JP2001353000A - メシチリン耐性黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子の検出法 - Google Patents
メシチリン耐性黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子の検出法Info
- Publication number
- JP2001353000A JP2001353000A JP2000179394A JP2000179394A JP2001353000A JP 2001353000 A JP2001353000 A JP 2001353000A JP 2000179394 A JP2000179394 A JP 2000179394A JP 2000179394 A JP2000179394 A JP 2000179394A JP 2001353000 A JP2001353000 A JP 2001353000A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna
- primer
- seq
- oligonucleotide
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】メシチリン耐性黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝
子に由来するＲＮＡを特異的に増幅したり、検出及び同
定を高感度で行うために有用なオリゴヌクレオチドの組
み合わせを提供する。 【解決手段】ＲＮＡ増幅工程を利用した検出法におい
て、第一のプライマーとして配列番号１のオリゴヌクレ
オチド、第二のプライマーとして配列番号２から４のい
ずれかのオリゴヌクレオチドを用いるか、第一のプライ
マーとして配列番号５のオリゴヌクレオチド、第二のプ
ライマーとして配列番号６または７のオリゴヌクレオチ
ドを用いるか、または第一のプライマーとして配列番号
８のオリゴヌクレオチド、第二のプライマーとして配列
番号６または７のオリゴヌクレオチドを用いることを特
徴とする、検出法。
子に由来するＲＮＡを特異的に増幅したり、検出及び同
定を高感度で行うために有用なオリゴヌクレオチドの組
み合わせを提供する。 【解決手段】ＲＮＡ増幅工程を利用した検出法におい
て、第一のプライマーとして配列番号１のオリゴヌクレ
オチド、第二のプライマーとして配列番号２から４のい
ずれかのオリゴヌクレオチドを用いるか、第一のプライ
マーとして配列番号５のオリゴヌクレオチド、第二のプ
ライマーとして配列番号６または７のオリゴヌクレオチ
ドを用いるか、または第一のプライマーとして配列番号
８のオリゴヌクレオチド、第二のプライマーとして配列
番号６または７のオリゴヌクレオチドを用いることを特
徴とする、検出法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査における
メシチリン耐性黄色ブドウ球菌の検出法に関するもので
ある。
メシチリン耐性黄色ブドウ球菌の検出法に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】ＭＲＳＡは、ブドウ球菌が産生するβ−
ラクタマーゼに安定とされるメチシリンなどのβ−ラク
タマーゼ耐性ペニシリン剤に耐性を示す黄色ブドウ球菌
の耐性株を意味する。院内感染の主要な病原菌であり、
治療薬の切り札的存在とみなされているバンコマイシン
に軽度耐性を示す菌株も検出されている。このように、
ＭＲＳＡは決定的な抗菌薬がないために大きな医療問題
となっている。従って、臨床検査における正確・迅速な
検出は、診断と治療における重大な課題である。
ラクタマーゼに安定とされるメチシリンなどのβ−ラク
タマーゼ耐性ペニシリン剤に耐性を示す黄色ブドウ球菌
の耐性株を意味する。院内感染の主要な病原菌であり、
治療薬の切り札的存在とみなされているバンコマイシン
に軽度耐性を示す菌株も検出されている。このように、
ＭＲＳＡは決定的な抗菌薬がないために大きな医療問題
となっている。従って、臨床検査における正確・迅速な
検出は、診断と治療における重大な課題である。
【０００３】通常、黄色ブドウ球菌が産生する細胞壁合
成タンパク質ＰＢＰ（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｂｉｎｄ
ｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）はＰＢＰ−１からＰＢＰ−４
の４種類存在するが、ＭＲＳＡではＰＢＰ−２’と名付
けられた新たなＰＢＰも産生される。このＰＢＰはβ−
ラクタム系の抗生物質への結合親和力の弱い特異的なタ
ンパク質であり、耐性の中心的な役割を果たすことが知
られている。ＰＢＰ−２’をコードする遺伝子ｍｅｃＡ
の配列は既に知られている（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２
１、１６７〜１７１、１９８７年、他）。そこで、ＭＲ
ＳＡの検出および同定には、ｍｅｃＡ遺伝子に特異的な
遺伝子プローブを用いるハイブリダイゼーション法が試
みられている
成タンパク質ＰＢＰ（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｂｉｎｄ
ｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）はＰＢＰ−１からＰＢＰ−４
の４種類存在するが、ＭＲＳＡではＰＢＰ−２’と名付
けられた新たなＰＢＰも産生される。このＰＢＰはβ−
ラクタム系の抗生物質への結合親和力の弱い特異的なタ
ンパク質であり、耐性の中心的な役割を果たすことが知
られている。ＰＢＰ−２’をコードする遺伝子ｍｅｃＡ
の配列は既に知られている（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２
１、１６７〜１７１、１９８７年、他）。そこで、ＭＲ
ＳＡの検出および同定には、ｍｅｃＡ遺伝子に特異的な
遺伝子プローブを用いるハイブリダイゼーション法が試
みられている
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記のように、ＭＲＳ
Ａを遺伝子レベルで検出する試みがなされているが、試
料の調製に患者検体から採取した菌の培養が必要なた
め、迅速性に問題があった。ＭＲＳＡの検出および同定
には、培養に長時間を要し、また短時間で試料中に存在
する極微量のｍｅｃＡ遺伝子を検出することは困難であ
ったため、臨床診断の分野では迅速かつ高感度な検出法
の出現が望まれている。さらには、検査をより簡便にす
るために、自動検査装置の開発も望まれている。
Ａを遺伝子レベルで検出する試みがなされているが、試
料の調製に患者検体から採取した菌の培養が必要なた
め、迅速性に問題があった。ＭＲＳＡの検出および同定
には、培養に長時間を要し、また短時間で試料中に存在
する極微量のｍｅｃＡ遺伝子を検出することは困難であ
ったため、臨床診断の分野では迅速かつ高感度な検出法
の出現が望まれている。さらには、検査をより簡便にす
るために、自動検査装置の開発も望まれている。
【０００５】検出を高感度で行うためには、検出および
同定しようとする遺伝子や該遺伝子に由来するＲＮＡ
（以下これらを標的核酸とする）中の特定の配列を増幅
したうえで検出等することが好適である。
同定しようとする遺伝子や該遺伝子に由来するＲＮＡ
（以下これらを標的核酸とする）中の特定の配列を増幅
したうえで検出等することが好適である。
【０００６】標的核酸がＤＮＡである場合の増幅法とし
ては、ポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）法
が知られている。この方法は、標的ＤＮＡ中の特定の配
列の両末端部に相補的および相同な一組のプライマーと
熱耐性ＤＮＡポリメレース存在下で、熱変性、プライマ
ー・アニール、伸長反応からなるサイクルを繰り返し行
うことによって前記特定の配列を増幅する方法である。
この時、前記特定の配列をＰＣＲ法で増幅するには前記
特定の配列との特異性が高いオリゴヌクレオチドが必要
であり、更にその検出及び同定を高感度で行うために
は、標的ＤＮＡとの特異性が高いオリゴヌクレオチドが
必要である。更にはそれらのオリゴヌクレオチドの最適
な組み合わせを検討する必要がある。そこで、特定の配
列のオリゴヌクレオチドを用いて、ｍｅｃＡ遺伝子をＰ
ＣＲ法で黄色ブドウ球菌の染色体ＤＮＡ上に検出する試
みがなされている。しかしながら、試料の調製に患者検
体から採取した菌の培養が必要なため、前記のハイブリ
ダイゼーション法と同様、迅速性に問題があった。ま
た、染色体ＤＮＡ上のｍｅｃＡ遺伝子を検出したとして
も、実際にＰＢＰ−２’の発現を同定したことにはなら
ないために、臨床的意義上の問題点も挙げられる。ま
た、ＰＣＲ法は急激な昇温・降温を繰り返すという複雑
操作が必要であり、そのことが自動化への障害となる。
ては、ポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）法
が知られている。この方法は、標的ＤＮＡ中の特定の配
列の両末端部に相補的および相同な一組のプライマーと
熱耐性ＤＮＡポリメレース存在下で、熱変性、プライマ
ー・アニール、伸長反応からなるサイクルを繰り返し行
うことによって前記特定の配列を増幅する方法である。
この時、前記特定の配列をＰＣＲ法で増幅するには前記
特定の配列との特異性が高いオリゴヌクレオチドが必要
であり、更にその検出及び同定を高感度で行うために
は、標的ＤＮＡとの特異性が高いオリゴヌクレオチドが
必要である。更にはそれらのオリゴヌクレオチドの最適
な組み合わせを検討する必要がある。そこで、特定の配
列のオリゴヌクレオチドを用いて、ｍｅｃＡ遺伝子をＰ
ＣＲ法で黄色ブドウ球菌の染色体ＤＮＡ上に検出する試
みがなされている。しかしながら、試料の調製に患者検
体から採取した菌の培養が必要なため、前記のハイブリ
ダイゼーション法と同様、迅速性に問題があった。ま
た、染色体ＤＮＡ上のｍｅｃＡ遺伝子を検出したとして
も、実際にＰＢＰ−２’の発現を同定したことにはなら
ないために、臨床的意義上の問題点も挙げられる。ま
た、ＰＣＲ法は急激な昇温・降温を繰り返すという複雑
操作が必要であり、そのことが自動化への障害となる。
【０００７】一方、標的核酸がＲＮＡである場合の増幅
法としては、ＲＴ−ＰＣＲ法の他、逆転写酵素およびＲ
ＮＡポリメレースの協奏的作用によって前記特定配列を
増幅するＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法等が知られている。こ
の方法は、標的ＲＮＡの特定配列に対し、プロモーター
配列を含むプライマーと逆転写酵素、およびリボヌクレ
エースHにより、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ
を合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメレ
ースにより、前記特定配列を含むＲＮＡを合成するとと
もに、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本
鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うものである。
ＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法は一定温度での核酸増幅が可能
であり、自動化へ適している方法だと考えられる。しか
し、これらの増幅法は比較的低温（例えば４１℃）で反
応を行うために、標的ＲＮＡが分子内構造を形成し、プ
ライマーの結合を阻害し、反応効率を低下させる可能性
が考えられる。したがって、増幅反応の前に標的ＲＮＡ
の熱変性を行うことで、標的ＲＮＡの分子内構造を壊
し、プライマーの結合効率を向上させるための操作が必
要であった。
法としては、ＲＴ−ＰＣＲ法の他、逆転写酵素およびＲ
ＮＡポリメレースの協奏的作用によって前記特定配列を
増幅するＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法等が知られている。こ
の方法は、標的ＲＮＡの特定配列に対し、プロモーター
配列を含むプライマーと逆転写酵素、およびリボヌクレ
エースHにより、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ
を合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメレ
ースにより、前記特定配列を含むＲＮＡを合成するとと
もに、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本
鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うものである。
ＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法は一定温度での核酸増幅が可能
であり、自動化へ適している方法だと考えられる。しか
し、これらの増幅法は比較的低温（例えば４１℃）で反
応を行うために、標的ＲＮＡが分子内構造を形成し、プ
ライマーの結合を阻害し、反応効率を低下させる可能性
が考えられる。したがって、増幅反応の前に標的ＲＮＡ
の熱変性を行うことで、標的ＲＮＡの分子内構造を壊
し、プライマーの結合効率を向上させるための操作が必
要であった。
【０００８】そこで本願発明は、メシチリン耐性黄色ブ
ドウ球菌が産生する細胞壁合成タンパク質ＰＢＰ―２’
をコードするｍｅｃＡ遺伝子に由来するＲＮＡを比較的
低温（例えば４１℃）で特異的に増幅したり、検出およ
び同定を高感度で行うために有用なオリゴヌクレオチド
の好適な組み合わせの提供を目的とするものである。
ドウ球菌が産生する細胞壁合成タンパク質ＰＢＰ―２’
をコードするｍｅｃＡ遺伝子に由来するＲＮＡを比較的
低温（例えば４１℃）で特異的に増幅したり、検出およ
び同定を高感度で行うために有用なオリゴヌクレオチド
の好適な組み合わせの提供を目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
になされた本願請求項１の発明は、メシチリン耐性黄色
ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子に由来するＲＮＡの特定配
列を鋳型として、該特定配列に相同的な配列を有する第
一のプライマーおよび該特定配列に相補的な配列を有す
る第二のプライマー（ここで第一または第二のプライマ
ーのいずれか一方のプライマーは、５’側にＲＮＡポリ
メレースのプロモーター配列を付加した配列を有する）
を用い、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによりｃＤＮ
Ａを生成することによりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成
し、リボヌクレエースＨによりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖の
ＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮ
Ａを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより
前記ＲＮＡ配列または前記ＲＮＡ配列に相補的な配列か
らなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２
本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポ
リメレース存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ
転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレー
スによる１本鎖ＤＮＡ生成の鋳型となるようなＲＮＡ増
幅工程を利用した検出法において、第一のプライマーと
して配列番号１のオリゴヌクレオチド、第二のプライマ
ーとして配列番号２から４のいずれかのオリゴヌクレオ
チドを用いるか、第一のプライマーとして配列番号５の
オリゴヌクレオチド、第二のプライマーとして配列番号
６または７のオリゴヌクレオチドを用いるか、または第
一のプライマーとして配列番号８のオリゴヌクレオチ
ド、第二のプライマーとして配列番号６または７のオリ
ゴヌクレオチドを用いることを特徴とする。
になされた本願請求項１の発明は、メシチリン耐性黄色
ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子に由来するＲＮＡの特定配
列を鋳型として、該特定配列に相同的な配列を有する第
一のプライマーおよび該特定配列に相補的な配列を有す
る第二のプライマー（ここで第一または第二のプライマ
ーのいずれか一方のプライマーは、５’側にＲＮＡポリ
メレースのプロモーター配列を付加した配列を有する）
を用い、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによりｃＤＮ
Ａを生成することによりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成
し、リボヌクレエースＨによりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖の
ＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮ
Ａを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより
前記ＲＮＡ配列または前記ＲＮＡ配列に相補的な配列か
らなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２
本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポ
リメレース存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ
転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレー
スによる１本鎖ＤＮＡ生成の鋳型となるようなＲＮＡ増
幅工程を利用した検出法において、第一のプライマーと
して配列番号１のオリゴヌクレオチド、第二のプライマ
ーとして配列番号２から４のいずれかのオリゴヌクレオ
チドを用いるか、第一のプライマーとして配列番号５の
オリゴヌクレオチド、第二のプライマーとして配列番号
６または７のオリゴヌクレオチドを用いるか、または第
一のプライマーとして配列番号８のオリゴヌクレオチ
ド、第二のプライマーとして配列番号６または７のオリ
ゴヌクレオチドを用いることを特徴とする。
【００１０】本願請求項２の発明は、請求項１の発明に
係り、前記第一のプライマーが配列番号１、５または８
の配列のうち少なくとも連続した１０塩基以上からなる
オリゴヌクレオチドであることを特徴とする。本願請求
項３の発明は、請求項１の発明に係り、前記第二のプラ
イマーが配列番号２、３、４、６または７の配列のうち
少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレ
オチドであることを特徴とする。そして本願請求項４の
発明は、請求項１の発明に係り、前記ＲＮＡ増幅工程
を、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴ
ヌクレオチドプローブ存在下で実施することからなり、
ここで該プローブの配列がＲＮＡ転写産物の少なくとも
一部と相補的であり、該プローブがＲＮＡ転写産物と相
補結合によって、複合体を形成していない場合と比較し
て蛍光特性が変化するものである、反応液の蛍光強度を
測定することからなるメシチリン耐性黄色ブドウ球菌の
ｍｅｃＡ遺伝子の検出方法である。以下、本発明を詳細
に説明する。
係り、前記第一のプライマーが配列番号１、５または８
の配列のうち少なくとも連続した１０塩基以上からなる
オリゴヌクレオチドであることを特徴とする。本願請求
項３の発明は、請求項１の発明に係り、前記第二のプラ
イマーが配列番号２、３、４、６または７の配列のうち
少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレ
オチドであることを特徴とする。そして本願請求項４の
発明は、請求項１の発明に係り、前記ＲＮＡ増幅工程
を、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴ
ヌクレオチドプローブ存在下で実施することからなり、
ここで該プローブの配列がＲＮＡ転写産物の少なくとも
一部と相補的であり、該プローブがＲＮＡ転写産物と相
補結合によって、複合体を形成していない場合と比較し
て蛍光特性が変化するものである、反応液の蛍光強度を
測定することからなるメシチリン耐性黄色ブドウ球菌の
ｍｅｃＡ遺伝子の検出方法である。以下、本発明を詳細
に説明する。
【００１１】本願発明は、比較的低温かつ一定温度（３
５℃〜５０℃、好ましくは４１℃）で、メシチリン耐性
黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子に由来するＲＮＡを増
幅および検出するためのオリゴヌクレオチドの組合せを
提供すること、すなわちｍｅｃＡ遺伝子に由来するＲＮ
Ａの増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー、及び検出
用のオリゴヌクレオチドプローブの組合わせを提供する
ことで、それを利用した簡便、迅速かつ高感度なｍｅｃ
Ａ遺伝子の検出方法ならびに検出キットを臨床検査等に
提供するものである。
５℃〜５０℃、好ましくは４１℃）で、メシチリン耐性
黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子に由来するＲＮＡを増
幅および検出するためのオリゴヌクレオチドの組合せを
提供すること、すなわちｍｅｃＡ遺伝子に由来するＲＮ
Ａの増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー、及び検出
用のオリゴヌクレオチドプローブの組合わせを提供する
ことで、それを利用した簡便、迅速かつ高感度なｍｅｃ
Ａ遺伝子の検出方法ならびに検出キットを臨床検査等に
提供するものである。
【００１２】本願発明の態様の一例では、試料中に存在
するメシチリン耐性黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子に
由来するＲＮＡの特定配列を鋳型として、第二のプライ
マー（標的ＲＮＡの特定配列の３'末端領域に相補的配
列）が相補結合し、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースに
よる伸長反応からｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ
−ＤＮＡからなる２本鎖を形成し、次いでリボヌクレエ
ースＨによりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して
１本鎖ＤＮＡを生成する。その後、該１本鎖ＤＮＡに対
し第一のプライマー（標的ＲＮＡの５’末端領域に相同
的配列であり、５’末端にＲＮＡポリメレースのプロモ
ーター配列が付加されている）が相補結合し、ＤＮＡ依
存性ＤＮＡポリメレースにより前記標的ＲＮＡ配列と相
同的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーターを
有する２本鎖ＤＮＡを生成する。そして、該２本鎖ＤＮ
ＡがＲＮＡポリメレース存在下で前記標的ＲＮＡと相同
的な配列からなるＲＮＡ転写産物が増幅される。そして
本願発明は、第一のプライマーとして配列番号１、５ま
たは８のオリゴヌクレオチド、第二のプライマーとして
配列番号２、３、４、６または７の配列のオリゴヌクレ
オチドを用いることを特徴とする。第一および第二のプ
ライマーは、それぞれの配列番号の全長であっても良い
が、各配列の中の少なくとも連続した１０塩基以上から
なるオリゴヌクレオチドの組み合わせを使用することも
できる。
するメシチリン耐性黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子に
由来するＲＮＡの特定配列を鋳型として、第二のプライ
マー（標的ＲＮＡの特定配列の３'末端領域に相補的配
列）が相補結合し、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースに
よる伸長反応からｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ
−ＤＮＡからなる２本鎖を形成し、次いでリボヌクレエ
ースＨによりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して
１本鎖ＤＮＡを生成する。その後、該１本鎖ＤＮＡに対
し第一のプライマー（標的ＲＮＡの５’末端領域に相同
的配列であり、５’末端にＲＮＡポリメレースのプロモ
ーター配列が付加されている）が相補結合し、ＤＮＡ依
存性ＤＮＡポリメレースにより前記標的ＲＮＡ配列と相
同的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーターを
有する２本鎖ＤＮＡを生成する。そして、該２本鎖ＤＮ
ＡがＲＮＡポリメレース存在下で前記標的ＲＮＡと相同
的な配列からなるＲＮＡ転写産物が増幅される。そして
本願発明は、第一のプライマーとして配列番号１、５ま
たは８のオリゴヌクレオチド、第二のプライマーとして
配列番号２、３、４、６または７の配列のオリゴヌクレ
オチドを用いることを特徴とする。第一および第二のプ
ライマーは、それぞれの配列番号の全長であっても良い
が、各配列の中の少なくとも連続した１０塩基以上から
なるオリゴヌクレオチドの組み合わせを使用することも
できる。
【００１３】上記本願発明の一態様において、標的ＲＮ
Ａは、特定配列の５’末端で切断される必要がある。こ
のように標的ＲＮＡを切断する方法としては、特定配列
の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配
列を有するオリゴヌクレオチド（切断用オリゴヌクレオ
チドプローブ）を添加することによって、標的ＲＮＡを
リボヌクレエースＨ等により切断する方法が好ましい。
該切断用オリゴヌクレオチドの３’末端はオリゴヌクレ
オチドプライマーとして機能しないように処理されたも
の、例えばアミノ化等されているものを使用することが
望ましい。
Ａは、特定配列の５’末端で切断される必要がある。こ
のように標的ＲＮＡを切断する方法としては、特定配列
の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配
列を有するオリゴヌクレオチド（切断用オリゴヌクレオ
チドプローブ）を添加することによって、標的ＲＮＡを
リボヌクレエースＨ等により切断する方法が好ましい。
該切断用オリゴヌクレオチドの３’末端はオリゴヌクレ
オチドプライマーとして機能しないように処理されたも
の、例えばアミノ化等されているものを使用することが
望ましい。
【００１４】上記本願発明の一態様においては増幅され
るＲＮＡ転写産物の配列の少なくとも一部に対して相補
的な配列を有するインターカレーター性蛍光色素で標識
されたオリゴヌクレオチドプローブ（検出用オリゴヌク
レオチドプローブ）存在下でこの増幅工程を実施するこ
とが好ましい。この際、該プローブがＲＮＡ転写産物と
相補結合によって、複合体を形成していない場合と比較
して蛍光特性が変化するものであって、反応液の蛍光強
度を測定すれば良い。さらには、標識されたオリゴヌク
レオチドプローブを増幅工程中に共存させる場合には、
プローブが伸長反応のプライマーとして機能しないよう
に、例えばその３’末端にグリコール酸を付加する等の
修飾を行うことが特に望ましい。検出用オリゴヌクレオ
チドプローブとしては、配列番号３または１２に記載し
た配列のオリゴヌクレオチドを利用することが例示でき
る。
るＲＮＡ転写産物の配列の少なくとも一部に対して相補
的な配列を有するインターカレーター性蛍光色素で標識
されたオリゴヌクレオチドプローブ（検出用オリゴヌク
レオチドプローブ）存在下でこの増幅工程を実施するこ
とが好ましい。この際、該プローブがＲＮＡ転写産物と
相補結合によって、複合体を形成していない場合と比較
して蛍光特性が変化するものであって、反応液の蛍光強
度を測定すれば良い。さらには、標識されたオリゴヌク
レオチドプローブを増幅工程中に共存させる場合には、
プローブが伸長反応のプライマーとして機能しないよう
に、例えばその３’末端にグリコール酸を付加する等の
修飾を行うことが特に望ましい。検出用オリゴヌクレオ
チドプローブとしては、配列番号３または１２に記載し
た配列のオリゴヌクレオチドを利用することが例示でき
る。
【００１５】また本願発明の別の態様では、試料中に存
在するメシチリン耐性黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子
に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型として、第二のプラ
イマー（標的ＲＮＡに相補的配列で、５’側にＲＮＡポ
リメレースのプロモーター配列が付加されている）が相
補結合し、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによる伸長
反応からｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ−ＤＮＡ
からなる２本鎖を形成し、次いでリボヌクレエースＨに
よりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖Ｄ
ＮＡを生成する。その後、該１本鎖ＤＮＡに対し第一の
プライマー（標的ＲＮＡの５’末端領域に相同的配列で
あり、）が相補結合し、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレー
スにより前記標的ＲＮＡ配列と相同的な配列からなるＲ
ＮＡを転写可能なプロモーターを有する２本鎖ＤＮＡを
生成する。そして、該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレー
ス存在下で前記標的ＲＮＡと相同的な配列からなるＲＮ
Ａ転写産物が増幅される。そして本願発明は、第一のプ
ライマーとして配列番号１、５または８のオリゴヌクレ
オチド、第二のプライマーとして配列番号２、３、４、
６または７の配列のオリゴヌクレオチドを用いることを
特徴とする。第一および第二のプライマーは、それぞれ
の配列番号の全長であっても良いが、各配列の中の少な
くとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチ
ドの組み合わせを使用することもできる。
在するメシチリン耐性黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子
に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型として、第二のプラ
イマー（標的ＲＮＡに相補的配列で、５’側にＲＮＡポ
リメレースのプロモーター配列が付加されている）が相
補結合し、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによる伸長
反応からｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ−ＤＮＡ
からなる２本鎖を形成し、次いでリボヌクレエースＨに
よりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖Ｄ
ＮＡを生成する。その後、該１本鎖ＤＮＡに対し第一の
プライマー（標的ＲＮＡの５’末端領域に相同的配列で
あり、）が相補結合し、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレー
スにより前記標的ＲＮＡ配列と相同的な配列からなるＲ
ＮＡを転写可能なプロモーターを有する２本鎖ＤＮＡを
生成する。そして、該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレー
ス存在下で前記標的ＲＮＡと相同的な配列からなるＲＮ
Ａ転写産物が増幅される。そして本願発明は、第一のプ
ライマーとして配列番号１、５または８のオリゴヌクレ
オチド、第二のプライマーとして配列番号２、３、４、
６または７の配列のオリゴヌクレオチドを用いることを
特徴とする。第一および第二のプライマーは、それぞれ
の配列番号の全長であっても良いが、各配列の中の少な
くとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチ
ドの組み合わせを使用することもできる。
【００１６】上記本願発明の一態様においては増幅され
るＲＮＡ転写産物の配列の少なくとも一部に対して相補
的な配列を有するインターカレーター性蛍光色素で標識
されたオリゴヌクレオチドプローブ（検出用オリゴヌク
レオチドプローブ）存在下でこの増幅工程を実施するこ
とが好ましい。この際、該プローブがＲＮＡ転写産物と
相補結合によって、複合体を形成していない場合と比較
して蛍光特性が変化するものであって、反応液の蛍光強
度を測定すれば良い。さらには、標識されたオリゴヌク
レオチドプローブを増幅工程中に共存させる場合には、
プローブが伸長反応のプライマーとして機能しないよう
に、例えばその３’末端にグリコール酸を付加する等の
修飾を行うことが特に望ましい。検出用オリゴヌクレオ
チドプローブとしては、配列番号３または１２に記載し
た配列と相補的な配列のオリゴヌクレオチドを利用する
ことが例示できる。
るＲＮＡ転写産物の配列の少なくとも一部に対して相補
的な配列を有するインターカレーター性蛍光色素で標識
されたオリゴヌクレオチドプローブ（検出用オリゴヌク
レオチドプローブ）存在下でこの増幅工程を実施するこ
とが好ましい。この際、該プローブがＲＮＡ転写産物と
相補結合によって、複合体を形成していない場合と比較
して蛍光特性が変化するものであって、反応液の蛍光強
度を測定すれば良い。さらには、標識されたオリゴヌク
レオチドプローブを増幅工程中に共存させる場合には、
プローブが伸長反応のプライマーとして機能しないよう
に、例えばその３’末端にグリコール酸を付加する等の
修飾を行うことが特に望ましい。検出用オリゴヌクレオ
チドプローブとしては、配列番号３または１２に記載し
た配列と相補的な配列のオリゴヌクレオチドを利用する
ことが例示できる。
【００１７】
【発明の実施の形態】以下、本願発明を実施例により更
に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定
されるものではない。
に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定
されるものではない。
【００１８】実施例１ 本願発明によるオリゴヌクレオチドプライマーの組合わ
せを用いて、標的ＲＮＡの特異的増幅を行った。なおｍ
ｅｃＡ−ＲＮＡとは、ｍｅｃＡの塩基配列を含む２本鎖
ＤＮＡを鋳型としたインビトロ転写により合成、精製さ
れたＲＮＡである。
せを用いて、標的ＲＮＡの特異的増幅を行った。なおｍ
ｅｃＡ−ＲＮＡとは、ｍｅｃＡの塩基配列を含む２本鎖
ＤＮＡを鋳型としたインビトロ転写により合成、精製さ
れたＲＮＡである。
【００１９】（１）ＰＢＰ−２’に由来するｍｅｃＡ−
ＲＮＡの塩基番号１〜２０１３（ＲＮＡの塩基番号は松
橋ら「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２１、１６７〜１７１
（１９８７）」に従った）を含む標準ＲＮＡ（２０１６
ｍｅｒ）を試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定
量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μ
ｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、５．０ｍＭ Ｄ
ＴＴ）を用い１．０×１０4コピー／２．５μｌとなる
よう希釈した。コントロール試験区（Ｎｅｇａ）には希
釈液のみを用いた。
ＲＮＡの塩基番号１〜２０１３（ＲＮＡの塩基番号は松
橋ら「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２１、１６７〜１７１
（１９８７）」に従った）を含む標準ＲＮＡ（２０１６
ｍｅｒ）を試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定
量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μ
ｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、５．０ｍＭ Ｄ
ＴＴ）を用い１．０×１０4コピー／２．５μｌとなる
よう希釈した。コントロール試験区（Ｎｅｇａ）には希
釈液のみを用いた。
【００２０】（２）以下の組成の反応液２３．３μｌを
０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔ
ｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ
ｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ
試料２．５μｌを添加した。
０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔ
ｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ
ｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ
試料２．５μｌを添加した。
【００２１】反応液の組成（濃度は酵素溶液添加後の反
応系の最終濃度） ６０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液 （ｐH８．６） １３．０ｍＭ 塩化マグネシウム ９０．０ｍＭ 塩化カリウム １．０ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ 各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ ２．２５ｍＭ ＧＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各１．０μＭの第一のプライマーと第二のプライマー ０．１６μＭの切断用オリゴヌクレオチドプローブ（標
的ＲＮＡを第一のプライマーが結合し得る位置で切断す
るためのオリゴヌクレオチド、３’末端はアミノ化して
ある） ３９Ｕ リボヌクレエース インヒビター（宝酒造
（株）製） １５．０％ ＤＭＳＯ 容量調製用蒸留水 なお、第一のプライマー、第二のプライマーおよび切断
用プローブの組み合わせとしては、以下の番号のうち、
いずれか一つを用いた。
応系の最終濃度） ６０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液 （ｐH８．６） １３．０ｍＭ 塩化マグネシウム ９０．０ｍＭ 塩化カリウム １．０ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ 各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ ２．２５ｍＭ ＧＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各１．０μＭの第一のプライマーと第二のプライマー ０．１６μＭの切断用オリゴヌクレオチドプローブ（標
的ＲＮＡを第一のプライマーが結合し得る位置で切断す
るためのオリゴヌクレオチド、３’末端はアミノ化して
ある） ３９Ｕ リボヌクレエース インヒビター（宝酒造
（株）製） １５．０％ ＤＭＳＯ 容量調製用蒸留水 なお、第一のプライマー、第二のプライマーおよび切断
用プローブの組み合わせとしては、以下の番号のうち、
いずれか一つを用いた。
【００２２】１．第一のプライマーとして配列番号１と
して記載した配列の５’末端４番目から１５番目までの
オリゴヌクレオチド（ただし、その５’末端には、配列
番号１３で示したＴ７ポリメレースのプロモータ配列を
付加した）、第二のプライマーとして配列番号２に記載
したオリゴヌクレオチド、切断用プローブとして配列番
号９に記載したオリゴヌクレオチド ２．第一のプライマーとして配列番号１として記載した
配列の５’末端４番目から１５番目までのオリゴヌクレ
オチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポリ
メレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプライ
マーとして配列番号３に記載したオリゴヌクレオチド、
切断用プローブとして配列番号９に記載したオリゴヌク
レオチド ３．第一のプライマーとして配列番号１として記載した
配列の５’末端４番目から１５番目までのオリゴヌクレ
オチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポリ
メレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプライ
マーとして配列番号４に記載したオリゴヌクレオチド、
切断用プローブとして配列番号９に記載したオリゴヌク
レオチド ４．第一のプライマーとして配列番号１として記載した
配列の５’末端４番目から２８番目までのオリゴヌクレ
オチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポリ
メレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプライ
マーとして配列番号３に記載したオリゴヌクレオチド、
切断用プローブとして配列番号９に記載したオリゴヌク
レオチド ５．第一のプライマーとして配列番号１として記載した
配列の５’末端４番目から２８番目までのオリゴヌクレ
オチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポリ
メレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプライ
マーとして配列番号４に記載したオリゴヌクレオチド、
切断用プローブとして配列番号９に記載したオリゴヌク
レオチド ６．第一のプライマーとして配列番号１として記載した
配列の５’末端１番目から２５番目までのオリゴヌクレ
オチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポリ
メレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプライ
マーとして配列番号３に記載したオリゴヌクレオチド、
切断用プローブとして配列番号９に記載したオリゴヌク
レオチド ７．第一のプライマーとして配列番号１として記載した
配列の５’末端１番目から２５番目までのオリゴヌクレ
オチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポリ
メレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプライ
マーとして配列番号４に記載したオリゴヌクレオチド、
切断用プローブとして配列番号９に記載したオリゴヌク
レオチド ８．第一のプライマーとして配列番号５として記載した
配列の５’末端４番目から２８番目までのオリゴヌクレ
オチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポリ
メレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプライ
マーとして配列番号６に記載したオリゴヌクレオチド、
切断用プローブとして配列番号１０に記載したオリゴヌ
クレオチド ９．第一のプライマーとして配列番号５として記載した
配列の５’末端４番目から２８番目までのオリゴヌクレ
オチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポリ
メレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプライ
マーとして配列番号７に記載したオリゴヌクレオチド、
切断用プローブとして配列番号１０に記載したオリゴヌ
クレオチド １０．第一のプライマーとして配列番号５として記載し
た配列の５’末端１番目から２５番目までのオリゴヌク
レオチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポ
リメレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプラ
イマーとして配列番号６に記載したオリゴヌクレオチ
ド、切断用プローブとして配列番号１０に記載したオリ
ゴヌクレオチド １１．第一のプライマーとして配列番号５として記載し
た配列の５’末端１番目から２５番目までのオリゴヌク
レオチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポ
リメレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプラ
イマーとして配列番号７に記載したオリゴヌクレオチ
ド、切断用プローブとして配列番号１０に記載したオリ
ゴヌクレオチド １２．第一のプライマーとして配列番号８として記載し
た配列の５’末端４番目から２８番目までのオリゴヌク
レオチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポ
リメレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプラ
イマーとして配列番号６に記載したオリゴヌクレオチ
ド、切断用プローブとして配列番号１１に記載したオリ
ゴヌクレオチド １３．第一のプライマーとして配列番号８として記載し
た配列の５’末端４番目から２８番目までのオリゴヌク
レオチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポ
リメレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプラ
イマーとして配列番号７に記載したオリゴヌクレオチ
ド、切断用プローブとして配列番号１１に記載したオリ
ゴヌクレオチド １４．第一のプライマーとして配列番号８として記載し
た配列の５’末端１番目から２５番目までのオリゴヌク
レオチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポ
リメレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプラ
イマーとして配列番号６に記載したオリゴヌクレオチ
ド、切断用プローブとして配列番号１１に記載したオリ
ゴヌクレオチド １５．第一のプライマーとして配列番号８として記載し
た配列の５’末端１番目から２５番目までのオリゴヌク
レオチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポ
リメレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプラ
イマーとして配列番号７に記載したオリゴヌクレオチ
ド、切断用プローブとして配列番号１１に記載したオリ
ゴヌクレオチド （３）上記の反応液を、４１℃で５分間保温後、以下の
組成の予め４１℃で２分間保温した酵素液４．２μｌを
添加した。
して記載した配列の５’末端４番目から１５番目までの
オリゴヌクレオチド（ただし、その５’末端には、配列
番号１３で示したＴ７ポリメレースのプロモータ配列を
付加した）、第二のプライマーとして配列番号２に記載
したオリゴヌクレオチド、切断用プローブとして配列番
号９に記載したオリゴヌクレオチド ２．第一のプライマーとして配列番号１として記載した
配列の５’末端４番目から１５番目までのオリゴヌクレ
オチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポリ
メレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプライ
マーとして配列番号３に記載したオリゴヌクレオチド、
切断用プローブとして配列番号９に記載したオリゴヌク
レオチド ３．第一のプライマーとして配列番号１として記載した
配列の５’末端４番目から１５番目までのオリゴヌクレ
オチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポリ
メレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプライ
マーとして配列番号４に記載したオリゴヌクレオチド、
切断用プローブとして配列番号９に記載したオリゴヌク
レオチド ４．第一のプライマーとして配列番号１として記載した
配列の５’末端４番目から２８番目までのオリゴヌクレ
オチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポリ
メレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプライ
マーとして配列番号３に記載したオリゴヌクレオチド、
切断用プローブとして配列番号９に記載したオリゴヌク
レオチド ５．第一のプライマーとして配列番号１として記載した
配列の５’末端４番目から２８番目までのオリゴヌクレ
オチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポリ
メレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプライ
マーとして配列番号４に記載したオリゴヌクレオチド、
切断用プローブとして配列番号９に記載したオリゴヌク
レオチド ６．第一のプライマーとして配列番号１として記載した
配列の５’末端１番目から２５番目までのオリゴヌクレ
オチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポリ
メレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプライ
マーとして配列番号３に記載したオリゴヌクレオチド、
切断用プローブとして配列番号９に記載したオリゴヌク
レオチド ７．第一のプライマーとして配列番号１として記載した
配列の５’末端１番目から２５番目までのオリゴヌクレ
オチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポリ
メレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプライ
マーとして配列番号４に記載したオリゴヌクレオチド、
切断用プローブとして配列番号９に記載したオリゴヌク
レオチド ８．第一のプライマーとして配列番号５として記載した
配列の５’末端４番目から２８番目までのオリゴヌクレ
オチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポリ
メレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプライ
マーとして配列番号６に記載したオリゴヌクレオチド、
切断用プローブとして配列番号１０に記載したオリゴヌ
クレオチド ９．第一のプライマーとして配列番号５として記載した
配列の５’末端４番目から２８番目までのオリゴヌクレ
オチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポリ
メレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプライ
マーとして配列番号７に記載したオリゴヌクレオチド、
切断用プローブとして配列番号１０に記載したオリゴヌ
クレオチド １０．第一のプライマーとして配列番号５として記載し
た配列の５’末端１番目から２５番目までのオリゴヌク
レオチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポ
リメレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプラ
イマーとして配列番号６に記載したオリゴヌクレオチ
ド、切断用プローブとして配列番号１０に記載したオリ
ゴヌクレオチド １１．第一のプライマーとして配列番号５として記載し
た配列の５’末端１番目から２５番目までのオリゴヌク
レオチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポ
リメレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプラ
イマーとして配列番号７に記載したオリゴヌクレオチ
ド、切断用プローブとして配列番号１０に記載したオリ
ゴヌクレオチド １２．第一のプライマーとして配列番号８として記載し
た配列の５’末端４番目から２８番目までのオリゴヌク
レオチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポ
リメレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプラ
イマーとして配列番号６に記載したオリゴヌクレオチ
ド、切断用プローブとして配列番号１１に記載したオリ
ゴヌクレオチド １３．第一のプライマーとして配列番号８として記載し
た配列の５’末端４番目から２８番目までのオリゴヌク
レオチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポ
リメレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプラ
イマーとして配列番号７に記載したオリゴヌクレオチ
ド、切断用プローブとして配列番号１１に記載したオリ
ゴヌクレオチド １４．第一のプライマーとして配列番号８として記載し
た配列の５’末端１番目から２５番目までのオリゴヌク
レオチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポ
リメレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプラ
イマーとして配列番号６に記載したオリゴヌクレオチ
ド、切断用プローブとして配列番号１１に記載したオリ
ゴヌクレオチド １５．第一のプライマーとして配列番号８として記載し
た配列の５’末端１番目から２５番目までのオリゴヌク
レオチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポ
リメレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプラ
イマーとして配列番号７に記載したオリゴヌクレオチ
ド、切断用プローブとして配列番号１１に記載したオリ
ゴヌクレオチド （３）上記の反応液を、４１℃で５分間保温後、以下の
組成の予め４１℃で２分間保温した酵素液４．２μｌを
添加した。
【００２３】酵素液の組成（反応時の再終濃度） １．７％ ソルビトール ８ユニット ＡＭＶ逆転写酵素 （宝酒造（株）製） １４２ユニット Ｔ７ ＲＮＡポリメレース （ＧＩＢ
ＣＯ社製） ３μｇ 牛血清アルブミン 容量調製用蒸留水 （４）引き続きＰＣＲチューブを４１℃に９０分間保温
した後、特定の増幅産物を４％アガロースゲルを用いた
電気泳動により分析した。
ＣＯ社製） ３μｇ 牛血清アルブミン 容量調製用蒸留水 （４）引き続きＰＣＲチューブを４１℃に９０分間保温
した後、特定の増幅産物を４％アガロースゲルを用いた
電気泳動により分析した。
【００２４】（５）電気泳動後の染色には市販の染色液
（商品名；ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、宝酒造（株）
製）を用いた。
（商品名；ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、宝酒造（株）
製）を用いた。
【００２５】電気泳動結果を図１（白黒反転した写真）
に示した。いずれの組み合わせにおいても、ｍｅｃＡ−
ＲＮＡを添加した系において、特異的なＲＮＡ増幅産物
（矢印部分）が得られた。このことから、これらのオリ
ゴヌクレオチドプライマーの組合せは、メシチリン耐性
黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子に由来するＲＮＡの増
幅、検出に有用であることが示された。
に示した。いずれの組み合わせにおいても、ｍｅｃＡ−
ＲＮＡを添加した系において、特異的なＲＮＡ増幅産物
（矢印部分）が得られた。このことから、これらのオリ
ゴヌクレオチドプライマーの組合せは、メシチリン耐性
黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子に由来するＲＮＡの増
幅、検出に有用であることが示された。
【００２６】実施例２ 本願発明によるオリゴヌクレオチドプライマーの組合わ
せを用いて、標的ＲＮＡであるｍｅｃＡ−ＲＮＡの特異
的な検出が可能であることを確認した。
せを用いて、標的ＲＮＡであるｍｅｃＡ−ＲＮＡの特異
的な検出が可能であることを確認した。
【００２７】（１）ＰＢＰ−２’に由来するｍｅｃＡ−
ＲＮＡの塩基番号１〜２０１３（ＲＮＡの塩基番号は松
橋ら「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２１、１６７〜１７１
（１９８７）」に従った）を含む標準ＲＮＡ（２０１６
ｍｅｒ）を試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定
量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μ
ｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、５．０ｍＭ Ｄ
ＴＴ）を用い１．０×１０6コピー／２．５μｌまたは
１．０×１０4コピー／２．５μｌとなるよう希釈し
た。コントロール試験区（Ｎｅｇａ）には希釈液のみを
用いた。
ＲＮＡの塩基番号１〜２０１３（ＲＮＡの塩基番号は松
橋ら「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２１、１６７〜１７１
（１９８７）」に従った）を含む標準ＲＮＡ（２０１６
ｍｅｒ）を試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定
量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μ
ｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、５．０ｍＭ Ｄ
ＴＴ）を用い１．０×１０6コピー／２．５μｌまたは
１．０×１０4コピー／２．５μｌとなるよう希釈し
た。コントロール試験区（Ｎｅｇａ）には希釈液のみを
用いた。
【００２８】（２）以下の組成の反応液２３．３μｌを
０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔ
ｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ
ｓ、パーキンエルマー社製）に分注し、これに上記ＲＮ
Ａ試料２．５μｌ（ｍｅｃＡ−ＲＮＡ）を添加した。
０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔ
ｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ
ｓ、パーキンエルマー社製）に分注し、これに上記ＲＮ
Ａ試料２．５μｌ（ｍｅｃＡ−ＲＮＡ）を添加した。
【００２９】反応液の組成（濃度は酵素溶液添加後の反
応系の最終濃度） ６０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液 （ｐH８．６） １３．０ｍＭ 塩化マグネシウム ９０．０ｍＭ 塩化カリウム １．０ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ 各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ ２．２５ｍＭ ＧＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ １．０μＭの第一のオリゴヌクレオチドプライマー １．０μＭの第二のオリゴヌクレオチドプライマー ０．１６μＭの切断用オリゴヌクレオチドプローブ（標
的ＲＮＡを第一のプライマーが結合し得る位置で切断す
るためのオリゴヌクレオチド、３'末端はアミノ化して
ある） ２５．０ｎＭのインターカレーター性蛍光色素（図２）
で標識された検出用オリゴヌクレオチドプローブ（ＭＲ
ＳＨ−ＹＯ、３’末端はグリコール酸で修飾してあ
る）。
応系の最終濃度） ６０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液 （ｐH８．６） １３．０ｍＭ 塩化マグネシウム ９０．０ｍＭ 塩化カリウム １．０ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ 各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ ２．２５ｍＭ ＧＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ １．０μＭの第一のオリゴヌクレオチドプライマー １．０μＭの第二のオリゴヌクレオチドプライマー ０．１６μＭの切断用オリゴヌクレオチドプローブ（標
的ＲＮＡを第一のプライマーが結合し得る位置で切断す
るためのオリゴヌクレオチド、３'末端はアミノ化して
ある） ２５．０ｎＭのインターカレーター性蛍光色素（図２）
で標識された検出用オリゴヌクレオチドプローブ（ＭＲ
ＳＨ−ＹＯ、３’末端はグリコール酸で修飾してあ
る）。
【００３０】３９Ｕ リボヌクレエース インヒビター
（宝酒造（株）製） １５．０％ ＤＭＳＯ 容量調製用蒸留水 なお、プライマー・プローブの組み合わせとしては、以
下の番号のうち、いずれか一つを用いた。
（宝酒造（株）製） １５．０％ ＤＭＳＯ 容量調製用蒸留水 なお、プライマー・プローブの組み合わせとしては、以
下の番号のうち、いずれか一つを用いた。
【００３１】１．第一のプライマーとして配列番号１と
して記載した配列の５’末端４番目から１５番目までの
オリゴヌクレオチド（ただし、その５’末端には配列番
号１３に示したＴ７ポリメレースのプロモータ配列を付
加した）、第二のプライマーとして配列番号２に記載し
たオリゴヌクレオチド、切断用プローブとして配列番号
９に記載したオリゴヌクレオチド配列、検出用プローブ
として配列番号３に記載したオリゴヌクレオチド配列 ２．第一のプライマーとして配列番号８として記載した
配列の５’末端１番目から２５番目までのオリゴヌクレ
オチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポリ
メレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプライ
マーとして配列番号７に記載したオリゴヌクレオチド、
切断用プローブとして配列番号１１に記載したオリゴヌ
クレオチド配列、検出用プローブとして配列番号１２に
記載したオリゴヌクレオチド配列 （３）上記の反応液を、４１℃で５分間保温後、以下の
組成で、かつ、予め４１℃で２分間保温した酵素液４．
２μｌを添加した。
して記載した配列の５’末端４番目から１５番目までの
オリゴヌクレオチド（ただし、その５’末端には配列番
号１３に示したＴ７ポリメレースのプロモータ配列を付
加した）、第二のプライマーとして配列番号２に記載し
たオリゴヌクレオチド、切断用プローブとして配列番号
９に記載したオリゴヌクレオチド配列、検出用プローブ
として配列番号３に記載したオリゴヌクレオチド配列 ２．第一のプライマーとして配列番号８として記載した
配列の５’末端１番目から２５番目までのオリゴヌクレ
オチド（ただし、５’末端には配列番号１３のＴ７ポリ
メレースのプロモータ配列を付加した）、第二のプライ
マーとして配列番号７に記載したオリゴヌクレオチド、
切断用プローブとして配列番号１１に記載したオリゴヌ
クレオチド配列、検出用プローブとして配列番号１２に
記載したオリゴヌクレオチド配列 （３）上記の反応液を、４１℃で５分間保温後、以下の
組成で、かつ、予め４１℃で２分間保温した酵素液４．
２μｌを添加した。
【００３２】酵素液の組成（反応時の再終濃度） １．７％ ソルビトール ８ユニット ＡＭＶ逆転写酵素 （宝酒造（株）製） １４２ユニット Ｔ７ ＲＮＡポリメレース （ＧＩＢ
ＣＯ社製） ３μｇ 牛血清アルブミン 容量調製用蒸留水 （４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機
能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃保温して、励起波
長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液の蛍光
強度を経時的に測定した。酵素添加時の時刻を０分とし
て、サンプルの蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バ
ックグランドの蛍光強度値）の経時変化を図３に示し
た。ＲＮＡサンプル濃度は組み合わせ１では１０6コピ
ー／３０μｌ、組み合わせ２では１０4コピー／３０μ
ｌである。
ＣＯ社製） ３μｇ 牛血清アルブミン 容量調製用蒸留水 （４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機
能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃保温して、励起波
長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液の蛍光
強度を経時的に測定した。酵素添加時の時刻を０分とし
て、サンプルの蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バ
ックグランドの蛍光強度値）の経時変化を図３に示し
た。ＲＮＡサンプル濃度は組み合わせ１では１０6コピ
ー／３０μｌ、組み合わせ２では１０4コピー／３０μ
ｌである。
【００３３】標的ＲＮＡにｍｅｃＡ−ＲＮＡを添加した
系では、特異的な蛍光増感が得られた。以上のことか
ら、本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせはｍｅ
ｃＡ遺伝子由来のＲＮＡを特異的に増幅検出することが
可能であることが示された。
系では、特異的な蛍光増感が得られた。以上のことか
ら、本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせはｍｅ
ｃＡ遺伝子由来のＲＮＡを特異的に増幅検出することが
可能であることが示された。
【００３４】実施例３ 本願発明によるオリゴヌクレオチドプライマーの組合わ
せを用いて、標的ＲＮＡの様々な初期コピー数における
検出を行った。
せを用いて、標的ＲＮＡの様々な初期コピー数における
検出を行った。
【００３５】（１）ＰＢＰ−２’に由来するｍｅｃＡ−
ＲＮＡの塩基番号１〜２０１３（ＲＮＡの塩基番号は松
橋ら「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２１、１６７〜１７１
（１９８７）」に従った）を含む標準ＲＮＡ（２０１６
ｍｅｒ）を試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定
量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μ
ｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、５．０ｍＭ Ｄ
ＴＴ）を用い１．０×１０4コピー／２．５μｌから１
０コピー／２．５μｌとなるよう希釈した。コントロー
ル試験区（Ｎｅｇａ）には希釈液のみを用いた。
ＲＮＡの塩基番号１〜２０１３（ＲＮＡの塩基番号は松
橋ら「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２１、１６７〜１７１
（１９８７）」に従った）を含む標準ＲＮＡ（２０１６
ｍｅｒ）を試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定
量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μ
ｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、５．０ｍＭ Ｄ
ＴＴ）を用い１．０×１０4コピー／２．５μｌから１
０コピー／２．５μｌとなるよう希釈した。コントロー
ル試験区（Ｎｅｇａ）には希釈液のみを用いた。
【００３６】（２）以下の組成の反応液２３．３μｌを
０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔ
ｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ
ｓ、パーキンエルマー社製）に分注し、これに上記ＲＮ
Ａ試料２．５μｌ（ｍｅｃＡ−ＲＮＡ）を添加した。
０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔ
ｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ
ｓ、パーキンエルマー社製）に分注し、これに上記ＲＮ
Ａ試料２．５μｌ（ｍｅｃＡ−ＲＮＡ）を添加した。
【００３７】反応液の組成（濃度は酵素溶液添加後の反
応系の最終濃度） ６０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液 （ｐH８．６） １３．０ｍＭ 塩化マグネシウム ９０．０ｍＭ 塩化カリウム １．０ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ 各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ ２．２５ｍＭ ＧＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ １．０μＭの第一のオリゴヌクレオチドプライマー（配
列番号８として記載した配列の５’末端４番目から２８
番目までのオリゴヌクレオチド。ただし、５’末端には
配列番号１３のＴ７ポリメレースのプロモータ配列を付
加した） １．０μＭの第二のオリゴヌクレオチドプライマー（配
列番号６に記載した配列の５’末端１番目から１８番目
までのオリゴヌクレオチド） ０．１６μＭの切断用オリゴヌクレオチドプローブ（配
列番号１１、標的ＲＮＡを第一のプライマーが結合し得
る位置で切断するためのオリゴヌクレオチド、３'末端
はアミノ化してある） ２５．０ｎＭのインターカレーター性蛍光色素（図２）
で標識された検出用オリゴヌクレオチドプローブ（ＭＲ
ＳＡ−ＹＯ）、そのオリゴヌクレオチド配列は配列番号
１２であり、３'末端はグリコール酸で修飾してある） ３９Ｕ リボヌクレエース インヒビター（宝酒造
（株）製） １５．０％ ＤＭＳＯ 容量調製用蒸留水 （３）上記の反応液を、４１℃で４分間保温後、以下の
組成で、かつ、予め４１℃で２分間保温した酵素液４．
２μｌを添加した。
応系の最終濃度） ６０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液 （ｐH８．６） １３．０ｍＭ 塩化マグネシウム ９０．０ｍＭ 塩化カリウム １．０ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ 各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ ２．２５ｍＭ ＧＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ １．０μＭの第一のオリゴヌクレオチドプライマー（配
列番号８として記載した配列の５’末端４番目から２８
番目までのオリゴヌクレオチド。ただし、５’末端には
配列番号１３のＴ７ポリメレースのプロモータ配列を付
加した） １．０μＭの第二のオリゴヌクレオチドプライマー（配
列番号６に記載した配列の５’末端１番目から１８番目
までのオリゴヌクレオチド） ０．１６μＭの切断用オリゴヌクレオチドプローブ（配
列番号１１、標的ＲＮＡを第一のプライマーが結合し得
る位置で切断するためのオリゴヌクレオチド、３'末端
はアミノ化してある） ２５．０ｎＭのインターカレーター性蛍光色素（図２）
で標識された検出用オリゴヌクレオチドプローブ（ＭＲ
ＳＡ−ＹＯ）、そのオリゴヌクレオチド配列は配列番号
１２であり、３'末端はグリコール酸で修飾してある） ３９Ｕ リボヌクレエース インヒビター（宝酒造
（株）製） １５．０％ ＤＭＳＯ 容量調製用蒸留水 （３）上記の反応液を、４１℃で４分間保温後、以下の
組成で、かつ、予め４１℃で２分間保温した酵素液４．
２μｌを添加した。
【００３８】酵素液の組成（反応時の再終濃度） １．７％ ソルビトール ８ユニット ＡＭＶ逆転写酵素 （宝酒造（株）製） １４２ユニット Ｔ７ ＲＮＡポリメレース （ＧＩＢ
ＣＯ社製） ３μｇ 牛血清アルブミン 容量調製用蒸留水 （４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機
能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃保温して、励起波
長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液の蛍光
強度を経時的に測定した。酵素添加時の時刻を０分とし
て、サンプルの蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バ
ックグランドの蛍光強度値）の経時変化を図４に示し
た。ＲＮＡサンプル濃度は１０コピー／３０μｌから１
０4コピー／３０μｌである。
ＣＯ社製） ３μｇ 牛血清アルブミン 容量調製用蒸留水 （４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機
能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃保温して、励起波
長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液の蛍光
強度を経時的に測定した。酵素添加時の時刻を０分とし
て、サンプルの蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バ
ックグランドの蛍光強度値）の経時変化を図４に示し
た。ＲＮＡサンプル濃度は１０コピー／３０μｌから１
０4コピー／３０μｌである。
【００３９】図４より、標的ＲＮＡの初期濃度に依存し
た蛍光プロファイルが得られ、未知試料中に存在するｍ
ｅｃＡ遺伝子に由来するＲＮＡ量を推測することが可能
であることが示唆された。
た蛍光プロファイルが得られ、未知試料中に存在するｍ
ｅｃＡ遺伝子に由来するＲＮＡ量を推測することが可能
であることが示唆された。
【００４０】
【発明の効果】以上の説明のように、本発明によれば、
試料中のＲＮＡが分子内構造を形成し、プライマーやプ
ローブの結合を阻害しかねない、比較的低温かつ一定温
度（３５〜５０℃、好ましくは４１℃）条件下でも、Ｐ
ＢＰ―２’をコードするｍｅｃＡ遺伝子に由来するＲＮ
Ａに特異的に結合し、標的ＲＮＡを迅速に増幅し、かつ
検出等するためのオリゴヌクレオチドプライマー、オリ
ゴヌクレオチドプローブの組み合わせとして有用であ
る。
試料中のＲＮＡが分子内構造を形成し、プライマーやプ
ローブの結合を阻害しかねない、比較的低温かつ一定温
度（３５〜５０℃、好ましくは４１℃）条件下でも、Ｐ
ＢＰ―２’をコードするｍｅｃＡ遺伝子に由来するＲＮ
Ａに特異的に結合し、標的ＲＮＡを迅速に増幅し、かつ
検出等するためのオリゴヌクレオチドプライマー、オリ
ゴヌクレオチドプローブの組み合わせとして有用であ
る。
【００４１】上記以外にも、本願発明のオリゴヌクレオ
チドの組み合わせは、ｍｅｃＡ−ＲＮＡに限らず、ＲＮ
Ａを逆転写して得られるｃＤＮＡを検出するためには、
上記したオリゴヌクレオチドと相補的配列も有用であ
る。
チドの組み合わせは、ｍｅｃＡ−ＲＮＡに限らず、ＲＮ
Ａを逆転写して得られるｃＤＮＡを検出するためには、
上記したオリゴヌクレオチドと相補的配列も有用であ
る。
【００４２】本願発明の組み合わせにおけるオリゴヌク
レオチドの塩基長は、具体的に記載した長さに限られ
ず、これら配列中の少なくとも連続した１０塩基以上か
らなるオリゴヌクレオチドを含む。これは、比較的低温
（好ましくは４１℃）条件下で、プライマーまたはプロ
ーブの標的核酸への特異性を確保するためには１０ｍｅ
ｒ程度の塩基配列があれば十分であることから、明らか
である。
レオチドの塩基長は、具体的に記載した長さに限られ
ず、これら配列中の少なくとも連続した１０塩基以上か
らなるオリゴヌクレオチドを含む。これは、比較的低温
（好ましくは４１℃）条件下で、プライマーまたはプロ
ーブの標的核酸への特異性を確保するためには１０ｍｅ
ｒ程度の塩基配列があれば十分であることから、明らか
である。
【００４３】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TOSOH Corporation <120>メシチリン耐性黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子の検出法 <130> PA211-0199 <160> 13 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー <400> 1 aaattgggta caagatgata ccttcgtt 28 <210> 2 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>プライマー <400> 2 gaaggtgtgc ttac 14 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>プライマー <400> 3 ttttcttttt ctctattaat g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>プライマー <400> 4 gttagttgaa tatctttgcc 20 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>プライマー <400> 5 aaagaaaaaa gatggcaaag atattcaa 28 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー <400> 6 ttctttttta tcttcggtta 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー <400> 7 tcattgctgt taatattttt 20 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー <400> 8 caactaacta ttgatgctaa agttcaaa 28 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プローブ <400> 9 cccaattttg atccatttgt tgttgatata gtcttcaga 39 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プローブ <400>10 ttttcttttt ctctattaat gtatgtgcga ttgtattgc 39 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プローブ <400> 11 gttagttgaa tatctttgcc atcttttttc tttttctct 39 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー <400> 12 tgtttgaggg tggatagcag 20 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> T7 phage <220> <221> promoter <223>Ｔ７ポリメレースのプロモータ配列 <400> 13 aattctaata cgactcacta tagggaga 28
【図１】図１は、実施例１において、ＲＮＡ増幅反応を
様々なプライマーの組み合わせにより行った結果であ
る。図中、Ｐは初期ＲＮＡ量１０5コピー／３０μｌを
ＲＮＡ試料として用いた場合であり、ＮはＲＮＡ試料の
代わりに希釈液のみを用いた場合である。また、レーン
Ｍは分子量マーカーであり、１から１５は実施例１で示
したプライマー・プローブの組み合わせ番号である。
様々なプライマーの組み合わせにより行った結果であ
る。図中、Ｐは初期ＲＮＡ量１０5コピー／３０μｌを
ＲＮＡ試料として用いた場合であり、ＮはＲＮＡ試料の
代わりに希釈液のみを用いた場合である。また、レーン
Ｍは分子量マーカーであり、１から１５は実施例１で示
したプライマー・プローブの組み合わせ番号である。
【図２】図２は、実施例２で用いたインターカレーター
性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドのインター
カレータ性蛍光色素の化学構造である。Ｂ1〜Ｂ3は核酸
塩基を示す。
性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドのインター
カレータ性蛍光色素の化学構造である。Ｂ1〜Ｂ3は核酸
塩基を示す。
【図３】図３は、実施例２において、反応時間と蛍光増
加率の時間を示したものである。１および２は実施例２
で示したプライマー・プローブの組み合わせ番号であ
る。図中、Ｐは組み合わせ１では初期ＲＮＡ量１０6コ
ピー／３０μｌをＲＮＡ試料として用いた場合であり、
組み合わせ２では初期ＲＮＡ量１０4コピー／３０μｌ
をＲＮＡ試料として用いた場合である。ＮはＲＮＡ試料
の代わりに希釈液のみを用いた場合である。
加率の時間を示したものである。１および２は実施例２
で示したプライマー・プローブの組み合わせ番号であ
る。図中、Ｐは組み合わせ１では初期ＲＮＡ量１０6コ
ピー／３０μｌをＲＮＡ試料として用いた場合であり、
組み合わせ２では初期ＲＮＡ量１０4コピー／３０μｌ
をＲＮＡ試料として用いた場合である。ＮはＲＮＡ試料
の代わりに希釈液のみを用いた場合である。
【図４】図４は、実施例３で行った初期ＲＮＡ量１０4
コピー／３０μｌから１０コピー／３０μｌにおいて、
反応時間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光増加率の
グラフである。ＮｅｇａはＲＮＡ試料の代わりに希釈液
のみを用いた。
コピー／３０μｌから１０コピー／３０μｌにおいて、
反応時間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光増加率の
グラフである。ＮｅｇａはＲＮＡ試料の代わりに希釈液
のみを用いた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA28 AA35 CB21 DA12 DA13 DA14 DA77 FB01 FB02 FB07 FB12 GC15 4B024 AA13 CA01 CA09 CA11 HA14 4B063 QA01 QA07 QA18 QA19 QQ06 QQ52 QR07 QR08 QR32 QR35 QR39 QR42 QR56 QS24 QS34 QX02
Claims (4)
- 【請求項１】試料中に存在するメシチリン耐性黄色ブド
ウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ
Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ、以下
ＭＲＳＡ）の遺伝子要素であるｍｅｃＡ遺伝子に由来す
るＲＮＡの特定配列を鋳型として、該特定配列に相同的
な配列を有する第一のプライマーおよび該特定配列に相
補的な配列を有する第二のプライマー（ここで第一また
は第二のプライマーのいずれか一方のプライマーは、
５’側にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を付加
した配列を有する）を用い、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメ
レースによりｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ−Ｄ
ＮＡ２本鎖を形成し、リボヌクレエースＨによりＲＮＡ
−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成
し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポ
リメレースにより前記ＲＮＡ配列または前記ＲＮＡ配列
に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモータ
ー配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖
ＤＮＡがＲＮＡポリメレース存在下でＲＮＡ転写産物を
生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性
ＤＮＡポリメレースによる１本鎖ＤＮＡ生成の鋳型とな
るようなＲＮＡ増幅工程を利用した検出法において、第
一のプライマーとして配列番号１のオリゴヌクレオチ
ド、第二のプライマーとして配列番号２から４のいずれ
かのオリゴヌクレオチドを用いるか、第一のプライマー
として配列番号５のオリゴヌクレオチド、第二のプライ
マーとして配列番号６または７のオリゴヌクレオチドを
用いるか、または第一のプライマーとして配列番号８の
オリゴヌクレオチド、第二のプライマーとして配列番号
６または７のオリゴヌクレオチドを用いることを特徴と
する、検出法。 - 【請求項２】前記第一のプライマーが配列番号１、５ま
たは８の配列のうち少なくとも連続した１０塩基以上か
らなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請
求項１の検出法。 - 【請求項３】前記第二のプライマーが配列番号２、３、
４、６または７の配列のうち少なくとも連続した１０塩
基以上からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴と
する、請求項１の検出法。 - 【請求項４】請求項第１項に記載されたＲＮＡ増幅工程
を、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴ
ヌクレオチドプローブ存在下で実施することからなり、
ここで該プローブの配列がＲＮＡ転写産物の少なくとも
一部と相補的であり、該プローブがＲＮＡ転写産物と相
補結合によって、複合体を形成していない場合と比較し
て蛍光特性が変化するものである、反応液の蛍光強度を
測定することからなるメシチリン耐性黄色ブドウ球菌の
検出方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000179394A JP2001353000A (ja) | 2000-06-09 | 2000-06-09 | メシチリン耐性黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子の検出法 |
| DE60133321T DE60133321T2 (de) | 2000-05-29 | 2001-05-29 | Methoden zur Detektion des mecA Gens beim methicillin-resistenten Staphylococcus Aureus |
| US09/865,579 US7297517B2 (en) | 2000-05-29 | 2001-05-29 | Oligonucleotides and method for detection of meca gene of methicillin-resistant Staphylococcus aureus |
| EP01112100A EP1160333A3 (en) | 2000-05-29 | 2001-05-29 | Oligonucleotides and method for detection of mecA gene of methicillin-resistant staphylococcus aureus |
| EP04026759A EP1512756B1 (en) | 2000-05-29 | 2001-05-29 | Methods for detection mecA gene of methicillin-resistant Staphylococcus Aureus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000179394A JP2001353000A (ja) | 2000-06-09 | 2000-06-09 | メシチリン耐性黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子の検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001353000A true JP2001353000A (ja) | 2001-12-25 |
Family
ID=18680675
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000179394A Pending JP2001353000A (ja) | 2000-05-29 | 2000-06-09 | メシチリン耐性黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子の検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001353000A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019074091A1 (ja) * | 2017-10-12 | 2019-04-18 | 三井化学株式会社 | ｍｅｃＡ遺伝子増幅用プライマーペア、ｍｅｃＡ遺伝子検出キット及びｍｅｃＡ遺伝子検出方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0723800A (ja) * | 1993-07-08 | 1995-01-27 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | 核酸の検出方法 |
| JPH10504973A (ja) * | 1994-09-12 | 1998-05-19 | ベルジユロン，ミシエル・ジエ | 微生物検査室における日常的診断用の臨床検体からの通常の細菌病原体および抗生物質耐性遺伝子を迅速に検出および同定するための特異的および普遍的プローブおよび増幅プライマー |
| JP2002509436A (ja) * | 1997-07-03 | 2002-03-26 | アイディー バイオメディカル コーポレイション | メチシリン耐性ブドウ球菌を迅速に検出するための方法 |
-
2000
- 2000-06-09 JP JP2000179394A patent/JP2001353000A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0723800A (ja) * | 1993-07-08 | 1995-01-27 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | 核酸の検出方法 |
| JPH10504973A (ja) * | 1994-09-12 | 1998-05-19 | ベルジユロン，ミシエル・ジエ | 微生物検査室における日常的診断用の臨床検体からの通常の細菌病原体および抗生物質耐性遺伝子を迅速に検出および同定するための特異的および普遍的プローブおよび増幅プライマー |
| JP2002509436A (ja) * | 1997-07-03 | 2002-03-26 | アイディー バイオメディカル コーポレイション | メチシリン耐性ブドウ球菌を迅速に検出するための方法 |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019074091A1 (ja) * | 2017-10-12 | 2019-04-18 | 三井化学株式会社 | ｍｅｃＡ遺伝子増幅用プライマーペア、ｍｅｃＡ遺伝子検出キット及びｍｅｃＡ遺伝子検出方法 |
| JPWO2019074091A1 (ja) * | 2017-10-12 | 2020-04-16 | 三井化学株式会社 | ｍｅｃＡ遺伝子増幅用プライマーペア、ｍｅｃＡ遺伝子検出キット及びｍｅｃＡ遺伝子検出方法 |
| KR20210134421A (ko) * | 2017-10-12 | 2021-11-09 | 미쓰이 가가쿠 가부시키가이샤 | mecA 유전자 증폭용 프라이머 페어, mecA 유전자 검출 키트 및 mecA 유전자 검출 방법 |
| JP2022025117A (ja) * | 2017-10-12 | 2022-02-09 | 三井化学株式会社 | ｍｅｃＡ遺伝子増幅用プライマーペア、ｍｅｃＡ遺伝子検出キット及びｍｅｃＡ遺伝子検出方法 |
| AU2018350052B2 (en) * | 2017-10-12 | 2022-06-02 | Mitsui Chemicals, Inc. | Meca gene amplification primer pair, meca gene detection kit and meca gene detection method |
| JP7199367B2 (ja) | 2017-10-12 | 2023-01-05 | 三井化学株式会社 | ｍｅｃＡ遺伝子増幅用プライマーペア、ｍｅｃＡ遺伝子検出キット及びｍｅｃＡ遺伝子検出方法 |
| KR20230128154A (ko) * | 2017-10-12 | 2023-09-01 | 미쓰이 가가쿠 가부시키가이샤 | mecA 유전자 증폭용 프라이머 페어, mecA 유전자 검출 키트 및 mecA 유전자 검출 방법 |
| KR102593021B1 (ko) * | 2017-10-12 | 2023-10-31 | 미쓰이 가가쿠 가부시키가이샤 | mecA 유전자 증폭용 프라이머 페어, mecA 유전자 검출 키트 및 mecA 유전자 검출 방법 |
| KR102757284B1 (ko) * | 2017-10-12 | 2025-01-21 | 미쓰이 가가쿠 가부시키가이샤 | mecA 유전자 증폭용 프라이머 페어, mecA 유전자 검출 키트 및 mecA 유전자 검출 방법 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2020294316B2 (en) | Nucleic acid probe with single fluorophore label bound to internal cytosine for use in loop mediated isothermal amplification | |
| JPH02503054A (ja) | 核酸配列の増幅および検出 | |
| JP6126381B2 (ja) | 標的核酸の検出方法及びキット | |
| EP1512756B1 (en) | Methods for detection mecA gene of methicillin-resistant Staphylococcus Aureus | |
| US6562955B2 (en) | Oligonucleotides for detection of Vibrio parahaemolyticus and detection method for Vibrio parahaemolyticus using the same oligonucleotides | |
| EP2202305A1 (en) | Primer for amplification of rrna of bacterium belonging to the genus legionella, detection method, and detection kit | |
| US7495094B2 (en) | Detection reagent for thermostable direct hemolysin-related hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus | |
| KR100984264B1 (ko) | 결핵균 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 및 방법 | |
| JPH08297A (ja) | バクテリアを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ | |
| JP2001353000A (ja) | メシチリン耐性黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子の検出法 | |
| US20030113736A1 (en) | Oligonucleotide for detecting Salmonella and method of detecting Salmonella | |
| US20020031760A1 (en) | Oligonucleotides and method for detection of small round structured virus (SRSV) RNA | |
| US6756198B2 (en) | Oligonucleotide for highly sensitive detection of hepatitis C virus and method for detection thereof | |
| JP7472476B2 (ja) | プライマー及び百日咳菌 ｒＲＮＡの検出方法 | |
| US20050112629A1 (en) | Detection reagent for thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus | |
| JP2001340087A (ja) | 腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒類似溶血毒遺伝子の検出法 | |
| JP2001340086A (ja) | 腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒遺伝子の検出法 | |
| JP2003289869A (ja) | 非定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法 | |
| JP2001340088A (ja) | 腸炎ビブリオ菌の毒素遺伝子の検出法 | |
| JP2003033182A (ja) | 結核菌検出のためのオリゴヌクレオチド | |
| JP2001333783A (ja) | メシチリン耐性黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチド | |
| JP2002281972A (ja) | サルモネラ検出のためのオリゴヌクレオチド及び検出法 | |
| JP2006075046A (ja) | 改良された核酸増幅方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070522 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100316 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100517 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100706 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20101109 |