JP2001083050A - 核酸の回収方法及び試薬キット - Google Patents
核酸の回収方法及び試薬キットInfo
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- JP2001083050A JP2001083050A JP26320399A JP26320399A JP2001083050A JP 2001083050 A JP2001083050 A JP 2001083050A JP 26320399 A JP26320399 A JP 26320399A JP 26320399 A JP26320399 A JP 26320399A JP 2001083050 A JP2001083050 A JP 2001083050A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】核酸を含有する材料からの迅速、簡便で精製度
の高い核酸を収量を低下させずに回収する方法の提供に
あり、特に、生物試料中に存在する核酸成分を自動回収
装置に好適な方法の提供、及び、大腸菌からのプラスミ
ドＤＮＡの自動回収装置に好適な方法の提供にある。 【解決手段】核酸含有材料から核酸の遊離を促すための
第１工程、遊離した核酸と核酸の固相への結合を促進す
る物質を混合する第２工程、混合液と核酸結合性固相と
を酸性条件下で接触させる第３工程、固相と液体とを分
離する第４工程、核酸が結合した固相を塩を含む酸性溶
液により洗浄する第５工程、アルカリ性条件下で核酸を
固相から溶離する第６工程、を備える。 【効果】本発明により、遺伝子検査、或いは、遺伝子解
析、に好適な純度の核酸を迅速、且つ、簡便に、危険性
のある物質を使用することなく得ることが出来る。
の高い核酸を収量を低下させずに回収する方法の提供に
あり、特に、生物試料中に存在する核酸成分を自動回収
装置に好適な方法の提供、及び、大腸菌からのプラスミ
ドＤＮＡの自動回収装置に好適な方法の提供にある。 【解決手段】核酸含有材料から核酸の遊離を促すための
第１工程、遊離した核酸と核酸の固相への結合を促進す
る物質を混合する第２工程、混合液と核酸結合性固相と
を酸性条件下で接触させる第３工程、固相と液体とを分
離する第４工程、核酸が結合した固相を塩を含む酸性溶
液により洗浄する第５工程、アルカリ性条件下で核酸を
固相から溶離する第６工程、を備える。 【効果】本発明により、遺伝子検査、或いは、遺伝子解
析、に好適な純度の核酸を迅速、且つ、簡便に、危険性
のある物質を使用することなく得ることが出来る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸を含有する物
質からの核酸の回収方法に関する。更に詳しくは、核酸
の検査による遺伝子診断のための体液成分からの内因
性、或いは、外来性の遺伝子として存在する核酸成分の
自動回収装置、或いは、核酸の塩基配列決定のための遺
伝子組換え大腸菌等からのプラスミドＤＮＡの自動回収
装置に適した核酸の回収方法に関する。
質からの核酸の回収方法に関する。更に詳しくは、核酸
の検査による遺伝子診断のための体液成分からの内因
性、或いは、外来性の遺伝子として存在する核酸成分の
自動回収装置、或いは、核酸の塩基配列決定のための遺
伝子組換え大腸菌等からのプラスミドＤＮＡの自動回収
装置に適した核酸の回収方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】分子生物学の進歩によって、遺伝子に関
する数々の技術が開発され、また、それらの技術により
多くの疾患性の遺伝子が分離・同定された。その結果、
医療の分野でも、診断、或いは、検査法に分子生物学的
な技法が取り入れられ、従来不可能であった診断が可能
となったり、検査日数の大幅短縮が達成されつつある。
する数々の技術が開発され、また、それらの技術により
多くの疾患性の遺伝子が分離・同定された。その結果、
医療の分野でも、診断、或いは、検査法に分子生物学的
な技法が取り入れられ、従来不可能であった診断が可能
となったり、検査日数の大幅短縮が達成されつつある。
【０００３】この急激な進歩は、主として、核酸増幅
法、特に、ＰＣＲ法（polymerase chain reaction：ポ
リメラーゼ連鎖反応、Saiki et al., Science, 239, 48
7−491(1988)）に依るところが大きい。ＰＣＲ法は、溶
液中の核酸を配列特異的に増幅することが可能なため、
例えば、血清中に極微量しか存在しないウイルスを、そ
のウイルスの遺伝子である核酸を増幅し検出することに
より、間接的に証明できる。
法、特に、ＰＣＲ法（polymerase chain reaction：ポ
リメラーゼ連鎖反応、Saiki et al., Science, 239, 48
7−491(1988)）に依るところが大きい。ＰＣＲ法は、溶
液中の核酸を配列特異的に増幅することが可能なため、
例えば、血清中に極微量しか存在しないウイルスを、そ
のウイルスの遺伝子である核酸を増幅し検出することに
より、間接的に証明できる。
【０００４】しかし、このＰＣＲ法を臨床の場で日常検
査に使用した際に、いくつかの問題点が存在する。その
中でも特に、前処理における核酸の抽出、精製工程の重
要性が指摘されてる(大島ほか, JJCLA, 22(2), 145−15
0(1997))。これは、核酸精製時に除去し得なかった阻害
因子の影響によるものであり、血液中のヘモグロビン、
抽出工程で使用される界面活性剤等が知られている。ま
た、抽出工程に関しては、用手法による煩雑な操作と熟
練者による多大な労力が必要とされる。そのため、病院
の検査室へ新規に遺伝子検査を導入する際の障害となっ
ており、この工程の自動化が熱望されている。
査に使用した際に、いくつかの問題点が存在する。その
中でも特に、前処理における核酸の抽出、精製工程の重
要性が指摘されてる(大島ほか, JJCLA, 22(2), 145−15
0(1997))。これは、核酸精製時に除去し得なかった阻害
因子の影響によるものであり、血液中のヘモグロビン、
抽出工程で使用される界面活性剤等が知られている。ま
た、抽出工程に関しては、用手法による煩雑な操作と熟
練者による多大な労力が必要とされる。そのため、病院
の検査室へ新規に遺伝子検査を導入する際の障害となっ
ており、この工程の自動化が熱望されている。
【０００５】また、分子生物学的な研究を行う機関で
は、遺伝子組換え操作を行うための材料として、プラス
ミドＤＮＡが頻繁に使用されているが、省力化の点等か
ら、検査室の場合と同様に、核酸を抽出し精製する工程
の自動化が望まれている。
は、遺伝子組換え操作を行うための材料として、プラス
ミドＤＮＡが頻繁に使用されているが、省力化の点等か
ら、検査室の場合と同様に、核酸を抽出し精製する工程
の自動化が望まれている。
【０００６】核酸を含有する生物試料から阻害因子を含
まない精製度の高い状態で核酸を回収するための既知の
方法としては、タンパク質分解酵素の存在下で、生物試
料に界面活性剤を作用させ、核酸を遊離状とし、フェノ
ール（及び、クロロフォルム）と混合し、遠心分離器に
よる水相・有機相分離を数回行った後、水相からアルコ
ールにより沈殿物の形で核酸を回収する方法が知られて
いる。しかし、この調製方法は、工程内に有毒物質であ
るフェノール等の有機溶媒を使用することに伴う問題が
存在する。
まない精製度の高い状態で核酸を回収するための既知の
方法としては、タンパク質分解酵素の存在下で、生物試
料に界面活性剤を作用させ、核酸を遊離状とし、フェノ
ール（及び、クロロフォルム）と混合し、遠心分離器に
よる水相・有機相分離を数回行った後、水相からアルコ
ールにより沈殿物の形で核酸を回収する方法が知られて
いる。しかし、この調製方法は、工程内に有毒物質であ
るフェノール等の有機溶媒を使用することに伴う問題が
存在する。
【０００７】また、上記の水相・有機相分離を利用した
方法以外にも、カオトロピック物質の存在下でガラス表
面に核酸が結合する性質を利用して、アガロースゲルか
らＤＮＡを回収する方法(B. Vogelstein and D. Gilles
pie, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 76(2), 615−619(197
9))、或いは、大腸菌からプラスミドＤＮＡを回収する
為の方法(M. A. Marko, R. Chipperfield and H. C. Bi
rnboim, Anal. Biochem., 121,382-387(1982))が報告さ
れている。
方法以外にも、カオトロピック物質の存在下でガラス表
面に核酸が結合する性質を利用して、アガロースゲルか
らＤＮＡを回収する方法(B. Vogelstein and D. Gilles
pie, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 76(2), 615−619(197
9))、或いは、大腸菌からプラスミドＤＮＡを回収する
為の方法(M. A. Marko, R. Chipperfield and H. C. Bi
rnboim, Anal. Biochem., 121,382-387(1982))が報告さ
れている。
【０００８】更に、生物材料からの核酸の回収を目的と
し、より操作を簡便にした方法として特開平11-127854
が存在するが、結合から溶離までの工程における至適pH
の記載はされていない。また、先行技術である特開平10
−75784号には、リボ核酸を結合するための条件として
使用するカオトロピック剤の溶液をpH6.0以下の溶液が
望ましい旨の記載はあるが、洗浄、溶離工程でのpHの記
載は無い。
し、より操作を簡便にした方法として特開平11-127854
が存在するが、結合から溶離までの工程における至適pH
の記載はされていない。また、先行技術である特開平10
−75784号には、リボ核酸を結合するための条件として
使用するカオトロピック剤の溶液をpH6.0以下の溶液が
望ましい旨の記載はあるが、洗浄、溶離工程でのpHの記
載は無い。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、核酸
を含有する材料からの迅速、簡便で精製度の高い核酸を
収量を低下させずに回収する方法の提供にあり、特に、
生物試料中に存在する核酸成分を自動回収装置に好適な
方法の提供、あるいは、大腸菌からのプラスミドＤＮＡ
の自動回収装置に好適な方法の提供にある。
を含有する材料からの迅速、簡便で精製度の高い核酸を
収量を低下させずに回収する方法の提供にあり、特に、
生物試料中に存在する核酸成分を自動回収装置に好適な
方法の提供、あるいは、大腸菌からのプラスミドＤＮＡ
の自動回収装置に好適な方法の提供にある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
めに、本発明は以下のように構成される。
めに、本発明は以下のように構成される。
【００１１】すなわち、核酸含有材料から核酸の遊離を
促すための第１工程、遊離した核酸と核酸の固相への結
合を促進する物質を混合する第２工程、混合液と核酸結
合性固相とを接触させる第３工程、固相と液体とを分離
する第４工程、核酸が結合した固相を塩を含む溶液によ
り洗浄する第５工程、核酸を固相から溶離する第６工程
を備える。
促すための第１工程、遊離した核酸と核酸の固相への結
合を促進する物質を混合する第２工程、混合液と核酸結
合性固相とを接触させる第３工程、固相と液体とを分離
する第４工程、核酸が結合した固相を塩を含む溶液によ
り洗浄する第５工程、核酸を固相から溶離する第６工程
を備える。
【００１２】本発明は、核酸を含有する材料であれば適
応可能であるが、特に、全血、血清、喀痰、尿等の臨床
検体、或いは、培養細胞、培養細菌等の生物学的な試
料、或いは、電気泳動後のゲルに保持された状態の核
酸、等が好適である。また、本発明の方法は、ＤＮＡ増
幅酵素等の反応産物や素精製状態の核酸を含む材料に対
しても有効である。なお、ここでいう核酸は、2本鎖、1
本鎖、或いは、部分的に2本鎖、もしくは、1本鎖構造を
採るＤＮＡ、或いは、ＲＮＡである。
応可能であるが、特に、全血、血清、喀痰、尿等の臨床
検体、或いは、培養細胞、培養細菌等の生物学的な試
料、或いは、電気泳動後のゲルに保持された状態の核
酸、等が好適である。また、本発明の方法は、ＤＮＡ増
幅酵素等の反応産物や素精製状態の核酸を含む材料に対
しても有効である。なお、ここでいう核酸は、2本鎖、1
本鎖、或いは、部分的に2本鎖、もしくは、1本鎖構造を
採るＤＮＡ、或いは、ＲＮＡである。
【００１３】本発明の第１工程における、核酸含有材料
から核酸の遊離を促すための方法は、乳鉢、超音波、マ
イクロウエーブなどによる物理的な方法、或いは、界面
活性剤、変性剤などによる化学的な方法、或いは、タン
パク質分解酵素などによる生化学的な方法、及び、それ
らを組み合わせた方法などが使用できる。
から核酸の遊離を促すための方法は、乳鉢、超音波、マ
イクロウエーブなどによる物理的な方法、或いは、界面
活性剤、変性剤などによる化学的な方法、或いは、タン
パク質分解酵素などによる生化学的な方法、及び、それ
らを組み合わせた方法などが使用できる。
【００１４】本発明の第２工程における、核酸の固相へ
の結合を促進する物質としては、ＮａＩ(ヨウ化ナトリ
ウム)、ＫＩ(ヨウ化カリウム)、ＮａＣｌＯ４、ＮａＳ
ＣＮ(チオシアン酸ナトリウム)、ＧｕＳＣＮ(チオシア
ン酸グアニジン)、ＧｕＨＣｌ(塩酸グアニジン)などの
カオトロピック剤の使用が好適である。本発明において
は、特異的に核酸成分を固相へ結合させるために、例え
ばＧｕＨＣｌを使用する場合には、最終濃度を、４mol
／l以上とするのが望ましい。
の結合を促進する物質としては、ＮａＩ(ヨウ化ナトリ
ウム)、ＫＩ(ヨウ化カリウム)、ＮａＣｌＯ４、ＮａＳ
ＣＮ(チオシアン酸ナトリウム)、ＧｕＳＣＮ(チオシア
ン酸グアニジン)、ＧｕＨＣｌ(塩酸グアニジン)などの
カオトロピック剤の使用が好適である。本発明において
は、特異的に核酸成分を固相へ結合させるために、例え
ばＧｕＨＣｌを使用する場合には、最終濃度を、４mol
／l以上とするのが望ましい。
【００１５】本発明の第３工程における、核酸結合性固
相は、ガラス粒子、シリカパウダー、石英濾紙、石英ウ
ール、あるいは、それらの破砕物、ケイソウ土など、酸
化ケイ素を含有する物質であれば使用することができる
が、核酸とカオトロピック剤の混合液中で、核酸と固相
の接触確率を高める事により、結合効率の向上、或い
は、結合時間の短縮が可能であるため、粒径の小さい粒
子の使用が望ましい。
相は、ガラス粒子、シリカパウダー、石英濾紙、石英ウ
ール、あるいは、それらの破砕物、ケイソウ土など、酸
化ケイ素を含有する物質であれば使用することができる
が、核酸とカオトロピック剤の混合液中で、核酸と固相
の接触確率を高める事により、結合効率の向上、或い
は、結合時間の短縮が可能であるため、粒径の小さい粒
子の使用が望ましい。
【００１６】本発明の第４工程における、固相と液体を
分離する手段としては、遠心分離や濾過により分離可能
であるが、自動化、及び、装置化に際しては、抗原抗体
反応を利用した免疫分析装置で一般的に使用される、既
知のＢ／Ｆ(bond form／freeform)分離技術を応用する
ことが出来る(例えば、公開特許公報 平８−２９４２
４号)。
分離する手段としては、遠心分離や濾過により分離可能
であるが、自動化、及び、装置化に際しては、抗原抗体
反応を利用した免疫分析装置で一般的に使用される、既
知のＢ／Ｆ(bond form／freeform)分離技術を応用する
ことが出来る(例えば、公開特許公報 平８−２９４２
４号)。
【００１７】本発明の第５工程における、核酸が結合し
た固相を塩を含む酸性溶液により洗浄する手段は、第４
工程終了後の固相に対して、核酸の固相への結合を保持
しつつ、固相を洗浄するための塩を含む酸性溶液を混合
し、第４工程と同様、固相と液体の分離をすることによ
り洗浄を行うことが出来る。
た固相を塩を含む酸性溶液により洗浄する手段は、第４
工程終了後の固相に対して、核酸の固相への結合を保持
しつつ、固相を洗浄するための塩を含む酸性溶液を混合
し、第４工程と同様、固相と液体の分離をすることによ
り洗浄を行うことが出来る。
【００１８】固相の洗浄のために使用する液体は、固相
に結合した核酸を溶離させないことが重要であり、これ
は最終的に得られる核酸の収率に影響を及ぼす。公知の
方法としては、室温で上記操作を効率的に行うには少な
くとも75%濃度のエタノール使用が推奨されてる(C. W.
Chen and C. A. Thomas,Jr., Anal. Biochem., 101,339
−341(1980))が、50％濃度のエタノールに終濃度で25mM
になるようにpH5.0に調整した酢酸カリウムを添加した
場合でも良好な結果が得られる。
に結合した核酸を溶離させないことが重要であり、これ
は最終的に得られる核酸の収率に影響を及ぼす。公知の
方法としては、室温で上記操作を効率的に行うには少な
くとも75%濃度のエタノール使用が推奨されてる(C. W.
Chen and C. A. Thomas,Jr., Anal. Biochem., 101,339
−341(1980))が、50％濃度のエタノールに終濃度で25mM
になるようにpH5.0に調整した酢酸カリウムを添加した
場合でも良好な結果が得られる。
【００１９】本発明の第６工程における、核酸を固相か
ら溶離する手段は、洗浄後の固相に対して固相の体積以
上の低塩濃度のアルカリ性水溶液を混合することにより
達成される。この操作により核酸は固相から水相へと移
行するため、第４工程と同様に固相と液体を分離するこ
とで精製状態の核酸水溶液が得られる。本発明において
使用される、低塩濃度のアルカリ性水溶液は滅菌状態で
あることが好適である。また、ここで使用される、低塩
濃度のアルカリ性水溶液は、洗浄工程で使用した酸性溶
液との極微量の混合が避けられないため、アルカリ性側
でのpH緩衝能を有す物質の添加が必要であり、得られた
核酸水溶液を次操作に使用する際に不具合の生じない物
質の使用が望ましい。例えば、次操作にPCR反応を行う
場合はTris緩衝液の使用は良好であり、また、次操作に
RT-PCR反応を行う場合にはBicineの使用が良好であっ
た。
ら溶離する手段は、洗浄後の固相に対して固相の体積以
上の低塩濃度のアルカリ性水溶液を混合することにより
達成される。この操作により核酸は固相から水相へと移
行するため、第４工程と同様に固相と液体を分離するこ
とで精製状態の核酸水溶液が得られる。本発明において
使用される、低塩濃度のアルカリ性水溶液は滅菌状態で
あることが好適である。また、ここで使用される、低塩
濃度のアルカリ性水溶液は、洗浄工程で使用した酸性溶
液との極微量の混合が避けられないため、アルカリ性側
でのpH緩衝能を有す物質の添加が必要であり、得られた
核酸水溶液を次操作に使用する際に不具合の生じない物
質の使用が望ましい。例えば、次操作にPCR反応を行う
場合はTris緩衝液の使用は良好であり、また、次操作に
RT-PCR反応を行う場合にはBicineの使用が良好であっ
た。
【００２０】また、得られる核酸の収率を高めるため
に、５５〜６５℃に加温した状態で使用することが望ま
しいが、溶離を行う際に使用する容器を同様の温度に加
温した場合でも同様の効果が得られる。また、本発明に
おいて、核酸の収率を高めるためには、第６工程を少な
くとも２回行うことが望ましい。
に、５５〜６５℃に加温した状態で使用することが望ま
しいが、溶離を行う際に使用する容器を同様の温度に加
温した場合でも同様の効果が得られる。また、本発明に
おいて、核酸の収率を高めるためには、第６工程を少な
くとも２回行うことが望ましい。
【００２１】以上のようにして構成した核酸回収方法
は、核酸含有材料から核酸の遊離を促すための第１工
程、遊離した核酸と核酸の固相への結合を促進する物質
を混合する第２工程、混合液と核酸結合性固相とを酸性
条件下で接触させる第３工程、固相と液体とを分離する
第４工程、核酸が結合した固相を塩を含む酸性溶液によ
り洗浄する第５工程、アルカリ性条件下で核酸を固相か
ら溶離する第６工程、を備える。
は、核酸含有材料から核酸の遊離を促すための第１工
程、遊離した核酸と核酸の固相への結合を促進する物質
を混合する第２工程、混合液と核酸結合性固相とを酸性
条件下で接触させる第３工程、固相と液体とを分離する
第４工程、核酸が結合した固相を塩を含む酸性溶液によ
り洗浄する第５工程、アルカリ性条件下で核酸を固相か
ら溶離する第６工程、を備える。
【００２２】第３工程における、核酸結合性固相は、ガ
ラス粒子、シリカパウダー、石英濾紙、石英ウール、あ
るいは、それらの破砕物、ケイソウ土など、酸化ケイ素
を含有する物質であれば使用することが可能で、１〜１
００μｍ程度の粒径の場合、数分から１０分程度で実用
上十分な固相に対する核酸の結合が得られる。また、ケ
イソウ土を使用した場合、１回の処理に必要な原価を低
減させることが出来る。また、核酸と固相の接触確率を
高めるために、使用する粒子の比重に応じて、攪拌操作
を併用することにより更に結合時間の効率化や再現性の
向上がはかれる。
ラス粒子、シリカパウダー、石英濾紙、石英ウール、あ
るいは、それらの破砕物、ケイソウ土など、酸化ケイ素
を含有する物質であれば使用することが可能で、１〜１
００μｍ程度の粒径の場合、数分から１０分程度で実用
上十分な固相に対する核酸の結合が得られる。また、ケ
イソウ土を使用した場合、１回の処理に必要な原価を低
減させることが出来る。また、核酸と固相の接触確率を
高めるために、使用する粒子の比重に応じて、攪拌操作
を併用することにより更に結合時間の効率化や再現性の
向上がはかれる。
【００２３】第４工程における、固相と液体を分離する
手段としては、抗原抗体反応を利用した免疫分析装置で
一般的に使用される、Ｂ／Ｆ分離技術が流用できるた
め、既存の免疫分析装置の技術を生かすことが可能であ
る。
手段としては、抗原抗体反応を利用した免疫分析装置で
一般的に使用される、Ｂ／Ｆ分離技術が流用できるた
め、既存の免疫分析装置の技術を生かすことが可能であ
る。
【００２４】
【発明の実施の形態】（核酸の固相に対する結合率）図
１のフローチャートに従い、核酸を含む水溶液からの核
酸の回収を行った。
１のフローチャートに従い、核酸を含む水溶液からの核
酸の回収を行った。
【００２５】核酸含有材料としては、市販精製品のpBR3
22 DNAをＴＥ緩衝液(pH8.0)により希釈した。この場
合、核酸含有材料中で既に核酸は遊離の状態であるた
め、第1工程はスキップした。第2工程では、1.5ml容量
の反応容器内で、前記核酸水溶液100μｌに対してMES緩
衝液／或いは／Tris緩衝液により各種pHに調整を行った
6mol／lGuHCl溶液500μｌを添加し攪拌を行った。第3工
程で、核酸結合性固相として石英粒子を100mg添加し、
室温中でロータリーミキサーにより、一定時間、溶液を
攪拌する事により固相と液体の接触を行った。第4工程
では、核酸が結合した固相と液体を分離するために、遠
心分離器を使用し、12000rpm、1分の遠心により固相を
沈殿させ、分取した上清を分光光度計を利用して核酸の
結合量を求めた。結果を図２に示す。結合時の溶液のpH
により単位時間内の結合率に差が生じること、溶液のpH
が6.5以下が有効であることが分かる。
22 DNAをＴＥ緩衝液(pH8.0)により希釈した。この場
合、核酸含有材料中で既に核酸は遊離の状態であるた
め、第1工程はスキップした。第2工程では、1.5ml容量
の反応容器内で、前記核酸水溶液100μｌに対してMES緩
衝液／或いは／Tris緩衝液により各種pHに調整を行った
6mol／lGuHCl溶液500μｌを添加し攪拌を行った。第3工
程で、核酸結合性固相として石英粒子を100mg添加し、
室温中でロータリーミキサーにより、一定時間、溶液を
攪拌する事により固相と液体の接触を行った。第4工程
では、核酸が結合した固相と液体を分離するために、遠
心分離器を使用し、12000rpm、1分の遠心により固相を
沈殿させ、分取した上清を分光光度計を利用して核酸の
結合量を求めた。結果を図２に示す。結合時の溶液のpH
により単位時間内の結合率に差が生じること、溶液のpH
が6.5以下が有効であることが分かる。
【００２６】（核酸の回収）図１のフローチャートに従
い、核酸を含む水溶液からの核酸の回収を行った。核酸
含有材料としては、市販精製品のpBR322 DNAをＴＥ緩衝
液(pH8.0)により希釈した。この場合、核酸含有材料中
で既に核酸は遊離の状態であるため、第1工程はスキッ
プした。第２工程では、1.5ml容量の反応容器内で、前
記核酸水溶液100μｌに対してMES緩衝液によりpH4.0に
調整を行った6mol/lGuHCl溶液500μｌを添加し攪拌を行
った。第３工程で、核酸結合性固相として石英粒子を10
0mg添加し、室温中でロータリーミキサーにより、一定
時間、溶液を攪拌する事により固相と液体の接触を行っ
た。第４工程では、核酸が結合した固相と液体を分離す
るために、遠心分離器を使用し、12000rpm、1分の遠心
により固相を沈殿させ、上清を廃棄した。第５工程で
は、pH5.0に調整した酢酸カリウムを添加した50％エタ
ノール水溶液により固相を懸濁し、12000rpm、1分の遠
心により固相の沈殿を得、上清を破棄する操作を2回繰
り返し固相の洗浄を行った。第６工程では、pHを6.5〜
9.5の範囲で調製した各種10mM Tris緩衝液を固相へ添加
し、65℃、1分の加温により溶離を行い、12000rpm、1分
の遠心により上清を得、この一部分を試料とし、0.8%ア
ガロースゲルを支持体として電気泳動を行い、エチジウ
ムブロマイド染色後に、各バンドの強度をデンシトグラ
フ(ＡＴＴＯ社製)により数値化し、第1工程での核酸量
に基づき回収率を算出した。結果を図３に示す。結合工
程、及び、洗浄工程で酸性溶液を使用し、アルカリ性溶
液により溶離を行うことにより有効に核酸が回収される
のが分かる。
い、核酸を含む水溶液からの核酸の回収を行った。核酸
含有材料としては、市販精製品のpBR322 DNAをＴＥ緩衝
液(pH8.0)により希釈した。この場合、核酸含有材料中
で既に核酸は遊離の状態であるため、第1工程はスキッ
プした。第２工程では、1.5ml容量の反応容器内で、前
記核酸水溶液100μｌに対してMES緩衝液によりpH4.0に
調整を行った6mol/lGuHCl溶液500μｌを添加し攪拌を行
った。第３工程で、核酸結合性固相として石英粒子を10
0mg添加し、室温中でロータリーミキサーにより、一定
時間、溶液を攪拌する事により固相と液体の接触を行っ
た。第４工程では、核酸が結合した固相と液体を分離す
るために、遠心分離器を使用し、12000rpm、1分の遠心
により固相を沈殿させ、上清を廃棄した。第５工程で
は、pH5.0に調整した酢酸カリウムを添加した50％エタ
ノール水溶液により固相を懸濁し、12000rpm、1分の遠
心により固相の沈殿を得、上清を破棄する操作を2回繰
り返し固相の洗浄を行った。第６工程では、pHを6.5〜
9.5の範囲で調製した各種10mM Tris緩衝液を固相へ添加
し、65℃、1分の加温により溶離を行い、12000rpm、1分
の遠心により上清を得、この一部分を試料とし、0.8%ア
ガロースゲルを支持体として電気泳動を行い、エチジウ
ムブロマイド染色後に、各バンドの強度をデンシトグラ
フ(ＡＴＴＯ社製)により数値化し、第1工程での核酸量
に基づき回収率を算出した。結果を図３に示す。結合工
程、及び、洗浄工程で酸性溶液を使用し、アルカリ性溶
液により溶離を行うことにより有効に核酸が回収される
のが分かる。
【００２７】
【発明の効果】本発明により、核酸を含有する材料から
の迅速、簡便で精製度の高い核酸を収量を低下させずに
回収することができ、特に、生物試料中に存在する核酸
成分の回収に好適な方法の提供、及び、大腸菌からのプ
ラスミドＤＮＡの回収に好適な方法が提供できた。
の迅速、簡便で精製度の高い核酸を収量を低下させずに
回収することができ、特に、生物試料中に存在する核酸
成分の回収に好適な方法の提供、及び、大腸菌からのプ
ラスミドＤＮＡの回収に好適な方法が提供できた。
【図１】本発明による核酸の回収を行うためのフローチ
ャートである。
ャートである。
【図２】本発明の効果を表すための図である。
【図３】本発明による核酸の回収率を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 保田 健二 茨城県ひたちなか市大字市毛882番地 株 式会社日立製作所計測器グループ内 (72)発明者 福薗 真一 茨城県ひたちなか市大字市毛882番地 株 式会社日立製作所計測器グループ内 Ｆターム(参考） 2G045 AA39 BB02 BB12 BB15 BB52 DA12 DA13 DA14 FB15 HA06 4B063 QA01 QQ42 QQ89 QR32
Claims (5)
- 【請求項１】 核酸を含有する材料からの核酸の回収方
法において、核酸含有材料から核酸の遊離を促すための
第１工程、遊離した核酸と核酸の固相への結合を促進す
る物質を混合する第２工程、混合液と核酸結合性固相と
を酸性条件下で接触させる第３工程、固相と液体とを分
離する第４工程、核酸が結合した固相を塩を含む酸性溶
液により洗浄する第５工程、核酸を固相からアルカリ性
条件下で溶離する第６工程を有し、前記固相がシリカを
含有する物質であり、第３工程における溶液のpHが６以
下であることを特徴とする核酸の回収方法。 - 【請求項２】 第３工程における溶液のpHを維持するた
めに、酸性溶液でpH緩衝能力を持つ物質を使用すること
を特徴とする請求項１に記載の核酸の回収方法。 - 【請求項３】 第６工程における溶液のpHが８以上であ
ることを特徴とする請求項１に記載の核酸の回収方法。 - 【請求項４】 第６工程における溶液のpHを維持するた
めに、アルカリ性溶液でpH緩衝能力を持つ物質を使用す
ることを特徴とする請求項３に記載の核酸の回収方法。 - 【請求項５】 核酸含有材料から核酸の遊離を促すため
の第１工程、遊離した核酸と核酸の固相への結合を促進
する物質を混合する第２工程、混合液と核酸結合性固相
とを酸性条件下で接触させる第３工程、固相と液体とを
分離する第４工程、核酸が結合した固相を塩を含む酸性
溶液により洗浄する第５工程、核酸を固相からアルカリ
性条件下で溶離する第６工程を行うための試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26320399A JP2001083050A (ja) | 1999-09-17 | 1999-09-17 | 核酸の回収方法及び試薬キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26320399A JP2001083050A (ja) | 1999-09-17 | 1999-09-17 | 核酸の回収方法及び試薬キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001083050A true JP2001083050A (ja) | 2001-03-30 |
Family
ID=17386222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26320399A Pending JP2001083050A (ja) | 1999-09-17 | 1999-09-17 | 核酸の回収方法及び試薬キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001083050A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003089929A1 (en) * | 2002-04-22 | 2003-10-30 | Hokuto Scientific Industry, Co., Ltd. | Device, method, and kit for gene detection |
-
1999
- 1999-09-17 JP JP26320399A patent/JP2001083050A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003089929A1 (en) * | 2002-04-22 | 2003-10-30 | Hokuto Scientific Industry, Co., Ltd. | Device, method, and kit for gene detection |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040330 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040531 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040907 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041108 |
|
| A911 | Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20041228 |
|
| A912 | Removal of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20050225 |