JP2001178498A - １６ＳｒＲＮＡ遺伝子による放線菌の同定・検出及びモニタリング方法 - Google Patents
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子による放線菌の同定・検出及びモニタリング方法Info
- Publication number
- JP2001178498A JP2001178498A JP37125799A JP37125799A JP2001178498A JP 2001178498 A JP2001178498 A JP 2001178498A JP 37125799 A JP37125799 A JP 37125799A JP 37125799 A JP37125799 A JP 37125799A JP 2001178498 A JP2001178498 A JP 2001178498A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- actinomycetes
- base sequence
- seq
- sequence represented
- detected
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 16SｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列におい
て、検出しようとする放線菌に属する微生物間で特異的
に保存性を有する領域の塩基配列又はそれに相補的な塩
基配列を用いる放線菌の検出方法を提供する。 【効果】 本発明の菌の検出方法により、放線菌を簡便
かつ迅速に検出することができる。また、本発明の菌の
同定方法により従来の生化学的検査を用いることなく、
目的とする放線菌を簡便、迅速かつ精度よく同定するこ
とができる。
て、検出しようとする放線菌に属する微生物間で特異的
に保存性を有する領域の塩基配列又はそれに相補的な塩
基配列を用いる放線菌の検出方法を提供する。 【効果】 本発明の菌の検出方法により、放線菌を簡便
かつ迅速に検出することができる。また、本発明の菌の
同定方法により従来の生化学的検査を用いることなく、
目的とする放線菌を簡便、迅速かつ精度よく同定するこ
とができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物を検出又は
同定する方法に関し、より詳細には、放線菌（Actinomy
cetes）に属する微生物を遺伝子レベルで特異的に検出
する方法、さらには検出された該微生物を同定する方法
に関する。
同定する方法に関し、より詳細には、放線菌（Actinomy
cetes）に属する微生物を遺伝子レベルで特異的に検出
する方法、さらには検出された該微生物を同定する方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】放線菌は、医学分野、環境浄化、食品、
化学、農業等の各種産業分野、水処理等の環境保全にお
いて重要な役割を担う微生物群である。医学分野におい
ては、放線菌の産生物質である抗生物質、ビタミンＢ1
2、ペプチド等が拮抗薬として利用されており、また、
産生酵素であるコレステロールオキシダーゼが血清コレ
ステロール測定キットに利用されている。
化学、農業等の各種産業分野、水処理等の環境保全にお
いて重要な役割を担う微生物群である。医学分野におい
ては、放線菌の産生物質である抗生物質、ビタミンＢ1
2、ペプチド等が拮抗薬として利用されており、また、
産生酵素であるコレステロールオキシダーゼが血清コレ
ステロール測定キットに利用されている。
【０００３】環境浄化産業においては、放線菌の産生す
る色素であるアリザリンによるウランの吸着、カドミウ
ム等の重金属の除去回収などに利用されている。また、
放線菌は石油、ダイオキシン等の環境汚染物質の分解を
行うことが知られているため、その環境浄化への利用が
期待されている。
る色素であるアリザリンによるウランの吸着、カドミウ
ム等の重金属の除去回収などに利用されている。また、
放線菌は石油、ダイオキシン等の環境汚染物質の分解を
行うことが知られているため、その環境浄化への利用が
期待されている。
【０００４】食品産業においては、上記コレステロール
オキシダーゼによる発酵食品のコレステロール制御、同
じく放線菌の産生するβ−ガラクトシダーゼによる加水
分解やガラクトシル基転移反応等が利用されている。ま
た、放線菌の産生する溶菌酵素の食品保存剤としての利
用が期待されている。化学産業では、化粧品分野におい
て、放線菌の産生するヒアルロン酸が保湿剤として利用
されている。
オキシダーゼによる発酵食品のコレステロール制御、同
じく放線菌の産生するβ−ガラクトシダーゼによる加水
分解やガラクトシル基転移反応等が利用されている。ま
た、放線菌の産生する溶菌酵素の食品保存剤としての利
用が期待されている。化学産業では、化粧品分野におい
て、放線菌の産生するヒアルロン酸が保湿剤として利用
されている。
【０００５】農業分野においては、肥料作製の短期化と
脱臭効果をねらった、豚糞等の家畜排泄物への放線菌の
接種が行われている。また、放線菌は抗生物質や拮抗物
質を産生するため、家畜飼料添加物及び土壌改良剤とし
て利用されている。最近では、放線菌の遺伝子を植物に
組み込んだ遺伝子組換え植物として、病害虫耐性植物や
除草剤耐性植物の開発が進められている。
脱臭効果をねらった、豚糞等の家畜排泄物への放線菌の
接種が行われている。また、放線菌は抗生物質や拮抗物
質を産生するため、家畜飼料添加物及び土壌改良剤とし
て利用されている。最近では、放線菌の遺伝子を植物に
組み込んだ遺伝子組換え植物として、病害虫耐性植物や
除草剤耐性植物の開発が進められている。
【０００６】一方、水処理の分野においては、汚泥中に
発生するスカム（scum）やカビ臭が問題となっている
が、これらはいずれも放線菌の活動に起因することが知
られている。従って、上記の各分野においては、放線菌
の活動状況を把握するための方法、特に、放線菌を特異
的に検出／同定する方法、放線菌の菌数変化を特異的に
モニタリングする方法等の必要性は大きい。
発生するスカム（scum）やカビ臭が問題となっている
が、これらはいずれも放線菌の活動に起因することが知
られている。従って、上記の各分野においては、放線菌
の活動状況を把握するための方法、特に、放線菌を特異
的に検出／同定する方法、放線菌の菌数変化を特異的に
モニタリングする方法等の必要性は大きい。
【０００７】従来の放線菌の検出、同定、菌数変化のモ
ニタリング、および単離方法としては、培地を使用した
培養法が中心であり、これにより同時に検出できる放線
菌の種類は培養条件により制限されていた。
ニタリング、および単離方法としては、培地を使用した
培養法が中心であり、これにより同時に検出できる放線
菌の種類は培養条件により制限されていた。
【０００８】上記のような制限のない方法として、16S
ｒＲＮＡ遺伝子の一部の領域を増幅するＰＣＲにより放
線菌を検出する方法が報告されている。しかし、このＰ
ＣＲでは放線菌以外の菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子を増幅す
る可能性が挙げられており、放線菌の特異的な検出とい
う点では信頼性が低い。
ｒＲＮＡ遺伝子の一部の領域を増幅するＰＣＲにより放
線菌を検出する方法が報告されている。しかし、このＰ
ＣＲでは放線菌以外の菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子を増幅す
る可能性が挙げられており、放線菌の特異的な検出とい
う点では信頼性が低い。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、16S
ｒＲＮＡ遺伝子の特定の領域を用いて、検出しようとす
る放線菌を特異的に検出又は同定し、さらにはその菌数
変化をモニタリングする方法を提供することにある。
ｒＲＮＡ遺伝子の特定の領域を用いて、検出しようとす
る放線菌を特異的に検出又は同定し、さらにはその菌数
変化をモニタリングする方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意検討を行った結果、16S ｒＲＮ
Ａ遺伝子の塩基配列において、検出しようとする放線菌
に特異的に保存されている領域、すなわち、検出しよう
とする放線菌の間では保存されているが、他の微生物の
ものとは配列が異なる領域を特定し、この領域の塩基配
列又はそれに相補的な塩基配列を用いることにより、検
出しようとする放線菌を特異的に検出できることを見出
し、本発明を完成させるに至った。
題を解決するために鋭意検討を行った結果、16S ｒＲＮ
Ａ遺伝子の塩基配列において、検出しようとする放線菌
に特異的に保存されている領域、すなわち、検出しよう
とする放線菌の間では保存されているが、他の微生物の
ものとは配列が異なる領域を特定し、この領域の塩基配
列又はそれに相補的な塩基配列を用いることにより、検
出しようとする放線菌を特異的に検出できることを見出
し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】すなわち、本発明は、16SｒＲＮＡ遺伝子
の塩基配列において、検出しようとする放線菌に属する
微生物間で特異的に保存性を有する領域の塩基配列又は
それに相補的な塩基配列を用いる放線菌の検出方法を提
供する。前記検出方法では、検出しようとする放線菌に
属する微生物間で特異的に保存性を有する前記領域が２
つあり、この２つの領域の塩基配列の一方が配列番号１
で表わされる塩基配列であり、他方が配列番号３で表わ
される塩基配列であることが好ましい。さらに、前記検
出方法は、被検物から得られる核酸試料を鋳型とし、配
列番号１で表わされる塩基配列を含むプライマー及び配
列番号２で表わされる塩基配列を含むプライマーを用い
てポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を含むことが好まし
い。
の塩基配列において、検出しようとする放線菌に属する
微生物間で特異的に保存性を有する領域の塩基配列又は
それに相補的な塩基配列を用いる放線菌の検出方法を提
供する。前記検出方法では、検出しようとする放線菌に
属する微生物間で特異的に保存性を有する前記領域が２
つあり、この２つの領域の塩基配列の一方が配列番号１
で表わされる塩基配列であり、他方が配列番号３で表わ
される塩基配列であることが好ましい。さらに、前記検
出方法は、被検物から得られる核酸試料を鋳型とし、配
列番号１で表わされる塩基配列を含むプライマー及び配
列番号２で表わされる塩基配列を含むプライマーを用い
てポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を含むことが好まし
い。
【００１２】さらに、本発明は、16SｒＲＮＡ遺伝子の
塩基配列において、モニタリングしようとする放線菌に
属する微生物間で特異的に保存性を有する領域の塩基配
列又はそれに相補的な塩基配列を用いることを特徴とす
る、被検物中に存在する放線菌の菌数変化をモニタリン
グする方法を提供する。前記方法では、モニタリングし
ようとする放線菌に属する微生物間で特異的に保存性を
有する前記領域が２つあり、この２つの領域の塩基配列
の一方が配列番号１で表わされる塩基配列であり、他方
が配列番号３で表わされる塩基配列であることが好まし
い。さらに、前記方法は、被検物から得られる核酸試料
を鋳型とし、配列番号１で表わされる塩基配列を含むプ
ライマー及び配列番号２で表わされる塩基配列を含むプ
ライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を含
むことが好ましい。
塩基配列において、モニタリングしようとする放線菌に
属する微生物間で特異的に保存性を有する領域の塩基配
列又はそれに相補的な塩基配列を用いることを特徴とす
る、被検物中に存在する放線菌の菌数変化をモニタリン
グする方法を提供する。前記方法では、モニタリングし
ようとする放線菌に属する微生物間で特異的に保存性を
有する前記領域が２つあり、この２つの領域の塩基配列
の一方が配列番号１で表わされる塩基配列であり、他方
が配列番号３で表わされる塩基配列であることが好まし
い。さらに、前記方法は、被検物から得られる核酸試料
を鋳型とし、配列番号１で表わされる塩基配列を含むプ
ライマー及び配列番号２で表わされる塩基配列を含むプ
ライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を含
むことが好ましい。
【００１３】さらに、本発明は、16SｒＲＮＡ遺伝子の
塩基配列において、検出しようとする放線菌に属する微
生物間で特異的に保存性を有する２つの領域の塩基配列
又はそれに相補的な塩基配列を用いて放線菌を検出した
後に、該２つの領域に挟まれた該16SｒＲＮＡ遺伝子上
の領域の塩基配列を用いて、検出された放線菌を同定す
る方法を提供する。前記方法では、検出しようとする放
線菌に属する微生物間で特異的に保存性を有する２つの
前記領域の塩基配列の一方が配列番号１で表わされる塩
基配列であり、他方が配列番号３で表わされる塩基配列
であることが好ましい。さらに、前記方法は、被検物か
ら得られる核酸試料を鋳型とし、配列番号１で表わされ
る塩基配列を含むプライマー及び配列番号２で表わされ
る塩基配列を含むプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖
反応を行う工程を含むことが好ましい。上記被検物とし
ては、例えば、浄化処理後の汚染土壌、コンポスト又は
植栽用土壌が挙げられる。
塩基配列において、検出しようとする放線菌に属する微
生物間で特異的に保存性を有する２つの領域の塩基配列
又はそれに相補的な塩基配列を用いて放線菌を検出した
後に、該２つの領域に挟まれた該16SｒＲＮＡ遺伝子上
の領域の塩基配列を用いて、検出された放線菌を同定す
る方法を提供する。前記方法では、検出しようとする放
線菌に属する微生物間で特異的に保存性を有する２つの
前記領域の塩基配列の一方が配列番号１で表わされる塩
基配列であり、他方が配列番号３で表わされる塩基配列
であることが好ましい。さらに、前記方法は、被検物か
ら得られる核酸試料を鋳型とし、配列番号１で表わされ
る塩基配列を含むプライマー及び配列番号２で表わされ
る塩基配列を含むプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖
反応を行う工程を含むことが好ましい。上記被検物とし
ては、例えば、浄化処理後の汚染土壌、コンポスト又は
植栽用土壌が挙げられる。
【００１４】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、種々の微生物の中から放線菌だけを特異的に
検出する方法であり、これは、16SｒＲＮＡ遺伝子の塩
基配列において、検出しようとする放線菌に属する微生
物間で特異的に保存性を有する領域（以下「特異的保存
領域」という。）の塩基配列又はそれに相補的な塩基配
列を用いることにより可能となる。さらに、このような
方法による検出を経時的に行うことにより、放線菌の菌
数変化をモニタリングすることができる。
本発明は、種々の微生物の中から放線菌だけを特異的に
検出する方法であり、これは、16SｒＲＮＡ遺伝子の塩
基配列において、検出しようとする放線菌に属する微生
物間で特異的に保存性を有する領域（以下「特異的保存
領域」という。）の塩基配列又はそれに相補的な塩基配
列を用いることにより可能となる。さらに、このような
方法による検出を経時的に行うことにより、放線菌の菌
数変化をモニタリングすることができる。
【００１５】上記のような特異的保存領域は、検出しよ
うとする放線菌およびその他の微生物の16SｒＲＮＡ遺
伝子として知られている複数の公知の塩基配列を比較す
ることにより特定することができる。より詳細には、こ
れらの塩基配列を比較して、検出しようとする放線菌由
来のものの間でのみ保存性が高く、その他の微生物由来
のものとは保存性が低い領域を、特異的保存領域として
特定することができる。このような特異的保存領域の塩
基数は特に制限されないが、好ましくは１０塩基以上、
より好ましくは１５塩基以上、最も好ましくは１７塩基
以上である。
うとする放線菌およびその他の微生物の16SｒＲＮＡ遺
伝子として知られている複数の公知の塩基配列を比較す
ることにより特定することができる。より詳細には、こ
れらの塩基配列を比較して、検出しようとする放線菌由
来のものの間でのみ保存性が高く、その他の微生物由来
のものとは保存性が低い領域を、特異的保存領域として
特定することができる。このような特異的保存領域の塩
基数は特に制限されないが、好ましくは１０塩基以上、
より好ましくは１５塩基以上、最も好ましくは１７塩基
以上である。
【００１６】上記の特異的保存領域の特定のための配列
比較に用いる公知の塩基配列としては、微生物の16Sｒ
ＲＮＡ遺伝子として知られているものであればいずれの
ものを用いてもよく、このような塩基配列はGenBank等
のＤＮＡデータベースを用いて検索し、入手することが
できる。ＤＮＡデータベースから入手できる16SｒＲＮ
Ａ遺伝子の塩基配列としては、例えば、下記の表１に示
されるものが挙げられる。
比較に用いる公知の塩基配列としては、微生物の16Sｒ
ＲＮＡ遺伝子として知られているものであればいずれの
ものを用いてもよく、このような塩基配列はGenBank等
のＤＮＡデータベースを用いて検索し、入手することが
できる。ＤＮＡデータベースから入手できる16SｒＲＮ
Ａ遺伝子の塩基配列としては、例えば、下記の表１に示
されるものが挙げられる。
【００１７】
【表１】
【００１８】表１において、３番目以下に示されるもの
が、放線菌に属する微生物である。さらに、表１に示さ
れる塩基配列の比較を図１〜２６に示す。例えば、これ
らの比較図に基づき、検出しようとする放線菌の間で保
存性が高く、かつ、大腸菌（E. coli）及びバチルスsp.
（Bacillus sp.）の塩基配列との間で保存性の低い領域
を、特異的保存領域として特定することができる。表１
に示される放線菌のうち、サーモアクチノミセス・ジコ
トミカス（Thermoactinomyces dichotomicus）以外の全
てを検出の対象とする場合には、特異的保存領域とし
て、例えば、図１における第２７７〜２９３塩基（配列
番号１）の領域、第１２２５〜１２４１塩基（配列番号
３）の領域等を特定することができる。
が、放線菌に属する微生物である。さらに、表１に示さ
れる塩基配列の比較を図１〜２６に示す。例えば、これ
らの比較図に基づき、検出しようとする放線菌の間で保
存性が高く、かつ、大腸菌（E. coli）及びバチルスsp.
（Bacillus sp.）の塩基配列との間で保存性の低い領域
を、特異的保存領域として特定することができる。表１
に示される放線菌のうち、サーモアクチノミセス・ジコ
トミカス（Thermoactinomyces dichotomicus）以外の全
てを検出の対象とする場合には、特異的保存領域とし
て、例えば、図１における第２７７〜２９３塩基（配列
番号１）の領域、第１２２５〜１２４１塩基（配列番号
３）の領域等を特定することができる。
【００１９】本発明の好ましい実施形態では、検出しよ
うとする放線菌に属する微生物間で特異的に保存性を有
する領域を２つ用いる。上記表１に示される放線菌のう
ち、サーモアクチノミセス・ジコトミカス（Thermoacti
nomyces dichotomicus）以外の全てを検出対象とする場
合には、この２つの領域の塩基配列としては、例えば、
配列番号１で表わされる塩基配列及び配列番号３で表わ
される塩基配列が挙げられる。
うとする放線菌に属する微生物間で特異的に保存性を有
する領域を２つ用いる。上記表１に示される放線菌のう
ち、サーモアクチノミセス・ジコトミカス（Thermoacti
nomyces dichotomicus）以外の全てを検出対象とする場
合には、この２つの領域の塩基配列としては、例えば、
配列番号１で表わされる塩基配列及び配列番号３で表わ
される塩基配列が挙げられる。
【００２０】上記のような２つの特異的保存領域を用い
て所定の放線菌の検出を行うためには、好ましくはポリ
メラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction、以下
「ＰＣＲ」という。）を用いる。この場合には、被検物
から得られる核酸試料を鋳型とし、上記の２つの特異的
保存領域に基づいて設計したオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとして用いることができる。
て所定の放線菌の検出を行うためには、好ましくはポリ
メラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction、以下
「ＰＣＲ」という。）を用いる。この場合には、被検物
から得られる核酸試料を鋳型とし、上記の２つの特異的
保存領域に基づいて設計したオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとして用いることができる。
【００２１】鋳型として用いる核酸試料は、ＤＮＡ試料
及びＲＮＡ試料のいずれであってもよいが、好ましくは
ＤＮＡ試料である。このような核酸試料は、被検物から
公知の核酸抽出法によって得ることができる。
及びＲＮＡ試料のいずれであってもよいが、好ましくは
ＤＮＡ試料である。このような核酸試料は、被検物から
公知の核酸抽出法によって得ることができる。
【００２２】２つの特異的保存領域に基づくプライマー
の設計は、両領域のうちの5'末端側のものの塩基配列を
そのままセンスプライマーとし、3'末端側のものの塩基
配列に相補的な配列をアンチセンスプライマーとするこ
とにより行うことができる。設計されるプライマーによ
り増幅される領域の塩基数は特に制限されないが、好ま
しくは３kbp以下、より好ましくは１kbp以下とする。ま
た、プライマーそのものの塩基数もまた特に制限されな
いが、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩
基以上、最も好ましくは１７塩基以上とする。プライマ
ーのＧＣ含量は５０〜６５％とすることが好ましく、Ｔ
ｍ値は、好ましくは５０℃〜６５℃、より好ましくは約
５５℃とする。さらに、２つのプライマーがプライマー
ダイマーを形成しないように、プライマー同士に相補性
がないように設計する必要がある。例えば、特異的保存
領域として上記の配列番号１及び３に示される塩基配列
を用いる場合には、配列番号１で表わされる塩基配列を
含むプライマー及び配列番号２で表わされる塩基配列を
含むプライマーを設計することができる。このようにし
て設計されたプライマーは、オリゴヌクレオチドの合成
法として当技術分野で公知の方法により調製することが
できる。
の設計は、両領域のうちの5'末端側のものの塩基配列を
そのままセンスプライマーとし、3'末端側のものの塩基
配列に相補的な配列をアンチセンスプライマーとするこ
とにより行うことができる。設計されるプライマーによ
り増幅される領域の塩基数は特に制限されないが、好ま
しくは３kbp以下、より好ましくは１kbp以下とする。ま
た、プライマーそのものの塩基数もまた特に制限されな
いが、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩
基以上、最も好ましくは１７塩基以上とする。プライマ
ーのＧＣ含量は５０〜６５％とすることが好ましく、Ｔ
ｍ値は、好ましくは５０℃〜６５℃、より好ましくは約
５５℃とする。さらに、２つのプライマーがプライマー
ダイマーを形成しないように、プライマー同士に相補性
がないように設計する必要がある。例えば、特異的保存
領域として上記の配列番号１及び３に示される塩基配列
を用いる場合には、配列番号１で表わされる塩基配列を
含むプライマー及び配列番号２で表わされる塩基配列を
含むプライマーを設計することができる。このようにし
て設計されたプライマーは、オリゴヌクレオチドの合成
法として当技術分野で公知の方法により調製することが
できる。
【００２３】ＰＣＲに関する他の試薬、温度条件、サイ
クルの回数等は、当業者であれば適切に選択及び設定す
ることができるため、特に制限されない。上記ＰＣＲに
より得られるＰＣＲ産物中に、目的の増幅断片が含まれ
るかどうかは、電気泳動、ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ン等の公知の方法を用いて確認することができる。目的
の増幅断片のサイズは、検出しようとする放線菌の16S
ｒＲＮＡ遺伝子上において両プライマーに挟まれる領域
の塩基数となる。例えば、上記の配列番号１で表わされ
る塩基配列を含むプライマー及び配列番号２で表わされ
る塩基配列を含むプライマーを用いた場合には、目的と
する増幅断片のサイズは約960bpである。
クルの回数等は、当業者であれば適切に選択及び設定す
ることができるため、特に制限されない。上記ＰＣＲに
より得られるＰＣＲ産物中に、目的の増幅断片が含まれ
るかどうかは、電気泳動、ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ン等の公知の方法を用いて確認することができる。目的
の増幅断片のサイズは、検出しようとする放線菌の16S
ｒＲＮＡ遺伝子上において両プライマーに挟まれる領域
の塩基数となる。例えば、上記の配列番号１で表わされ
る塩基配列を含むプライマー及び配列番号２で表わされ
る塩基配列を含むプライマーを用いた場合には、目的と
する増幅断片のサイズは約960bpである。
【００２４】上述のように２つの特異的保存領域を用い
て放線菌の検出を行った場合には、その後、これらの特
異的保存領域に挟まれる領域の塩基配列によって、検出
された放線菌の同定を行うことができる。
て放線菌の検出を行った場合には、その後、これらの特
異的保存領域に挟まれる領域の塩基配列によって、検出
された放線菌の同定を行うことができる。
【００２５】この同定は、放線菌に属する微生物の属、
種及び株の相違による16S ｒＲＮＡ遺伝子配列の相違に
基づいて行われる。従って、上記同定を行う方法として
は、このような配列の相違を知ることができる方法であ
ればいかなる方法であってもよく、例えば、塩基配列決
定法、ＤＮＡハイブリダイゼーション法等が挙げられ
る。放線菌の検出を上述のＰＣＲを用いて行う場合に
は、ＰＣＲ産物から目的の増幅断片を分離した後に、ジ
デオキシ法等の公知の方法によってその塩基配列を決定
し、該塩基配列に基づいて検出された放線菌の同定を行
うことができる。
種及び株の相違による16S ｒＲＮＡ遺伝子配列の相違に
基づいて行われる。従って、上記同定を行う方法として
は、このような配列の相違を知ることができる方法であ
ればいかなる方法であってもよく、例えば、塩基配列決
定法、ＤＮＡハイブリダイゼーション法等が挙げられ
る。放線菌の検出を上述のＰＣＲを用いて行う場合に
は、ＰＣＲ産物から目的の増幅断片を分離した後に、ジ
デオキシ法等の公知の方法によってその塩基配列を決定
し、該塩基配列に基づいて検出された放線菌の同定を行
うことができる。
【００２６】本発明の放線菌の検出方法又は同定方法に
よって検出又は同定が可能な菌は、16S ｒＲＮＡをコー
ドする遺伝子を有する放線菌である。このような放線菌
としては、アクチノプラネスおよび関連放線菌群、多室
型放線菌群、ノカルジア型放線菌群、ストレプトミセス
及び関連放線菌群、マジュロース含有放線菌群、サーモ
モノスポラ及び関連放線菌群、サーモアクチノミセス放
線菌群その他の放線菌群に属するものが挙げられる。
よって検出又は同定が可能な菌は、16S ｒＲＮＡをコー
ドする遺伝子を有する放線菌である。このような放線菌
としては、アクチノプラネスおよび関連放線菌群、多室
型放線菌群、ノカルジア型放線菌群、ストレプトミセス
及び関連放線菌群、マジュロース含有放線菌群、サーモ
モノスポラ及び関連放線菌群、サーモアクチノミセス放
線菌群その他の放線菌群に属するものが挙げられる。
【００２７】アクチノプラネスおよび関連放線菌群に属
する放線菌としては、例えば、ピリメリア・アヌラタ
（Pilimelia anulata）等が挙げられるが、これに限定
されない。多室型放線菌群に属する放線菌としては、例
えば、ジオデルマトフィルス・オブスクルス（Geoderma
tophilus obscurus）、フランキアsp.（Frankia s
p.）、デルマトフィルス・コンゴレンシス（Dermatophi
lus congolensis）等が挙げられるが、これらに限定さ
れない。
する放線菌としては、例えば、ピリメリア・アヌラタ
（Pilimelia anulata）等が挙げられるが、これに限定
されない。多室型放線菌群に属する放線菌としては、例
えば、ジオデルマトフィルス・オブスクルス（Geoderma
tophilus obscurus）、フランキアsp.（Frankia s
p.）、デルマトフィルス・コンゴレンシス（Dermatophi
lus congolensis）等が挙げられるが、これらに限定さ
れない。
【００２８】ノカルジア型放線菌群に属する放線菌とし
ては、例えば、ツカムレラ・インコネンシス（Tsukamur
ella inchonensis）、サッカロポリスポラ・レクチビル
グラ（Saccharopolyspora rectivirgula）、サッカロモ
ノスポラsp.（Saccharomonospora sp.）、ロドコッカス
・ルバー（Rhodococcus ruber）、プロミクロモノスポ
ラ・シトレア（Promicromonospora citrea）、オエルス
コビア・ターバタ（Oerskovia turbata）、ノカルディ
オイデスsp.（Nocardioides sp.）、ノカルディア・レ
ストリカ（Nocardia restrica）、アクチノポリスポラ
・モルチバリス（Actinopolyspora mortivallis）等が
挙げられるが、これらに限定されない。
ては、例えば、ツカムレラ・インコネンシス（Tsukamur
ella inchonensis）、サッカロポリスポラ・レクチビル
グラ（Saccharopolyspora rectivirgula）、サッカロモ
ノスポラsp.（Saccharomonospora sp.）、ロドコッカス
・ルバー（Rhodococcus ruber）、プロミクロモノスポ
ラ・シトレア（Promicromonospora citrea）、オエルス
コビア・ターバタ（Oerskovia turbata）、ノカルディ
オイデスsp.（Nocardioides sp.）、ノカルディア・レ
ストリカ（Nocardia restrica）、アクチノポリスポラ
・モルチバリス（Actinopolyspora mortivallis）等が
挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】ストレプトミセス及び関連放線菌群に属す
る放線菌としては、例えば、ストレプトベルティチリウ
ム・マシュエンセ（Streptoverticillium mashuens
e）、ストレプトミセス・ラベンデュラエ（Streptomyce
s lavendulae）、スポリクシア・ポリモルファ（Sporic
hthya polymorpha）、キネオスポリア・オーランティア
カ（Kineosporia aurantiaca）等が挙げられるが、これ
らに限定されない。
る放線菌としては、例えば、ストレプトベルティチリウ
ム・マシュエンセ（Streptoverticillium mashuens
e）、ストレプトミセス・ラベンデュラエ（Streptomyce
s lavendulae）、スポリクシア・ポリモルファ（Sporic
hthya polymorpha）、キネオスポリア・オーランティア
カ（Kineosporia aurantiaca）等が挙げられるが、これ
らに限定されない。
【００３０】マジュロース含有放線菌群に属する放線菌
としては、例えば、ストレプトスポランギウム・フラギ
ル（Streptosporangium fragile）、サッカロトリクス
・オーストラリエンシス（Saccharothrix australiensi
s）、ミクロテトラスポラ・フスカ（Microtetraspora f
usca）、ミクロビスポラ・アエラタ（Microbisporaaera
ta）、アクチノマデュラ・シトレア（Actinomadura cit
rea）等が挙げられるが、これらに限定されない。
としては、例えば、ストレプトスポランギウム・フラギ
ル（Streptosporangium fragile）、サッカロトリクス
・オーストラリエンシス（Saccharothrix australiensi
s）、ミクロテトラスポラ・フスカ（Microtetraspora f
usca）、ミクロビスポラ・アエラタ（Microbisporaaera
ta）、アクチノマデュラ・シトレア（Actinomadura cit
rea）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】サーモモノスポラ及び関連放線菌群に属す
る放線菌としては、例えば、ノカルディオプシス・アル
ボルビダ（Nocardiopsis alborubida）、アクチノシン
ネマ・ミルム（Actinosynnema mirum）、サーモモノス
ポラ・カーバタ（Thermomonospora curvata）等が挙げ
られるが、これらに限定されない。
る放線菌としては、例えば、ノカルディオプシス・アル
ボルビダ（Nocardiopsis alborubida）、アクチノシン
ネマ・ミルム（Actinosynnema mirum）、サーモモノス
ポラ・カーバタ（Thermomonospora curvata）等が挙げ
られるが、これらに限定されない。
【００３２】サーモアクチノミセス放線菌群に属する放
線菌としては、例えば、サーモアクチノミセス・ジコト
ミカス（Thermoactinomyces dichotomicus）等が挙げら
れるが、これに限定されない。
線菌としては、例えば、サーモアクチノミセス・ジコト
ミカス（Thermoactinomyces dichotomicus）等が挙げら
れるが、これに限定されない。
【００３３】その他の放線菌群に属する放線菌として
は、例えば、アミコラトプシスsp.（Amycolatopsis s
p.）等が挙げられるが、これに限定されない。また、同
時に検出しようとする放線菌は、上記のような放線菌群
の全部又は一部とすることができ、その選択のしかたに
応じて様々な特異的保存領域を特定することができる。
は、例えば、アミコラトプシスsp.（Amycolatopsis s
p.）等が挙げられるが、これに限定されない。また、同
時に検出しようとする放線菌は、上記のような放線菌群
の全部又は一部とすることができ、その選択のしかたに
応じて様々な特異的保存領域を特定することができる。
【００３４】本発明の放線菌の検出方法又は同定方法に
よれば、様々な被検物から放線菌を検出又は同定するこ
とができる。このような被検物としては、放線菌を含む
可能性のあるものであればよく、特に制限されないが、
例えば、浄化処理後の汚染土壌、木材等のコンポスト、
植栽時に使用する土壌等が挙げられる。ＰＣＲによって
検出又は同定を行うためには、このような各種被検物か
ら核酸試料を調製する必要があるが、これは当業者に公
知の方法によって行うことができ、例えば、微生物の培
養物からの核酸抽出法と同様にして行うことができる。
よれば、様々な被検物から放線菌を検出又は同定するこ
とができる。このような被検物としては、放線菌を含む
可能性のあるものであればよく、特に制限されないが、
例えば、浄化処理後の汚染土壌、木材等のコンポスト、
植栽時に使用する土壌等が挙げられる。ＰＣＲによって
検出又は同定を行うためには、このような各種被検物か
ら核酸試料を調製する必要があるが、これは当業者に公
知の方法によって行うことができ、例えば、微生物の培
養物からの核酸抽出法と同様にして行うことができる。
【００３５】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的
に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのも
のであり、本発明の技術的範囲を制限するものではな
い。 〔実施例１〕16S ｒＲＮＡの遺伝子中における放線菌に
特異的に保存性を有するＤＮＡ配列の決定 検出対象の放線菌として、アミコラトプシスsp.（Amyco
latopsis sp.）、ノカルディオプシス・アルボルビダ
（Nocardiopsis alborubida）、アクチノシンネマ・ミ
ルム（Actinosynnema mirum）、サーモモノスポラ・カ
ーバタ（Thermomonospora curvata）、ストレプトスポ
ランギウム・フラギル（Streptosporangiumfragile）、
サッカロトリクス・オーストラリエンシス（Saccharoth
rix australiensis）、ミクロテトラスポラ・フスカ（M
icrotetraspora fusca）、ミクロビスポラ・アエラタ
（Microbispora aerata）、アクチノマデュラ・シトレ
ア（Actinomadura citrea）、ストレプトベルティチリ
ウム・マシュエンセ（Streptoverticillium mashuens
e）、ストレプトミセス・ラベンデュラエ（Streptomyce
s lavendulae）、スポリクシア・ポリモルファ（Sporic
hthya polymorpha）、キネオスポリア・オーランティア
カ（Kineosporia aurantiaca）、ツカムレラ・インコネ
ンシス（Tsukamurella inchonensis）、サッカロポリス
ポラ・レクチビルグラ（Saccharopolyspora rectivirgu
la）、サッカロモノスポラsp.（Saccharomonospora s
p.）、ロドコッカス・ルバー（Rhodococcus ruber）、
プロミクロモノスポラ・シトレア（Promicromonospora
citrea）、オエルスコビア・ターバタ（Oerskovia turb
ata）、ノカルディオイデスsp.（Nocardioides sp.）、
ノカルディア・レストリカ（Nocardia restrica）、ア
クチノポリスポラ・モルチバリス（Actinopolyspora mo
rtivallis）、ジオデルマトフィルス・オブスクルス（G
eodermatophilus obscurus）、フランキアsp.（Frankia
sp.）、デルマトフィルス・コンゴレンシス（Dermatop
hilus congolensis）、及びピリメリア・アヌラタ（Pil
imelia anulata）を選択した。
に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのも
のであり、本発明の技術的範囲を制限するものではな
い。 〔実施例１〕16S ｒＲＮＡの遺伝子中における放線菌に
特異的に保存性を有するＤＮＡ配列の決定 検出対象の放線菌として、アミコラトプシスsp.（Amyco
latopsis sp.）、ノカルディオプシス・アルボルビダ
（Nocardiopsis alborubida）、アクチノシンネマ・ミ
ルム（Actinosynnema mirum）、サーモモノスポラ・カ
ーバタ（Thermomonospora curvata）、ストレプトスポ
ランギウム・フラギル（Streptosporangiumfragile）、
サッカロトリクス・オーストラリエンシス（Saccharoth
rix australiensis）、ミクロテトラスポラ・フスカ（M
icrotetraspora fusca）、ミクロビスポラ・アエラタ
（Microbispora aerata）、アクチノマデュラ・シトレ
ア（Actinomadura citrea）、ストレプトベルティチリ
ウム・マシュエンセ（Streptoverticillium mashuens
e）、ストレプトミセス・ラベンデュラエ（Streptomyce
s lavendulae）、スポリクシア・ポリモルファ（Sporic
hthya polymorpha）、キネオスポリア・オーランティア
カ（Kineosporia aurantiaca）、ツカムレラ・インコネ
ンシス（Tsukamurella inchonensis）、サッカロポリス
ポラ・レクチビルグラ（Saccharopolyspora rectivirgu
la）、サッカロモノスポラsp.（Saccharomonospora s
p.）、ロドコッカス・ルバー（Rhodococcus ruber）、
プロミクロモノスポラ・シトレア（Promicromonospora
citrea）、オエルスコビア・ターバタ（Oerskovia turb
ata）、ノカルディオイデスsp.（Nocardioides sp.）、
ノカルディア・レストリカ（Nocardia restrica）、ア
クチノポリスポラ・モルチバリス（Actinopolyspora mo
rtivallis）、ジオデルマトフィルス・オブスクルス（G
eodermatophilus obscurus）、フランキアsp.（Frankia
sp.）、デルマトフィルス・コンゴレンシス（Dermatop
hilus congolensis）、及びピリメリア・アヌラタ（Pil
imelia anulata）を選択した。
【００３６】上記２６種類の放線菌及びサーモアクチノ
ミセス・ジコトミカス（Thermoactinomyces dichotomic
us）、並びに大腸菌（E. coli）及びバチルスsp.（Baci
llussp.）の16S ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列をGen
Bankで検索後、MacVecterのソフトウェアを用いてアラ
イメントをとり、放線菌に特異的に保存性を有する領域
の存在を調べた。上記各微生物由来16S ｒＲＮＡ遺伝子
のGenBankアクセッション番号を表２に、アライメント
をとった結果を図１〜２６に示す。
ミセス・ジコトミカス（Thermoactinomyces dichotomic
us）、並びに大腸菌（E. coli）及びバチルスsp.（Baci
llussp.）の16S ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列をGen
Bankで検索後、MacVecterのソフトウェアを用いてアラ
イメントをとり、放線菌に特異的に保存性を有する領域
の存在を調べた。上記各微生物由来16S ｒＲＮＡ遺伝子
のGenBankアクセッション番号を表２に、アライメント
をとった結果を図１〜２６に示す。
【００３７】
【表２】
【００３８】その結果、図１における第２７７〜２９３
塩基及び第１２２５〜１２４１塩基の領域が、放線菌に
特異的に保存性が高く、大腸菌（E. coli）とバチルスs
p.（Bacillus sp.）では保存性が低い領域であることを
見出した。これらの領域はそれぞれ、ピリメリア・アヌ
ラタ（Pilimelia anulata）由来16S ｒＲＮＡをコード
するＤＮＡ配列の第２１６〜２３２塩基及び第１１２５
〜１１４１塩基に相当する。それぞれの塩基配列を以下
に示す。 第２１６〜２３２塩基：5'-CGCGGCCTATCAGCTTG-3'（配
列番号１） 第１１２５〜１１４１塩基：5'-GGGTCAACTCGGAGGAA-3'
（配列番号３） 両領域は放線菌群にのみ保存性が高かったが、放線菌群
の中のサーモアクチノミセス放線菌群の16S ｒＲＮＡ遺
伝子については保存性が低かった。
塩基及び第１２２５〜１２４１塩基の領域が、放線菌に
特異的に保存性が高く、大腸菌（E. coli）とバチルスs
p.（Bacillus sp.）では保存性が低い領域であることを
見出した。これらの領域はそれぞれ、ピリメリア・アヌ
ラタ（Pilimelia anulata）由来16S ｒＲＮＡをコード
するＤＮＡ配列の第２１６〜２３２塩基及び第１１２５
〜１１４１塩基に相当する。それぞれの塩基配列を以下
に示す。 第２１６〜２３２塩基：5'-CGCGGCCTATCAGCTTG-3'（配
列番号１） 第１１２５〜１１４１塩基：5'-GGGTCAACTCGGAGGAA-3'
（配列番号３） 両領域は放線菌群にのみ保存性が高かったが、放線菌群
の中のサーモアクチノミセス放線菌群の16S ｒＲＮＡ遺
伝子については保存性が低かった。
【００３９】〔実施例２〕プライマーの設計及び調製 実施例１で特定した２つの保存塩基配列に基づいて、そ
れぞれ17merのセンスプライマー（AceF）及びアンチセ
ンスプライマー（AceR）を設計した。これらのプライマ
ーの塩基配列を以下に示す。 AceF：5'-CGCGGCCTATCAGCTTG-3'（配列番号１） AceR：5'-TTCCTCCGAGTTGACCC-3'（配列番号２） AceFは実施例１で特定した配列番号１で表わされる塩基
配列と同一の塩基配列を有し、AceRは配列番号３で表わ
される塩基配列に相補的な塩基配列を有する。これらの
プライマーは、通常のオリゴヌクレオチド合成法に従っ
て合成した。
れぞれ17merのセンスプライマー（AceF）及びアンチセ
ンスプライマー（AceR）を設計した。これらのプライマ
ーの塩基配列を以下に示す。 AceF：5'-CGCGGCCTATCAGCTTG-3'（配列番号１） AceR：5'-TTCCTCCGAGTTGACCC-3'（配列番号２） AceFは実施例１で特定した配列番号１で表わされる塩基
配列と同一の塩基配列を有し、AceRは配列番号３で表わ
される塩基配列に相補的な塩基配列を有する。これらの
プライマーは、通常のオリゴヌクレオチド合成法に従っ
て合成した。
【００４０】〔実施例３〕プライマーを用いた放線菌の
検出及び同定 シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomona
s pseudoalcaligenes,KF707）、アルカリゲネスsp.（Al
caligenes sp., ATCC53640）、バチルス・サブチルス
（Bacillus subtilus, MAFF118087）、並びに放線菌で
あるロドコッカスsp.（Rhodococcus sp., ATCC29673）
及びストレプトミセス・ラベンデュラエ（Streptomyces
lavendulae, MAFF116011）からのＤＮＡ試料を調製
し、該ＤＮＡ試料を鋳型として用い、実施例２で調製し
たプライマーを用いるＰＣＲにより、その間に挟まれる
ＤＮＡ領域を増幅させた。上記の菌株のうち、登録番号
に「ATCC」を含むものはアメリカンタイプカルチャーコ
レクション（American TypeCulture Collection）から
入手した。登録番号に「MAFF」を含むものは農林水産省
農業生物資源研究所から入手した。また、登録番号に
「KF」を含むものは九州大学農学部の古川謙介教授によ
り提供された。さらに、ＰＣＲ産物を電気泳動によって
分離し、予想される約960bpの増幅断片の有無を調べ
た。これらの操作の具体的手順を以下に示す。
検出及び同定 シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomona
s pseudoalcaligenes,KF707）、アルカリゲネスsp.（Al
caligenes sp., ATCC53640）、バチルス・サブチルス
（Bacillus subtilus, MAFF118087）、並びに放線菌で
あるロドコッカスsp.（Rhodococcus sp., ATCC29673）
及びストレプトミセス・ラベンデュラエ（Streptomyces
lavendulae, MAFF116011）からのＤＮＡ試料を調製
し、該ＤＮＡ試料を鋳型として用い、実施例２で調製し
たプライマーを用いるＰＣＲにより、その間に挟まれる
ＤＮＡ領域を増幅させた。上記の菌株のうち、登録番号
に「ATCC」を含むものはアメリカンタイプカルチャーコ
レクション（American TypeCulture Collection）から
入手した。登録番号に「MAFF」を含むものは農林水産省
農業生物資源研究所から入手した。また、登録番号に
「KF」を含むものは九州大学農学部の古川謙介教授によ
り提供された。さらに、ＰＣＲ産物を電気泳動によって
分離し、予想される約960bpの増幅断片の有無を調べ
た。これらの操作の具体的手順を以下に示す。
【００４１】（１）菌の培養 シュードモナス・シュードアルカリゲネス及びアルカリ
ゲネスsp.の培養には、トリプティック・ソイ・ブロス
（Tryptic soy broth；トリプティック・ソイ・ブロス
(Difco)30.0g及び蒸留水1000.0mlを含む）を用いた。バ
チルス・サブチルスの培養には、ＮＡ（Nutrient brot
h）（牛肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、NaCl 2.5ｇ、
及び蒸留水1,000ｍｌを含み、pH7.0に調整したもの）を
用いた。
ゲネスsp.の培養には、トリプティック・ソイ・ブロス
（Tryptic soy broth；トリプティック・ソイ・ブロス
(Difco)30.0g及び蒸留水1000.0mlを含む）を用いた。バ
チルス・サブチルスの培養には、ＮＡ（Nutrient brot
h）（牛肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、NaCl 2.5ｇ、
及び蒸留水1,000ｍｌを含み、pH7.0に調整したもの）を
用いた。
【００４２】ロドコッカスsp.及びストレプトミセス・
ラベンデュラエの培養には、ＹＭブロス（酵母エキス４
ｇ、モルトエキス１０ｇ、グルコース４ｇ、及び蒸留水
1,000ｍｌを含み、pH7.3に調整したもの）を用いた。各
菌を２８℃で定常期になるまで振とう培養した。
ラベンデュラエの培養には、ＹＭブロス（酵母エキス４
ｇ、モルトエキス１０ｇ、グルコース４ｇ、及び蒸留水
1,000ｍｌを含み、pH7.3に調整したもの）を用いた。各
菌を２８℃で定常期になるまで振とう培養した。
【００４３】（２）ＤＮＡ試料の調製 上記（１）で得られた培養物の各６mlを遠心分離（6,00
0rpm、１０分間）し、上清を除いた。得られた沈澱物
を、120μlの10％ＳＤＳ、24μlのプロテイナーゼＫ（1
0mg/ml）を含む２mlのＴＥバッファーに再懸濁させ、３
７℃で１時間インキュベートした。該懸濁液に、５Ｍ塩
化ナトリウム400μlを添加して混合した。次いで、該混
合物にCTAB/NaCl溶液320μlを添加し、６５℃で２０分
間インキュベートした。
0rpm、１０分間）し、上清を除いた。得られた沈澱物
を、120μlの10％ＳＤＳ、24μlのプロテイナーゼＫ（1
0mg/ml）を含む２mlのＴＥバッファーに再懸濁させ、３
７℃で１時間インキュベートした。該懸濁液に、５Ｍ塩
化ナトリウム400μlを添加して混合した。次いで、該混
合物にCTAB/NaCl溶液320μlを添加し、６５℃で２０分
間インキュベートした。
【００４４】インキュベート後の混合物に対し、等容量
のクロロホルム／イソアミルアルコールを用いて抽出処
理を行い、遠心分離（15,000rpm、室温、１０分間）に
よって上清を採取した。該上清に対し、等容量のＴＥ飽
和フェノールを用いて抽出処理を行い、遠心分離（15,0
00rpm、室温、１０分間）によって上清を採取した。該
上清に0.6容量のイソプロパノールを添加してＤＮＡを
沈澱させ、該ＤＮＡ沈澱物を70％エタノールで洗浄し
た。
のクロロホルム／イソアミルアルコールを用いて抽出処
理を行い、遠心分離（15,000rpm、室温、１０分間）に
よって上清を採取した。該上清に対し、等容量のＴＥ飽
和フェノールを用いて抽出処理を行い、遠心分離（15,0
00rpm、室温、１０分間）によって上清を採取した。該
上清に0.6容量のイソプロパノールを添加してＤＮＡを
沈澱させ、該ＤＮＡ沈澱物を70％エタノールで洗浄し
た。
【００４５】洗浄後のＤＮＡ沈澱物を４mlのＴＥバッフ
ァーに再懸濁させた。該懸濁液に20μlのRNase（20mg/m
l）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。
得られた懸濁液に対し、等容量のＴＥ飽和フェノールを
用いて抽出処理を行い、遠心分離（15,000rpm、室温、
１０分間）によって上清を採取した。該上清に対し、等
容量のクロロホルム／イソアミルアルコールを用いて抽
出処理を行い、遠心分離（15,000rpm、室温、１０分
間）によって上清を採取した。該上清に対し、等容量の
ＴＥ飽和フェノールを用いて抽出処理を行い、遠心分離
（15,000rpm、室温、１０分間）によって上清を採取し
た。該上清に0.6容量のイソプロパノールを添加してＤ
ＮＡを沈澱させ、該ＤＮＡ沈澱物を70％エタノールで洗
浄した。洗浄後のＤＮＡ沈澱物を４mlのＴＥバッファー
に再懸濁させ、各菌のＤＮＡ試料を得た。
ァーに再懸濁させた。該懸濁液に20μlのRNase（20mg/m
l）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。
得られた懸濁液に対し、等容量のＴＥ飽和フェノールを
用いて抽出処理を行い、遠心分離（15,000rpm、室温、
１０分間）によって上清を採取した。該上清に対し、等
容量のクロロホルム／イソアミルアルコールを用いて抽
出処理を行い、遠心分離（15,000rpm、室温、１０分
間）によって上清を採取した。該上清に対し、等容量の
ＴＥ飽和フェノールを用いて抽出処理を行い、遠心分離
（15,000rpm、室温、１０分間）によって上清を採取し
た。該上清に0.6容量のイソプロパノールを添加してＤ
ＮＡを沈澱させ、該ＤＮＡ沈澱物を70％エタノールで洗
浄した。洗浄後のＤＮＡ沈澱物を４mlのＴＥバッファー
に再懸濁させ、各菌のＤＮＡ試料を得た。
【００４６】（３）ＰＣＲ ＰＣＲプライマーとして実施例２で得られたAceF及びAc
eRを用い、上記（２）で得られた各ＤＮＡ試料を鋳型Ｄ
ＮＡとしてＰＣＲを行った。25μlの10×PCRバッファー
（100mM Tris-Hcl (pH 8.3), 500mM KCl, 15mM MgCl2,
0.01％ゲラチン(w/v)を含む）、各50pmolのAceF及びAce
R、2.5μlの2mM dNTPs、１ユニットのTaqポリメラー
ゼ、並びに250ngの鋳型ＤＮＡを100μl容のチューブに
分注し、全体容量が25μlになるように滅菌水を加え
た。得られたＰＣＲ溶液をサイクル反応に供した。該サ
イクル反応の条件は、94℃1分間の後、94℃30秒間、65
℃1分間及び72℃1分間の一連の反応を30サイクル行った
後、72℃2分間とした。
eRを用い、上記（２）で得られた各ＤＮＡ試料を鋳型Ｄ
ＮＡとしてＰＣＲを行った。25μlの10×PCRバッファー
（100mM Tris-Hcl (pH 8.3), 500mM KCl, 15mM MgCl2,
0.01％ゲラチン(w/v)を含む）、各50pmolのAceF及びAce
R、2.5μlの2mM dNTPs、１ユニットのTaqポリメラー
ゼ、並びに250ngの鋳型ＤＮＡを100μl容のチューブに
分注し、全体容量が25μlになるように滅菌水を加え
た。得られたＰＣＲ溶液をサイクル反応に供した。該サ
イクル反応の条件は、94℃1分間の後、94℃30秒間、65
℃1分間及び72℃1分間の一連の反応を30サイクル行った
後、72℃2分間とした。
【００４７】（４）電気泳動による増幅産物の検出 ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動により、増幅産物
の検出を行った。検出結果を示す電気泳動写真を図２７
に示す。その結果、放線菌であるロドコッカスsp.及び
ストレプトミセス・ラベンデュラエでは目的の約960bp
のＤＮＡ断片が増幅されていたが、シュードモナス・シ
ュードアルカリゲネス、アルカリゲネスsp.及びバチル
ス・サブチルスでは増幅されなかった。
の検出を行った。検出結果を示す電気泳動写真を図２７
に示す。その結果、放線菌であるロドコッカスsp.及び
ストレプトミセス・ラベンデュラエでは目的の約960bp
のＤＮＡ断片が増幅されていたが、シュードモナス・シ
ュードアルカリゲネス、アルカリゲネスsp.及びバチル
ス・サブチルスでは増幅されなかった。
【００４８】
【発明の効果】本発明の菌の検出方法により、放線菌を
簡便かつ迅速に検出することができる。また、本発明の
菌の同定方法により従来の生化学的検査を用いることな
く、目的とする放線菌を簡便、迅速かつ精度よく同定す
ることができる。
簡便かつ迅速に検出することができる。また、本発明の
菌の同定方法により従来の生化学的検査を用いることな
く、目的とする放線菌を簡便、迅速かつ精度よく同定す
ることができる。
【００４９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TAISEI Corporation <120> Methods for Identifying, Detecting And Monitoring Actinomycetes Using 16S rRNA Gene <130> P99-0574 <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed Oligonucleotide that specifically hybridizes to 16S rRNA genes of Actinomycetes <400> 1 cgcggcctat cagcttg 17 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed Oligonucleotide that specifically hybridizes to 16S rRNA genes of Actinomycetes <400> 2 ttcctccgag ttgaccc 17 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed Oligonucleotide whose sequence is conserved among 16S rRNA genes of Actinomycetes <400> 3 gggtcaactc ggaggaa 17
【００５０】
【００５１】
【配列番号１及び２】放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子に特
異的にハイブリダイズするように設計されたオリゴヌク
レオチド。
異的にハイブリダイズするように設計されたオリゴヌク
レオチド。
【００５２】
【配列番号３】放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の間で保存
された配列を有するように設計されたオリゴヌクレオチ
ド。
された配列を有するように設計されたオリゴヌクレオチ
ド。
【図１】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus s
p.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比較
を示す図である。
p.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比較
を示す図である。
【図２】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus s
p.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比較
を示す図である。
p.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比較
を示す図である。
【図３】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus s
p.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比較
を示す図である。
p.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比較
を示す図である。
【図４】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus s
p.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比較
を示す図である。
p.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比較
を示す図である。
【図５】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus s
p.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比較
を示す図である。
p.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比較
を示す図である。
【図６】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus s
p.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比較
を示す図である。
p.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比較
を示す図である。
【図７】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus s
p.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比較
を示す図である。
p.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比較
を示す図である。
【図８】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus s
p.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比較
を示す図である。
p.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比較
を示す図である。
【図９】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus s
p.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比較
を示す図である。
p.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比較
を示す図である。
【図１０】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
【図１１】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
【図１２】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
【図１３】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
【図１４】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
【図１５】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
【図１６】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
【図１７】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
【図１８】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
【図１９】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
【図２０】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
【図２１】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
【図２２】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
【図２３】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
【図２４】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
【図２５】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
【図２６】大腸菌（E. coli）、バチルスsp.（Bacillus
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
sp.）、及び各種放線菌の16S ｒＲＮＡ遺伝子の配列比
較を示す図である。
【図２７】放線菌の特異的検出の結果を示す電気泳動写
真である。
真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA05 AA07 AA11 AA17 CA01 CA12 CA20 DA05 HA08 HA11 4B063 QA18 QQ06 QQ19 QQ42 QQ54 QR08 QR62 QS02 QS16 QS24 QS25 QX01
Claims (9)
- 【請求項１】 16SｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列におい
て、検出しようとする放線菌に属する微生物間で特異的
に保存性を有する領域の塩基配列又はそれに相補的な塩
基配列を用いる放線菌の検出方法。 - 【請求項２】 検出しようとする放線菌に属する微生物
間で特異的に保存性を有する前記領域が２つあり、この
２つの領域の塩基配列の一方が配列番号１で表わされる
塩基配列であり、他方が配列番号３で表わされる塩基配
列である請求項１記載の放線菌の検出方法。 - 【請求項３】 被検物から得られる核酸試料を鋳型と
し、配列番号１で表わされる塩基配列を含むプライマー
及び配列番号２で表わされる塩基配列を含むプライマー
を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を含む、請求
項１記載の放線菌の検出方法。 - 【請求項４】 16SｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列におい
て、モニタリングしようとする放線菌に属する微生物間
で特異的に保存性を有する領域の塩基配列又はそれに相
補的な塩基配列を用いることを特徴とする、被検物中に
存在する放線菌の菌数変化をモニタリングする方法。 - 【請求項５】 モニタリングしようとする放線菌に属す
る微生物間で特異的に保存性を有する前記領域が２つあ
り、この２つの領域の塩基配列の一方が配列番号１で表
わされる塩基配列であり、他方が配列番号３で表わされ
る塩基配列である請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 被検物から得られる核酸試料を鋳型と
し、配列番号１で表わされる塩基配列を含むプライマー
及び配列番号２で表わされる塩基配列を含むプライマー
を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を含む、請求
項４記載の方法。 - 【請求項７】 16SｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列におい
て、検出しようとする放線菌に属する微生物間で特異的
に保存性を有する２つの領域の塩基配列又はそれに相補
的な塩基配列を用いて放線菌を検出した後に、該２つの
領域に挟まれた該16SｒＲＮＡ遺伝子上の領域の塩基配
列を用いて、検出された放線菌を同定する方法。 - 【請求項８】 検出しようとする放線菌に属する微生物
間で特異的に保存性を有する２つの前記領域の塩基配列
の一方が配列番号１で表わされる塩基配列であり、他方
が配列番号３で表わされる塩基配列である請求項７記載
の方法。 - 【請求項９】 被検物から得られる核酸試料を鋳型と
し、配列番号１で表わされる塩基配列を含むプライマー
及び配列番号２で表わされる塩基配列を含むプライマー
を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を含む請求項
７記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP37125799A JP2001178498A (ja) | 1999-12-27 | 1999-12-27 | １６ＳｒＲＮＡ遺伝子による放線菌の同定・検出及びモニタリング方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP37125799A JP2001178498A (ja) | 1999-12-27 | 1999-12-27 | １６ＳｒＲＮＡ遺伝子による放線菌の同定・検出及びモニタリング方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001178498A true JP2001178498A (ja) | 2001-07-03 |
Family
ID=18498403
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP37125799A Pending JP2001178498A (ja) | 1999-12-27 | 1999-12-27 | １６ＳｒＲＮＡ遺伝子による放線菌の同定・検出及びモニタリング方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001178498A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010531640A (ja) * | 2007-06-29 | 2010-09-30 | コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション | 毒性化合物の分解方法 |
-
1999
- 1999-12-27 JP JP37125799A patent/JP2001178498A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010531640A (ja) * | 2007-06-29 | 2010-09-30 | コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション | 毒性化合物の分解方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Satake et al. | Detection of vancomycin-resistant enterococci in fecal samples by PCR | |
| US5298392A (en) | Process for detection of water-borne microbial pathogens and indicators of human fecal contamination in water samples and kits therefor | |
| Rudi et al. | Development and application of new nucleic acid-based technologies for microbial community analyses in foods | |
| EP0581171B1 (en) | Species-specific oligonucleotides for bifidobacteria and a method of detection using the same | |
| Fraiture et al. | Are antimicrobial resistance genes key targets to detect genetically modified microorganisms in fermentation products? | |
| EP2902506B1 (en) | Detection of listeria species in food and environmental samples, methods and compositions thereof | |
| Deckers et al. | Strategy for the identification of micro-organisms producing food and feed products: Bacteria producing food enzymes as study case | |
| KR101293713B1 (ko) | 시토신의 화학적 변형에 의한 미생물 핵산의 단순화 방법 | |
| CN114207154A (zh) | 用于检测一种或多种病原体的选择性富集肉汤 | |
| JP4771755B2 (ja) | オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドを用いた真核生物の検出方法及び同定方法 | |
| US20100233717A1 (en) | Methods for detecting toxigenic microbes | |
| EP1019532B1 (en) | Primers and probes for the amplification, detection and typing of mycoplasma pneumoniae | |
| EP2419524B1 (en) | Detection of bacteria and fungi | |
| AU732150B2 (en) | Means for qualitative and quantitative analysis of microbial populations potentially present in a sample | |
| Mirza et al. | PCR-amplified 16S rRNA sequence analysis to confirm nodulation of Datisca cannabina L. by the endophyte of Coriaria nepalensis Wall | |
| US7160701B2 (en) | Genes for detecting bacteria and a method for detecting bacteria by using the genes | |
| Petershofen et al. | Detection of nucleic acid sequences from bacterial species with molecular genetic methods | |
| JP2001178498A (ja) | １６ＳｒＲＮＡ遺伝子による放線菌の同定・検出及びモニタリング方法 | |
| JPWO2000009683A1 (ja) | 細菌検出のための遺伝子及びそれを用いた検出法 | |
| AU769095B2 (en) | Rapid and sensitive method for detecting (Histoplasma capsulatum) | |
| JPH10210980A (ja) | 乳酸菌検出用オリゴヌクレオチド及び該菌の検出方法 | |
| JPH1118780A (ja) | 乳酸菌検出用オリゴヌクレオチド及びそれを用いた判定法 | |
| CA2696433A1 (en) | Methods for detecting drug-resistant microbes | |
| US7439022B2 (en) | Nucleic acids for detection of Listeria | |
| WO1994017203A1 (en) | Amplified dna fingerprinting method for detecting genomic variation |