ(Chikungunya)、オニオニオン(O'nyong-nyon g)、およびマヤロ（Mayaro）よりなる。この群に関しては、重大な流行が報告さ れているが、感染は一般的に自己制限型(self-limiting)であり、永続的な後遺 症はない。 シンドビスウイルスは、トガウイルス科のアルファウイルス属の原型のメンバ ーである。細胞の感染後のその複製ストラテジー（図１を参照のこと）は、ニワ トリ胚線維芽細胞(CEF)およびベビーハムスター腎臓(BHK)細胞により十分に特徴 付けられている。ここで、シンドビスウイルスは迅速に成長して高力価になり、 そして他のアルファウイルスのモデルとして作用する。簡潔には、シンドビスウ イルス由来のゲノムは、（他のアルファウイルスと同様に）約12kbの一本鎖ポジ ティブセンスRNA分子であり、これはキャップされポリアデニル化され、そして ウイルスコードキャプシドタンパク質殻内に含まれる。ヌクレオキャプシドは、 さらに宿主由来脂質エンベロープにより囲まれる。２つのウイルス特異的糖タン パク質であるE1およびE2は、このエンベロープに挿入され、そしてヌクレオキャ プシドに固着される。特定のアルファウイルス（例えば、SF）はまた、さらなる タンパク質であるE3（これはE2前駆体タンパク質であるPE2の切断産物である） を維持する。標的細胞へのウイルス粒子の吸収、浸透、およびウイルスゲノムRN Aを細胞質へ放出するためのヌクレオキャプシドの脱コートの後、複製プロセス が、ウイルスゲノムの5'側の３分の２からの非構造タンパク質(nsP)の翻訳によ り開始される。４つのnsP（nsP1〜nsP4）は、ゲノムRNAテンプレートから、２つ のポリタンパク質（nsP123またはnsP1234）の１つとして直接翻訳され、そしてC 末端ドメインnsP2において活性プロテアーゼによりモノマー単位に翻訳後プロセ シングされる。大部分のアルファウイルスのnsP3とnsP4との間に存在するリーキ ーオパール(leaky opal)(UGA)コドンは、nsP123ポリタンパク質と比較してnsP12 34ポリタンパク質の10〜20％の量を占める。両方の非構造ポリタンパク質および それら由来のモノマー単位は、RNA複製プロセスに関与し得る。このプロセスは 、5'および3'末端に存在する保存されたヌクレオチド配列エレメント(CSE)、な らびにゲノムの内部に配置される連結領域サブゲノムプロモーターへの結合を含 む（以下でさらに議論される）。 ポジティブ鎖ゲノムRNAは、全長の相補的なネガティブ鎖のnsP触媒合成のため のテンプレートとして作用する。相補的なネガティブ鎖の合成は、ポジティブ鎖 ゲノムRNAの3'末端CSEへのnsP複合体の結合の後に触媒される。次には、ネガテ ィブ鎖は、順番に、さらなるポジティブ鎖ゲノムRNAおよび大量に発現される26S サブゲノムRNA（連結領域プロモーターで内部に開始される）の合成のためのテ ンプレートとして作用する。さらなるポジティブ鎖ゲノムRNAの合成は、相補的 なネガティブ鎖ゲノムRNAテンプレートの3'末端CSEへのnsP複合体の結合の後に 生じる。ネガティブ鎖ゲノムRNAテンプレートからのサブゲノムmRNAの合成は、 連結領域プロモーターから開始される。従って、ポジティブ鎖ゲノムRNAの5'末 端および連結領域CSEは、それらがネガティブ鎖ゲノムRNA相補体に転写された後 にのみ機能的である（すなわち、5'末端CSEは、それがゲノムネガティブ鎖相補 体の3'末端である場合に機能的である）。構造タンパク質(sP)は、サブゲノム26 S RNAから翻訳される。これは、ゲノムの3'側の３分の１を示し、そしてnsPと同 様に、個々のタンパク質に翻訳後プロセシングされる。 いくつかのグループは、アルファウイルス属の特定のメンバーを発現ベクター として利用することを示唆している。これには、例えば、シンドビスウイルス（ Xiongら、Science 243:1188-1191,1989;Hahnら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:26 79-2683,1992;Dubenskyら、J.Virol 70:508-519,1996）、セムリキ森林ウイルス （Liljestrom、Bio/Technology 9:1356-1361,1991）、およびヴェネズエラウマ 脳炎ウイルス（Davisら、J.Cell.Biochem.Suppl.19A:10,1995）が挙げられる。 さらに、１つのグループは、インビボでの治療的遺伝子の送達のためにアルファ ウイルス由来ベクターを使用することを示唆している。しかし、上述のベクター に伴う一つの問題点は、宿主細胞に指向される巨大分子合成（すなわち、タンパ ク質またはRNA合成）の阻害が感染後数時間以内に始まり、そして細胞変性効果( CPE)が12〜16時間の感染後時間(hpi)以内に生じることである。宿主細胞タンパ ク質合成の阻害および遮断は、構造タンパク質発現の存在下または非存在下にお いて、組換えウイルス粒子で感染されたBHK細胞において2hpi以内に始まる。こ のことは、ウイルス感染後の初期事象（例えば、nsPおよび一鎖RNAの合成）が、 宿主細胞タンパク質合成の阻害およびそれに続くCPEの発達および細胞死に直接 的に影響し得ることを示唆する。 SIN-1は、野生型シンドビスに由来する改変体株であり、そして１ヶ月の期間 にわたりシンドビスウイルスで持続的に感染させたBHK細胞の培養物から単離さ れた（Weissら、J.Viol.33:463-474,1980）。単一のプラークからの拡大により 得られた純粋なSIN-1ウイルスのストックは、それが感染するBHK細胞を殺傷しな い。重要なことには、ウイルス収率（＞103PFU／細胞）は、野生型シンドビスウ イルスまたは改変体SIN-1ウイルスで感染させたBHK細胞において同一である。従 って、感染させたBHK細胞におけるSIN-1の主な表現型は、ウイルス誘導細胞死の 非存在下における野生型レベルの感染性ウイルスの生成により特徴付けられる。 本発明は、種々の適用（例えば、遺伝子療法および組換えタンパク質生成を含 む）における使用のための選択された所望の表現型を有する組換えベクターを提 供し、そして他の関連した利点をさらに提供する。発明の要旨 簡潔に述べると、本発明は、RNAベクターレプリコン、アルファウイルスベク ター構築物、真核生物重層ベクター開始系、および組換えアルファウイルス粒子 を提供する。これらは、細胞巨大分子合成（例えば、タンパク質またはRNA合成 ）の阻害の減少、遅延、または非存在を示し、それによってCPEの発達または細 胞死が減少して、遅延して、または存在せずに、タンパク質発現、遺伝子療法な どのためのこれらのベクターの使用を可能にする。このようなベクターは、広範 な種々のアルファウイルス（例えば、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイル ス、ヴェネズエラウマ脳炎ウイルス、またはシンドビスウイルス）から構築され 得、そして多数の異種配列（例えば、タンパク質に対応する配列、アンチセンス RNAに対応する配列、非コードセンスRNA配列に対応する配列、またはリボザイム に対応する配列）を発現するように設計され得る。 本発明の１つの局面において、単離された核酸分子が提供される。この分子は 、組換えアルファウイルスに作動可能に組み込まれた場合、野生型アルファウイ ルスと比較して、哺乳動物細胞における発現後の宿主細胞に指向される巨大分子 合成の50％阻害に到達するのに必要な時間を増加させる、改変されたアルファウ イルス非構造タンパク質遺伝子を含む。本発明の文脈内において利用される「改 変されたアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子」は、アルファウイルスRNA ベクターレプリコン、組換えアルファウイルス粒子、または真核生物重層ベクタ ー開始系に作動可能に組み込まれた場合に、所望の表現型（例えば、細胞巨大分 子合成の阻害の減少、遅延、または非存在）を生じる遺伝子をいう。このような 改変されたアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子は、野生型アルファウイル ス遺伝子のヌクレオチド配列からの配列を改変する１つ以上のヌクレオチドの置 換、欠失、または挿入を有する。遺伝子は、人工的な（例えば、指示された選択 手順から；以下の実施例２を参照のこと）または天然に存在するウイルス改変体 （以下の実施例１を参照のこと）のいずれかに由来し得る。さらに、単離された 本発明の核酸分子が、上記のアルファウイルスRNAベクターレプリコン、組換え アルファウイルス粒子、または真核生物重層ベクター開始系へ組み込まれた場合 、特定の実施態様において、それらは宿主細胞に指向される巨大分子合成の50％ 阻害に到達するのに必要な時間を、宿主細胞に指向される巨大分子合成の検出可 能な阻害が実質的に存在しない程度まで実質的に増加させることは理解されるは ずである。宿主細胞に指向される巨大分子合成の阻害パーセントを検出するため に適切なアッセイとしては、例えば、実施例１において記載されるアッセイが挙 げられる。 本発明の他の局面において、単離された核酸分子が提供される。この核酸分子 は、改変されたアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子を含む。この遺伝子は 、組換えアルファウイルス粒子、真核生物重層ベクター開始系、またはRNAベク ターレプリコンに作動可能に組み込まれた場合、野生型と比較して減少したレベ ル（例えば、２倍、５倍、10倍、50倍、または100倍より多い）のベクター特異 的RNA合成を生じ、そして野生型組換えアルファウイルス粒子、野生型真核生物 重層ベクター開始系、または野生型RNAベクターレプリコンと比較して、同一の また はより大きいレベルの、ウイルス連結領域プロモーターから転写されたRNAによ りコードされるタンパク質を生じる。RNAレベルを定量するための代表的なアッ セイとしては、実施例１に記載されるような[3H]ウリジン取り込み、またはノー ザンブロット分析により検出されるようなRNA蓄積（実施例４を参照のこと）が 挙げられる。タンパク質レベルを定量するための代表的なアッセイとしては、ス キャンニングデンシトメトリー（実施例４を参照のこと）および種々の酵素アッ セイ（実施例３〜５を参照のこと）が挙げられる。 上記の実施態様の１つにおいて、単離された核酸分子は、非構造タンパク質２ (nsP2)をコードする。さらなる実施態様において、単離された核酸分子は、nsP2 のLXPGGモチーフにおいて変異を有する。 本発明の別の局面において、上記の核酸分子の１つに作動可能に連結されたプ ロモーターを含む発現ベクターが提供される。１つの実施態様において、発現ベ クターはさらに、ポリアデニル化配列または核酸分子の3'側に転写終結配列を含 む。 本発明のさらに別の局面において、アルファウイルスベクター構築物が提供さ れる。この構築物は、cDNAからのインビトロでのウイルスRNA合成を開始する5' プロモーター、アルファウイルスRNAの転写を開始する5'配列、４つ全てのアル ファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子（上記のような 単離された核酸分子を含む）、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列、お よび3'ポリアデニル化域(polyadenylate tract)を含む。１つの実施態様におい て、このような構築物はさらに、ウイルス連結領域の下流の、そしてその領域に 作動可能に連結された、選択された異種配列を含む。 本発明のさらに他の局面において、真核生物系において翻訳し得るRNAベクタ ーレプリコンが提供される。このレプリコンは、アルファウイルスRNAの転写を 開始する5'配列、４つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコ ードする核酸分子（上記の単離された核酸分子を含む）、アルファウイルスRNA ポリメラーゼ認識配列、および3'ポリアデニル化域を含む。別の実施態様におい て、このようなRNAベクターレプリコンはさらに、ウイルス連結領域の下流の、 そしてその領域に作動可能に連結された、選択された異種配列を含む。本発明の さらなる局面において、本明細書中に記載されるRNAベクターレプリコンの１つ を含む宿主細胞が提供される。本発明のさらなる局面において、上記のRNAベク ターレプリコンおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組 成物が提供される。 本発明の他の局面において、組換えアルファウイルス粒子が提供される。この 粒子は、本明細書中に記載のように、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク 質、脂質エンベロープ、およびRNAベクターレプリコンを含む。１つの実施態様 において、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質は、RNAベクターレプリ コンが由来するアルファウイルスとは異なるアルファウイルスに由来する。他の 実施態様において、アルファウイルス構造タンパク質および脂質エンベロープは 異なる種に由来する。さらなる局面において、薬学的組成物が提供される。この 組成物は、上記のような組換えアルファウイルス粒子および薬学的に受容可能な キャリアまたは希釈剤を含む。さらに、このような組換えアルファウイルス粒子 に感染させた哺乳動物細胞もまた、提供される。 本発明の特定の実施態様において、上記のベクターまたは粒子はさらに、異種 配列とインフレームで融合された耐性マーカーを含み得る。このような耐性マー カーの代表的な例としては、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼおよび ネオマイシンが挙げられる。 本発明の他の局面において、アルファウイルスまたは組換えアルファウイルス ベクター改変体を選択するための方法が提供される。これらの改変体は、本明細 書中に記載の、宿主細胞に指向される巨大分子合成の阻害が減少したか、遅延し たか、または存在しない表現型を示す。このような方法の代表的な例としては選 択薬物または抗原性マーカーの使用が挙げられ、そして以下の実施例２において より詳細に提供される。 本発明の他の局面において、ゲノム（すなわち、野生型ウイルスゲノム）また はRNAベクターレプリコン核酸を実質的に含まないトガウイルスキャプシド粒子 が提供される。トガウイルスの代表的な例としては、例えば、アルファウイルス およびルビウイルス（例えば、風疹）が挙げられる。特定の実施態様において、 キャプシド粒子はさらに、１つ以上のアルファウイルス糖タンパク質を含む脂質 エンベロープを含む。他の実施態様において、キャプシド粒子はさらに、アルフ ァウイルスエンベロープ（すなわち、脂質二重層および糖タンパク質相補体）を 含む。本発明に関連する局面において、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈 剤と共に、上述のキャプシド粒子（脂質二重層（例えば、アルファウイルス糖タ ンパク質を含むウイルスエンベロープ）を有するかまたは有しない）を含む薬学 的組成物が提供される。さらなる局面において、このようなキャプシド粒子（脂 質二重層（例えば、アルファウイルス糖タンパク質を含むウイルスエンベロープ ）を有するかまたは有しない）または薬学的組成物は、所望のトガウイルスに対 する免疫応答を誘導するために、ワクチン接種薬剤として利用され得る。 本発明のさらなる局面において、誘導性プロモーターが提供される。このプロ モーターは、コアRNAポリメラーゼプロモーター配列、コアプロモーター配列か らの転写を活性化するタンパク質のDNA結合を指向する作動可能に連結された核 酸配列、およびコアプロモーター配列からの転写を抑制するタンパク質のDNA結 合を指向する作動可能に連結された核酸配列を含む。このようなプロモーターは 、本明細書中に記載される遺伝子送達ビヒクルにおいて、ならびに当業者に公知 の広範な種々の他のベクターにおいて利用され得る。 他の局面において、アルファウイルス構造タンパク質発現カセットが提供され る。このカセットは、DNAからのウイルスRNAの合成を開始する5'プロモーター、 １つ以上の機能的なアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸分子、発 現カセットの転写に作動可能に連結された選択マーカー、および必要に応じて、 転写終結を制御する3'配列を含む。１つの実施態様において、このような発現カ セットはさらに、アルファウイルスRNAの転写を開始する5'配列、ウイルス連結 領域プロモーター、およびアルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列を含む。 別の実施態様において、発現カセットはさらに、触媒リボザイムプロセシング配 列、核からのRNAの輸送を容易にする翻訳後転写調節エレメント、および／また は複数シストロン性の(multicistronic)mRNAの翻訳を可能にするエレメント（内 部リボゾーム進入部位（Internal Ribosome Entry Site）エレメント、リボソー ムの読み通し(read through)を促進するエレメント、およびBiP配列からなる群 より選択される）を含む。他の実施態様において、選択マーカーは、cDNAからの アルファウイルスRNAの合成を開始し得る5'プロモーターに作動可能に連結され る。さらなる実施態様において、選択マーカーは、連結領域プロモーターよりお よびアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸分子より下流に配置され る。なお他の実施態様において、5'プロモーターは、本明細書中に記載されるよ うに誘導性プロモーターである。別の実施態様において、アルファウイルス構造 タンパク質発現カセットはさらに、アルファウイルスキャプシドタンパク質遺伝 子またはエンハンサー配列の3'側に位置する１つ以上の機能的なアルファウイル ス構造タンパク質遺伝子の翻訳を増強し得る他の配列（例えば、タバコエッチウ イルス(tobacco etch virus)または「TEV」リーダー）を含む。好ましくは、キ ャプシドタンパク質遺伝子配列は、アルファウイルス構造遺伝子をコードする配 列が得られたアルファウイルスとは異なるアルファウイルスに由来する。 本発明のなお他の局面において、上記のようなアルファウイルス構造タンパク 質発現カセットを含む細胞を含むアルファウイルスパッケージング細胞株が提供 される。特定の実施態様において、アルファウイルスパッケージング細胞株は、 本明細書中に提供されるアルファウイルス構造タンパク質発現カセットで安定に 形質転換される。関連する局面において、アルファウイルスプロデューサー細胞 株が提供される。この細胞株は、安定に形質転換されたアルファウイルス構造タ ンパク質発現カセット、ならびにRNAベクターレプリコン、アルファウイルスベ クター構築物、および真核生物重層ベクター開始系からなる群より選択されたベ クターを含む細胞を含む。 含む。 本発明のなお他の局面において、真核生物重層ベクター開始系が提供される。 この系は、cDNAからのRNAのインビボでの5'合成を開始し得る5'プロモーター、 アルファウイルスRNAの転写を開始するこの5'プロモーターに続く配列；４つ全 てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子（上記 のような単離された核酸分子を含む）、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識 配列、および3'ポリアデニル域を含む。適切な5'プロモーターの代表的な例とし ては、RNAポリメラーゼＩプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNA ポリメラーゼIIIプロモーター、HSV-TKプロモーター、RSVプロモーター、テトラ サイクリン誘導性プロモーター、MoMLVプロモーター、SV40プロモーター、およ びCMVプロモーターが挙げられる。好ましい実施態様において、5'プロモーター は、本明細書中に記載されるような誘導性プロモーターである。 特定の実施態様において、ウイルス連結領域に作動可能に連結された異種配列 、および／または核からのRNA輸送を容易にする転写後調節エレメントをさらに 含む真核生物重層ベクター開始系が提供される。さらなる実施態様において、本 明細書中で提供される真核生物重層ベクター開始系はさらに、転写終結シグナル を含み得る。 関連する実施態様において、本発明はまた、上記のような安定に形質転換され た真核生物重層ベクター開始系を含む宿主細胞（例えば、脊椎動物または昆虫） を提供する。本発明のさらなる局面において、選択された異種配列を脊椎動物ま たは昆虫に送達するための方法が提供される。この方法は、本明細書中に記載の ような、アルファウイルスベクター構築物、RNAベクターレプリコン、組換えア ルファウイルス粒子、または真核生物重層ベクター開始系を脊椎動物または昆虫 に投与する工程を含む。特定の実施態様において、アルファウイルスベクター構 築物、RNAベクターレプリコン、組換えアルファウイルス粒子、または真核生物 重層ベクター開始系は脊椎動物の細胞にエクスビボで投与され、続いてベクター または粒子を含む細胞が温血動物に投与される。 他の局面において、上記のような真核生物重層ベクター開始系および薬学的に 受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物が提供される。特定の実施 態様において、薬学的組成物はリポソーム製剤として提供される。 さらなる局面において、組換えアルファウイルス粒子を作製する方法が提供さ れる。この方法は、(a)ベクター（例えば、上記のような真核生物重層ベクター 開始系、RNAベクターレプリコン、またはアルファウイルスベクター粒子）を、 組換えアルファウイルス粒子の生成を可能にするに十分な条件下および時間でパ ッケージング細胞の集団に導入する工程、ならびに(b)組換えアルファウイルス 粒子を収集する工程を含む。関連する局面において、選択されたタンパク質を作 製する方法が提供される。この方法は、(a)選択された異種タンパク質をコード するベクター（例えば、上記の真核生物重層ベクター開始系、RNAベクターレプ リコン、またはアルファウイルスベクター粒子）を、選択されたタンパク質の生 成を可能にするに十分な条件下および時間でパッケージング細胞または他の細胞 の集団に導入する工程、ならびに(b)ベクター含有細胞により生成されるタンパ ク質を収集する工程を包含する。なお他の局面において、選択されたタンパク質 を作製する方法が提供される。この方法は、選択された異種タンパク質を生成し 得る真核生物重層ベクター開始系を、選択されたタンパク質の発現を可能にする に十分な条件下および時間で宿主細胞に導入する工程を含む。さらなる局面にお いて、本明細書中に記載されるようなRNAベクターレプリコンを含む宿主細胞株 が提供される。 本発明のなお他の局面において、アルファウイルスワクチンが提供される。こ のワクチンは、上記のアルファウイルスベクター構築物、RNAベクターレプリコ ン、真核生物ベクター開始系、または組換えアルファウイルス粒子の一つを含む 。これらは、本明細書中で提供される異種配列の１つを発現するかもしれないし 、発現しないかもしれない（例えば、それらは、アルファウイルス疾患を処置ま たは予防するためのワクチンとして単独で利用され得る）。例えば、本発明の１ つの実施態様において、核酸またはRNAベクターレプリコン核酸を実質的に全く 有しない組換えトガウイルス粒子が提供される。さらなる実施態様において、異 種ウイルス核酸（すなわち、トガウイルス粒子とは異なるウイルス由来）を含む 組換えトガウイルス粒子が提供される。なお別の実施態様において、組換えトガ ウイルス粒子はT=3以上である。 本発明のさらなる局面において、組換えキメラトガウイルス粒子（空かまたは 核酸を含むかのいずれか）が提供される。ここで、ウイルス粒子は、異なるトガ ウイルス科から得られたかまたは由来するウイルス構造成分を有する（例えば、 キャプシドタンパク質および糖タンパク質が異なるアルファウイルス供給源から 得られる）。 本発明のこれらのおよび他の局面および実施態様は、以下の詳細な説明および 添付された図面を参照すれば明白となる。さらに、より詳細に特定の手順または 組成物（例えば、プラスミド、配列など）を記載する種々の参考文献が本明細書 中に記載され、従って、各々が援用について個々に記述されたかのように、それ らの全体が参考として援用される。図面の簡単な説明 図１は、シンドビスゲノムの編成および複製ストラテジーの模式図である。 図２は、SIN-1、SIN-1/nsP1-4、Toto1101，またはSIn-1/nsP2ウイルスでMOI 1 0で感染されたBHK細胞からのウイルス放出のグラフである。培養上清は、感染の ３、６、９および12時間後に採集した。ウイルスカ価は、プラークアッセイによ り決定した。 図３は、Toto1101、SIN-1/nsP2、SIN-1/nsP1-4、またはSIN-1ウイルスによる 感染後のBHK細胞におけるウイルスRNA合成を示すグラフである。細胞はMOI 10で 感染させ、そして感染１時間後、アクチノマイシンＤおよび3Ｈウリジンを添加 した。３、６、９、および12hpiで、3Ｈウリジン取り込みの量を決定した。 図４は、SIN-1/nsP1、SIN-1/nsP2、SIN-1/nsP3、SIN-1/nsP3-4、SIN-1/nsP4、 SIN-1/nsP2-C、SIN-1/nsP2-N，Toto1101、SIN-1またはSIn-1/nsP1-4により感染 されたBHK細胞におけるウイルスRNA合成を示すグラフである。3Ｈウリジン取り 込みのレベルを野生型（Toto1101）感染に対して表す。 図５は、SIN-InsP1-4、SIN-1、SIN-1nsP2、またはToto1101ウイルスにより感 染されたBHK細胞における宿主細胞タンパク質合成の遮断を示すグラフである。 図６は、SIN-1ウイルスの8000塩基のcDNA配列である（配列番号101）。 図７は、SINCGウイルスの8000塩基のcDNA配列である（配列番号102）。 図８は、Toto1101ウイルスのcDNA配列である（配列番号103）。 図９Ａは、pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAPまたはpBG/wt ELVS 1.5-SEAPプラスミドD NAでトランスフェクトされたBHK-21細胞から単離され、そして放射性標識ウイル スRNAプローブとハイブリダイズしたRNAのノーザンブロットである。図９Ｂは、 pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAPまたはpBG/wt ELVS 1.5-SEAPプラスミドDNAでトランス フェクトされたBHK細胞におけるアルカリホスファターゼ発現の７日の時間経過 を示すグラフである。 図１０は、pBG/SIN-1 ELVS 1.5-lucまたはpBG/wt ELVS 1.5-lucプラスミドDNA でトランスフェクトされたBHK細胞におけるルシフェラーゼ発現の４日の時間経 過を示すグラフである。 図１１Ａは、pBG/SIN-1 ELVS-1.5-β-galまたはpBG/wt ELVS 1.5-β-galプラ スミドDNAでトランスフェクトされたBHK-21細胞から単離され、そして放射性標 識ウイルスRNAプローブとハイブリダイズしたRNAのノーザンブロットである。図 １１Ｂは、pBG/SIN-1 ELVS-1.5-β-galまたはpBG/wt ELVS 1.5-β-galプラスミ ドDNAのいずれかでトランスフェクトされたBHK-21細胞におけるβ-gal発現を検 出しているウエスタンブロットである。図１１Ｃは、pBG/SIN-1 ELVS-1.5-β-ga lまたはpBG/wt ELVS 1.5-β-galプラスミドDNAでトランスフェクトされたBHK細 胞におけるアルカリホスファターゼ発現の５日の時間経過を示すグラフである。 図１２ＡおよびＢは、RLU（相対的光単位）により測定した、HBV PRE配列を有 するまたは有さないELVS β-galベクターでトランスフェクトされたHT1080およ びBHK-21細胞におけるβ-gal発現を示すグラフである。 図１３は、ベクター誘導性アルファウイルスパッケージング細胞株によるRNA 増幅、構造タンパク質発現、およびベクターパッケージングの模式図である。 図１４は、アルファウイルスパッケージング細胞株の生成において用いられる ベクター誘導性構造タンパク質発現カセットの模式図である。 図１５は、異なるアルファウイルスパッケージング細胞株によるルシフェラー ゼベクターパッケージング（発現の移行）を示すグラフである。 図１６は、アルファウイルスパッケージング細胞株によるベクター誘導性構造 タンパク質発現を示すウエスタンブロットである。 図１７Ａは、pDCMV-intSINrbz構造タンパク質発現カセットを含むC6/36蚊細胞 によるルシフェラーゼベクターパッケージングを示すグラフである。図１７Ｂは 、プラスミドpBGSVCMVdlneoで安定に形質転換されたヒト293パッケージング細胞 によるルシフェラーゼベクターパッケージングを示すグラフである。 図１８は、異なるアルファウイルスパッケージング細胞株によるルシフェラー ゼベクターパッケージングを示すグラフである。 図１９は、アルファウイルスパッケージング細胞株から生成されたSINrep/Lac Zベクター粒子で感染されたBHK細胞からの3Ｈウリジン標識RNAを示すRNAゲルオ ートラジオグラフである。 図２０は、アルファウイルスパッケージング細胞株から生成されたSINrep/Lac Zベクター粒子で感染されたBHK細胞からの35Ｓメチオニン標識タンパク質を示す タンパク質ゲルオートラジオグラフである。 図２１は、キャプシド細胞株のβ-galまたは糖タンパク質ベクタートランスフ ェクション後のベクター誘導性キャプシドタンパク質発現を示すウエスタンブロ ットである。 図２２は、野生型または欠失変異体ロスリバーウイルスキャプシドタンパク質 遺伝子を含む構造タンパク質発現カセットの領域の模式図である。 図２３は、野生型または欠失変異体ロスリバーウイルスキャプシドタンパク質 遺伝子を含むベクター誘導性構造タンパク質発現カセットの模式図である。 図２４は、シンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子の上流にロスリバーウイル スキャプシドタンパク質遺伝子配列を含む「分割(split)」構造タンパク質遺伝 子発現カセットによるベクターパッケージングの模式図である。 図２５は、１つのカセットにおいてシンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子の 上流にロスリバーウイルスキャプシドタンパク質遺伝子配列、そして別のカセッ トにおいてシンドビスウイルスキャプシドタンパク質遺伝子を含む「分割」構造 タンパク質遺伝子発現カセットによるベクターパッケージングの模式図である。 図２６は、上記「分割」構造タンパク質遺伝子発現カセットを用いるベクター 粒子パッケージングの結果を示す表である。 図２７は、パッケージング化ベクター粒子調製物の増幅および組換えタンパク 質の大規模生成のためのアルファウイルスパッケージング細胞株の使用の模式図 である。 図２８は、アルファウイルスパッケージング細胞株を用いる経時的なβ-galタ ンパク質の増幅および生成を示すグラフである。 図２９は、インビボにおけるcDNAからのアルファウイルスベクターRNAの発現 を制御するためのテトラサイクリン調節プロモーター系の使用の模式図である。 図３０は、インビボにおけるcDNAからのアルファウイルスベクターRNAの発現 を制御するための連結転写リプレッサーおよび転写インデューサー／アクチベー ター調節プロモーター系の使用の模式図である。 図３１ＡおよびＢは、SINrep/LacZレプリコン、およびDH構築物を含む種々のR RVキャプシド由来のDH RNAでエレクトロポレートされたBHK細胞から、およびエ レクトロポレーションの18時間後の培養液に存在するベクター粒子から単離され た変性グリオキサールゲル上で電気泳動された[3Ｈ]ウリジン標識RNAのオートラ ジオグラフである。 図３２ＡおよびＢは、SINrep/LacZレプリコン、およびDH構築物を含む種々のR RVキャプシド由来のDH RNAでエレクトロポレートされたBHK細胞から、およびエ レクトロポレーションの18時間後の培養液に存在するベクター粒子からの35Ｓメ チオニン標識タンパク質を示すタンパク質ゲルオートラジオグラフである。 図３３Ａ〜Ｄは、野生型遺伝子（Ａ）および３つの欠失変異体ＣΔ1rrv、ＣΔ 2rrv、およびＣΔ3rrv（それぞれＢ〜Ｄ）から発現された種々のロスリバーウイ ルス(RRV)キャプシドタンパク質のKyte-Doolittle疎水性プロットである。 図３４は、野生型遺伝子（配列番号114）および３つの欠失変異体ＣΔ1rrv（ 配列番号115）、ＣΔ2rrv（配列番号116）、およびＣΔ3rrv（配列番号117）か ら発現されたアミノ末端RRVキャプシドタンパク質を示す模式図である。RRVキャ プシド遺伝子変異体において欠失されたリジン残基が示される。 図３５は、Toto1101野生型ウイルスで高いMOIで感染されたBHK細胞においてウ イルス粒子に取り込まれた[35Ｓ]メチオニンおよび[3Ｈ]ウリジンの相対的レベ ルを示すグラフである。 図３６は、SINrep/lacZおよびDH-BB（5’tRNA）Crrv DHRNAでエレクトロポレ ートされたBHK細胞においてウイルス粒子に取り込まれた[35Ｓ]メチオニンおよ び[3Ｈ]ウリジンの相対的レベルを示すグラフである。 図３７は、SINrep/lacZおよびRRVキャプシド欠失変異体DH-BB（5’tRNA）CΔ ３rrv DH RNAでエレクトロポレートされたBHK細胞においてウイルス粒子に取り 込まれた[35Ｓ]メチオニンおよび[3Ｈ]ウリジンの相対的レベルを示すグラフで ある。 図３８は、SINrep/lacZおよびDH RNAでエレクトロポレートされた、またはTot o1101野生型ウイルスで感染されたBHK細胞においてウイルス粒子に取り込まれた [35Ｓ]メチオニンおよび[3Ｈ]ウリジンの相対的レベルを示す、図３５〜３７に 示す結果をまとめるグラフである。 図３９は、pBGSVCMVdlhygで安定に形質転換されたBHK細胞によるルシフェラー ゼベクターパッケージングを示すグラフである。用語の定義 以下の用語を明細書を通して使用する。他に示されていなければ、これらの用 語を以下のように定義する： 「ゲノムRNA」とは、標的細胞内でインビボにおけるそれ自身の増幅または自 己複製を指向するのに必要な遺伝情報の全てを含むRNAをいう。それ自身の複製 を指向するために、RNA分子は、１）１つ以上のポリメラーゼ、レプリカーゼ、 あるいはウイルスもしくは宿主細胞由来タンパク質、核酸、またはリボヌクレオ タンパク質と相互作用し、RNA増幅過程を触媒し得る他のタンパク質をコードし 得；そして２）複製に必要なシスRNA配列（これは、その自己コード化タンパク 質、または非自己コード化細胞由来タンパク質、核酸もしくはリボヌクレオタン パク質、あるいはこれらの任意の成分間の複合体により、複製過程で結合され得 る）を含み得る。アルファウイルス由来ゲノムRNA分子は、以下の順でのエレメ ントを含むべきである：複製のためにシスで必要な5'ウイルスまたは欠陥干渉性 RNA配列（単数または複数）、発現されたとき生物学的に活性なアルファウイル ス非構造タンパク質（例えば、nsP1、nsP2、nsP3、nsP4）をコードする配列、複 製のためにシスで必要な3'ウイルス配列、およびポリアデニル化域。アルファウ イルス由来ゲノムRNAベクターレプリコンはまた、特定の実施態様において、サ ブゲノムフラグメントのウイルス転写を防ぐか、増大させるか、または減少させ るように改変され得るウイルスサブゲノム「連結領域」プロモーター、および発 現されたとき生物学的に活性なアルファウイルス構造タンパク質（例えば、C、E 3、E2、6K、E1）をコードする配列を含み得る。一般に、用語ゲノムRNAは、＋極 の分子、または「メッセージ」センスをいい、そしてゲノムRNAは、任意の公知 の天然に存在するアルファウイルスとは異なる長さであり得る。好ましい実施態 様において、ゲノムRNAは、任意のアルファウイルス構造タンパク質（単数また は複数）をコードする配列を含まず、むしろそれらの配列は、異種配列と置換さ れる。ゲノムRNAが組換えアルファウイルス粒子中にパッケージングされる場合 、 これは、アルファウイルス構造タンパク質と相互作用を開始させるように作用し て粒子形成に至る１つ以上の配列を含まなければならず、好ましくは、用いられ るパッケージング系により効率的にパッケージングされる長さである。 「サブゲノムRNA」（または「26S」RNA）とは、それが由来するゲノムRNAより 小さい長さまたはサイズのRNA分子をいう。サブゲノムRNAは、配列がゲノムRNA またはその相補体内に位置する内部プロモーターから転写されるべきである。サ ブゲノムRNAの転写は、ウイルスコード化ポリメラーゼ（単数または複数）、宿 主細胞コード化ポリメラーゼ（単数または複数）、転写因子（単数または複数） 、リボヌクレオタンパク質（単数または複数）、またはそれらの組み合わせによ り媒介され得る。好ましい実施態様では、サブゲノムRNAは、本発明に従ってベ クターから生成され、そして目的の遺伝子（単数または複数）または配列（単数 または複数）をコードするか、または発現させる。サブゲノムRNAは、必ずしも2 6の沈降係数を有するわけではない。 「アルファウイルスベクター構築物」とは、目的の配列（単数または複数）ま たは遺伝子（単数または複数）の発現を指向し得るアセンブリをいう。このよう なベクター構築物は、アルファウイルスRNAの転写を開始させ得る5'配列（背景 では、5’CSEとも称される）、ならびに発現されたとき生物学的に活性なアルフ ァウイルス非構造タンパク質（例えば、nsP1、nsP2、nsP3、nsP4）をコードする 配列、およびアルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列（背景では、3’CSEと も称される）で構成される。さらに、ベクター構築物は、特定の実施態様におい て、サブゲノムフラグメントのウイルス転写を防ぐか、増大させるか、または減 少させるように改変され得るウイルスサブゲノム「連結領域」プロモーター、お よびまたポリアデニル化域を含むべきである。ベクターはまた、１つ以上の構造 タンパク質遺伝子由来の配列またはその部分、生存可能なウイルスの生成を可能 にするのに充分なサイズである外来性核酸分子（単数または複数）、cDNAからの インビトロでのウイルスRNAの合成を開始させ得る5'プロモーター、発現される べき異種配列、ならびに異種配列の挿入のための１つ以上の制限部位を含み得る 。 「アルファウイルスRNAベクターレプリコン」、「RNA ベクターレプリコン」お よび「レプリコン」とは、標的細胞内でインビボにおけるそれ自身の増幅または 自己複製を指向し得るRNA分子をいう。それ自身の増幅を指向するために、RNA分 子は、１）１つ以上のポリメラーゼ、レプリカーゼ、あるいはウイルスもしくは 宿主細胞由来タンパク質、核酸、またはリボヌクレオタンパク質と相互作用し、 RNA増幅を触媒し得る他のタンパク質をコードし得；そして２）複製に必要なシ スRNA配列（これは、その自己コード化タンパク質、または非自己コード化細胞 由来タンパク質、核酸もしくはリボヌクレオタンパク質、あるいはこれらの任意 の成分間の複合体により、複製過程で結合され得る）を含み得る。特定の実施態 様では、増幅はまた、インビトロで生じ得る。アルファウイルス由来RNAベクタ ーレプリコン分子は、以下の順でのエレメントを含むべきである：複製のために シスで必要な5'ウイルス配列（背景では、5’CSEとも称される）、発現されたと き生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、nsP1、nsP2、 nsP3、nsP4）をコードする配列、複製のためにシスで必要な3’ウイルス配列（ 背景では、3’CSEとも称される）、およびポリアデニル化域。アルファウイルス 由来RNAベクターレプリコンはまた、特定の実施態様において、サブゲノムフラ グメントのウイルス転写を防ぐか、増大させるか、または減少させるように改変 され得るウイルスサブゲノム「連結領域」プロモーター、１つ以上の構造タンパ ク質遺伝子由来の配列またはその部分、生存可能なウイルスの生成を可能にする のに充分なサイズである外来性核酸分子（単数または複数）、ならびに発現され るべき異種配列（単数または複数）を含み得る。細胞におけるRNAベクターレプ リコンの供給源は、ウイルスまたは組換えアルファウイルス粒子での感染、ある いはプラスミドDNAまたはインビトロ転写RNAのトランスフェクションに由来し得 る。 「組換えアルファウイルス粒子」とは、アルファウイルスRNAベクターレプリ コンを含むビリオン単位をいう。一般に、組換えアルファウイルス粒子は、１つ 以上のアルファウイルス構造タンパク質、脂質エンベロープ、およびRNAベクタ ーレプリコンを含む。好ましくは、組換えアルファウイルス粒子は、宿主細胞由 来脂質二重層（例えば、原形質膜）内に含まれるヌクレオキャプシド構造を含み 、ここには、アルファウイルスコード化エンベロープ糖タンパク質が包埋されて いる。粒子はまた、アルファウイルスが由来する粒子の指向性を指向する他の成 分（例えば、ビオチンのような標的化エレメント、他のウイルス構造タンパク質 、 または他のレセプター結合リガンド）、または他のRNA分子を含み得る。 「構造タンパク質発現カセット」とは、１つ以上のアルファウイルス構造タン パク質の合成を指向し得る核酸分子をいう。発現カセットは、cDNAからのRNAの 合成をインビボで開始させ得る5'プロモーター、ならびに発現されたとき１つ以 上の生物学的に活性なアルファウイルス構造タンパク質（例えば、C、E3、E2、6 K、E1）をコードする配列、および転写終結を制御する3'配列を含むべきである 。発現カセットはまた、アルファウイルスRNAの転写を開始させ得る5'配列（背 景では、5’CSEとも称される）、ウイルスサブゲノム「連結領域」プロモーター 、およびアルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列（背景では、3’CSEとも称 される）を含み得る。特定の実施態様において、発現カセットはまた、スプライ ス認識配列、触媒リボザイムプロセシング配列、選択マーカーをコードする配列 、核輸送シグナル、ならびにポリアデニル化配列を含み得る。さらに、アルファ ウイルス構造タンパク質（単数または複数）の発現は、特定の実施態様において 、誘導性プロモーターの使用により調節され得る。 「安定な形質転換」とは、生細胞への核酸分子の導入、および連続周期の細胞 分裂を通した子孫細胞におけるその核酸分子の長期または恒久的な維持をいう。 核酸分子は、任意の細胞区画に維持され得、このような区画には、核、ミトコン ドリア、または細胞質が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施態様 では、核酸分子は、核において維持され得る。維持は、染色体内（組み込み）ま たは染色体外（エピソーム事象として）であり得る。 「アルファウイルスパッケージング細胞株」とは、アルファウイルス構造タン パク質発現カセットを含み、かつアルファウイルスベクター構築物、RNAベクタ ーレプリコン、真核生物重層ベクター開始系、または組換えアルファウイルス粒 子の導入後、組換えアルファウイルス粒子を生成する細胞をいう。親細胞は、哺 乳動物起源であるか、または哺乳動物起源でなくてもよい。好ましい実施態様で は、パッケージング細胞株は、構造タンパク質発現カセットで安定に形質転換さ れている。 「アルファウイルスプロデューサー細胞株」とは、組換えアルファウイルス粒 子を生成し得る細胞株をいう。この細胞株は、アルファウイルスパッケージング 細胞株を含み、この中にはまた、アルファウイルスベクター構築物、RNAベクタ ーレプリコン、真核生物重層ベクター開始系、または組換えアルファウイルス粒 子が含まれる。好ましくは、アルファウイルスベクター構築物は真核生物重層ベ クター開始系であり、そしてプロデューサー細胞株はそのベクター構築物で安定 に形質転換される。好ましい実施態様では、アルファウイルスベクター構築物の 転写および続く組換えアルファウイルス粒子の生成は、１つ以上の因子またはア ルファウイルスプロデューサー細胞株の分化状態に応じてのみ生じる。 「欠陥ヘルパー構築物」とは、トランスで供給された生物学的に活性なアルフ ァウイルス非構造タンパク質に応じて、RNA増幅または複製、および１つ以上の アルファウイルス構造タンパク質の発現を行い得るアセンブリをいう。欠陥ヘル パー構築物は、以下の順でのエレメントを含むべきである：複製のためにシスで 必要な5'ウイルスまたは欠陥干渉性RNA配列、ウイルスサブゲノム連結領域プロ モーター、発現されたとき１つ以上の生物学的に活性なアルファウイルス構造タ ンパク質（例えば、C、E3、E2、6K、E1）をコードする配列、複製のためにシス で必要な3'ウイルス配列、およびポリアデニル化域。欠陥ヘルパー構築物はまた 、cDNAからのウイルスRNAの合成を開始させ得る5'プロモーター、転写終結を制 御する3'配列、スプライス認識配列、触媒リボザイムプロセシング配列、選択マ ーカーをコードする配列、および核輸送シグナルを含み得る。 「真核生物重層ベクター開始系」とは、目的の配列（単数または複数）または 遺伝子（単数または複数）の発現を指向し得るアセンブリをいう。真核生物重層 ベクター開始系は、cDNAからのインビボ（即ち、細胞内）でのRNAの合成を開始 させ得る5'プロモーター、および真核生物細胞におけるそれ自身の複製を指向し 、かつ異種配列を発現させ得る核酸ベクター配列を含むべきである。それ自身の 増幅を指向し得る核酸配列は、ウイルス起源であってもなくてもよい。特定の実 施態様では、核酸ベクター配列はアルファウイルス由来配列であり、そして、ア ルファウイルスRNAの転写を開始させ得る5'配列（背景では、5’CSEとも称され る）、ならびに発現されたとき生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパ ク質（例えば、nsP1、nsP2、nsP3、nsP4）をコードする配列、およびアルファウ イルスRNAポリメラーゼ認識配列（背景では、3’CSEとも称される）で構成され る。さらに、ベクター配列は、特定の実施態様において、サブゲノムフラグメン トのウイルス転写を防ぐか、増大させるか、または減少させるように改変され得 るウイルスサブゲノム「連結領域」プロモーター、１つ以上の構造タンパク質遺 伝子由来の配列またはその部分、至適な増幅を可能にするのに充分なサイズであ る外来性核酸分子（単数または複数）、発現されるべき異種配列、異種配列の挿 入のための１つ以上の制限部位、ならびにポリアデニル化配列を含み得る。真核 生物重層ベクター開始系はまた、スプライス認識配列、触媒リボザイムプロセシ ング配列、核輸送シグナル、および転写終結配列を含み得る。特定の実施態様で は、cDNAからのベクター核酸配列のインビボ合成は、誘導性プロモーターの使用 によって調節され得る。 「アルファウイルスcDNAベクター構築物」とは、目的の配列（単数または複数 ）または遺伝子（単数または複数）の発現を指向し得るアセンブリをいう。ベク ター構築物は、アルファウイルスRNAの転写を開始させ得る5'配列（背景では、5 ’CSEとも称される）、ならびに発現されたとき生物学的に活性なアルファウイ ルス非構造タンパク質（例えば、nsP1、nsP2、nsP3、nsP4）をコードする配列、 およびアルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列（背景では、3’CSEとも称さ れる）で構成される。さらに、ベクター構築物は、cDNAからのウイルスRNAの合 成をインビボで開始させ得る5'プロモーター、および転写終結を制御する3'配列 を含むべきである。特定の実施態様では、ベクター構築物は、特定の実施態様に おいて、サブゲノムフラグメントのウイルス転写を防ぐか、増大させるか、また は減少させるように改変され得るウイルスサブゲノム「連結領域」プロモーター をさらに含み得る。ベクターはまた、１つ以上の構造タンパク質遺伝子由来の配 列またはその部分、生存可能なウイルスの生成を可能にするのに充分なサイズで ある外来性核酸分子（単数または複数）、発現されるべき異種配列、異種配列の 挿入のための１つ以上の制限部位、スプライス認識配列、触媒リボザイムプロセ シング配列、核輸送シグナル、ならびにポリアデニル化配列を含み得る。特定の 実施態様では、cDNAからのウイルスRNAのインビボ合成は、誘導性プロモーター の使用によって調節され得る。 「遺伝子送達ビヒクル」とは、目的の遺伝子または配列を送達するために利用 され得る構築物をいう。代表例は、アルファウイルスRNAベクターレプリコン、 アルファウイルスベクター構築物、真核生物重層ベクター開始系、および組換え アルファウイルス粒子を含む。 本発明の多数の局面および利点は、以下の詳細な説明を考慮すると当業者に明 らかである。この詳細な説明により、本発明の実施の啓発が提供される。発明の詳細な説明 上記のように、本発明は、例えば、RNAベクターレプリコン、アルファウイル スベクター構築物、真核生物重層ベクター開始系、および組換えアルファウイル ス粒子を含む、新規な遺伝子送達ビヒクルを提供する。簡略には、プラスミドDN A、インビトロで転写されたRNA、または粒子に基づく、本発明のベクターの細胞 への導入は、野生型由来アルファウイルスベクターの発現レベルと比較して等価 であるかまたは高いレベルの異種遺伝子発現をもたらす。しかし、予想外に、合 成されるベクター特異的RNAのレベルは、本発明の遺伝子送達ビヒクルを含む培 養細胞においては、野生型由来ベクターと比較して少なくとも約５〜10倍低い。 さらに、このような遺伝子送達ビヒクルは、宿主細胞中への導入の後に、野生型 由来ベクターと比較して阻害が減少した、遅延した、または存在しない、宿主細 胞に指向される巨大分子合成を示す。 以下でより詳細に議論するように、本発明は、以下を提供する：(A)本発明の 遺伝子送達ビヒクルの構築のために適切な野生型アルファウイルスの供給源；(B )所望の表現型を有するアルファウイルスを選択するための方法；(C)アルファウ イルスベクター構築物およびアルファウイルスRNAベクターレプリコンの構築；( D)真核生物重層ベクター開始系の構築；(E)組換えアルファウイルス粒子の構築 ；(F)本発明の遺伝子送達ビヒクルにより発現され得る異種配列；(G)アルファウ イルスパッケージング細胞株またはプロデューサー細胞株の構築；(H)薬学的組 成物；および(I)アルファウイルスに基づくベクターを利用するための方法。 Ａ．野生型アルファウイルスの供給源 上記のように、本発明は、アルファウイルスに基づく広範囲な種々のベクター （例えば、RNAベクターレプリコン、アルファウイルスベクター構築物、真核生 物重層ベクター開始系、および組換えアルファウイルス粒子）ならびにこのよう なベクター構築物および粒子を利用するための方法を提供する。簡略には、上記 のベクターの調製における使用のために適切な野生型アルファウイルスをコード する配列は、本明細書中に提供される開示が与えられれば、天然に存在する供給 源または寄託所（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション，Rockvill e，Maryland）から容易に入手され得る。さらに、野生型アルファウイルスは、 野生型アルファウイルスに感染した細胞における宿主細胞に指向される巨大分子 合成のレベルと、本発明の遺伝子送達ビヒクルを含む細胞における宿主細胞に指 向される巨大分子合成のレベルとを比較するために利用され得る。 適切なアルファウイルスの代表例は、アウラウイルス（ATCC VR-368）、ベバ ルウイルス（ATCC VR-600、ATCC VR-1240）、キャバソウ（Cabassou）ウイルス （ATCC VR-922）、チクングンヤウイルス（ATCC VR-64、ATCC VR-1241）、東部 ウマ脳脊髄炎ウイルス（ATCC VR-65、ATCC VR-1242）、フォートモルガン（Fort Morgan）ウイルス（ATCC VR-924）、ゲタウイルス（ATCC VR-369，ATCC VR-124 3）、キジルアガハ（Kyzylagach）ウイルス（ATCC VR-927）、マヤロウイルス（ ACTT VR-66、ATCC VR-1277）、ミッデルブルグウイルス（ATCC VR-370）、ムカ ンボウイルス（ATCC VR-580、ATCC VR-1244）、ヌヅムウイルス（ATCC VR-371） 、ピクスナウイルス（ATCC VR-372，ATCC VR-1245）、ロスリバーウイルス（ATC C VR-373、ATCC VR-1246）、セムリキ森林ウイルス（ATCC VR-67、ATCC VR-1247 ）、シンドビスウイルス（ATCC VR-68、ATCC VR-1248；以下に記載されるCMCC番 号4640もまた参照のこと)、トナテ(Tonate)ウイルス(ATCC VR-925)、トリニティ ウイルス(ATCC VR-469)、ウナウイルス(ATCC VR-374)、ヴェネズエラウマ脳脊髄 炎ウイルス(ATCC VR-69、ATCC VR-923、ATCC VR-1250、ATCC VR-1249、ATCC VR- 532)、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス(ATCC VR-70、ATCC VR-1251、ATCC VR-622、AT CC VR-1252)、ワタロアウイルス(ATCC VR-926)、およびY-62-33ウイルス(ATCC V R-375)を含む。 細胞巨大分子合成のレベルを比較する目的のために、以下のプラスミドもまた 、野生型アルファウイルスストックの標準的な供給源として利用され得る。これ ら のプラスミドは、以下を含む：セムリキ森林ウイルスのためには、pSP6-SFV4（L iljestromら，J.Virol．65:4107-4113，1991）；ヴェネズエラウマ脳炎ウイルス のためには、pV2000（Davisら，Vir.183:20-31，1991）；ロスリバーウイルスの ためには、pRR64（Kuhnら，Vir．182:430-441，1991）。簡略には、これらのプ ラスミドのためには、プラスミド由来のインビトロで転写されたゲノムRNAでト ランスフェクトされたBHK細胞からウイルスが入手され得る。シンドビスウイル スのためには、感染性ウイルスは、pVGELVIS（ATCC番号75891）プラスミドDNAで トランスフェクトされたBHK細胞から直接単離され得るか、あるいは野生型ウイ ルスストックとして入手され得る（ATCC番号VR-2526に関して以下に提供される 寄託情報を参照のこと）。 Ｂ．所望の表現型を有するアルファウイルスの選択 アルファウイルスに基づくベクターからのインビボ異種遺伝子発現の持続は、 いくつかの機構（宿主細胞に指向される巨大分子合成の阻害を含む）により影響 される。しかし、本発明の前には、非細胞変性表現型をもたらす、コードまたは 非コードベクターウイルス特異的配列の変化を選択するかまたは同定するための 明白な方法は存在しなかった。従って、本発明の１つの局面では、宿主細胞に指 向される巨大分子合成の阻害が減少しているかまたは存在しない、アルファウイ ルス由来遺伝子送達ビヒクルを単離および／または構築するための方法が提供さ れる。 １．ウイルス改変体の生物学的選択 ａ．DI 粒子を含むウイルスストックからの選択 非細胞変性性アルファウイルス改変体を単離するための１つのアプローチは、 野生型ウイルス調製物における欠陥妨害（DI）粒子の存在を利用する。簡略には 、特定のRNAウイルス（例えば、ラブドウイルス（例えば、水庖性口内炎ウイル ス）およびアルファウイルス（例えば、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林 ウイルス））は高度に細胞変性性であるが、これらはそれにもかかわらずDI粒子 の存在下で培養細胞において長期間持続した感染を確立する。定義によれば、DI 粒子は、野生型ウイルスに由来し、そしてDIによる自律的複製を防ぐ野生型ゲノ ムからの１つ以上の変異（例えば、欠失、再編、ヌクレオチド置換など）を含む 。一般に、DI粒子のゲノムは、野生型ウイルスと比較して小さく、かつ複雑度が 低く、そしてタンパク質をコードする領域を欠失しているが、複製のためにシス で必要とされる領域は維持している。このようなシス配列は、しばしば重複およ び／または再編されている。特定のアルファウイルス（例えば、シンドビスウイ ルス）の場合、DI RNAゲノムの配列および編成は分析されており、そして野生型 ウイルスゲノムの一番端の3'末端由来の最小限50ntを含み、そしてその5'末端で は、野生型配列または細胞tRNA（例えば、tRNAAsp）配列のいずれかをウイルス 配列に加えて含むことが見出されている。全ての場合において、変異DIゲノムの 増殖および維持は、感染細胞において親のヘルパーウイルスの同時存在を必要と する。しかし、それらの遺伝構造の結果として、DIゲノム複製は、その野生型対 応物に対して非常に優れており、そして比較して豊富である。この特徴は、野生 型ゲノム複製の妨害、感染性ウイルスの非存在または低レベルの生成、および細 胞の長期間存続する感染の確立をもたらす。 従って、以下で実施例１および２に記載のように、DI粒子の集団を含む混合ア ルファウイルスストックでの感染により許容細胞（例えば、ヒト起源の細胞を含 む、哺乳動物細胞）において長期間存続する感染を確立する能力は、DI粒子の非 存在下でさえも存続する感染を確立し得る完全にインタクトなウイルス改変体を 経時的に単離するための機構を提供する。このような感染性ウイルス改変体は、 長期間存続する感染性培養物から、複数回のプラーク精製により単離され得、そ して宿主細胞において増殖性（productive）、存続性、および非細胞変性性の感 染を開始することが見出されている。さらに、このような増殖性、存続性、およ び非細胞変性性の感染から生成される改変体ウイルスのレベルは、野生型ウイル ス感染と区別できない。この観察は、DI粒子の混台物を含むウイルスストックで の存続性感染の確立の以前の必要要件とは明らかに対照的である。 ｂ．DI 粒子を含まないウイルスストックからの選択 欠陥妨害粒子を含むウイルスストックからの選択に加えて、本発明での使用に 適切なウイルス改変体は、精製ウイルスストック（DI粒子を含まない）から入手 され得る。このウイルスストックは、感受性培養細胞の感染の前にランダム変異 誘発に供されるか、または培養細胞でのRNA複製の間に非特異的変異を作製させ るかのいずれかである。簡略には、最初のウイルスストックは、天然の単離株ま たはそれに由来する生物学的改変体として入手され得るか、または培養細胞を、 ゲノムcDNAクローンまたはインビトロで転写されたRNAを含む感染性核酸分子で トランスフェクトすることにより作製され得る。所望の場合、次いで、ウイルス ストックは、物理的または化学的変異誘発に供され得る（好ましいとはいえ、こ のような変異誘発は必要ではない）。化学的変異誘発の場合、好ましい実施態様 は、容易に利用され得る変異誘発剤（例えば、亜硝酸、5-アザシチジン、N-メチ ル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン、またはエチルメタンスルホン酸（Sigma， St．Louis，MO））をウイルス感染の前に利用する。ランダム変異誘発の後に、 特異的選択手順を適用して、以下の実施例２により詳細に記載するような所望の 表現型を有するウイルス改変体が単離される。 ２．ウイルス改変体の遺伝的選択 関連するアプローチにおいて、変異は、ウイルスストックを用いずに、むしろ ウイルスのクローン化ゲノムcDNAを用いて入手され得る。このウイルスは、その 後、感染性ウイルスRNAをインビトロで（例えば、シンドビスウイルス(Riceら， J．Virol．61:3809-3819，1987;Dubenskyら，J．Virol．70:508-519，1996)、 183:20-31，1991）、ロスリバーウイルス（Kuhnら，Virology 182:430-441，199 1）、ポリオウイルス(Van Der Werfら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA83:2330-23 34，1986))またはインビボで（シンドビスウイルス（Dubenskyら、同書）、ポリ オウイルス（RacanielloおよびBaltimore，Science 214:916-919，1981））転写 するために使用され得る。簡略には、感染性核酸は、直接に、または上記の方法 の１つを用いて行った変異誘発の後のいずれかに、感受性培養細胞（例えば、ヒ ト起源の細胞を含む、哺乳動物細胞）中に導入される。あるいは、ベクター核酸 は、粒子中に最初にパッケージングされ得、そして粒子は選択のために標的細胞 集団にベクターを送達するために使用され得る。続いて、所望の表現型を有する ウイルス改変体を単離するための特異的選択手順が適用され、そして以下に記載 される。 特定の実施態様において、ランダム変異誘発は、E.coliのXL1-Red株（Stratag ene，San Diego，CA）においてウイルスcDNAを含むプラスミドの増殖により最初 に実施され得る。この株は、mutS、mutD、およびmutT変異に起因して、３つの主 要なDNA修復経路を欠損している。しかし、他の変異誘発手順（リンカースキャ ニング変異誘発（Haltinerら，Nucleic Acids Res．13:1015，1985;Barany，Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 82:4202，1985）、ランダムオリゴヌクレオチド特異 的変異誘発（Kunkelら，Methods Enzymol．155:166，1987;ZollerおよびSmith， Mathods Enzymol．154:329，1987;Hillら，Methods Enzymol．155:558，1987;He rmesら，Gene 84:143，1989）、およびPCR変異誘発（HerlitzeおよびKoenen，Ge ne 91:143，1990）を含むがこれらに限定されない）が、公開されたプロトコル を利用して容易に置換され得る。得られる変異cDNAクローンの混合集団は、感受 性培養細胞中に、直接的にまたはインビトロでの転写の後に導入される。所望の 表現型の変異ウイルスを含むトランスフェクト細胞についての富化は、以下のよ うに、野生型ウイルスに感染した細胞を越える増加した生存時間に基づいて達成 される。 ３．ウイルス由来ベクターを用いる改変体の遺伝的選択 別のアプローチにおいて、変異は、ウイルス由来発現ベクターの任意の領域（ 調節領域、非翻訳領域、またはタンパク質コード遺伝子領域を含む）において作 製され得る。例えば、本発明の１つの局面において、宿主細胞に指向される巨大 分子合成の阻害が低減しているかまたは存在しないウイルス改変体を選択するた めの方法が提供される。この方法は、(a)細胞に真核生物重層ベクター開始系、R NAベクターレプリコン、または免疫原性細胞表面タンパク質の発現を行う（ベク ター含有細胞の検出に適切な）組換えアルファウイルス粒子、あるいは選択マー カー（薬物または非薬物マーカーのいずれかであって、ここで、非ベクター含有 細胞は、例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン、gpt、ピ ューロマイシン、またはヒスチジノールのような薬物の添加の際に殺傷される） を導入する工程；(b)所望の表現型を示すベクター含有細胞を選択する条件下で そしてそれに十分な時間で細胞をインキュベートまたは培養する工程；その後、 (c)所望の表現型のベクターを含む細胞を単離する工程、および(d)原因の変 異についてベクターを分析する工程を含む。 上記のように、本発明のウイルスベクターは、広範囲な種々のウイルス（例え ば、シンドビスウイルス（Xiongら，Science 243:1188-1191，1989;Hahnら，Pro c．Natl．Acad．Sci．USA89:2679-2683，1992;Schlesinger，Trends Biotechnol ．11:18-22，1993;Dubenskyら，同書）、セムリキ森林ウイルス（Liljestromお よびGaroff，Bio/Technology 9:1356-1361，1991）、ヴェネズエラウマ脳炎ウイ ルス（Davisら，J．Cell．Biochem．Suppl．19A:310，1995）、ポリオウイルス （Choiら，J．Virol．65:2875-2883，1991;Ansardiら，Cancer Res．54:6359-63 64，1994;およびAndinoら，Science 265:1448-1451，1994））に由来し得る。上 記の方法の代表例は、以下の実施例２により詳細に議論される。 ４．ウイルス改変体の使用 本明細書中でより詳細に議論するように、本明細書中に提供される方法を利用 して選択または作製されたウイルス改変体は、所望の表現型を示す広範囲な種々 の組換え遺伝子送達ビヒクルを構築するために利用され得る。特定の実施態様で は、遺伝子送達ビヒクルは、nsP2遺伝子のLeu-Xaa-Pro-Gly-Gly（「LXPGG」）モ チーフ内に変異を含む。簡略には、nsP2遺伝子の公開された配列が利用可能であ るアルファウイルスについては、高度に保存されたアミノ酸モチーフ-Leu-Xaa-P ro-Gly-Gly-（「LXPGG」）が観察される。標準的なタンパク質モデリングアルゴ リズム（ChouおよびFasman，Adv．Enzym．47:45-148，1978）により推定された ように、このモチーフの残基は、構造中におそらくβターンを含む。シンドビス ウイルスにおけるnsP2のプロリン726は、このモチーフの中心の残基である。他 のアルファウイルスにおける対応するモチーフを以下の表に例示する。 *公開されたnsP2配列を有するアルファウイルス株：(1)Straussら，Virology 13 3:92-110，1984；(2)Simpsonら，Virology 222:464-4691996:(3)Shirakoら，Vir ology 182:753-764，1991;(4)Rumenapfら，Virology 208:621-633，1995;(5)Tak kinen，Nucleic Acids Res．14:5667-5682，1986;(6)Kinneyら，Virology 170:1 9-30，1989;および(7)Faragherら，Virology 163:509-526，1988。 それ故、本発明の種々の実施態様においては、遺伝子送達ビヒクルが提供され る。ここで、遺伝子送達ビヒクルは、LXPGGモチーフに変異を有するnsP2遺伝子 を含む。１つの実施態様では、Leuコドンは、Ala、Arg、Asn、Asp、Asx、Cys、G ln、Glu、Glx、Gly、His、Ile、Lys、MeLPhe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、 または別の稀なもしくな非タンパク質性のアミノ酸（例えば、Lehninger，Bioch emistry，Worth Publishers，Inc．N.Y．N.Y.，1975を参照のこと）からなる群 より選択される別のアミノ酸に変異される。別の実施態様では、Proコドンは、A la，Arg、Asn、Asp、Asx、Cys、Gln、Glu、Glx、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Mel 、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、または別の稀なもしくな非タンパク質性のア ミノ酸からなる群より選択される別のアミノ酸に変異される。他の実施態様では 、Glyコドンのいずれかまたは両方は、Ala、Arg、Asn、Asp、Asx、Cys、Gln、Gl u、 Glx、His、Ile、Leu、Lys，Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、または 別の稀なもしくな非タンパク質性のアミノ酸からなる群より選択される別のアミ ノ酸に変異され得る。さらに他の実施態様では、Xaaアミノ酸またはLXPGGモチー フの１〜３残基上流もしくは下流のアミノ酸は、得られる遺伝子送達ビヒクルの 表現型に影響を与えるために、野生型アミノ酸から変異され得る。本発明の特定 の実施態様では、LXPGGモチーフは、１つより多くのコドンの改変、あるいは１ つ以上の挿入または欠失を含むように変異され得る。 Ｃ．アルファウイルスベクター構築物およびアルファウイルスRNAベクターレプ リコン 上記のように、本発明は、アルファウイルスに由来するDNAおよびRNAの両方の 構築物を提供する。簡略には、本発明の１つの局面では、cDNAからのウイルスRN Aの合成をインビトロで開始する5'プロモーター、アルファウイルスRNAの転写を 開始する5'配列、４つの全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能に コードする核酸分子（上記のような単離された核酸分子、アルファウイルスRNA ポリメラーゼ認識配列、および3'ポリアデニル化域を含む）を含むアルファウイ ルスベクター構築物が提供される。他の局面では、アルファウイルスRNAの転写 を開始する5'配列、４つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能に コードする核酸分子（上記の単離された核酸分子、アルファウイルスRNAポリメ ラーゼ認識配列、および3'ポリアデニル化域を含む）を含むRNAベクターレプリ コンが提供される。上記の好ましい実施態様では、上記の構築物はさらに、ウイ ルス連結領域を含む。これらの局面のそれぞれは、以下でより詳細に議論される 。 １．ウイルスRNAの合成を開始する5'プロモーター 上記のように、本発明の特定の実施態様において、インビトロ転写のプロセス によりcDNAからのウイルスRNAの合成を開始する5'プロモーター（例えば、DNA依 存性RNAポリメラーゼプロモーター）を含むアルファウイルスベクター構築物が 提供される。好ましい実施態様では、このようなプロモーターは、例えば、バク テリオファージT7、T3、およびSP6 RNAポリメラーゼプロモーターを含む。同様 に、インビボで（すなわち細胞内で）cDNAからのウイルスRNAの合成を開始する5 'プロモーター（例えば、DNA依存性RNAポリメラーゼプロモーター）を含む真核 生物重層ベクター開始系が提供される。特定の実施態様では、このようなRNAポ リメラーゼプロモーター（アルファウイルスベクター構築物または真核生物重層 ベクター開始系のいずれか）は、原核生物および真核生物の両方に由来し得、そ して例えば、細菌のβ-ガラクトシダーゼおよびtrpEプロモーター、ならびに真 核生物ウイルスのシミアンウイルス40（SV40）（例えば、初期または後期）、サ イトメガロウイルス（CMV）（例えば、即時型）、モロニーマウス白血病ウイル ス（MoMLV）またはラウス肉腫ウイルス（RSV）LTR、および単純ヘルペスウイル ス（HSV）（チミジンキナーゼ）のプロモーターを含む。 ２．転写を開始する配列 上記のように、好ましい実施態様では、本発明のアルファウイルスベクター構 築物およびRNAベクターレプリコンは、アルファウイルスRNAの転写を開始し得る 5'配列（5'末端CSEまたは5'シス複製配列ともいう）を含む。このような配列の 代表例は、野生型シンドビスウイルスのヌクレオチド1〜60、および塩基150〜21 0に沿ったより少ない範囲のヌクレオチド、tRNAAspのヌクレオチド10〜75（アス パラギン酸、Schlesingerら、米国特許第5,091,309号）、ならびに転写を開始す る他のアルファウイルス由来の5'配列を含む。一鎖ゲノムコピーの3'末端に対応 する配列、nsPレプリカーゼ複合体により結合される配列、およびおそらくさら なる宿主細胞因子（ここからポジティブ鎖ゲノムRNAの転写が開始される）は、 これらの配列相補物である。 ３．アルファウイルス非構造タンパク質 本明細書中に提供されるアルファウイルスベクター構築物およびRNAベクター レプリコンはまた、４つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質（上記の所望 の表現型を提供する配列を含む）をコードする配列を必要とする。簡略には、ア ルファウイルス非構造タンパク質をコードする広範な種々の配列は、本明細書中 に明白に提供されるものに加えて、本発明において利用され得、従って、用語「 アルファウイルス非構造タンパク質」の範囲内にあると判断される。例えば、遺 伝コードの縮重のために、１つより多くのコドンが、所定のアミノ酸をコードし 得る。従って、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする広範な種々の 核酸配列が作製され得る。さらに、多数の任意の位置でのアミノ酸の置換、付加 、または欠失は、機能的または生物学的に活性な非構造タンパク質を依然として 提供し得る。本発明の状況においては、アルファウイルス非構造タンパク質は、 これらがベクター構築物の自己複製（すなわち、ウイルス核酸の複製および必然 的にではないが感染性ウイルスの生成）を促進する場合、生物学的に活性である と判断され、そして経時的に行われる代謝的標識またはRNase保護アッセイによ り容易に決定され得る。このような誘導体を作製するための方法は、本明細書中 に提供される開示が与えられれば、当業者により容易に達成され得る。 アルファウイルスは、４つの非構造タンパク質（nsp1、nsp2、nsp3、およびns p4と称される）を発現する。アルファウイルスに由来する本発明のベクターは、 ４つの非構造タンパク質をコードする配列を含むべきである。野生型シンドビス ウイルスでは、非構造タンパク質１〜３はヌクレオチド60〜5747によりコードさ れるが、nsP4はヌクレオチド5769〜7598によりコードされる（図１を参照のこと ）。非構造タンパク質は、(1)nsP3のコード領域とnsP4のコード領域との間にオ パール終結コドンが存在するか否か、および(ii)このようなオパールコドンが存 在する場合、新生ポリペプチドの翻訳終結がその点に存在するか、または読み通 され、それゆえP1234の生成となるかに依存して、ゲノムのポジティブ鎖RNAから 、それぞれ、P123またはP1234として知られる２つの大きなポリタンパク質の１ つとして翻訳される。オパール終結コドンは、アルファウイルスSIN（株AR339お よび本明細書中に記載されるSIN-1株）、アウラ、WEE、EEE、VEE、およびRRのns P3/nsP4連結部に存在し、従ってP123およびP1234種は、これらのウイルスで感染 した細胞において発現される。対照的に、終結コドンは、アルファウイルスSIN （株AR86、SF、およびONN）のnsP3/nsP4連結部に存在せず、従ってこれらのウイ ルスで感染した細胞においてはP1234種のみが発現される。ポリタンパク質およ びプロセシングされたモノマー形態の非構造タンパク質は、アルファウイルスRN Aゲノムの複製において機能する。アルファウイルス非構造タンパク質の切断変 異体の増殖特徴を調べる実験は、ポリタンパク質は、ゲノムのネガティブ鎖RNA の合成に関与するが、個々のモノマータンパク質は、ゲノムおよびサブゲノムの ポジティブ鎖RNA種の合成を触媒することを示した（ShirakoおよびStrauss，J． Virol．68:1874-1885，1994）。翻訳読み通しは、一般に、nsP3/nsP4連結部にオ パール終結コドンを含む野生型シンドビスウイルスで感染した細胞において、１ 回に約10％〜20％で生じる。P123およびP1234のプロセシングは、非構造タンパ ク質の１つによりコードされるプロテイナーゼ活性によるものであり、そして以 下にさらに議論される。シスかまたはトランスかのプロセシングの順番は、種々 の要因（感染段階を含む）に依存する。例えば、シンドビスウイルスおよびSFV は、P123およびnsp4を感染の初期に、そしてP12およびP34を感染の後期に生成す る。次いでさらなるプロセシングが個々の非構造タンパク質を放出する。各非構 造タンパク質は、いくつかの機能を有する。これらのいくつかを以下に記載する 。 ａ．nsP1 非構造タンパク質１は、一鎖RNA合成の開始（または継続）のために必要とさ れる。これはまた、転写の間に、ゲノムおよびサブゲノムのアルファウイルスRN Aの5'末端のキャッピングにおいて役割を果たす。なぜなら、nsP1は、メチルト ランスフェラーゼ活性（MiおよびStollar，Vir．184:423-427，1991）およびグ アニルトランスフェラーゼ活性（StraussおよびStrauss，Microbiol．Rev．58(3 ):491-562，1994）の両方を有するからである。nsP1はまた、nsP2のプロテイナ ーゼ活性を調節する。なぜなら、nsP1含有ポリタンパク質は、nsP2とnsP3との間 で非効率的に切断されるからである（de Grootら，EMBO J．9:2631-2638，1990 ）。 ｂ．nsP2 非構造タンパク質２は、ウイルスRNAの複製および非構造ポリタンパク質のプ ロセシングに関与する多機能性タンパク質である。このタンパク質のＮ末端ドメ イン（最初の460アミノ酸にほぼまたがる）は、RNA複製および転写の間に二重鎖 のねじれを戻すのに活性であるヘリカーゼであると考えられる。本発明によるベ クターにおける26SサブゲノムmRNA（目的の遺伝子（単数または複数）をコード する）の合成は、機能的nsP2を必要とする。シンドビスウイルスのアミノ酸残基 460〜807の間のnsP2のＣ末端ドメインは、非構造ポリタンパク質を、nsP1/nsP2 、nsP2/nsP3、およびnsP3/nsP4連結部の間でトランスおよびシスでタンパク質分 解 により切断する。アルファウイルスnsP2 Ｃ末端ドメインの一次配列のアライン メントは、nsP2がパパイン様プロテイナーゼであることを示唆する（Hardyおよ びStrauss，J．Vlrol．63:4653-4664，1988）。 nsP2の他の観察された特徴は、アルファウイルスの増殖に直接関連する機能に 未だに割り当てられていない。例えば、nsP2が、SFV感染細胞においてリボソー ムと密接に関連し、そしてUV照射によりrRNAに架橋され得ることが示されている （Rankiら，FEBS Lett．108:299-302，1979）。さらに、50％のnsP2は、SFV感染 BHK細胞の核マトリックス、特に核小体の領域に局在する（Perinenら，J.Virol ．64:1888-1896，1990）。核へのnsP2の局在は、おそらく活性な輸送により進行 される。なぜなら、これは核コア複合体を通しての拡散により核に侵入し得る小 タンパク質および代謝産物のサイズ（約20〜60kD）を越えるからである（Paine ら，Nature 254:109-114，1975）。推定のNLS配列は、アルファウイルスSFV、SI N、RR、ONN，OCK、およびVEEにおいて同定されている（Rikkonenら，Vir．189:4 62-473，1992）。 ｃ．nsP3 非構造タンパク質nsP3は、ウイルス複製におけるそれらの正確な役割は十分に は理解されていないとはいえ、２つの異なるドメインを含む。種々のアルファウ イルスにおいてＮ末端ドメインは、322〜329残基長の範囲であり、そして任意の ２つのアルファウイルス間で最小51％のアミノ酸配列同一性を示す。しかし、Ｃ 末端ドメインは、公知のアルファウイルス間で長さも配列も保存されておらず、 そして複数の変化が許容される（Liら，Virology，179:416-427）。タンパク質 は、高度にリン酸化された状態で複製複合体と会合して見出される。そのゲノム 中にnsP3/nsP4連結部の間でオパール終結コドンを含むアルファウイルスにおい て、オパール終結シグナルの読み通しが存在するか否かに依存して、２つの異な るタンパク質が生成される。読み通しは、ポリタンパク質の切断後に７個のさら なるカルボキシ末端アミノ酸を含むnsP3タンパク質を生じる。nsP3がウイルスRN A合成の何らかの能力に必要とされることは明白である。なぜなら、このタンパ ク質の特定の変異体はRNAネガティブであり、そしてP123ポリタンパク質は一鎖R NA合成に必要とされるからである。 ｄ．nsP4 nsP4は、ウイルスにコードされるRNAポリメラーゼであり、そしてこのような 酵素に特有のGDDモチーフを含む（KamerおよびArgos，Nucleic Acids Res．12:7 269-7282，1984）。従って、nsP4は、アルファウイルスRNA複製に不可欠である 。nsP4の濃度は、感染細胞において厳密に調節される。ほとんどのアルファウイ ルスにおいて、nsP4の翻訳は、nsP3コード領域とnsP4コード領域との間のオパー ルコドンの読み通しを必要とし、他の非構造タンパク質と比較して細胞内レベル が低い。さらに、nsP4の大半は、Ｎ末端規則経路（Gondaら，J．Biol．Chem．26 4:16700-16712，1989）による分解を通して代謝的に不安定である。しかし、分 解シグナルを隠す複製複合体とのその会合に起因して、いくらかのnsP4は安定で ある。従って、アミノ末端残基を改変することによる酵素の安定化は、本明細書 中に記載されるベクターによりコードされるタンパク質のより長期間の発現を促 進するのに有用であることを証明し得る。安定化アミノ末端残基は、メチオニン 、アラニン、およびチロシンを含む。 ４．ウイルス連結領域 アルファウイルスウイルス連結領域は、通常、サブゲノムmRNAの転写開始を制 御する；従って、このエレメントはまた、サブゲノムmRNAプロモーターとも呼ば れる。シンドビスウイルスの場合、通常のウイルス連結領域は、代表的には、ほ ぼヌクレオチド数7579で始まり、そして少なくともヌクレオチド数7612を通って 連続する（そしておそらくそれを越える）。最小では、ヌクレオチド7579〜7602 （5'-ATC TCT ACG GTG GTC CTA AAT AGT-配列番号１）が、サブゲノムフラグメ ントの転写に必要であると考えられる。この領域（ヌクレオチド7579〜7602）を 、本明細書中以下で「最小の連結領域コア」という。 本発明の特定の局面では、ウイルス連結領域は、サブゲノムフラグメントの合 成を防ぐために不活化される。本発明の状況において利用されるように、「不活 化」は、記載されたように（FrolovおよびSchlesinger，J．Virol．68:1721-172 7，1994）、サブゲノムmRNAに対応する種が、これらのベクターを含む細胞から 精製され、そして１μg/mlダクチノマイシンで処理され、そして［3Ｈ］−ウリ ジンで標識され、電気泳動されたRNAの変性ゲルからのオートラジオグラムにお いて観察されないことを意味する。 本発明の１つの実施態様では、遺伝子送達ビヒクルは、リボゾームの読み通し または無能力化された連結領域プロモーターのすぐ下流の内部リボゾーム侵入の いずれかを促進するシグナルの置換により構築され得る。このベクター構成にお いて、サブゲノムメッセージの合成は起こり得ない；しかし、異種タンパク質は リボゾームの読み通し（スキャニング）または内部リボゾーム侵入のいずれかに より、ゲノム長のmRNAから発現される。 本明細書中に記載される遺伝子送達ビヒクルの特定の適用において、１つより 多くの異種遺伝子の発現が所望される。例えば、ゴシェ症候群（Gaucher's synd rome）のような代謝性疾患の処置のためには、治療用緩和剤の持続が限定され得 るため、遺伝子送達ビヒクルまたは粒子の複数回投与が必要であり得る。従って 、本発明の特定の実施態様においては、グルコセレブロシダーゼ遺伝子のような 治療用緩和剤とともに、標的細胞においてアデノウイルス2 E3遺伝子を同時発現 することが所望され得る。野生型ウイルスでは、構造タンパク質（「sP」）ポリ シストロン性メッセージは単一のポリタンパク質に翻訳され、これは次に部分的 にsPキャプシドプロテイナーゼにより切断されて個々のタンパク質にプロセシン グされる。従って、キャプシドsPのプロテアーゼ活性、または切断のために認識 されるペプチドがアルファウイルスベクターの置換領域内に存在しないため、ポ リシストロン性メッセージからの複数の異種遺伝子の発現は、野生型ウイルスと は異なる機構を必要とする。従って、本発明のさらなる実施態様では、複数の独 立の異種配列の翻訳を可能にする機能的エレメント（リボゾームの読み通し、キ ャップとは独立の翻訳、内部リボゾーム侵入、または最小連結領域コア配列を含 む）が利用され得る。 ５．アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列およびポリ(A)域 上記のように、本発明のアルファウイルスベクター構築物またはRNAベクター レプリコンはまた、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列（「アルファウ イルスレプリカーゼ認識配列」、「3'末端CSE」、または「3'シス複製配列」と もいう）を含むべきである。簡略には、ポジティブ鎖ゲノムRNAの3'末端領域に 位置するアルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列は、このウイルスがネガテ ィブ鎖の合成によって複製を始める認識部位を提供する。アルファウイルスRNA ポリメラーゼ認識配列として、広範な種々の配列が利用され得る。例えば、１つ の実施態様において、ポリメラーゼ認識が、認識配列としてなお機能し得る最小 の領域(例えば、ヌクレオチド11,684〜11,703)まで端が切断されているシンドビ スウイルスベクター構築物が利用され得る。本発明の別の実施態様において、E1 sP遺伝子の下流の非翻訳領域全体からウイルスゲノムの3'末端までがポリメラ ーゼ認識部位を含む（例えば、ヌクレオチド11,382〜11,703）、シンドビスウイ ルスベクター構築物が利用され得る。 本発明の好ましい実施態様において、アルファウイルスベクター構築物または RNAベクターレプリコンはさらにポリ(A)域を含み得る。これは、アルファウイル ス由来ベクターでトランスフェクトした細胞における異種遺伝子発現の観察レベ ルを劇的に増加させる（例えば、Dubenskyら、前出を参照のこと）。簡略には、 ポリ(A)域は、細胞質中での安定性を促進し、それにより、ウイルスの生活環の 開始効率を上昇させるに十分な任意のサイズであり得る。本発明の種々の実施態 様において、ポリ(A)配列は少なくとも10アデノシンヌクレオチド、そして最も 好ましくは、少なくとも25アデノシンヌクレオチドを含む。１つの実施態様にお いて、ポリ(A)配列は、シンドビスウイルスヌクレオチド11,703に直接結合され る。 Ｄ．真核生物重層ベクター開始系 全長ゲノムアルファウイルスcDNAクローンのサイズのため、インビトロでの全 長のキャップされたRNA分子の転写は、むしろ効率が悪い。これは、トランスフ ェクトされたRNAのインビトロ転写量に対して、ウイルスの感染中心に関して低 いトランスフェクション効率をもたらす（プラーク形成により測定される）。こ のような効率の悪さはまた、インビトロでのアルファウイルス発現ベクターの転 写に関連する。従って、感染サイクルを開始する能力または異種配列の発現を指 向する能力について候補cDNAクローンおよび他のアルファウイルスcDNA発現ベク ターを試験することは、cDNAクローンが、DNA分子として感受性細胞にトランス フェクトされ、これが次いでインビボでウイルスRNAの合成を指向する場合、非 常に促進され得る。 従って、本発明の１つの局面において、インビボでのウイルスRNA（ゲノムま たはベクター）の合成を指向し得る、DNAに基づくベクター（「真核生物重層ベ クター開始系」という）が提供される。一般に、真核生物重層ベクター開始系は 、インビボ（すなわち、細胞内）でcDNAからのRNAの5'合成を開始し得る5'プロ モーター、細胞中でのそれ自身の複製を指向し得る構築物（この構築物はまた、 異種核酸配列を発現し得る）、および転写終結を制御する3'配列（例えば、ポリ アデニル化域）を含む。このような真核生物重層ベクター開始系は、異種ヌクレ オチド配列の発現を制御する、２段階または「重層」機構を提供する。簡略には 、第１の層は第２の層の転写を開始し、そしてインビボでcDNAからのRNAの5'か ら3'への合成を開始し得るプロモーター（例えば、5'真核生物プロモーター）を 含み、そしてさらに他のエレメント（3'転写終結／ポリアデニル化部位、１つ以 上のスプライス部位を含む）、ならびに他のRNA核輸送エレメント(例えば、Ｂ型 肝炎ウイルス翻訳後調節エレメント（PRE）（Huangら，Mol．Cell．Biol．13:74 76，1993;Huangら，J．Virol．68:3193，1994;HuangらMol．Cell．Biol．15:386 4-3869，1995）、メイソン-ファイザーサルウイルスの構成性輸送エレメント（C TE）（Brayら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:1256-1260，1994）、HIV Rev応 答性エレメント(Malimら，Nature 338:254-257，1989;Cullenら，Trends Bioche m．Sci．16:346，1991)を含む)、および、所望であれば、他の同様のエレメント を含み得る。本発明での使用に適切な代表的なプロモーターは、真核生物性（例 えば、pol I、II、またはIII）および原核生物性プロモーター、ならびに誘導性 または非誘導性（すなわち、構成性）プロモーター（例えば、モロニーマウス白 血病ウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイ ドプロモーター、Drosophilaアクチン５Ｃ遠位プロモーター、SV40プロモーター 、熱ショックタンパク質65プロモーター、熱ショックタンパク質70プロモーター 、免疫グロブリンプロモーター、マウスポリオーマウイルスプロモーター（Py） 、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、単純ヘルペスウイルス（HSV）プロモーター、BK ウイルスおよびJCウイルスのプロモーター、マウス乳ガンウイルス（MMTV）プロ モーター、アルファウイルス連結領域、CMVプロモーター、アデノ ウイルスE1またはVAIRNAのプロモーター、rRNAプロモーター、tRNAメチオニンプ ロモーター、CaMV 35Sプロモーター、ノパリンシンセターゼプロモーター、テト ラサイクリン応答性プロモーター、およびlacプロモーターを含む。 本発明のなお他の実施態様では、誘導性プロモーターが利用され得る。例えば 、１つの実施態様において、DNAからのRNAの合成を開始する誘導性プロモーター が提供される。誘導性プロモーターは、コアRNAポリメラーゼプロモーター配列 、および転写アクチベータ一タンパク質のDNA結合を指向する作動可能に連結さ れた核酸配列、および転写リプレッサータンパク質のDNA結合を指向する作動可 能に連結された核酸配列を含む。さらなる実施態様において、転写アクチベータ ータンパク質のDNA結合を指向する核酸配列は、テトラサイクリンリプレッサー ／VP16トランスアクチベーター融合タンパク質を結合する配列である。さらに別 の実施態様において、転写リプレッサータンパク質のDNA結合を指向する核酸配 列は、ラクトースリプレッサー／Kruppelドメイン融合タンパク質を結合する配 列である。 第２の層は、１つ以上の異種ヌクレオチド配列を発現し得、そして自律的にま たは１つ以上の因子（例えば、誘導性である）に応答してのいずれかで細胞中で それ自身の複製を指向し得る、自己触媒ベクター構築物を含む。第２の層は、ウ イルス起源または非ウイルス起源であり得る。本発明の１つの実施態様において 、第２の層の構築物は、上記のアルファウイルスベクター構築物であり得る。 真核生物重層ベクター開始系の第１の層として広範な種々のベクター系が使用 され得、以下のDNAウイルスから開発されるウイルスベクター構築物を含む：例 えば、カナリアポックスウイルスまたはワクシニアウイルスを含むポックスウイ ルス科(例えば、Fisher-Hochら、PNAS 86:317-321、1989;Flexnerら、Ann．N．Y ．Acad．Sci．569：86-103、1989；Flexnerら、Vaccine 8：17-21，1990;米国特 許第4,603,112号、同第4,769,330号、および同第5,017,487号；WO 89/01973)；B KV、JCVまたはSV40のようなパポーバウイルス科(例えば、Mulliganら、Nature 2 77:108-114、1979);アデノウイルスのようなアデノウイルス科(例えば、Berkner ら、Biotechniques 6:616-627、1988;Rosenfeldら、Science 252:431-434、1991 )；アデノ関連ウイルスのようなパルボウイルス科(例えば、Samulsk iら、J．Vir．63:3822-3828、1989;Mendelsonら、Virol．166:154-165、1988;PA 7/222,684)；単純ヘルペスウイルスのようなヘルペスウイルス科(例えば、Kit ，Adv．Exp．Med．Biol．215:219-236、1989)；およびヘパドナウイルス科（例 えば、HBV）、ならびにレトロウイルス科のようなDNA中間体を通して複製される 特定のRNAウイルス（例えば、米国特許第4,777,127号、GB 2,200,651、EP 0,345 ,242、およびWO91/02805；MoMLVのような白血病中のウイルスおよびHIVのような 免疫不全症ウイルスを含むレトロウイルス科（例えば、Ponzansky．J.Virol．65 :532-536、1991を参照のこと）。 同様に、広範な種々のベクター系は、真核生物重層ベクター開始系の第２の層 として利用され得、例えば、以下の科のウイルス由来のベクター系を含む：ピコ ルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイ ルス）、カリチウイルス科、トガウイルス科（例えば、アルファウイルス、風疹 ）、フラビウイルス科（例えば、黄熱病、HCV）、コロナウイルス科（例えば、H CV、TGEV、IBV、MHV、BCV）、ブンヤウイルス科、アレナウイルス科、レトロウ イルス科（例えば、RSV、MoMLV、HIV、HTLV）、デルタ型肝炎ウイルス、および アストロウイルス。さらに、非哺乳動物RNAウイルス（ならびにそれら由来の成 分）もまた利用され得、それは、例えば、細菌およびバクテリオファージレプリ カーゼ、ならびにポテックスウイルス（例えば、PVX）、カルラウイルス（例え ば、PVM）、トブラウイルス（例えば、TRV、PEBV、PRV）、トバモウイルス（例 えば、TMV、ToMV、PPMV）、ルテオウイルス（例えば、PLRV）、ポティウイルス （例えば、TEV、PPV、PVY）、トムブスウイルス（例えば、CyRSV）、ネポウイル ス（例えば、GFLV）、ブロモウイルス（例えば、BMV）、およびトパモウイルス （topamovirus）のような植物ウイルス由来の成分を含む。 真核生物ベクター開始系の第２の層に含まれる自己触媒ベクター構築物の複製 能力は、例えば、ダクチノマイシンのような細胞RNA合成阻害剤の存在下で、ト ランスフェクトされた細胞中でのポジティブセンスRNAおよびネガティブセンスR NAの両方の増加を経時的に測定するリボヌクレアーゼ保護アッセイ、およびまた トランスフェクトされた細胞中のサブゲノムRNAの合成または異種レポーター遺 伝子の発現を測定するアッセイを含む、当業者に公知の種々のアッセイで測定さ れ得る。 本発明の特に好ましい実施態様において、インビボでcDNAからのアルファウイ ルスRNAの合成を開始し得る5'プロモーター（すなわち、RNA合成のDNAプロモー ター）、続いてアルファウイルスRNAの転写を開始し得る5'配列、４つ全てのア ルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸配列（組換えアル ファウイルス粒子に作動可能に取り込まれた場合に、所望の表現型をもたらす上 記の核酸分子を含む）、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列、および転 写終結／ポリアデニル化を制御する3'配列を含む真核生物重層ベクター開始系が 提供される。さらに、発現されるべき異種配列に作動可能に連結されたウイルス 連結領域が含まれ得る。種々の実施態様において、ウイルス連結領域は、不活化 されるというよりむしろサブゲノムフラグメントのウイルス転写が増加または減 少するように改変され得る。他の実施態様において、第２のウイルス接合領域は 、第１の不活化ウイルス連結領域に続いて挿入され得、その第２のウイルス連結 領域は、サブゲノムフラグメントのウイルス転写が増加または減少するように活 性であるかまたは改変されているかのいずれかである。 真核生物重層ベクター開始系の転写に引き続いて、得られるアルファウイルス RNAベクターレプリコン分子は、アルファウイルスRNAの転写を開始し得る5'配列 、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチ ド配列、ウイルス連結領域、異種ヌクレオチド配列、アルファウイルスRNAポリ メラーゼ認識配列、およびポリアデニル化配列から構成される。 アルファウイルスcDNAベクター構築物の種々の局面が上記で議論されており、 アルファウイルスの転写を開始し得る5'配列、アルファウイルス非構造タンパク 質をコードするヌクレオチド配列、ウイルス連結領域（サブゲノムフラグメント のウイルス転写を妨害するように不活化された連結領域を含む）、およびアルフ ァウイルスRNAポリメラーゼ認識配列を含む。さらに、改変された連結領域およ び縦列連結領域もまた、上記で議論されている。 本発明の別の実施態様において、真核生物重層ベクター開始系は、特定の真核 生物種、特に哺乳動物種（例えば、ヒト）由来の１つ以上の細胞株において複製 するように適合されたアルファウイルスベクター（例えば、シンドビスベクター 構築物）に由来する。例えば、発現されるべき組換えタンパク質をコードする遺 伝子がヒト起源のものであり、そしてタンパク質がヒトの治療的使用を意図され る場合、適切なヒト細胞株における産生は、そのタンパク質がヒトにおいて生じ ることが期待されるように、翻訳後に改変されるために好ましいかもしれない。 このアプローチは、（以下でより詳細に議論するように）組換えタンパク質の産 生をさらに増強する際に有用であり得る。ウイルスレプリカーゼの不正確さ（in fidelity）に起因したアルファウイルスゲノムの全体的な可塑性を仮定すれば、 選択された真核生物細胞（例えば、ヒト、マウス、イヌ、ネコなど）における高 力価増殖性感染を確立する増強された能力を有する改変体株が単離され得る。さ らに、真核生物細胞における高力価存続性感染を確立する増強された能力を有す る改変体アルファウイルス株もまた、このアプローチを用いて単離され得る。次 いで、アルファウイルス発現ベクターは、これらの改変体株のcDNAクローンから 、本明細書中に提供される手順に従って構築され得る。 本発明の別の実施態様において、真核生物重層ベクター開始系は、分化した細 胞型においてのみ転写時に活性がある、最初のアルファウイルスベクター転写の ためのプロモーターを含む。簡略には、培養中の哺乳動物細胞（例えば、ハムス ター（例えば、ベビーハムスター腎臓細胞）またはニワトリ（ニワトリ胚線維芽 細胞）に由来する細胞）のアルファウイルス感染が、典型的には細胞傷害性を生 じることが十分に確立されている。従って、安定的に形質転換またはトランスフ ェクトされた宿主細胞株を産生するために、真核生物重層ベクター開始系が宿主 細胞中に導入され得る。ここで、最初のベクター増幅を可能にするプロモーター は転写時に不活性なプロモーターであるが、誘導性プロモーターである。特に好 ましい実施態様において、このようなプロモーターは、分化状態依存性である。 この構成において、プロモーターの活性化およびその後のアルファウイルスDNA ベクターの活性化は、細胞分化の誘導と同時に起きる。このような安定に形質転 換またはトランスフェクトされた宿主細胞株の特定の細胞数への増殖の際に、適 切な分化刺激が提供され、それによりベクター構築物の転写、ならびに所望の遺 伝子およびコードされるポリペプチド（単数または複数）の増幅された発現が開 始される。多くのこのような分化状態依存性プロモーターは、特定の刺激の適用 により分化するように誘導され得る細胞株と同様に当業者に公知である。代表例 は、それぞれ、レチノイン酸、ウマ血清、およびDMSOにより活性化される、細胞 株F9およびP19、HL60、ならびにフロイント赤白血病細胞株および有ELを含む。 好ましい実施態様において、このようなプロモーターは、２つの別々の成分に より調節され得る。例えば、実施例７に記載のように、転写アクチベーターおよ び翻訳リプレッサーの両方についての結合部位は、作動可能に依存した様式で「 コア」プロモーターに隣接して位置する。この構成において、誘導されていない 状態は、転写アクチベーターがその認識部位を見出す能力をブロックするが、転 写リプレッサーが構成的に発現され、そしてその認識部位に結合することを可能 にすることにより維持される。誘導は、転写リプレッサーをブロックし、そして トランスアクチベーターブロックを除去することにより可能になる。例えば、テ トラサイクリン応答性プロモーター系（GossenおよびBujard，Proc．Natl．Acad ．Sci．89:5547-5551，1992）は、アルファウイルスベクターRNAの誘導性転写の ために利用され得る。この系において、テトラサイクリンリプレッサーおよびHS V-VP16トランスアクチベータードメインの「融合」タンパク質（rTA）としての 発現は、最小「コア」プロモーター（例えば、CMV）にすぐ隣接して位置するテ トラサイクリンオペレーター配列（tet0）に特異的に結合することにより、アル ファウイルスベクターRNAのインビボ転写を刺激する。結合およびトランス活性 化事象は、テトラサイクリンの存在により可逆的にブロックされ、そして培養培 地からテトラサイクリンを除去することにより「オン」にされ得る。転写の誘導 されない基底レベルは、異なる細胞型の間で異なるので、他の異なる最小のコア プロモーター（例えば、HSV-tk）は、アルファウイルスベクターヌクレオチド１ と並んでいるかまたはそのすぐ近くに位置することを可能にするためにテトラサ イクリンオペレーター配列（ただし、転写開始部位は公知である）に連結され得 る。 rTAトランスアクチベーターは、同じ細胞株に安定に形質転換されてもいる、 さらなる発現カセットにより提供され得る；そして特定の実施態様において、rT A発現カセットは、それ自身自己調節され得る。自己調節rTA発現カセットの使用 は、rTAそれ自身が結合する同一のteto連結プロモーターによって発現を転写制 御とリンクさせることにより、rTAの構成的な高レベル発現に関連する潜在的な 毒性の問題を回避する。この型の系は、テトラサイクリンの存在下ではrTAがほ とんど生成されないことを保証するが、テトラサイクリンが除去された場合には 高度に活性となるネガティブフィードバックサイクルを作製する。このような自 己調節性rTA発現カセットは、プラスミドpTet-tTAk（Shockettら，Proc．Natl． Acad．Sci．USA 92:6522-6526，1995）において提供される。 転写抑制のために、特定のジンクフィンガータンパク質のKRAB抑制ドメインもノ末端領域に存在する、高度に保存された配列である。このドメインは、２つの 推定両親媒性α-ヘリックスを含み、そしてDNA結合依存性RNAポリメラーゼII転 写リプレッサーとして機能することが示されている（例えば、Lichtら，Nature3 46:76-79，1990）。他の転写因子と同様に、活性な抑制ドメインおよびDNA結合 ドメインは、別々でありそして分離し得る。従って、抑制ドメインは、融合タン パク質として、標的化のために任意の配列特異的なDNA結合タンパク質に結合さ れ得る。従って、DNA結合タンパク質成分は、可逆的に、調節可能な様式で結合 を妨げられ得、それにより転写サイレンシングを「オフ」にし得る。例えば、ヒ トKoxl（Thiesen，New Biol．2:363-374，1990）からのKRABドメインは、DNA結 合ラクトース（lac）リプレッサータンパク質に融合されて、tet応答性プロモー ターのすぐ近くに操作されたlacオペレーター配列への可逆的な配列特異的結合 を有するハイブリッド転写サイレンサーを形成し得る。この構成において、lac リプレッサー／KRABドメイン融合物（rKR）の構成的な発現は、lacオペレーター 配列への結合および誘導されていないtet応答性プロモーターからの何らかの「 漏出性の」基底転写の消去をもたらす。ベクター発現が所望され、そしてテトラ サイクリンが系から除去される場合、IPTGが添加されてrKR媒介性転写サイレン シングを防ぐ。 さらに、他のジンクフィンガータンパク質からのKRABドメイン(例えば、ZNF13 3（Tommerupら，Hum．Mol．Genet．2:1571-1575，1993）、ZNF91（Bellefroidら ，EMBO J．12:1363-1374，1993）、ZNF2(Rosatiら，Nucleic Acids Res．1 9:5661-5667，1991))、ならびに他の移入可能なリプレッサードメイン(例えば、 Drosophila enまたはeve遺伝子（Jaynesおよび0'Farrell，EMBO J．10:1427-143 3，1991;HanおよびManley，Genes Dev．7:491-503，1993）、ヒトジンクフィン ガータンパク質YY1（Shiら，Cell 67:377-388，1991）、ウィルムス腫瘍抑制タ ンパク質WT1（Maddenら，Science 253:1550-1553，1991）、甲状腺ホルモンレセ プター（Baniahmadら，EMBO J．11:1015-1023，1992）、レチノイン酸レセプタ ー（Baniahmadら，同書）、Kid-1(Witzgallら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91 :4514-4518，1994))は、本明細書に提供される遺伝子送達ビヒクルにおいて同様 に容易に使用され得る。さらに、本システムのlacリプレッサー／lacオペレータ ー成分は、他の供給源（例えば、トリプトファンおよびマルトースオペロン、ま たはGAL4）に由来する任意の数の他の調節可能な系により置換され得る。 Ｅ．組換えアルファウイルス粒子、ならびに「空の」トガウイルス粒子または非 相同ウイルスRNAを含有するトガウイルス粒子の作製および使用 本発明の別の局面では、真核生物標的細胞に感染し得るRNAアルファウイルス ベクターを含有する組換えアルファウイルス粒子の作製が記載される。簡略には 、このような組換えアルファウイルス粒子は、一般に、本明細書中に記載される ような１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質、脂質エンベロープ、および RNAベクターレプリコンを含む。 組換えアルファウイルスベクター粒子の作製方法は、例えば、相補するベクタ ーとインビトロで転写されたRNAに由来する欠陥ヘルパー（DH）分子あるいはプ ラスミドDNAとの同時トランスフェクションにより、またはウイルスとの同時感 染（Xiongら，Science 243:1188-1191，1989，Bredenbeekら，J．Virol．67:643 9-6446，1993，Dubenskyら，J.Virol 70:508-519，1996およびDubenskyら，W/O 95/07994を参照のこと）により容易に達成され得る。 他の局面では、アルファウイルス由来パッケージング細胞株またはプロデュー サー細胞株から組換えアルファウイルスベクター粒子を作製するための方法が提 供される。簡略には、このようなPCLおよびそれらの安定に形質転換された構造 タンパク質発現カセットは、W/O 95/07994に記載される方法を用いて、または本 発明に記載される新規な方法を用いて誘導され得る。例えば、PCLによる組換え アルファウイルスベクター粒子の生成は、望ましい特性を有するアルファウイル スに基づくベクター粒子のPCLへの導入の後に達成され得る（実施例６を参照の こと）。このベクターは、インビトロで転写されたRNA、プラスミドDNA、または 以前に得られた組換えアルファウイルス粒子に由来する。なおさらなる実施例に おいて、アルファウイルスベクタープロデューサー細胞株からの組換え粒子の生 成が記載される（実施例７を参照のこと）。 他の実施態様では、ゲノムRNAを含まない（すなわち、実質的にウイルスRNAを 含まない）またはRNAベクターレプリコンを全く含まない、高力価の安定なトガ ウイルスキャプシド粒子を生成するための方法が提供される。本発明で利用され るように、ゲノムまたはRNAベクターレプリコン核酸が「実質的にない」とは、3 5 Ｓメチオニン対3Ｈウリジンのウイルス粒子への取り込みの、（野生型と比較し て）10:1より大きな、そして好ましくは15:1より大きな比をいうことが理解され るべきである（例えば、実施例８および図38を参照のこと）。例えば、１つの実 施態様において、空のキャプシド粒子（好ましくは脂質二重層および糖タンパク 質相補体を有する）が、トガウイルス科から選択された病原性ウイルス（例えば 、アルファウイルスまたはルビウイルス）から構築され、そして免疫原として使 用されて野生型トガウイルスによる感染に対する防御免疫を確立する。空のウイ ルス粒子は、望ましい免疫原性代替物である。なぜなら、これらは、ウイルスを 複製および生成することができないが、細胞性および体液性の両方の免疫応答を 生じ得るからである。従って、実施例８により詳細に記載される方法を利用して 、トガウイルスに由来する空のキャプシド粒子（脂質二重層および糖タンパク質 相補体を有するかまたは有さない）が、広範な種々のトガウイルスから作製され 得る。このトガウイルスは、アルファウイルス（例えば、シンドビスウイルス（ 例えば、SIN-1または野生型シンドビスウイルス）、ヴェネズエラウマ脳炎ウイ ルス、ロスリバーウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、お よびルビウイルス（例えば、風疹））を含むがこれらに限定されない。 第２の実施態様において、ゲノムウイルスRNAに結合するペプチドをコードす る異種ウイルスに由来する配列は、欠陥ヘルパー（DH）発現カセット中に、アル ファウイルスキャプシド遺伝子のアミノ末端領域で挿入され得る。この遺伝子は 、相同アルファウイルスゲノムRNAに結合するタンパク質の領域をコードする配 列が欠失している。例えば、BHK細胞は、アルファウイルスレプリコンRNA、相同 なウイルスゲノムRNA結合ペプチドをコードする配列を含むDH RNA、および同じ 異種ウイルス由来のレプリコンを用いてエレクトロポレーションされ得る。従っ て生成されるアルファウイルス粒子は、異種ウイルス由来のゲノムRNAを含み、 そしてアルファウイルスの宿主域向性を有する。１つの可能な例として、レトロ ウイルスRNA結合に必要とされるタンパク質をコードするgag配列は、DH発現カセ ット構築物内に含まれる。この構成において、得られるアルファウイルス粒子は 、レトロウイルスベクターRNAを含む。 Ｆ．異種配列 上記のように、本発明の遺伝子送達ビヒクルにより、広範な種々のヌクレオチ ド配列が担持および発現され得る。好ましくは、ヌクレオチド配列は、生存可能 な(viable)ウイルスの生成を可能にするのに十分なサイズであるべきである。本 発明の状況では、組換えアルファウイルス粒子による任意の測定可能な力価（例 えば、プラークアッセイ、ルシフェラーゼアッセイ、またはβ-ガラクトシダー ゼアッセイによる）の感染性ウイルスの適切な感受性単層での生成またはRNAも しくはDNAベクターにより生成される異種遺伝子の検出可能なレベルの発現は、 「生存可能なウイルスの生成」であると考えられる。これは最小の場合、さらな る異種配列を全く含有しないアルファウイルスベクター構築物であり得る。しか し他の実施態様において、ベクター構築物はさらなる異種配列または外来配列を 含有し得る。好ましい実施態様において、異種配列は、少なくとも約100塩基、 ２kb、3.5kb、５kb、７kbの異種配列、または少なくとも約８kbの異種配列さえ も含み得る。 本明細書中に提供される開示が与えられれば当業者には明らかなように、組換 えアルファウイルス粒子のパッケージング効率、従ってウイルス力価は、ある程 度パッケージングされるべき配列のサイズに依存する。従ってパッケージングの 効率および生存可能なウイルスの生成を増大させるために、さらなる非コード配 列をベクター構築物に付け加え得る。さらに本発明の特定の実施態様において、 ウイルスの力価を増加または減少させることが所望され得る。この増加または減 少は異種配列のサイズ、従ってパッケージングの効率を増加または減少させるこ とにより達成され得る。 上記で簡略に述べたように、本明細書中に記載される遺伝子送達ビヒクルには 、例えばリンホカインまたはサイトカイン、トキシン、プロドラッグ変換酵素、 免疫応答を刺激する抗原、リボザイム、増殖因子または調節因子のような治療的 適用のためのタンパク質および免疫応答を補助または阻害するタンパク質のよう な緩和剤をコードする配列、ならびにアンチセンス配列（または「アンチセンス 適用」のためのセンス配列）を含む広範な種々の異種配列が含まれ得る。さらに 上記のように、本明細書中に提供される遺伝子送達ビヒクルは２つ以上の異種配 列を含有（そして、特定の実施態様においては発現）し得る。 １．リンホカイン 本発明の１つの実施態様において、異種配列はリンホカインをコードする。簡 略には、リンホカインは、免疫エフェクター細胞を増殖、活性化または分化する ように作用する。リンホカインの代表例としては、γインターフェロン、腫瘍壊 死因子、IL−１、IL−２、IL−３、IL−４、IL−５、IL−６、IL−７、IL−８、 IL−９、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、GM−CSF、CSF−１ 、およびＧ−CSFが挙げられる。 本発明の関連する実施態様において、異種配列は免疫制御性補助因子をコード する。簡略には、本発明の状況で利用される「免疫制御性補助因子」は、免疫応 答に関与する１つ以上の細胞により産生される場合、または細胞に外から加えら れる場合、その補助因子の非存在下で生じた免疫応答とは質または強さにおいて 異なる免疫応答を引き起こす因子をいう。応答の質または強さは、当業者に公知 の種々のアッセイにより測定し得、これには例えば、細胞の増殖を測定するイン ビトロアッセイ（例えば、3Ｈチミジンの取り込み）、およびインビトロ細胞傷 害性アッセイ（例えば、51Cr放出を測定するもの）（Warnerら、AIDS Res．and Human Retroviruses 7：645-655，1991を参照のこと）がある。 免疫制御性補助因子の代表例は、αインターフェロン（Finterら、Drugs 42 (5)：749-765，1991；米国特許第4,892,743号；米国特許第4,966,843号；WO 85/ 02862；Nagataら、Nature 284：316-320，1980；Famillettiら、Methods in Enz ．78：387-394，1981；Twuら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86：2046-2050，19 89；Faktorら、Oncogene 5：867-872，1990）、βインターフェロン（Seifら、J ．Virol．65：664-671，1991）、γインターフェロン（Radfordら、American So ciety of Hapatology：2008-2015，1991；Watanabeら、PNAS 86：9456-9460，19 89；Gansbacherら、Cancer Research 50：7820-7825，1990；Maioら、Can．Immu nol．Immunother．30：34-42，1989；米国特許第4,762,791号および同第4,727,1 38号）、Ｇ−CSF(米国特許第4,999,291号および同第4,810,643号)、GM−CSF（WO 85/04188）、TNF(Jayaramanら、J．Immunology 144：942-951，1990)、インタ ーロイキン−２（IL−2）（Karuplahら、J．Immunology 144：290-298，1990；W eberら、J．Exp．Med．166：1716-1733，1987；Gansbacherら、J．Exp．Med．17 2：1217-1224，1990；米国特許第4,738,927号）、IL−４（Tepperら、Cell 57： 503-512，1989；Golumbekら、Science 254：713-716，1991；米国特許第5,017,6 91号）、IL−６（Brakenhofら、J．Immunol．139：4116-4121，1987；WO 90/063 70）、IL−12、IL−15（Grabsteinら、Science 264：965-968，1994；Genbank-E MBL登録番号V03099）、ICAM−１（Altmanら、Nature 338：512-514，1989）、IC AM−２、LFA-１、LFA-３、MHCクラスＩ分子、MHCクラスII分子、β2−ミクログ ロブリン、シャペロン、CD3、B7/BB1、MHC結合トランスポータータンパク質また はこれらのアナログを含む。 アルファウイルスベクター構築物中にどの免疫制御性補助因子を含めるかの選 択は、補助因子の公知の治療効果に基づき得るか、または実験的に決定され得る 。例えば、慢性Ｂ型肝炎感染では、患者の免疫不全を補い、そしてそれゆえ、疾 患からの回復を助けるのに、αインターフェロンが有効であることが見出されて いる。あるいは適切な免疫制御性補助因子を実験的に決定し得る。簡略には、肝 疾患の患者からまず血液サンプルを採取する。自己細胞またはHLA適合細胞（例 えば、EBV形質転換細胞）でインビトロで末梢血リンパ球(PBL)を再刺激し、そし て肝炎抗原の免疫原性部分および免疫制御性補助因子の発現を指向するアルファ ウイルスベクター構築物で形質導入する。HLA適合形質導入細胞を標的として用 い て、刺激したPBLをCTLアッセイにおけるエフェクターとして使用する。HLA適合 刺激物質および抗原のみをコードするベクターで形質導入した標的細胞を用いて 行った同じアッセイで見られるCTL応答の増加は、有用な免疫制御性補助因子を 示す。本発明の１つの実施態様において、免疫制御性補助因子であるγインター フェロンが特に好ましい。 免疫制御性補助因子の別の例は、B7/BB1補助刺激因子である。簡略には、Ｔ細 胞の完全な機能活性の活性化には２つのシグナルが必要である。第１のシグナル は抗原特異的Ｔ細胞レセプターと主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)分子に結合 したペプチドとの相互作用により提供され、そして第２のシグナル（補助刺激と 呼ぶ）は抗原提示細胞によりＴ細胞に送達される。第２のシグナルはＴ細胞によ るインターロイキン−２（IL−２）生成に必要であり、そして抗原提示細胞上の B7/BB1分子と、Ｔリンパ球上のCD28およびCTLA−４レセプターとの相互作用に関 与しているようである(Llnsleyら、J．Exp．Med．173：721-730，1991a、および J．Exp．Med．174：561-570，1991)。本発明の１つの実施態様において、B7/BB1 はCD8+T細胞の補助刺激を起こすために腫瘍細胞に導入され得、その結果CD8+T細 胞は拡張し十分活性化するために十分なIL−２を生成する。これらのCD8+T細胞 は、さらなるCTL機能のために補助刺激がもはや必要ではないため、B7を発現し ていない腫瘍細胞を殺傷し得る。補助刺激性B7/BB1因子および例えば免疫原性HB Vコアタンパク質の両方を発現するベクターは、本明細書に記載した方法を利用 して作製され得る。これらのベクターで形質導入された細胞は、より有効な抗原 提示細胞となる。HBVコア特異的CTL応答は、補助刺激性リガンドB7/BB1を介して 、十分に活性化されたCD8+T細胞により増強される。 ２．トキシン 本発明の別の実施態様において、異種配列はトキシンをコードする。簡略には 、トキシンは細胞の増殖を直接阻害するように作用する。トキシンの代表例は、 リシン（Lambら、Eur．J．Biochem．148：265-270，1985）、アブリン(Woodら、 Eur．J．Biochem．198：723-732，1991；Evensenら、J．of Biol．Chem．266：6 848-6852，1991；Collinsら、J．of Biol．Chem．265：8665-8669，1990；Chen ら、Fed．of Eur．Biochem Soc．309：115-118，1992)、ジフテリアト キシン（Twetenら、J．Biol．Chem．260：10392-10394，1985）、コレラトキシ ン（Mekalanosら、Nature 306：551-557，1983；SanchezおよびHolmgren，PNAS 86：481-485，1989）ゲロニン（gelonin）（Stirpeら、J．Biol．Chem．255：69 47-6953，1980）、アメリカヤマゴボウ（Irvin，Pharmac．Ther．21：371-387， 1983）、抗ウイルスタンパク質（Barbieriら、Biochem．J．203：55-59，1982； Irvinら、Arch．Biochem．& Biophys．200：418-425，1980；Irvin，Arch．Bioc hem．& Biophys．169：522-528，1975）、トリチン（tritin）、赤痢菌トキシン (Calderwoodら、PNAS 84：4364-4368，1987；Jacksonら、Microb．Path．2：147 -153，1987)、シュードモナス外毒素Ａ(CarrollおよびCollier，J．Biol．Chem ．262：8707-8711，1987)、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）(F ieldら、J．Gen．Virol．49：115-124，1980)、およびE.coli.グアニンホスホリ ボシルトランスフェラーゼを含む。 ３．プロドラッグ変換酵素 本発明の他の実施態様において、異種配列はプロドラッグ変換酵素をコードす る。簡略には、本発明の状況で利用されるプロドラッグ変換酵素とは、ほとんど または全く細胞傷害性のない化合物を毒性産物（プロドラッグ）に活性化する遺 伝子産物を意味する。このような遺伝子産物の代表例は、HSVTKおよびVZVTK（な らびにそれらのアナログおよび誘導体）を含み、これらは特定のプリンアラビノ シドおよび置換ピリミジン化合物を選択的にモノリン酸化して、これらを細胞傷 害性または細胞増殖抑制代謝物に変換する。さらに詳しくは、薬物であるガンシ クロビル、アシクロビルまたはそれらの任意のアナログ（例えば、FIAU、FIAC、 DHPG）のHSVTKへの曝露は、この薬物を対応する活性ヌクレオチド三リン酸形態 にリン酸化する。 本発明の状況でまた使用され得る他のプロドラッグ変換酵素の代表例は：E.co liグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（これはチオキサンチンを毒性の あるチオキサンチン−リン酸に変換する）（Besnardら、Mol．Cell．Biol．7：4 139-4141，1987）；アルカリホスファターゼ（これは不活性なリン酸化化合物（ 例えば、マイトマイシンリン酸およびドキソルビシンリン酸）を毒性の脱リン酸 化化合物に変換する）；真菌性(例えば、Fusarium oxysporum)または細菌性 のシトシンデアミナーゼ（これは５−フルオロシトシンを毒性の化合物５−フル オロウラシルに変換する）(Mullen，PNAS 89：33，1992)；カルボキシペプチダ ーゼG2（これはパラ−Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノベンゾイルグルタミ ン酸からグルタミン酸を切断して、それにより毒性の安息香酸マスタードをつく り出す）；およびペニシリン−Ｖアミダーゼ（これはドキソルビシンおよびメル ファランのフェノキシアセトアビド誘導体を毒性化合物に変換する）(一般的に は、Vrudhulaら、J．of Med．Chem．36(7)：919-923，1993；Kernら、Canc．Imm un．Immunother．31(4)：202-206，1990を参照のこと)を含む。 ４．アンチセンス配列 本発明の別の実施態様において、異種配列はアンチセンス配列である。簡略に は、アンチセンス配列はRNA転写産物に結合するように設計され、これにより特 定のタンパク質の細胞性合成を防止するか、または細胞によるこのRNA配列の使 用を防止する。このような配列の代表例は、アンチセンスチミジンキナーゼ、ア ンチセンスジヒドロ葉酸レダクターゼ(MaherおよびDolnick，Arch．Biochem．&B iophys．253：214-220，1987；Bzikら、PNAS 84：8360-8364，1987)、アンチセ ンスHER2(Coussensら、Science 230：1132-1139，1985)、アンチセンスABL（Fai nstelnら、Oncogene 4：1477-1481，1989）、アンチセンスMyc（Stantonら、Nat ure 310：423-425，1984）およびアンチセンスras、ならびに任意の細胞周期シ グナル伝達成分（例えば、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン 依存性阻害剤）またはヌクレオチド生合成経路の任意の酵素をブロックするアン チセンス配列を含む。さらに本発明の他の実施態様において、インターフェロン および２ミクログロブリンに対するアンチセンス配列は、免疫応答を減少させる ために利用され得る。 さらに、本発明のさらなる実施態様において、アンチセンスRNAは強力なクラ スＩ制限応答を誘導するために抗腫瘍剤として利用され得る。簡略には、RNAへ 結合すること、そしてこれにより特異的mRNAの翻訳を防止することに加え、高レ ベルの特異的アンチセンス配列が多量の２本鎖RNAの形成によりインターフェロ ン（γ−インターフェロンを含む）の発現の増加を誘導すると考えられる。γ− インターフェロンの発現の増加は、次いでMHCクラスＩ抗原の発現を増強する。 これに関する使用に好ましいアンチセンス配列は、アクチンRNA、ミオシンRNA、 およびヒストンRNAを含む。アクチンRNAとミスマッチを形成するアンチセンスRN Aは特に好ましい。 ５．リボザイム 本発明の他の局面において、宿主細胞の感染によりリボザイムを生成する遺伝 子送達ビヒクルが提供される。簡略には、リボザイムは特異的RNAを切断するた めに使用され、そして１つの特異的RNA配列のみに作用し得るように設計される 。一般的には、リボザイムの基質結合配列は10〜20ヌクレオチド長である。この 配列の長さは、標的RNAとハイブリダイズし、そして切断されたRNAからリボザイ ムを解離するのを可能にするのに十分である。 本発明の状況では、広範な種々のリボザイムが利用され得る。これらのリボザ イムは、例えば、グループＩイントロンリボザイム（Cechら，米国特許第4,987, 071号）；ヘアピンリボザイム（Hampelら，Nucl．Acids Res．18:299-304，1990 ，米国特許第5,254,678号および欧州特許公開第0 360 257）、ハンマーヘッドリ ボザイム（Rossi，J.J.ら，Pharmac．Ther．50:245-254，1991;ForsterおよびSy mons，Cell 48:211-220，1987;HaseloffおよびGerlach，Nature 328:596-600，1 988;WalbotおよびBruening，Nature 334:196，1988;HaseloffおよびGerlach，Na ture 334:585，1988)、デルタ型肝炎ウイルスリボザイム（PerrottaおよびBeen ，Biochem．31:16，1992）；RNase Pリボザイム（Takadaら，Cell 35:849，1983 ）；ならびに他のタイプのリボザイム（例えば、WO 95/29241、およびWO 95/315 51を参照のこと）を含む。リボザイムのさらなる例は、米国特許第5,116,742号 、同第5,225,337号、および同第5,246,921号に記載されるものを含む。 ６．タンパク質および他の細胞構成成分 本発明の他の局面において、広範な種々のタンパク質または他の細胞構成成分 が本明細書中に提供される遺伝子送達ビヒクルに担持および／または発現され得 る。このようなタンパク質の代表例は、例えばウイルス、細菌、寄生体、または 真菌中に見いだされる、天然のまたは改変された細胞成分、ならびに外来タンパ ク質または細胞構成成分を含む。 ａ．改変された細胞成分 １つの実施態様において、免疫原性で非ガン原性の、改変された細胞成分の発 現を指向する遺伝子送達ビヒクルが提供される（例えば、WO 93/10814を参照の こと）。本明細書において利用される場合、用語「免疫原性」とは、適切な条件 下で免疫応答を引き起こし得る改変された細胞成分をいう。この応答は細胞媒介 性でなければならず、そして体液性応答もまた含み得る。用語「非ガン原性」と は、ヌードマウスにおいて細胞形質転換を引き起こさないかまたはガン形成を誘 導しない、改変された細胞成分をいう。用語「改変された細胞成分」とは、細胞 をガン原性にすることに関連するか、またはガン原性細胞に一般に関連するが細 胞をガン原性にすることに必要でも必須でもないタンパク質および他の細胞構成 成分をいう。 簡略には、改変の前に、細胞成分は、正常な細胞の増殖および調節に必須であ り得、そして、例えば、細胞内タンパク質分解、転写調節、細胞周期の制御、お よび細胞−細胞相互作用を調節するタンパク質を含む。改変後には細胞成分はも はやそれらの調節機能を果たさず、従って細胞は調節されない増殖を経験し得る 。改変された細胞成分の代表例は、ras*，p53*，Rb*、ウィルムス腫瘍遺伝子(Wi lms'tumorgene)によりコードされる改変されたタンパク質、ユビキチン*、ムチ ン*、DCC、APC、およびMCC遺伝子によりコードされるタンパク質、乳ガン遺伝子 BRCA1*、ならびにレセプターまたはレセプター様構造（例えば、neu、甲状腺ホ ルモンレセプター、血小板由来増殖因子（PDGF）レセプター、インスリンレセプ ター、上皮増殖因子(EGF)レセプター、およびコロニー刺激因子（CSF）レセプタ ー）を含む。 改変された細胞成分をコードする配列がいったん得られたら、この配列が非ガ ン原性タンパク質をコードすることを確実にすることが必要である。特定の細胞 成分のガン原性を評価する種々のアッセイが公知であり、そして容易に達成され 得る。代表的アッセイには、ラット線維芽細胞アッセイ、ヌードマウスまたはラ ットにおける腫瘍形成、軟寒天中のコロニー形成、およびトランスジェニック動 物（例えばトランスジェニックマウス）の調製が含まれる。 ヌードマウスまたはラットにおける腫瘍形成は、特定の細胞成分のガン原性を 決定するのに特に重要でかつ高感度な方法である。ヌードマウスは機能的な細胞 免疫系が欠如しており（すなわち、CTLを有さない）、従って細胞のガン原性の 可能性を試験するのに有用なインビボのモデルを提供する。正常な非ガン原性細 胞は、ヌードマウス中に感染させた場合に制御されない増殖特性を示さない。し かし形質転換した細胞はヌードマウス中で急速に増殖し、そして腫瘍を発生させ る。簡略には、１つの実施態様において、アルファウイルスベクター構築物は同 系のマウスの細胞に投与され、次にヌードマウスに注射される。腫瘍の増殖を決 定するために注射後２〜８週間の間、マウスを肉眼で観察する。また腫瘍が存在 するか否かを決定するために、マウスを屠殺し剖検し得る（Giovanellaら、J．N atl．Cancer Inst．48：1531-1533，1972:Fureszら、Abnormal Cells，New Prod ucts and Risk，HoppsおよびPetricciani編、Tissue Culture Association，198 5；およびLevenbookら、J．Biol．Std．13：135-141，1985）。 ガン原性はまた軟寒天中のコロニー形成を目視することによっても評価され得 る(MacphersonおよびMontagnier，Virol．23：291-294，1964)。簡略には、正常 な非ガン原性細胞の１つの性質は「接触阻害」である（すなわち、細胞は隣接す る細胞に接触するとその増殖を止める）。細胞を半固体寒天支持培地中にプレー ティングすると、正常な細胞はすぐ接触阻害を受けて増殖を止めるが、ガン原性 細胞は増殖し続けて軟寒天中でコロニーを形成する。 改変された細胞成分が細胞をガン原性にすることに関係しているならば、改変 された細胞成分を非ガン原性にすることが必要である。例えば１つの実施態様に おいて、改変された細胞成分をコードする目的の配列または遺伝子は、遺伝子産 物を非ガン原性にするために端が切り取られる。改変された細胞成分をコードす る遺伝子は種々のサイズに切り取られ得るが、改変された細胞成分をできるだけ 多く保持することが好ましい。さらに切り取りが行われても、改変された細胞成 分の免疫原性配列の少なくともいくつかは無傷であることが必要である。あるい は複数の翻訳終結コドンが免疫原性領域の下流に導入され得る。終結コドンの挿 入によりタンパク質発現が早期に終結され、こうしてタンパク質の形質転換部分 の発現を防止する。 上記のように、適切な免疫応答を発生させるために、変化した細胞成分はまた 免疫原性でなければならない。Ｔ細胞のエピトープはしばしば免疫原性で両親媒 性のα−ヘリックス成分を有するが、特定の配列の免疫原性はしばしば予測する ことが難しい。しかし、一般に、免疫原性はアッセイにより決めることが好まし い。代表的なアッセイは、新規に導入したベクターに対する抗体の存在を検出す るELISA、ならびにγインターフェロンアッセイ、IL−２生成アッセイ、および 増殖アッセイのようにＴヘルパー細胞を試験するアッセイを含む。 上記のように、本発明の別の局面において、一般的な抗ガン治療物を形成する ために、いくつかの異なる改変された細胞成分が同時発現され得る。一般に、種 々の組合せがなされ得ることは当業者には明らかである。好適な実施態様では、 この治療物は特定のタイプのガンを標的とし得る。例えば、ほとんどすべての大 腸ガンは、ras、p53、DCC、APCまたはMCC遺伝子に変異を有する。これらの多数 の改変された細胞成分を同時発現するアルファウイルスベクター構築物が、すべ ての可能な変異を処置するために大腸ガン患者に投与され得る。この方法はまた 、他のガンを処置するためにも利用され得る。従って、ムチン*、ras*、neu、BR CA1*、およびp53*を同時発現するアルファウイルスベクター構築物は、乳ガンを 処置するために利用され得る。 ｂ．外来生物または他の病原性物質からの抗原 本発明の他の局面において、外来生物または他の病原性物質からの抗原の免疫 原性部分の発現を指向するベクターが提供される。このような抗原の代表例は、 細菌性抗原（例えば、E.coli、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、マイ コバクテリウムなど）、真菌性抗原、寄生体抗原、およびウイルス抗原（例えば 、インフルエンザウイルス、ネコ白血病ウイルス（「FeLV」）、ネコ免疫不全症 ウイルス（「FIV」）またはヒト免疫不全症ウイルス（「HIV」）のような免疫不 全症ウイルス、Ａ型、Ｂ型、およびＣ型肝炎ウイルス（それぞれ、「HAV」、「H BV」、および「HCV」）、ヒトパピローマウイルス（「HPV」）、エプスタインバ ーウイルス（「EBV」）、単純ヘルペスウイルス（「HSV」）、ハンタウイルス、 TTLVＩ、HTLVIIおよびサイトメガロウイルス（「CMV」）を含む。本発明の状況 で利用される場合、「免疫原性部分」とは、適切な条件下で免疫応答（すなわち 、細胞性または体液性）を引き起こし得る各抗原の部分をいう。「部分」とは種 々 のサイズであり得るが、好ましくは少なくとも９アミノ酸の長さであり、そして 抗原全体を含み得る。細胞媒介性免疫応答は、主要組織適合性遺伝子複合体（「 MHC」）クラスＩの提示、MHCクラスIIの提示、またはその両方を介して媒介され 得る。 本発明の１つの局面において、Ｂ型肝炎抗原の免疫原性部分（例えば、WO 93/ 15207を参照のこと）の発現を指向するアルファウイルスベクター構築物が提供 される。簡略にはＢ型肝炎のゲノムは、約3.2キロベースの長さの環状DNAで構成 され、そしてよく特徴付けられている（Tiollaisら、Science 213：406-411，19 81；Tiollaisら、Nature 317：489-495，1985；およびGanemおよびVarmus、Ann ．Rev．Biochem．56：651-693，1987；EP 0 278,940、EP 0 241,021、WO 88/103 01、ならびに米国特許第4,696,898号および同第5,024,938号も参照のこと、これ らは参考として本明細書中に援用される）。Ｂ型肝炎ウイルスは数個の異なる抗 原を示し、これらは特に、３つのHB「Ｓ」抗原（HBsAg）(HBc抗原(HBcAg)、HBe 抗原(HBeAg)、およびHBx抗原(HBxAg))を含む（Blumら、TIG 5(5)：154-158，198 9を参照のこと）。簡略には、HBeAgはP22プレコア中間体のタンパク質分解切断 により得られ、そして細胞から分泌される。HBeAgは血清中に17kDタンパク質と して見出される。HBcAgは183アミノ酸のタンパク質であり、HBxAgはサブタイプ により異なるが、145〜154アミノ酸のタンパク質である。 HBsAg（「大」、「中」、および「小」と呼ぶ）はＢ型肝炎ウイルスゲノムの ３つの領域によりコードされる：Ｓ、プレーS2およびプレーS1。389〜400アミノ 酸の様々な長さを有する大タンパク質はプレーS1、プレーS2、およびＳ領域によ りコードされ、そしてグリコシル化および非グリコシル化形態で見いだされる。 中タンパク質は281アミノ酸の長さであり、そしてプレーS2およびＳ領域により コードされる。小タンパク質は226アミノ酸の長さであり、そしてＳ領域により コードされる。これは２つの形態（グリコシル化(GP27S)および非グリコシル化( P24S)）で存在する。これらのそれぞれの領域が別々に発現されると、プレーS1 領域は約119アミノ酸のタンパク質をコードし、プレーS2領域は約55アミノ酸の タンパク質をコードし、そしてＳ領域は約226アミノ酸のタンパク質をコードす る。 当業者には明らかなように、本明細書中に記載のアルファウイルスベクター構 築物の１つにより投与された場合に免疫応答を誘導するために、上記のＳ抗原の 種々の免疫原性部分を組合せ得る。さらに、HBVのＳオープンリーディングフレ ームについて様々な地域で見いだされる大きな免疫学的多様性のために、特定の 地域での投与のために特定の組合せの抗原が好適であり得る。 HBVにより示されるものはまた、pol(「HBV pol」)、ORF5、および0RF6抗原で ある。簡略には、HBVのポリメラーゼオープンリーディングフレームは、感染し た肝臓のビリオンおよびコア様粒子に見いだされる逆転写酵素活性をコードする 。ポリメラーゼタンパク質は少なくとも２つのドメインよりなる：逆転写を開始 するタンパク質をコードするアミノ末端ドメイン、ならびに逆転写酵素およびRN ase Ｈ活性をコードするカルボキシル末端ドメイン。HBV polの免疫原性部分は 、本明細書に記載の方法を利用して、下記のアルファウイルスベクター構築物を 利用して決定され得、そして温血動物中に免疫応答を発生させるために投与され 得る。同様にORF5およびORF6（Millerら、Hepatology 9：322-327，1989）のよ うな他のHBV抗原が、本明細書に記載のようなアルファウイルスベクター構築物 を利用して発現され得る。 上記のように、Ｂ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分が、遺伝子送達 ビヒクル中に取り込まれる。遺伝子送達ビヒクルに取り込まれる免疫原性部分（ 単数または複数）は種々の長さであり得るが、一般的にはこの部分は少なくとも ９アミノ酸の長さであることが好ましく、そして抗原全体を含み得る。特定の配 列の免疫原性を予測することはしばしば困難であるが、Ｔ細胞のエピトープは、 潜在的なＴヘルパー部位およびCTL部位のコード領域をスキャンするために、TSI TES（MedImmune、Maryland）のようなコンピューターアルゴリズムを利用して予 測され得る。この解析から、ペプチドが合成され、そしてインビトロの細胞傷害 性アッセイで標的として使用される。しかし、他のアッセイもまた利用され得、 例えば、新規に導入したベクターに対する抗体の存在を検出するELISA、ならび にγインターフェロンアッセイ、IL−２生成アッセイ、および増殖アッセイのよ うなＴヘルパー細胞を試験するアッセイを含む。 免疫原性部分はまた他の方法により選択され得る。例えば、HLA A2.1トランス ジェニックマウスは、ウイルス抗原のヒトＴ細胞認識のモデルとして有用である ことが示されている。簡略にはインフルエンザウイルス系およびＢ型肝炎ウイル ス系では、マウスのＴ細胞レセプターレパートリーがヒトＴ細胞により認識され る抗原決定基と同じものを認識する。両方の系において、HLA A2.1トランスジェ ニックマウスにおいて生じるCTL応答は、ヒトCTLのHLA A2.1ハプロタイプにより 認識されるエピトープと事実上同じエピトープを指向する(Vitielloら、J．Exp ．Med．173：1007-1015，1991；Vitielloら、Abstract of Molecular Biology o f Hepatitis B Virus Symposia，1992)。アルファウイルスベクター構築物への 組み込みに特に好ましい免疫原性部分は、HBeAg、HBcAg、およびHBsAgを含む。 Ｂ型肝炎ウイルスのさらなる免疫原性部分は、コード配列を種々の位置（例えば 、以下の部位を含む：Bst UI、Ssp I、PpuMI、およびMspI）で切り取ることによ り得られ得る（Valenzuelaら、Nature 280：815-19，1979；Valenzuelaら、Anim al Virus Genetics：ICN/UCLA Symp．Mol．Cell Biol.，1980，B．N．Fieldsお よびR．Jaenisch（編）、57〜70頁，New York：Academic)。 上記のように、遺伝子送達ビヒクルには１つより多くの免疫原性部分が組み込 まれ得る。例えば、遺伝子送達ビヒクルは、HBcAg、HBeAg、HBsAg、HBxAgのすべ てまたは免疫原性部分、ならびにHCV抗原の免疫原性部分を（別々に、または１ つの構築物として）発現し得る。 ７．異種配列の供給源 上記のタンパク質をコードする配列は、種々の供給源（例えば、アメリカンタ イプカルチャーコレクション(ATCC、Rockville、MD)のような寄託機関、またはB ritish Bio-Technology Limited（Cowley、Oxford、England）のような商業的供 給源を含む）から容易に得られ得る。代表例は、BBG12（127アミノ酸の成熟タン パク質をコードするGM−CSF遺伝子を含有する）；BBG6(γインターフェロンをコ ードする配列を含有する)；ATCC No.39656（TNFをコードする配列を含有する） ；ATCC No.20663(αインターフェロンをコードする配列を含有する)；ATCCNo.31 902およびNo.39517(βインターフェロンをコードする配列を含有する)；ATCC No .67024(インターロイキン−1bをコードする配列を含有する)；ATCC No.39405、N o.39452、No.39516、No.39626、およびNo.39673(インターロイキン−２ をコードする配列を含有する)；ATCC No.59399、No.59398、およびNo.67326(イ ンターロイキン−３をコードする配列を含有する)；ATCCNo.57592(インターロイ キン−４をコードする配列を含有する)；ATCC No.59394およびNo.59395(インタ ーロイキン−５をコードする配列を含有する)；ならびにATCC No.67153(インタ ーロイキン−６をコードする配列を含有する)を含む。 上記のような改変された細胞成分をコードする配列は、種々の供給源から容易 に得られ得る。例えば、改変された細胞産物をコードする配列を含むプラスミド は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC、Rockville、MD）のよう な寄託機関、またはAdvanced Biotechnologies（Columbia、Maryland）のような 商業的供給源から得られ得る。上記の配列のいくつかを含むプラスミドの代表例 は、ATCC No.41000（rasの12番目のコドンにＧからＴへの変異を含む）、および ATCC No.41049（12番目のコドンにＧからＡへの変異を含む）を含む。 あるいは、正常な細胞成分をコードするプラスミドはまた、ATCCのような寄託 機関から得られ得（例えば、ATCC No.41001（正常なrasタンパク質をコードする 配列を含む）；ATCC No.57103（ablをコードする）；およびATCC No.59120また はNo.59121（bcr遺伝子座をコードする）を参照のこと）、そして改変された細 胞成分を形成するために変異され得る。特定の部位を変異誘発する方法は、当該 分野で公知の方法（例えば、Sambrookら、前出、15.3以下を参照のこと）を用い て容易に達成され得る。特に、rasのような正常な細胞成分の点変異は、特定の コドン（例えば、コドン12、13、または61）の部位特異的変異誘発により容易に 達成され得る。 上記のウイルス抗原をコードする配列も同様に種々の供給源から得られ得る。 例えば、Ｂ型肝炎ウイルスをコードする分子的にクローン化したゲノムは、アメ リカンタイプカルチャーコレクション（ATCC、Rockville、MD）のような供給源 から得られ得る。例えば、ATCC No.45020は、pBR322(Moriartyら、Proc．Natl． Acad．Sci．USA 78：2606-2610，1981)のBamHＩ部位にＢ型肝炎の全ゲノムDNA（ 精製したDane粒子から抽出された）(Blumら、TIG 5(5)：154-158，1989の図３を 参照のこと）を含む。 あるいは、上記の異種配列をコードするcDNA配列は、配列を発現または含有す る細胞から得られ得る。簡略には、１つの実施態様において、目的の遺伝子を発 現する細胞由来のmRNAは、オリゴヌクレオチドdTまたはランダムプライマーを用 いて逆転写酵素により逆転写される。次いでこの１本鎖cDNAを、所望の配列のい ずれかの側の配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用してPCR（米 国特許第4,683,202号；同第4,683,195号および同第4,800,159号を参照のこと。P CR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification，Erlich （編）、Stockton Press，1989も参照のこと）により増幅し得る。特に、２本鎖 DNAは、熱安定性Taqポリメラーゼ、配列特異的DNAプライマー、dATP、dCTP、dGT P、およびdTTPの存在下で加熱することにより変性される。合成が完了すると２ 本鎖DNAが生成される。このサイクルは何回も繰り返し得、所望のDNAの何乗倍も の増幅がもたらされる。 上記のタンパク質をコードする配列はまた、例えばApplied Biosystems Inc． のDNA合成機（例えば、APBDNA合成機モデル392(Foster City、CA)）で合成され 得る。 Ｇ．アルファウイルスパッケージング細胞株／プロデューサー細胞株 本発明のさらなる局面では、アルファウイルスパッケージング細胞株およびプ ロデューサー細胞株が提供される。詳細には、本発明の１つの局面において、ア ルファウイルスパッケージング細胞株を提供する。ここで、ウイルス構造タンパ ク質は１つ以上の安定に形質転換された発現ベクターからトランスで供給され、 そしてトランスフェクトされ、形質導入され、または細胞内に生成されたベクタ ーRNA転写産物を細胞質においてキャプシド化し得、そして細胞膜を通して感染 性パッケージ化ベクター粒子を放出し得る。好ましい実施態様において、パッケ ージングに必要な構造タンパク質は、RNAベクターレプリコン自身または提供さ れる他の何らかの刺激により誘導された後にのみ高レベルで合成され、そしてこ れらの構造タンパク質をコードする転写産物は、天然のウイルス感染の発現レベ ルを模倣するに十分な発現レベルを可能にする様式で細胞質で増幅し得る。さら に、他の実施態様において、選択マーカーの発現は、構造タンパク質発現カセッ トに作動可能に連結される。このような連結された選択マーカーは、機能的で安 定に形質転換されたPCLの効率的な生成を可能にする。 例えば、パッケージングされる所望の表現型のアルファウイルスRNAベクター レプリコン分子は、それ自身細胞の細胞質において自己触媒複製し得、インビト ロ転写されたRNA、組換えアルファウイルス粒子、またはアルファウイルスcDNA ベクター構築物としてパッケージング細胞中に導入され得る。次いで、RNAベク ター転写産物は、高レベルまで複製して、構造タンパク質遺伝子転写産物（単数 または複数）の増幅およびその後のタンパク質発現を刺激し、続いてウイルス構 造タンパク質によりパッケージングされて感染性ベクター粒子を生じる。特定の レベルより上のレベルのアルファウイルスタンパク質および／またはベクターRN Aの細胞内発現は、パッケージング細胞株またはプロデューサー細胞株において 細胞傷害効果をもたらし得る。従って、本発明の特定の実施態様では、これらの エレメントが、それらの発現される構造タンパク質の細胞傷害性の減少、宿主巨 大分子合成の減少した阻害、および／または存続した感染を確立する能力につい て選択されるウイルス改変体に由来することが、望ましいとされ得る。 ベクターパッケージング細胞株の能力および最終ベクター力価を最適化するた めに、遺伝子移入およびベクターパッケージングの連続的なサイクルを実行し得 る。例えば、パッケージング細胞株のベクタートランスフェクションに由来する 感染性のパッケージングされたベクター粒子を含む上清を用いて、新鮮な単層の アルファウイルスパッケージング細胞を感染または「形質導入」し得る。パッケ ージングされたベクター粒子および新鮮なパッケージング細胞での連続的な形質 導入は、核酸トランスフェクションよりも好ましいとされ得る。なぜなら、これ は、細胞へのそのより高いRNA移入効率は、細胞におけるベクターの生物学的置 換の最適化、および増大する多数のパッケージング細胞からのベクター生成のた めにプロセスを「スケールアップ」する能力のためである。これは、より高い発 現およびより高い力価のパッケージングされた感染性組換えアルファウイルスベ クターをもたらす。 本発明の他の局面では、安定に組み込まれたかまたはエピソームに維持された DNA発現ベクターを用いて、アルファウイルスベクターRNA分子を細胞中で生成さ せ得る。簡略には、このようなDNA発現ベクターは、好ましい実施態様において 、 アルファウイルスベクターRNAの転写が、細胞が所望の密度まで増殖したときに のみ生じ、その後誘導されるように、誘導性であるように構成され得る。一旦転 写されると、アルファウイルスベクターは、自己触媒的に自己複製する能力を維 持し、そしてパッケージングされたベクター粒子生成における最高点に達する事 象のカスケードを誘発する。このアプローチは、延長された培養期間にわたる連 続したベクター発現を可能にする。なぜなら、組み込まれたDNAベクター発現系 は、薬物または他の選択マーカーを通して維持され、そしてDNA系は、一旦誘導 されると、欠陥RNAコピーにより希釈され得ない改変されていないRNAベクターレ プリコンを構成的に発現するからである。大規模で高力価のパッケージングされ たアルファウイルスベクターの生成は、このアルファウイルス「プロデューサー 細胞株」の構成において可能であり、DNAに基づくアルファウイルスベクターは 、最初にパッケージング細胞株にトランスフェクションにより導入される。なぜ なら、サイズ制限は、形質導入のためのウイルスベクター粒子中への発現ベクタ ーのパッケージングを防ぎ得るからである。 Ｈ．薬学的組成物 上記のように、本発明はまた、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または 賦形剤と組み合わせた、本明細書中に記載の遺伝子送達ビヒクルを含む薬学的組 成物を提供する。例えば、１つの実施態様では、本発明のRNAまたはDNAベクター 構築物は、長期間の保存および輸送のために凍結乾燥され得、そして種々の物質 を用いて投与の前に再構成され得るが、好ましくは水を用いて再構成される。特 定の例において、最終製剤を等張にする希釈塩溶液もまた使用され得る。さらに 、再構成された核酸調製物の活性または物理的保護を増強する成分を含む水溶液 を使用することも有利であり得る。このような成分は、サイトカイン（例えば、 IL-2）、ポリカチオン（例えば、硫酸プロタミン）、脂質製剤、または他の成分 を含む。凍結乾燥または脱水された組換えベクターは、任意の便利な容量の水ま たは、凍結乾燥または脱水されたサンプルの実質的な、そして好ましくは完全な 可溶化を可能にする、上記の再構成物質により再構成され得る。 組換えアルファウイルス粒子または感染性組換えウイルス（以下で両方をウイ ルスという）は、粗製形態または精製形態のいずれかで保存され得る。ウイルス を粗製形態で生成するためには、増殖性細胞は、バイオリアクターまたはフラッ トストック培養において最初に培養され得、ここで、ウイルス粒子は細胞から培 養培地中に放出される。次いで、ウイルスは、最初に十分な量の処方緩衝液を組 換えウイルスを含む培養培地中に添加して水性懸濁液を形成することにより、粗 製形態で保存され得る。特定の実施態様では、処方緩衝液は、糖、高分子量構造 添加物、および緩衝化成分を水中に含む水溶液である。水溶液はまた、１つ以上 のアミノ酸を含み得る。 組換えウイルスはまた、精製形態で保存され得る。より詳細には、処方緩衝液 の添加前に、上記の粗製組換えウイルスをフィルターに通すことにより澄明化し 、次いで、例えば、向流濃縮システム（Filtron Technology Corp.、Nortboroug h、MA）により濃縮し得る。１つの実施態様では、DNaseを濃縮物に加えて、外来 DNAを消化する。次いで、過剰の培地成分を除去し、消化物をダイアフィルトレ ートして、より望ましい緩衝化溶液中に組換えウイルスを樹立させる。次いで、 ダイアフィルトレートした物をSephadex S-500ゲルカラムに通し、そして精製組 換えウイルスを溶出させる。次に所望の最終成分濃度を得、そして組換えウイル スを最小限で希釈するためにこの溶出液に十分量の処方緩衝液を加える。次いで 、水性懸濁液を、好ましくは−70℃で保存し得るか、または直ちに乾燥し得る。 上記のように、処方緩衝液は、糖、高分子量構造添加物、および緩衝化成分を水 中に含む水溶液であり得る。この水溶液はまた、１つ以上のアミノ酸を含み得る 。 粗製組換えウイルスはまた、イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製 され得る。簡略には、粗製組換えウイルスをまずフィルターに通すことにより澄 明化し、次に濾液を高度にスルホン酸化されたセルロースマトリックスを含有す るカラムにのせ得る。次いで、高塩緩衝液を用いることにより組換えウイルスを 精製形態でカラムから溶出させ、そして溶出液を分子排除カラムに通すことによ り、高塩緩衝液をより所望される緩衝液に交換し得る。次いで、上記のように、 精製組換えウイルスに十分量の処方緩衝液を加え、そして水性懸濁液を、直ちに 乾燥させるかまたは好ましくは−70℃で保存するかのいずれかである。 粗製形態または精製形態の水性懸濁液は、凍結乾燥または雰囲気温度での蒸発 により乾燥され得る。簡略には、凍結乾燥は、水性懸濁液をガス転移温度より低 くにまたは水性懸濁液の共晶点温度より低くに冷却する工程、および昇華により 冷却した懸濁液から水分を除去して凍結乾燥ウイルスを形成する工程を含む。１ つの実施態様では、処方された組換えウイルスのアリコートを凍結乾燥機（Supe rmodulyo 12K）に取り付けたEdwards Refrigerated Chamber(3 shelf RC3S unit )に入れる。Phillipsら(Cryobiology，18:414，1981)に記載されるような多段階 凍結乾燥手順を用いて、処方された組換えウイルスを、好ましくは−40℃〜−45 ℃の温度で凍結乾燥する。得られる組成物は、凍結乾燥ウイルスの10重量％未満 の水を含む。以下により詳細に議論されるように、一旦凍結乾燥されると、組換 えウイルスは安定であり、そして−20℃〜25℃で保存され得る。 蒸発法では、水分は雰囲気温度で蒸発により水性懸濁液から除去される。１つ の実施態様において、水分は噴霧乾燥により除去される（EP 520,748）。噴霧乾 燥プロセスでは、水性懸濁液は予め加熱された気体流（通常は空気）の中に送達 され、この際懸濁液の液滴から水分は急速に蒸発する。噴霧乾燥装置は、多くの 製造業者から入手可能である（例えば、Drytec Ltd.,Tonbridge、England；Lab- Plant，Ltd.，Huddersfield、England）。一旦脱水されると、組換えウイルスは 安定であり、そして、−20℃〜25℃で保存され得る。本明細書に記載した方法で は、乾燥または凍結乾燥ウイルスの得られる水分含量は、カールーフィッシャー 装置（EM，Science Aquastar’V1B容積滴定機、Cherry Hill、NJ）、または重 量法の使用により測定され得る。 上記のように、処方に使用される水溶液は、好ましくは、糖、高分子量構造添 加物、および緩衝化成分および水から構成される。この溶液はまた、１つ以上の アミノ酸を含み得る。これらの成分の組合せは、凍結および凍結乾燥または蒸発 による乾燥に際して組換えウイルスの活性を保護するように作用する。利用され 得る糖の１つはラクトースであるが、他の糖（例えば、スクロース、マンニトー ル、グルコース、トレハロース、イノシトール、フルクトース、マルトースまた はガラクトースを含む）も同様に利用され得る。さらに、糖の組合せ（例えば、 ラクトースとマンニトール、またはスクロースとマンニトール）が使用され得る 。特に好ましいラクトースの濃度は３重量％〜４重量％である。好ましくは、糖 の 濃度は、１重量％〜12重量％の範囲にわたる。 高分子量構造添加物は、凍結の間のウイルスの凝集の防止を助け、凍結乾燥ま たは乾燥状態での構造的支持を提供する。本発明の状況において、構造添加物は 、これらが5000m.w.より大きい場合は「高分子量」であると考えられる。好まし い高分子量構造添加物は、ヒト血清アルブミンである。しかし、他の物質（例え ば、ヒドロキシエチル−セルロース、ヒドロキシメチル−セルロース、デキスト ラン、セルロース、ゼラチン、またはポビドン）もまた使用し得る。ヒト血清ア ルブミンの特に好ましい濃度は、0.1重量％である。好ましくは、高分子量構造 添加物の濃度は、0.1重量％〜10重量％の範囲である。 アミノ酸は（存在する場合は）、水性懸濁液の冷却および融解に際して、ウイ ルス感染性をさらに保護するように機能する。さらに、アミノ酸は、冷却された 水性懸濁液の昇華の間および凍結乾燥状態にある間にウイルスの感染性をさらに 保護するように機能する。好ましいアミノ酸はアルギニンであるが、他のアミノ 酸（例えば、リジン、オルニチン、セリン、グリシン、グルタミン、アスパラギ ン、グルタミン酸またはアスパラギン酸）もまた使用し得る。特に好ましいアル ギニン濃度は、0.1重量％である。好ましくは、アミノ酸濃度は、0.1重量％〜10 重量％の範囲である。 緩衝化成分は、比較的一定のpHを維持することにより、溶液を緩衝化するよう に作用する。所望のpHの範囲（好ましくは7.0と7.8との間）に応じて種々の緩衝 液が使用され得る。適切な緩衝液には、リン酸緩衝液およびクエン酸緩衝液が含 まれる。組換えウイルス製剤の特に好ましいpHは7.4であり、そして好ましい緩 衝液はトロメタミンである。 さらに、水溶液が、最終的に処方された組換えアルファウイルスを適切な等浸 透圧塩濃度に調整するために使用される中性の塩を含有することが好ましい。適 切な中性の塩には、塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは塩化マグネシウムが含 まれる。好ましい塩は塩化ナトリウムである。 上記の、所望の濃度の成分を含有する水溶液は、濃縮されたストック溶液とし て調製され得る。 本明細書中に提供される開示を考慮すれば、凍結乾燥ウイルスを室温で保存す ることを意図する場合は、水溶液中に特定の糖を利用することが好ましいとされ 得ることが当業者には明らかである。より詳細には、特に室温での保存には、二 糖（例えば、ラクトースまたはトレハロース）を利用することが好ましい。 本発明の凍結乾燥または脱水されたウイルスは、種々の物質を用いて再構成さ れ得るが、好ましくは水を使用して再構成される。特定の場合には、最終製剤を 等張にする希塩溶液もまた使用され得る。さらに、再構成されたウイルスの活性 を増強することが公知の成分を含有する水溶液を使用することが有利であり得る 。このような成分には、サイトカイン（例えば、IL-2）、ポリカチオン（例えば 、硫酸プロタミン）または再構成されたウイルスの形質導入効率を増強する他の 成分が含まれる。凍結乾燥または脱水された組換えウイルスは、任意の便利な容 量の水、または凍結乾燥または脱水されたサンプルの実質的な、そして好ましく は完全な可溶化を可能にする上記の再構成物質により再構成され得る。 Ｉ．遺伝子送達ビヒクルを利用するための方法 上記のように、本発明はまた、選択された異種配列を脊椎動物（例えば、哺乳 動物（例えば、ヒト）または他の温血動物（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ 、イヌ、ネコ、ラット、またはマウス））または昆虫に送達するための方法を提 供する。この方法は、脊椎動物または昆虫に、選択された異種配列を発現し得る 、本明細書に記載されたような遺伝子送達ビヒクルを投与する工程を含む。この ような遺伝子送達ビヒクルは、直接（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、 経口、直腸、眼内、鼻腔内）または種々の物理的方法（例えば、リポフェクショ ン（Felgnerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA84:7413-7147，1989）、直接的DNA 注入（Fungら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80:353-357，1983;Seegerら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 81:5849-5852;Acsadiら，Nature 352:815-818，1991） ；マイクロプロジェクタイルボンバードメント（Williamsら，PNAS88:2726-2730 ，1991）；いくつかのタイプのリポソーム（例えば、Wangら，PNAS 84:7851-785 5，1987を参照のこと）；CaPO4（Dubenskyら，PNAS 81:7529-7533，1984）；DNA リガンド(Wuら，J．Biol．Chem．264:16985-16987，1989)；核酸単独の投与（WO 90/11092）；または殺傷されたアデノウイルスに結合されたDNAの投 与（Curielら，Hum．Gene Ther．3:147-154，1992）；レセプター特異的リガン ドを利用して、ポリリジンのようなポリカチオン化合物を介して；ならびにソラ レン不活化ウイルス（例えば、センダイウイルスまたはアデノウイルス）を用い て）のいずれかにより投与され得る。さらに、遺伝子送達ビヒクルは、直接（す なわちインビボで）または取り出されていて（エクソビボで）続いて戻される細 胞のいずれかで投与され得る。 以下でより詳細に議論するように、遺伝子送達ビヒクルは、脊椎動物または昆 虫に、広範な種々の治療目的および／または他の生成的目的のために投与され得 る。これらの目的は、例えば、特異的な免疫応答を刺激するため；宿主細胞レセ プターとの薬剤の相互作用を阻害するため；毒性緩和剤（例えば、条件的毒性緩 和剤を含む）を発現するため；免疫系を免疫学的に調節するため；細胞分裂を防 ぐため、置換遺伝子治療のためにマーカーを発現するため、創傷治癒を促進する ため、および／または組換えタンパク質を生成するための目的を含む。これらお よび他の使用は、以下でより詳細に議論される。 １．免疫刺激 本発明の１つの局面において、感染性、ガン性、自己免疫性、または免疫疾患 を防止、阻害、安定化、または逆転し得る遺伝子送達ビヒクルを投与するための 組成物および方法が提供される。このような疾患の代表例として、HIV、HBV、HC V、HTLVI、HTLVII、CMV、EBV、およびHPVのようなウイルス感染症、メラノーマ 、糖尿病、移植片対宿主病、アルツハイマー病、および心臓疾患などが挙げられ る。より具体的には、本発明の１つの局面において、病原性物質が死滅するかま たは阻害されるかのいずれかであるように、病原性物質に対する免疫応答（体液 性または細胞媒介性のいずれか）を刺激するための組成物および方法が提供され る。病原性物質の代表例として、細菌、真菌、寄生体、ウイルス、およびガン細 胞が挙げられる。 本発明の１つの実施態様において、病原性物質はウイルスであり、そして（１ ）ウイルス抗原に対する免疫応答を開始させるか、または（２）ウイルスの相互 作用に必要な細胞レセプターを占有することによりウイルスの拡散を防止するこ とのいずれかが可能である感受性の標的細胞に、抗原またはその改変型の発 現を指向する遺伝子送達ビヒクルを用いることにより、特異的免疫応答を刺激し 、そしてウイルスの拡散を阻害するための方法が提供される。ベクターの核酸に コードされたタンパク質の発現は一時的であるか、または時間が経過しても安定 なものであり得る。病原性物質抗原に対して免疫応答が刺激される場合、遺伝子 送達ビヒクルは好ましくは、免疫応答を刺激しかつ天然の抗原に比較して低下し た病原性を有する、改変型の抗原を発現するように設計される。この免疫応答は 、細胞が正しい様式で抗原を提示する場合、すなわち、MHCクラスＩおよび／ま たはII分子と、CD3、ICAM-1、ICAM-2、LFA-1、またはこれらのアナログのような アクセサリー分子とともに抗原を提示する場合に、達成される(例えば、Altmann ら、Nature 338：512，1989)。遺伝子送達ビヒクルに感染した細胞は、これらが 真のウイルス感染を厳密に模倣し、そしてこれらは、（ａ）複製していない細胞 に感染することができ、（ｂ）宿主細胞ゲノム内に組み込まれることがなく、（ ｃ）いかなる致死的疾患にも関係がなく、そして（ｄ）高レベルの異種タンパク 質を発現するため、これを効率的に行うことが予想される。これらの差異のため に、遺伝子送達ビヒクルはワクチン使用のために健常人に対して使用され得る安 全なウイルスベクターとして容易に考えられ得る。 提示細胞が完全に生存しており、健康であり、そして異種遺伝子に比較して低 レベルのウイルス抗原が発現されるという点で、本発明のこの局面は、同じ様式 で機能すると予想され得る他の系に対してさらなる利点を有する。発現される抗 原性エピトープは、抗原の遺伝子のサブフラグメントの組換えアルファウイルス への選択的クローニングにより改変され得、このことは他の場合には免疫優勢な エピトープにより隠され得る免疫原性エピトープに対する応答を導くので、これ は明確な利点を有する。このようなアプローチは多数のエピトープ（このエピト ープの１つ以上は、異なるタンパク質由来である）を有するペプチドの発現に拡 張し得る。さらに、本発明のこの局面は、細胞内合成およびこれらのペプチドフ ラグメントとMHCクラスＩ分子との会合を介する、抗原性エピトープおよび遺伝 子のサブフラグメントによりコードされる抗原のペプチドフラグメントに対する 細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)の効率的な刺激を可能にする。このアプローチはCTL 誘導について主要な免疫優勢エピトープをマッピングするために利用され得る。 免疫応答はまた、（もしも必要であるなら適切なMHC分子と関係して）目的の 抗原を認識する特異的Ｔ細胞レセプターの遺伝子、目的の抗原を認識する免疫グ ロブリンの遺伝子、またはMHCの関係の非存在下でCTL応答を提供する２つのもの の１つのハイブリッドの遺伝子を、適切な免疫細胞（例えばＴリンパ球）に移入 することによっても、達成され得る。従って、遺伝子送達ビヒクル細胞は、免疫 刺激剤、免疫調節剤、またはワクチンとして使用され得る。 本発明の別の実施態様において、遺伝子送達ビヒクルが、ウイルスのアセンブ リを阻害する、欠陥のある妨害性ウイルス構造タンパク質を送達および発現する 、阻害剤緩和剤を生成するための方法が提供される。このような遺伝子送達ビヒ クルは、欠陥のあるgag、pol、env、または他のウイルス粒子タンパク質または ペプチドをコードし得、そしてこれらはウイルス粒子のアセンブリを優勢な様式 で阻害する。これは、ウイルス粒子の正常なサブユニットの相互作用が、欠陥の あるサブユニットとの相互作用により妨害されるために発生する。 本発明の別の実施態様において、ウイルスプロテアーゼに特異的な阻害性ペプ チドまたはタンパク質の発現方法が提供される。簡単に記載すると、ウイルスプ ロテアーゼはウイルスのgagおよびgag/polタンパク質を、多くのより小さなペプ チドに切断する。この切断がないと、全ての場合に感染性レトロウイルス粒子の 生成が完全に阻害される。例として、HIVプロテアーゼはアスパルチンプロテア ーゼであることが公知であり、そしてこれらはタンパク質またはアナログ由来の アミノ酸から作製されるペプチドにより阻害されることが公知である。HIVを阻 害するための遺伝子送達ビヒクルは、このようなペプチド阻害剤の１つまたは多 数の融合したコピーを発現する。 別の実施態様は、ある細胞型で欠失、変異しているか、または発現されない場 合に、その細胞型に腫瘍形成を導く、抑制遺伝子の送達に関する。遺伝子送達ビ ヒクルによる欠失した遺伝子の再導入は、これらの細胞における腫瘍表現型の後 退を導く。このようなガンの例は網膜芽細胞腫およびウイルムス腫瘍である。悪 性疾患は、細胞増殖と比較して細胞の最終分化の阻害であると考えられ得るので 、アルファウイルスベクターの送達、および腫瘍の分化を導く遺伝子産物の発現 はまた、一般的には後退を導くはずである。 さらに別の実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、病原性機能に対応する RNA分子を切断し、それゆえそれを不活化するリボザイム（RNA酵素）（Haseloff およびGerlach，Nature 334:585，1989）を転写することにより治療効果を提供 する。リボザイムは標的RNA中の特異的配列を認識することにより機能し、そし てこの配列は通常12bp〜17bpであるため、これはRNAまたはレトロウイルスゲノ ムのような特定のRNA種の特異的認識を可能とする。さらなる特異性が、ある場 合にはこれを条件的毒性緩和剤とすることにより達成され得る（以下を参照のこ と）。 阻害性緩和剤の有効性を増加させる１つの方法は、問題のウイルスによる耐性 細胞の感染の可能性を増加させる遺伝子の発現とともに、ウイルス性阻害性遺伝 子を発現させることである。その結果は、増殖性感染事象に競合する非生産的な 「行き止まり(dead-end)」事象である。HIVの具体例では、HIV複製を（前述のよ うに、アンチセンスtatなどを発現することにより）阻害し、そしてまたCD4のよ うな感染に必要なタンパク質を過剰発現する遺伝子送達ビヒクルが送達され得る 。こうして比較的少数のベクター感染HIV耐性細胞は、遊離のウイルスまたはウ イルスの感染した細胞を用いる多数の非増殖性融台事象のための「シンク」また は「マグネット」として作用する。 ２．ブロッキング剤 多くの感染性疾患、ガン、自己免疫疾患、および他の疾患には、ウイルス粒子 と細胞、細胞と細胞、または細胞とそれら自身もしくは他の細胞により生成され た因子の相互作用が関与する。ウイルス感染では、ウイルスは普通、感受性細胞 の表面のレセプターを介して細胞に入る。ガンまたは他の増殖状態（例えば再狭 窄）では、細胞は他の細胞または因子由来のシグナルに不適切に応答し得るかま たはまったく応答し得ないか、または特定の因子は変異、過剰発現、または過少 発現されて適切な細胞周期制御の損失をもたらし得る。自己免疫疾患では、「自 己」マーカーが不適切に認識される。本発明においては、そのような相互作用は 、相互作用におけるパートナーのいずれかに対するアナログをインビボで生成す ることによりブロックされ得る。あるいは、細胞周期制御は、存在しないかまた は過少発現されるブロッキング因子を用いて、ある期から別の期（例えば、Ｇ１ 期 からＳ期への移行）を防ぐことにより回復され得る。このブロッキング作用は細 胞内、細胞膜上、または細胞外で起こり得る。そしてブロッキング剤に対する遺 伝子を有するアルファウイルスベクターの作用は、感受性細胞の内部から、また は病原性相互作用を局所的にブロックするブロッキングタンパク質の一種を分泌 することによるかのいずれかにより媒介され得る。 HIVの場合、相互作用の２つの物質はgp120/gp41エンベロープタンパク質およ びCD4レセプター分子である。従って適切なブロッカーは、病原作用を生じずにH IVの侵入をブロックするHIV envアナログ、またはCD4レセプターアナログのいず れかを発現する遺伝子送達ビヒクルである。CD4アナログは分泌され、そして隣 接する細胞を保護するように機能するが、一方gp120/gp41はベクター含有細胞の みを保護するように、分泌されるかまたは細胞内でのみ生成される。安定性また は補体溶解性を強化するために、CD4にヒト免疫グロブリン重鎖かまたは他の成 分を加えることが有利であり得る。そのようなハイブリッド可溶性CD4をコード する遺伝子送達ビヒクルの宿主への投与は、安定なハイブリッド分子の連続的な 供給をもたらす。処置の効力は、抗体レベル、ウイルス抗原生成、感染性HIVレ ベル、または非特異的感染のレベルを含む、疾患進行の通常の指標を測定するこ とによりアッセイされ得る。 制御されない増殖状態（例えば、ガンまたは再狭窄）の場合、細胞サイクルの 進行は、サイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼ（CDK）によるシグナル伝 達に影響を与える多数の分化因子の発現により停止し得る。例えば、サイクリン 依存性キナーゼ阻害剤、p16、p21、およびp27は、それぞれ、サイクリン：CDK媒 介性細胞周期シグナル伝達を調節する。遺伝子送達ビヒクルによる細胞内でのこ れらの因子の過剰発現は、細胞増殖の細胞分裂停止性の抑制をもたらす。細胞増 殖を破壊するためのブロッキング剤または標的として治療的に使用され得る他の 因子は、例えば、野生型または変異体のRb、p53、Myc、Fos、Jun、PCNA、GAX、 レンチウイルスvpr、およびp15を含む。関連する実施態様では、心血管疾患（例 えば、再狭窄またはアテローム性動脈硬化症）は、再内皮化（re-endothelializ ation）または血管再構築を促進する産物（例えば、VEGF、TFPI、SOD）を発現す るベクターを用いて処置または予防され得る。 ３．緩和剤の発現 上記の技術と類似の技術が、病原性物質または遺伝子の機能を阻害し得る物質 （または「緩和剤」）の発現を指令する遺伝子送達ビヒクルを生成するのに使用 され得る。本発明において「機能を阻害し得る」とは、緩和剤が機能を直接阻害 するか、または例えば細胞中に存在する物質を、通常は病原性物質の機能を阻害 しないものから、機能を阻害するものに変換することにより、間接的に阻害する かのいずれかであることを意味する。ウイルス疾患についてのそのような機能の 例として、吸着、複製、遺伝子発現、アセンブリ、および感染細胞からのウイル スの放出が挙げられる。ガン性細胞、ガン促進成長因子、または制御されない増 殖条件（例えば、再狭窄）についてのこのような機能の例として、生存性(viabi lity)、細胞複製、外部シグナルに対する感受性の改変（例えば、接触阻害）、 および抗ガン遺伝子タンパク質の生成の欠如またはその変異型の生成が挙げられ る。 ａ．阻害剤緩和剤 本発明の１つの局面において、遺伝子送達ビヒクルは、例えばウイルス疾患ま たは悪性疾患における病原性物質の機能を妨害し得る遺伝子の発現を指向する。 このような発現は、本質的に連続的であるか、または病状または特定の細胞型の いずれかに関連する別の物質（「同定物質」）の細胞における存在に応答するか のいずれかであり得る。さらにベクターの送達は、上記のように、ベクターの侵 入を特異的に所望の細胞型（例えば、ウイルス感染細胞または悪性細胞）に標的 化することにより制御され得る。 投与の１つの方法は白血球伝達（leukophoresis）であり、ここでは任意の一 時期に個体の約20％のPBLが取り出され、そしてインビトロで操作される。従っ て、約２×109個の細胞が処置および置換され得る。繰り返し処置も行われ得る 。あるいは骨髄が処置され得、上記のように効果を増幅させ得る。さらにベクタ ーを生成するパッケージング細胞株は被験体に直接注射され得、このことは組換 えビリオンの連続的な産生を可能とする。 １つの実施態様において、重要な病原性遺伝子転写産物（例えば、ウイルス遺 伝子産物または活性化された細胞性ガン遺伝子）に対して相補的なRNAを発現す る遺伝子送達ビヒクルが、その転写産物のタンパク質への翻訳を阻害（例えば、 HIV tatタンパク質の翻訳の阻害）することに使用され得る。このタンパク質の 発現はウイルス複製に必須であるため、遺伝子送達ビヒクルを含む細胞はHIV複 製に耐性である。 第２の実施態様において、病原性物質がパッケージングシグナルを有する１本 鎖ウイルスである場合、ウイルスパッケージングシグナル（例えば、緩和剤がHI Vに対して指向されるときはHIVパッケージングシグナル）に相補的なRNAが発現 され、その結果これらの分子とウイルスパッケージングシグナルとの会合は、レ トロウイルスの場合は、アルファウイルスRNAゲノムの正しいキャプシド形成(en capsidation)または複製に必要な、ステムループ形成またはtRNAプライマー結合 を阻害する。 第３の実施態様において、病原性遺伝子の発現を選択的に阻害し得る緩和剤、 または病原性物質により生成されるタンパク質の活性を阻害し得る緩和剤を発現 する遺伝子送達ビヒクルが導入され得る。HIVの場合、１つの例は、HIV LTRから の発現をトランス活性化する能力が欠如しており、そしてtatタンパク質が正常 に機能することを（トランスドミナントな様式で）妨害する変異体tatタンパク 質である。このような変異体はHTLV II tatタンパク質について同定されている （「XIILeu5」変異体；Wachsmanら、Science 235：674，1987を参照のこと）。 変異体トランスリプレッサーtatは、HSV-１において類似の変異体リプレッサー について示されたように複製を大いに阻害するはずである（Friedmannら、Natur e 335：452，1988）。 このような転写リプレッサータンパク質は、その発現がウイルス特異的トラン ス活性化タンパク質（上記）により刺激される、任意のウイルス特異的転写プロ モーターを用いて組織培養において選択され得る。HIVの具体的な場合において 、HIV tatタンパク質およびHIVプロモーターにより駆動されるHSVTK遺伝子を発 現する細胞株は、ACVの存在下で死滅する。しかし、もし一連の変異したtat遺伝 子がこの系に導入されるなら、適切な特性（すなわち、野生型tatの存在下でHIV プロモーターからの転写を抑制する）を有する変異体が増殖しそして選択される 。次にこの変異遺伝子は、これらの細胞から再び単離され得る。条件的致死ベク タ ー／tat系の多数のコピーを含む細胞株は、生存している細胞クローンはこれら の遺伝子内の内因性変異により引き起こされるのではないことを確認するために 、使用され得る。次に、「回収可能な(rescuable)」アルファウイルスベクター （すなわち、変異体tatタンパク質を発現し、そして細菌内での増殖および選択 のために細菌の複製起点および薬物耐性マーカーを含むベクター）を用いて、一 組のランダムに変異誘発したtat遺伝子がこれらの細胞に導入される。これによ り多数のランダム変異を評価することができ、そして所望の変異体細胞株のその 後の容易な分子クローニングが可能になる。この手順は、潜在的な抗ウイルス療 法のための種々のウイルス性転写アクチベーター／ウイルスプロモーター系にお ける変異を同定および利用するために使用され得る。 ｂ．条件的毒性緩和剤 病原性物質を阻害するための別のアプローチは、病原性条件を発現する細胞に とって毒性である緩和剤を発現することである。この場合、遺伝子送達ビヒクル からの緩和剤の発現は、非病原性細胞の破壊を避けるために、病原性物質に関連 した物質（例えば、病原性状態を同定する特異的ウイルスRNA配列）の存在によ り制限されるべきである。 この方法の１つの実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、細胞特異的応答 性ベクターから毒性遺伝子（上で議論されたように）を発現するために利用され 得る。この様式で、細胞特異的応答性ベクターを活性化し得るRNA配列を含む、 急速に複製している細胞は、遺伝子送達ビヒクルにより生成される細胞傷害性物 質により優先的に破壊される。 上記の実施態様と同様の様式で、遺伝子送達ビヒクルは、リン酸化、ホスホリ ボシル化、リボシル化、またはプリンもしくはピリミジンに基づくの薬物の他の 代謝のための遺伝子を有し得る。この遺伝子は哺乳動物細胞に等価物がない場合 があり、そしてウイルス、細菌、真菌、または原生動物のような生物由来であり 得る。この１つの例は、チオキサンチンの存在下で致死的である、E．coliのグ アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子産物である（Besnardら、Mol． Cell．Biol．7：4139-4141，1987を参照のこと）。この型の条件的致死遺伝子産 物（上記のように「プロドラッグ変換酵素」とも呼ぶ）は、多くの現在公知の プリンまたはピリミジンに基づく抗ガン薬への適用を有し、これは、有効な細胞 傷害性物質となるために、しばしば細胞内リボシル化またはリン酸化を必要とす る。この条件的致死遺伝子産物はまた、プリンまたはピリミジンのアナログでは ない非毒性薬物を細胞傷害性形態に代謝し得る（Searleら、Brit．J．Cancer 53 ：377-384，1986を参照のこと）。 一般的に哺乳動物ウイルスは、他のウイルスプロモーターエレメントからのそ の後の転写活性化に必要な「即時型（immediate early）」遺伝子を有する傾向 がある。この性質を有するRNA配列は、ウイルス感染のアルファウイルスベクタ ー細胞内シグナル（または「同定物質」）を活性化するための優れた候補である 。従って、これらのウイルス「即時型」遺伝子産物に応答するアルファウイルス 細胞特異的ベクターから発現される条件的致死遺伝子は、任意の特定のウイルス に感染された細胞を特異的に死滅させ得る。さらに、ヒトおよびインターフェロ ンプロモーターエレメントは、広範な種々の非関連ウイルスによる感染に応答し て転写的に活性化されるため、例えばインターフェロン生成に応答して、HSVTK のような条件的致死遺伝子産物を発現するベクターの導入により、種々の異なる ウイルスに感染した細胞の破壊がもたらされ得る。 本発明の別の局面において、他の場合には不活性な前駆体を病原性物質の活性 な阻害剤に活性化し得る、遺伝子産物の発現を指向する、遺伝子送達ビヒクルが 提供される。例えば、HSVTK遺伝子産物は、AZTまたはddCのような潜在的に抗ウ イルス性のヌクレオシドアナログをより効果的に代謝するために使用され得る。 HSVTK遺伝子は細胞特異的応答性ベクターの制御下で発現され得、そしてこれら の細胞型の中に導入され得る。AZT(および他のヌクレオシド抗ウイルス剤)は、 レトロウイルス逆転写酵素、従って、HIV複製を特異的に阻害するために、細胞 性機構によりヌクレオチド三リン酸の形態に代謝されなければならない(Furmam ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83：8333-8337，1986)。HSVTK(非常に広範な 基質特異性を有するヌクレオシドおよびヌクレオシドキナーゼ)の構成的発現に より、それらの生物学的に活性なヌクレオチド三リン酸形態へのこれらの薬物の より効果的な代謝がもたらされる。従って、AZTまたはddC治療は、より効果的で あり、投与量はより少なく、全身性毒性はより低く、そして増殖性感染に対する より高い効力を可能にする。そのヌクレオチド三リン酸の形態がレトロウイルス 逆転写酵素に対して選択性を示すが、細胞性ヌクレオシドおよびヌクレオチドキ ナーゼの基質特異性の結果リン酸化されないさらなるヌクレオシドアナログは、 より効果的になる。 これらの遺伝子送達ビヒクルのヒトＴ細胞およびマクロファージ／単球細胞株 への投与は、レトロウイルスベクター処理のない同じ細胞に比べて、AZTおよびd dCの存在下で、HIVに対するこれらの耐性を増加させ得る。AZTでの処理は毒性の 副作用を避けるため通常レベルより低いが、それでもHIVの蔓延を有効に阻害す る。処理の経路はブロッカーについて記載したものと同様である。 １つの実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、それ自身毒性はないが、ウ イルスまたは他の病原体に特異的なプロテアーゼのようなタンパク質によりプロ セシングまたは改変された場合、毒性の形態に変換される産物を特定する遺伝子 を有する。例えば、遺伝子送達ビヒクルは、リシンＡ鎖のプロタンパク質をコー ドする遺伝子を有し得、これはHIVプロテアーゼによるプロセシングにより毒性 になる。より詳しくは、毒素リシンまたはジフテリアＡ鎖の合成の不活性なプロ タンパク質形態は、HIVウイルスによりコードされたプロテアーゼが適切な「プ ロ」エレメントを認識し、そしてそれを切り離すように配置することにより、活 性形態に切断され得る。 別の実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、細胞内の同定物質の存在（例 えば、ウイルス遺伝子の発現）に応答して標的細胞の表面に「レポーティング産 物」を発現し得る。この表面タンパク質は、レポーティングタンパク質に対する 抗体のような細胞傷害性物質または細胞傷害性Ｔ細胞により認識され得る。同様 の様式で、このような系は、同定タンパク質を発現する特定の遺伝子を有するこ れらの細胞を簡単に同定するための検出系（下記を参照のこと）として使用され 得る。 同様に、別の実施態様において、それ自身が治療的に有益である表面タンパク 質が発現され得る。HIVの特定の場合に、HIV感染細胞において特異的なヒトCD4 タンパク質の発現は、２つの点で有益であり得る： １．可溶性CD4が遊離のウイルスを阻害することが示されているが、細胞内で のHIV envへのCD4の結合は、生存可能なウイルス粒子の形成を阻害し得る。しか し、このタンパク質は膜に結合したままであり、そして構造的に内因性CD4(患者 はこれに対して免疫学的に寛容（tolerant）であるはずである）と同一であるた め、全身性のクリアランスおよび可能な免疫原性の問題はない。 ２．CD4/HIV env複合体は細胞死の原因に関与するため、（HIV感染細胞に存在 する過剰のHIV-env存在下での）CD4のさらなる発現は、より急速な細胞死を引き 起こし、従ってウイルス拡散を阻害する。これは特に、HIV誘導性細胞傷害性に 対するそれらの相対的な屈折性の結果（これは次には、明らかにそれらの細胞表 面上のCD4の相対的な欠乏のためである）、ウイルス生成の病原性物質保有者と して働く単球およびマクロファージに適用可能であり得る。 別の実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、ベクターに感染した細胞の生 存性に必須のRNA分子を切断し、そして不活化するリボザイムを提供し得る。リ ボザイム生成を病原性状態に対応する特異的なRNA配列(例えば、HIV tat)に依存 させることにより、毒性は病原性状態に特異的になる。 ４．マーカーの発現 特異的なRNA配列に応答して細胞中で緩和剤を発現する上記の技術はまた、同 定タンパク質を発現する細胞における特定の遺伝子（例えば、特定のウイルスが 有する遺伝子）の検出を可能にし、それによりそのウイルスを有する細胞の検出 を可能にするように改変され得る。さらにこの技術は、ウイルスに関連する同定 タンパク質を有する細胞の臨床サンプルにおけるウイルス(例えば、HIV)の検出 を可能にする。 この改変は、感染細胞中における同定タンパク質の存在に応答する遺伝子送達 ビヒクル中で、その存在が容易に同定され得る産物（「マーカー産物」）をコー ドするゲノムを提供することにより達成され得る。例えば、HIVは、それが適切 な細胞に感染した場合、tatおよびrevを作る。この指示細胞は、従って、tatお よび／またはrev RNA転写産物による活性化の際に組換えアルファウイルスによ り発現されるマーカー遺伝子（例えば、アルカリホスファターゼ遺伝子、β−ガ ラクトシダーゼ遺伝子、またはルシフェラーゼ遺伝子）をコードするゲノム（例 えば、適切な組換えアルファウイルスでの感染によって）を用いて提供され得る 。 β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼの場合、細胞を基質アナロ グに曝すと、サンプルがHIV陽性の場合は色または蛍光の変化がもたらされる。 ルシフェラーゼの場合、サンプルをルシフェリンに曝すことにより、サンプルが HIV陽性の場合、発光する。β−ガラクトシダーゼのような細胞内酵素の場合、 着色細胞または蛍光細胞を計測するか、または細胞抽出物を作製して適切なアッ セイを行うことにより、ウイルスの力価を直接測定し得る。また、膜結合型のア ルカリホスファターゼの場合、蛍光性基質を用いて細胞表面上で酵素アッセイを 行うことにより、ウイルスの力価をまた測定し得る。分泌された酵素（例えば、 操作された形態のアルカリホスファターゼ）については、少量の培養上清サンプ ルを活性についてアッセイすることにより、単一培養物を経時的に連続的にモニ ターし得る。従って、異なる目的に対して異なる形態のこのマーカー系が使用さ れ得る。これらには、活性のあるウイルスの計測、または培養物中のウイルス蔓 延および種々の薬物によるこの蔓延の阻害の感度が高くかつ簡単な測定が含まれ る。 ウイルスに対する中和抗体の存在下または非存在下のいずれかで、このウイル スの存在を試験することにより、上記の系にさらなる特異性を組み込み得る。例 えば、試験する臨床サンプルの一部において、HIVに対する中和抗体が存在し得 るが、別の部分では、中和抗体が全く存在しないこともある。抗体が存在する系 においてこの試験が陰性であり、かつ抗体が全く存在しない系においてこの試験 が陽性の場合、これはHIVの存在を確認することを助ける。 インビトロアッセイの類似の系で、特定の遺伝子（例えば、ウイルス遺伝子） の存在は、細胞サンプルにおいて決定され得る。この場合、サンプルの細胞を、 適切なウイルスRNA転写産物の存在下でのみ発現されるレポーター遺伝子を有す る適切な遺伝子送達ビヒクルで感染させる。レポーター遺伝子は、サンプル細胞 に入った後、宿主細胞が適切なウイルスタンパク質を発現する場合のみ、そのレ ポーター産物（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ）を発現す る。 レポーター遺伝子は、存在する同定物質よりも多量のレポーター産物を発現し 得、これにより増幅効果が得られるため、これらのアッセイはより迅速かつ好感 度である。 ５．免疫ダウンレギュレーション 上記のように、本発明はまた、アルファウイルスに感染した標的細胞中の免疫 系の１つ以上のエレメントを抑制し得る遺伝子送達ビヒクルを提供する。簡単に 説明すると、不適切なまたは好ましくない免疫応答（例えば慢性肝炎、または骨 髄のような異種組織の移植）の特異的ダウンレギュレーションは、移植(MHC)抗 原の表面発現を抑制する免疫抑制性ウイルス遺伝子産物を用いて操作され得る。 Ｃ群アデノウイルスであるAd2およびAd5は、ウイルスのE3領域にコードされる19 kd糖タンパク質（gp19）を有する。このgp19分子は細胞の小胞体中のクラスIMHC 分子に結合し、そしてクラスIMHCの末端グリコシル化および細胞表面へのその移 動を防止する。例えば、骨髄移植の前に、ドナー骨髄細胞はgp19の発現の際に、 MHCクラスI移植抗原の表面発現を阻害するgp19コード遺伝子送達ビヒクルを用い て感染され得る。これらのドナー細胞は、移植片拒絶の危険性が低く移植され得 、そして移植患者は最小限の免疫抑制療法を必要とし得る。このことは、ほとん ど合併症もなく、ドナー−レシピエントの許容されるキメラ状態が存在するのが 可能であり得る。いわゆる自己免疫疾患の部類（ループスエリテマトーデス（lu pus erythromiatis）、多発性硬化症、慢性関節リウマチまたは慢性Ｂ型肝炎感 染を含む）を処置するのに、同様の処置が使用され得る。 別の方法は、事実上自己反応性のＴ細胞クローンに特異的な、アンチセンスメ ッセージ、リボザイムまたは他の特異的遺伝子発現阻害剤の使用を含む。これら は、自己免疫応答の原因である特定の好ましくないクローンのＴ細胞レセプター の発現をブロックする。このアンチセンス、リボザイムまたは他の遺伝子は、ウ イルスベクター送達系を用いて導入され得る。 ６．置換または増強遺伝子療法 本発明のさらに１つの局面は、治療用タンパク質を発現し得る遺伝子配列を供 給するため遺伝子送達ビヒクルを用いて、脊椎動物または昆虫の細胞を形質転換 することに関する。本発明の１つの実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、 代謝、免疫調節、ホルモン調節、酵素的または膜関連構造機能における、遺伝性 または非遺伝性の遺伝子欠陥を防止、阻害、安定化または逆転し得る治療用タン パク質を発現するように設計される。この実施態様はまた、個々の細胞を形質導 入し得る遺伝子送達ビヒクルを記載し、これにより治療用タンパク質が特定の細 胞または組織から全身的にまたは局所的に発現され得、これにより治療用タンパ ク質は、（ａ）存在しないかもしくは欠陥のある細胞性タンパク質もしくは酵素 の置換、または（ｂ）欠陥のある、発現量の少ない細胞性タンパク質もしくは酵 素の補充生成を行い得る。このような疾患は、嚢胞性線維症、パーキンソン病、 高コレステロール血症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、β−グロビン障害、血 友病ＡおよびＢ、ゴーシェ病、糖尿病および白血病を含み得る。 本発明の１つの例として、ゴーシェ病を処置するために遺伝子送達ビヒクルが 構築および利用され得る。簡単に説明すると、ゴーシェ病は酵素グルコセレブロ シダーゼの欠陥により特徴付けられる遺伝障害である。この型の治療は、機能的 細胞性酵素を提供することによる単一の遺伝子置換療法の１つの例である。この 酵素の欠陥により、体内のすべての細胞のリソゾーム中でのグルコセレブロシド の蓄積が導かれる。しかし疾患の表現型は、非常にまれな神経障害性形態のこの 疾患を除いて、マクロファージにのみ現れる。この疾患では通常、肝臓および脾 臓の肥大、ならびに骨の病変が導かれる（総説については、Science 256：794,1 992、およびThe Metabolic Basis of Inherited Disease、第６版、Scriverら、 第２巻、1677頁を参照のこと）。 遺伝子送達ビヒクルは、疾患または疾患の進行を処置、治療、予防するために 、広範な種々の治療用タンパク質を送達するのに同様に利用され得る。このよう な遺伝子の代表例は、インスリン（米国特許第4,431,740号およびBE 885196Aを 参照のこと）、ヘモグロビン（Lawnら，Cell 21:647-51，1980）、エリスロポエ チン（EPO；米国特許第4,703,008号を参照のこと）、巨核球増殖および分化因子 （MGDF）、幹細胞因子（SCF）、G-CSF（Nagataら，Nature 319:415-418，1986） 、GM-CSF、M-CSF（WO 8706954を参照のこと）,flt3リガンド（Lymanら(1993)，C ell 75:1157-1167）、EGF、酸性および塩基性のFGF、PDGF、インターロイキンお よびインターフェロンのファミリーのメンバー（上記）、神経向性因子（neurot ropic factor）（例えば、BDNF；Rosenthalら，Endocrinology 129:1289-1294， 1991，NT-3；WO 9103569を参照のこと、CNTF；WO 9104316を参照のこ と、NGF；WO 9310150を参照のこと）、凝固因子（例えば、第VIII因子および第I X因子）、t-PAのような血栓溶解因子（EP 292009、AU 8653302、およびEP 17483 5を参照のこと）、およびストレプトキナーゼ（EP 407942を参照のこと）、ヒト 成長ホルモン（JP 94030582および米国特許第4,745,069を参照のこと）および他 の動物のソマトトロピン、インテグリン、および他の細胞接着分子（例えば、IC AM-1およびELAM（上記の「異種配列」もまた参照のこと））、ならびに他の増殖 因子（例えば、IGF-IおよびIGF-II、TGF-β、骨形成タンパク質-1（Ozkaynakら ，EMBOJ．9:2085-2093，1990））、ならびに他の骨形成性タンパク質（例えば、 BMP-4、Nakaseら，J．Bone Miner．Res．9:651-659，1994）を含むがこれらに限 定されない。 ７．リンホカインおよびリンホカインレセプター 上記のように、本発明はまた、遺伝子送達ビヒクルを提供し、この遺伝子送達 ビヒクルは、他の機能の中でも、１つ以上のサイトカインまたはサイトカインレ セプターの発現を指向し得る。簡単に述べれば、ガン治療剤としてのそれら役割 に加え、サイトカインは、特定の病状を生じるネガティブな効果を有し得る。例 えば、ほとんどの休止Ｔ細胞、Ｂ細胞、大型の顆粒状リンパ球および単球は、IL -2R（レセプター）を発現しない。正常な休止細胞におけるIL-2R発現の欠如とは 対照的に、IL-2Rは、特定の白血病（ATL、毛様細胞性白血病、ホジキン病、急性 および慢性の顆粒球性白血病）、自己免疫疾患を患う患者の異常細胞によって発 現され、そして同種移植片拒絶に関連する。興味深いことに、これらの患者のほ とんどにおいて、IL-2Rの可溶性形態の血清濃度が上昇する。従って、本発明の 特定の実施態様では、可溶性形態のサイトカインレセプターの血清濃度を増大す ることによって、治療が達成され得る。例えば、IL-2Rの場合には、遺伝子送達 ビヒクルが、可溶性のIL-2RおよびIL-2Rの両方を生成するために操作され得、こ れにより高い親和性の可溶性レセプターが作られる。この構成において、血清IL -2レベルが減少し、パラクリンループを阻害する。この同じストラテジーはまた 、自己免疫疾患に対しても有効であり得る。特に、いくつかの自己免疫疾患（例 えば、慢性関節リウマチSLE）はまた、IL-2の異常発現に関係するので、レセプ ターの血清レベルを増加させることによってIL-2の作用をブロックすることもま た、 このような自己免疫疾患を処置するために利用され得る。 他の場合においても、IL-1のレベルを阻害することが有益であり得る。簡単に 述べれば、IL-1は、２つのポリペプチドIL-1およびIL-1からなり、これらは各々 多面発現効果を有する。IL-1は、微生物産物または炎症による刺激に応答して、 主として単核食細胞により合成される。IL-1Rの天然に存在するアンタゴニスト が存在し、IL-1レセプターアンタゴニスト（「IL-1Ra」）と呼ばれる。このIL-1 Rアンタゴニストは、成熟IL-1と同じ分子サイズを有し、そしてそれと構造的に 関係がある。しかし、IL-1RaのIL-1Rへの結合は、任意のレセプターのシグナル 伝達を開始しない。従って、この分子は、可溶性レセプターとは異なる作用機構 を有し、これはサイトカインと複合体化し、それゆえレセプターとの相互作用を 防げる。IL-1は、正常なホメオスタシスにおいて重要な役割を果たしていないよ うである。動物においては、IL-1レセプターに対する抗体は、内毒素および他の 炎症誘発剤による、炎症および食欲不振を弱める。 敗血症ショックの場合において、IL-1は、強力な血管拡張剤である２次化合物 を誘導する。動物においては、外部から供給されたIL-1は平均動脈圧を減少させ 、そして白血球減少症を誘発する。IL-1に対する中和抗体は、動物において、内 毒素誘発熱を下げる。IL-1Rの３日間連続的な注入治療を受けた敗血症ショック 患者の研究において、28日の死亡率は16％であり、これに対してプラシーボ注入 を受けた患者は44％であった。自己免疫疾患の場合には、IL-1活性の減少が、炎 症を減少させる。同様に、組換えレセプターを用いたIL-1活性のブロックは、さ らに、おそらく炎症を減少させることにより、動物における同種移植の生存性の 増加をもたらし得る。 これらの疾患は、遺伝子送達ビヒクルを操作して、可溶性レセプターまたはよ り詳細には、IL-1Ra分子を生成し得るさらなる例を提供する。例えば、敗血症シ ョックを受けた患者において、IL-1Ra生成ベクター粒子の単一の注射が、組換え IL-1Rの連続的注入を必要とする現行のアプローチに取って代わり得る。 サイトカイン応答性、またはより詳細には、不正確なサイトカイン応答性はま た、感染性疾患の制御または消散の不全に関与し得る。おそらく、最も良く研究 された例は、強力で、しかし逆効果のTH2優勢応答を有するマウスおよびヒトの リーシュマニア症の非回復形態である。同様に、癩腫癩が、優勢で、しかし不適 切なのTH2応答に関与する。これらの症状において、遺伝子送達ビヒクルは、固 形腫瘍の治療について提案される部位特異的アプローチとは反対に、IFNγの循 環レベルを増加させるために有用であり得る。IFNγは、TH-1 Ｔ細胞により生成 され、そしてTH-2サブタイプ増殖のネガティブレギュレーターとして機能する。 IFNγはまた、IgEへのアイソタイプスイッチングを含む、Ｂ細胞に対する多くの IL-4媒介効果を拮抗する。 IgE、肥満細胞、および好酸球は、アレルギー反応の媒介に関与する。IL-4は 、Ｔ細胞の分化に作用してTH-2の発達を刺激する一方、TH-1応答を阻害する。従 って、アルファウイルスに基づく遺伝子治療はまた、伝統的なアレルギー治療と 共に達成され得る。１つの可能性は、少量の攻撃アレルゲン（すなわち、伝統的 なアレルギー注射）と共に、IL4Rを生成する遺伝子送達ビヒクルを送達すること である。可溶性IL-4Rは、IL-4の活性を防げ、そしてそれゆえ、強力なTH-2応答 の誘導を防げる。 ８．自殺ベクター 本発明の１つのさらなる局面は、パッケージング／プロデューサー細胞株にお ける野生型アルファウイルスの蔓延を制限するための、遺伝子送達ビヒクル自殺 ベクターの使用に関する。簡略には、１つの実施態様において、遺伝子送達ビヒ クルは、ベクターの連結領域の３’配列、およびパッケージング細胞株発現ベク ターの５’アルファウイルス構造配列との間のRNA組換え事象から生じる、野生 型アルファウイルス配列に特異的な、アンチセンスまたはリボザイム配列から構 成される。アンチセンスまたはリボザイム分子は、特異的組換え配列の存在下に おいてのみ、温度安定性であり、そしてアルファウイルスパッケージング／プロ デューサー細胞株においては、その他の効果を何も有さない。あるいは、毒性分 子（例えば、本明細書中以下で開示される分子）はまた、野生型アルファウイル スの存在下のみで発現するベクターに関して発現され得る。 ９．転移性腫瘍の蔓延を妨げるための遺伝子送達ビヒクル 本発明の１つのさらなる局面は、悪性新生物の侵襲性を阻害または低減するた めの、遺伝子送達ビヒクルの使用に関する。簡略には、特に悪性疾患の程度は、 代表的には腫瘍の血管新生に関係する。腫瘍の血管新生の１つの原因は、いくつ かの腫瘍により発現される可溶性腫瘍血管新生因子（TAF）（Paweletzら、Crit ．Rev．Oncol．Hematol．9:197，1989）の生成である。本発明の１つの局面にお いて、腫瘍血管新生は、TAFに特異的なアンチセンスまたはリボザイムRNA分子を 発現するために遺伝子送達ビヒクルを利用することによって遅らされ得る。ある いは、抗血管新生因子（Mosesら、Science 248:1408，1990;Shapiroら、PNAS 84 :2238，1987）が、単独または上記のリボザイムもしくはアンチセンス配列との 組み合わせのいずれかで、腫瘍の血管新生を遅らせるかまたは阻害する目的で、 発現され得る。あるいは、遺伝子送達ビヒクルはまた、周辺組織上のTAFレセプ ターに対して特異的な抗体を発現するために用いられ得る。 10．遺伝子送達ビヒクルの投与 本発明の他の局面において、脊椎動物または昆虫に遺伝子送達ビヒクルを投与 するための方法が提供される。簡略には、遺伝子送達ビヒクルの最終的な投与様 式は、通常特定の治療適用、ベクターの効力を増加させる最良の様式、および最 も便利な投与経路に依存する。一般的に、この実施態様は、例えばの血流への直 接注入；（２）特定の組織または腫瘍への直接注入；（３）経口投与；（４）鼻 内吸入；（５）粘膜組織への直接塗付；または（６）脊椎動物もしくは昆虫への 形質導入自己細胞のエクスビボ投与により、送達されるように設計され得る遺伝 子送達ビヒクルを含む。本発明の特定の実施態様において、エクスビボ適用のた めには、細胞はまず宿主から取り出され、少なくとも部分的に精製された細胞集 団（例えば、CD34+幹細胞、Ｔ細胞など）を生じるためにポジティブおよび／ま たはネガティブに選択され、本発明の遺伝子送達ビヒクルの１つを用いて形質導 入、トランクフェクトもしくは感染され、そして同じ宿主または別の個体のいず れかに再導入され得る。 従って、治療用遺伝子送達ビヒクルは、ベクターが（ａ）正常な健常細胞を形 質導入し、かつ細胞を形質転換して、全身的または局所的に分泌される治療用タ ンパク質または物質のプロデューサーにする、（ｂ）異常または欠陥のある細胞 を形質転換して細胞を正常な機能性表現型に転換する、（ｃ）異常な細胞をそれ が破壊されるように形質転換する、および／または（ｄ）細胞を形質導入して免 疫応答を操作する、ことができるような様式で、投与され得る。 11．転写因子活性の調節 さらに別の実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、感染細胞中の転写因子 の増殖制御活性を調節するために利用され得る。簡略には、転写因子は、配列特 異的トランス活性化または抑制を介して、遺伝子発現のパターンに直接的に影響 を与える(Karin，New Biologist 21：126-131，1990)。従って、変異された転写 因子がガン遺伝子のファミリーを表すことは驚くべきことではない。遺伝子送達 ビヒクルは、例えば、その調節されない増殖が腫瘍形成性転写因子により活性化 される腫瘍細胞、ならびにホモダイマーおよびヘテロダイマーのトランス活性化 または抑制性の転写因子複合体の形成において共同して結合を促進または阻害す るタンパク質に対する制御を復帰させるために使用され得る。 細胞増殖を逆転させる１つの方法は、c-myc/Maxヘテロダイマー転写因子複合 体のトランス活性化の潜在能力を阻害することである。簡略には、核ガン遺伝子 c-mycは、細胞を増殖させることにより発現され、そしていくつかの異なる機構 （レトロウイルス挿入、増幅、および染色体転座を含む）により活性化され得る 。Maxタンパク質は静止細胞中で発現され、そしてc-mycとは独立して、単独でま たは未同定の因子とともにのいずれかで発現され、myc/Maxヘテロダイマーによ り活性化されるものと同じ遺伝子の発現を抑制するように機能する(Cole，Cell 65：715-716，1991)。 腫瘍細胞のc-mycまたはc-myc/Max増殖の阻害は、遺伝子送達ビヒクルにより制 御される標的細胞中でのMaxの過剰発現により達成され得る。Maxタンパク質はわ ずか160アミノ酸（480ヌクレオチドのRNA長に相当する）であり、そして独立し てまたは細胞の増殖制御を放出する因子に標的化された他の遺伝子および／もし くはアンチセンス／リボザイム部分とともにのいずれかで、遺伝子送達ビヒクル に容易に組み込まれる。 ホモ／ヘテロ複合体会合の調節は、転写因子活性化遺伝子発現を制御するため の別のアプローチである。例えば、トランス活性化転写因子NF-Bの細胞質から核 への輸送は、阻害剤タンパク質IBとともにヘテロダイマー複合体中にある間は防 止される。種々の物質（特定のサイトカインを含む）による誘導に際して、IBは リン酸化され、そしてNF-Bは放出され、そして核に輸送され、ここでこれはその 配列特異的トランス活性化機能を発揮し得る(BaeuerleおよびBaltimore，Scienc e 242：540-546，1988)。NF-B/IB複合体の解離は、IBのリン酸化部位を抗体でマ スクすることにより防止され得る。このアプローチは、NF-IB転写因子の核への 移行を防止することにより、NF-IB転写因子のトランス活性化活性を有効に阻害 する。標的細胞におけるIBリン酸化部位特異的抗体またはタンパク質の発現は、 アルファウイルス遺伝子移入ベクターを用いて達成され得る。本明細書に記載し たアプローチと類似のアプローチは、junタンパク質とfosタンパク質との間の会 合を阻害することにより、トランス活性化転写ヘテロダイマー因子AP-1(Turner およびTijan，Science 243：1689-1694，1989)の形成を防止するために使用され 得る。 12．組換えタンパク質の生成 本発明の別の局面において、トガウイルス（アルファウイルスを含む）遺伝子 送達ビヒクルが、真核生物細胞中（エクソビボ、インビボ、または確立された細 胞株）で１つ以上の組換えタンパク質の発現を指向するために利用され得る。本 明細書中で使用される「組換えタンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、酵 素、またはそれらのフラグメントをいう。このアプローチを使用して、治療用ま たは他の商業的実用性を有するタンパク質が、費用に関してさらに効率よく生成 され得る。さらに、真核生物細胞中で生成されたタンパク質は、原核生物細胞中 で発現されたタンパク質と比較して翻訳後により確実に修飾（例えば、グリコシ ル化、硫酸化、アセチル化など）され得る。さらに、このような系は種々の化学 的化合物（例えば、精製化学薬品または特別な化学薬品）のインビボ生成に使用 され得る。 この局面において、所望のタンパク質、酵素、または酵素経路（所望の化学薬 品の生成に必要とされ得るような）をコードする遺伝子送達ビヒクルは、適切な 真核生物細胞に形質転換、トランスフェクト、形質導入、またはそれ以外の方法 で導入される。このような系を使用して生成され得るタンパク質の代表例として 以下が挙げられるが、これらに限定されない：インスリン（U.S．4,431,740およ びBE 885196Aを参照）、ヘモグロビン（Lawnら、Cell 21:647-51，1980）、エリ スロポエチン(EPO；U.S．4,730,008を参照)、巨核球成長および分化因子（MGDF ）、幹細胞因子（SCF）、G-CSF（Nagataら、Nature 319:415-418，1986）、GM-C SF、M-CSF（WO 8706954を参照）、flt3リガンド（Lymanら（1993）Cell 75:1157 -1167）、EGF、酸性および塩基性FGF、PDGF、インターロイキンまたはインター フェロンファミリーのメンバー（前出）、神経向性因子（例えば、BDNF；Rosent halら、Endocrinology 129:1289-1294，1991，NT-3；WO 9103569を参照、CNTF； WO 9104316を参照、NGF；WO 9310150を参照）、凝固因子（例えば、第VIII因子 および第IX因子）、t-PAのような血栓崩壊因子（EP 292009、AU 8653302、およ びEP 174835を参照）およびストレプトキナーゼ（EP 407942を参照）、ヒト成長 ホルモン（JP 94030582およびU.S．4,745,069を参照）および他の動物のソマト トロピン、インテグリン、および他の細胞接着分子（例えば、ICAM-1およびELAM ）（上記の他の「異質配列」もまた参照）、ならびに他の成長因子（例えば、IG F-IおよびIGF-II、TGF-β、骨形成タンパク質-1（Ozkaynakら、EMBO J．9:2085- 2093,1990）、ならびに他の骨形態発生タンパク質（例えば、BMP-4、Nakaseら、 J．Bone Miner．Res．9:651-659，1994)）。当業者に明らかなように、一旦特徴 づけられると、任意の遺伝子が、本発明に従って遺伝子送達ビヒクル中に容易に クローニングされ、続いて適切な宿主細胞中に導入され、そして所望の遺伝子を 発現し得る。 本明細書中に記載されるベクターおよびアルファウイルスパッケージング細胞 株を使用する組換えタンパク質の生成方法が、提供される（実施例６および７を 参照）。簡潔には、組換えタンパク質をコードする遺伝子送達ビヒクル（インビ トロで転写されたRNAの形態、プラスミドDNAの形態、または組換えベクター粒子 の形態）は、アルファウイルスパッケージング細胞株（PCL）中に（トランスフ ェクションまたは感染を介して）導入され得、その結果培養細胞の小さい画分（ ≦１％）のみがベクター分子を含む。ベクターレプリコンは、ベクターRNAの増 幅後に、PCLからトランスで供給されるsPによってパッケージされる。これは、 シンドビスウイルス複製ストラテジーに従って生じる。ついで、生成された組換 えベクター粒子が培養物の残存している細胞に感染する。従って、組換えタンパ タ質発現の発生は、経時的に、組換えベクター粒子が生成され、続いてPCL培養 物中の全細胞を感染させるという結果を生じる。同様に、PCLを有するベクター 粒子の増幅は、他の適用のための大量の高力価の粒子ストックを生成するために 使用され得る。本発明のなお別の局面において、プロデューサー細胞株からの組 換えタンパク質の発現が記載される（実施例７を参照）。簡潔には、培養物への 細胞外刺激因子の添加によってベクター粒子の生成が誘導され得る全ての遺伝子 エレメント（ベクターレプリコン、および欠陥ヘルパー発現カセットを含む）を 含む細胞株が誘導される。従って、ベクターコードされる組換えタンパク質の発 現は、アルファウイルスベクター粒子プロデューサー細胞株の誘導の結果として 生じる。本発明のなおさらに別の局面において、真核生物重層ベクター開始系で 安定に形質転換された細胞株からの組換えタンパク質の発現が記載される（実施 例７を参照）。簡潔には、目的の組換えタンパク質をコードする誘導性真核生物 重層ベクター開始系カセットで安定に形質転換された細胞株が誘導される。従っ て、ベクターでコードされた組換えタンパク質の発現は、真核生物重層ベクター 開始系カセットの誘導の結果として生じる。 本明細書中に提供される開示を考慮すれば容易に理解されるように、RNAベク ターレプリコン、真核生物重層ベクター開始系、または組換えベクター粒子を利 用するタンパク質生成がまた、パッケージング細胞株またはプロデューサー細胞 株への導入以外の方法によっても達成され得る。例えば、所望のタンパク質を生 成するために、そのようなベクターが広範な種々の他の真核生物宿主細胞株（例 えば、COS、BHK，CHO、293、またはHeLa細胞）に導入、およびインビボまたはエ キスビボで細胞に直接投与され得る。 Ｊ．寄託情報 以下の物質がアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された： 上記の物質は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条 約によって、カイロンコーポレイションによってアメリカンタイプカルチャーコ レクション（ATCC）（12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland）に寄託さ れた。受託番号は、電話番号(301)881-2600でATCCから入手可能である。 これらの寄託物は、当業者に対する便宜として提供されるに過ぎず、そして米 国特許法第112条の下で寄託が必要とされることの承認ではない。これらの寄託 物の核酸配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は 、本明細書中に参考として援用され、そして本明細書中に記載の配列に誤りのあ る場合には参照されるべきである。寄託物を製造し、使用し、または販売するた めには実施許諾が必要とされ得、そしてそのような実施許諾は本明細書によって 与えられるわけではない。 以下の実施例は、本発明をより完全に説明するために含まれる。さらに、これ らの実施例は本発明の好ましい実施態様を提供し、そしてその範囲を制限するこ とを意図しない。以下の実施例において記載される多くの手順または適切な変更 手順の標準的な方法は、例えば、「Molecular Cloning」第２版（Sambrookら、C old Spring Harbor Laboratory Press，1987）および「Current Protocols in M olecular Biology」（Ausubelら編、Greene Associates/Wiley Interscience，N Y，1990）のような分子生物学のマニュアルに広範に改編されて提供される。 実施例 実施例１ SIN1の単離および特徴付け 以下には、宿主の巨大分子合成の減少した阻害を示し、そして同じウイルスの 溶解性、細胞病原性野生型株と比較して、脊椎動物細胞中での持続感染を確立し 得るポジティブ鎖RNAウイルスの同定および分子の特徴付けが記載される。例え ば、シンドビスウイルスが、アルファウイルス属の代表的な原型として使用され る。 Ａ．野生型シンドビスウイルスストックからのSIN-1の単離、プラーク精製、お よび特徴付け シンドビスウイルス改変体株の単離、分子クローニング、および特徴付けを記 載する。この株は、細胞変性性の非存在下で生産的な持続感染を確立し得るが、 野生型ウイルスと同等のウイルスのレベルを生成する。 高力価（＞108PFU/ml）野生型ストックを、低MOI（≦0.1）でシンドビスウイ ルス（CMCC #4639）でのBHK細胞（ATCC番号CCL-10）の感染によって得た。感染 を容易にするために、ウイルス接種物は、細胞に添加された場合に単層を覆うに ちようど十分な容量を含んだ。BHK細胞を維持し、そして全てのウイルス希釈を 、10％ウシ胎児血清を補充したEagle最少必須培地中で行った。細胞を37℃で５ ％CO2大気中で培養した。「ラウンディングアップ（rounding up）」で示される 大量のCPE、接着の欠失、および単層中の個々の細胞の増大した光屈折、さらに 単層の減少した全細胞密度を、感染後48時間（hpi）以内に観察した。細胞培養 液を採集し、細胞の残骸を低速遠心分離（室温にて4,000rpmで10分間）によって 除去し、そしてウイルスストックを等分して−70℃で保存した。シンドビスウイ ルスストックの力価を、以前に記載された（Straussら、Virology 74:154-168， 1976）ようなプラークアッセイによって決定した。簡潔には、ニワトリ胚線維芽 細胞（CEF）単層を、ウイルスストックの種々の希釈物で感染させ、そして単層 を0.75％のアガロースを補充した培地で重層した。24〜48hpiで、細胞溶解によ るプラークを可視化し、そして直接あるいはアガロースの重層を除去した後にク リスタルバイオレットで染色するかのいずれかによって定量した。ウイルス力価 を、プラークを正確に定量したウイルス希釈物で感染させたサンプルから決定し た。 DI粒子を富化させたシンドビスウイルスストックを、BHK細胞について高MOI継 代（≧５）を繰り返すことによって得た。BHK単層を、MOI＝５でシンドビスウイ ルスシードストックで最初に感染させた。培養培地を採集し、そして感染させた 培地の完全な細胞溶解を観察した後（通常は24hpi以内）、低速遠心分離によっ て清澄化した。次いで、感染させた培養物から採集した清澄化した培地を、新鮮 なBHK単層を感染させるために使用した。例えば、２mlのウイルス接種物を、10c mのペトリ皿中の新鮮なBHK単層に添加した。１hpi後、８mlの新鮮な培地をウイ ルス感染培養物に添加した。上記のように、培養培地を採集し、培養物の完全な 細胞溶解の観察の後に清澄化した。このプロセスを、感染後に発生するBHK単層 細胞病原性が少なくとも４日目まで遅延される速度で繰り返した。感染後の細胞 病原性の開始の遅延は、ウイルス調製物中の高レベルのDI粒子の存在を示す。 感染させた細胞培地の複数の連続的な未希釈の継代物に由来するウイルス調製 物中の高レベルのDI粒子の存在を、干渉アッセイまたはBHK感染細胞のRNA分析に よって決定した。第１の方法において、相同干渉アッセイを、DI粒子の存在の測 定として行った。簡潔には、BHK細胞を、上記のように調製した高力価（＞108PF U/ml）の野生型ストックでMOI＝10で単独で感染させた。16hpiで、ウイルス収量 を、上記のようなプラークアッセイによって決定した。この実験によるウイルス 収量は、代表的には1×109〜1×1010PFU/mlであった。別の実験群において、BHK 細胞を、野生型ストック（MOI=10）および感染させた細胞培地の複数の連続の未 希釈の継代物によって調製したウイルスストック（MOI＝５）で同時に共感染さ せた。上記のように、プラークアッセイによって16hpiでウイルス収量を決定し た。第２の実験群由来のウイルスストックが高レベルのDI粒子を含む場合、ウイ ルス収量は、第１の実験よりも少なくとも２〜３桁少ない量（例えば、≦1×107 PFU/ml）である。 ウイルス調製物中のDI粒子の存在を示すさらに決定的な方法として、16hpiでB HK感染細胞中のウイルス特異的RNAを分析した。簡潔には、BHK細胞を、高力価（ ＞108PFU/ml）の野生型ストック、またはDI粒子を含有するウイルスストックで 感染（MOI＝10）させた。偽感染コントロールおよび感染細胞をダクチノマイシ ン（１mg/ml）で処理し、そして１〜16hpiまで[3H]ウリジン（20mCi/ml）で標識 した。RNAを、感染させた細胞およびコントロール細胞から、製造業者（Tel-Tes t、Inc.，Friendswood，Texas）に記載されるようにRNAzol Bを使用することに よって単離した。あるいは、Tri-Reagent（Molecular Research Center，Inc.， Cincinnati，Ohio）を用いるか、またはWeissら（J．Virol．14:1189-1198,1974 ）に記載されるように0.5％のTritonおよび0.5％の再結晶ナフタレンジスルホン 酸を含有する緩衝液(0.05M Tris、0.1M NaCl、0.001M EDTA，pH7.5）中で溶解さ せた細胞のフェノール抽出を使用する従来の方法によって、RNAを単離 した。RNAをグリオキサールで変性させ、そして0.01Mのリン酸ナトリウム緩衝液 （pH7.0）中で調製した1.1％の水平なアガロースゲルを通して５V/cmで電気泳動 し得る（McMasterおよびCarmichael，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74:4835-483 8，1977）。あるいは、RNAを、ホルムアルデヒドゲルを通して電気泳動し得る。 電気泳動後、ゲル乾燥機を用いて減圧下でゲルから全ての水分を除去し、そして 乾燥させたゲルを蛍光間接撮影法で処理しそしてフィルムに曝した。ゲノムおよ びサブゲノム種に対応する２つのRNA（それぞれ42Sおよび26S）を、野生型ウイ ルスストックで感染させたBHK細胞由来のサンプル中で観察した。対照的に、標 準的な42Sおよび26SウイルスRNAとは異なる多数のRNA種が、DI粒子を含有するウ イルスストックで感染させたBHK細胞由来のサンプル中で観察された。DI RNAに 対応する複数のRNAが、野生型ウイルス由来の26S RNA種よりも小さい分子量で優 先的に移動した。DI粒子を含有するウイルスストックで感染させたBHK細胞にお いて観察される42Sおよび26S種に加えて、複数のRNAの一例が、Weissら（J．Vir ol．33:463-473，1980）の図３レーン３に見られ得る。 減少された細胞病原性を有する持続感染生成性を確立し得るシンドビスウイル ス改変体株を単離し、そしてDI粒子を富化されたウイルスストックから分子クロ ーニングした。BHK細胞をDI粒子を富化させたシンドビスウイルスストックで高 多重度（MOI＝５）で感染させた。細胞病原性は、野生型ウイルスでのBHK細胞の 感染と比較して遅く生じるが、ほとんどの細胞は最終的に溶解し、そしてプレー トから分離した。細胞の残骸および非接着性細胞を、培地の交換によって２日お きに取り除いた。最初の感染後２週間以内に、別個の異なるコロニーが観察され た。これらのコロニーを成長させ、そしてこれらは、未感染のBHK細胞コントロ ールと比較してCPEの形態学的証拠を示さなかった。３〜４週間以内で、細胞コ ロニーは大きくなり、そして裸眼で識別可能であった。コロニーをクローニング リングで単離し、そして細胞を３mMのEDTAまたはトリプシンのいずれかで分散さ せた。各コロニー由来の分散された細胞を、希釈せずに再度プレーティングした 。その後、コンフルエントに到達したとき（一般に、４日以内）に細胞を1：10 希釈でサブクローニングした。BHK（SIN-1）と命名した細胞のアリコートを、長 期間の貯蔵のために液体窒素中での５回の継代後に低温チューブ中に調製した。 BH K（SIN-1）細胞は、増殖速度に関しておよび形態学的に、元の未感染のBHK細胞 から区別できなかった。 Ｂ．SIN-1 の分子クローニング SIN-1の実質的に低減された細胞病原性の発達に関連する、シンドビスゲノム の変異（単数または複数）を特徴づけるために、SIN-1ビリオンからゲノムRNAを 単離し、逆転写させ、そして非構造タンパク質遺伝子を含む得られたcDNAを、以 下にさらに完全に記載するように配列決定した。 簡潔には、SIN-1ウイルスを、RNAの単離に使用するストックの調製の前に３回 プラーク精製した。BHK（SIN-1）細胞を上記のように増殖させ、培養液を採集し 、そして種々の希釈を使用して初代ニワトリ胚線維芽細胞単層（CEF、３％ウシ 胎児血清を補充した最少必須培地中で増殖させた）を感染させた。感染後、0.5 ％の不活性な寒天を含有する培地を単層に添加した。さらに、DEAE-デキストラ ン（100μg/mL）を、寒天重層培地中に含ませてSIN-1プラークの大きさを拡大し 得る。個々の分離したプラークを、BHK（SIN-1）培養液の適切に希釈した接種物 を用いて感染させたプレート中での30℃で３日間のインキュベーション後に観察 した。３回の精製後、クローニングしたSIN-1ウイルスを、MOI＝0.1で感染させ たCEF細胞中に、30℃で１回継代した。プラーク精製したSIN-1ウイルス調製物を 、上記のような、干渉アッセイおよびBHK感染細胞中でのRNA分析によってDI粒子 を含まないことを決定した。 BHK細胞を、プラーク精製したSIN-1ストックで感染させ（MOI＝10）、持続性 を確立するこの野生型シンドビスウイルス改変体株の能力を決定した。上記のよ うに、野生型シンドビスウイルスを有するBHK細胞中での持続感染の確立は、ウ イルス調製物中のDI粒子の存在、および僅かな生存細胞の増殖を可能にするため の相当な時間を必要とする。対照的に、持続感染は、DI粒子がウイルス接種物中 に存在するかどうかに関わらず、SIN-1改変体で37℃で感染させたBHK細胞中で容 易に確立された。SIN-1での感染後６日目に、BHK細胞は、野生型シンドビスウイ ルスでの重感染に完全に耐性であり、このことは、持続感染の確立を示す。しか し、これらの細胞は、異種ウイルスVSVによる感染に敏感であり、このことは、 インターフェロンがSIN-1持続感染の確立に関与しないことを示す。 CEF細胞を、プラーク精製したSIN-1ストックで感染させ（MOI＝10）、RNAの単 離のために高力価のウイルスストックを生成した。90mlの培養液（2×1010PFU/m l）を、Sorvall GSAローター中で2,500rpmで５分間の遠心分離によって清澄化し た。SIN-1ウイルスを、SW27.1ローター中で２時間、24,000rpm、４℃での遠心分 離によって清澄化した培養液からペレット化した。次いで、ウイルスペレットを ３mlの培養培地中に再懸濁し、ピペッティングを繰り返すことによってホモジナ イズし、そして25〜40％（w/w）のスクロース勾配の上に重層した。次いでこれ を、SW27.1ローター中で４時間、24,000rpmで４℃で遠心分離した。ウイルスの バンドを白熱光の照射で可視化し、そして22ゲージ針／シリンジで採集した。RN AをProteinase K（Boehringer Mannheim，Indianapolis，Indiana）消化（56℃ 、１時間）、続いてH2O-飽和フェノール：クロロホルム（1：1v/v、pH7.0）の等 容量での抽出、続く２容量のエタノールおよび0.3M酢酸ナトリウム（pH5.2）で の沈澱によってさらに精製した。 あるいは、SIN-1ウイルスを、感染させたBHK細胞培養培地のポリエチレングリ コール沈澱（Straussら、Virology 133:154-168，1976)、あるいはスクロースク ッションを通してピペッティングすること（Poloら、J．Virol．62:2124-2133,1 988）によってさらに精製し得る。 ２回の第１鎖cDNAの合成を、モロニーマウス白血病ウイルスまたはSuperScrip t II逆転写酵素（Gibco-BRL，Gaithersburg，Maryland）を使用して製造者によ って推奨される条件に従って、精製したウイルスRNAを用いて行った。６回の別 々の反応を、以下に示すポジティブ鎖に相補的なシンドビスウイルス特異的プラ イマー（Ｒで示されるプライマー）を用いて行った。Ｒで示される全てのプライ マーは、クローニングを容易にするために、第１鎖の合成反応の前にポリヌクレ オチドキナーゼ（New England Biolabs）を用いてそれらの5'末端でリン酸化さ れていた。 上記のcDNAテンプレート由来の第２鎖の合成を、製造者により推奨される条件 に従ってDNAポリメラーゼIのKlenowフラグメント(New England Biolabs，Beverl y，MA)を用いて、６つの別々の反応において達成した。ネガティブ鎖に相補的な シンドビスウイルス特異的プライマー（上記でＦで示されるプライマー）を使用 した。二本鎖DNA産物を、全長のシンドビスウイルスゲノムを含有するプラスミ ドToto1101（Riceら、J．Virol，61:3809-3819，1987）中の対応する領域と段階 的に置換した。例えば、T7/1F-1465R産物をSacIおよびEco47IIIで消化し、SacI/ Eco47III消化しそしてCIAP処理したToto1101プラスミド（これは、１％アガロー ス／TAE（50×／リットル：242g Tris base／57.1ml氷酢酸／100ml 0.5M EDTA p H8.0）電気泳動およびGENECLEAN IIによりSacI/Eco47III小フラグメント（SP6 プロモーター、シンドビスウイルスnt 1-1407）から精製した）中に挿入した。 次いで、この構築物をEco47IIIおよびAvrII（それぞれ、シンドビスウイルスnt 番号1407および4281）で消化し、CIAPで処理し、続いてEco47IIIおよびAvrIIで 消化した1003F−4303R産物から単離した3300bpのフラグメントを挿入した。完全 に組み立てたクローンを、pRSIN-1g（ｇは、全長のゲノムクローンを意味する） と命名し、これは11,703bpのウイルスゲノム全体を含む。先の表に列挙したプラ イマーのサブセットは、SIN-1ゲノム中の重複する二本鎖DNA反応産物を生成した 。例えば、4051F/8115R産物中の配列は、1680F/8115R産物中に存在する。これら の重複する産物を、SIN-1ゲノムクローンのための別の構築物として提供する。 すなわち一般に、cDNAクローニングの効率は所望のフラグメントの長さと反比例 する。 上記の方法によって得られなかったウイルスゲノムの一部をクローニングする ために、SIN-1 RNAウイルスゲノムを逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）に よってクローニングした。第１鎖の合成を上記のように達成した。上記のプライ マー対を使用するシンドビスcDNAのPCR増幅を、Klentaql酵素およびBarnes（Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 91:2216-2220，1994）に記載されるような反応条件を 使用して、別々の反応として行った。あるいは、サーマラーゼ(Thermalase)熱安 定性DNAポリメラーゼ（Amresco Inc.，Solon，OH）を、供給者によって提供され る1.5mM MgCl2を含有する緩衝液を使用してKlentaq1酵素について置換した。あ るいは、VentR熱安定性DNAポリメラーゼ（New England Biolabs，Beverly，MA） を増幅反応に使用した。さらに、反応は、５％DMSOおよび「HOT START WAX」ビ ーズ（Perkin-Elmer）を含んだ。使用したPCR増幅プロトコールを以下に示す（7 2℃での伸長インキュベーション期間を、テンプレートDNAの１kbあたり１分に調 節した）： あるいは、全長のSIN-1 RNAゲノムのクローニングを、以前に記載された（Dub enskyら、J．Virol．70:508-519，1996）方法に類似の方法で行い得る。簡潔に は、第１鎖cDNAの合成を、ランダムヘキサマープライマー（50ng/mlの反応濃度 ）（Invitrogen，San Diego，California）および配列が以下の表に示されるプ ライマー4Bの混合物を用いて達成する。次いで、ゲノム長シンドビスウイルスSI N-1改変体cDNAを、PCRによって増幅する。重複するプライマーの６つの対を使用 する６つの異なるセグメントが、全ゲノムをクローニングするために十分である 。ウイルス相補配列に加えて、SIN-1の5'末端正方向プライマーは、細菌のSP6RN Aポリメラーゼプロモーターおよびその5'末端に連結されたApaI制限エンドヌク レアーゼ認識配列に対応する19ヌクレオチド配列を含む。細菌のSP6 RNAポリメ ラーゼは維持されて、その結果、インビトロの転写は、真正のシンドビスウイル スの5'末端に対応するＡリボヌクレオチドに連結された単一の非ウイルス性Ｇリ ボヌクレオチドのみの封入を生じる。ApaI認識配列の封入は、プラスミドベクタ ーpKSII+（Stratagene，La Jolla，California）ポリリンカー配列中へのPCRア ンプリコンの挿入を容易にする。５ヌクレオチドの「緩衝配列」伸長がまた、効 率的な酵素消化を容易にするためにApaI認識配列の上流に連結される。SP6-5'SI N-1正方向プライマーおよび全体のSIN-1ゲノムの増幅に必要な全てのプライマー 対の配列が、以下の表に示される（本明細書中以後利用される「nt」および「nt s」が、それぞれ「ヌクレオチド（単数）」および「ヌクレオチド（複数）」を 意味することに注意」）。参考配列（GenBank登録番号J02363、遺伝子 座：SINCG）は、Straussら、Virology 133:92-110，1984による。 上記のプライマー対を用いるシンドビスcDNAのPCR増幅を、ThermalaseまたはV entRDNAポリメラーゼ（上記）、上記のような反応条件およびPCR増幅条件を使用 して別々の反応として行う。 増幅産物間の配列重複の領域は、PCRアンプリコン内の単一の酵素認識部位に 対応する。PCR産物を精製し（QIAquick PCR精製キット、Qiagen，Chatsworth，C alifornia）、PKSII+ベクターのApaIおよびXbaI部位の間に段階的に挿入した。 完全に組み立てたクローンをpKSRSIN-1g（ｇは全長のゲノムクローンを意味する ）と命名し、そしてこれは、11,703bpのウイルスゲノム全体を含む。 Ｃ．SIN-1 表現型の配列 pRSIN-1gクローンのSIN-1特異的ヌクレオチド配列を、ジデオキシ鎖終結法に よって決定した。ウイルス配列の8,000bpの配列比較は、本明細書中に記載のSIN -1クローンとGenBank（GenBank受託番号第102363号、遺伝子座：SINCG）におい て提供されるシンドビスウイルス（HRsp株）配列との間の複数の差異を明らかに した。SIN-1（図６）、SINCG（図７）、およびToto1101（図８）の間の配列にお ける差異を以下に示す。 *この変異は１つのcDNAクローンにおいて見出された。これはSIN-1ウイルスRNA が配列決定された場合には検出されなかった。これはRNA集団におけるマイナー な種を表しているようである。 配列変化が本明細書中に記載のクローンに独特である（そしてクローン化人工 産物の結果ではない）という証明を、上記のRT-PCRによりSIN-1ビリオンRNAを増 幅し、問題のヌクレオチドを含む配列をRT-PCRアンプリコン産物の直接の配列決 定によって確立し、そしてその配列を対応するSIN-1配列と比較することによっ て決定した。 Ｄ．分子クローンを用いるSIN-1表現型の特徴付けおよび遺伝子マッピング： SIN-1ゲノムの種々の領域によって、存続性の確立のための表現型の位置をマ ッピングするために、Toto1101プラスミドの対応する野生型シンドビスウイルス 領域を置換した（Riceら，J．Virol．61:3809-3819，1987）。以下の表に例示す るように、種々のSIN nsP遺伝子によって、pRSIN-1gから精製した制限酵素フラ グメントを使用して、Toto1101野生型シンドビスウイルスバックグラウンドを置 換した。非構造遺伝子コード領域の座標を以下の表に提供する： 種々のSIN-1．Toto、およびキメラSIN-1/Totoクローン、pRSIN-1g、Toto、pRS IN-1nsP1、pRSIN-1nsP2、pRSIN-1nsP2-N、pRSIN-1nsP2-C、pRSIN-1nsP3、pRSIN- 1nsP4、およびpRSIN-1nsP1-4を、Xho Iでの消化によって直線化した。これによ って、シンドビスウイルス3'末端（ウイルスnt．11703）に続くポリdA:dTトラク トに直ちに隣接し、そしてその21ヌクレオチド下流にあるcDNAクローン中の単一 のカットが作製された。直線化クローンをGENECLEAN II（BIO 101，La Jolla，C alifornia）で精製し、そして0.5μg/μlの濃度に調整した。直線化クローンの 転写を、以下の反応条件に従って、40℃にて90分間、インビトロで実施した：２ μl DNA/4.25μl H2O）；10μl 2.5mM NTP（UTP、ATP，GTP、CTP）；1.25μl 20 mM Me7G(5')ppp(5')Gキャップアナログ；1.25μl 100mM DTT；５μl ５×転写緩 衝液（Promega，Madison Wisconsin）；0.5μl RNasin（Promega）；0.25μl 10 μg/μlウシ血清アルブミン；および0.5μl T7 RNAポリメラーゼ（Promega）。 インビトロ転写反応産物をDNase I（Promega）で消化し、連続的なフェノール:C HCl3およびエーテル抽出、ならびに続くエタノール沈澱によって精製した。ある いは、インビトロ転写反応産物を、トランスフェクションのために直接使用し得 る。インビトロ転写反応産物または精製RNAを、市販の陽イオン性脂質化合物（L IPOFECTIN，GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD）と複合体化し、そして75％のコンフ ルエンシーで60mmペトリ皿中に維持されたBaby Hamster Kidney-21（BHK-21）細 胞に適用した。あるいは、BHK細胞をインビトロ転写反応産物または精製RNAと共 に、以前に記載されたように（Liljestrom，Bio/Technology 9:1356-1361，1991 ）正確にエレクトロポレートした。トランスフェクトした細胞を37℃でインキュ ベートした。トランスフェクト後48時間にて培養培地を収集し、そして各ウイル スの力価を、上記のようにプラークアッセイによって決定した。これらのインビ トロ転写反応に由来する、力価測定したウイルスストックを、以下の表に示すよ うに命名した。 SIN-1存続性表現型をマッピングするために、８×105のBHK細胞を上記で調製 したウイルスストックの各々で感染させた（MOI＝５）。感染後３日にて、培養 の生存性をトリパンブルー色素排除によって決定した。この実験の結果（以下に 示す）は、存続性非細胞破壊感染を確立するSIN-1表現型が、非構造遺伝子をマ ッピングし、そして特にnsP2遺伝子をマッピングすることを実証した。偽感染培 養における細胞の数は、これらの細胞が定常期に達するまでの継続した増殖を表 す。３dpiにて、SIN-1nsP1、SIN-1nsP3、SIN-1nsP3-4、およびSIN-1nsP4に感染 した細胞は全て死滅した。SIN-1nsP2およびSIN-1nsP4での感染を生き抜いた細胞 は増殖し続け、そしてこれをシンドビスウイルスに特異的な抗体での染色に基づ いて持続的に感染させた。 上記のように、非細胞破壊存続性感染を確立する観察されたSIN-1表現型は、s Pとは反対にnsPをマッピングする。この結論は、TotoまたはSIN-1nsP1-4ウイル スストックに感染した培養間での細胞生存レベルの比較によって明確に実証され た。TotoおよびSIN-1nsP1-4ウイルスの両方が、野生型sPを含有する；しかし、S IN-1クローンに由来するnsPを含有するウイルス（SIN-1nsP1-4）に感染したそれ らの培養においてのみ、細胞生存が観察された。これらの実験において、細胞生 存はシンドビスウイルスsPの供給源に依存しない。重要なことに、SIN-1表現型 は、さらにnsP2にマッピングされた。細胞生存のレベルは、SIN-1nsP1-4またはS IN-1nsP2ウイルスに感染した培養間で匹敵していた。さらに、SIN-1nsP2遺伝子 中のヌクレオチド3855におけるC→T転位は、SIN-1ウイルス感染細胞における存 続性感染の確立の特徴的な表現型を担っている。キメラウイルスSIN-1nsP2-C感 染細胞中で産生されたnsP2タンパク質における単一のプロリンからセリンの変化 が、感染細胞の全てを死滅させたウイルス由来の野生型シンドビスウイルス（To to 1101）を、感染細胞の多くが生存しそしてウイルスを産生し続けるのを可能 にするウイルスに転換するのに必要な全てであった。Totoバックグラウンドへの SIN-1 nsP1、nsP3、またはnsP4遺伝子の挿入に由来するキメラウイルスの表現型 は、野生型から区別不可能であり、そして完全な溶解が、これらのウイルスに感 染した培養において観察された。 SIN-1 nsPにおけるアミノ酸変化の、BHK細胞における増殖性感染のレベルに対 する可能な効果を、種々のSIN-1、野生型（Toto）、またはSIN-1/Totoキメラ株 で接種したBHK細胞における、一定期間にわたるウイルス収量を比較することに よって決定した。簡潔には、BHK細胞を、SIN-1（上記のプラーク精製したストッ ク）、Toto、SIN-1nsP1-4、またはSIN-1nsP2ウイルスで感染させ（MOI＝20）、 そして培養液を感染後３、６、９、および12時間にて収集した。次いで、培養液 中のウイルスの力価を、上記のようにプラークアッセイによって決定した。この 研究の結果（図２に示す）は、等価なレベルのウイルスが、野生型またはSIN-1 株に感染したBHK細胞において産生されたことを実証した。12hpiの時点における 実際のウイルス力価を、以下の表に示す。BHK細胞の半分より多くが、野生株と 等価なウイルス産生のレベルと組み合わせたSIN-1ウイルス（およびSIN-1nsP1-4 、またはSIN-1 nsP2を含有するキメラウイルス）での感染を生き抜いた。 SIN-1nsPにおけるアミノ酸変化の、ウイルス特異的RNA合成のレベルに対する 可能な効果を、種々のSIN-1、野生型（Toto）、またはSIN-1/Totoキメラ株で接 種したBHK細胞における、一定期間にわたる[3H]-ウリジン取り込みのレベルを比 較することによって決定した。BHK細胞（３×105細胞/35mm皿）を、本明細書中 に記載の条件に従って37℃で増殖させた。細胞を、SIN-1、Toto1101、SIN-1nsP1 -4、またはSIN-1nsP2ウイルスで感染させた（MOI＝20）。感染後30分にて、培養 培地を１μg/mlアクチノマイシンＤに調整した。さらなる30分のインキュベーシ ョンの後、培養培地を10μCi/ml[3H]-ウリジンに調整した。３、６、９、および 12hpiにて、処理した細胞をPBSで洗浄し、そして200μlのTTE緩衝液（0.2％ Tri ton X-100、10mM Tris-HCl（pH8.0）、１mM EDTA）の添加によって溶解させた。 このRNAを、200μlの25％トリクロロ酢酸（TCA）溶液の添加によって４℃で沈澱 させた。このRNAを、14,000rpmで５分間の微小遠心分離(microcentrifugation) によってペレット化し、５％ TCAで１回リンスし、そして50mM NaOH/0.1％ SDS からなる溶液に55℃で溶解させた。溶解したRNAを含有する溶液を、シンチレー ションバイアルに移し、そして取り込まれた[3H]-ウリジンのレベルを、EcoLume （ICN，Irvine，CA）シンチレーション液を使用して決定した。この研究の結果 （図３に示す）は、ウイルス特異的RNAのレベルが、SIN-1感染BHK細胞において 野生型と比較して劇的に低いことを実証した。この低レベルのウイルス特異的RN A合成の表現型は、SIN-1またはSIN-1nsP1-4株に感染したBHK細胞において産生さ れる、野生型と比較して同等に低いレベルのRNAによって示されるように、nsPに マッピングする。 感染したBHK細胞におけるウイルス特異的RNA合成もまた、SIN-1株、Toto株、 およびSIN-1/Totoキメラ株の全てを使用して決定した。９hpiでの野生型感染（T oto）と比較しての[3H]-ウリジン取り込みのレベルを、図４に示し、そして以下 の表に提供する。従って、BHK細胞はSIN-1ウイルス（およびSIN-1 nsPl-4、またはSIN-1 nsP2を含 有するキメラウイルス）での感染を生き抜き、野生型株と同等のSIN-1ウイルス レベルがBHK細胞において産生され、そして合成されたウイルス特異的RNAのレベ ルは、野生型ウイルスと比較して10倍低かった。 SIN-1 nsPにおけるアミノ酸変化の、宿主細胞タンパク質合成の阻害のレベル に対する可能な効果を、種々のSIN-1、野生型（Toto）、またはSIN-1/Totoキメ ラ株で接種したBHK細胞における一定期間にわたるタンパク質合成のレベルを、 非感染細胞に対して比較することによって決定した。簡潔には、２×105BHK細胞 で播種した35mm皿を、PBS/１％ウシ胎児血清からなる緩衝液中0.5mlウイルス接 種材料中の種々のシンドビスウイルス株で感染させた（MOI＝20）。プレートを ４℃で１時間、穏やかに振盪させながらインキュベートした。接種材料を、上記 のように、10％ウシ胎児血清を含有する２mlの培地（前記）で置換し、そして皿 をCO2インキュベーター中に37℃で配置した。５、８、および11時間後にて、培 地を２％のウシ胎児血清を有する２mlのメチオニン欠乏MEM（Met-）で置換し、 そして30分間インキュベートした。次いで培地を２％ウシ胎児血清および10μCi /mlの[35S]メチオニンを含有する１mlのMEM（Met-）で置換した。37℃で30分間 のインキュベーションに続いて、10％のウシ胎児血清を含有する１mlの培地を各 ウェルに添加し、そして皿を37℃でさらに30分間インキュベートした。この希釈 は、 タンパク質への放射活性標識のさらなる取り込みを阻害するのに十分であり、そ してポリアクリルアミドゲル中で検出される遊離の[35S]メチオニンのバックグ ラウンドを有意に減少させる。次いで、培地をウェルから取り出した。細胞をPB Sで３回洗浄し、皿からPBSへと削ぎ落とし、遠心分離によってペレット化し、そ して25μlのローディング緩衝液（0.06M Tris-HCl（pH6.7）、２％SDS、５％β- メルカプトエタノール、５％グリセロール、0.05％ブロモフェノールブルー）中 に溶解させた。サンプルの５分の１をゲル上で分析した。電気泳動の後、ゲルを CoomassieブリリアントブルーRで染色し、乾燥させ、そしてオートラジオグラフ した。宿主細胞タンパク質合成の阻害の速度を、宿主タンパク質のみを含有する ゲルの切片における放射活性の量を定量化することによって比較した。この研究 の結果（図５に示す）は、宿主細胞タンパク質合成の阻害のレベルが、SIN-1ウ イルス感染細胞において、野生型ウイルス感染細胞と比較して有意に低く、特に 、より早期である感染後６時間および９時間の時点において低いことを実証する 。 要約すると、BHK細胞はSIN-1感染を生き抜き、野生型株と等価なウイルスレベ ルがBHK細胞において産生され、合成されるウイルス特異的RNAのレベルは野生型 ウイルスよりも10倍低く、そしてSIN-1ウイルス感染細胞における宿主細胞タン パク質合成の阻害のレベルは、野生型ウイルス感染細胞と比較して有意に低い。 本明細書中に記載のSIN-1ウイルスの表現型は、ウイルスnsP遺伝子にマッピング する。 実施例２ 宿主巨大分子合成の減少した阻害を示す ポジティブ鎖RNAウイルスの単離および特徴付け 宿主細胞巨大分子合成の減少した阻害、遅延した阻害、または阻害なしの所望 の表現型を示すウイルス改変体の誘導は、野生型ウイルスの配列と異なる配列の 生成、特徴付け、および単離に依存する。しかし、実施例１を除いて、このウイ ルスに基づく巨大分子合成の阻害の改変、または溶解性ではなく存続性の感染を 導くウイルスの生成の改変を生じるコードまたは非コードウイルス配列変化を選 択または同定するための、明白な方法または以前に開示された方法は全く存在し ない。この実施例は、特異的な方法を提供し、そしてこれらの障害を克服するこ とを可能にする。 Ａ．ウイルス改変体の生物学的選択 宿主巨大分子合成の減少した阻害、遅延した阻害、または阻害なしを生じるか 、あるいは存続性感染を確立するウイルス改変体の生物学的誘導を、細胞内での 自然突然変異を可能にするか、あるいは最初に所望のウイルスストックを物理的 、化学的、または他の人工的な変異誘発に供した後に感受性細胞を感染させ、そ して変異したウイルスを有するこれらの細胞集団について連続的に富化すること により、実施し得る。事前の変異誘発は、必要ではないが、適切な変異の発生を 促進することが可能である。選択は、所望の改変体に感染した細胞が、野生型ウ イルス感染細胞よりも有意に長い期間生存する能力に基づく。以下の実施例は、 例としてシンドビスウイルスを使用して、詳細な方法を提供する；しかし、詳細 な説明において記載したように、他のウイルスが容易に代用される。 具体的には、化学的変異誘発の場合には、109pfu/ml以上の力価を有するシン ドビスウイルスストック懸濁物を、最終濃度100μg/mlのニトロソグアニジンで 処理する。室温にて15分の後、ニトロソグアニジンを４℃での透析によって除去 し、そして変異誘発されたストックを引き続いて感染に使用する。フラットスト ック培養中で増殖させた約５×106の所望のタイプの細胞（例えばBHK-21）を、 全ての細胞が感染することを保証するために、約５の感染多重度（M.O.I.）で変 異誘発したウイルスで感染させる。感染後12、24、36、および48時間にて、細胞 単層を新たな培地で２回洗浄して死滅細胞を除去し、そして50％の新たな培地と 50％の馴化培地との混合物からなる培地に置換する。感染後の所望の時間（例え ば72時間）の後、残存する細胞を穏やかにトリプシン消化してそれらを培養皿か ら脱着させ、そして細胞に付随する細胞外ウイルスを剥ぎ落とし、次いでこれを 分画遠心分離によって細胞から分離する。次いで、残存する細胞を、セミコンフ ルエントな非感染細胞単層を含有する組織培養皿中に、103の非感染細胞毎に１ つの感染細胞の比で直接再播種する。さらなる回数の選択を、増幅のために非感 染細胞上に播種し、続いて上記の洗浄および採取工程を行うことによって実施し た。あるいは、初期感染を、野生型ウイルスストックを使用して低M.O.I.で実施 し、細胞内での複製の間の自然突然変異を可能にし得る。このアプローチを使用 して、変異体ウイルスの異種集団を、感染細胞によって産生する。トリプシン消 化後に回収された感染細胞の集団が、有意な数の非生存細胞または重大な損傷を 受けた細胞を含むような例においては、17mM Tris（pH7.65、HClによる）中の0. 75％NH4Clでの簡単な処理（室温で５分間）、またはPercollTMによる遠心分離が 、非感染細胞単層上への再播種に先立っての残存する死滅細胞または損傷細胞の 除去に含まれる。最小の連続する２回の選択の後、所望の表現型を示すウイルス 改変体を、限界希釈またはプラーク精製によって単離し、そして実施例１に記載 のようにcDNAクローニングに供する。改変体表現型を担う特異的配列の単離およ び特徴付けを、実施例において概説するように、ゲノムクローンまたは発現ベク ター内をcDNAの規定の領域で置換し、そしてそれに伴う表現型変化を試験するこ とによって達成する。 Ｂ．ウイルス改変体の遺伝的選択 関連するアプローチにおいて、自然変異またはランダム変異誘発を、ウイルス ストック上ではなく、むしろインビトロまたはインビボで感染性ウイルスRNAへ と転写され得るウイルスのクローン化されたゲノムcDNAを使用して、実行した。 例えば、事前の変異誘発において、プラスミドpRSINg（バクテリオファージSP6 プロモーター（Dubenskyら，J．Virol．70:508-519，1996）に機能的に連結した 全長のゲノムシンドビスcDNAを含有する）を、コンピテントなE．coli XL1-Red ミューテーター細胞中に形質転換し、そしてアンピシリンプレート上にプレーテ ィングしてコロニーを得る。少なくとも200のコロニーをランダムに選択し、プ ールし、そして一晩の増殖のためにアンピシリンを含有する10mlのブロス培養物 中に接種する。プラスミドDNAを培養から調製し、種々の変異を有するpRSINgの 異種集団を得る。DNAをXba Iを用いて直線化し、そして以前に記載されたように SP6ポリメラーゼを使用してインビトロで転写した（Riceら，J．Virol．61:3809 -3819，1987）。RNA転写物を、シンドウイルス感染サイクルの開始のために、エ レクトロポレーション（LiljestromおよびGaroff，Bio/Technology 9:1356-1361 ， 1991）によって所望の細胞タイプ（例えば、BHK細胞）中へ引き続きトランスフ ェクトした。あるいは、変異誘発されていないテンプレートからインビトロ転写 されたRNAもまた、トランスフェクトし得る。存続性感染を確立するか、あるい は宿主巨大分子合成の減少した阻害、遅延した阻害、または阻害なしを示すウイ ルス変異体の選択を、上記のように実施する。所望の表現型を有する選択された ウイルス改変体を、限界希釈またはプラーク精製によって単離し、cDNAクローニ ングに供し、そして改変体表現型を担う配列を上記のように単離および特徴付け する。 Ｃ．ウイルス由来ベクターを使用する改変体の遺伝子選択 １．免疫原性タンパク質を発現するベクター 別のアプローチにおいて、自然細胞内変異またはランダム変異誘発を、ウイル スに基づく発現ベクターのウイルス由来配列上で実施する。これらの配列は、非 コード領域および調節領域、ならびに非構造タンパク質コード領域を含む。特定 の例においては、構造タンパク質コード配列もまた含まれる。このようなランダ ム変異誘発または自然細胞内変異を、インビトロまたはインビボでRNAへと転写 され得るウイルス由来ベクターのクローン化cDNAと共に、本発明に記載される任 意の技術を使用して実施し得る。例えば、複製にコンピテントなシンドビスウイ ルス発現ベクターを使用して、感染細胞に添加された特異的抗体によって結合さ れ得る免疫原性細胞表面タンパク質または他のペプチドを発現させ得る。機能性 ベクターを有する細胞を、ベクターにコードされる異種抗原の発現、およびコー ドされる抗原に特異的な抗体によって結合される能力によって同定する。選択プ ロセスを長期間にわたって生存する細胞（上記を参照のこと）に限定することに より、所望の表現型を示すベクター改変体を有する細胞のみを富化する。 具体的には、異種遺伝子の発現のための複製されたサブゲノムプロモーターを 有する全長のゲノムシンドビスcDNAに作動可能に連結されたSP6プロモーターを 含む、プラスミドpTE3'2J（Hahnら，J．Virol．89:2679-2683，1992）を、上記 のようにランダム変異誘発に供する。このプロセスは、ランダム変異誘発を含有 する異種プラスミドの集団の単離を生じる。並行して、所望の異種細胞表面タン パク質またはマーカーペプチド遺伝子を、変異誘発したpTE3'2Jベクターへの挿 入のためのシャトルベクター中にクローン化する。マーカーとしての使用に好ま しい細胞表面タンパク質は、ヒトB7.1（Freemanら，J．Immunol．143:2714-2722 ，1989）およびマウスH-2KbクラスI分子（Songら，J．Biol．Chem．269:7024-70 29，1994）を含む。ヒトB7.1遺伝子を、隣接するXbaIおよびBanHI部位を含有す るように設計された以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、全長のcD NA配列を含有するpCDM8ベクター（Freemanら，同書）から、1.5分間の伸長での 標準的な３サイクルPCRによって増幅する。正方向プライマー：hB7.1FX（5'-制限部位/B7.1配列） （配列番号24） 逆方向プライマー：hB7.1RB（5'-制限部位/B7.1配列）（配列番号25） 増幅に続いて、約875bpのDNAフラグメントを、QIAquick-spin PCR精製キット （Qiagen，Chatsworth，CA）を使用して精製し、XbaIおよびBamHIで消化し、そ してシンドビスシャトルベクターpH3'2J1（Hahnら、同書）(これもまたXbaIおよ びBamHIで消化されており、仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理されている) 中に連結し、構築物pH3'B7.1を作製した。 pTE3'2J二重サブゲノムベクターのランダム変異誘発に続いて、上記のように 、プラスミドpH3'B7.1およびプラスミドpTE3'2Jの変異した集団を、ApaIおよびX hoIで消化し、GENECLEAN II IITM（Bio101，Vista，CA）を使用して0.7％アガロ ースゲルから精製し、そしてB7.1発現ベクターの異種集団（pTE3'B7.1と称する ）を形成するように連結した。E．coliの形質転換および個々のクローンの単離 なしに、連結されたベクターの完全な集団をXhoIで直線化し、そして上記のよう なインビトロSP6転写反応のためのテンプレートとして使用する。次いで、ラン ダム変異誘発したB7.1ベクター転写物の異種集団を、シンドビス複製サイクルの 開始のために、所望の細胞タイプ（例えば、BHK細胞）中にエレクトロポレート す る。存続性感染を確立するか、あるいは宿主巨大分子合成の減少した阻害、遅延 した阻害、または阻害なしを示すウイルス変異体の選択を、B7.1に特異的なモノ クローナル抗体（Pharmingen，San Diego，CA）、および磁気細胞選別または蛍 光活性化細胞選別のいずれかのプロトコルを使用して実施する。好ましい二次抗 体タグは、磁気細胞選別のための磁気マイクロビーズと結合したラット抗マウス IgG（miniMACS Magnetic Separation System，Miltenyi Biotec，Auburn，CA；M iltenyiら，Cytometry 11:231-238，1990）、および蛍光活性化細胞選別のため のFITC結合ラット抗マウスIgG（Pharmingen，San Diego，CA）を含む。このよう なアプローチを使用し、そして長時間（上記を参照のこと）の後に細胞を収集し て、機能性ウイルス由来ベクター（B7.1発現によって証明されるような）を含有 する生存可能な細胞（所望の表現型を示す）のみを富化する。 具体的には、ランダム変異誘発したB7.1ベクター転写物の異種集団を、Liljes tromおよびGaroff（1991、同書）の手順に従って５×107細胞中にエレクトロポ レートし、そしてフラットストック培養としてプレーティングした。感染後12、 24、36、および48時間にて、細胞単層を新たな培地で２回洗浄して死滅細胞を除 去し、そして50％の新たな培地と50％の馴化培地との混合物からなる培地に置換 する。感染後の所望の時間（例えば72時間）の後、残存する細胞を穏やかにトリ プシン消化してそれらを培養皿から脱着させ、そして1000rpm、４℃での遠心分 離によってペレット化する。細胞を２mlのブロッキング溶液（PBS＋10％ウシ胎 児血清＋１％BSA）中に再懸濁し、氷上で10分間インキュベートし、そして再ペ レット化した。次に、細胞を200μlの一次抗B7.1抗体溶液（PBS＋0.5％BSA中で 希釈）中に再懸濁し、そして氷上で30分間インキュベートする。細胞をPBS＋0.5 ％BSAで２回洗浄し、ペレット化し、そして200μlの磁気ビーズ溶液（200μlのP BS＋0.5％BSA＋５mM EDTA中で洗浄した、ラット抗マウスでコートされた磁気ビ ーズ）中に再懸濁する。４℃で30分間のインキュベーションに続いて、ビーズに 結合した細胞をPBS＋0.5％BSA＋５mM EDTAで２回洗浄し、そして1mlの同じ緩衝 液中に再懸濁する。次いで、ビーズに結合した細胞を、製造者の指示に従ってMi niMacs磁気カラムを使用して精製する。次いで、溶出したポジティブ細胞を、セ ミコンフルエントな非感染細胞単層を含有する組織培養皿中に、104の非感染細 胞毎に１つの感染細胞の比で直接再播種する。さらなる回数の選択を、増幅/富 化について上記のように実施する。所望の表現型を有する選択されたベクター改 変体を、限界希釈またはプラーク精製によって単離し、cDNAクローニングに供し 、そして改変体表現型を担う配列を、前記のように単離および特徴付けする。 あるいは、B7.1発現ベクターであるpTE3'B7.1を、事前の変異誘発なしにイン ビトロ転写に直接使用し得る。これらのRNA転写産物のトランスフェクションに 続いて、所望の表現型の変異体の選択を上記のように実施する。 ２．選択マーカーを発現するベクター あるいは、抗生物質耐性マーカーは、所望の表現型を示すウイルスベクター改 変体の選択のために使用され得る。例えば、シンドビスベクターpRSIN-luc（Dub enskyら、同書）を、上記のランダム変異誘発に供し、そしてランダム変異を含 む異種プラスミドの集団を単離する。さらに、ネオマイシン（G418）耐性をコー ドする遺伝子を、隣接するXhoIおよびNotI制限部位を含むように設計される以下 のオリゴヌクレオチドプラスミドを使用して、標準的な３サイクルのPCR増幅に よって、1.5分間の伸長で、プラスミドpcDNA3（Invitrogen，San Diego，CA）か ら単離する：正方向プライマー：NeoFX(5'-制限部位/neo配列) （配列番号26） 逆方向プライマー：NeoRN(5'-制限部位/neo配列)（配列番号27） 増幅に続いて、DNAフラグメントを、QIAquick-spinで精製し、XhoIおよびNotI で消化し、そしてXhoIおよびNotIで同じく消化し、仔ウシ腸管アルカリホスファ ターゼで処理し、そしてGENECLEAN IIを使用して0.7％アガロースゲルからその 以前のルシフェラーゼ挿入物と離して精製したpRSIN-lucベクターの変異した集 団に連結する。ネオマイシン耐性マーカーの変異したpRSINベクターへの連結は 、 neor発現ベクター（pRSIN-neoと称される）の異種集団を作製する。E.coliを形 質転換せずそして個々のクローンを単離せずに、連結したベクターの全体の集団 をSacIで直線化し、そして上記のように、インビトロでのSP6転写反応のための テンプレートとして使用する。ランダムに変異誘発したneorベクター転写物の異 種集団を、シンドビス複製サイクルの開始および異種遺伝子発現のために所望の 細胞型（例えば、BHK細胞）にエレクトロポレーションする。トランスフェクシ ョンの約12〜24時間後、細胞をトリプシン処理し、そしてG418を含む培地に再プ レーティングする。続いて、培地を、死滅細胞を除去するために約24時間間隔で 交換し、そして50％の新たな培地と50％の馴化培地との混合物からなるG418含有 培地で置き換える。培地交換を、大部分の死滅細胞が洗い流された後に低減させ 、そして細胞増殖巣が形成し始める。この選択を使用して、機能的なウイルス由 来ベクターを含み、所望の表現型（ネオマイシン耐性によって実証されるような ）を示す生細胞のみを、富化する。所望の表現型を表示する変異体ベクター改変 体ゲノムを、RNAzol B（Tel-Test，Friendswood，TX）を使用して、細胞溶解物 から直接RNAを収集することによって単離する。あるいは、細胞を、欠陥ヘルパ ーシンドビスRNA（pR-dlnsPSIN，Dubenskyら、同書）でトランスフェクトし、こ れは、細胞上清において、パッケージングされたpRSIN-neoベクター含有粒子の 産生を生じ、続くベクターRNA単離（上記）のために遠心分離によって濃縮され 得る。各場合において、ベクターRNAを、cDNAクローニングに供し、そして先に 記載のように、改変体表現型を担う配列を単離および特徴付けする。 あるいは、ネオマイシン耐性マーカーを有するpRSINベクターを、先の変異誘 発を含まないインビトロでの転写に直接使用し得る。これらのRNA転写物のトラ ンスフェクションに続いて、所望の表現型の変異体についての選択を、上記のよ うに実行する。 別の実施態様において、セムリキ森林ウイルス由来ベクターpSFV-1（GIBCO/BR L）を、抗生物質耐性マーカーの挿入および続く所望の表現型の選択のために使 用する。ネオマイシン（G418）耐性をコードする遺伝子を、隣接するBamHI制限 部位を含むように設計される以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、 標準的な３サイクルのPCR増幅によって、1.5分間の伸長で、プラスミドpcDNA3 （Invitrogen，San Diego，CA）から単離する：正方向プライマー：5'BAMHI-Neo （配列番号118） 逆方向プライマー：3'BAMHI-Neo（配列番号57） 増幅に続いて、DNAフラグメントを、QIAquick-spinで精製し、BamHIで消化し 、そしてBamHIで消化し、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、そしてGENEC LEAN IIを使用して、0.7％アガロースゲルから精製した、SPV-1の野生型または 予め変異した集団に連結する。RNAベクターの転写および所望の表現型の変異体 のための選択を、本質的にシンドビスウイルスの選択について上記のように行う 。 実施例３ SINIに基づくRNAベクターレプリコンの調製 Ａ．SIN-1 基本ベクターの構築 SIN-1由来ベクター骨格を構築し、そしてバクテリオファージRNAポリメラーゼ プロモーターを含むプラスミドDNAに挿入した。その結果、インビトロでの転写 は、感受性細胞への導入に際して自己複製分子（レプリコン）として作用するRN A分子を産生した。基本SIN-1 RNAベクターレプリコンは、以下の順序のエレメン トから構成された：SIN-1 nsPs遺伝子、サブゲノム性RNAプロモーター領域、ポ リリンカー配列（異種配列挿入物を含み得る）、SIN-1 3'非翻訳領域（NTR）、 およびポリアデニル化配列。感受性細胞へのトランスフェクションに続いて、RN Aベクターレプリコンの自律複製は、ウイルスについて生じ、そして異種配列は 、非常に豊富なサブゲノム性mRNA分子として合成され、次いで、異種遺伝子産物 のための翻訳テンプレートとして役割を果たす。 ベクターの5'領域（SIN-1 nsP遺伝子およびサブゲノム性プロモーターから構 成される）は、キャプシド遺伝子翻訳開始点の２つのヌクレオチド内で伸長する 。この領域を、pKSII+プラスミド（Stratagene）のApaIとXhoI部位との間に最初 に挿入した。ベクター5'領域を、PCRによって、２つの重複フラグメント中のpRS IN-1gプラスミドから、増幅した。第１のフラグメントを、以下のプライマー対 とのPCR反応において生成した：正方向プライマー：SP6-1F（ApaI部位／SP6プロモーター／SIN nt 1-18） ：（配 列番号12） 逆方向プライマー：SIN5160R（SIN nt 5160-5140）：（配列番号28） 第２のフラグメントを、以下のプライマー対とのPCR反応において生成した：正方向プライマー：5079F（SIN nt 5079-5100） ：（配列番号29） 逆方向プライマー：SIN7643R（緩衝配列／XhoI部位／SINnt7643-7621）：（配列 番号30） 上記に示されるプライマー対との２つのPCR反応を、Thermalase（Amresco，So lon，OH）、Vent（New England Biolabs，Beverly，MA）、またはKlenTaq熱安定 性DNAポリメラーゼを使用して実施した。さらに、反応は、５％DMSOおよび「HOT START WAX」ビーズ（Perkin-Elmer，FosterCity，CA）を含んだ。以下に示すPC R増幅プロトコルを使用した。伸長期間は、SP6-IF/SIN5160Rまたは5079F/SIN764 3Rプライマー対との反応について、それぞれ５分または2.5分であった。 PCRに続いて、5142bp（S6-1F/SIN5160Rプライマー対）および2532bp(5079F/SI N7643Rプライマー対)の二つの増幅産物を精製し（PCR精製キット、Qiagen，Chat sworth，CA）、そしてApaIおよびSfiI（5142bpアンプリコン産物）またはSfiIお よびXhoI（2532bpアンプリコン産物）で消化した。消化した産物を、GENECLEAN II(Bio 101．Vista，CA）を用いて精製し、そしてApaIおよびXhoIでの消化によ って調製し、CIAPでホスファターゼ処理したpKS+プラスミド（Stratagene，La J olla，CA）とともに連結した。この構築物は、pKSSIN-1-BV5'として公知である 。 ベクターの3'領域（ウイルス3'末端、ポリアデニル化域、および独自の制限認 識配列からなる）を、プラスミドpKSSIN-1-BV'5のNotIとSacI部位との間に挿入 した。ベクターの3'領域を、PCRによって、pRSIN-1gプラスミドから、以下のプ ライマー対を含む反応において増幅した：正方向プライマー：SIN11386F（緩衝配列／NotI部位／SIN nt 11386-11407） ： （配列番号31） 逆方向プライマー：SIN11703R（緩衝配列／SacIおよびPmeI部位／T40／SIN nt 1 1703-11698） ：（配列番号32） 上に示したプライマー対に加えて、PCR反応は、Thermalase、Vent、またはKle nTaq熱安定性DNAポリメラーゼ、５％DMSO、および「Hot Start Wax」ビーズ(Per kin-Elmer）を含んだ。増幅プロトコルは、72℃で30秒間の伸長期間を除いては 、上に示した通りであった。 3'ベクター末端に対応する377bpの増幅産物を精製し、NotIおよびSacIで消化 し、精製し、そしてpKSSIN-1-BV5'（NotIおよびSacIでの消化およびCIAPでの処 理によって調製した）に連結した。このプラスミドは、pKSSIN-1-BVとして公知 である。 上記の技術を使用して、β-ガラクトシダーゼレポータータンパク質をコード するlacZ遺伝子を、BamHIおよびHindIIIを用いて、プラスミドpSV-β-ガラクト シダーゼ（Promega Corp.，Madison，WI）から遊離させ、そして対応する酵素制 限部位でpKS+に挿入した。lacZ遺伝子を。このプラスミド（pKS-β-gal）から、 XhoIおよびNotIで消化し、そしてpKSSIN-1-BVに、XhoIとNotI部位との間で挿入 した。このプラスミドは、SINrep/SIN-1 nsP1-4/lacZとして公知である。 あるいは、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするホタルルシフェ ラーゼ遺伝子を、HindIIIでの消化によってプラスミドpT3/T7-LUC（Clontech，P alo Alto，CA）から遊離させ、複数のクローニング配列に含まれる対応する酵素 認識部位でpKS+（Stratagene，La Jolla，CA）に挿入し、pKS-lucを作製した。 ルシフェラーゼ遺伝子を、XhoIおよびNotIでの消化によってpKS-lucから遊離さ せ、そしてXhoI/NotI消化pKSSIN-1-BVに挿入した。このプラスミドは、SINrep/S IN-1 nsP1-4/lucとして公知である。 さらに、アルカリホスファターゼの分泌形態（SEAP）をコードする遺伝子を、 pKSSIN-1-BVに挿入した。簡潔には、SEAP遺伝子を、HindIIIおよびXbaIでの消化 によってプラスミドpCMV/SEAP（Tropix，Bedford，MA）から遊離させ、複数のク ローニング配列に含まれる対応する認識部位でpSK+（Stratagene，La Jolla，CA ）に挿入し、pSK-SEAPを作製した。次いで、SEAP遺伝子を、XhoIおよびNotIでの 消化によってpSK-SEAPから遊離させ、pKSSIN-1-BVの対応する酵素認識部位に挿 入した。このプラスミドは、SINrep/SIN-1 nsP1-4/SEAPとして公知である。 個々のSIN-1nsp遺伝子を、SIN-1および野生型発現ベクターの発現特性を比較 するために、以前に記載のシンドビスウイルスに基づくlacZレプリコンの対応す る野生型ウイルス領域(Bredenbeekら、J．Virol．67:6439-6446，1993)に置換し た。SIN-1 nsP遺伝子のToto1101由来lacZレプリコンへの置換を、実施例１に記 載のように達成した。これらのベクターを、以下の表に示すように命名した。 SP6転写物を、XhoIで直線化した後、実施例１に記載のように、上記の表に示 すレプリコンから調製した。RNA転写物は、シンドビスウイルスの転写を開始し 得る5'配列、シンドビスウイルス非構造タンパク質遺伝子1-4、パッケージング に必要なRNA配列、シンドビスウイルス接合領域、lacZ遺伝子、およびマイナス 鎖RNAの合成に必要なシンドビスウイルス3'末端近位配列を含んだ。 インビトロでの転写反応産物または精製RNAを、以前に記載のように(Liljestr omおよびGaroff，Bio/Technology 9:1356-1361，1991）ベビーハムスター腎臓-2 1（BHK-21）細胞にエレクトロポレートした。あるいは、BHK-21細胞を、実施例 １に記載のように、市販のカチオン性脂質化合物と複合体化し、そして75％のコ ンフルエンシーに維持したBHK-21細胞に適用した。トランスフェクトした細胞を 、35mm皿の中で増殖させ、そして37℃でインキュベートした。 SINrep/lacZ RNAを用いるBHK-21細胞のトランスフェクションの９時間後の効 率を、２つの二者択一の方法によって測定した。第１の方法において、β-ガラ クトシダーゼを発現するトランスフェクトした細胞を、以前に記載のように（Ma cGregorら、Cell Mol．Genet．13:253-265，1987）２％の冷メタノールで細胞を 最初に固定した後、X-gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-b-D-ガラクトピラ ノシド)で直接染色することによって測定した。第２の方法において、β-ガラク トシダーゼの発現を、ウサギ抗β-ガラクトシダーゼ抗体を使用して、免疫蛍光 によって測定した。上記のいずれかの方法によってトランスフェクトされた細胞 の一部を、35mm皿に含まれた、円形ガラスカバースリップ上で増殖させた。トラ ンスフェクション（hpt）の９時間後、培地を吸引によって除去し、そして細胞 をPBSDで２回リンスし、そして-20℃で一晩インキュベーションすることによっ てメタノールで固定した。メタノールを吸引によって除去し、細胞をPBSで３回 リンスし、次いで、２％BSA（画分Ｖ、Sigma，St．Louis，MO）と室温で30分間 インキュベートした。非特異的抗体結合を防ぐためのBSAとのインキュベーショ ンに続いて、細胞を、一次抗β-ガラクトシダーゼ抗体（0.1％BSA/PBS中の１：8 00希釈）と室温で１時間インキュベートした。次いで、過剰の一次抗体を、吸引 およびPBS中の0.1％BSAで３回リンスすることによって除去した。PBS中の２％BS A中の１：100希釈に続いて、100mlのヤギ抗ウサギFITC結合二次抗体（Sigma，St ．Louis，MO）を、カバースリップに添加し、そして室温で45分間、暗所にてイ ンキュベートした。過剰の二次抗体を、カバースリップをPBS中の0.1％BSAで２ 回、およびPBSで１回リンスすることによって除去した。次いで、カバースリッ プを、１滴のCytoseal 60マウンティング（mounting）培地（Stephens Scientif ic，Riverdale，NJ）の下側の細胞にマウントし、顕微鏡スライド上に置いた。 蛍光顕微鏡を使用して、トランスフェクション効率を測定するために、β-ガラ クトシダーゼを発現する細胞の頻度を測定した。 全体のトランスフェクトされた細胞溶解物におけるβ-ガラクトシダーゼのレ ベルを、２つの二者択一の方法によって、９hptで測定した。第１の方法におい て、トランスフェクトした細胞を、培地を吸引した後にPBSでリンスし、そして1 06細胞あたり250μlのレポーター溶解緩衝液（Promega，Madison，WI）を各皿に 添加した。β-ガラクトシダーゼの発現レベルを、細胞溶解物からの上清画分を 混合することによって測定し、市販の基質検出系（Lumi-gal，Clonthch，Palo A lto．CA）を用いて、14,000r.p.m.で室温で１分間の微量遠心分離によってプロ セスし、その後、照度測定（luminometry）を行った。（Analytical Luminescen ce Laboratory，San Diego，CA）。第２の方法において、β-ガラクトシダーゼ の活性を、SambrookおよびManiatis（1989，第２版、Cold Spring Harbor Labor atory Press，NY）によって以前に記載されたように、測定した。簡潔には、ト ランスフェクトした細胞を、培地を吸引した後に、PBSでリンスし、そして106細 胞あたり200μlのTTE溶解緩衝液（10mM Tris-HCl（pH8.0）／1mM EDTA／0.2％Tr iton X-100）を各皿に添加した。細胞溶解物からの細胞片を、14,000r.p.m.で室 温で１分間微量遠心分離することによってペレット化した後に、50μlの上清を0 .5mlのＺ緩衝液（pH7.0）（60mM Na2HPO4／40mM NaH2PO4／10mM KCl／10mM MgSO4 ／50mM 2-メルカプトエタノール）に添加し、そして37℃で５分間インキュベー トした。次いで、試料中のβ-ガラクトシダーゼ活性を、Ｚ緩衝液中に４mg/mlの 色素基質o-ニトロフェニル-b-D-ガラクトピラノシド（ONPG;SIGMA，St．Louis， MO）を含む溶液0.2mlを添加した後、分光光度測定（420nm）によって決定した。 試料を、黄色が発色するまで（約５分間）37℃でインキュベートし、そして反応 を0.5mlの0.5M Na2CO3の添加によって停止させた。 トランスフェクトしたBHK-21細胞中のβ-ガラクトシダーゼの発現のレベルを 、上記の方法に従って測定した。これを以下に示す表に表す。示したデータは、 上記のように変動するトランスフェクション効率について正規化されている。 この結果は、SIN-1改変体株由来のレプリコンベクターが実際は機能的である ことを示す。BHK-21細胞にトランスフェクトした場合、発現されるレポータータ ンパク質のレベルは、野生型ウイルス由来ベクターでトランスフェクトした細胞 において得られるレベルよりも高かった。さらに、増殖性の存続性感染の確立の ための表現型を有するため、SIN-1由来レプリコンベクターでトランスフェクト したBHK-21細胞における高レベルのβ-ガラクトシダーゼの発現は、主にnsP2遺 伝子にマップした。 実施例４ SINlに基づくDNAベクターの調製 Ａ．プラスミドDNASIN-1由来発現ベクターの構築 シンドビスウイルス感染性周期の効率的な開始は、RNAポリメラーゼIIの発現 カセット内に含まれるゲノムcDNAクローンから、インビボで生じ得る。（Dubens kyら、J．Virol 70:508-519，1996）。DNAフォーマットから機能的なアルファウ イルス遺伝子を発現する能力は、２つの新規なアルファウイルスに基づく遺伝子 発現系が開発されることを可能にする：（１）遺伝的な免疫に適用される、プラ スミドDNAに基づくベクター、および（２）ベクターレプリコンおよびDHプラス ミドDNAで同時トランスフェクトした細胞における、パッケージングされたアル ファウイルス粒子の産生。以前に、感染シンドビスウイルスRNAおよびそれに由 来する相補体ベクターを産生するための分子的アプローチは、バクテリオファー ジRNAポリメラーゼプロモーターからのcDNAクローンのインビトロでの転写、続 いての許容細胞へのトランスフェクションに主に限定された。 プラスミドDNAに基づくアルファウイルス由来発現ベクターは、ELVSTM（真核 生物重層ベクター系）として公知である。ELVSTMプラスミドDNAベクターは、自 己複製ベクターRNA（レプリコン）の重層DNAに基づく発現系への転換を含む。特 定の実施態様内において、最初の層は、第２の層の転写を開始する真核生物の（ 例えば、RNAポリメラーゼII）発現カセットを有し、これはRNAベクターレプリコ ンに対応する。最初の層から発現されるレプリコンの核から細胞質への輸送に続 いて、ベクターの自己触媒性増幅は、ウイルス（例えば、アルファウイルス）複 製周期に従って進行し、異種遺伝子の発現を生じる。 SIN-1ウイルス由来プラスミドDNA発現ベクターの構築を、以前に記載の方法 （Dubenskyら、J．Virol 70:508-519，1996）を改良して行った。発現ベクター を、pUC9（Sprattら、Gene 41:337-342，1986）のカナマイシン耐性アナログで あるプラスミドベクターpBGS131（ATCC番号37443）上で構築した。pBGS131およ びそれに由来するプラスミドを、20μg/mlのカナマイシンを含むLB培地において 増殖させた。 異種配列の発現ベクターへの挿入を促進するために、XhoI認識配列（pBGS131 中のカナマイシン遺伝子の翻訳リーディングフレーム内に位置する）を、XhoI付 着末端を含む部分的に相補な12マーのオリゴヌクレオチドを挿入することによっ て、取り除いた。XhoI認識部位を、以下に示すように、挿入の結果として消失さ せた： オリゴヌクレオチド１：（配列番号33） （XhoI部位：CTCGAG）（配列番号33〜36および104） オリゴヌクレオチドを、10mM MgCl2の存在下の等モル濃度でゲルアニールし、 100℃で５分間加熱し、室温までゆっくりと冷却し、そしてポリヌクレオチドキ ナーゼでリン酸化する。オリゴヌクレオチドを、200：１の挿入物：プラスミド ベクターの比で、pBGS13lに連結し、これを、XhoI消化およびCIAP処理によって 調製した。得られるプラスミドを、pBGS131 dlXhoIと呼ぶ。pBGS131またはpBGS1 31 dlXhoIプラスミドで形質転換したXL1-Blue（Stratagene）の、20μg/mlのカ ナマイシンを含むLB培地における増殖速度は、1.5〜８時間の時間経過では区別 できなかった。 ウシ成長ホルモン（BGH）転写終結／ポリアデニル化シグナルを、pBGS131 dlX hoIのSacIとEcoRI部位との間に挿入した。BGH転写終結配列を、以下に示すプラ イマー対およびpCDNA3プラスミド（Invitrogen，San Diego，CA）をテンプレー トとして使用して、PCR増幅によって単離した。正方向プライマーBGHTTF（緩衝配列／SacI部位／pCDNA3 nt 1132-1161） ：（配 列番号37） 逆方向プライマーBGHTTR（緩衝配列／EcoRI部位／pCDNA3 nt 1180-1154）：（配 列番号38） 上に示したプライマーを、30秒の伸長期間を使用して、３温度サイクルプログ ラムでのPCR反応に使用した。58bpの増幅産物を、PCR精製キット（Qiagen Chats worth，CA）を用いて精製し、SacIおよびEcoRIで消化し、GENECLEAN IIを用い て精製し、そしてSacI/EcoRI消化し、CIAP処理したpBGS131に連結した。このプ ラスミドは、pBGS131 dlXhoI-BGHTTとして公知である。 次いで、シンドビスウイルス由来プラスミドDNA発現ベクターの3'末端を、pBG S131 dlXhoI-BGHTT構築物に挿入した。このベクターの領域は、以下の順序のエ レメントを含む：シンドビスウイルス3'末端非翻訳領域（3'NTR）；40マーのポ リ(A)配列；D型肝炎ウイルス（HDV）アンチゲノム性リボザイム；およびSacI認 識配列。これらの順序のエレメントの構築を、以下に示すプライマーおよびpKSS IN-1-BVプラスミド（実施例４）をテンプレートとして使用して、ネスティッド なPCRによって達成した。正方向プライマー：SIN11386F（緩衝配列/Not I部位/SIN nts 11386-11407） ： （配列番号31） ネスティッドプライマー：pAHDV1F(ポリ(A)/HDV RBZ nts 1-46)：（配列番号39 ） 逆方向プライマー：SacHDV77R（緩衝配列/Sac I部位/HDV RBZ nts 77-27）：（ 配列番号40） 上記のプライマーを、実施例４に記載の反応条件および３つの温度サイクルプ ログラムに従い、30秒間の伸長時間を伴うPCR増幅において使用した。422bpの増 幅産物をPCR精製キット（Qiagen Chatsworth，CA）で精製し、NotIおよびSacIで 消化し、GENECLEAN IIで精製し、そしてNotI/SacI消化しCIAP処理したpKSSIN-1- BVに連結した。この構築物は、pKSSIN-1BV/HDVRBZとして識別され、そしてHDVリ ボザイム配列を含むベクターの3'末端を通って延伸するシンドビスnt 2289にお けるBgl II部位からのシンドビスウイルス由来のプラスミドDNA発現ベクター配 列を含む。 次いで、プラスミドpKSSIN-1BV/HDVRBZを、Bgl IIおよびSac Iで消化し、5815 bpフラグメントを１％アガロース/TBEゲル電気泳動により単離し、GENECLEAN II により精製し、そしてBgl II/Sac Iで消化しCIAPで処理したpBGS131 dlXho I-BG HTTに挿入して、pBG/SIN-1BglLFとして識別されるプラスミド構築物を生成した 。この構築物は、pBGS131 dlXho Iプラスミド上のBGH転写終結配列に融合した3' 末端を有する上記のプラスミドpKSSIN-1BV/HDVRBZからのシンドビスウイルス発 現ベクターの領域を含む。 シンドビスウイルスプラスミドDNAベクターのアセンブリを、シンドビスウイ ルスゲノム（5'ウイルス末端およびnsP遺伝子の一部を含む）の最初の2289ntsと 隣接して並べたCMVプロモーターのpBG/SIN-1BglLFプラスミドへの挿入により達 成した。重複PCRアプローチを使用することにより、CMVプロモーターを5'ウイル ス末端に配置し、その結果転写開始により一個の非ウイルスヌクレオチドのシン ドビスウイルスベクターレプリコンRNAの5'末端への付加を生じた。CMVプロモー ターを最初のPCR反応においてpCDNA3（Invitrogen，San Diego，CA）から以下の プライマー対を使用して増幅した：正方向プライマー：pCBgl233F（緩衝配列/Bgl II認識配列/CMVプロモーターnts 1-22） ：（配列番号41） 逆方向プライマー：SNCMV1l42R（SIN nts 8-1/CMVプロモーターnts 1142-1108） ： （配列番号42） 上記のプライマーを実施例４に記載の反応条件および３つの温度サイクルプロ グラムに従って、１分間の伸長時間を伴うPCR反応において使用した。 SIN-15'末端を、pKSRSIN-1gクローン（実施例１）から以下のプライマー対を 用いて第二のPCR反応において増幅した：正方向プライマー：CMVSINIF(CMVプロモーターnts 1124-1142/SIN nts 1-20） ： （配列番号43） 逆方向プライマー：SIN 3182R(SIN nts 3182-3160)：（配列番号44） 上記のプライマーを３つの温度サイクルプログラムで３分間の伸長時間を用い たPCR反応において使用した。 930bpおよび3200bpの増幅された産物をPCR精製キット（Qiagen）で精製し、そ して共に以下のプライマー対を用いたPCR反応において使用した：正方向プライマー：pCBg1233F ：（配列番号41） 逆方向プライマー：（SIN nts 2300-2278）：（配列番号45） 上記のプライマーを３つの温度サイクルプログラムで3.5分間の伸長時間を用 いたPCR反応において使用した。 第一のPCR増幅産物の3'末端の26塩基は、第二のPCR増幅産物の5'末端の26塩基 と重複した；得られた3200bpの重複する二次PCR増幅産物を１％アガロース/TBE 電気泳動により精製し、BglIIで消化し、そしてBglIIで消化しCIAP処理したpBG/ SIN-1BglLFに連結した。この構築物を、pBG/SIN-1 ELVS 1.5と呼ぶ。 実施例1において議論したように、野生型シンドビスウイルスのnsP遺伝子配列 における比較的少ないヌクレオチド点変化がSIN-1の表現型特徴を生じる。これ らのヌクレオチド変化の結果として、野生型およびSIN-1遺伝子型に由来するク ローンを簡便に識別するのを促進する新たな制限酵素認識部位は生成しない。そ れゆえ、PCRに基づく診断アッセイをSIN-1由来のクローンの同定のための迅速な 方法として考案した。手短に言うと、正方向プライマーをSIN-1と野生型との間 の特定の塩基変化がプライマーの3'末端塩基に配置されるように設計した。１つ のプライマーはSIN-1ヌクレオチドを含み、一方、別のプライマーは野生型ヌク レオチドを含んでいた。両方の遺伝子型間で保存されている下流領域における逆 方向プライマーを、各正方向プライマーと組み合わせて使用した。正確なアニー リング温度において、SIN-1テンプレートのみがSIN-1正方向プライマーを含む反 応において増幅された。野生型およびSIN-1遺伝子型を識別するために使用した プライマー配列を以下に与える。反応条件は、本明細書中に含まれる実施例のす べてにわたって記載される通りであった。プライマーセットI： 正方向プライマー： 逆方向プライマー： SIN2300R PCRプログラム： （95℃-30秒、72℃-２分）20サイクルプライマーセット２： 正方向プライマー： 逆方向プライマー： SIN5448R PCRプログラム： （95℃-30秒、60℃-30秒、72℃-２分）20サイクルプライマーセット３： 正方向プライマー： 逆方向プライマー： PCRプログラム： （95℃-30秒、60℃-30秒、72℃-２分）20サイクル レポータータンパク質発現ベクターを、lacZ、SEAP、またはルシフェラーゼレ ポーター遺伝子をpBG/SIN-1 ELVS 1.5ベクター骨格に挿入することにより構築し た。別の反応において、pKS-β-gal、pSK-SEAP、およびpKS-lucプラスミド（実 施例４）を、XhoIおよびNotIで消化した。lac、SEAP、またはルシフェラーゼ遺 伝子を含むフラグメントを、１％アガロース/TBEゲル電気泳動により単離し、そ して続いてGENECLEAN IIで精製した。次いで、これらのレポーター遺伝子を、Xh oI/NotI消化しCIAP処理したpBG/SIN-1 ELVS 1.5プラスミドに別の反応において 連結した。これらの構築物は、pBS/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal、pBG/SIN-1 ELVS 1. 5-SEAP、およびpBG/SIN-1 ELVS 1.5-lucとして識別される。 Ｂ．pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAP 、pBG/SIN-1 ELVS 1.5-lucまたはpBG/SIN-1 ELVS1 .5-β-gal発現ベクターでトランスフェクトした細胞における異種タンパク質の 発現 pBG/SIN-1 ELVS 1.5またはpBG/wt ELVS 1.5ベクターを、トランスフェクトし たBHK細胞において、分泌されたアルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、お よびβ-ガラクトシダーゼレポーター遺伝子発現のパターンを比較した。pBG/wt ELVS 1.5プラスミドは、SIN-1改変体というよりは野生型シンドビスウイルス由 来の配列を含む。pBG/wt ELVS 1.5発現ベクターの構築は、pBG/SIN-1 ELVS 1.5 発現ベクターについての本明細書中の記載と、ベクター構築のためのテンプレー トとして野生型シンドビスウイルス（Dubenskyら、WO 95/07994）由来の全長の ゲノムcDNAを用いたこと以外は全く同じであった。pBG/wt ELVS 1.5発現ベクタ ーの構築は以前に（Dubenskyら、前出）記載されており、従って、株（および、 それゆえ配列）は異なっているが、pBG/wt ELVS 1.5発現ベクターおよびpBG/SIN -1 ELVS 1.5発現ベクターに含まれるシンドビスウイルス特異的領域は同じであ る。 12mmディッシュ中で75％のコンフルエンシーで維持したベビーハムスター腎臓 -21（BHK-21）細胞を、1.0μgのpBG/SIN-1 ELVS 1.5発現ベクタープラスミドDNA またはpBG/wt ELVS 1.5発現ベクタープラスミドDNA（これらのDNAは4.0μlの市 販の脂質（Lipofectamine，GIBCO-BRL）で複合化した）でトランスフェクトした 。他方で、トランスフェクション条件は脂質の製造者により示唆されるとおりで あった。５％のウシ胎児血清を補充したEagle最小必須培地を、別に指示しない 限りトランスフェクション後４時間（hpt）で細胞に添加した。トランスフェク トした細胞を、37℃にてインキュベートした。トランスフェクション後種々の時 間において以下に示すように、いくつかのアッセイを実施して、pBG/SIN-1 ELVS 1.5プラスミドDNAまたはpBG/wt ELVS 1.5プラスミドDNAでトランスフェクトし た細胞における、ベクター特異的RNA合成、および分泌されたアルカリホスファ ターゼ、ルシフェラーゼ、またはβ-ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の発現 を比較した。 pBG/SIN-1 ELVS-1 1.5-SEAPプラスミドDNAまたはpBG/wt ELVS 1.5-SEAPプラス ミドDNAでトランスフェクトしたBHK細胞の培養培地へ分泌されたアルカリホスフ ァターゼのレベルを比較した。細胞培養培地を、Phospha-LightTM化学発光レポ ーター遺伝子アッセイを用いて製造者（Tropix，Inc.，Bedford，MA）の指示に 従ってアルカリホスファターゼの存在についてアッセイした。手短に言うと、10 μlの細胞培養上清を30μlの希釈緩衝液と混合し、そして65℃にて30分間インキ ュ ベートした。サンプルを室温まで放冷し、その後40μlのアッセイ緩衝液と混合 した。サンプルを室温にて５分間インキュベートし、続いて40μlの反応緩衝液 を添加した。サンプルを室温にて20分間インキュベートした。全発光をML3000マ イクロタイタープレート照度計（Dynatech，Inc.，Chantilly，VA）上でサイク ルモードで測定した。そしてpBG/SIN-1 ELVS-1 1.5-SEAPプラスミドDNAまたはpB G/wt ELVS 1.5-SEAPプラスミドDNAでトランスフェクトしたBHK細胞の培養培地の アルカリホスファターゼ（AP）を48hptにおいて決定し、そして結果を以下の表 に示す。 トランスフェクトしたプラスミド 48hptにおけるRLU pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAP 18±1.7 pBG/wt ELVS 1.5-SEAP 94±10.7 pCDNA3 0.13±0.04 さらに、pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAPプラスミドまたはpBG/wt ELVS 1.5-SEAPプ ラスミドでトランスフェクトしたBHK-21細胞において合成されたベクター特異的 RNAのレベルをノーザンブロット分析により、以前に記載されたものと全く同様 に（Dubensky、前出）、トランスフェクション後48時間で決定した。この実験の 結果を図9Aに示す。総細胞性RNAを、トランスフェクトしたBHK細胞からTri-Reag entを用いて製造者（Molecular Research Center，Inc.，Cincinnati，OH）によ り記載されるように単離した。トランスフェクトしたBHK細胞からのサンプル中 に存在する総細胞性RNA濃度を分光光学的に決定した。さらに、トランスフェク トした細胞から単離された物質が、10μl/mlのエチジウムブロミドにより染色し た0.5μgの総細胞性RNAの0.7％アガロース/TBEミニゲルによる電気泳動によりイ ンタクトであることを決定した。ノーザンブロット分析をSambrookおよびManiat is（1989,第２版、Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y. ）に従って実施した。すべてのトランスフェクトしたサンプル由来のRNAを単一 のノーザンブロット分析からのオートラジオグラムにおいて可視化され得るため に、1レーン当たり、pBG/wt ELVS 1.5-SEAPでトランスフェクトした細胞およ びpBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAPでトランスフェクトした細胞由来のそれぞれ、2.5μ gおよび30μgのRNAをロードした。試験した両方のプラスミドを有する別々のト ランスフェクション由来の４つのRNAサンプルを0.7％ホルムアルデヒドアガロー スゲルで電気泳動し、そしてZeta-probeメンブレン（Bio-Rad，Richmond，CA） に移した。ブロットをアルカリホスファターゼ遺伝子に対応するランダムプライ ムしたプローブとハイブリダイズさせた。トランスフェクトされたBHK細胞にお けるベクター特異的RNA合成のレベルおよびAP発現のレベルを48hptにて比較した この実験の結果は、pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAP DNAでトランスフェクトした細胞 において合成されるベクター特異的RNAのレベルが、pBG/wt ELVS 1.5-SEAPトラ ンスフェクト細胞におけるより少なくとも100倍低いが、一方APのレベルはpBG/w t ELVS 1.5-SEAP DNAと比較してpBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAP DNAでトランスフェク トした細胞において、５倍低いだけであったことを実証する。 pBG/SIN-1 ELVS-1 1.5-SEAPまたはpBG/wt ELVS 1.5-SEAPのプラスミドDNAでト ランスフェクトしたBHK細胞の培養培地へ分泌されるアルカリホスファターゼの レベルをまた、７日間にわたって経時的に比較した。この研究の結果を図9Bに示 し、これは、初期の時点で培養培地中に存在するAPのレベルが、pBG/wt ELVS 1. 5-SEAPプラスミドと比較してpBG/SIN-1 ELVS-1 1.5-SEAPプラスミドでトランス フェクトした細胞においてはるかに低かったことを実証する。しかし、SIN-1シ ンドビスウイルス改変体株由来ベクターでトランスフェクトした細胞において発 現されるAPのレベルは迅速に増大し、そして96hptの時点まで、野生型ウイルス 由来ベクターでトランスフェクトした細胞におけるよりも高かった。 pBG/SIN-1 ELVS-1 1.5-lucプラスミドDNAまたはpBG/wt ELVS 1.5-lucプラスミ ドDNAでトランスフェクトしたBHK細胞に存在するルシフェラーゼレベルを、24、 48、および72hptにおいて比較した。ルシフェラーゼ発現レベルを、106のトラン スフェクト細胞当たり250μlのレポーター溶解緩衝液（Promega，Madison WI） を添加し、14,000rpmにて１分間溶解物を遠心分離し、次いで細胞溶解物由来の 上清画分を市販の基質検出系（Promega，Madison WI）と混合し、続いて照度計 測定（Analytical Luminescence Laboratory，San Diego，CA）することにより 定量した。この実験の結果（以下の表に示す）および図10において図式的に示さ れる結果は、アルカリホスファターゼ発現ベクターで観察した結果と同様であっ た。トランスフェクション後の初期の時間において、ルシフェラーゼ発現レベル は、pBG/wt ELVS 1.5-lucプラスミドと比較してpBG/SIN-1 ELVS 1.5-lucプラス ミドでトランスフェクトしたBHK細胞において、低かった。しかし、48および72h pt時点において、ルシフェラーゼレベルは、シンドビスウイルスSIN-1改変体株 由来発現ベクターおよび野生型由来発現ベクターでトランスフェクトしたBHK細 胞と類似していた。 48hptでのBHK細胞におけるpBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-galプラスミドおよびpBG/w t ELVS 1.5-β-galプラスミドのトランスフェクション効率を、β-ガラクトシダ ーゼを発現する細胞数を直接測定するために、細胞単層（MacGregor，Cell Mol. Genet．13:253-265，1987）の直接X-gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-b-D -ガラクトピラノシド）染色により決定した。トランスフェクション効率は同等 であった。そして以下の表に示す。 トランスフェクトしたプラスミド 青色細胞数／100×視野 pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal 24±３ pBG/wt ELVS 1.5-β-gal 26±７ pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-galプラスミドまたはpBG/wt ELVS 1.5-β-galプラス ミドでトランスフェクトしたBHK-21細胞中で合成されたベクター特異的RNAのレ ベルを、トランスフェクション後48および72時間後において、以前に記載された （Dubensky、前出）ものと全く同様にノーザンブロット分析により決定した。総 細胞性RNAをトランスフェクトしたBHK細胞から製造者（Molecular Research Cen ter，Inc.，Cincinnati，OH）によって記載される通りにTri-Reagentを用いて単 離した。pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-galプラスミドまたはpBG/wt ELVS 1.5-β-gal プラスミドでトランスフェクトしたBHK細胞由来のサンプル中に存在する総細胞 性RNA濃度を、分光光学的に決定した。さらに、トランスフェクトした細胞から 単離した物質が、10μl/mlのエチジウムブロミドにより染色した、0.7％アガロ ース/TBEミニゲルによる0.5μgの総細胞性RNAの電気泳動によりインタクトであ ることを決定した。ノーザンブロット分析は、SambrookおよびManiatis（1989、 第２版、Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.）に従っ て実施した。すべてのトランスフェクトしたサンプル由来のRNAを単一のノーザ ンブロット分析からのオートラジオグラムにて可視化され得るために、１レーン 当たり、pBG/wt ELVS 1.5-β-galでトランスフェクトした細胞およびpBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-galでトランスフェクトした細胞由来のそれぞれ、2.5μgおよび5μ gのRNAをロードした。試験した両方のプラスミドを有する別々のトランスフェク ション由来の２つのRNAサンプルを、48および72hptにおいて、0.7％ホルムアル デヒドアガロースゲルで電気泳動し、そしてZeta-probeメンブレン（Bio-Rad，R ichmond，CA）に移した。ブロットをβ-ガラクトシダーゼ遺伝子に対応するラン ダムプライムしたプローブでハイブリダイズした。この実験の結果を図11Aに示 し、これはpBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal DNAでトランスフェクトした細胞におい て、トランスフェクション後48および72時間で合成されたベクター特異的RNAの レベルが、pBG/wt ELVS 1.5-β-galトランスフェクト細胞において検出されたRN Aのレベルより少なくとも100倍低かったことを実証する。 さらに、β-ガラクトシダーゼ発現レベルを、106トランスフェクト細胞当たり 250μlのレポーター溶解緩衝液（Promega，Madison WI）を添加し、14,000rpmに て１分間溶解物を遠心分離し、次いで細胞溶解物由来の上清画分を市販の基質検 出系（Clontech，Palo Alto，CA）と混合し、続いて照度計測定（Analytical Lu minescence Laboratory，San Diego，CA）することより、トランスフェクトした 全細胞溶解物中で定量した。この実験の結果（以下の表に示し、そして図9Cにお いて図式的に示す）は、トランスフェクション後初期の時点において、β-ガラ クトシダーゼ発現レベルが、pBG/wt ELVS 1.5-β-galプラスミドと比較して、pB G/SIN-1 ELVS 1.5-β-galプラスミドでトランスフェクトしたBHK細胞において、 顕著に低かったことを実証する。しかし、レポーター発現は、pBG/SIN-1 ELVS 1 .5-β-galトランスフェクト細胞において経時的に迅速に増大し、その結果β-ガ ラクトシダーゼレベルは、最後の120時間の時点において野生型ウイルスでトラ ンスフェクトした細胞におけるよりも高かった。 pBG/SIN-1 ELVS-1 1.5-β-galプラスミドDNAまたはpBG/wt ELVS 1.5-β-galプ ラスミドDNAでトランスフェクトした細胞におけるβ-ガラクトシダーゼの発現を また、最後の120hpt時点において、レポータータンパク質に特異的なモノクロー ナル抗体（Boehringer Mannheim）を用いるウェスタンブロット分析により直接 測定した。120hptで決定したレポータータンパク質の活性と類似して、β-ガラ クトシダーゼタンパク質のレベルは、PBG/SIN-1 ELVS-1 1.5-β-galトランスフ ェクトBHK細胞において、pBG/wt ELVS 1.5-β-galと比較して、同レベルである かそれ以上であり、そして図11Cに示す。 これらを総合すると、本明細書中に記載の結果は、pBG/SIN-1 ELVSトランスフ ェクト細胞において合成されるベクター特異的RNAのレベルは、pBG/wt ELVSトラ ンスフェクト細胞と比較して、少なくとも100倍少ないことを示す。しかし重要 なことに、48〜72時間のラグの後、pBG/SIN-1 ELVSトランスフェクト細胞におけ るレポーター遺伝子発現のレベルは、pBG/wt ELVSトランスフェクト細胞と比較 して同等またはそれ以上である。トランスフェクト細胞における低いベクター特 異的RNA合成との組合せの高発現レベルで特徴付けられるpBG/SIN-1 ELVSの表現 型は、おそらく宿主細胞タンパク質合成が低減しているか、または存在しないこ とに起因する。従って、このpBG/SIN-1 ELVSの特性は、トランスフェクト細胞に おけるサブゲノムmRNA翻訳テンプレート当たりの発現されるレポータータンパク 質を、pBG/wt ELVSと比較してはるかに高いレベルで生じる。要約すれば、SIN-1 改変体株由来のプラスミドDNA発現ベクターの表現型は、野生型ウイルス由来ベ クターと比較して、比較的低レベルのRNA合成と組み合わさった同等の発現レベ ルという点で、親ウイルスに追随している。ベクターは、シンドビスウイルス構 造タンパク質を含有していないので、この表現型は、SIN-1ウイルス改変体の非 構造遺伝子にマップされるはずである。 実施例５ プラスミドDNA SIN-1由来発現ベクターの改変 アルファウイルスに基づくベクターからの標的細胞における異種遺伝子の発現 レベルは、宿主の属およびベクター構成を含むいくつかの要素によって影響され る。例えば、BHK細胞におけるβ-ガラクトシダーゼ発現レベルは、いくつかのヒ ト細胞（例えば、pBG/ELVSベクターでトランスフェクトされたHT1080）と比較し て、10〜100倍高い。pBG/wt ELVS 1.5-βgalプラスミドDNAでトランスフェクト したBHKおよびいくつかのヒト細胞株におけるレポーター遺伝子発現のレベル（ 実施例４を参照のこと）を、意図されるインビボ標的属由来の細胞型におけるベ クター特異的発現の相対的レベルを樹立するために比較した。pBG/wt ELVS 1.5- βgalプラスミド、または従来のプラスミド発現ベクターでトランスフェクトし たBHK細胞およびヒト線維肉腫株のHT1080(ATCC CCL 121)細胞における、β-ガラ クトシダーゼ発現のレベルを決定した。CMVプロモーター駆動pUC由来発現プラ スミドマルチクローニング部位(Invitrogen，San Diego，CA)へのlac Z遺伝子(P romega，Madison，WI)の挿入により、従来のプラスミドベクターを構築した。そ してこれはpCMV-β-galとして識別される。図12Aに示す本研究の結果は、pBG/wt ELVS 1.5-βgalプラスミドDNAでトランスフェクトしたHT1080細胞におけるβ- ガラクトシダーゼ発現のレベルは、BHK細胞と比較しておおよそ100倍低いことを 実証する。RNAポリメラーゼII発現をシンドビスウイルスベクターレプリコン発 現から分離するために、細胞をまた、pCMV-β-galでトランスフェクトした。こ の実験において、BHK細胞と比較して、pCMV-β-galプラスミドでトランスフェク トしたHT1080細胞における発現は５〜10倍減少したが、pBG/wt ELVS 1.5-βgal プラスミドDNAでトランスフェクトしたHT1080細胞における発現はおおよそ100倍 減少した。従って、この結果は、pBG/wt ELVS 1.5-βgalプラスミドDNAでトラン スフェクトしたHT1080細胞におけるレポーター遺伝子発現の劇的な減少は、部分 的に、これらのヒト細胞におけるシンドビスウイルスベクターレプリコンの減少 された活性によることを示す。 RNAアルファウイルスゲノムおよびBHK細胞におけるウイルスの増殖の全体的な 柔軟性を考慮すると、異種遺伝子の発現レベルがベクターが由来する宿主細胞株 において最も高いことは、驚くべきことではない。従って、比較的低いウイルス RNAレベルおよび同等なウイルス生成レベルと、宿主細胞タンパク質合成の阻害 の遅延または非存在を伴うことによって特徴付けられるSIN-1表現型（実施例１ および２に記載）を有するアルファウイルスの選択は、任意のヒト初代細胞、ま たは二倍体もしくは倍数体ヒト細胞において実施され得る。 最も密接にインビボで標的細胞に類似する細胞（例えば、ヒト）において所望 の表現型を有するアルファウイルスの選択に加えて、原型プラスミドDNA発現カ セット成分のいくつかの代替の改変が実施され得る。例えば、強力なCMV即時型( IE)プロモーターでのMoMLV RNAポリメラーゼIIプロモーターの置換は、トランス フェクト細胞における異種遺伝子発現のレベルを有意に増強する(Dubenskyら、J ．Vlrol．70:508-519，1996、およびDubenskyら、W/O 95/07994)。さらに、異種 遺伝子の上流または下流のいずれかでのイントロン（例えば、SV40スモールt抗 原またはCMVイントロンA）の並列は、いくつかのトランスフェクト細胞型にお いて異種遺伝子発現のレベルを増大し得る(Dubenskyら、前出)。 インビトロまたはインビボで、トランスフェクト細胞における発現全体を増強 するために、原型プラスミドDNA発現カセット成分のいくつかのさらなる代替の 改変もまた利用され得る。１つの改変において、B型肝炎ウイルス(HBV)転写後調 節エレメント(PRE)をpBG/wt ELVS 1.5-βgalプラスミドDNAに挿入した。PRE配列 は、HBV S転写産物の核から細胞質への輸送をシスで活性化する。PRE配列は、ス プライスドナーおよびアクセプター部位とは独立して機能するようであり、そし てイントロンを含まないβ-グロブリン転写産物の細胞質発現を活性化すること が示されている。シスにおけるPRE機能は、スプライシング経路と効率的に相互 作用しないために、核から十分に輸送されない核転写産物の輸送を可能にすると 提案されている(Huangら、Molecular and Cellular Biology 15:3864-3869，199 5)。 PRE配列を、最初にPCR生成されたHBVの564bpフラグメントをADWウイルス株のp AM6(ATCC No．39630)全長ゲノムクローンから単離することにより、pBG/SIN-1 E LVS 1.5-βgalにクローン化した。増幅フラグメントは、HBVゲノムの塩基1238〜 1802にわたる。プライマー配列を以下に示す。正方向プライマー：NTPRE1238F （配列番号46） 逆方向プライマー：EAPRE1802R（配列番号47） プライマーは、フラグメントの5'末端にNot I認識部位および3'末端にEae I認 識部位を導入する。Not IおよびEae Iは、適合性の粘着末端を有する。Eae I認 識部位はNot I部位に内在するので、Eae Iは、両方の部位を切断する。 PCRフラグメントをEae Iで消化し、そしてNot I消化/CIAP処理pBG/wt ELVS 1. 5-βgalにクローン化した。正確なクローンはPREの5'末端にNot I部位を保有し 、そしてこれをpBG/wt ELVS/PRE 1.5-βgalと呼ぶ。 ELVSプラスミドに含まれるPRE配列の、トランスフェクト細胞における異種遺 伝子発現への可能な効果を決定した。簡潔には、BHKおよびHT1080細胞を12mmデ ィッシュ中で75％コンフルエンスまで培養し、そしてLipofectamine(GIBCO-BRL ，Gaithersburg，MD)で複合体化した500ngのpCMV-β-gal、pBG/wt ELVS 1.5-βg al、またはpBG/wt ELVS/PRE 1.5-βgalプラスミドDNAでトランスフェクトし、そ してβ-ガラクトシダーゼ発現のレベルを48時間後に決定した。トランスフェク ション効率を、実施例４に記載のように、トランスフェクト単層の直接的なXgal 染色によって決定した。そして以下の表に示す。 この結果は、ELVSプラスミドでトランスフェクトされ、βガラクトシダーゼを発 現するBHKまたはHT1080細胞の数が、ベクター中にRNA輸送PRE配列を含ませるこ とにより、劇的に増大したことを明らかに実証する。さらに、これらの結果は、 ELVISプラスミドDNAでトランスフェクトしたBHK細胞に比較して、HT1080細胞に おいて減少された異種遺伝子発現レベルの１つの原因が、１次転写産物の核から の非効率的な輸送であることを示す。 PRE配列を含むELVSプラスミドでトランスフェクトされ、レポータータンパク 質を発現するHT1080細胞のより高い頻度に類似して、PRE配列を含むELVSベクタ ーでトランスフェクトされたHT1080細胞からの溶解物において、β-ガラクトシ ダーゼのレベルは劇的により高かった。これらの結果を図12Bに示し、そして上 の表に示した結果と一緒に、ELVSプラスミドでトランスフェクトされたヒト細胞 において、機能的ベクターレプリコンが核から非効率的に輸送されることを実証 する。さらに、ELVSプラスミド構築にPRE配列を含ませることにより、試験した 全ての細胞において異種遺伝子発現のレベルが増大する。これは、細胞質ベクタ ーレプリコン輸送の効率と、全体の異種遺伝子発現レベルとの間の明らかな相関 を実証する。 非スプライシングRNAの輸送にシスで作動する、いくつかの他のウイルス配列 エレメントもまた同定した。例えば、メイソン−パイツァーサルウイルス(MPMV) ゲノムの3'末端の近くのnts8022と8240との間に位置する219bp配列が、Rev非依 存性ヒト免疫不全症ウイルス１型(HIV-1)複製を可能にすることを示した(Brayら 、PNAS 91:1256-1260，1994)。全長ゲノムクローンテンプレート(Sonigoら、Cel l45:375-385，1986)またはMPSVサブゲノムクローンpGEM7FZ(-)MPSV 8007-8240(D .Rekosh，Ham-Rek Laboratories，SUNY at Buffalo，304 Foster Hall，Buffalo ,New York)からPCR生成されたMPSVの2l9bpフラグメントを最初に単離することに より、構成的輸送エレメント(CTE)として知られるMPMV RNA輸送エレメントを、p BG/SIN-1 ELVS 1.5-βgalプラスミドに挿入する。増幅されたフラグメントは、M PSVゲノムの塩基8022〜8240にわたる。プライマー配列を以下に示す。正方向プライマー：NMPVM8021F （配列番号48） 逆方向プライマー：EMPMV8241R（配列番号49） プライマーは、フラグメントの5'末端にNot I認識部位および3'末端にEae I認 識部位を導入する。Not IおよびEae Iは、適合性の粘着末端を有する。Eae I認 識部位はNot I部位に内在するので、Eae Iは、両方の部位を切断する。 PCRフラグメントをEae Iで消化し、そしてNot I消化/CIAP処理pBG/wt ELVS 1. 5-βgalにクローン化した。正確なクローンはPREの5'末端にNot I部位を保有し 、そしてこれをpBG/wt ELVS/CTE 1.5-βgalと呼ぶ。 HBV PREおよびMPSV CTE配列に加えて、他のウイルスまたは細胞供給源由来の いくつかのRNA輸送エレメントがELVSプラスミド構築物に上記のように挿入され 得る。例えば、これらのいくつかのエレメントは、HIV Rec応答エレメント(Mali mら、Nature，338:254-257，1989)、HTLV 1 Rexエレメント(Ahmedら、Genes Dev .4:1014-1022，1990)、およびサルレトロウイルス１型由来の別のシス作用配列( Zolotukhinら、J．Virol.，68:7944-7952，1994)を含む。さらに、上記のRNA輸 送エレメントの各々はまた、実施例６および７に記載される構造タンパク質発現 カセット、パッケージング細胞株、またはプロデューサー細胞株に組込まれ得る 。 原型ELVSベクターのなお別の改変において、アルファウイルスレプリコンの発 現を、RNAポリメラーゼIプロモーターから駆動させ得る。簡潔には、RNAポリメ ラーゼIプロモーターは組織特異性ではなく、そして本質的に身体の全てのヒト 細胞において発現されるので、これらはトランスフェクト細胞におけるプラスミ ドDNA指向アルファウイルスレプリコン発現のための魅力的な代替物を提供する 。例えば、ヒトrDNAプロモーター（プラスミドprHU3、LearnedおよびTjian，J.M ol.Appl．Gen.，1:575-584，1982）は、異種遺伝子発現のためのベクターを構築 するために使用されている(Palmerら、Nuc．Acids Res．21:3451-3457，1993)。 従って、本発明の１つの実施態様において、トランスフェクトされた細胞にお いて転写される最初のヌクレオチドが、真のアルファウイルス5'末端に対応する ように、RNAポリメラーゼIプロモーターをレプリコンcDNAの5'末端に並列させ得 る。転写開始が生じるRNAポリメラーゼIプロモーター（例えば、プラスミドprHU 3）ヌクレオチドの同定は、以前記載されたように決定される(Dubenskyら、W/O 95/07994)。 シンドビスウイルス野生型またはSIN-1 nsP、または任意のアルファウイルス 由来のnsP遺伝子を含むELVS構築物を用いて、本明細書中に記載される全ての改 変を実施し得る。例えば、実施例５において提供された全ての構築物もまた、実 施例４に構築が記載されるプラスミドpBG/SIN-1 ELVS 1.5-βgalを用いて実施し 得る。 実施例６ アルファウイルスパッケージング細胞株の構築 本発明において、アルファウイルスパッケージング細胞株(PCL)が提供される 。 これにより、RNAパッケージングおよび組換えアルファウイルスベクター粒子の 形成に必要なウイルス由来構造タンパク質が、１つ以上の安定に形質転換される 構造タンパク質発現カセット（単数または複数）によりコードされる。これらの タンパク質の合成は、好ましくは誘導様式で生じ、そして特に好ましい実施態様 において、それらのネイティブな「連結領域」プロモーターからのサブゲノムmR NAの転写を介して生じる。誘導性サブゲノム転写は、導入アルファウイルスベク ターRNA自体により媒介される（図13）。構造タンパク質発現カセット（単数ま たは複数）からの１次転写に続き、ベクターにコードされた非構造タンパク質に よりRNA転写産物の細胞質性増幅が開始され、そして最終的に連結領域プロモー ターからの転写および高レベル構造タンパク質発現に導く。構造タンパク質発現 カセットは、本発明において以前記載された任意のエレメントを含み、RNA輸送 エレメント（例えば、HBV PREおよびMPMV CTE）およびスプライシング配列を含 み得る。PCT出願WO 95/07994に記載される方法を用いて、または本発明に記載さ れる新規なアプローチを用いて、このようなPCLおよびこれらの安定に形質転換 される構造タンパク質発現カセットを誘導し得る。PCLは、哺乳動物および非哺 乳動物の両方の細胞を含む、現存するほとんどいかなる親の細胞株に由来し得る 。PCLの誘導のために好ましい実施態様は、ヒト起源の細胞株である。 Ａ．ベクター誘導性アルファウイルスPCLの構築 例えば、アルファウイルス構造タンパク質発現カセットを構築した。これによ り、CMV即時型プロモーターからの１次転写は、効率的な細胞質性増幅、および ベクターRNAからの非構造レプリカーゼタンパク質の翻訳後のみの構造タンパク 質発現を可能にするRNA分子を生成する。詳細には、DNAに基づくシンドビス欠陥 ヘルパー(DH)ベクターのプラスミドpDCMV-dlnsPSIN(Dubenskyら、J．Virol．70: 508-519，1996)を、3'末端RNAプロセシングのためにδ型肝炎ウイルス(HDV)抗ゲ ノムリボザイム配列(PerottaおよびBeen，Nature 350:434-436，1991)、および 非構造タンパク質遺伝子欠失の領域中に挿入されたSV40スモールt抗原イントロ ンの両方を含むように改変した。HDVリボザイム配列の挿入に伴う制限部位の重 複により、Dubenskyら（同書）からのさらなるプラスミドpDLTRSINgHDVを出発物 質として用いて、改変CMVに基づくDH構築物を再構築した。プラスミドpDLTRSINg HDVはHDVリボザイムを含むLTRに基づくシンドビスゲノムクローンであり、これ をBgl IIで消化して、存在するLTRプロモーターおよびシンドビスヌクレオチド １〜2289（Straussら、Virology 133:92-110，1984に従う番号づけ）を除去し、 ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、そしてGENECLEAN IITM(Bio101，San D iego，CA)を用いて0.7％アガロースゲルから精製した。シンドビスゲノムクロー ンpDCMVSINg（Dubenskyら、同書）のBgl II消化およびGENECLEAN IIを用いる１ ％アガロースゲルからの精製により、CMVプロモーターを有する対応する5'末端 フラグメントを得、次いでBgl II欠失pDLTRSINgHDVベクターに連結して、構築物 pDCMVSINgHDVを生成した。HDVリボザイムを有するこのCMVに基づくゲノムプラス ミドは、感染性シンドビスウイルスを生成し、そしてBHK細胞へのトランスフェ クト後の24時間以内に細胞変性効果を生じることを示した。次いで、HDVリボザ イムを含む欠陥ヘルパープラスミドpDCMVdlnsPSINgHDVを、BspE I消化および希 釈条件下での再連結により構築し、ヌクレオチド422と7054との間の非構造遺伝 子配列を除去した。同時に、SV40イントロンをPCRにより合成し、非構造タンパ ク質遺伝子欠失の領域に挿入した。SV40イントロン配列の増幅を、テンプレート としてプラスミドpBR322/SV40(776株、ATCC #45019)および隣接BspE IまたはBam H I部位を含むように設計した以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、3 0秒間の伸長時間を有する標準的な３サイクルPCRにより達成した。正方向プライマー：BspSVSDF（5'-制限部位/SV40イントロン配列） (配列番号50) 逆方向プライマー：BamSVSAR（5'-制限部位/SV40イントロン配列）(配列番号51) 増幅に続いて、DNAフラグメントをQIAquick-spin PCR精製キット(Qiagen，Cha tsworth，CA)を用いて精製し、BspE IおよびBam HIで消化し、MerniaidTM(Bio10 1,San Diego，CA)を用いて1.2％アガロースゲルから精製し、そして欠陥ヘルパ ープラスミドpDCMV-dlnsPSIN（これもまたBspE IおよびBam HIで消化し、ウシ腸 アルカリホスファターゼで処理し、そしてGENECLEAN IIを用いて0.7％アガロー スゲルから精製した）に連結し、構築物pDCMV-intSINrbz（図14）を生じた。プ ラスミドの別の部分にSV40プロモーター駆動ネオマイシン耐性選択マーカーをま た含むプラスミドpDCMV-intSINrbzを、LipofectamineTM(Gibco/BRL，Gaithersbu rg，MD)を用いて、製造者によって記載されるようにBHK細胞にトランスフェクト した。トランスフェクトの約24時間後、細胞をトリプシン処理し、そして600μg /ml G418（ネオマイシン）を含む培地に再プレートした。培地を定期的に新鮮な G418含有培地に交換し、そして耐性細胞のフォーカスを増殖させた。細胞をトリ プシン処理し、そして96ウェル組織培養ディッシュへの限界希釈によりクローン 化し、そして個々の細胞クローンを増殖させそしてスクリーニングのために拡大 した。 個々のクローンについてのポジティブなパッケージング活性を、ルシフェラー ゼレポーター遺伝子（Dubenskyら、同書に記載）を発現するシンドビスベクター RNAでのLipofectinTM(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)トランスフェクション、ト ランスフェクションの約24時間後の培養上清を採取すること、およびパッケージ 化シンドビス−ルシフェラーゼベクター粒子の存在についてアッセイすることに より同定した。さらに、最初のトランスフェクションレベルを、レポーター溶解 緩衝液(Promega，Madison，WI)を用いてトランスフェクト細胞溶解物を採取する こと、および製造者によって記載されるようにルシフェリン基質(Promega)を用 いてルシフェラーゼ活性の存在について試験することにより決定した。培養上清 におけるパッケージ化ベクター粒子についてアッセイするために、１mlの希釈し ていない、明澄化上清を使用して新鮮なBHK細胞単層を約18時間感染させた。次 いで、細胞を上記のように溶解し、そしてルシフェラーゼ活性を決定した。感染 BHK細胞におけるルシフェラーゼ活性の存在は、トランスフェクト細胞上清にお けるパッケージ化ベクター粒子を確認した。pDCMV-intSINrbz構造タンパク質発 現カセットの組み込まれたコピーを保有し、そしてPCLとして機能するいくつか のポジティブ細胞クローンを同定した。群の代表的な２つの個々のPCLクローン( #10s-19および#10s-22)のパッケージング化データを図15に示す。さらに、生成 されたパッケージ化ベクター粒子の力価を、個々のPCLクローン(#10s-22)をSIN- β-galベクターRNA（Dubenskyら、同書に記載）でトランスフェクトすることに より決定した。培養上清をトランスフェクションの48時間後に回収し、0.45mmフ ィルターの通過により明澄化し、そして新鮮なBHK単層を上清の10倍希釈で感染 させた。トランスフェクションの約14時間後、細胞をPBSで洗浄し、２％ホルム アルデヒドで固定し、PBSで再び洗浄し、そしてX-galで染色した。次いで、ベク ター粒子ユニットを、個々の青色染色細胞の計数により決定した。このPCLクロ ーンからのパッケージ化β-galベクター力価は、上清の約106感染ユニット/mlで あった。シンドビス構造タンパク質発現のベクター制御誘導性を、構造タンパク 質に対して特異的なポリクローナルウサギ抗血清を用いて、ウェスタンブロット 分析により実証した。ポジティブ10s-22 PCLおよびネガティブコントロールBHK 細胞溶解物を、SIN-β-galベクターRNAでのトランスフェクションの前(U；非誘 導)か、または後(I；誘導)のいずれかでLameliサンプル緩衝液中で作製した。図 16に示すように、ベクターRNAでのトランスフェクションの後に、シンドビス構 造タンパク質の発現を示した細胞溶解物は、10s-22PCLクローンのみであった。 キャプシドタンパク質とエンベロープ糖タンパク質との間の発現の見かけ上のレ ベルの差異は、作製された実際のタンパク質の量か、またはこの特定の実験のた めに使用した細胞溶解手順におけるエンベロープ糖タンパク質のより低い安定性 のいずれをも反映しない。 CMVに基づくDH構築物のパッケージング活性はまた、非哺乳動物細胞（例えば 、C6/36蚊細胞）においても高い効率であった。PCLの誘導のためのこのような非 哺乳動物の親の細胞型の使用は、PCLがベクタープロデューサー細胞株の生成の ための出発物質としての後の使用のために意図される場合に、特に有利であり得 る。この細胞型の利点は、宿主巨大分子合成の阻害、および細胞変性効果(CPE) を生じる、哺乳動物細胞に伴う表現型を有さずに、アルファウイルスの持続感染 を樹立する天然の能力である。従って、適切な選択マーカーを有するDNAに基づ くアルファウイルスベクター（実施例４および５）が、蚊または他の非哺乳動物 細胞 由来のPCLに安定に形質転換され得る。図17Aは、CMVプロモーターの制御下でDNA に基づくルシフェラーゼレポーターベクターおよびシンドビス構造タンパク質を 発現するDHヘルパーベクターの両方が、ルシフェラーゼベクターパッケージング により実証されるように、C6/36細胞において完全に機能性であったことを示す 。 Ｂ．作動可能に連結された選択マーカーを有するPCLの構築 本発明の他の実施態様において、選択マーカーをアルファウイルス構造タンパ ク質発現カセットの転写に作動可能に連結した。好ましい実施態様において、こ の作動可能な連結を、残りのnsP1アミノ酸との融合物としてのマーカーの非構造 タンパク質遺伝子欠失の領域への挿入、または内部リボソーム侵入部位(IRES)配 列の翻訳制御下での構造タンパク質遺伝子の下流への挿入のいずれかによって達 成する。再び、一次構造タンパク質遺伝子mRNA転写産物の増幅および構造タンパ ク質発現の誘導を、インプットベクターRNA分子および合成されたその非構造タ ンパク質により制御する。 詳細には、構造タンパク質発現カセットの構築のために、プラスミドpBGS131( Sprattら、Gene 41:337-342，1986;ATCC #37443)を改変して外来性配列を除去し 、そしてカナマイシン耐性遺伝子中に存在するXho I部位を非機能性にした。プ ラスミドpBGS131をXho Iで消化し、そしてXho I適合性末端を有する合成２本鎖 オリゴヌクレオチドリンカーをこの部位に連結した。以下に示す合成12マーオリ ゴヌクレオチドを、それ自体にアニールして連結のためのXho I粘着末端を生じ る部分的パリンドロームとして設計し、そして４つのインフレームのアミノ酸を 挿入することにより、カナマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレームを 維持した。dIXho リンカー （配列番号52） このオリゴヌクレオチドの挿入は、Xho I部位欠失プラスミドを生じ、これをp BGS131dlXhoIと命名した。次に、このプラスミドをBspH Iで消化し、希釈条件下 で自己に連結し、ColE1レプリコンとカナマイシン耐性マーカーとの間の829bpの 外来性配列を除去し、プラスミドpBGS131d1Bを生成した。次に、pBGS131dlBをBs pH Iで消化することによりBspH I部位をPac I部位に変換し、Klenow酵素およびd NTPで末端を平滑にし、そして過剰のPac Iリンカーと連結した。Pac I リンカー （配列番号53） pBGS131dlB-Pと呼ばれるこの新しい構築物を、Fsp IおよびPvu IIで消化する ことにより、マルチクローニング部位(MCS)を含むさらなる472bpを除去し、そし てGENECLEAN IIを用いて残りのベクターを１％アガロースゲルから精製すること により、さらに改変した。置換MCSを、２つの相補的オリゴヌクレオチドPME.MCS IおよびPME.MCSIIをアニーリングし、そして線状化プラスミドと連結することに より、改変ベクターに挿入した。PME.MCSI （配列番号54） PME.MCSII（配列番号55） 約2475bpの新しいクローニングベクターをpBGSVGと命名し、そしてこれは以下 のマルチクローニング部位を含んでいた：＜Pme I-Bgl II-Xho I-Not I-EcoR I- Pme I＞。作動可能に連結された選択マーカーを含む構造タンパク質発現カセッ トの挿入を、段階的に、以下のように行った。シンドビスウイルスの3'末端、合 成A40路、抗ゲノムHDVリボザイム、およびBGH転写終結シグナルを含むDNAフラグ メントを、Not IおよびEcoR Iでの消化およびGENECLEAN IIを用いる１％アガロ ースゲルからの精製により、プラスミドpBG/SIN-1 ELVS 1.5（実施例５）から取 り出した。プラスミドpBGSVGもまた、Not IおよびEcoR Iで消化し、GENECLEAN I Iを用いて１％アガロースゲルから精製し、そして精製3'末端/A40/HDV/BGHフラ グメントと連結し、構築物pBGSV3'を生成した。次に、構造タンパク質遺伝子お よび非構造タンパク質をコードする領域の大部分を含む約9250bpのシンドビスcD NAフラグメントを、Bgl IIおよびFsp Iでの消化により、プラスミドpDLTRSINg(D ubenskyら、同書)から取り出し、そしてGENECLEAN IIを用いて0.7％アガロース ゲルから精製した。次いで、シンドビスcDNAフラグメントを、プラスミドpBGSV3 '（これもまた、Bgl IIおよびFsp Iで消化し、アルカリホスファターゼで処理し 、そしてGENECLEAN IIを用いて0.7％アガロースゲルから精製した）に連結した 。新たな構築物をpBGSV3'BFと命名した。続いて、この構築物をBgl IIで消化し 、アルカリホスファターゼで処理し、そしてGENECLEAN IIで残りの5'末端および 非構造遺伝子配列ならびにCMV IEプロモーターの挿入のために精製した。残りの 配列を、Bgl IIでのプラスミドpDCMVSINg(Dubenskyら、同書)の消化、GENECLEAN IIを用いる１％アガロースゲルからのフラグメントの精製、および線状pBGSV3' BFベクターとの連結により得、CMV駆動シンドビスゲノム構築物であるpBGSVCMVg enを作製した。この構築物のシンドビスウイルス複製サイクルの開始についての 機能性を、pBGSVCMVgenプラスミドのBHK細胞へのLipofectamine媒介トランスフ ェクションおよびトランスフェクト後24時間以内のCPEの観察により決定した。 続いて、プラスミドpBGSVCMVgenを使用し、ほとんどの非構造タンパク質遺伝 子を欠失させ、そしてnsP1オープンリーディングフレームの残りのコドンとのイ ンフレーム融合物としてネオマイシン耐性遺伝子を挿入することにより、DH構造 タンパク質発現カセットを構築した。簡潔には、隣接するBspE IおよびBamH I部 位を含むように設計した以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ネオマ イシン耐性遺伝子をpcDNA3ベクター(Invitrogen，San Diego，CA)から標準的な ３サイクルPCRにより増幅した。正方向プライマー：NEO5'FUSE（5'-制限部位/neo遺伝子） （配列番号56） 逆方向プライマー：NEO3'BAM（5'-制限部位/neo遺伝子）（配列番号57） 増幅後、DNAフラグメントをQIAquick-spinを用いて精製し、BspEIおよびBamHI で消化し、GENECLEAN IIを使用して精製し、そしてプラスミドpBGSVCMVgen（Bsp EIおよびBamHIで同様に消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてGENEC LEAN IIを使用して0.7％アガロースゲルから精製した）に連結した。生じた構築 物をpBGSVCMVdlneoと命名した。そしてこれを図14において模式的に示す。pBGSV CMVdlneoの構成は、構造タンパク質発現カセットの一部として、そして同じCMV プロモーターによって制御される、開始メチオニンおよびnsP1のアミノ末端の12 1アミノ酸ならびにメチオニン開始コドンおよび次の10のアミノ酸を欠失するネ オマイシン耐性遺伝子を含む融合タンパク質を含む。 プラスミドpBGSVCMVdlneoを、製造者によって記載されるようにLipofectamin を使用して、BHK細胞へトランスフェクトした。トランスフェクション約24時間 後、細胞をトリプシン処理し、そして600μg/mlの薬物G418（ネオマイシン）を 含有する培地中に再びプレートした。培地を、新たなG418含有培地で定期的に交 換し、そして耐性細胞のフォーカスを増殖させた。細胞をトリプシン処理し、そ して96ウェル組織培養ディッシュ中で限界希釈によってクローニングし、そして スクリーニングのために個々の細胞クローンを増殖させ、そして拡大させた。 個々のクローンについて、ポジティブパッケージング活性について、シンドビス ルシフェラーゼベクターRNAをトランスフェクトし、そして先の節において記載 されたようにパッケージングされたシンドビスルシフェラーゼベクター粒子の存 在についてアッセイすることによって同定した。組み込まれたpBGSVCMVdlneo構 造タンパク質遺伝子発現カセットのコピーを有し、そしてPCLとして機能するい くつかのポジティブ細胞クローンを同定した。群を代表する個々のクローン（F1 1、F13、F15）についての、ならびに上記の10s-22 PCL株のSNBSTM-ルシフェラー ゼベクターパッケージングデータを図18に示す。 シンドビス−ルシフェラーゼベクターを用いた機能的なパッケージング活性を 実証することに加えて、同じPCLを使用して行ったさらなる実験もまた、他のア ルフアウイルス由来のベクターもまた、パッケージングされ得ることを示した。 例えば、β-ガラクトシダーゼを発現するシンドビス（Dubenskyら、同書）およ びセムリキ森林（pSFV3-lacZ；GIBCO BRL Gaithersburg，MD）ベクターRNAの両 方を、F15パッケージング細胞株へトランスフェクトした。トランスフェクショ ンの約48時間後、培養上清を採取し、明澄化し、連続的に希釈し、そしてベクタ ー粒子力価の測定のために、新鮮なBHK細胞単層に感染するために使用した。感 染18時間後、上記のようにBHK細胞を固定し、X-galで染色し、そして青色染色細 胞を数えた。シンドビスβ-galについて得たベクター力価は、約５×106IU/mlで あったが、SFVβ-galについての力価は約４×106IU/mlであった。これらのデー タは、２つの異なるアルファウイルスおよびそれらに対応するベクターが、類似 のパッケージングシグナルを有すること、および本明細書中で記載されるシンド ビス系のために誘導したPCLが別のアルファウイルスとともに使用された場合、 十分に機能的であることを実証する。 pBGSVCMVdlneo構築物のパッケージング活性もまた、ヒト起源の細胞（例えば 、293細胞）において非常に効率的であった。PCLの誘導のために、このようなヒ トの親細胞型の使用は、相補的な耐性組換えアルファウイルス粒子の生成におい て特に有利であり得る。図17Bは、RNAに基づくルシフェラーセリポーターベクタ ーおよびDNAに基づくルシフェラーゼベクターの両方が、BHK細胞へのルシフェラ ーゼ発現の上清移入によって示されたように、G418耐性pBGSVCMVdlneo形質転換2 93PCL中へのトランスフェクション後、効率的にパッケージングされたことを示 す。 別の選択可能な薬物耐性マーカーもまた、そのＮ末端で残りのnsP1アミノ酸を 有する融合タンパク質として、類似のPCL構成において機能することが示された 。簡略には、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ハイグロマイ シン耐性マーカー、hygror）を、存在するネオマイシン耐性マーカーの代わりに 、プラスミドpBGSVCMVdlneo中に置換した。hygror遺伝子を、隣接するEcoRVおよ びBamHI部位を含むように設計された以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使 用して、プラスミドp3'SS（Stratagene、La Jolla，CA）から標準的な３サイク ルPCRによって増幅した。正方向プライマー：5'HYGROEV（5'制限部位／hygro遺伝子） （配列番号112） 逆方向プライマー：3'HYGROBA（5'-制限部位／hygro遺伝子）（配列番号113） 増幅後、DNAフラグメントをQIAquick-spinで精製し、EcoRVおよびBamHIで消化 し、GENECLEANを使用して精製し、そしてプラスミドpBGSVCMVdlneo（BspEIで消 化し、Klenowで平滑末端化し、さらにBamHIで消化し、アルカリホスファターゼ で処理し、そしてGenecleanを使用して0.7％ゲルから精製した）に連結した。生 じた構築物をpBGSVCMVdlhygと命名した。 プラスミドpBGSVCMVdlhygを、製造者によって記載されるようにLipofectamine を使用して、BHK細胞へトランスフェクトした。トランスフェクトの約24時間後 、細胞をトリプシン処理し、そして1.2mg/mlの薬物ハイグロマイシン（Boehring er Mannheim）を含有する培地中に再びプレートした。培地を、新鮮なハイグロ マシン含有培地で定期的に交換し、そして耐性細胞のフォーカスをプールに増殖 させた。選択されたパッケージング細胞の機能性を、シンドビスルシフェラーゼ ベクターRNAでトランスフェクトし、そして先の節で記載されたように、パッケ ージングされたシンドビス−ルシフェラーゼベクター粒子の存在についてアッセ イすることによって実証した。これらのパッケージング実験からのポジティブな 結果を図39において示す。 代替のパッケージング細胞株において、構造タンパク質発現カセット、選択マ ーカー（この場合ではネオマイシン耐性）を、シンドビス構造タンパク質遺伝子 の下流に、内部リボソーム侵入部位（IRES）の翻訳制御下で挿入した。従って、 ネオマイシン耐性をコードするmRNAの転写は、ゲノムレベル（RSVプロモーター から）およびまたサブゲノム連結領域プロモーターからの両方で生じる。この構 築物にとって独特なさらなる特徴は、一次転写のためのラウス肉腫ウイルス（RS V）LTRプロモーターおよびシンドビス欠陥干渉RNAクローンDI25（MonroeおよびS chlesinger、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80:3279-3283、1983）由来のtRNAAsp 5'末端配列を含む。この特定のPCL発現カセット構成は、987DHBBNeoと命名され た。そしてこれを図14において模式的に示す。詳細には、プラスミド987DHBBNeo を、開始物質として、改変されたプラスミドベクターpBGS131dlB-P（上記）を使 用し て段階的に構築する。連結領域プロモーター、構造タンパク質遺伝子配列、およ び3'非翻訳領域＋ポリAを含むcDNAフグメントを、全長シンドビスcDNAクローンp RSINg（Dubenskyら、同書）のBamHIおよびXbaIでの消化、ならびにGENECLEAN II を使用する0.7％アガロースゲルからの精製によって得る。シンドビスcDNADNAフ ラグメントを、プラスミドベクターpBGS131dlB-P（これはまたBamHIおよびXbaI で消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてGENECLEAN IIを使用して0. 7％アガロースゲルから精製した）で連結し、構築物pBGSINspを生成した。 次いで、SV40初期領域由来の転写終結シグナルを、pBGSINspのSacI部位とEcoR I部位との間、シンドビス配列の直ぐ下流に挿入する。初期領域転写終結配列を 含む、SV40ウイルスヌクレオチド2643〜2563を、以下に示すプライマー対および テンプレートとしてpBR322/SV40プラスミド（ATCC#45019）を使用するPCR増幅に よって単離する。正方向プライマー：FSVTT2643（5'-制限部位／SV40nts2643〜2613）（配列番号5 8） 逆方向プライマー：RSVTT2563（制限部位／SV40nts2563〜2588）（配列番号59） プライマーを、30秒間の伸長時間を有する標準的な３サイクルPCRで使用する 。増幅産物をQIAquick-spinで精製し、SacIおよびEcoRIで消化し、Mermaid kit で再び精製し、そして90bpフラグメントを、プラスミドpBGSINsp（同様にSacIお よびEcoRIで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてGENECLEAN IIを 使用して0.7％アガロースゲルから精製した）に連結する。この構築物は、pBGSI NspSVとして識別される。 次いで、DI tRNAAsp構造を含むRSVプロモーターおよびシンドビス5'末端配列 を重複PCRによって構築し、そして完全なフラグメントを構造タンパク質遺伝子 ベクターpBGSINspSV中へ挿入する。PCR反応#1において、RSVプロモーターフラグ メ ントを、一方のプライマー中に隣接BglII部位および他方のプライマー中にtRNA5 '末端に重複する配列もまた含むように設計された、以下のオリゴヌクレオチド プライマーを使用して、１分間の伸長を有する標準的な３サイクルPCRによって 増幅する。シンドビスtRNA 5'末端をRSVプロモーター転写開始部位にすぐに隣接 して配置する。正方向プライマー：5'RSVpro（5'-制限部位／RSV配列） （配列番号60） 逆方向プライマー：3'RSVtR（5'-Sin tRNA配列/RSV配列）（配列番号61） PCR反応#2において、一方のプライマー中に隣接するBamHI部位および他方のプ ライマー中に3'RSVtRプライマーに重複する配列もまた含むように設計された以 下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、１分間伸長を有する標準的な３ サイクルPCRによって、テンプレートプラスミドTotol101(5'tRNAAsp)（Bredenbe ekら、J．Virol．67:6439-6446，1993）からシンドビス5'末端ならびにtRNA配列 を増幅する。正方向プライマー：5'tRNASin（5'-シンドビス+tRNA配列のみ） （配列番号62） 逆方向プライマー：3'SinBam（3'-制限部位／シンドビス配列）（配列番号63） 増幅後、DNAフラグメントをQIAquick-spinで精製し、そしてさらなる5'RSVpro および3'SinBamプライマーを使用して２分間伸長を有する後続の３サイクルPCR 反応中でテンプレートとして一緒に使用する。生じる重複PCRアンプリコンをGEN ECLEAN IIを使用して精製し、BglIIおよびBamHIで消化し、そしてプラスミドpBG SINspSV（またBglIIおよびBamHIで同様に消化し、アルカリホスファターゼで処 理し、そしてGENECLEAN IIを使用して0.7％アガロースゲルから精製した）中ヘ 連結した。生じる構造タンパク質発現性の、欠陥ヘルパーを987DHBBと命名する 。 次いで、脳心筋炎ウイルス（EMCV）由来のIRES配列を、選択マーカーとしての ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の直ぐ上流に重複PCRによって配 置し、そして完全なアンプリコンを987DHBBのNslI部位中に挿入する。NsiI部位 での挿入は、選択マーカーを構造タンパク質ORFの直ぐ下流に配置する。PCR反応 #1において、EMCV IRESフラグメント（ヌクレオチド260〜827）を、一方のプラ イマーに隣接NsiI部位および他方にneo遺伝子に重複する配列もまた含むように 設計された以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、30秒間の伸長を有 する標準的な３サイクルPCRによって、テンプレートプラスミドpBS-ECAT（Jang ら、J．Virol 63:1651，1989）から増幅する。正方向プライマー：5'EMCVIRES（5'-制限部位／EMCV配列） （配列番号64） 逆方向プライマー：3'EMCVIRES（5'-pcDNA+neo配列/EMCV配列）（配列番号65） PCR反応#2において、neo耐性マーカーを、一方のプライマーに隣接NsiI部位お よび他方に3'EMCVIRESプライマーに重複する配列もまた含むように設計された以 下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、1.5分間の伸長を有する標準的 な３サイクルPCRによって、テンプレートプラスミドpcDNA3（Invitrogen，San D iego，CA）から増幅する。正方向プライマー：5'Neo/pcDNA（5'-pcDNA+neo配列のみ） （配列番号66） 逆方向プライマー：3'Neo/pcDNA（3'制限部位/neo配列）（配列番号67） 増幅後、DNAフラグメントをQIAquick-spinを用いて精製し、そしてさらなる5' EMCVIRESおよび3'Neo/pcDNAプライマーを使用する、２分間の伸長を有する後続 の３サイクルPCR反応中でテンプレートとして一緒に使用する。生じる重複PCRア ンプリコンをGENECLEAN IIを使用して精製し、NsiIで消化し、そしてプラスミド 987DHBB（同様にNsiIで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてGENEC LEAN IIを使用して、0.7％アガロースゲルから精製した）に連結する。シンドビ ス3'非翻訳領域にIRESneo挿入物を有する、生じる構造タンパク質発現構築物を9 87DHBBNeoと命名する。 安定なパッケージング細胞株を作製するために、BHK細胞を10μgのプラスミド 987DHBBNeoで、標準的なリン酸カルシウム沈澱プロトコルを使用してトランスフ ェクトした。トランスフェクションの約24時間後、培地を、１mg/mlの薬物G418 を含有する新鮮な培地で置換した。さらに１日後、細胞をトリプシン処理し、そ して500μg/ml G418を含有する培地中で1/10密度で再びプレートした。さらに数 回の継代の後、細胞を希釈クローニングに供し、そして個々のクローンを拡張し た。個々のクローンのパッケージング細胞株として機能する能力を、プラスミド RSV/Sinrep/LacZ、β-galを発現するシンドビスDNAベクターでリン酸カルシウム トランスフェクションし、そして48時間後上清中でパッケージングされたベクタ ー粒子の存在についてアッセイすることによって測定した。パッケージングされ たベクターレプリコンをFrolovおよびSchlesinger（J．Virol．68:1721-1727，1 994）に記載されるCPEアッセイによって力価測定し、そして987DH-BBNeoと命名 されたパッケージングされた高い力価の粒子を与えるレプリコンをさらなる特徴 づけに使用した。パッケージングされたベクター力価を、いくつかの異なるトラ ンスフェクション技術を使用してRNAに基づくβgal発現シンドビスベクターまた はDNAに基づくβ-gal発現シンドビスベクターのいずれかのトランスフェクショ ン後48時間目に測定した。結果は以下のようであった： さらに、987DH-BB細胞株を用いてパッケージングされたSINrep/LacZ粒子を使 用して、続いて、新鮮なBHK細胞単層に感染させ、そしてRNAおよびタンパク質の 発現パターンを評価した。図19は、BHK細胞を１細胞当たり150感染性単位のMOI でのSINrep/LacZ粒子（レーン１および２）またはコントロールとして野生型シ ンドビスウイルス（レーン３）の２つの異なる調製物で感染させた後のRNAパタ ーンを示す。感染から７時間後、ダクチノマイシン（１μg/ml）および[3H]ウリ ジン（20μCi/ml）を添加し、続いて４時間後、Bredenbeekら（J．Virol．67:64 39-6446，1993）に従ってRNAを採取し、そして分析した。高いMOIを、可能性の ある組換え体を検出するために使用した。ゲルレーンの右側の横線は、シンドビ スおよび目的のβ-gal RNAを示す。最も高い分子量バンドは、レプリコンまたは ウイルスのゲノムRNAを示す（レーン１および２、SINrep/LacZ；レーン３シンド ビスウイルス）。次の２つの示されているRNAは、987DH-BBNeo PCL発現カセット のゲノムRNAおよび同一の987DH-BBNeo PCLカセット由来の誘導性サブゲノム構造 タンパク質mRNAである。後者の２つのバンドの存在は、パッケージング細胞株由 来のヘルパーゲノムRNAもまた同時パッケージングされることを実証する。次のR NAバンド（それらは、最も多量に存在する）は、SINrep/LacZ（レーン１および ２）またはシンドビスウイルスゲノム（レーン３）のいずれか由来のサブゲノム RNAである。 タンパク質分析を、パッケージングされたSINrep/LacZレプリコンを用いた20 感染性単位／細胞のMOIでのBHK21細胞の感染後に行った。感染から15時間後、細 胞を[35S]メチオニンで30分間標識し、溶解物を作製し、そしてタンパク質をSDS -PAGEによって分析した。図20（レーン２および３）に示すように、β-ガラクト シダーゼおよびシンドビスウイルスキャプシドタンパク質の両方が、ベクター粒 子感染細胞において標識されるが、非感染細胞においては標識されていない（レ ーン１）。キャプシドの存在は、パッケージングされた粒子のいくつかもまた、 PCL由来の構造タンパク質遺伝子RNA転写産物を含むことを示す。 Ｃ．「分割構造遺伝子」PCL構成の構築 本発明の他の実施態様において、PCLが提供される。ここで、アルファウイル ス構造タンパク質は、その天然の翻訳後プロセシングを有する単一のmRNA由来の ポリタンパク質として発現されず、むしろ複数のカセットを介して転写される独 立したmRNA由来の分離したタンパク質として発現される。このような構成は、複 製可能なまたは感染性ウイルスの形成を導く組換えまたは同時パッケージング事 象の可能性を非常に少なくする。好ましい実施態様において、キャプシドタンパ ク質は一つの安定に形質転換されたカセットから発現され、そしてエンベロープ 糖タンパク質は、第２の安定に形質転換されたカセットから一緒に発現され、そ して各々は、連結領域プロモーターからベクター誘導性様式で発現される（上記 ）。 例えば、シンドビスウイルスキャプシドタンパク質遺伝子を、隣接XhoI部位お よびキャプシドタンパク質遺伝子開始コドンまたは隣接Not I部位および翻訳停 止コドンを含むように設計された以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用し て、1.5分間の伸長を有する標準的な３サイクルPCRによって、プラスミドpDLTRS INg（Dubenskyら、同書）から増幅した。正方向プライマー：SIN5'CXho（5'-制限部位／キャプシド配列） （配列番号68） 逆方向プライマー：SIN3'CNot（5'-制限部位／停止コドン／キャプシド配列） （配列番号69） 増幅後、キャプシドDNAフラグメントをQIAquick-spinで精製し、XhoIおよびNo tIで消化し、GENECLEAN IIで精製し、そしてDNAに基づくシンドビス発現ベクタ ーpDCMVSIN-luc（Dubenskyら、同書）（ルシフェラーゼレポーター遺伝子挿入物 を除去するためにXhoIおよびNot Iで同様に消化し、アルカリホスファターゼで 処理し、そしてGENECLEAN IIを使用して0.7％アガロースゲルから精製した）に 連結した。生じたキャプシドタンパク質発現構築物を、pDCMVSIN-Cと命名した。 プラスミドpDCMVSIN-Cを続いてBspEIで消化し、ほとんどの非構造タンパク質遺 伝子配列を除去し、そして希釈条件下で自己に再び連結させて、DHベクター構築 物のpDCMVSINdl-Cを作製した。 プラスミドpDCMVSINdl-C（これはまた、ネオマイシン耐性カセットを含む）を 、製造者によって記載されるように、LiPfectaminを使用して、BHK細胞中へトラ ンスフェクトした。トランスフェクションから約24時間後、細胞をトリプシン処 理し、そして600μg/mlの薬物G418（ネオマイシン）含有培地中へ再びプレート した。培地を新鮮なG418含有培地で定期的に交換し、そして耐性細胞のフォーカ スを増殖させた。細胞をトリプシン処理し、そして96ウェル組織培養ディッシュ 中に限界希釈することによってクローン化し、そして個々の細胞クローンを増殖 させ、そしてスクリーニングのために拡張させた。ベクターの投入に応答して誘 導性にキャプシドタンパク質を発現した細胞を、シンドビスルシフェラーゼベク ターRNAをトランスフェクトし、トランスフェクション後の約15時間に細胞溶解 物を作製し、そしてウサギ抗シンドビスポリクローナル抗体を用いてウェスタン ブロット分析を行うことによって同定した。組み込まれたキャプシドタンパク質 遺伝子発現カセットのコピーを有し、そして誘導性にタンパク質を発現するを有 するいくつかのポジティブ細胞クローンを同定した。 「分割構造遺伝子」カセットの状況において、発現されたキャプシドの誘導性 および機能性の両方を実証するために、シンドビスウイルスエンベロープ糖タン パク質を発現したさらなる構築物、pDCMVSIN-lucから生成した。簡潔には、シン ドビスエンベロープ糖タンパク質遺伝子を、隣接XhoI部位および良好なKozak状 況における翻訳開始コドン、または隣接Not I部位および翻訳停止コドンを含む ように設計された以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、2.5分間の 伸長を有する標準的な３サイクルPCRによってプラスミドpDLTRSINgから増幅した 。正方向プライマー：5'GLYCO-X（5'-制限部位／開始コドン／糖タンパク質配列） （配列番号70） 逆方向プライマー：3'GLYCO-N（5'-制限部位／糖タンパク質配列）（配列番号71 ） 増幅後、糖タンパク質遺伝子DNAフラグメントを、QIAquick-spinで精製し、Xh oIおよびNot Iで消化し、GENECLEAN IIを使用して精製し、そしてDNAに基づくシ ンドビス発現ベクターpDCMVSIN-luc（ルシフェラーゼレポーター遺伝子挿入物を 除去するためにXhoIおよびNot Iで同様に消化し、アルカリホスファターゼで処 理し、そしてGENECLEAN IIを使用して0.7％アガロースゲルから精製した）に連 結した。生じた糖タンパク質発現構築物を、pDCMVSIN1.5PEと命名した。 図21は、２つの異なるクローン性のキャプシド株（9-3および9-9）細胞株のベ クター制御された誘導性を実証するウェスタンブロットである。これらをLipofe ctaminを使用して、エンベロープ糖タンパク質（1.5PEレーン）またはβ-ガラク トシダーゼレポーター、pDCMVSIN-β-gal（Dubenskyら、同書；1.5β-galレーン ）を発現するシンドビスDNAベクターでトランスフェクトしたか、または「偽」 トランスフェクトした（Ｍレーン）。細胞溶解物をトランスフェクションから48 時間後に作製し、SDS-PAGEによって分離し、そしてメンブレンに移した。ここで 、メンブレンを、シンドビス構造タンパク質およびβ-ガラクトシダーゼについ て特異的である抗体の組合せでプローブした。ブロットは、明らかに、い ずれかのベクターによって供給される非構造タンパク質に応答するキャプシドタ ンパク質の誘導性ならびにβ-ガラクトシダーゼおよびエンベロープ糖タンパク 質の発現を示す。「分割構造遺伝子」キャプシド細胞株の機能性（相補性および ベクター粒子パッケージングによる）をLipofectamineを使用してβ-ガラクトシ ダーゼおよびエンベロープ糖タンパク質ベクターをキャプシド細胞株中へ同時ト ランスフェクトし、そして培養上清中のパッケージングされた粒子についてアッ セイすることによって実証した。トランスフェクションの約48時間後に、上清を 採取し、そしてパッケージングアッセイおよびベクター力価の測定のために明澄 化した。さらに、細胞を、Lameliサンプル緩衝液を使用して溶解し、そしてポリ クローナルな抗シンドビス抗体を用いてウェスタンブロット分析によって調べた 。これは、キャプシドタンパク質およびベクター供給エンベロープタンパク質の 両方の発現を実証した。次いで、上清を、約18時間天然のBHK細胞に感染させ、 そして本実施例において上記のようにβ-galレポーター遺伝子発現のために染色 することによって、パッケージングされたベクター粒子の存在について試験した 。細胞株の相補性およびパッケージングについての機能性を、青色に染色された β-gal発現細胞の観察によって実証した。 キャプシドタンパク質およびエンベロープ糖タンパク質の両方について別々の ベクター誘導性発現カセットを有する安定な「分割構造遺伝子（split structur al gene）」PCLを生成するために、上記のキャプシド細胞株を、異なる選択マー カーを含む（例えば、ハイグロマイシンＢ耐性）さらなるエンベロープ糖タンパ ク質発現構築物とともに使用する。簡潔に記載すると、プラスミドpBG/SIN-1 EL VS 1.5-β-gal（実施例５）をBamHIおよびFspIで消化して、連結領域プロモータ ー、β-galレポーター遺伝子、およびいくつかの3'末端配列を含む配列を単離す る。所望のフラグメントをGENECLEAN IIを使用して１％アガロースゲルから精製 し、そしてこれもまたBamHIおよびFspIで消化して、全ての構造タンパク質遺伝 子配列を除去し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてGENECLEAN IIを使用 して0.7％アガロースゲルから精製したプラスミドpBGSVCMVdlneo（上記を参照の こと）中に連結する。得られる構築物をpBGSVCMVdlsP-lucと称する。次に、プラ スミドpBGSVCMVdlsP-lucをXhoIおよびNot Iで消化して、ルシフェラーゼレポー タ ー遺伝子を除去し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてGENECLEAN IIを使 用して0.7％アガロースゲルから精製し、そしてその後上記からのXhoIおよびNot Ｉ消化したエンベロープ糖タンパク質PCRアンプリコンを、消化したpBGSVCMVdls P-lucベクター中に連結して、エンベロープ糖タンパク質発現DH構築物pBGSVCMVd l-Gを生成する。このプラスミド中へのハイグロマイシン耐性マーカーカセット 、ならびに隣接するHSV TKプロモーターおよびポリアデニル化配列の挿入は、2. 5分間伸長での標準的な３サイクルプロトコル、テンプレートとしてのプラスミ ドpDR2（Clontech，Palo Alto，CA）、および隣接するPac I部位を含むように設 計されている以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、PCR増幅により 達成される。正方向プライマー：5'HYGRO/Pro-P（5'-制限部位/pDR2配列） （配列番号72） 逆方向プライマー：3'HYGRO/pA-P（5'-制限部位/pDR2配列）（配列番号73） 増幅後、DNAフラグメントをQIAquick-spinで精製し、Pac Iで消化し、GENECLEAN IIを使用して精製し、そしてこれもまたPacIで消化し、アルカリホスファター ゼで処理し、そしてGENECLEAN IIを使用して精製したプラスミドpBGSVCMVdl-G中 に連結する。得られる構築物をpBGSVhygro-Gと称する。 プラスミドpBGSVhygro-G（これはまた今やハイグロマイシン耐性カセットを含 む）を製造業者により記載されるようにLipofectamineを使用してキャプシド細 胞株中にトランスフェクトする。トランスフェクション後約24時間で、細胞をト リプシン処理し、そして1200ug/mlのハイグロマイシン（Calbiochem，La Jolla ，CA）を含有する培地中に再プレーティングする。この培地を定期的に新鮮なハ イグロマイシン含有培地に交換し、そして耐性細胞のフォーカスを増殖させる。 細胞をトリプシン処理し、そして96ウェル組織培養ディッシュ中での限界希釈に よりクローン化し、そして個々の細胞クローンを増殖させそしてスクリーニング のために拡大する。投入ベクターに応答して生物学的に活性なキャプシドタンパ ク質およびエンベロープ糖タンパク質を誘導的に発現する細胞を、２つの方法で 同定する：第１に、上記のように、シンドビスルシフェラーゼベクターRNAでの Ｌipofectin媒介性トランスフェクション、およびトランスフェクション後15時 間の溶解物をウエスタンブロットにおいてプローブすることによる；そして第２ に、同様なシンドビスルシフェラーゼベクタートランスフェクションであるが、 上清をトランスフェクション後24時間に回収し、そして上清での感染による新鮮 なBHK細胞へのルシフェラーゼ発現の移行について試験することによる（上記を 参照のこと）。このようにして誘導した分割構造遺伝子PCLをC/GLYCO PCLと称す る。 Ｄ．「ハイブリッド」構造タンパク質を有するPCLの構築 同時パッケージングまたはDHとベクターRNA分子との間の組換えのレベルを減 少させて、糖タンパク質遺伝子の翻訳を増強するため、またはパッケージングさ れた組換えアルファウイルスベクター粒子の細胞もしくは組織特異性を変化させ るために利用され得るさらなるアプローチは、他のアルファウイルスまたはトガ ウイルス由来の構造タンパク質遺伝子を使用する。より詳細には、シンドビスウ イルスまたは異なるアルファウイルスベクターとの使用のための、アルファウイ ルスまたはトガウイルス構造タンパク質遺伝子の多数の組み合わせが意図され得 る。例えば、ロスリバーウイルス（RRV）のキャプシドタンパク質遺伝子を、シ ンドビスウイルスのエンベロープ糖タンパク質遺伝子（同一のまたは異なる構築 物から発現される）とともに使用して、実施例３、４、または５に記載のシンド ビスウイルス由来ベクターをパッケージングし得る。さらに、RRVキャプシドタ ンパク質遺伝子の欠失形態を、シンドビス糖タンパク質遺伝子配列の直ぐ上流に 配置して、翻訳エンハンサーエレメントとして作用させ得る。別の例として、シ ンドビスウイルスの構造タンパク質を使用して、セムリキ森林ウイルスRNAベク ターをパッケージングし得る。 詳細には、インタクトなまたは欠失した形態のRRVキャプシド遺伝子（図22） ＋シンドビス糖タンパク質遺伝子を含む欠陥ヘルパー（DH）構造タンパク質構築 物を、それぞれプラスミドテンプレートToto1101（Riceら、J．Virol．61:3809- 3819，1987）およびRR6415（Kuhnら、Virology 182:430-441，1991）由来のシン ドビスウイルスまたはロスリバーウイルス配列のPCR増幅、ならびにSP6ポリメラ ーゼでのインビトロにおける転写のための、以前に記載のDH構築物DH-BBまたはD H-BB(5'SIN)（Bredenbeekら、J．Virol．67:6439-6446，1993）中へのこれらの 配列の組み込みにより構築した。DH構築物DH-BBまたはDH-BB(5'SIN)は、シンド ビス5'末端におけるDI由来tRNAAsp配列の存在（DH-BB）または非存在（DH-BB(5' SIN)）で異なる。以下の表は、特異的PCRプライマー配列およびそれらの対応す るシンドビスまたはロスリバーヌクレオチド位置を示し、大文字はウイルスヌク レオチドを示し、そして小文字はクローニングエ程において使用する制限部位ま たは特異的点変異のさらなるヌクレオチドを示す。プライマー６（RRV Bsp）中 の点変異は、生じるアミノ酸配列を変化させなかった。PCR のために使用するプライマー ： １．RRV Ava ：（nt.7510〜7525）（配列番号74） ２．RRV Ncil ：（nt.7606〜7620）（配列番号75） ３．RRV Nci2 ：（nt.7616〜7630）（配列番号76） ４．RRV Apa1 ：（nt.8088〜8102）（配列番号77） ５．RRV Apa2 ：（nt.8097〜8III）（配列番号78）６．RRV Bsp ：（nt.8339〜8361）（配列番号79） ７．RRV Afl1 ：（nt.7820〜7836）（配列番号80） ８．RRV Afl2 ：（nt.7892〜7907）（配列番号81） ９．SIN Ava ：（nt.7591〜7594）（配列番号82） 10．SIN Bam ：（nt.7325〜7343）（配列番号83） 11．SIN Bsp ：（nt.8418〜8433）（配列番号84） 12．SIN Bsu ：（nt.8887〜8902）（配列番号85） PCR反応を、以下に示すプライマー対を使用して、標準的な３サイクルプロトコ ルで、30秒間の伸長およびVentポリメラーゼを用いて実施して、対応するDNAフ ラグメント（これもまた以下に示す）を生成した。PCR フラグメント：プライマー対、プラスミドテンプレート フラグメント１：pr1＋pr2、RRV6415プラスミド フラグメント２：pr3＋pr4、RRV6415プラスミド フラグメント３：pr5＋pr6、RRV6415プラスミド フラグメント４：pr3＋pr7、RRV6415プラスミド フラグメント５：pr4＋pr8、RRV6415プラスミド フラグメント６：pr9＋pr10、Toto1101プラスミド フラグメント７：pr11＋pr12、Toto1101プラスミド 増幅後、PCR産物を示す酵素で消化し、そしてpUC18プラスミドアナログであるpR S2（これは、さらなるポリリンカー部位を含み、そしてこれもまた同じ酵素の組 み合わせで消化した）中に連結した：フラグメント１をEcoR I＋Hind IIIで；フ ラグメント２をBamH I＋Hind IIIで；フラグメント３をBamH I＋Hind IIIで；フ ラグメント４をBamH I＋Af1 IIで；フラグメント５をHind III＋Af1 IIで；フラ グメント６をBamH I＋Hind IIIで；そしてフラグメント７をBamH I+Bsu 361で切 断した。全ての挿入物を配列決定して、PCRの間に人工物が獲得されていないこ とを確認した。 その後、フラグメントをpRS2プラスミドから以下に示す酵素を使用して遊離さ せ、そして正確に示すように連結して、次の組の構築物を生成した。FR8を生成 するために、フラグメント６（Bam HIおよびAva IIにより切断）をフラグメント １（Ava IIおよびNci Iにより切断）、フラグメント２（Nci IおよびHind IIIに より切断）、ならびにプラスミドpRS2（Bam HIおよびHind IIIにより切断）と連 結した。FR9を生成するために、フラグメント６（BamHIおよびAva IIにより切断 ）を、フラグメント１（Ava IIおよびNci Iにより切断）、フラグメント４（Nci IおよびAfl IIにより切断）、ならびにプラスミドpRS2（BamH IおよびAfl IIに より切断）と連結した。FR10を切断するために、フラグメント５（Afl IIおよび ApaL Iにより切断）を、フラグメント３（ApaL IおよびHind IIIにより切断）、 ならびにプラスミドpRS2（Afl IIおよびHind IIIにより切断）と連結した。E．c oliの形質転換の後、プラスミドを制限分析により分析し、そしてそれらのイン サートを消化により再度単離し、そしてクローニングの次の工程のために使用し た。 FR8インサート（BamHIおよびApaL Iにより切断）を、フラグメント３（ApaL I およびBspM IIにより切断）、フラグメント７（BspM IIおよびBsu36 Iにより切 断）、ならびにプラスミドDH-BB（BamH IおよびBsu36 Iにより切断）と連結した 。また同じフラグメントを使用して、プラスミドDH-BB(5'SIN)のBamH I-Bsu36 I フラグメントを置換した。得られたプラスミドは、それぞれDH-BB CrrvおよびDH -BB(5'SIN)Crrvと称した（図23を参照のこと）。FR9インサート（BamH IおよびA fl IIにより切断）を、FR10インサート（Afl IIおよびBspM IIにより切断）、フ ラグメント７（BspM IIおよびBsu36 Iにより切断）、ならびにプラスミドDH-BB （BamHIおよびBsu36 Iにより切断）と連結した。また同じフラグメントを使用し て、プラスミドDH-BB(5'SIN)のBamH I-Bsu36 Iフラグメントを置換した。得られ たプラスミドは、DH-BB CΔrrvおよびDH-BB(5'SIN)CΔrrvと称した（図23を参照 のこと）。 キメラ構造タンパク質遺伝子を含むDH構築物についての複数の使用が可能であ り、そして２つのそのようなアプローチを図24および25に例証する。図24におい て、インタクトなロスリバーキャプシドタンパク質遺伝子を、欠陥ヘルパー構築 物の一部として、シンドビス糖タンパク質遺伝子配列に連結し（DH-BB Crrvまた はDH-BB(5'SIN)Crrv）、そしてシンドビスレポーターRNAベクターレプリコンと ともに同時トランスフェクトして、組換えアルファウイルス粒子中へのパッケー ジングを実証する（図26）。図25において、欠失形態のロスリバーキャプシドタ ンパク質遺伝子を、翻訳エンハンサーおよびDH構築物の一部として、シンドビス 糖タンパク質遺伝子配列と連結し（DH-BB CΔrrvおよびDH-BB(5'SIN)CΔrrv）、 一方シンドビスキャプシドタンパク質遺伝子を第２のDH構築物から発現させる。 両方のDH構築物をシンドビスレポーターRNAベクターレプリコンとともに同時ト ランスフェクトして、組換えアルファウイルス粒子中へのパッケージングを実証 する（図26）。さらに、ロスリバーキャプシドタンパク質遺伝子を単独でDH構築 物から発現させ得、一方シンドビス糖タンパク質をパッケージングにおける使用 のために別の構築物から発現させる。この知見および構造タンパク質遺伝子配列 が由来するいくつかの他のアルファウイルスの利用可能性を使用して、多数の異 なるタンパク質の組み合わせを同様なアプローチで生成し得る。 あるいは、上でSFVベクターおよびシンドビス構造タンパク質について示した ように、１つのアルファウイルスまたは他のTogaviridaeのメンバー（例えば、 風疹ウイルス）由来の構造タンパク質遺伝子の全体の相補物を、別のウイルス由 来のRNAベクターをパッケージングするために使用し得る。別の実施態様におい て、ベネズエラウマ脳脊髄炎（VEE）ウイルス由来の構造タンパク質遺伝子を、 シンドビスウイルス由来ベクター（野生型または実施例４もしくは５に記載の表 現型を示す）をパッケージングするために使用し得る。そのような方法は、本発 明の所望の特性（例えば、宿主巨大分子合成の遅延、減少、または阻害なし）を 示すベクターRNA＋組換え粒子の向性を再指向する構造タンパク質を含む組換え アルファウイルス粒子を提供する。ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（VEE）は 、そのシンドビスウイルス相当物とは異なり、リンパ系起源の細胞に対する向性 を示すアルファウイルスである。それゆえ、VEE構造タンパク質を発現する細胞 株によりパッケージングされたシンドビス由来ベクター構築物は、そこからパッ ケージング細胞構造タンパク質遺伝子カセットを得た親VEEウイルスと同一のリ ンパ向性（lymphotropic）特性を示す。 詳細には、VEEウイルスのトリニダードロバ株（ATCC♯VR-69）をBHK-21細胞中 で増殖させ、そしてビリオンRNAを実施例１に記載の手順と同様の手順を使用し て抽出する。全体の構造タンパク質コード領域を、その5'末端がそれぞれオーセ ンティックなAUG翻訳開始部位（周囲のKozakコンセンサス配列を含む）およびUG Ａ翻訳終始部位をマップするプライマー対を用いるPCRにより増幅する。正方向 プライマーはVEEヌクレオチド7553〜7579に相補的であり、そして逆方向プライ マーはVEEヌクレオチド11206〜111相補的である（Kineyら、Virology 170:19-30 ，1989由来の配列）。構造タンパク質遺伝子に対応するVEE cDNAのPCR増幅を、 上記のような２工程逆転写酵素-PCRプロトコル、テンプレートとしてのVEEゲノ ムRNA、および以下の隣接するXho IおよびNot I部位を含むオリゴヌクレオチド 対を使用して達成する：正方向プライマー：VEE7553F(5'制限部位/VEEキャプシド配列) (配列番号86) 逆方向プライマー：VEE 11206R(5'制限部位/VEE E1糖配列)(配列番号87) PCR増幅後、約3800bpのフラグメントを0.7％アガロースゲルからGENECLEAN IIを 使用して精製し、そしてXho IおよびNot Iで消化する。次いで、得られるフラグ メントをDNAベースのシンドビス発現ベクターpDCMVSIN-luc（上記を参照のこと ）（これもまたXho IおよびNot Iで消化して、そのルシフェラーゼレポーター遺 伝子インサートを除去し、アルカリホスファターゼで処理し、そして0.7％アガ ロースゲルからGENECLEAN IIを使用して精製した）中に連結する。得られるVEE 構造タンパク質発現構築物をpDCMV-VEEspと称する。次に、プラスミドpDCMV-VEE spを限定部分消化条件下でBspEIで消化して、大部分の非構造タンパク質遺伝子 配列を除去し、そして再連結して、構造タンパク質発現DHベクター構築物である pDCMV-VEEdlを作製する。 プラスミドpDCMV-VEEdl（これはまた、ネオマイシン耐性マーカーを含む）を 、製造業者により記載されるようにLipofectamineを使用してBHK細胞中にトラン スフェクトする。トランスフェクション後約24時間に、細胞をトリプシン処理し 、そして600μg/mlの薬物G418を含有する培地中に再プレーティングする。培地 を定期的に新鮮なG418含有培地に交換し、そして耐性細胞のフォーカスを増殖さ せた。細胞をトリプシン処理し、そして96ウェル組織培養ディッシュ中での限界 希釈によりクローン化し、そして個々の細胞クローンを増殖させそしてスクリー ニングのために拡大する。投入ベクターに応答してVEE構造タンパク質を誘導的 に発現する細胞を、以前に記載のように、シンドビスルシフェラーゼベクターRN Aをトランスフェクトし、そして細胞溶解物または上清中のパッケージングされ たルシフェラーゼベクターにおけるVEE構造タンパク質発現についてアッセイす ることにより同定する。VEEの改変体または組織向性が異なる他のアルファウイ ルスおよびその改変体から得られる構造タンパク質遺伝子もまた、このアプロー チに従って有用である。さらに、本実施例に記載の種々の構造タンパク質遺伝子 発現カセット構造の各々を使用し得る。 Ｅ．PCL からのパッケージングされたアルファウイルスベクターの産生 本実施例を通して記載のアルファウイルス由来PCLを、組換えアルファウイル ス粒子ストックを産生する、そしてRNAまたはDNA分子のいずれかのトランスフェ クションによるベクターの導入、以前に産生したパッケージングされたベクター 含有粒子での感染、または安定に形質転換された発現カセットからのベクターの 細胞内産生を含む多数の異なる方法で使用し得る。ベクター粒子の産生のための アルファウイルスPCLの有用性を、まずレポーターベクター構築物を用いて実証 し、そして後に所望の異種配列を発現する任意の他のベクター構築物に適用し得 る。例えば、パッケージングされたシンドビス-β-galベクター粒子のストック を、記載の手順を使用して（LiljestromおよびGaroff、Bio/Technology 9:1356- 1361，1991）、約107のアルファウイルスC/GLYCOまたは他のPCL細胞（上記、な らびに例えば図15、17、および18を参照のこと）の、50ugのpKSSIN-1-BV-β-gal もしくは-luciferase RNA（実施例４）またはpBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-galもしく は-luciferase DNA（実施例５）でのエレクトロポレーションにより得る。トラ ンスフェクトされたPCLを所望の温度（例えば、37℃）でインキュベートし、そ してトランスフェクション後約48時間に、上清を回収し、そして0.45ミクロンフ ィルターの通過により澄明化する。さらなる処方を、本発明の詳細な説明に例証 するパラメーターを使用して実施し得る。 あるいは、パッケージングされた組換えアルファウイルス粒子のストック（上 記のようにPCLを使用して、またはベクターおよびDH構築物の同時トランスフェ クションにより得る）を使用して、さらなる増幅のためにPCLの天然培養物を感 染する。例えば、５×107のアルファウイルスC/GLYCOまたは他のPCL細胞をパッ ケージングされたpKSSIN-1-BV-β-galベクターのストックで、約１感染単位／細 胞の感染多重度（MOI）で感染させる。細胞質への到達に際して、粒子送達RNAベ クターは自己触媒的に増幅され、そしてさらなる子孫粒子中にパッケージングさ れる。所望の温度（例えば、37℃）での約48時間のインキュベーション後、培養 上清を回収し、0.45ミクロンフィルターの通過により澄明化し、そして所望のよ うに処方する。 パッケージングされた組換えアルファウイルスベクター粒子をさらに増幅する PCLの能力を利用するなお別の方法において、パッケージングされた粒子のスト ックを使用して、PCLの天然培養物を感染させ、ベクター含有PCL（ベクター産生 細胞、図27）の作業細胞バンクを作製する。次に、これを使用して、PCLの別の 天然培養物を播種し得る。例えば、そのような作業細胞バンクを、アルファウイ ルスC/GLYCOまたは他のPCL細胞のパッケージングされたベクターストックでのM. 0.I.＝５での感染により得る。感染後約２〜３時間に、ベクター含有PCLを穏や かに剥がし、そして細胞数を測定する。ベクター含有PCLを、今や、直接使用し 得るか、または小分けし、そしてベクター産生細胞バンクとして液体N2中で貯蔵 し得る。所望の場合は、細胞を、天然のアルファウイルスC/GLYCOまたは他のPCL の以前に増殖させた培養物中に、1000新鮮PCL当たり約１ベクター産生細胞の割 合で、多量の高力価のパッケージングされたベクター粒子の産生のために、直接 播種する。同時培養後種々の時点で培養上清のアリコートを回収して、最大組換 えアルファウイルス粒子産生の時間を決定し、そしてその時間を、上記のような 、さらなる回収、精製、および処方のために選択する。ベクター産生細胞を使用 する同じ一連の増幅方法はまた、任意の所望の組換えタンパク質の大規模産生の ために有用である（図27）。組換えタンパク質の産生のために、組換えタンパク 質の性質に依存して、上清または細胞溶解物を回収し得る。 パッケージングされた組換えアルファウイルス粒子の高力価または大規模スト ックを産生するためのなお別の方法において、本明細書中に記載のように、一般 的に受容される試薬または方法（例えば、それぞれLipofectinもしくはLipofect amine、または低MOI[≦0.1]でのベクター粒子での感染）を使用する、インビト ロ転写RNAまたはプラスミドDNAベクターのトランスフェクションにより、所望の 発現ベクターを１〜５％の天然アルファウイルスPCL培養物中に導入する。その 中にベクターを導入した最初の細胞により産生された組換えベクター粒子は、次 に、培養物中の他の天然パッケージング細胞を感染し、次にこれはさらにより多 くのパッケージングされた粒子を産生する。一時的増幅のこのプロセスは、パッ ケージングされた組換えアルファウイルス粒子がPCL培養物の全ての細胞におい て産生されるまで継続する。この増幅プロセスを図28に示す。ELVS 1.5-β-gal プラスミドDNAを987DHBBNeoパッケージング細胞またはBHK-21細胞中にトランス フェクトし、そして細胞溶解物中に存在するβ-ガラクトシダーゼのレベルを、 以前に記載のように、トランスフェクション後の示す時点に測定した。BHK-21細 胞において、β-ガラクトシダーゼ発現のレベルは、約48hptまでに最大に達し、 そしてプラトーになった。対照的に、β-ガラクトシダーゼ発現のレベルは、ELV S 1.5-β-galトランスフェクト987DHBBNeo PCL培養物において、より長い期間に わたって増加し続けた。これは、組換えベクター粒子増幅プロセス、および培養 物の全ての細胞におけるβ-ガラクトシダーゼの最終的な発現を反映する。全て の場合において、組換えアルファウイルスベクター粒子のストックを今や、本明 細書に記載の任意の方法を使用して、薬学的に受容可能であるように処方し得る 。 実施例７ アルファウイルスプロデューサー細胞株の構築 宿主細胞巨大分子合成の減少、遅延、または阻害なしを示すDNAベースのアル ファウイルスベクターの構築と結びつけられた、上記のようなアルファウイルス PCLの生成（実施例１、２、４、および５）は、アルファウイルスベクタープロ デューサー細胞株を誘導するための比較的直線的な機構を提供する。本発明の特 定の実施態様において、ベクタープロデューサー細胞株は、１つ以上の安定に形 質転換された構造タンパク質遺伝子発現カセット、およびまた上記の表現型を有 するアルファウイルスRNA発現ベクター分子を含み、これはトランスフェクトさ れるか、形質導入されるか、または細胞内で産生され、パッケージングされたベ クター粒子の産生を導く。好ましい実施態様において、RNAベクターレプリコン を、安定に形質転換されたDNA分子（真核生物重層ベクター開始系）から細胞内 で産生する。このDNA分子は、組み込まれた形態でまたはエピソームDNAとしての いずれかで存在し、ベクターRNAの転写は所望の時点で提供される１つ以上の剌 激により誘導的に制御される。この型のアルファウイルスプロデューサー細胞株 構造は、本質的に、以下を含む事象のカスケードを提供する：ベクターRNAの誘 導性産生および結果として生じるRNAの自己触媒性細胞質増幅、ベクター供給非 構造タンパク質による高レベルの構造タンパク質発現の誘導、発現された構造タ ンパク質によるベクターRNAのパッケージング、およびパッケージングされたベ クター粒子の放出。一旦プロデューサー細胞集団が所望の数に達すると、ベクタ ー複製の低レベル細胞傷害性の潜在力、または非構造タンパク質合成を制御する 必要性のために、DNA分子からのベクターRNAの強固に調節された、誘導性の発現 は好ましい。なぜなら、それは正鎖対負鎖ベクターRNA比の調節に関連するから である。 Ａ．単一レベル調節を有するアルファウイルスDNAベクター 本発明の特定の実施態様において、DNAに基づくアルファウイルスベクターが 提供される。ここで、自己触媒的増幅が可能であるアルファウイルスベクターRN A分子のインビボ転写は、所望の時点に刺激を適用することによって調節可能で あるプロモーターから生じる。このようなDNAに基づくアルファウイルスベクタ ーを、引き続いて、アルファウイルスパッケージング細胞株（PCL）に安定に形 質転換して、誘導性アルファウイルスプロデューサー細胞株を作製し得る。それ ゆえ、本明細書中に記載されるプロデューサー細胞株構成は、「フィードフォワ ード（feed-forward）」系であり、ここで：１）刺激が細胞に適用され、アルフ ァウイルスベクターRNAの効率的な転写が生じる；２）ベクターRNAは、自己触媒 的に複製し、そして非構造タンパク質を生成する；３）非構造タンパク質は、構 造タンパク質発現カセットmRNAの増幅および高レベルの構造タンパク質発現を刺 激する；そして４）構造タンパク質はベクターRNAと相互作用し、そして培養培 地に放出される組換えアルファウイルス粒子の引き続くパッケージングを生じる 。任意の以前に記載されたアルファウイルスPCL（１以上の誘導性アルファウイ ルス構造タンパク質発現カセットで安定に形質転換されている）が、プロデュー サー細胞株を派生させるための親株として働き得る。 例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター系（GossenおよびBujard，Proc .Natl.Acad.Sci．89:5547-5551，1992）は、図29に記載されるような、アルファ ウイルスベクターRNAの誘導性転写のために利用され得る。この系において、「 融合」タンパク質（rTA）としての、テトラサイクリンリプレッサーおよびHSV-V P16トランスアクチベータードメインの発現は、最小「コア」プロモーター（例 えば、CMV）にすぐに近接して位置したテトラサイクリンオペレーター配列（tet O）への特異的な結合によって、アルファウイルスベクターRNAのインビボ 転写を刺激する。結合およびトランス活性化事象は、テトラサイクリンの存在に よって可逆的にブロックされ、そして培養培地からテトラサイクリンを除去する ことによって「オン」にされ得る。転写の非誘導の基底レベルは、異なる細胞型 間で変化するので、転写開始部位が既知であり、アルファウイルスベクターヌク レオチド１との並置またはすぐ近傍を許容する場合には、他の異なる最小コアプ ロモーター（例えば、HSV-tk）を、テトラサイクリンオペレーター配列に連結し 得る。 rTAトランスアクチベーターは、それもまた同一の細胞株に安定に形質転換さ れるさらなる発現カセットにより提供され；そして特定の実施態様では、rTA発 現カセットは、それ自体で自己調節的であり得る。自己調節的rTA発現カセット の使用は、rTA自体が結合する同一のtetO-連結プロモーターによる転写制御に発 現をリンクさせることにより、rTAの構成的な高レベル発現に関連する潜在的な 毒性問題を回避する。このタイプの系は、テトラサイクリンの存在下では非常に 少ないrTAが生成されることを確実にするが、テトラサイクリンが除去されると 、高度に活性になる負のフィードバックサイクルを作製する（図29）。このよう な自己調節的rTA発現カセットは、プラスミドpTet-tTAk（Shockettら、Proc.Nat l.Acad.Sci.USA 92:6522-6526，1995）中に提供される。 このようなテトラサイクリン調節性のDNAに基づくアルファウイルスベクター の機能性は、改変SIN-1-由来ルシフェラーゼプラスミドベクターを構築すること によって実証され、これはテトラサイクリンオペレーター/CMV最小プロモーター によって駆動される。出発材料としてプラスミドpBG/SIN-1 ELVS 1.5−luc（実 施例４）およびpBGSV3'（実施例６）を用いて、SIN-1非構造コード領域の多く、 連結領域プロモーターおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子、ならびに3'-UTR の一部を含む、約7200bpのフラグメントを、Bgl IIおよびFsp IでのpBG/SIN-1 ELVS1.5-lucの消化、およびGENECLEAN IIを用いる0.7％アガロースゲルからの精 製によって単離する。この7200bpフラグメントを、引き続いて、同様にBgl IIお よびFsp Iで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてGENECLEAN IIを 用いて0.7％アガロースゲルから精製したプラスミドpBGSV3'に連結する。得られ る構築物をpBGSVdlB/SIN1-lucと命名する。残りの配列（転写がシンドビスヌク レ オチド１の5'側の１つのさらなる非ウイルスヌクレオチドから開始するように、 シンドビスヌクレオチド１〜2289に連結された７量体化テトラサイクリンオペレ ーターおよび最小のCMVプロモーター（tetO/CMV）を含む）の挿入を、オーバー ラップPCRによって達成する。PCR反応＃１において、この配列の約370bpのtetO/ CMV部分を、30秒伸長を用いる標準的な３サイクルPCRによって、テンプレートプ ラスミドpUHC13-3（GossenおよびBujard，同書）から、以下のオリゴヌクレオチ ドプライマー（一方のプライマー上において隣接するBgl IIおよびAsc I部位を 、そして他方において5'-シンドビスヌクレオチドにオーバーラップする配列を さらに含むように設計されている）を用いて、増幅する。正方向プライマー：5'BAtetOF(5'-制限部位/tetO nts.) (配列番号88) 逆方向プライマー：3'CMVpro/SINR(5'-シンドビスnts./CMV nts.)(配列番号89) PCR反応＃２において、この配列の2289bpのシンドビス5'-末端部分を、３分伸 長を用いる標準的な３サイクルPCRによって、テンプレートプラスミドpKSRSIN-1 （実施例１）から、一方のプライマー上でCMVプロモーターヌクレオチドにオー バーラップする配列をさらに含むように設計した以下のオリゴヌクレオチドプラ イマーを用いて、増幅する。正方向プライマー：CMVSIN5'endF(5'-CMV nts./シンドビスnts.) (配列番号90) 逆方向プライマー：SIN2400R(全てのシンドビスnts.)(配列番号91) 増幅に続いて、DNAフラグメントを、QIAquick-spinで精製し、そして、さらな る5'BAtetOFおよびSIN2400Rプライマーを用いて、3.5分伸長を用いる引き続く３ サイクルPCR反応において、テンプレートとして一緒に用いる。得られる約2660b pのオーバーラップPCRアンプリコンを、GENECLEAN IIを用いて精製し、Bgl IIで 消化し、そして同様にBgl IIで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そし てGENECLEAN IIを用いて0.7％アガロースゲルから精製したプラスミドpBGSVdlB/ SIN1-lucに連結する。得られる構築物をptetSIN1-lucと命名する。他の異種の目 的の配列を含有するベクター構築物を、同様のアプローチを用いて、またはXhoI および/またはNot I部位への直接クローニングによって生成する。引き続いて、 選択可能なE.coli gpt遺伝子（キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフ ェラーゼ）発現カセットを、生成し、そしてプラスミドptetSINl-lucの唯一のPa c I部位に挿入して、さらなる選択マーカーを提供する。最初に、gpt遺伝子オー プンリーディングフレームに連結したSV40プロモーターを含むフラグメントを、 プラスミドpMAM（Clontech，Palo Alto，CA）から、２分伸長を用いる標準的な ３サイクルPCRによって、そして上流の隣接するSacIおよびPacI部位ならびに下 流のSacI部位を含むように設計した以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用い て増幅する。正方向プライマー：SV40proSPF(5'-制限部位/SV40プロモーター配列) (配列番号9 2) 逆方向プライマー：3'ECgptR(5'-制限部位/gpt遺伝子配列)(配列番号93) 増幅に続いて、SV40プロモーター/gpt遺伝子DNAフラグメントを、QIAquick-sp inで精製し、Sac Iで消化し、GENECLEAN IIを用いて精製し、そして同様にSac I で消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてGENECLEAN IIを用いて0.7 ％アガロースゲルから精製したプラスミドpBGS131 dlXhoI-BGHTT（実施例５） に連結する。正しい方向の挿入物を有するクローンを、制限分析によって同定す る。この構成は、プロモーターおよびgpt遺伝子をウシ成長ホルモン転写終結シ グナルのすぐ近傍に配置する。得られるgpt発現構築物をpBGS131 dlXhoI-gptと 命名する。次に、全体の発現カセットを、プラスミドpBGS131 dlXhoI-gptから、 ２分伸長を用いる標準的な３サイクルPCRによって、そして隣接するPacI部位を 含むように設計した以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。正方向プライマー：上記に示した、SV40proSPF （配列番号92）逆方向プライマー：BGHTTpacR(5'-制限部位/BGH配列) (配列番号94) 増幅に続いて、gpt遺伝子発現カセットフラグメントを、QIAquick-spinで精製 し、Pac Iで消化し、GENECLEAN IIを用いて精製し、そして同様にPac Iで消化し 、アルカリホスファターゼで処理し、そしてGENECLEAN IIを用いて0.7％アガロ ースゲルから精製したtet誘導性アルファウイルスベクター構築物ptetSIN1-luc に連結する。得られる構築物をptetSINlgpt-lucと命名する。 最初のテトラサイクリン誘導性アルファウイルスベクタープロデューサー細胞 株の構築のために、ptetSINlgpt-luc構築物およびテトラサイクリンリプレッサ ー/VP16トランスアクチベーター（rTA）発現カセットを、所望のアルファウイル スPCLに安定に形質転換する。例えば、アルファウイルスC/GLYCO PCL細胞（上記 由来）を、選択マーカーをコードする別のプラスミドとの同時トランスフェクシ ョンによってプラスミドpTet-tTAk（上記を参照のこと）で安定に形質転換する 。プラスミドpTet-tTAkおよびヒスチジノールデヒドロゲナーゼマーカーをコー ドするpSV2-His（Schatzら、1989，Cell 59:1035-1048）を、それぞれ、40:1の モル比で、製造業者によって記載されるようにLipofectamineを用いて、C/GLYCO PCL細胞（または他のPCL）に同時トランスフェクトする。トランスフェクショ ンの約24時間後、細胞を、トリプシン処理し、そしてヒスチジノールおよび0.5 μg/mlテトラサイクリンを含有する培地に再プレートする。培地を、新鮮な薬物 含 有培地に定期的に交換し、そして耐性細胞のフォーカスを増殖させる。細胞を、 トリプシン処理し、そして96ウェル組織培養ディッシュにおける限界希釈によっ てクローン化し、そして個々の細胞クローンを、スクリーニングのために増殖さ せ、そして拡大する。ポジティブpTet-tTAk含有パッケージング細胞クローン（C /GLYCO/TAk細胞と称される）を、テトラサイクリンの存在下または非存在下の両 方で、teto/プロモーターの制御下のルシフェラーゼレポータープラスミドpUHC1 3-3（GossenおよびBujard，同書）をトランスフェクトすることによって同定す る。テトラサイクリンの非存在下では、ポジティブC/GLYCO/TAk PCL細胞は、tet O/プロモーターからの誘導、および誘導性の高レベルのルシフェラーゼを提供す る。 引き続いて、DNAに基づくアルファウイルスベクター構築物ptetSISlgpt-lucを 、製造業者によって記載されるようにLipofectamineを用いて、C/GLYCO/TAk細胞 に安定にトランスフェクトする。トランスフェクションの約24時間後、細胞を、 トリプシン処理し、そして特定の細胞型に至適化しそして0.5μg/mlテトラサイ クリンを含有する選択培地（DMEM＋10％透析ウシ胎仔血清；250μg/mlキサンチ ン；15μg/mlヒポキサンチン；10μg/mlチミジン；２μg/mlアミノプテリン；25 μg/mlミコフェノール酸）に再プレートする。培地を、新鮮な選択培地に定期的 に交換し、そして耐性細胞のフォーカスを増殖させる。細胞を、トリプシン処理 し、そして96ウェル組織培養ディッシュにおける限界希釈によってクローン化し 、そして個々の細胞クローンを、スクリーニングのために増殖させ、そして拡大 する。ptetSINlgpt-lucで安定に形質転換したポジティブプロデューサー細胞株 を、以前に記載されるように、少なくとも24時間培地からテトラサイクリンを除 去し、そして細胞溶解物中のルシフェラーゼについて試験し、そしてさらに培養 上清中のパッケージングされたルシフェラーゼベクターについて試験することに よって、同定する。 Ｂ．２つのレベル調節を有するアルファウイルスDNAベクター 好ましい実施態様において、DNAに基づくアルファウイルスベクター（野生型 または宿主巨大分子合成の減少した阻害、遅延した阻害もしくは阻害なしの所望 の表現型を有する）を構築することが望ましくあり得る。ここで、RNAベクター 分子の転写（自己触媒性増幅が可能である）は、全ての基底レベルの転写を除去 する２つのレベルの調節によって非常に厳密に制御されるプロモーターから生じ る。このようなアプローチは、１つの誘導性成分（例えば、上記由来のtet系） と可逆的な転写のサイレンシング成分とを組み合わせ得る。例えば、特定のジン クフィンガータンパク質のKRAB抑制ドメインを使用し得る。 s2HiS2ジンクフィンガータンパク質の1/3より多くのアミノ末端領域に存在する 高度に保存された配列である。これらのドメインは、２つの推定上の両親媒性α -ヘリックスを含み、そしてDNA結合依存性RNAポリメラーゼII転写リプレッサー として機能することが示されている（例えば、Lichtら、Nature 346:76-79，199 0）。他の転写因子と同様に、活性抑制ドメインとDNA結合ドメインとは、異なり 、そして分離可能である。それゆえ、抑制ドメインを、融合タンパク質として、 標的化のために任意の配列特異的DNA結合タンパク質に連結し得る。理想的には 、DNA結合タンパク質成分は、調節可能様式で結合を可逆的に妨げられ得、従っ て転写サイレンシングを「オフ」にする。例えば、１つの実施態様において、ヒ トKoxl（Thiesen，New Biol．2:363-374，1990）由来のKRABドメインを、DNA結 合ラクトース（lac）リプレッサータンパク質に融合して、tet応答性プロモータ ーのすぐ近傍に操作したlacオペレーター配列への可逆性の配列特異的結合を有 するハイブリッド転写サイレンサーを形成させる（図30）。この構成では、lac リプレッサー/KRABドメイン融合体（rKR）の構成的発現は、lacオペレーター配 列への結合および誘導されていないtet応答性プロモーターからの何らかの「漏 出性の」基底の転写の除去を生じる。ベクター発現が所望であり、そしてテトラ サイクリンがこの系から除去される場合には、IPTGを、rKR媒介転写サイレンシ ングを妨げるために添加する。 さらに、他のジンクフィンガータンパク質由来のKRABドメイン（例えば、ZNF1 33（Tommerupら、Hum.Mol.Genet．2:1571-1575，1993）、ZNF91（Bellefroidら 、EMBO J．12:1363-1374，1993）、ZNF2（Rosatiら、Nucleic Acids Res．19:56 61-5667，1991）など）ならびに他の移動させ得るリプレッサードメイン（例え ば、 Drosophila enまたはeve遺伝子（Jaynesおよび0'Farrell，EMBO J．10:1427-143 3，1991;HanおよびManley，Genes Dev．7:491-503，1993）、ヒトジンクフィン ガータンパク質YY1(Shiら、Cell 67:377-388，1991)、ウィルムス腫瘍抑制タン パク質WT1（Maddenら、Science 253:1550-1553,1991）、甲状腺ホルモンレセプ ター（Baniahmadら、EMBO J．11:1015-1023，1992）、レチノイン酸レセプター （Baniahmadら、同書）、Kid-1（Witzgallら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:4514 -4518，1994)）がこのような系で容易に用いられる。さらに、この系のlacリプ レッサー/lacオペレーター成分を、他の供給源に由来する多数の任意の他の調節 可能な系（例えば、トリプトファンおよびマルトースオペロン、GAL4など）によ って置換し得る。 詳細には、タンパク質を核に戻るようにより効率的に方向付けるために、連結 された核局在化配列（NLS;Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys(配列番号100);Kalderonら 、Cell 39:499-509，1984）を有する、ヒトKoxlのKRABドメインに融合したIacリ プレッサー（lacI）タンパク質を含有する発現カセットを、オーバーラップPCR によって構築する。PCR反応＃１において、約1100bpのlacI配列を、1.5分伸長を 用いる標準的な３サイクルPCRによって、テンプレートプラスミドp3'SS（Strata gene，La Jolla，CA）から、以下のオリゴヌクレオチドプライマー（上流プライ マーに隣接するXhoI部位および良好な翻訳開始状況にあるAUG開始コドンを、そ して他方にSV40ラージＴ抗原核局在化配列をさらに含むように設計されている） を用いて増幅する。正方向プライマー：LacI5'F(5'-制限部位/AUG+lacI配列) (配列番号95) 逆方向プライマー：LacI3'NLSR(5'-NLS/lacI配列)(配列番号96) PCR反応＃２において、ヒトKoxlのアミノ末端121残基KRABドメインを含む、約 400bpのアンプリコンを、１分伸長を用いる標準的な３サイクルPCRによって、テ ンプレートプラスミドpKoxl（Thiesen，New Biol．2:363-374，1990）から、以 下のオリゴヌクレオチドプライマー（一方のプライマーにおいてNLSおよびLacI にオーバーラップする配列を、そして他方においてSacI制限部位および停止コド ンをさらに含むように設計されている）を用いて増幅する。正方向プライマー：KRAB5'F(5'-NLS+lacIオーバーラップ配列/KRAB配列) (配列番 号97) 逆方向プライマー：KRAB3'R(5'-制限部位＋停止コドン/KRAB配列)(配列番号98) 増幅に続いて、DNAフラグメントを、QIAquick-spinで精製し、そして、さらな るLacI5'FおよびKRAB3'Rプライマーを用いて、2.5分伸長を用いる引き続く３サ イクルPCR反応においてテンプレートとして一緒に用いる。得られる約1500bpの オーバーラップするPCRアンプリコンを、GENECLEAN IIを用いて精製し、XhoIお よびSac Iで消化し、そして同様にXho IおよびSac Iで消化し、アルカリホスフ ァターゼで処理し、そしてGENECLEANIIを用いて0.7％アガロースゲルから精製し た真核生物発現ベクタープラスミドpEUK-Cl（Clontech，Palo Alto，CA）に連結 する。得られるlacl/KRAB発現構築物をpEUK-rKRと命名する。 lacI/KRAB発現カセットを含有する安定なPCL形質転換体を生成するために、rT A tet/トランスアクチベーター融合タンパク質カセットでの形質転換について既 に選択されているアルファウイルスPCLを、出発材料として用いる。例えば、ア ルファウイルスC/GLYCO/TAk PCL細胞（上記由来）を、選択マーカーをコードす る別のプラスミドとの同時トランスフェクションによってプラスミドpEUK-rKRで 安定に形質転換する。プラスミドpEUK-rKRおよびピューロマイシンアセチルトラ ンスフェラーゼ選択マーカー（Clontech）をコードするpPURを、それぞれ、40:1 のモル比で、製造業者によって記載されるようにLipofectamineを用いて、C/GLY CO/TAk PCL細胞（または他のPCL）に同時トランスフェクトする。トランスフェ クションの約24時間後、細胞を、トリプシン処理し、そして５μg/mlピューロマ イシンおよび0.5μg/mlテトラサイクリンを含有する培地に再プレートする。培 地を、新鮮な薬物含有培地に定期的に交換し、そして耐性細胞のフォーカスを増 殖させる。細胞を、トリプシン処理し、そして96ウェル組織培養ディッシュにお ける限界希釈によってクローン化し、そして個々の細胞クローンをスクリーニン グのために増殖させ、そして拡大する。ポジティブpEUK-rKR含有パッケージング 細胞クローン（C/G/TAk/rKR細胞と称される）を、lacIに特異的なポリクローナ ル抗血清（Stratagene，La Jolla，CA）で免疫染色することによって同定する。 次に、特異的なlacオペレーター（lac0）配列を、所望のptetに基づくアルフ ァウイルスベクター（上記を参照のこと）に挿入しなければならない。例えば、 ベクター構築物ptetSINlgpt-lucを、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いる ことによって、多コピーのlacOを含有するように改変する。Lac0オリゴヌクレオ チドを、対称のlacO配列を含有するように設計する。これは、全長の22bpパリン ドロームのオペレーター配列（Simonsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1624-1628 ，1984;Sadlerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:6785-6789，1983）を含み、そし て二本鎖分子に自己アニールした場合には隣接するAsc I部位を含む。LacOsymA （配列番号99） LacOsymA oligoを、自己アニールさせてAscI「粘着末端」DNAフラグメントを 形成させ、次いでAscIで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてGENE CLEAN IIを用いて0.7％ゲルから精製したプラスミドptetSINlgpt-lucに連結する 。lacO配列の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のタンデムコピーを含むクロー ンを配列分析によって同定し、そしてそれらに名称pOItetSINlgpt-luc、pOIItet SINlgpt-luc．pOIIItetSINlgpt-lucなどを与える。次いで、異なるlacOコピー数 を有する個々のクローンを、以下に記述するようにトランスフェクトし、そして 転写調節の最も厳密なレベルについて試験する。 アルファウイルスベクタープロデューサー細胞株を生成するために、DNAに基 づくpOtetSINlgpt-lucベクター構築物を、製造業者によって記載されるようにLi pofectamineを用いてC/G/TAk/rKR細胞に安定にトランスフェクトする。トランス フェクションの約24時間後、細胞を、トリプシン処理し、そして特定の細胞型に 至適化されそして0.5μg/mlテトラサイクリンを含有する選択培地（DMEM＋10％ 透析ウシ胎仔血清；250μg/mlキサンチン；15μg/mlヒポキサンチン；10μg/ml チミジン；２μg/mlアミノプテリン；25μg/mlミコフェノール酸）に再プレート する。培地を、新鮮な選択培地に定期的に交換し、そして耐性細胞のフォーカス を増殖させる。細胞を、トリプシン処理し、そして96ウェル組織培養ディッシュ における限界希釈によってクローン化し、そして個々の細胞クローンを、スクリ ーニングのために増殖させ、そして拡大する。pOtetSINlgpt-luc構築物で安定に 形質転換されたポジティブプロデューサー細胞株を、培地からのテトラサイクリ ンの除去、および誘導のための20mM IPTGの添加の少なくとも24時間後のルシフ ェラーゼの発現（以前に記載される）によって同定する。ルシフェラーゼ活性を 、プロデューサー細胞溶解物に対して、およびさらに培養上清を用いる発現の伝 達（tranfer-of-expression）実験の後の両方で測定する。 さらなるレベルの制御を、第３の、またはさらに第４のレベルの調節をアルフ ァウイルスベクター分子の転写を担うプロモーターに付加することによって取り 込ませ得る。このような付加的なレベルの調節は、最小のプロモーターに取り込 まれ得、そして他の誘導性系および/または細胞分化制御を含み得る。上記の場 合の各々において、安定な形質転換が、宿主細胞染色体への組み込みとして、ま たは例えば、EBVエピソームに基づくベクタープロモーター（非組み込みのため の）を用いて染色体外エピソームとして、達成され得る。 実施例８ アルファウイルス由来の空のまたはキメラのウイルス粒子の生成方法 実施例６に示したように、個々の欠陥ヘルパー（DH）発現カセットを、複数の アルファウイルスまたはそれらの改変体由来のエレメントを含むように構築し得 る。従って、実施例６に記載のように、ウイルス糖タンパク質の発現のための分 割（split）構造遺伝子DHカセットを、異なるアルファウイルス種由来のキャプ シド遺伝子および糖タンパク質遺伝子を含むように構築し得る。例えば、このよ うな異種アルファウイルス糖タンパク質DHカセットは、ロスリバーウイルス（RR V）由来のキャプシド遺伝子、およびシンドビスウイルス由来の糖タンパク質遺 伝子を含み得る。この構成（configuration）において、RRVキャプシド遺伝子は 、糖タンパク質遺伝子の翻訳のレベルを増強するように働く。 本明細書中に記載される異種アルファウイルス糖タンパク質DHカセットの構成 は、アルファウイルス粒子へのベクターレプリコンのパッケージングを改善する が、なお組換えの可能性を減少させ、その結果、複製コンピテントなアルファウ イルスを形成するように設計される。異種アルファウイルス糖タンパク質DH発現 カセットは、実施例６に記載のDH発現カセットにおけるシンドビスウイルスキャ プシド遺伝子の置換物として（「ゲノム」構造タンパク質遺伝子PCL）、異種ア ルファウイルスキャプシド遺伝子（例えば、RRV）を含むものである。分割構造 遺伝子PCLにおける第２のDH発現カセットは、例えば、シンドビスウイルスキャ プシド遺伝子を含む。従って、シンドビスウイルス構造タンパク質を有する組換 えアルファウイルスベクター粒子の生成のための分割構造遺伝子PCLは、例えば 、個々のDH発現カセット上のシンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子およびキャ プシド遺伝子を伴って誘導され得る。 RRVの遺伝子の全てを含むが、シンドビスウイルス由来のキャプシド遺伝子を 有するキメラウイルス、または相反するキメラウイルスは、感染性ウイルス粒子 ヘアセンブリしないことが以前に示されている(Lopezら、J．Virol．68:1316-13 23，1994)。その著者らは、この報告においてウイルスアセンブリにおける糖タ ンパク質E2のカルボキシ末端とキャプシドタンパク質との相互作用が、異種アル ファウイルスの構造タンパク質の間では起こり得ないと結論した。従って、実施 例６に記載の分割構造遺伝子アルファウイルスPCLに起こる組換えゲノムであっ て、シンドビスウイルスの非構造タンパク質遺伝子（ベクターレプリコン起源） 、RRVキャプシド遺伝子、およびシンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子からな るゲノムは、複製コンピテントであるべきではなく、ウイルス（複製コンピテン トなシンドビスウイルス、RCSV）の増殖を生じる。異種アルファウイルス種間の パ ッケージング制限は、キャプシド遺伝子（１つのアルファウイルス由来の翻訳増 強エレメントおよび異なるアルファウイルス由来の糖タンパク質遺伝子を含む） で構成されるDHカセットの構築を可能にする。 しかし、図31に例示されるように、異種アルファウイルスの構造タンパク質間 ではアセンブリは起こり得ないというLopezら（同書）の観察は、正確ではない 。実際、RRVキャプシド遺伝子、およびシンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子 からなるDHカセットは、感染性ウイルス粒子を生成する。簡単に述べれば、BHK 細胞を、SINrep/Lac Zレプリコン（Bredenbeekら、J．Virol.，67:6439-6446，1 993）およびDH-BB(5'tRNA/SIN)Crrv（実施例６および図24；RRVキャプシド/シン ドビスウイルス糖タンパク質）でインビトロで転写したRNAと同時エレクトロポ レートした。エレクトロポレーションおよびインビトロ転写を、実施例１に記載 のように行った。エレクトロポレーションの後、BHK細胞を、実施例１に記載と 全く同様に、ダクチノマイシンで処理し、そして［3H]ウリジンで標識した。エ レクトロポレーションの18時間後、培養培地を回収し、そして6,000rpmで10分間 の遠心分離によって明澄化した。上清に残ったベクター粒子を、超遠心分離によ って、スクロースクッション上に最初に重層したあとにペレット化した。RNAを 、実施例１に記載と全く同様に、エレクトロポレーションの18時間後にBHK細胞 から、およびウイルスペレットから単離し、変性グリオキサールアガロースゲル 上で電気泳動し、そしてオートラジオグラフィーによって可視化した。SINrep/L acZおよびDH-BB Crrv RNAでエレクトロポレートしたBHK細胞およびウイルス粒子 に存在するウイルスRNAを、図31（レーン１、パネルＡ、およびレーン１、パネ ルＢ）に示す。SINrep/LacZおよびDH-BB Crrv RNAについてのゲノムおよびサブ ゲノム複製種に対応するRNAは、エレクトロポレートしたBHK細胞および生成され たウイルス粒子の両方に存在した。結果は、Lopezら（同書）とは対照的に、RRV キャプシドタンパク質およびシンドビスウイルス糖タンパク質からなるキメラア ルファウイルス粒子の形成を実証する。さらに、キメラアルファウイルス粒子中 のゲノムおよびサブゲノムSINrep/LacZおよびDH-BB Crrv RNAの無差別パッケー ジングは、ロスリバーキャプシドタンパク質が、シンドビスウイルスパッケージ ング配列（これは、SINrep/LacZベクターレプリコンのnsP1遺伝子中に存在する ） を特異的に認識し得ないことを示す。 エレクトロポレーションの18時間後にSINrep/LacZおよびDH-BB Crrv RNAでエ レクトロポレートしたBHK細胞中に存在するウイルスタンパク質、および生成さ れたウイルス粒子を、図32（レーン１、パネルＡ、およびレーン１、パネルＢ） に示す。エレクトロポレートした細胞中のウイルス特異的構造タンパク質と生成 されたキメラアルファウイルス粒子とを、区別できなかった。つまり、図32は、 SINrep/LacZおよびDH-BB Crrv RNAでエレクトロポレートしたBHK細胞から生成さ れたウイルス粒子が、RRVキャプシドならびにシンドビスウイルス糖タンパク質E lおよびE2を含んでいたことを明確に示す。この結果は、Lopezら（同書）とは対 照的に、異種アルファウイルスキャプシドと糖タンパク質との間にはアセンブリ における制限（これは、キメラウイルス粒子の形成を防止する）が存在しないと いう疑う余地のない証拠を提供する。 従って、Lopezらの結果および考察とは明確に対照的に、RRVキャプシドタンパ ク質のアミノ末端は、異種シンドビスウイルスゲノムに結合し、そして感染性キ メラアルファウイルス粒子を形成し得る。重要なことに、異種アルファウイルス キャプシドタンパク質と糖タンパク質との間にはウイルスアセンブリの制限が存 在するという以前の結論は、不正確である。次いで、本明細書中に記載されるキ メラアルファウイルス粒子の生成はまた、上記の分割構造遺伝子PCLにおいてRCS Ｖの形成を生じる。なぜなら、シンドビスウイルス非構造タンパク質遺伝子（ベ クターレプリコン由来）、RRVキャプシド遺伝子、およびシンドビスウイルス糖 タンパク質遺伝子からなる組換えゲノムは、感染性ウイルスを生成するからであ る。あるいは、個々のアルファウイルス構造タンパク質とベクターレプリコンと の間のこのパッケージングの制限の欠如は、ベクター粒子の指向性が改変される ことを可能にする。例えば、シンドビスウイルスレプリコンは、リンパ指向性の 組換えベクター粒子を生成するために、ヴェネズエラウマ脳炎ウイルス構造タン パク質とともにパッケージングされ得る。 ２つの別々の以前の研究において記載された結果は、キャプシドタンパク質と 、三角測量数（triangulationnumber）(T)＝３を有する２つの正十二面体ウイル スポジティブRNA鎖ゲノム、turnip crinkleウイルス(TCV)およびsouthern bean mosaicウイルス(SBMV)、との間の相互作用のインビトロでの消失が、ウイルス粒 子の解離、および核酸を含まないＴ＝１粒子の形成を生じたことを示している(S orgerら、J．Mol．Biol.，191:639-656，1986、およびEricksonおよびRossmann ，Virology 116:128-136，1982)。核酸の非存在下では、野生型ウイルスに類似 のＴ＝３粒子は、インビトロで形成されなかった。OwenおよびKuhn(J．Virol.， 70:2757-2763，1996)は、インビボでのキャプシド形成反応の特異性を指示する のに必要であるキャプシドタンパク質の領域を同定するために、キャプシドに欠 失を含むシンドビスウイルスゲノムのパッケージング特性を調査した。キャプシ ドの残基97-106に対応する欠失を含む１つの変異体ウイルス[CD(97-106)]は、ゲ ノムRNAおよびサブゲノムRNAの両方をキャプシド形成し、このことは、キャプシ ドタンパク質のドメインが、ゲノムRNAパッケージングシグナルの特異的認識の ために必要とされることを示す。なお別の報告において、アウラアルファウイル スのパッケージング特性が調査された(Rumenapfら、J．Virol.，69:1741-1746， 1995)。この研究において、キャプシドタンパク質キャプシド形成配列相互作用 開始複合体を含むアルファウイルスパッケージングのための機構が提唱された。 この提唱された機構は、その筆者らおよび他者（OwenおよびKuhn、同書を含む） の観察（そこでは、26Sおよび49SアルファウイルスRNAがＴ＝１、Ｔ＝３、Ｔ＝ ４、およびＴ＝７ウイルス粒子にパッケージングされる）に基づいており、アル ファウイルスでの感染の間に生じる空のキャプシドは報告されていない。 上記の文献およびそれに含まれる議論に基づいて、キャプシド形成反応の特異 性を指示するために必要とされるキャプシドタンパク質ドメインに対応する領域 を欠失するRRVキャプシド遺伝子、およびさらにウイルスRNAと静電的に結合する そのまわりの塩基性残基は、ウイルスRNAを含む安定なキャプシド粒子を形成し 得るべきではない。従って、この欠失したRRVキャプシド遺伝子およびシンドビ スウイルス糖タンパク質遺伝子からなる異種アルファウイルスDHカセットから発 現されたアルファウイルス構造タンパク質は、アセンブリして安定なキメラウイ ルス粒子にならないはずである。従って、上記および実施例６において考察され た分割構造遺伝子PCLにおいて、シンドビスウイルス非構造タンパク質遺伝子、R RVキャプシド遺伝子（パッケージング特異性に対応する領域およびそのまわりの 塩基性残基を欠失する）、およびシンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子からな る組換えゲノムは、感染性ウイルスを生成し得なかった。実施例６において記載 したように、シンドビスウイルスキャプシドタンパク質は、別々のDH発現カセッ トから発現される；従って、３つのシンドビスウイルス構造タンパク質は、全体 として発現され、その結果、組換えベクター粒子を生成する。 シンドビスウイルスパッケージング配列に結合する発現されるタンパク質の予 想される領域に対応するRRVキャプシド遺伝子のヌクレオチド（Weissら、Noc．A cids．Res.，22:780-786，1994、およびLopezら、同書）（ウイルスRNAに静電的 に結合する塩基性残基を含む）を、異種アルファウイルスキャプシド糖タンパク 質DHを構築するために欠失させた。これは、翻訳増強および翻訳後切断による正 確なpE2-6K-E1ポリタンパク質プロセシングを提供したが、安定なキメラRRV/シ ンドビスウイルス粒子をアセンブリし得なかった。図33は、RRVキャプシドタン パク質、および３つの個々のRRVキャプシド遺伝子変異体（CΔ1rrv，CΔ2rrv、 およびCΔ3rrv）から発現されるキャプシドタンパク質の疎水性プロフィール（K yte-Dolittle）を例示する。ここで、ウイルスパッケージング配列RNAと相互作 用するリジンリッチタンパク質をコードする種々の量のキャプシド遺伝子が欠失 していた。RRVキャプシドタンパク質のリジンリッチ塩基性領域を図33に示す。 さらに、疎水性プロフィールは、このリジンリッチ塩基性領域が、３つの個々の RRVキャプシド遺伝子変異体CΔ1rrv、CΔ2rrv、およびCΔ3rrvにおいて段階的に 排除されていることを実証する。図34は、変異体CΔ1rrv、CΔ2rrv、およびCΔ3 rrvにおける欠失の結果として、発現されたRRVキャプシドタンパク質において排 除されているリジン残基を示す。以下に示す表は、構築物CΔ1rrv、CΔ2rrv、お よびCΔ3rrvのRRVゲノムにおいて欠失したヌクレオチドを示す。 構築物 欠失したRRVゲノムnt CΔ1rrv 7841〜7891 CΔ2rrv 7796〜7891 CΔ3rrv 7760〜7891 RRVキャプシド遺伝子欠失を、図23に示し、そして実施例６で記載したDH-BB Crr vプラスミドDNA上で構築した。指示されたRRVキャプシド遺伝子配列を、実施例 ６に示すプライマーおよび他のクローニング工程を用いてPCRによって欠失させ た。 上記で考察した図31および32は、SINrep/LacZおよびDH-BB CΔ1rrv．CΔ2rrv 、またはCΔ3rrv RNAでエレクトロポレートされたBHK細胞において合成され、こ れらの細胞の培養液に含まれるウイルス粒子中に存在するウイルス特異的RNA（ 図31）およびタンパク質（図32）を図示する。ゲノムおよびサブゲノム種を、エ レクトロポレートした細胞において、SINrep/LacZレプリコンおよび３つ全てのD H-BB CΔ1rrv、CΔ2rrv、またはCΔ3rrv DH RNAの両方について検出した(図31、 パネルＡ)。しかし、SINrep/lacZレプリコンは、ウイルス粒子中のレプリコンゲ ノムRNAの不在によって示されるように、RRVキャプシド遺伝子に欠失を含むDH R NAでエレクトロポレートした細胞においてベクター粒子にパッケージングされな かった(図31、パネルＢ)。さらに、細胞をRRVキャプシドのより大きな欠失（CΔ 2rrvまたはCΔ3rrv）を含むDH分子でエレクトロポレートした場合、ヘルパーゲ ノムRNAおよびサブゲノムRNAは、非常に非効率的にパッケージングされ、そして 変性ゲルのオートラジオグラムにおいてほとんど不可視であった(図31、パネル Ｂ、レーン３および４)。対照的に、SINrep/lacZゲノムRNA（およびCΔ2rrvまた はCΔ3rrvでのエレクトロポレーションにおけるDH RNA）を、RRVキャプシド遺伝 子に欠失を含むDHでエレクトロポレートしたBHK細胞由来のウイルス粒子におい て検出しなかったのに対し、等価なRRVキャプシドタンパク質およびシンドビス ウイルス糖タンパク質レベルを、全てのDH RNAでエレクトロポレートした細胞由 来のウイルス粒子において、RRVキャプシド遺伝子が欠失を含むか否かに関わら ず、観察した(図32、パネルＡおよびＢ)。この結果は、ベクターレプリコンを含 んでいない安定なキメラウイルス粒子、または他のウイルス特異的RNAが、SINre p/lacZゲノムRNAおよびDH RNAでエレクトロポレートされたBHK細胞（これから、 ゲノムRNAに結合し得ないキャプシドタンパク質が発現された）において形成さ れたことを示す。安定な空の異種アルファウイルス粒子の形成は、以前の調査の 結果および議論に基づいて予期されずそして予想されない(Lopezら、J．Virol． 6 8:1316-1323，1994，Sorgerら、J．Mol．Blol.，191:639-656，1986，Erickson およびRossmann，Virology 116:128-136，1982、およびRumenapfら、J．Virol., 69:1741-1746，1995)。 生成されたウイルス粒子の組成を決定するために、本明細書中に記載されるよ うに、SINrep lacZおよび種々のRRVキャプシド遺伝子構成を含むDH RNAで、BHK 細胞をエレクトロポレートし、そして続いて実施例１に記載のように、ダクチノ マイシンで処理し、[35S]メチオニンおよび[3H]ウリジンで標識した。生成され るウイルス粒子の構成を、明澄化した細胞培養培地を35,000rpmにて２時間、SW- 41ローター中で20％〜40％（w/w）スクロース勾配上で超遠心分離することによ って決定した。この研究の結果は、図35〜37に示され、そして安定な空の異種ア ルファウイルス粒子の形成を再び示す。図35は、高MOI(5)で野生型ウイルス、To to1101に感染したBHK細胞において合成された粒子中に取り込まれた[35S]メチオ ニンおよび[3H]ウリジンの相対的レベルを示す。図36は、SINrep/LacZおよびDH- BB(5'tRNA)Crrv（図23）RNAでエレクトロポレートしたBHK細胞において合成され た粒子中に取り込まれた[35S]メチオニンおよび[3H]ウリジンの相対的レベルが 、野生型ウイルスに感染した細胞におけるレベルと同様であったことを示す。対 照的に、図37は、SINrep/LacZおよびDH-BB(5'tRNA)CΔ3rrvでエレクトロポレー トしたBHK細胞において生成された粒子が、非常に低レベルの取り込まれた[3H] ウリジンを含んでいたことを示す。図38は、図35〜37を編集したものであり、粒 子に取り込まれた[35S]メチオニンおよび[3H]ウリジンの相対的レベルが、野生 型アルファウイルスキャプシド遺伝子を含むRNAで感染またはエレクトロポレー トしたBHK細胞におけるレベルと類似であったのに対し、RRVキャプシド遺伝子の nt7760〜7891の欠失を含むDH RNAでエレクトロポレートしたBHK細胞が、SINrep/ LacZ RNAを欠失する安定なキメラの空のアルファウイルス粒子を形成したことを 明らかに示す。SINrep/LacZ RNAおよびDH-BB CD3rrvでインビトロで転写されたR NAでエレクトロポレートした細胞株において生成され、そして[35S]メチオニン で標識された空のアルファウイルス粒子の力価を、Toto 1101野生型ウイルスで 感染し、そして[35S]メチオニンで標識したBHK細胞との比較によって決定した。 Toto1101感染細胞由来のウイルス含有スクロース勾配画分に存在する放射能のレ ベルを定量 し、そして実施例１に記載した方法に従うプラークアッセイによって決定される これらの同一の画分に存在するウイルス力価に関連付けた。空のアルファウイル ス粒子力価決定のために、SINrep/LacZ RNAおよびDH-BB CD3rrvでインビトロ転 写されたRNAでエレクトロポレートしたBHK細胞由来のウイルス粒子含有スクロー ス勾配画分に存在する放射能のレベルを定量し、そしてToto 1101感染細胞から の[35S]メチオニン/ウイルス力価に関連付けた。欠失ロスリバーウイルスキャプ シドおよびシンドビスウイルス糖タンパク質を含み、SINrep/LacZ RNAおよびDH- BB CD3rrvでインビトロ転写されたRNAでエレクトロポレートした細胞において生 成された空のキメラウイルス粒子の力価は、１×109粒子/mlであった。 本発明は、先に、一般的におよび好ましい実施態様に関しての両方で記載され たが、前述の記載を考慮して、変化および改変が当業者に想到されることが理解 される。それゆえ、添付の請求の範囲は、請求される本発明の範囲内にある全て のこのような改変を含むことが意図される。 さらに、本発明の背景を明らかにするため、そして特に詳細な説明および実施 例において記載したような本発明の実施に関するさらなる詳細を提供するために 引用された刊行物および他の資料は、本明細書中でその全体が参考として援用さ れる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号 ０８／６７９，６４０ (32)優先日 平成８年７月12日(1996．7．12) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 デュベンスキー，トーマス ダブリュー. ジュニア アメリカ合衆国 カリフォルニア 92067, ランチョ サンタフェ，ピー．オー．ボッ クス 675205（番地なし) (72)発明者 ポロ，ジョン エム. アメリカ合衆国 カリフォルニア 92024, エンシニタス，ウィサム ロード 221 (72)発明者 ベリー，バーバラ エイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 92124, サンディエゴ，デスペジョ プレイス 5850 (72)発明者 シュレシンガー，ソンドラ アメリカ合衆国 ミズーリ 63105，セン ト ルイス，マクファーソン ストリート 6320 (72)発明者 ドライガ，サーゲイ エイ. アメリカ合衆国 ミズーリ 63105，セン ト ルイス，サウスウッド アベニュー ナンバー３ 6334 (72)発明者 フロロブ，イリャ アメリカ合衆国 ミズーリ 63105，セン ト ルイス，クロムウェル ドライブ ナ ンバー２エスイー 7515

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  1. 【特許請求の範囲】 １．単離された核酸分子であって、組換えアルファウイルス粒子に作動可能に組 み込まれた場合に、野生型アルファウイルスと比較して、哺乳動物細胞における 発現後に宿主細胞に指向される巨大分子合成の50％阻害に到達するのに必要な時 間を増加させる、改変されたアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子を含む、 核酸分子。 ２．単離された核酸分子であって、組換えアルファウイルス粒子に作動可能に組 み込まれた場合に、野生型と比較して減少したレベルのベクター特異的RNA合成 を有し、そして野生型組換えアルファウイルス粒子と比較して同一またはより大 きいレベルの、ウイルス連結領域プロモーターから転写されたRNAによりコード されるタンパク質を有する、アルファウイルス非構造タンパク質遺伝子を含む、 核酸分子。 ３．アルファウイルスベクター構築物であって、cDNAからのインビトロでのウイ ルスRNAの合成を開始する5'プロモーター、アルファウイルスRNAの転写を開始す る5'配列、請求項１または２に記載の核酸分子を含む４つ全てのアルファウイル ス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスRNAポ リメラーゼ認識配列、および3'ポリアデニル域を含む、アルファウイルスベクタ ー構築物。 ４．真核生物系において翻訳可能なアルファウイルスRNAベクターレプリコンで あって、アルファウイルスRNAの転写を開始する5'配列、請求項１または２に記 載の核酸分子を含む４つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能に コードする核酸分子、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列、および3'ポ リアデニル域を含む、アルファウイルスRNAベクターレプリコン。 ５．薬学的組成物であって、請求項４に記載のアルファウイルスRNAベクターレ プリコンおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物 。 ６．組換えアルファウイルス粒子であって、１つ以上のアルファウイルス構造タ ンパク質、脂質エンベロープ、および請求項４に記載のRNAベクターレプリコン を含む、組換えアルファウイルス粒子。 ７．前記アルファウイルス構造タンパク質および脂質エンベロープが異なるアル ファウイルス種に由来する、請求項６に記載の組換えアルファウイルス粒子。 ８．請求項６または７に記載の組換えアルファウイルス粒子および薬学的に受容 可能なキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物。 ９．請求項６または７に記載の組換えアルファウイルス粒子で感染させた、宿主 細胞。 １０．ゲノム核酸またはRNAベクターレプリコン核酸を実質的に全く含まない、 トガウイルスキャプシド粒子。 １１．１つ以上のアルファウイルス糖タンパク質を含む脂質エンベロープをさら に含む、請求項１０に記載のキャプシド粒子。 １２．アルファウイルスエンベロープをさらに含む、請求項１０に記載のキャプ シド粒子。 １３．前記キャプシドが、アルファウイルス、ルビウイルス、フラビウイルス、 およびペスチウイルスからなる群より選択されるトガウイルスに由来する、請求 項１０に記載のキャプシド粒子。 １４．請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のキャプシド粒子および薬学的に 受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物。 １５．アルファウイルス構造タンパク質発現カセットであって、DNAからのRNAの 合成を開始する5'プロモーター、１つ以上の機能的なアルファウイルス構造タン パク質をコードする核酸分子、発現カセットの転写に作動可能に連結された選択 マーカー、および転写終結を制御する3'配列を含む、アルファウイルス構造タン パク質発現カセット。 １６．アルファウイルスパッケージング細胞株であって、請求項１５に記載のア ルファウイルス構造タンパク質発現カセットを含む細胞を含む、アルファウイル スパッケージング細胞株。 １７．アルファウイルスプロデューサー細胞株であって、安定に形質転換された アルファウイルス構造タンパク質発現カセット、ならびに請求項４に記載のRNA ベクターレプリコン、請求項３に記載のアルファウイルスベクター構築物、およ び請求項１８に記載の真核生物重層ベクター開始系からなる群より選択されるベ クターを含む細胞を含む、アルファウイルスプロデューサー細胞株。 １８．真核生物重層ベクター開始系であって、cDNAからのアルファウイルスRNA のインビボでの5'合成を開始し得る5'プロモーター、アルファウイルスRNAの転 写を開始する、該5'プロモーターに続く配列、請求項１または２に記載の核酸分 子を含む４つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする 核酸分子、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列、および3'ポリアデニル 域を含む、真核生物重層ベクター開始系。 １９．請求項１８に記載の真核生物重層ベクター開始系を含む、宿主細胞。 ２０．請求項１８に記載の真核生物重層ベクター開始系および薬学的に受容可能 なキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物。 ２１．選択された異種配列を脊椎動物または昆虫に送達するための方法であって 、請求項３に記載のアルファウイルスベクター構築物、請求項４に記載のアルフ ァウイルスRNAベクターレプリコン、請求項６に記載の組換えアルファウイルス 粒子、または請求項１８に記載の真核生物重層ベクター開始系を、脊椎動物また は昆虫に投与する工程を包含する、方法。 ２２．組換えアルファウイルス粒子を作製する方法であって、以下の工程： (a)請求項１８に記載の真核生物重層ベクター開始系、請求項４に記載のRNAベク ターレプリコン、および請求項６に記載の組換えアルファウイルスベクター粒子 からなる群より選択されるベクターを、組換えアルファウイルス粒子の生成を可 能にするに十分な条件下および時間で、請求項１６に記載のパッケージング細胞 の集団に導入する工程；ならびに (b)組換えアルファウイルス粒子を収集する工程、 を包含する、方法。 ２３．選択されたタンパク質を作製する方法であって、以下の工程： (a)選択された異種タンパク質をコードし、そして、請求項１８に記載の真核生 物重層ベクター開始系、請求項４に記載のアルファウイルスRNAベクターレプリ コン、および請求項６に記載の組換えアルファウイルスベクター粒子からなる群 より選択されるベクターを、該選択されたタンパク質の生成を可能にするに十分 な条件下および時間で、請求項１６に記載のパッケージング細胞の集団に導入す る工程；ならびに (b)該パッケージング細胞により生成されるタンパク質を収集する工程、 を包含する、方法。 ２４．選択されたタンパク質を作製する方法であって、請求項１８に記載の真核 生物重層ベクター開始系を、該選択されたタンパク質の発現を可能にするに十分 な条件下および時間で、宿主細胞に導入する工程を包含する、方法。 ２５．請求項４に記載のアルファウイルスRNAベクターレプリコンを含む、宿主 細胞株。
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