JP2001323001A - 免疫増強作用を有する低分子化βグルカン - Google Patents
免疫増強作用を有する低分子化βグルカンInfo
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Abstract
インの産生を促進し、その作用を増強させ、抗体産生能
或いは免疫作用全体を増強することによって各種感染症
や腫瘍発生の予防に役立つ、低分子量の水溶性βグルカ
ンを提供すること。 【解決手段】 免疫増強作用を有する低分子化された水
溶性βグルカン。
Description
種々の細菌、ウイルス感染やガンの発生を予防する作用
を有する水溶性βグルカン、及び該水溶性βグルカンを
有効成分として含有する食品素材、化粧品素材、医薬品
素材及びそれら素材の加工品に関する。
は、主として免疫系の作用によって、細菌やウイルス等
の微生物、或いは生体内で発生する腫瘍等の攻撃から守
られている。近年、免疫機能に作用し、これを増強する
効果を有する生体応答修飾物質(以下BRMと略記)を
用いたインフルエンザ予防或いはガン治療に関する研究
が注目されている。
様々な細胞にBRMが作用し、腫瘍壊死因子(以下TN
Fと略記)、インターロイキン類、インターフェロン類
等のサイトカインと総称される物質産生が活性化、誘導
されることにより生じる。誘導されたこれらの物質は、
免疫担当細胞に作用し免疫系を活性化する。サイトカイ
ンのうち、TNFは、単球やマクロファージから放出さ
れるものであって、細胞増殖作用や抗ウイルス作用を示
すことが知られている。インターロイキン類としては、
IL1〜IL12の存在が知られている。そのうちIL
1は、感染、炎症、種々の免疫反応等に伴い、主として
単球やマクロファージから産生される分子量17500
のペプチドホルモンである。インターフェロン類は、イ
ンターフェロン−α、インターフェロン−β、インター
フェロン−γの3つが知られている。インターフェロン
−γは、分子量が約2万の糖蛋白質であって、抗ウイル
ス作用、マクロファージやナチュラルキラー細胞等の免
疫担当細胞の活性化や分化誘導に作用し免疫調節因子と
して注目されている。
は遺伝子組換えによって調製し、それぞれを投与してウ
イルス感染治療或いはガン治療に応用する研究が行われ
ているが、免疫増強作用は、多くの細胞が協奏的に働
き、はじめて効果を発揮するものであり、それぞれのサ
イトカインのバランスが重要で、未だ多くのサイトカイ
ンをバランスよく投与する方法が見出されておらず、ガ
ン治療を達成するには至っていないのが現状で、これら
の課題克服の目的に使用されるBRMへの期待は大き
い。
いは細胞壁成分等では酵母菌体、乳酸菌菌体等が知られ
ている。また、シイタケ抽出多糖類であるレンチナン或
いはその他胆子菌類のβグルカン類も有効であることが
知られている。しかし、これら微生物や胆子菌は、培養
に手間がかかり、特殊な設備を必要とする。また、これ
ら微生物や胆子菌由来のβグルカン或いはその他多糖類
の抽出は、操作が煩雑であると共に、精製工程も煩雑
で、コスト及び操作時間が多大にかかり、得られるBR
Mが高価なものとなってしまう問題がある。
疫増強作用に関しては、胆子菌培養物或いは子実体の熱
水抽出物に同作用が認められている。しかし、これらの
キノコ類では、重量平均分子量200万〜20万の高分
子量のβグルカンに免疫増強作用が認められている。ま
た、イネ科植物由来の重量平均分子量が10万を超える
比較的高分子量のβグルカンに免疫増強作用のあること
は知られているが、その免疫増強作用は満足できるもの
ではなく、また重量平均分子量が10万以下に低分子化
されたβグルカンについての免疫増強作用に関しては未
知であった。
βグルカンは、重量平均分子量が10万を超える高分子
量のものである。一般的に高分子量のβグルカンは、粘
性が高く、水に溶解させるのが難しい。そのため、食
品、化粧品、医薬品等の素材として使用する場合、加熱
操作や長時間の攪拌操作等が必要になり、熱による変性
や分子修飾のためのコストが高くなる等の問題があり、
機能性を保持した、より低分子量のβグルカンが望まれ
ている。
NFをはじめとするサイトカインの産生を促進し、その
作用を増強させ、抗体産生能或いは免疫作用全体を増強
することによって各種感染症や腫瘍発生の予防に役立
つ、低分子量の水溶性βグルカンを提供することにあ
る。
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、高分子量のβグル
カンを低分子化することによって得られた低分子量の水
溶性βグルカンが、高分子量のβグルカンに比較してよ
り強い免疫増強作用を有することを見出し、本発明に到
達した。
分子化された水溶性βグルカンを提供するものである。
以下である前記水溶性βグルカンを提供するものであ
る。
ルカンの含有量の割合が、全βグルカンの80重量%以
上である前記水溶性βグルカンを提供するものである。
物由来のものである前記水溶性βグルカンを提供するも
のである。
類又はオーツ麦類である前記水溶性βグルカンを提供す
るものである。
含有する食品素材、化粧品素材及び医薬品素材並びにそ
れら素材の加工品を提供するものである。
0.1〜90重量%含有する前記素材及び前記加工品を
提供するものである。
菌体成分を含有する前記素材及び前記加工品を提供する
ものである。
グルカンは、抗体産生増強作用或いはサイトカイン特に
TNFの産生促進作用を有する免疫増強作用を有し、特
に、食品、化粧品及び医薬品等の素材として適してい
る。
植物由来のものが好ましく、食品素材として最も適当で
ある。イネ科植物の例としては、米類、小麦類、トウモ
ロコシ類、ヒエ類、アワ類、キビ類、大麦類、オーツ麦
類(カラス麦類)、ライ麦類等が挙げられ、好ましく
は、大麦類、オーツ麦類、さらに好ましくは大麦類であ
る。これらのイネ科植物には、ワキシー蛋白質を発現
し、アミロース合成される粳系統のもの或いはこの蛋白
質の作用の欠失した餅化系統のものがあるが、本発明に
おいては何れも材料とすることができる。
の水溶性とは、65℃の温水に完全に溶解する性質をい
う。完全に溶解する性質は、サンプルを蒸留水に対して
1重量%となるように添加し、10分間撹拌溶解させた
後、沈殿が目視によって確認されないこと、660nm
の吸光度による濁度測定において、対照の溶解水に対し
て、O.D.値が0.4以下である性質をいう。本発明
の水溶性βグルカンは、このような水溶性を有するた
め、食品、化粧品、医薬品等の素材として扱いやすく、
加工の手間がかからず、コストも抑えることができる。
ある。ここでいう低分子量とは、水溶性であり、且つ免
疫増強作用を有すればよい。その中でも、特に重量平均
分子量が10万以下の水溶性βグルカンが、免疫増強作
用に優れ、食品、化粧品、医薬品等の素材としても優れ
ている。その中でも、重量平均分子量5000〜10万
のものが好ましく。更に重量平均分子量1万〜6万のも
のがより好ましい。
万未満のβグルカンの含有量の割合が、全βグルカンの
80重量%以上が好ましく、90重量%以上がより好ま
しく、さらに95重量%以上がより好ましく、100重
量%のものが最も好ましい。
は、イネ科植物等の原料から直接得ることができ、また
原料から抽出精製された高分子量のβグルカンを低分子
化して得ることもできる。
としては、例えば、多ろう質大麦を原料とし、水抽出に
より製造する方法(特公平4−11197号公報)、或
いは、大麦、オーツ麦を原料として、アルカリ抽出、中
和、アルコール沈殿により、重量平均分子量10万〜1
00万のβグルカンを得る方法(特公平6−83652
号公報)等がある。これらの製造方法で得られたβグル
カンは、高分子量であるため、このままでは粘性が高く
水に再可溶させるのが難しい。これらの高分子量のβグ
ルカンを低分子化して本発明の低分子化水溶性βグルカ
ンを得ることができる。
としては、公知である多糖類の加水分解反応の何れもが
利用可能である。例えば、水溶性多糖類は、酸存在下に
加圧加熱により加水分解することが知られており、これ
を利用して高分子量のβグルカンを低分子化することが
できる。また、酵素による加水分解反応を利用した低分
子化も有効で、酵素としては、1/3βグルカナーゼ等
を用いることができる。以上のように、原料から抽出精
製された高分子量のβグルカンから本発明の低分子化水
溶性βグルカンを得ることができる。また、本発明の低
分子化水溶性βグルカンは、WO98/13056号国
際公報に記載の方法等により、原料穀物から直接抽出し
て得ることもできる。
の中でも最も好ましいものは、大麦由来の低分子化水溶
性βグルカンであり、このものは、免疫増強作用に優れ
ており、特に体内におけるTNF類、インターロイキン
類、インターフェロン類等のサイトカインの産生を促進
し、その作用による抗体産生等の免疫力を増強させる効
果に優れ、これらの効果の中でも特に抗体産生増強作用
が、重量平均分子量10万以上の高分子量のβグルカン
に比較して著しく優れている。
ルカンを、食品、化粧品、医薬品等の素材又はそれら素
材の加工品に含有させて使用する場合、0.1〜90重
量%含有させることが好ましい。また、本発明の低分子
化された水溶性βグルカンの免疫増強作用は単独で十分
発現しうるものであるが、乳酸菌又は乳酸菌菌体成分と
併用することで、さらに免疫増強作用が増し好ましい。
が、本発明はこれら実施例によって限定されるものでは
ない。尚、特に記述がない限り、実施例中の%は重量に
よるものであり、分子量は重量平均分子量である。
造) 市販の大麦を粉砕し、24メッシュの篩にて通過分を大
麦粉とした。該大麦粉500gに水2.5L(リット
ル)を加え、55℃に加温後、2時間攪拌抽出した。抽
出後、混合液を遠心力1500Gで10分間遠心分離
し、2.2Lの上清を得た。この上清を冷却、凍結し、
−10℃で24時間放置した。解凍後、沈殿したβグル
カンを濾過分離し、80℃にて加熱乾燥し、15gのβ
グルカン粗抽出物を得た。このβグルカン粗抽出物に水
300mlを加え、90℃にて完全に溶解させた後、−
20℃に冷却し、24時間凍結保存した。解凍後、沈殿
したβグルカンを濾過分離し、凍結乾燥し、10gのβ
グルカン精製物(サンプルA)を得た。
に加え、65℃に加温し、10分間放置したところ、溶
解し透明の水溶液となった。660nmによる吸光度
は、蒸留水を対照として、O.D.値0.127を示し
た。次に、サンプルAの分子量をゲル濾過クロマトグラ
フィーにて次のようにして測定した。サンプルAを蒸留
水に濃度1%となるように加え、沸騰水中で溶解させ
た。分離には温度50℃でゲル濾過カラムSupero
se6HR(ファルマシア製)を用い、分子量マーカー
としてShodexプルラン標準液P−82(昭和電工
社製)を用いた。蒸留水を溶出液とし、流速0.6ml
/min.で溶出画分を屈折計(RI)でモニタリング
した。プルラン標準物の分子量より、サンプルAの分子
量を測定した結果、その分子量は10万〜5000に分
布し、分子量10万以上のピークはわずかであり(3%
以下)、分子量が低下するほど含量は多くなり、主成分
は分子量4万であった。また分子量5000以下のβグ
ルカンはわずかであった(5%以下)。
麦粉とした。該大麦粉500gに水2.5Lを加え、5
5℃に加温後、30分間攪拌抽出した。抽出後、混合液
を遠心力1500Gで10分間遠心分離し、2.2Lの
上清を得た。この上清を冷却、凍結し、−10℃で24
時間放置した。解凍後、沈殿したβグルカンを濾過分離
し、80℃にて加熱乾燥し、5gのβグルカン粗抽出物
を得た。このβグルカン粗抽出物に水500mlを加
え、煮沸して溶解させた後、−20℃に冷却し、24時
間凍結保存した。解凍後、沈殿したβグルカンを濾過分
離し、凍結乾燥し、3.6gのβグルカン精製物(サン
プルB)を得た。
に加え、65℃に加温し、10分間溶解を試みたが、サ
ンプルBは沈殿が認められ全ては溶解しなかった。66
0nmの吸光度を測定したところ、O.D.値1.74
を示した。次に、サンプルBの分子量をゲル濾過クロマ
トグラフィーにて次のようにして測定した。サンプルB
を蒸留水に濃度1%となるように加え、沸騰水中で溶解
させた。分離には50℃でゲル濾過カラムSupero
se6HR(ファルマシア製)を用い、分子量マーカー
としてShodexプルラン標準液P−82(昭和電工
社製)を用いた。蒸留水を溶出液とし、流速0.6ml
/min.で溶出画分を屈折計(RI)でモニタリング
した。その結果、プルラン標準物の分子量より、サンプ
ルBの分子量を測定した結果、その分子量分布は、分子
量50万〜15万に分布し、主成分は分子量30万であ
った。分子量10万以下の低分子化βグルカンは認めら
れなかった。
化水溶性βグルカン)を10mMリン酸緩衝液(pH
6.9)100μlに溶解し、0.32〜20mgの量
でICRマウス6週齢メスの腹空に投与し、6時間後に
腹空細胞を採取し、顕微鏡下、その細胞数をカウントし
た。その結果、投与量に比例して細胞数は増加し、未投
与マウスに比較すると、2〜3倍となった。増加した全
細胞数に対する好中球数の割合をカウントしたところ、
投与量に従い増加し、0.32mg投与で約10倍、1
mg投与で20倍、5mg投与で30倍に増加した。増
加した細胞中の好中球数の割合は1mg投与で増加細胞
の70%を超えていた。臨床的に使用されている免疫増
強剤であるシイタケ抽出物由来の精製レンチナンは1m
g投与で、細胞数が3倍、好中球数は30倍、割合は8
0%であった。細菌由来のOK−432の投与では0.
2mg投与で細胞数は5倍、好中球は60倍、割合は9
0%であった。
細胞の質的変化を検討した。前記サンプルAの10mg
をマウス腹空に投与し、6、12、24、48、72時
間後に細胞を採取し免疫担当細胞である好中球、マクロ
ファージ、リンパ球の数をカウントした。その結果、総
細胞数は、24時間で最大となり未投与の10倍であっ
た。好中球は24時間後に最大となり、その後48時間
後には急激に減少し、72時間後にはほぼ正常値であっ
た。マクロファージは、12時間以降増加し48時間で
最大を示した。リンパ球数も48時間後に最大を示し
た。レンチナンでは、12時間後に総細胞数が最大とな
り、その後減少した。好中球数は6時間後が最大でその
後減少した。好中球の数は前記サンプルAでは24時間
まで減少せず、レンチナンに比較すると持続力があっ
た。レンチナン投与のマウスにおけるマクロファージと
リンパ球の変化は前記サンプルAとほぼ同様であった。
尚、上記細胞数のカウントは、腹空細胞をスライドガラ
スに塗布し、核染色して形態学的な変化より好中球、マ
クロファージ、リンパ球に類別してカウントした。ま
た、細胞の顕微鏡観察により、前記サンプルAの投与後
48時間の細胞観察において、マクロファージの活発な
貪食作用の結果と考えられる形態学的特徴と、劇的な好
中球の減少を認めた。このような変化はレンチナン、O
K−432、その他では認められず、前記サンプルAの
投与で特異的に認められることであった。
F量の変動) 実施例1で得られたサンプルAを投与したマウスより得
た腹空細胞を用いて、TNF−αの産生能を評価した。
先ず、前記サンプルAを10mMリン酸緩衝液(pH
6.9)100μlに溶解し、ICRマウス6週齢メス
に0〜10mgとなるよう腹空投与した。3日後、腹空
細胞を採取し、無血清培養液で洗浄後、同培養液にて各
ウェルに5×105cellsとなるよう調整して添加
した。さらに乳酸菌菌体を20μg/mlとなるように
各ウェルに添加し、全量を200μlとし、2時間37
℃にて放置した。培養上清のTNF−α濃度をELIS
A測定キット(ENDOGEN社製TNF−2 ELI
SAKIT EN−2601−90)を用いて測定し
た。その結果、前記サンプルAの0.3mg投与で51
pg/ml、1mg投与で128pg/ml、3mg投
与で141pg/mlと濃度依存的に産生されるTNF
−αの濃度は増加した。無添加の場合、25pg/ml
であり、その産生量は前記サンプルAに特異的であっ
た。
り得た腹空細胞を用いて、TNF−α産生能の経時変化
を評価した。サンプルAの3mgを10mMリン酸緩衝
液(pH6.9)100μlに溶解し、ICRマウス6
週齢メスに腹空投与した。0〜7日後、腹空細胞を採取
し、無血清培養液で洗浄後、同培養液にて各ウェルに5
×105cellsとなるよう調整して添加した。さら
に乳酸菌菌体を20μg/mlとなるように各ウェルに
添加し、全量を200μlとし、2時間37℃にて放置
した。培養上清のTNF−α濃度をELISA測定キッ
ト(ENDOGEN社製TNF−2 ELISAKIT
EN−2601−90)を用いて測定した。その結
果、前記サンプルA投与直後では18pg/ml、1日
後で84pg/ml、3日後で130pg/ml、5日
後に121pg/ml、7日後に98pg/mlとTN
F−αの産生量は経日的に増加し、その産生能は7日間
持続していた。
サンプルBをマウスに投与し、その抗体産生増強の作用
を解析した。先ず、抗原としてウシ・血漿ガンマーグロ
ブリン1mgをPBS(リン酸緩衝液)の1mlに溶解
させ1mg/mlの抗原液を調整した。前記サンプルA
又はBの500μgをPBSの1mlに加え、加熱溶解
させた。前記サンプルAは、50℃に加温することで瞬
時に溶解した。前記サンプルBは、50℃に加温するこ
とでは溶解せず、90℃に30分間放置し溶解させた。
抗原液とサンプル溶液を当量混合し、マウスの腹空に1
00μlづつ投与した。マウスは、Balbcマウス4
週齢、メスを用い、各サンプル5匹を1群とした。2週
間後に1回目と同様にして追加免疫した。尚、ウシ・血
漿ガンマーグロブリン0.5mgをPBSの1mlに溶
解させ0.5mg/mlとし、マウスに100μl投与
した群を対照とした。追加免疫後2週間で採血し、トー
タルの抗体産生量(IgG,IgM,IgA抗体量)の
差をELISAにて測定した。尚、ELISAは、先
ず、免疫に用いたウシ・血漿ガンマーグロブリンを10
μg/mlの濃度で96マイクロプレート(ヌンク社製
・マキシソープ)にプレートコーティングして、血清の
希釈液を1時間、37℃にて反応後、さらにペルオキシ
ターゼを標識した抗マウス・イムノグロブリン抗体を2
次抗体として1時間、37℃で反応させた。次に、オル
トフェニレンジアミン溶液(和光純薬社製)を発色剤と
して用いて、10分間37℃に放置後、2M硫酸で反応
を停止後、490nmの吸光度を測定した。
し、血清を得て、これを×10〜×5120倍に0.2
%BSA(牛血清アルブミン)を含むPBS−Twee
n溶液(ソルビタンモノエステルであるTween20
をPBSに0.05%となるように溶解したもの)にて
希釈し、抗体価を測定した。その結果、2560倍に希
釈した血清の抗ウシ・血漿ガンマーグロブリン抗体価を
O.D.値の平均値として比較すると、サンプルA投与
群(n=5)は0.703±0.1、サンプルB投与群
(n=5)は0.491±0.075、対照群(n=
5)は0.315±0.090であった。この試験から
サンプルA投与群の抗体価はサンプルB投与群よりも高
値を示し、前記サンプルAの抗体産生増強効果が認めら
れた。
ンは、体内におけるTNFをはじめとするサイトカイン
の産生を促進し、その作用を増強させ、抗体産生能或い
は免疫作用全体を増強することによって各種感染症や腫
瘍発生の予防に役立つものである。
Claims (8)
- 【請求項1】 免疫増強作用を有する低分子化された水
溶性βグルカン。 - 【請求項2】 重量平均分子量が10万以下である請求
項1記載の水溶性βグルカン。 - 【請求項3】 分子量が10万未満のβグルカンの含有
量の割合が、全βグルカンの80重量%以上である請求
項1記載の水溶性βグルカン。 - 【請求項4】 βグルカンが、イネ科植物由来のもので
ある請求項1〜3の何れかに記載の水溶性βグルカン。 - 【請求項5】 イネ科植物が、大麦類又はオーツ麦類で
ある請求項4記載の水溶性βグルカン。 - 【請求項6】 請求項1〜5の何れかに記載の水溶性β
グルカンを含有する食品素材、化粧品素材若しくは医薬
品素材又はそれら素材の加工品。 - 【請求項7】 水溶性βグルカンを0.1〜90重量%
含有する請求項6記載の素材又は加工品。 - 【請求項8】 さらに乳酸菌又は乳酸菌菌体成分を含有
する請求項6又は7記載の素材又は加工品。
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