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JP2001521167A - 蛍光免疫分析を行う装置および方法 - Google Patents

蛍光免疫分析を行う装置および方法

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JP2001521167A
JP2001521167A JP2000518268A JP2000518268A JP2001521167A JP 2001521167 A JP2001521167 A JP 2001521167A JP 2000518268 A JP2000518268 A JP 2000518268A JP 2000518268 A JP2000518268 A JP 2000518268A JP 2001521167 A JP2001521167 A JP 2001521167A
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JP
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light
optical waveguide
optical
fluorescence
piston
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Application number
JP2000518268A
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English (en)
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カテルカンプ，アンドレアス
クンツ，ウルリッヒ
グラヴェ，フランク
ケイ，ゲラン
Original Assignee
インスティトゥート フュール ヘモ‐ウント ビオゼンソリク ミュンステル エー．ファウ．
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

(57)【要約】 蛍光免疫分析を行う方法及び装置が開示される。光は少なくとも１個の光源から光が光導波管の一端の表面に照射され、光導波管中に導入された光による光導波管の表面におけるエバネッセントフィールド励起により、汎用受容体‐配位子系の化学的または生化学的パートナーに結合した少なくとも１個の標識物質において蛍光が励起される。本発明の解法は蛍光免疫分析を高精度、低コストで短時間に行う可能性を提供することである。この課題を解決するため、蛍光が光導波管から出離させられ、光学系を経て蛍光の強度が測定される光学検出器に入射される。光導波管はピストン−シリンダーユニットのピストン中に形成した測定室中に保持され、測定室はピストンに形成した入り口によりシリンダー内部に接続される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は蛍光免疫分析を行う装置および方法に関し、少なくとも１個の光源から
出た光が光導波管の一端の表面に導かれ、且つ光導波管に導入（カップリング）
され、光導波管の表面におけるエバネッセントフィールドにより汎用受容体‐配
位子系の化学的または生化学的パートナーに結合した少なくとも１個の標識物質
の蛍光が励起発光し、その蛍光が部分的に光導波管に導入され、更に光導波管の
表面から出離（デカップリング）し、その励起光は光学系を経て光検出器に導か
れて入射し、検出器により蛍光強度が測定される。
【０００２】 （技術背景） 本発明により、例えば抗体−抗原等の汎用受容体‐配位子系上で多彩な生化学分
析を行うことができる。本分析法により、液体試料中の化学物質または生化学物
質が定量的に分析される。
【０００３】 抗体をある標識物質（フルオロゲン：ｆｌｕｏｒｏｇｅｎ）で標識することが可
能であるが、個々の標識物質は特定の励起波長で光学的に励起され、励起により
得られる波長の異なった蛍光は適当な光学検出器で検出され、蛍光の強度を用い
て試料液由来の化学物質または生化学物質の個々の割合を測定する。蛍光励起の
ためには、界面で生じるエバネッセントフィールドが用いられる。但し、エバネ
ッセントフィールドと、特に励起光（蛍光を励起させるための光）の必要な全反
射との周知の物理的関係性を考慮しなければならない。
【０００４】 ＷＯ９７／１０５０６によれば、蛍光免疫分析を行う装置では光源から出た光を
導入する光導波管が用いられ、エバネッセンスフィールド励起により試料が蛍光
を発生する。個々の分析を行う前、即ち光導波管も含まれるレセプタクルに試料
液を導入するまでに、光導波管の表面は化学成分または生化学成分で被覆されて
いる。
【０００５】 光を光導波管に導入するために、複数の個々の光学部品で組み立てられた極めて
精巧で複雑な光学系が必要である。従って、用いる光源からの光はレンズ系を経
て半透明鏡へ導かれ、光の一部は参照信号として光学検出器へ導入され、光のそ
の他の部分は別なレンズを経てファイバー中に導入される。この場合、励起光お
よび蛍光のほとんどが再び光導波管から出離するように、光導入および出離表面
と反対側の光導波管の末端は金属処理されている。その結果、光検出器で評価さ
れる励起光と蛍光の比率は悪くなり、測定精度が損なわれるという望ましくない
事態が生じる。
【０００６】 この公知の装置の他の欠点は、光が光導波管の光導入面の前に置かれたレンズを
通過しなければならず、エバネッセンスフィールド励起にとって有利な狭い角度
範囲内での正確な主角度による光導波管への導入が、不可能ではないにしても極
めて困難となることである。
【０００７】 この公知の方法によれば、蛍光免疫分析は以下のように行われる。まずレセプタ
クルに収容され、あらかじめ被覆された光導波管は試料液と接触する。この態様
は、試料液がレセプタクルの蓋に開けた貫通孔を通って侵入することにより、光
導波管の表面に固定化された受容体‐配位子系の相補成分と結合することにより
行われる。その成分結合後、用いた光源から光を照射することにより蛍光が励起
され、その強度が光検出器で測定される。
【０００８】 成分結合過程では光導波管表面への物質の個々の輸送が重要であり、この場合は
対流と拡散を考慮しなければならない。ＷＯ９７／１０５０６が公開した方法で
誤差を生じるのは、レセプタクルに含まれる試料容積は一定であり、貫通孔を通
る試料液の導入は極めて迅速に行われるため、結合は静止後の液体中で行われる
からである。この場合、結合は主に拡散に影響されるが、このために、他の欠点
を別にしても測定時間が長くなる。
【０００９】 時間解析を行わないこの種の測定では、測定信号のバックグラウンドの補正が必
要であるが、ＷＯ９７／１０５０６ではそれが考慮されていない。
【００１０】 この公知の方法に関連する他の基本的な欠点は、測定結果の精度を増すために参
照信号として励起光のみが用いられていることである。しかしながら、測定精度
と分析結果の有用性を改善すると共に再現性を増すためには、免疫分析により適
した参照測定を行うことが必要である。
【００１１】 （発明の開示） 従って、本発明の目的は、短時間かつ低コストで高い精度の蛍光免疫分析を行い
得る方法を提供することである。
【００１２】 本発明によれば、この目的は請求項１の特徴により達成される。また、従属請求
項に含まれる特徴を用いるならば、本発明の有利な実施態様と展開が可能になる
。
【００１３】 本発明の装置は既に説明した最新技術に基づいており、エバネッセントフィール
ドによって蛍光励起するための光を光導波管に導入すべく少なくとも１個の光源
を使用し、汎用受容体‐配位子系のパートナーに結合する標識物質の蛍光が光検
出器で測定される。蛍光と励起光の一部は、励起光が導入される同じ表面から出
離する。光導波管はピストン−シリンダーユニットのピストン中に形成された測
定室中に保持される。ピストンの測定室は、ピストンを通過するように動作する
シリンダー内部への入り口を有する。この様なシリンダー−ピストンユニットは
少なくとも通常のシリンジと同様に構成されるが、ピストンのみは測定室を形成
するために変形しなければならない。
【００１４】 ピストン内に測定室と連通する付加的な試料収集室を形成することにより、更に
改良することができる。これにより、インキュベーション（潜伏）と測定が行わ
れ、個々の分析を行った後、試料が確実に保持され、対応するピストン‐シリン
ダーユニットが、その試料を重大な危険性なく輸送し廃棄できるようにした構造
を形成することになる。
【００１５】 光導波管はその一端面において励起光が導入され、再びその端面から蛍光と励起
光の一部が出離するものであり、その導入／出離方向においてピストンを閉じる
表面を有する。従って測定用の閉室と試料収集室も作られる。さらに、この表面
は光導波管をピストンのこの端面に固定する役割も有する。光導波管と表面を例
えばポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等の同じ材料で一体に製作すること
が有利である。
【００１６】 光導波管の他端には、好ましくは黒色プラスチック製の光吸収体を取り付けるこ
とが有利である。光吸収体は光導波管を測定室の下の部分に配置し固定する様な
寸法と形状にされる。
【００１７】 光吸収体により、励起光と蛍光の比率を測定に好都合の値に改善するさらに好ま
しい効果が得られる。光吸収体によりほとんどすべての励起光が吸収され、蛍光
は半分に減少するのみであるので、２種の光成分の比率は蛍光測定に都合の良い
様に変化する。従って、弱い蛍光を測定するために極めて感度の高い光検出器を
使用し得る。
【００１８】 光導波管を光導波管中で光伝播路と平行に走る数個の光光伝導セグメントに分割
することも可能である。個々のセグメントは薄い層により相互に空間的に分離さ
れている。全反射により光を伝播するため、この層の屈折率ｎ２は光波伝導セグ
メントの屈折率より小さい。蛍光免疫分析を個々の光波伝導セグメントを用いて
行い得るので、この様なセグメント化された光導波管を用いて複数の物質の測定
が可能である。
【００１９】 分析を行うために、ピストンを封じている表面に開閉可能の開口を設けることが
さらに好都合であり、閉じ蓋は例えば、必要に応じて取り除いて開放し、後に戻
すことができる、例えば薄い膜または対応するプラグとしてもよい。
【００２０】 個々の試料液は通常のシリンジがそうであるように、好ましくはシリンダーの導
入口を経て供給される。
【００２１】 シリンダーを満たした後、試料液が漏れるような不都合を避けるため、導入口は
バルブで閉じるようにすれば好都合である。
【００２２】 本発明の装置のさらに好ましい実施態様では、少なくとも試料収集室に含まれる
吸収材料が用いられ、吸収材料の一部は測定室まで延長される。
【００２３】 試料液中に含まれるある成分を測定から除外するため、または免疫カラムおよび
／または膜および／またはフィルターを用いることにより測定に影響を与えるた
め、前記入り口の前、または内部からピストンを通り、測定室中にかけて、フィ
ルターおよび／または免疫カラムおよび／または透過性または半透過性の膜が置
かれる。
【００２４】 光導波管の表面を異なった薬品または抗体等の生化学成分で被覆することにより
、多様な免疫分析を行うことができるが、被覆は例えば２段バッチ法で行うこと
ができる。このバッチ法には例えば個々の成分の吸着固定化による被覆に加えて
、光導波管表面の事前の洗浄が含まれる。この方法は通常の浸漬法で行うことが
でき、それにより比較的多数のこの様な光導波管の同時処理が容易に、且つ有効
に行い得る。光導波管は通常の射出成形法で製造することもできるので、射出成
形後に多数の連続した光導波管を得ることができ、当然この操作は極めて効率よ
く行うことができる。
【００２５】 この方法で被覆された光導波管は次に、先に述べた様に作られたピストンの測定
室に挿入され、光導波管の一端の表面に設けられたピストンを封閉するための開
口も閉じられる。この表面のピストンへの接続は接着剤で行われ、確実に密封さ
れる。
【００２６】 シリンダーに挿入する前に、使用するピストンの面を例えば生物成分で被覆する
ことも可能である。
【００２７】 また、シリンダーの内部表面を凍結乾燥した生物成分で被覆することもできる。
シリンダーの入り口の表面を被覆することも可能である。
【００２８】 この様にして調製した場合、本発明の装置は個々の要請に対応することができ、
適当な条件下でより長期間の保存も可能になる。
【００２９】 この様にして調製したピストン−シリンダーユニットは、必要あればシリンジの
様に引き抜いて試料液で満たすことができ、試料液の正確な量をシリンダー中に
引き込むことができる。空気が抜ける開口は閉じたままであるため、ピストン内
の空気は置換されず、試料液はシリンダー内のみに止まり、ピストンの入り口を
通って測定室内に入ることも、従って試料収集室に入ることもない。
【００３０】 シリンダーおよび／またはシリンダー表面および／またはピストン面を生物成分
で被覆するに当たり、生物成分は充填中の試料液に入れられる。この過程で生物
成分と化学または生化学成分とが反応（プレインキュベーション）する。このプ
レインキュベーション後、個々の前処理された試料が測定室に導かれ、端面の空
気抜き口が開かれると光導波管を通過する。この目的（端面封鎖）のためにフィ
ルムを用いる場合には、前記の過程（空気口の開放）はフィルムを取り除くか、
フィルムに穴を開けることで行われる。測定室および試料収集室からの空気が抜
けると、各室は毛細管作用により液体で満たされ、試料液は光導波管の外周面を
通って連続的に流れる。シリンジピストンを固定したままでシリンダーを一定の
方向に動かすことにより、試料液は光導波管の外周面を通って一定の流速で流れ
る。測定室中の空気、特に試料収集室中の空気が圧縮され、試料は光導波管の外
周面を通って流れ得るので、端面の空気抜き開口部が開いていることは必須では
ない。この様な操作法では、端面の空気抜き開口部そのものが不要である。
【００３１】 プレインキュベートされた試料が測定室を通って流れる間に、励起光用の光源か
らの光が正しい角度で表面に入射し、光導波管中に導入できる様に、シリンジの
ピストンは正確に保持されなければならない。直径約１ｍｍの光導波管を用いた
場合、ピストンの精度を比較的大きく下げても個々の測定結果に悪影響を及ぼさ
ない。
【００３２】 シリンダーへの入り口にある前記バルブは、シリンダー中に含まれる試料液が不
必要に漏れ出すことを防止し、その全量が測定に用いられるようにする。これは
測定室に試料を流すためにシリンダーを動かす場合、特に重要である。試料液が
測定室を通って流れ、標識された化学的または生化学的成分が光導波管表面に固
定化された受容体‐配位子系のパートナーに結合する間に、前記光源からの光に
より励起され光導波管の端面から出離する蛍光が前記光検出器で検出され、その
強度が測定される。このために用いられる光学構造は、以後に詳しく述べられる
。
【００３３】 また別に、前記の様にプレインキュベーションされた試料液の、光導波管から測
定室を通る流通性は、液体を極めて吸収し易い羊毛等の材料を試料収集室中に収
容することにより、改善しうる。この材料は測定室まで延長され、光導波管表面
にある開口を開いた後、プレインキュベーションされた試料液を毛細管作用によ
りシリンダーから測定室中へ流入させ、液体吸収材料中の毛細管作用によりさら
に導かれて試料収集室を満たすことができる。これにより液体輸送がより安定す
る。
【００３４】 また、試料液が光導波管に沿って測定室を通って流れる間に蛍光強度の測定が行
われる。この様に構成された装置を用いる場合、例えば安価に入手できる通常の
シリンジ本体をシリンダーとして使用できる様にするため、前述したシリンダー
の入り口バルブは無くてもよい。
【００３５】 生化学的に感作された表面に結合を生ずる場合、流体系中での２つの異なった効
果、即ち対流と拡散を考慮しなければならない。
【００３６】 流体力学上、本発明により製作される測定室内の様なパイプまたはチャネル状構
造中の液体の流速は、層流から始まり、壁からの距離によって変り得ることが知
られている。壁に接する流速はゼロであり、壁からの距離が増えるに従って流速
が増加する。
【００３７】 この事実を考慮して、本発明による装置で確実に生じる層流または擬似層流にお
いては２層を定義することができる。それらは第一に壁から一定距離にある流体
力学層、第二に拡散層であり、各層から壁へのそれぞれの距離は液体の粘度と流
速に依存する。
【００３８】 拡散層の上、即ち壁からより遠い距離で化学および生化学成分は対流により光入
射表面へ向かって動き、拡散層内、即ち壁に対向する層では運動は拡散過程で行
われる。対流による物質移動は拡散によって行われる移動よりもかなり大きい。
比較的速い抗原−抗体反応では、このことは相対的に遅い拡散過程によって反応
速度がかなり遅くなることを意味し、十分に正確な測定結果を得るためには、免
疫分析に例えば約１時間を要することになる。
【００３９】 物質の拡散輸送の場合、既に結合した化学成分または生化学成分の結合の分離又
は組み替えが高い確率で生じ、物質の濃度は流れ中の方が拡散層領域中より高い
ということであり、測定結果を誤らせることにつながる。
【００４０】 拡散層の厚みは、液体の流速を増加させることにより減らすことが可能であり、
化学成分および生化学成分が結合する壁面への物質の対流輸送の効果を増すこと
ができる。従って免疫分析の応答挙動が大きく改善され、その結果必要な測定時
間が短縮される。
【００４１】 しかし、流速を増加させる代わりに、測定室と光導波管からなる本発明の構造で
有利に設計することにより、拡散層の割合を減少させるために流速を上げないで
チャネル状の流路を減少させることができる。即ち、光導波管の表面と測定室の
内壁の間の距離を出来るだけ小さくする。２ｍｍ以下の距離を保つことが有利で
あり、好ましくは０．１から０．０５ｍｍの距離にされる。
【００４２】 様々な実施例として記載された様な、種々の方法で製作された本発明の装置は、
大量生産で安価に製造されると共に、適当な生物成分であらかじめ被覆されて調
製される。さらに有利なことは個々の試料液と人との接触が避けられることであ
り、分析終了後も確実に密閉が保たれていることは医療用途で特に有利である。
【００４３】 光導波管から出離した光の光路中、光検出器に達するまでのところにその出離し
た蛍光を透過し得るレンズと光学フィルターを配置することが蛍光強度を測定す
るために好ましく、その場合、励起光は光学フィルターで遮られる。レンズから
出発し、出離光は各フィルターを通って平行に光学検出器の方向に向かう。
【００４４】 検出器上に出離光を出来るだけ多い割合で集めるためには、この様なレンズは相
応の大きな寸法を有する必要がある。
【００４５】 しかし、励起光を光源からレンズを通って光導波管に導くのは有利でないので、
レンズに凹部を設け、それにより光源からの励起光をレンズに影響されずに光導
波管中へ導入させることが好ましい。この様な方法で実施される光導波管中への
光導入のより良い条件は出離光の損失を低く抑えるが、それはレンズに設けられ
た凹部により達成される。
【００４６】 出離光の光路中の前記光学フィルターの後にさらに第二のレンズを配置すること
により、本発明の装置の光学部をさらに改良することが可能であり、そのレンズ
によりフィルターを通って導かれた蛍光を検出器上に集めることができる。光導
波管から出離した蛍光像を光学検出器上に結像するためには、光学パラメーター
と、レンズから検出器までの距離を適当に選ぶか調節しなければならない。
【００４７】 ただ１個のレンズと検出器の前に置かれたフィルターで光を検出器上に集めるこ
とも可能である。しかしこの配置では光の強度は低くなる。
【００４８】 本発明の特に好ましい改良は、異なった標識物質を励起するための異なった波長
を有する、２つの異なった光源を使用することにより得られる。それにより２個
の異なった物質が並行して測定されるか、またはそのうちの一方の物質が参照物
質となり、従って分析結果の信頼性が大きくなり、内部品質管理の要請を満たす
ことができる。
【００４９】 ２個の異なった光源を用いた場合、個々の蛍光のために当然２個の異なった光学
フィルターが必要になる。これらは光導波管から出離した光の光路中に交互に配
置される様に駆動され、操作できることが有利であり、そのためそれぞれの蛍光
のために光路中に置かれるのは２個のフィルターのうちの１個のみである。
【００５０】 ２個の光源を同じ場所に配置することはできないので、第２の光源の光も光導波
管の光導入表面に直接入射する様に、第１レンズ中には第２の光源用の別の凹部
を設けなければならない。
【００５１】 平行な他の励起光源の光路を遮り、この光源からの光が光導波管中を通過しない
様に、それと対応するフィルターを蛍光の光路中に挿入することが有利である。
【００５２】 本発明のさらに有利な改良では、開口部を有するストッパーが検出器の前に配置
され、ストッパーの移動または回転によりその開口部を時間的に変動させて検出
光手前の光路中に位置させることができる。セグメント分解された光導波管を使
用する場合、この配置により光導波管の個々のセグメントを測定することができ
る。光導波管の個々のセグメントを測定するため、１個の検出器の代わりに、例
えば、ＣＣＤカメラ等の直線状の検出器の２次元配置を用いることも好ましい。
【００５３】 以下、実施例によって本発明をより詳細に説明する。
【００５４】 図１に本発明の装置に用いられる光導波管１の正面図および側面図を示す。光導
波管１はその両端の一方に入射光の大部分を吸収する黒色体、好ましくは黒いプ
ラスチック材料で製作された光吸収体５を有する。図１でさらに見られる様に、
光吸収体５はアタッチメントを有し、光導波管を以下に詳細に述べる測定室９に
挿入する場合のガイドおよび固定の役割をする。光導波管１上に１個以上のこの
様なアタッチメントを装備することも可能である。
【００５５】 図１はさらに、光導波管１を数個の光伝導セグメント２７に分割する一つの可能
な方法を示している。個々のセグメント２７は、その屈折率ｎ２が光伝導セグメ
ントの屈折率ｎ１より小さい薄い層２８によって相互に分離されている。図１の
側面図は光導波管１を分割するための可能な方法を同じく図示するものである。
【００５６】 光導波管１の他の端面には、その直径が光導波管の直径よりかなり大きくして、
以下により詳細に説明するピストン６の一端を外気に対して密閉する表面２が形
成されている。表面２で光導波管１に対し半径方向外側の領域に、扉４で一時的
に閉じられている開口部３がある。この様な扉は例えば分離可能または穿孔可能
なフィルムである。
【００５７】 さらに、図１の側面図は、蛍光を励起するために光が照射される表面２の領域を
さらに示す。
【００５８】 この様な方法で製作された光導波管はピストン６の測定室９の中へ導入され、図
２に示す様にピストンは表面２に接着される。
【００５９】 この場合、化学または生化学成分は光導波管１の表面に既に固定化されている。
【００６０】 ピストン６中には測定室９に接続する少なくとも１個の試料収集室１０が設けら
れ、この試料収集室１０は測定室９のまわりにリング状に形成される。試料収集
室１０は試料液体積の全て、または大部分を保持できる様な寸法でなければなら
ない。ピストン６中には、ピストン６に光導波管１が挿入された状態で、測定室
９とシリンダー７の間を繋ぐ入り口８がある。シリンダー７はさらに入り口１１
を有し、そこを通ってシリンダー７に試料液を導入することができる。
【００６１】 ピストン６がシリンダー内の自由な内部空間が増加するように動いた場合、通常
のシリンジまたは他のピストン−シリンダーアセンブリーにおけると同様、試料
液を入り口１１を通ってシリンダー７内部へ導入することができる。表面２の開
口部３は扉４で閉じているので、試料液は入り口８を通って測定室９へ入ること
ができない。開口部３が少なくとも部分的に開いた場合のみ、試料収集室１０お
よび測定室９に含まれる空気は、そこを抜け出して、入り口８、測定室９を通り
試料収集室１０へ流入する試料液で置換される。好ましくはピストン６を固定し
、シリンダー７を移動させることにより、シリンダー７内部の自由空間が減少す
るときの移動速度を一定にし、それに対応する測定室９を通る試料液の流速も正
確に調整することができる。入り口１１を通る試料液の流出は、以下に述べるバ
ルブ１５により阻止する必要がある。
【００６２】 試料収集室１０が相応の大容積を有する場合、表面の開口部３は不要である。シ
リンダー７の移動に伴い、測定室９中の空気は試料液で置換され、閉じられた試
料収集室１０内で圧縮され、これによってシリンダー７の移動方向に応じて測定
室９を通る試料液の流れが形成される。しかし、シリンダー７を動かさず、バル
ブ１５がない場合でも、扉４が取り除かれるか穿孔されれば、まず測定室９へ、
更に測定室９から試料収集室１０への試料の流れは単に毛細管作用により行われ
る。
【００６３】 図３は本発明の装置用のピストン６の他の例を示す。この図ではピストンシール
１３も明瞭に描かれている。
【００６４】 この例では、試料収集室１０は特に試料液に対する特別な吸収材である材料１２
で満たされているが、この図では明瞭ではないが、吸収材料１２は少なくとも部
分的に測定室９に延長又は突出することができる。
【００６５】 この様な設計では、測定室を通る試料液の輸送は吸収材料の毛細管作用に助けら
れ、この場合には表面２の開口部３が少なくとも部分的に開放され、その結果空
気を逃がすことができると共に、入り口１１が開いているときのみ、試料液は測
定室９を通って流れる。
【００６６】 図４には、ピストン６の入り口８の中に、試料液が実際に測定室９に入る前に通
過しなければならないフィルターまたは免疫カラム１４を配置しうることが示さ
れている。フィルターまたは膜はピストン端面２３上において入り口８を覆うこ
とも可能である。
【００６７】 図５にはシリンダー７の内部への入り口１１を封鎖または開放するバルブ１５の
配置と操作が示される。この例では、入り口１１の領域でシリンダー７の中に配
置された、逆止め作用を有する通常のフラップバルブが用いられる。
【００６８】 右向きの矢印で示される様にピストン６が現在動いている場合、試料液は入り口
１１と開いたバルブ１５を通過し、シリンダー７の内部に入る。
【００６９】 ピストン６の動きが終わると、バルブ１５が閉じ、試料液が不本意にシリンダー
７の内部から入り口１１を経て逃げ出さないようにする。
【００７０】 この位置を示す図５の下部においては、開口部３上の扉４が穿孔され、２本の矢
印で示される様にシリンダー７がその自由な内部空間を減らすように動くと、試
料液が入り口８への通過を強制され、試料液が入り口８を通過して測定室９の中
に入ることが分かる。
【００７１】 図５の下部の図を見ると、試料液が測定室９に流れ込み、同時に個別的な蛍光測
定が行われるが、それに対応する光学構造は図６に示される。
【００７２】 ここに示される例では、異なった２個の物質を並行して測定するため、または参
照測定を追加して行うために２個のレーザーダイオード１６および１７が光源と
して用いられる。
【００７３】 レーザーダイオード１６は蛍光励起用の光を光導波管１中へカップリングし、一
定角度で導かれる様に、光を一定角度で光導波管１のカップリング表面へ照射す
る。
【００７４】 この例では、蛍光がフルオロゲン（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎ）Ｃｙ５中で励起される
波長で光を放射するレーザーダイオード１６が使用されている。
【００７５】 光導波管１から出離し、そのごく一部が蛍光で残りの大部分がバックグラウンド
励起光である光は発散してレンズ１８上に達し、レンズ１８により平行またはほ
とんど平行なビームとして光学フィルター１９を通って光学検出器２２に向かい
、個別的な蛍光強度が測定される。検出器２２はフォトダイオード、フォトアバ
ランシェダイオードまたは光電子増倍管である。
【００７６】 フルオロゲンの蛍光を透過するが、励起光および散乱光部分は通過させないフィ
ルター１９が、検出器の前の光路中に置かれる。
【００７７】 図６に見られる様に、レンズ１８には２個のスロット状の凹部が備えられ、それ
によりレーザーダイオード１６および１７の励起光を、レンズ１８で反射または
屈折させることなく、光導波管１のカップリング表面に照射することができる。
【００７８】 レーザーダイオード１７はフルオロゲンＣｙ７が励起される波長で光を放射する
。
【００７９】 最終的には検出器２２に到達する蛍光の検出可能な成分は相対的に少ないので、
前記フィルター１９、およびフルオロゲンＣｙ７の蛍光を透過し得る第２フィル
ター２０を検出器の前の光路中に交互に移動させることが好ましい。その結果、
当然それぞれの測定を交互に行い、検出器２２の測定信号を２個のフィルター１
９および２０の運動と同期させなければならない。
【００８０】 図６に示す様に、光導波管１からのデカップルされた光の光路中の検出器２２に
蛍光を集めるための別なレンズ２１が、フィルター１９または２０の後に配置さ
れる。
【００８１】 この例では、２個のレーザーダイオード１６および１７は直径方向に向かい合っ
て配置されているが、相互にほとんど任意の角度で配置することも可能である。
【００８２】 しかしながら、個々の励起光を光導波管１中へほとんど最適に導入させることを
保障するためには、レーザーダイオード１６および１７のそれぞれの光ビームの
入射角を、異なった角度において維持しなければならない。
【００８３】 図６に示される様に、フィルター１９および／または２０の運動により、同時に
必要でない光源の光路を遮ることが有利である。従って、例えばレーザーダイオ
ード１６とフィルター１９が一緒に操作されて対応する光路を開通し、レーザー
ダイオード１７の光はその光路がフィルター２０で遮られるために、光導波管１
中を通過できないようにすることができる。従って、フィルター１９および２０
をレーザーダイオード１６および１７の光を透過させない様に選ばなければなら
ない。
【００８４】 レンズ１８のスロットの代わりに、レーザーダイオード１６および１７の光ビー
ムがレンズ１８に影響されない様に、全ての設定角度を保ちながらレンズ１８の
直径を減じてもよい。
【００８５】 更に、図６では２個のフィルター２４および２５の配置が示されるが、それらは
光路中でレーザーダイオード１６および１７のすぐ後ろに配置され、それにより
個々の励起光が個々のフィルターの設計に従って濾波される。
【００８６】 蛍光励起用の光を一定の決められた角度で光導波管１のカップリング面へ照射す
るために、対応する光学系を有するレーザーダイオード１６および１７が用いら
れ、光ビームの方向を平行に揃える。
【００８７】 セグメント化された光導波管１を用いる場合、可動式ストッパー２６を検出器２
２の前の光路中に置くことにより、個々のセグメント２７を測定することができ
る。蛍光のみが光導波管のセグメント２７を通過し検出器２２に入射する様に、
ストッパー２６の移動および／または回転を生じ、ストッパー２６の開口部を当
該光路中に位置させる。ストッパー２６は可動であるので、ストッパー２６の移
動および／または回転により個々のセグメント２７からの蛍光を検出器２２で測
定することができる。また、光検出素子の直線状または２次元配列からなる検出
器２２を使用することが有利である。それにより、光導波管１のすべてのセグメ
ント２７からの蛍光をほぼ同時に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は本発明の装置の光導波管の正面図および側面図である。
【図２】 図２は本発明の装置の断面図である。
【図３】 図３は本発明の装置のピストンを例示する図である。
【図４】 図４は本発明の装置のピストンを例示する図である。
【図５】 図５は異なった作動位置にある本発明のバルブ付き装置の例である。
【図６】 図６は本発明の装置の光学系を例示する図である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年４月２８日（２０００．４．２８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】 この公知の方法に関連する他の基本的な欠点は、測定結果の精度を増すために参
照信号として励起光のみが用いられていることである。しかしながら、測定精度
と分析結果の有用性を改善すると共に再現性を増すためには、免疫分析により適
した参照測定を行うことが必要である。 更に、米国特許第４９０９９９０号及び同第５４９２６７４号にも、蛍光免疫分
析を実施する方法が記載されている。これらの記載によれば、少なくとも部分的
にキャピラリースリーブ中に導入され、または保持された、例えば光ファイバー
からなり、励起光及び蛍光に対して透明な光導波管が用いられる。蛍光免疫分析
を実施する前に、試料液をキャピラリースリーブと光導波管との間に流入させる
。この光導波管には、予め適当な生化学的処理が施されている。光導波管の外周
面を通っての物質の移送は、ほぼ完全に拡散によって行われ、キャピラリースリ
ーブが適当に試料液を満たし、その試料液がキャピラリースリーブの領域内にお
ける光導波管の前記生化学処理された表面と接触した後、蛍光測定が行われる。
その蛍光は、光導波管中に入射した励起光のエバネッセントフィールドを用いる
という従来の方式で励起されるものである。この方法では、キャピラリーの僅少
な有効容積に従って比較的少量の試料しか分析することができない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クンツ，ウルリッヒ ドイツ連邦共和国、デー‐88400 ビーベ ラッハ、シュヴァーネンシュトラーセ 18 (72)発明者 グラヴェ，フランク ドイツ連邦共和国、デー‐48147 ミュン ステル、キンデルハウゼル シュトラーセ 171 (72)発明者 ケイ，ゲラン ドイツ連邦共和国、デー‐49084 オスナ ブリュック、イェッゲネル ヴェーク 160 Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 CA03 DA02 DA05 EA01 GA07 GB01 GB05 HA01 HA05 JA03 LA01 LA02 LA03 2G054 AA02 AA06 AB04 CA21 CE02 EA03 FA06 FA12 FA17 FA19 FB04 GB02 2G057 AA04 AC01 BA01 BD01 DC01 GA06 GA07

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも１個の光源（１６、１７）からの光を光導波管（１）
    の一端の表面を経てその光導波管（１）中に導入させ、その導入された光を用い
    て光導波管（１）の外表面におけるエバネッセントフィールド励起により、汎用
    受容体‐配位子系の化学的または生化学的パートナーに結合した少なくとも１個
    の標識物質から蛍光を励起させ、その蛍光が部分的に光導波管（１）中に導入さ
    れ、更に光導波管（１）の表面から出離し、光学系を経て蛍光強度が測定される
    光検出器（２２）上に入射するようにしたことにより蛍光免疫分析を行う装置で
    あって、光導波管（１）がピストン‐シリンダーユニット中のピストン（６）に
    形成された測定室（９）中に保持され、測定室（９）がピストン（６）中に形成
    された入り口（８）によりシリンダー（７）の内部に接続されたものであること
    を特徴とする蛍光免疫分析を行う装置。
  2. 【請求項２】 光導波管（１）はその屈折率ｎ２が光導波管材料の屈折率ｎ１よ
    り小さい少なくとも１層（２８）により、光導波管（１）中の光伝播方向と平行
    である少なくとも２個の光波伝導セグメント（２７）に分割されたものであるこ
    とを特徴とする請求項１記載の装置。
  3. 【請求項３】 測定室（９）の内壁面と光導波管（１）の間の距離が２ｍｍ以下
    であることを特徴とする請求項１または２記載の装置。
  4. 【請求項４】 ピストン（６）内に測定室（９）と連通する試料収集室（１０）
    が形成されていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の装置
    。
  5. 【請求項５】 光導波管内に光を導入させ、および出離させるための光導波管（
    １）における前記一端の表面に、ピストン（６）を閉じる表面（２）が配置され
    、光導波管（１）の他端に光吸収材（５）が配置されていることを特徴とする請
    求項１乃至４のいずれか１項に記載の装置。
  6. 【請求項６】 光吸収材（５）および／または光導波管（１）に少なくとも１個
    のガイドアタッチメントが形成されていることを特徴とする請求項１乃至５のい
    ずれか１項に記載の装置。
  7. 【請求項７】 表面（２）に閉鎖可能な開口部（３）があることを特徴とする請
    求項１乃至６のいずれか１項に記載の装置。
  8. 【請求項８】 シリンダー（７）上に入り口開口部（１１）があることを特徴と
    する請求項１乃至７のいずれか１項に記載の装置。
  9. 【請求項９】 入り口開口部（１１）がバルブ（１５）で閉鎖可能であることを
    特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の装置。
  10. 【請求項１０】 試料収集室（１０）に液体吸収材料（１２）を含むことを特徴
    とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の装置。
  11. 【請求項１１】 測定室（９）への入り口（８）中、またはその前にフィルター
    および／または膜および／または免疫カラム（１４）を配置したことを特徴とす
    る請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の装置。
  12. 【請求項１２】 光導波管（１）から出離された光の光路中において、レンズ（
    １８）と、蛍光を透過できる少なくとも１個の光学フィルター（１９）が、光検
    出器（２２）の前に配置されたことを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか１
    項に記載の装置。
  13. 【請求項１３】 レンズ（１８）が光源（１６）からの光を光導波管（１）上に
    導くための少なくとも１個の凹部を備えたことを特徴とする請求項１乃至１２の
    いずれか１項に記載の装置。
  14. 【請求項１４】 第２の光源（１７）と第２の光学フィルター（２０）を備え、
    第２の光学フィルターが第１の光学フィルター（１９）と交互に光導波管（１）
    から出離された光の光路中へ移動可能であり、第２の光源（１７）は第２の標識
    物質から蛍光を励起するための波長を有する光を放射するものであることを特徴
    とする請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の装置。
  15. 【請求項１５】 光学フィルター（１９、２０）と検出器（２２）の間に第２の
    レンズ（２１）が配置されていることを特徴とする請求項１乃至１４のいずれか
    １項に記載の装置。
  16. 【請求項１６】 光学フィルター（１９）および／または（２０）が二つの光源
    （１６）および（１７）の光を透過しないものであることを特徴とする請求項１
    乃至１５のいずれか１項に記載の装置。
  17. 【請求項１７】 移動および／または回転動作により、光路中の位置に時間的に
    出没自在となるようにした開口部を有する可動ストッパー（２６）が、検出器（
    ２２）の前の光路中に配置されたことを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか
    １項に記載の装置。
  18. 【請求項１８】 検出器（２２）が幾つかの光検出素子の直線状または２次元配
    列であることを特徴とする請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の装置。
  19. 【請求項１９】 光源（１６、１７）と表面（２）の間の光路中に光学フィルタ
    ー（２４、２５）が配置されたことを特徴とする請求項１乃至１８のいずれか１
    項に記載の装置。
  20. 【請求項２０】 光導波管（１）が化学的または生化学的成分で被覆され且つ測
    定室（９）内に装着され、試料液が測定室（９）を通り光導波管（１）の表面に
    沿って導かれると同時に、光源（１６、１７）から光導波管（１）中に導入され
    た光により蛍光を励起発光し、光導波管（１）から出離した蛍光は、蛍光の強度
    を測定する光検出器（２２）上に照射され、それにより試料液が通過すると光導
    波管（１）の表面に対する化学的または生化学的成分の標識パートナーの結合が
    、時間的尺度で測定されるものであることを特徴とする請求項１乃至１９のいず
    れか１項に記載の装置を用いる蛍光免疫分析を行う方法。
  21. 【請求項２１】 ピストン面（２３）および／またはシリンダー（７）の内面お
    よび／または入り口開口部（１１）の表面が、蛍光免疫分析を行う前において、
    化学的または生化学的成分で被覆されるものであることを特徴とする請求項２０
    記載の方法。
  22. 【請求項２２】 測定室（９）を通じて試料液を流すために開口部（３）が少な
    くとも部分的に開放されることを特徴とする請求項２０または２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 シリンダー（７）の入り口開口部が閉じられ、開口部（３）が
    閉じられるか表面（２）に開口部（３）がない場合において、ピストン（６）が
    固定され、光導波管（１）の表面（２）が固定された状態でシリンダー（７）が
    シリンダーの周面と平行に往復並進運動し、それによりシリンダー（７）の運動
    方向に従って試料液が測定室（９）を通じて流れるようにしたことを特徴とする
    請求項２０または２１記載の方法。
  24. 【請求項２４】 ２個の光源（１６、１７）により２個の異なった標識物質の蛍
    光を励起するための光が光導波管（１）中に導入され、その導波管（１）から出
    離した蛍光がその出離光の光路中の２個のフィルター（１９、２０）の対応する
    運動により交互に測定されるものであることを特徴とする請求項２０乃至２３の
    いずれか１項に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 試料液中の第２の物質が測定されるか、参照測定が行われるも
    のであることを特徴とする請求項２４記載の方法。
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