JP2001061498A - 還元型補酵素溶液 - Google Patents
還元型補酵素溶液Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明は、長期間にわたり保存安定な還元型補
酵素溶液を提供することを目的とする。 【解決手段】本発明の還元型補酵素溶液は活性酸素除去
物質を含むことにより目的を達成することを特徴とす
る。
酵素溶液を提供することを目的とする。 【解決手段】本発明の還元型補酵素溶液は活性酸素除去
物質を含むことにより目的を達成することを特徴とす
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、還元型補酵素溶液
の保存安定化に関する。本発明は活性酸素除去物質であ
るスーパーオキシドジスムターゼおよび／またはカタラ
ーゼを含み、溶液状であることを特徴とする。本発明は
さらに、活性酸素除去物質を含み、還元型補酵素の保存
安定化方法に関する。本発明は、活性酸素除去物質を含
む還元型補酵素溶液を用いて、試料に含まれる成分の測
定する方法および試薬に関する。
の保存安定化に関する。本発明は活性酸素除去物質であ
るスーパーオキシドジスムターゼおよび／またはカタラ
ーゼを含み、溶液状であることを特徴とする。本発明は
さらに、活性酸素除去物質を含み、還元型補酵素の保存
安定化方法に関する。本発明は、活性酸素除去物質を含
む還元型補酵素溶液を用いて、試料に含まれる成分の測
定する方法および試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】かっては、多くの臨床検査用測定液状試
薬が不安定な酵素や基質などを使用し、それらの安定化
を考慮して凍結乾燥品として供給されていた。近年、多
忙な臨床検査業務の現場で、凍結乾燥した粉末状の測定
試薬を使用の都度溶液に溶かす作業を回避し、使いやす
い試薬として、溶液状態でそのまま使える安定な液状試
薬が開発され数多く市販されている。しかし、液状の試
薬は凍結乾燥された試薬と比べて保存安定性の確保が困
難であり、更なる安定化方法の出現が待ち望まれてい
る。
薬が不安定な酵素や基質などを使用し、それらの安定化
を考慮して凍結乾燥品として供給されていた。近年、多
忙な臨床検査業務の現場で、凍結乾燥した粉末状の測定
試薬を使用の都度溶液に溶かす作業を回避し、使いやす
い試薬として、溶液状態でそのまま使える安定な液状試
薬が開発され数多く市販されている。しかし、液状の試
薬は凍結乾燥された試薬と比べて保存安定性の確保が困
難であり、更なる安定化方法の出現が待ち望まれてい
る。
【０００３】臨床化学、生化学、食品化学、薬剤学およ
びその他の分野において、多種類の酵素的反応が分析上
の目的で使用されている。特に、臨床検査において多く
の血液、血清、血漿、体液および尿試料中の代謝産物お
よび酵素が、酵素的に測定、研究されている。例えば、
生体物質に含まれる成分のアスパラギン酸アミノトラン
スフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェ
ラーゼ（ＡＬＴ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、α−オ
キシ酪酸脱水素酵素（ＨＢＤ）、遊離脂肪酸（ＮＥＦ
Ａ）、尿素窒素（ＵＮ）、又はクレアチニン（ＣＲＥ）
などの物質は、各種疾病診断の重要な指標として、日常
的に測定されている項目である。前記成分の物質を測定
するための試薬は、共通する補酵素として還元型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、または
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
（ＮＡＤＰＨ）を含み、液状試薬を調製する場合には、
該ＮＡＤＨ、またはＮＡＤＰＨを溶液状で長期間安定的
に維持させる必要がある。
びその他の分野において、多種類の酵素的反応が分析上
の目的で使用されている。特に、臨床検査において多く
の血液、血清、血漿、体液および尿試料中の代謝産物お
よび酵素が、酵素的に測定、研究されている。例えば、
生体物質に含まれる成分のアスパラギン酸アミノトラン
スフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェ
ラーゼ（ＡＬＴ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、α−オ
キシ酪酸脱水素酵素（ＨＢＤ）、遊離脂肪酸（ＮＥＦ
Ａ）、尿素窒素（ＵＮ）、又はクレアチニン（ＣＲＥ）
などの物質は、各種疾病診断の重要な指標として、日常
的に測定されている項目である。前記成分の物質を測定
するための試薬は、共通する補酵素として還元型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、または
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
（ＮＡＤＰＨ）を含み、液状試薬を調製する場合には、
該ＮＡＤＨ、またはＮＡＤＰＨを溶液状で長期間安定的
に維持させる必要がある。
【０００４】酸化還元酵素に関与する補酵素の一つであ
るＮＡＤＨは、以下の式（１）：
るＮＡＤＨは、以下の式（１）：
【０００５】 で表される反応を行う。体内に最も多量に存在する補酵
素で、ＮＡＤＰＨが合成反応の還元剤として生体内で働
くのに対して、ＮＡＤＨは各種の基質を酸化しエネルギ
ーを得る意義を有する。また、上述の酸化還元反応は一
般に可逆的反応である。ＮＡＤＨはＡ３４０付近に吸収
極大（Ａ３３８ｎｍ，ｐＨ９．５のモル吸光係数ε６２
２０）をもつので、分光光度計のＡ３４０の吸光度変化
は種々の酵素活性の測定に応用されている。つまり、Ｎ
ＡＤＨからＮＡＤ+への変化によるＡ３４０ｎｍ値の減
少を測定する。体外診断薬では、この原理を利用した測
定が種々行われている。上述した式(１)の原理を用いて
測定を行う場合、還元型補酵素の安定性が、測定範囲お
よび試薬の使用期限に影響する。
素で、ＮＡＤＰＨが合成反応の還元剤として生体内で働
くのに対して、ＮＡＤＨは各種の基質を酸化しエネルギ
ーを得る意義を有する。また、上述の酸化還元反応は一
般に可逆的反応である。ＮＡＤＨはＡ３４０付近に吸収
極大（Ａ３３８ｎｍ，ｐＨ９．５のモル吸光係数ε６２
２０）をもつので、分光光度計のＡ３４０の吸光度変化
は種々の酵素活性の測定に応用されている。つまり、Ｎ
ＡＤＨからＮＡＤ+への変化によるＡ３４０ｎｍ値の減
少を測定する。体外診断薬では、この原理を利用した測
定が種々行われている。上述した式(１)の原理を用いて
測定を行う場合、還元型補酵素の安定性が、測定範囲お
よび試薬の使用期限に影響する。
【０００６】一般的に、例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸））
などの還元型補酵素を溶液状で保存する場合、アルカリ
条件の溶液中に保存することで、その安定性を向上させ
ていた。更に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの安定化法として、特定
の塩基（イミダゾールなどのアミン塩基や水酸化ナトリ
ウムなどの強塩基）を共存させる報告（特開昭５５−４
２５９９号公報）、ＥＤＴＡ等のキレート化剤とアジ化
ナトリウム等のアジ化物を添加する報告（特開昭５９−
８２３９８号）、ほう酸を添加する報告（特開昭６２−
１９８６９７号）、アルカリ金属又はアンモニウムビカ
ルボネート緩衝剤を共存させる報告（特開平４−２２９
１９２号）等がある。しかしながら、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
は、アルカリ条件の溶液中において安定であるものの、
共存する夾雑物質や緩衝液濃度、ｐＨの経時的変動など
種々の要因によって、緩慢ではあるが酸化される。保存
には、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少速度を考慮して、予めＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈの添加量を増量しておき、実際の測定時に所
望の反応に必要なＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量を確保し得るように
調製することも可能であるが、このような方法はコスト
の面で好ましくない。また、測定に使用する酵素によっ
ては、溶液の保存中に阻害物質の生成を引き起こし、さ
らに、ＮＡＤ（Ｐ）ＨのＡ３４０ｎｍにおける吸光度変
化を測定する試薬にとっても不都合である。また、試料
中の成分を測定する試薬には、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ以外にも
所望の反応をさせるために必要な酵素や基質、その他の
組成物も含まれている。当然、反応時の条件の至適維持
（ｐＨ領域など）や他の組成物の安定性を考慮する必要
があり、単にＮＡＤ（Ｐ）Ｈに対してのみの至適な安定
化法に注目すれば良いというものではない。
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸））
などの還元型補酵素を溶液状で保存する場合、アルカリ
条件の溶液中に保存することで、その安定性を向上させ
ていた。更に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの安定化法として、特定
の塩基（イミダゾールなどのアミン塩基や水酸化ナトリ
ウムなどの強塩基）を共存させる報告（特開昭５５−４
２５９９号公報）、ＥＤＴＡ等のキレート化剤とアジ化
ナトリウム等のアジ化物を添加する報告（特開昭５９−
８２３９８号）、ほう酸を添加する報告（特開昭６２−
１９８６９７号）、アルカリ金属又はアンモニウムビカ
ルボネート緩衝剤を共存させる報告（特開平４−２２９
１９２号）等がある。しかしながら、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
は、アルカリ条件の溶液中において安定であるものの、
共存する夾雑物質や緩衝液濃度、ｐＨの経時的変動など
種々の要因によって、緩慢ではあるが酸化される。保存
には、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少速度を考慮して、予めＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈの添加量を増量しておき、実際の測定時に所
望の反応に必要なＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量を確保し得るように
調製することも可能であるが、このような方法はコスト
の面で好ましくない。また、測定に使用する酵素によっ
ては、溶液の保存中に阻害物質の生成を引き起こし、さ
らに、ＮＡＤ（Ｐ）ＨのＡ３４０ｎｍにおける吸光度変
化を測定する試薬にとっても不都合である。また、試料
中の成分を測定する試薬には、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ以外にも
所望の反応をさせるために必要な酵素や基質、その他の
組成物も含まれている。当然、反応時の条件の至適維持
（ｐＨ領域など）や他の組成物の安定性を考慮する必要
があり、単にＮＡＤ（Ｐ）Ｈに対してのみの至適な安定
化法に注目すれば良いというものではない。
【０００７】前述の従来の安定化方法は、特に溶液状態
における還元型補酵素の長期にわたる安定性が不十分で
あり、この条件で得られる安定性には限界があり、求め
られている安定性、特に、溶液状でかつ長期間、保存安
定性に適したものが得られていなかった。
における還元型補酵素の長期にわたる安定性が不十分で
あり、この条件で得られる安定性には限界があり、求め
られている安定性、特に、溶液状でかつ長期間、保存安
定性に適したものが得られていなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、活性酸素除
去物質を含むことにより、還元型補酵素が溶液の状態で
長期間にわたり保存安定な溶液試薬および方法を提供す
る。また、本発明の前記試薬を用いて、試料に含まれる
成分を測定する試薬および方法をも提供する。
去物質を含むことにより、還元型補酵素が溶液の状態で
長期間にわたり保存安定な溶液試薬および方法を提供す
る。また、本発明の前記試薬を用いて、試料に含まれる
成分を測定する試薬および方法をも提供する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記従来
の問題解決のために鋭意研究の努めた結果、活性酸素除
去物質が、溶液中の還元型補酵素のを高い保存性で長期
間維持することを見いだした。これは、補酵素の酸化還
元反応を利用した物質の測定系にも、本発明の試薬を採
用することが可能であることをも見出し、本発明を完成
するに至った。即ち、本発明は、還元型補酵素が長期
間、保存安定な溶液として、活性酸素除去物質を使用す
ることを特徴とする。本発明の還元型補酵素溶液は、一
態様において、活性酸素除去物質がスーパーオキシドジ
スムターゼおよび／またはカタラーゼである。本発明の
還元型補酵素溶液は、一態様において、還元型補酵素が
ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨである。また、活性
酸素除去物質を用いて還元型補酵素を溶液状で長期間、
保存安定化する方法を提供する。
の問題解決のために鋭意研究の努めた結果、活性酸素除
去物質が、溶液中の還元型補酵素のを高い保存性で長期
間維持することを見いだした。これは、補酵素の酸化還
元反応を利用した物質の測定系にも、本発明の試薬を採
用することが可能であることをも見出し、本発明を完成
するに至った。即ち、本発明は、還元型補酵素が長期
間、保存安定な溶液として、活性酸素除去物質を使用す
ることを特徴とする。本発明の還元型補酵素溶液は、一
態様において、活性酸素除去物質がスーパーオキシドジ
スムターゼおよび／またはカタラーゼである。本発明の
還元型補酵素溶液は、一態様において、還元型補酵素が
ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨである。また、活性
酸素除去物質を用いて還元型補酵素を溶液状で長期間、
保存安定化する方法を提供する。
【００１０】さらに、本発明の前記試薬を用いて、生体
物質に含まれる成分を測定する試薬および方法に関す
る。
物質に含まれる成分を測定する試薬および方法に関す
る。
【００１１】還元型補酵素溶液 本発明の対象となる還元型補酵素は、限定されるわけで
はないが、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＡＰＡＤＨ（還元型
３−アセチルピリジン−アデニンジヌクレオチド）、Ａ
ＰＡＤＰＨ（還元型３−アセチルピリジン−アデニンジ
ヌクレオチドリン酸）などが含まれる。本還元型補酵素
の保存中および／または反応中の安定性を保持するた
め、アルカリ性、好ましくはｐＨ８〜１１、より好まし
くはｐＨ９〜１０であり、なおかつ、活性酸素除去物質
を含んでなることが、少なくとも必要である。本試薬の
アルカリ性を保持するため、炭酸水素ナトリウム、炭酸
ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
等の緩衝液を含むことが望ましい。緩衝液の濃度として
は、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
の場合、５ｍＭ〜５０ｍＭの濃度で含めばよい。
はないが、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＡＰＡＤＨ（還元型
３−アセチルピリジン−アデニンジヌクレオチド）、Ａ
ＰＡＤＰＨ（還元型３−アセチルピリジン−アデニンジ
ヌクレオチドリン酸）などが含まれる。本還元型補酵素
の保存中および／または反応中の安定性を保持するた
め、アルカリ性、好ましくはｐＨ８〜１１、より好まし
くはｐＨ９〜１０であり、なおかつ、活性酸素除去物質
を含んでなることが、少なくとも必要である。本試薬の
アルカリ性を保持するため、炭酸水素ナトリウム、炭酸
ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
等の緩衝液を含むことが望ましい。緩衝液の濃度として
は、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
の場合、５ｍＭ〜５０ｍＭの濃度で含めばよい。
【００１２】一般に活性酸素除去物質とは、活性酸素で
あるスーパーオキシド（Ｏ2 -）、過酸化水素（Ｈ
2Ｏ2）、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）および１重項
酸素（１Ｏ 2）の酸素種などを除去する物質であれば限
定されない。例えば、スーパーオキシドジスムターゼ、
カタラーゼ、シトクロムC、ラクトペルオキシダーゼ、
Ｄ−マンニトール、トリプトファン、α−トコフェロー
ル、アスコルビン酸などがあげられ、単独もしくは、２
種以上の組み合せで行ってもよく、添加濃度は適宜選択
し用いればよい。
あるスーパーオキシド（Ｏ2 -）、過酸化水素（Ｈ
2Ｏ2）、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）および１重項
酸素（１Ｏ 2）の酸素種などを除去する物質であれば限
定されない。例えば、スーパーオキシドジスムターゼ、
カタラーゼ、シトクロムC、ラクトペルオキシダーゼ、
Ｄ−マンニトール、トリプトファン、α−トコフェロー
ル、アスコルビン酸などがあげられ、単独もしくは、２
種以上の組み合せで行ってもよく、添加濃度は適宜選択
し用いればよい。
【００１３】本発明の活性酸素除去物質の一つであるス
ーパーオキシドジスムターゼは、超酸化物不均化酵素と
も呼ばれ、以下の式（２）：
ーパーオキシドジスムターゼは、超酸化物不均化酵素と
も呼ばれ、以下の式（２）：
【００１４】 で表されるスーパーオキシドアニオンラジカル
（Ｏ2 ・ -）の不均化反応を触媒する酵素であり、酵素番
号１.１５.１.１が挙げられる。好気性生物に広く存在
し、ある種の通性嫌気性生物および偏性嫌気性生物に見
出されている。活性中心に銅と亜鉛を含む酵素、マンガ
ンを含む酵素、鉄を含む酵素の3種類が知られている。
本発明のスーパーオキシドジスムターゼは、限定される
わけではないが、上述の細胞より公知の方法によって、
抽出、精製することができ、また、遺伝子工学によって
得られた組換え型酵素であっても良い。また、０．０５
Ｕ／ｍｌ以上で活性酸素を除去する効果があり、特に
０．１〜３０Ｕ／ｍｌが好ましい。
（Ｏ2 ・ -）の不均化反応を触媒する酵素であり、酵素番
号１.１５.１.１が挙げられる。好気性生物に広く存在
し、ある種の通性嫌気性生物および偏性嫌気性生物に見
出されている。活性中心に銅と亜鉛を含む酵素、マンガ
ンを含む酵素、鉄を含む酵素の3種類が知られている。
本発明のスーパーオキシドジスムターゼは、限定される
わけではないが、上述の細胞より公知の方法によって、
抽出、精製することができ、また、遺伝子工学によって
得られた組換え型酵素であっても良い。また、０．０５
Ｕ／ｍｌ以上で活性酸素を除去する効果があり、特に
０．１〜３０Ｕ／ｍｌが好ましい。
【００１５】本発明の活性酸素除去物質の一つであるカ
タラーゼは、以下の式（３）：
タラーゼは、以下の式（３）：
【００１６】 で表される過酸化水素の分解反応を触媒する酵素であ
り、酵素番号１.１１.１.６が挙げられる。動物、植
物、微生物の好気的細胞に広く分布している。本発明の
カタラーゼは、限定されるわけではないが、上述の細胞
より公知の方法によって、抽出、精製することができ、
また、遺伝子工学によって得られた組換え型酵素であっ
ても良い。また、０．０５Ｕ／ｍｌ以上で活性酸素を除
去する効果があり、特に０．１〜１０Ｕ／ｍｌが好まし
い。本カタラーゼを用いる場合、上述したスーパーオキ
シドジスムターゼと併用することがより好ましい。
り、酵素番号１.１１.１.６が挙げられる。動物、植
物、微生物の好気的細胞に広く分布している。本発明の
カタラーゼは、限定されるわけではないが、上述の細胞
より公知の方法によって、抽出、精製することができ、
また、遺伝子工学によって得られた組換え型酵素であっ
ても良い。また、０．０５Ｕ／ｍｌ以上で活性酸素を除
去する効果があり、特に０．１〜１０Ｕ／ｍｌが好まし
い。本カタラーゼを用いる場合、上述したスーパーオキ
シドジスムターゼと併用することがより好ましい。
【００１７】還元型補酵素の安定化方法 本発明は、還元型補酵素溶液において、この活性酸素除
去物質含むものである。より詳細には、先ず、還元型補
酵素溶液中に存在する活性酸素を、活性酸素除去物質を
添加、反応させ活性酸素を除去せしめる方法に関する。
例えば、先ず、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含むトリスバッファー
（ｐＨ９．２）に、アラニン、アジ化ナトリウムおよび
乳酸脱水素酵素を溶解し、スーパーオキシドジスムター
ゼおよび／またはカタラーゼを別々に任意の順序で、ま
たは同時に作用させることにより活性酸素を除去する方
法をも提供する。
去物質含むものである。より詳細には、先ず、還元型補
酵素溶液中に存在する活性酸素を、活性酸素除去物質を
添加、反応させ活性酸素を除去せしめる方法に関する。
例えば、先ず、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含むトリスバッファー
（ｐＨ９．２）に、アラニン、アジ化ナトリウムおよび
乳酸脱水素酵素を溶解し、スーパーオキシドジスムター
ゼおよび／またはカタラーゼを別々に任意の順序で、ま
たは同時に作用させることにより活性酸素を除去する方
法をも提供する。
【００１８】還元型補酵素溶液を使用する測定方法 本発明の還元型補酵素溶液を用いた、試料に含まれる成
分の測定液状試薬の組成については、特に限定されない
が、脱水素酵素等の各種成分は、測定系に応じて選択す
ることが可能である。このような組合せとしては、例え
ば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、イソクエン酸
脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、アラニンアミノ
基転移酵素（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノ基転移酵
素（ＡＳＴ）などの酵素を用いた測定液状試薬において
も汎用可能である。具体的な添加量、基質、その他の組
成については、使用する個々の測定系に応じて適宜選択
することが可能である。本発明の液状試薬はさらに、液
状試薬中に活性酸素除去物質を含む還元型補酵素溶液と
その他の物質が含まれていればよく、添加時期は限定さ
れない。
分の測定液状試薬の組成については、特に限定されない
が、脱水素酵素等の各種成分は、測定系に応じて選択す
ることが可能である。このような組合せとしては、例え
ば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、イソクエン酸
脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、アラニンアミノ
基転移酵素（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノ基転移酵
素（ＡＳＴ）などの酵素を用いた測定液状試薬において
も汎用可能である。具体的な添加量、基質、その他の組
成については、使用する個々の測定系に応じて適宜選択
することが可能である。本発明の液状試薬はさらに、液
状試薬中に活性酸素除去物質を含む還元型補酵素溶液と
その他の物質が含まれていればよく、添加時期は限定さ
れない。
【００１９】本発明における試料とは、特に限定される
ものではないが、例えば、生体試料の血液、血清、血
漿、尿、髄液、細胞若しくは組織抽出液、唾液、汗に存
在する臨床検査の対象となる任意の物質で、例えば、各
種の酵素を意味し、アスパラギン酸アミノ基転移酵素、
アラニンアミノ基転移酵素、乳酸脱水素酵素、α−オキ
シ酪酸脱水素酵素、遊離脂肪酸、尿素窒素、またはクレ
アチニンなどを挙げることができる。
ものではないが、例えば、生体試料の血液、血清、血
漿、尿、髄液、細胞若しくは組織抽出液、唾液、汗に存
在する臨床検査の対象となる任意の物質で、例えば、各
種の酵素を意味し、アスパラギン酸アミノ基転移酵素、
アラニンアミノ基転移酵素、乳酸脱水素酵素、α−オキ
シ酪酸脱水素酵素、遊離脂肪酸、尿素窒素、またはクレ
アチニンなどを挙げることができる。
【００２０】本発明の一態様として、例えば、ＡＬＴを
用いた測定については、一般に用いられている方法によ
ればよく限定されないが、例えば、ＪＳＣＣ勧告法に準
拠すれば、スーパーオキシドジスムターゼ、ＮＡＤＨ、
乳酸脱水素酵素、Ｌ−アラニン、カタラーゼおよびトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ９．２，３０℃）からなる試薬１を
２．４ｍｌに血清０．３ｍｌを添加混合した後、３０℃
で８分間保温する。該混合溶液に２−オキソグルタル
酸、Ｌ−アラニンを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ３．
５，３０℃）の試薬２を０．３ｍｌ添加混合した後、３
０℃で１分間反応する。３０℃で２分間Ａ３４０ｎｍの
吸光度を測定する。
用いた測定については、一般に用いられている方法によ
ればよく限定されないが、例えば、ＪＳＣＣ勧告法に準
拠すれば、スーパーオキシドジスムターゼ、ＮＡＤＨ、
乳酸脱水素酵素、Ｌ−アラニン、カタラーゼおよびトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ９．２，３０℃）からなる試薬１を
２．４ｍｌに血清０．３ｍｌを添加混合した後、３０℃
で８分間保温する。該混合溶液に２−オキソグルタル
酸、Ｌ−アラニンを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ３．
５，３０℃）の試薬２を０．３ｍｌ添加混合した後、３
０℃で１分間反応する。３０℃で２分間Ａ３４０ｎｍの
吸光度を測定する。
【００２１】本発明の一態様として、例えば、ＡＳＴを
用いた測定については、一般に用いられている方法によ
ればよく限定されないが、例えば、ＪＳＣＣ勧告法に準
拠すれば、スーパーオキシドジスムターゼ、ＮＡＤＨ、
乳酸脱水素酵素、リンゴ酸脱脱水素酵素、Ｌ−アスパラ
ギン酸、カタラーゼおよびトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．
２，３０℃）からなる試薬１を２．４ｍｌに血清０．３
ｍｌを添加混合した後、３０℃で８分間保温する。該混
合溶液に２−オキソグルタル酸、Ｌ−アスパラギン酸を
含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ４．０，３０℃）の試薬２
０．３ｍｌを添加混合した後、３０℃で１分間反応す
る。３０℃で２分間Ａ３４０ｎｍの吸光度を測定する。
用いた測定については、一般に用いられている方法によ
ればよく限定されないが、例えば、ＪＳＣＣ勧告法に準
拠すれば、スーパーオキシドジスムターゼ、ＮＡＤＨ、
乳酸脱水素酵素、リンゴ酸脱脱水素酵素、Ｌ−アスパラ
ギン酸、カタラーゼおよびトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．
２，３０℃）からなる試薬１を２．４ｍｌに血清０．３
ｍｌを添加混合した後、３０℃で８分間保温する。該混
合溶液に２−オキソグルタル酸、Ｌ−アスパラギン酸を
含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ４．０，３０℃）の試薬２
０．３ｍｌを添加混合した後、３０℃で１分間反応す
る。３０℃で２分間Ａ３４０ｎｍの吸光度を測定する。
【００２２】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の技術的範囲を制限するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。
明するが、これらは本発明の技術的範囲を制限するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。
【００２３】
【実施例】実施例１ 還元型補酵素 ＮＡＤＨの安定化 還元型補酵素の一つであるＮＡＤＨを用い、以下に示す
組成の調製液を作成後、密封されたガラス容器に１０ｍ
ｌずつ分注し、以下の条件に従い、調製直後、１ヶ月
目、２ヶ月目、３ヶ月目に３４０ｎｍの吸光度を測定
し、還元型補酵素の保存安定性の試験を行った。本試験
は、調製直後の測定値を１００％として、各保存期間毎
の測定値の割合を算出し、還元型補酵素の残存率として
示した。コントロールは活性酸素除去物質を添加せず行
った。活性酸素除去物質を添加して行う場合は、スーパ
ーオキシドジスムターゼとカタラーゼを併用した場合
と、スーパーオキシドジスムターゼ単独でカタラーゼを
添加しない場合で行った。
組成の調製液を作成後、密封されたガラス容器に１０ｍ
ｌずつ分注し、以下の条件に従い、調製直後、１ヶ月
目、２ヶ月目、３ヶ月目に３４０ｎｍの吸光度を測定
し、還元型補酵素の保存安定性の試験を行った。本試験
は、調製直後の測定値を１００％として、各保存期間毎
の測定値の割合を算出し、還元型補酵素の残存率として
示した。コントロールは活性酸素除去物質を添加せず行
った。活性酸素除去物質を添加して行う場合は、スーパ
ーオキシドジスムターゼとカタラーゼを併用した場合
と、スーパーオキシドジスムターゼ単独でカタラーゼを
添加しない場合で行った。
【００２４】（組成） トリス塩酸緩衝液 ２０ｍＭ アラニン ５００ｍＭ アジ化ナトリウム ０．１％ 乳酸脱水素酵素 ０．２５Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＨ ０．２ｍＭ 活性酸素除去物質 スーパーオキシドジスムターゼ ３０Ｕ／ｍｌ カタラーゼ １．０Ｕ／ｍｌ
【００２５】（条件） 保存温度 ；１１℃ 測定波長 ；３４０ｎｍ 保存液ｐＨ ；９．２（３０℃） 活性単位は１分間あたり１μｍｏｌのＮＡＤ+生成量を
１単位と定めた。
１単位と定めた。
【００２６】結果を図１に示す。その結果、活性酸素除
去物質としてスーパーオキシドジスムターゼ、カタラー
ゼを用いた本発明の還元型補酵素溶液は、調整後、１１
℃で３ヶ月保存していてもＮＡＤＨの残存率が９０％代
であり、コントロールに比べ溶液状で保存安定であるこ
とが分った。
去物質としてスーパーオキシドジスムターゼ、カタラー
ゼを用いた本発明の還元型補酵素溶液は、調整後、１１
℃で３ヶ月保存していてもＮＡＤＨの残存率が９０％代
であり、コントロールに比べ溶液状で保存安定であるこ
とが分った。
【００２７】実施例２ 還元型補酵素溶液を使用したＡ
ＬＴ測定 還元型補酵素溶液を使用したＡＬＴ測定を行った。１２
００Ｕ／ＬのＡＬＴを１１段階に希釈後各々１５μｌ
を、あらかじめ２４０μｌの試薬１と１２０μｌの試薬
２を混合した溶液中に添加して、３７℃で反応後、ＡＬ
Ｔ活性を測定した。組成中の活性酸素除去物質として
は、スーパーオキシドジスムターゼとカタラーゼを併用
した場合と、スーパーオキシドジスムターゼ単独でカタ
ラーゼを添加しない場合で行った。
ＬＴ測定 還元型補酵素溶液を使用したＡＬＴ測定を行った。１２
００Ｕ／ＬのＡＬＴを１１段階に希釈後各々１５μｌ
を、あらかじめ２４０μｌの試薬１と１２０μｌの試薬
２を混合した溶液中に添加して、３７℃で反応後、ＡＬ
Ｔ活性を測定した。組成中の活性酸素除去物質として
は、スーパーオキシドジスムターゼとカタラーゼを併用
した場合と、スーパーオキシドジスムターゼ単独でカタ
ラーゼを添加しない場合で行った。
【００２８】 （組成） 検体： ヒト由来ＡＬＴ精製品（Ａａｌｔｏ社製） 試薬１： トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５，３０℃）１１１ｍＭ ＮＡＤＨ ０．２ｍＭ 乳酸脱水素酵素 ２５００Ｕ／Ｌ Ｌ−アラニン ６２５ｍＭ 活性酸素除去物質 スーパーオキシドジスムターゼ ３０Ｕ／ｍｌ カタラーゼ １．０Ｕ／ｍｌ
【００２９】 試薬２： トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５，３０℃）１１１ｍＭ ２−オキソグルタル酸 １５０ｍＭ
【００３０】結果を図２に示す。その結果、活性酸素除
去物質としてスーパーオキシドジスムターゼ、カタラー
ゼを用いた本発明の還元型補酵素溶液は、実際の測定系
に用いられるＡＬＴの測定には何ら影響を及ぼさないこ
とが分った。
去物質としてスーパーオキシドジスムターゼ、カタラー
ゼを用いた本発明の還元型補酵素溶液は、実際の測定系
に用いられるＡＬＴの測定には何ら影響を及ぼさないこ
とが分った。
【００３１】
【発明の効果】上記の通り、本発明の還元型補酵素溶液
は、活性酸素除去物質を含むことにより、還元型補酵素
の溶液中で高い安定性を長期間維持するとともに、その
測定に何ら影響を与えない試薬を提供することができ
る。
は、活性酸素除去物質を含むことにより、還元型補酵素
の溶液中で高い安定性を長期間維持するとともに、その
測定に何ら影響を与えない試薬を提供することができ
る。
【図１】 図１は、スーパーオキシドジスムターゼ、カ
タラーゼを含む、ＮＡＤＨの保存安定性を示す。
タラーゼを含む、ＮＡＤＨの保存安定性を示す。
【図２】 図２は、スーパーオキシドジスムターゼ、カ
タラーゼを含む、ＡＬＴの測定結果を示す。
タラーゼを含む、ＡＬＴの測定結果を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ // Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/68 (72)発明者 岡 治 東京都板橋区小豆沢三丁目６番10号 オリ エンタル酵母工業株式会社 Ｆターム(参考） 2G045 BA01 BB32 BB52 BB54 DA20 4B050 CC07 KK11 KK13 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ26 QR02 QR04 QR41 QR42 QR65 QS08 QS20 QX01
Claims (9)
- 【請求項１】活性酸素除去物質を含む、還元型補酵素溶
液。 - 【請求項２】活性酸素除去物質がスーパーオキシドジス
ムターゼおよび／またはカタラーゼである、請求項１に
記載の還元型補酵素溶液。 - 【請求項３】還元型補酵素がＮＡＤＨおよび／またはＮ
ＡＤＰＨである、請求項１に記載の還元型補酵素溶液。 - 【請求項４】還元型補酵素を請求項１ないし２のいずれ
か１項に記載の活性酸素除去物質によって安定化する、
還元型補酵素溶液の安定化方法。 - 【請求項５】少なくとも還元型補酵素を用いる測定試薬
において、請求項１ないし２のいずれか１項に記載の活
性酸素除去物質を含む測定液状試薬。 - 【請求項６】アラニンアミノ基転移酵素測定液状試薬で
ある請求項５記載の測定液状試薬。 - 【請求項７】スーパーオキシドジスムターゼ、ＮＡＤ
Ｈ、乳酸脱水素酵素、Ｌ−アラニン、カタラーゼおよび
トリス塩酸緩衝液からなる請求項６記載のアラニンアミ
ノ基転移酵素測定液状試薬。 - 【請求項８】アスパラギン酸アミノ基転移酵素測定液状
試薬である請求項５記載の測定液状試薬。 - 【請求項９】スーパーオキシドジスムターゼ、ＮＡＤ
Ｈ、乳酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、Ｌ−アスパ
ラギン酸、カタラーゼおよびトリス塩酸緩衝液からなる
請求項７記載のアスパラギン酸アミノ基転移酵素測定液
状試薬。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24464399A JP2001061498A (ja) | 1999-08-31 | 1999-08-31 | 還元型補酵素溶液 |
| EP00118757A EP1083235A3 (en) | 1999-08-31 | 2000-08-30 | Reduced coenzyme solution |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24464399A JP2001061498A (ja) | 1999-08-31 | 1999-08-31 | 還元型補酵素溶液 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001061498A true JP2001061498A (ja) | 2001-03-13 |
Family
ID=17121809
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24464399A Pending JP2001061498A (ja) | 1999-08-31 | 1999-08-31 | 還元型補酵素溶液 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1083235A3 (ja) |
| JP (1) | JP2001061498A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006512320A (ja) * | 2002-11-19 | 2006-04-13 | ヌートロピア エアネールングスメディツィニッシェ フォーシューンクス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | Ｎａｄｈ／ｎａｄｐｈを含む組成物 |
| JP2007075032A (ja) * | 2005-09-15 | 2007-03-29 | Oriental Yeast Co Ltd | Ｄ−乳酸脱水素酵素 |
| US7879567B2 (en) | 2004-10-05 | 2011-02-01 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Method for stabilizing coenzyme and composition therefor |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3756832B2 (ja) | 2002-03-12 | 2006-03-15 | 株式会社三菱化学ヤトロン | アラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定試薬 |
| WO2004050099A1 (ja) * | 2002-12-03 | 2004-06-17 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェイトの安定化方法 |
| CN108845140A (zh) * | 2018-05-04 | 2018-11-20 | 湖北科技学院 | 丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4010076A (en) * | 1976-04-01 | 1977-03-01 | Corning Glass Works | Reactor for stabilized microbes having photometabolic activity |
| US5169758A (en) * | 1986-05-02 | 1992-12-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Stabilized, NAD(P)H-dependent, soluble nitrate reductase, a process for the preparation thereof and a reagent containing it |
| US5116728A (en) * | 1990-07-20 | 1992-05-26 | Em Diagnostic Systems, Incorporated | Reagents for co2 detection |
| US5801006A (en) * | 1997-02-04 | 1998-09-01 | Specialty Assays, Inc. | Use of NADPH and NADH analogs in the measurement of enzyme activities and metabolites |
-
1999
- 1999-08-31 JP JP24464399A patent/JP2001061498A/ja active Pending
-
2000
- 2000-08-30 EP EP00118757A patent/EP1083235A3/en not_active Withdrawn
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006512320A (ja) * | 2002-11-19 | 2006-04-13 | ヌートロピア エアネールングスメディツィニッシェ フォーシューンクス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | Ｎａｄｈ／ｎａｄｐｈを含む組成物 |
| JP2011144186A (ja) * | 2002-11-19 | 2011-07-28 | Nutropia Ernaehrungsmedizinische Forschungs Gmbh | Ｎａｄｈ／ｎａｄｐｈを含む組成物 |
| US7879567B2 (en) | 2004-10-05 | 2011-02-01 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Method for stabilizing coenzyme and composition therefor |
| US8026075B2 (en) | 2004-10-05 | 2011-09-27 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Method for stabilizing coenzyme and composition thereof |
| JP2007075032A (ja) * | 2005-09-15 | 2007-03-29 | Oriental Yeast Co Ltd | Ｄ−乳酸脱水素酵素 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1083235A2 (en) | 2001-03-14 |
| EP1083235A3 (en) | 2002-07-24 |
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