JP2000511904A - 核酸による電子移動 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は遷移金属錯体の如き酸化還元活性部分を有する核酸の選択的共有結合修飾を提供する。電子ドナー部分及び電子アクセプター部分が前もって決められた位置で核酸のリボース−ホスフェート主鎖に共有結合される。得られた錯体は非常に大きい距離にわたって極めて速い速度で電子を伝達することができる生物分子鋳型である一連の新規な誘導体に相当する。これらの錯体はバイオコンダクター及び光活性プローブの全く新しいクラスの使用を可能にする特異な構造上の特徴を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸による電子移動 本願は、1993年12月10日出願の米国出願第08/166,036号及び1996年６月７日出 願の米国出願第08/475,051号の一部継続出願である。 発明の分野 本発明は、核酸による電子移動に関する。更に詳細には、本発明は、新規な一 連のバイオマテリアルを生じるレドックス活性遷移金属錯体のような電子移動部 分による核酸の部位選択的修飾及びその製造及び使用方法に関する。本発明の新 規なバイオマテリアルは、バイオコンダクタや診断プローブとして用いられる。 発明の背景 本発明は、部分的には、核酸を遷移金属錯体のようなレドックス活性部分で部 位選択的に修飾する方法、その修飾した核酸、及びその使用に関する。その修飾 した核酸は、バイオコンダクタや光活性核酸プローブとして特に有用である。 個々の核酸配列の検出は、診断薬や分子生物学の研究の重要な手段である。遺 伝子プローブ分析は、現在、細菌やウイルスのような感染性微生物を同定する、 正常な遺伝子の発現をプローブしがん遺伝子のような突然変異遺伝子を同定する 、組織移植の前に組織を適合性について型別する、法医学用組織又は血液試料を 照合する、及び異なる種からの遺伝子の中の相同性を調べる、のに役割を果たし ている。 理想的には、遺伝子プローブ分析は、感受性があり、特異的でありかつ容易に 自動操作できなければならない（総説としてNickerson，Current Opinion，Biot echnology 4:48-51(1993)を参照されたい）。感受性に要求されるもの（即ち、 検出限界が小さい）は、研究者が分析前に個々の核酸反応を指数関数的に増幅す るポリメラーゼ連鎖反応(PCR)及び他の増幅技術の開発によってかなり改善され た（総説としてAbramsonら，Current Opinion，Biotechnology，4:41-47(1993) を参照されたい）。 対照的に、特異性については多くの現在利用できる遺伝子プローブ分析の問題 が依然として残っている。プローブと標的間の分子相補性の程度が、相互作用の 特異性を特定する。ハイブリッド形成媒体中のプローブ、標的と塩の濃度、反応 温度、及びプローブの長さの変動がプローブ／標的相互作用の特異性を変化又は 影響させる。 完全に相補性のある標的をミスマッチのある標的から区別することは限定した 状況下では可能であるが、反応条件の小さな変動がハイブリッド形成を変化させ るので伝統的な技術を用いると一般的には非常に難しい。標準ブローブによるミ スマッチ検出の新しい実験法としては、単一の点ミスマッチが連結反応を防止す るDNA結合分析及びミスマッチがプローブ切断の部位をつくるプローブ消化分析 が含まれる。 更に、遺伝子プローブ分析の自動操作については現在の技術が欠けている領域 が依然として残っている。その分析は、一般的には、標的配列に対する標識プロ ーブのハイブリッド形成に続いてハイブリッド形成されない遊離プローブの分離 に頼っている。その分離は、一般的には、ゲル電気泳動又は固相捕捉と標的DNA の洗浄によって達成され、一般的には容易に自動操作することはかなり難しい。 その分離工程の時間を要することが２つの異なる開発の道へ導いた。一方は、 高速、高処理自動電気泳動法と他の分離法の開発に関係する。他方は、非分離遺 伝子プローブ均一分析の開発に関係する。 例えば、ハイブリッド形成したプローブが塩基加水分解から保護されるので続 いての化学発光が可能である保護均一分析がジーン・プローブ社（カリフオルニ ア州サンディエゴ）によって開発された。(Okwumabuaら，Res．Microbiol．143: 183(1992))残念ながら、高バックグラウンド光子放出として既知の化学発光基質 に関するこの方法の依存は特異性が高くない。欧州特許出願第86116652.8号には 、均一検出計画としてドナープローブからアクセプタープローブへの非放射性エ ネルギー移動を用いる試みが記載されている。しかしながら、蛍光エネルギー移 動はプローブトポロジーとトポグラフィーの双方によって非常に影響され、DNA 標的自体が相当なエネルギークエンチングが可能であり、かなりの変動が生じる 。従って、特異的であり、標的ミスマッチを検出することが可能であり、配列同 定の自動システムに組込むことが可能であるDNAプローブが求められている。 上記のように、分子生物学は、伝統的な遺伝子プローブ分析の修飾又は標識オ リゴヌクレオチドにかなり頼っている(Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach．Gaitら，Ed.，IRL Press:オックスフォード，英国，1984;Oligonucl eotides & Analogue:A Practical Approach．Ed．F．Eckstein，Oxford Univers ity Press，1991)。結果として、現在適合させた核酸分子の合成にいくつかの方 法が存在する。核酸は問題の分子が共有結合しやすい官能基を勿論含まないので 、末端のリン酸塩か又は複素環塩基で化学修飾を可能にする方法が開発された（ Dreyerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1985，82:968）。 例えば、糖の2'又は3'位にアミノ基を含む共通のデオキシリボ又はリボヌクレ オチドの類縁体は確立された化学的手法を用いて製造される。(Imazawaら，J．O rg．Chem.，1979，44:2039;Imazawaら，J．Org．Chem.，43(15):3044(1978);Ver heydenら，J．Org．Chem．36(2):250(1971);Hobbsら，J．Org．Chem．42(4):714 (1977)参照)更に、オリゴヌクレオチドは2'-5'又は3'-5'ホスホアミド結合で合 成される(Beaucageら，Tetrahedron 49(10):1925(1992);Letsinger，J．Org．Ch em.，35:3800(1970);Sawai，Chem．Lett．805(1984);Oligonucleotide & Analog ues:A Practical Approach，F．Eckstein，Ed．Oxford University Press(1991) )。 核酸の修飾は次の一般的な理由:非放射性DNAマーカーを作成してプローブとし て働かせるため及び化学的に修飾したDNAを用いて部位特異的切断を得るために 行われた。 これを目的として、DNAがヌクレオチドを修飾することによりプローブとして 働くように標識され、二本鎖DNAのニック翻訳再合成において置換類縁体として 働く。化学的に修飾したヌクレオチドは、ビオチンのような免疫学的又は他の標 識の結合のための反応性部位を生じる。(Gilliamら，Anal．Biochem．157:199(1 986))他の例は、特定条件下でホトルミネセンスを生じるようにDNAに挿入するル テニウム誘導体を用いるものである。（Friedmanら，J．Am．Chem．Soc．112:49 60(1990)） 第２カテゴリーにおいては、DNA鎖の切断を引き起こすDNAに共有結合した化合 物の多くの例がある。例えば、1,10−フェナントロリンは、Cu²⁺及び3-メルカ プトプロピオン酸の存在下にポリdAオリゴヌクレオチドの切断を生じるリンカー によって一本鎖オリゴチミジレートに結合された(Francoisら，Biochemistry 27 :2272(1988))。同様の実験がEDTA¹-Fe(II)（二本鎖DNAについてと共に（Boutori nら，FEBS Lett．172:43-46(1986)）と三重らせんDNA(Strobesら，Science 249: 73(1990)の双方）、ポルフィリン-Fe(III)(Le Doanら，Biochemistry 25:6736-6 739(1986))、及び1,10−フェナントロリン-Cu(I)(Chenら，Proc．Natl．Acad．S ci USA，83:7147(1985))で行われ、全て通気溶液中還元剤の存在下にDNA鎖切断 が生じる。ポルフィリンを用いる同様の例により非常に特異な条件下でDNA鎖切 断、及びDNAの塩基酸化又は架橋が得られた(Le Doanら，Nucleic Acids Res．15 :8643(1987))。 他の研究は、複素環塩基の化学修飾に集中した。無機配位錯体，Fe-EDTAの修 飾した内部塩基への結合により過酸化水素の存在下にハイブリッド形成した後に DNAの切断が生じた(Dreyerら，Proc．Natl.Acad．Sci.USA 82:968(1985))。ルテ ニウム化合物はDNA10量体において内部塩基に巧みに結合し、DNAハイブリッド形 成能とルテニウム標識の分光特性が維持された(Telserら，J．Am．Chem．Soc．1 11:7221(1989))。他の実験は、２種の別個の分光標識を単一の二本鎖DNA分子に 巧みに付加したものである（Telserら，J．Am．Chem．Soc．111:7221(1989)）。 タンパク質やDNAにおける電子移動反応の研究は、長距離電子移動が可能なシ ステムを得るために調べられた。 これを目的として、気道における光合成タンパク質とタンパク質においてみら れるようなタンパク質−タンパク質複合体の分子内電子移動は、タンパク質内部 においてかなりの距離にわたって生物学的に有意な速度で起こることがわかった （Bowlerら，Progress in Inorganic Chemistry:Bioinorganic Chemistry，Vol ．38，Ed．Stephrn J．Lippard(1990)参照）。更に、遷移金属による金属酵素の 選択的修飾が達成され、そのシステムにおける電子移動をモニターする方法が開 発された。例えば、シトクロムｃのような電子移動タンパク質は、数個のヒスチ ジンでの結合とヘムFe²⁺から結合したRu³⁺までの測定した電子移動の速度によっ てルテニウムで修飾された。結果から、電子移動“トンネル”路が存在すること が 示される。(Baum，Chemical & Engineering News，Feb．22，1993，p．2023;Che ngら，J．Am．Chem．Soc．113:7056(1991)も参照されたい）関連の研究において は、酵素又はタンパク質のレドックス中心を外部溶媒との無差別反応から保護す る正常タンパク質の絶縁が、これらのシステムを絶縁体から導電体へ変換するた めに“ワイヤ”でつながれた(Heller，Acc．Chem．Res．23:128(1990))。 DNAマトリックスにおける光誘起電子移動が2,3報告されている。そのシステ ムにおいては、電子ドナーとアクセプターはDNAに共有結合されないがDNAにラン ダムに結合し、ドナー−アクセプターシステムの明白な解明と制御を難しくして いる。例えば、ある種の四級ジアゾ芳香族塩の強い蛍光はDNAへの挿入時に又は 個々のモノヌクレオチドへの曝露時に消え、DNA内では電子ドナープロセスを示 す。(Brrnら，J．Am．Chem．Soc．113:8153(1991)) 電子移動メカニズムを求める難しさの他の例は、光励起可能なルテニウム化合 物で行われた研究に見られる。初期の研究からはある種のルテニウム化合物がヌ クレオチド塩基にランダムに挿入するか又はらせん表面に結合することが示され た。（Puruggananら，Science 241:1645(1988)）最近の文献には、ある種のルテ ニウム化合物がDNAに挿入せず(Satyanarayanaら，Biochemistry 31(39):9319(19 92)、むしろDNAらせんの表面に非共有結合で結合することが示されている。 初期の実験においては、コバルト、クロム又はロジウム化合物のような種々の 電子アクセプター化合物がある種のDNA結合ルテニウム電子ドナー化合物に付加 された（Puraggananら，Science 241:1645(1988);Orellanaら，Photochem．Phot obiol．499:54(1991);Brunら，J．Am.Chem．Soc．113:8153(1991);Davis，Chem ．Biol．Interactions 62:45(1987);Tomaliaら，Acc.Chem．Res.，24:332(1991) ）。らせんに非共有結合でランダムに結合する種々の電子アクセプター化合物に 付加するときに、電子移動によって光励起状態の消光が検出された。消光の速度 は、個々の電子ドナーとアクセプター及び濃度の双方に依存し、二分子としての プロセスが示された。 １組の実験においては、動きやすい表面結合ドナーが挿入化合物より効率よく 電子移動を促進すると仮定され、DNAの糖−リン酸骨格、及びおそらくDNAの周囲 の溶媒媒体が電子輸送に重要な役割を果たすことが示されている。 （Puruggananら，Science 241:1645(1988)）他の研究においては、ドナーとアク セプターの移動度の速度及び局部的な濃度に依存することが強調され、主として らせん上のドナーとアクセプター種の局部的濃度の増大を容易にするDNAの役割 が与えられている。（上記Orellanaら） 他の実験においては、電子ドナーはDNAの塩基の重層にランダムに挿入され、 アクセプターはDNAの表面とランダムに結合されたことが報告された。電子移動 消光速度によりドナーとアクセプターの密接な接触が示され、そのシステムは塩 の媒体への付加により電子移動速度を増大する。(Fromhrzら，J．Am．Chem．Soc ．108:5361(1986)) これらの実験においては、非共有結合ドナーとアクセプターの電子移動速度は 全て遊離溶液中に見られるものより大きさが数桁小さい。 長距離電子移動システムの開発の重要な刺激は、合成集光性システムの生成で ある。現在までの研究から人工集光性システムがエネルギー移動錯体、エネルギ ー泳動錯体、電子移動抱く体及び電子泳動錯体を含むことが示されている（この 領域の局部的な総説として、Chemical & Engineering News，Mar．15，1993，p ．38-48を参照されたい）。２種類の分子:a)電子移動化合物を共有結合した炭化 水素、又は電子移動化合物を挿入した、部分的に挿入した又はらせん結合したDN Aのような長鎖有機分子、及びb)合成ポリマーが試みられた。 長鎖有機分子は、極めて剛直であるが開発を難しくする多くの要因によって影 響される。その要因としては、溶媒の極性と組成、ドナーとアクセプター基の配 向、及び電子移動化合物の分子への共有結合か又は会合の化学的特性が含まれる 。 許容しうるポリマー電子移動システムの生成は、利用できるポリマーが可撓性 すぎていくつかの移動様式が生じることから困難であった。十分に剛直なポリマ ーは、電子移動メカニズムを著しく妨害し、合成を非常に困難にすることがよく ある。 従って、十分に剛直であり、特定の間隔で電子移動化合物を共有結合しており 、合成が容易でありかつ電子移動メカニズムをあまり妨害しない電子移動システ ムの開発が人工集光性システムの開発に有効である。 結論として、ドナーとアクセプター間の潜在的な短距離で結合した電子ドナー とアクセプター対のランダムな分布と移動度、ドナーとアクセプターのゆるい、 恐らくは可逆的な結合、溶媒や幅広い推定上の電子経路に対する依存性の報告、 及び標準塩基対合を不可能にする挿入化合物のDNA構造の破壊は全てDNAマトリッ クスにおける長い範囲の電子移動のはっきりした制限として役に立つ。従って、 核酸構造の混乱が最小でありかつ塩基対の本来の能力を保持する電子ドナーとア クセプターの剛直な共有結合を生じる方法が望ましい。本発明は、新規なバイオ コンダクタや診断用プローブの開発を可能にするそのシステムを供給するのに役 に立つものである。 発明の要約 本発明は、核酸を特定の部位で遷移金属錯体のようなレドックス活性部分で選 択的に修飾することを提供する。電子ドナー及び／又は電子アクセプター部分は 、好ましくは核酸の所定の位置のリボース−リン酸骨格に沿って共有結合する。 得られた錯体は、非常に長い距離にわたって非常に速い速度で電子を移動させる ことが可能な生体分子の鋳型である新規な一連の誘導体を示す。その錯体は、完 全に新規な種類のバイオコンダクタや診断用プローブの使用を可能にするユニー クな構造上の特徴を有する。 従って、本発明は、多座配位ヌクレオシドであって、遷移金属の存在下又は不 在下に前記ヌクレオチドの2'又は3'位に共有結合した多座リガンドを含む、前記 ヌクレオチドを提供する。ホスホルアミダイト多座配位ヌクレオシドも提供され る。更に、固体支持体に共有結合したオリゴヌクレオチドが提供され、前記のオ リゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドは多座配位ヌクレオシドであ る。 更に、少なくとも１つの電子ドナー部分と少なくとも１つの電子アクセプター 部分を含む一本鎖核酸が提供される。電子ドナーとアクセプター部分は核酸に共 有結合し、電子移動部分の少なくとも１つは多座配位ヌクレオシドに結合する。 更に、共有結合した電子ドナー部分を少なくとも１つ含む第１一本鎖核酸及び 共有結合た電子アクセプター部分を少なくとも１つ含む第２一本鎖核酸を含む組 成物が提供される。電子ドナー部分とアクセプター部分の少なくとも１つは多座 ヌクレオシドに結合する。 更に、核酸試料における標的配列の検出方法であって、共有結合した電子ドナ ー部分を少なくとも１つと共有結合した電子アクセプター部分を少なくとも１つ 含む一本鎖核酸を標的配列に対してハイブリッド形成してハイブリッド形成錯体 を形成する工程を含む、前記方法が提供される。電子移動部分の少なくとも１つ は多座配位ヌクレオシドに結合する。次に、標的配列の検出が生じる。 更に、第１標的ドメイン及び該第１標的ドメインに隣接した第２標的ドメイン を含む核酸において標的配列を検出する方法が提供される。該方法は、共有結合 した電子ドナー部分を少なくとも１つ含む第１核酸を前記第１標的ドメインに対 してハイブリッド形成する工程及び共有結合した電子アクセプター部分を少なく とも１つ含む第２核酸を前記第２標的ドメインに対してハイブリッド形成する工 程を含む。電子移動部分の少なくとも１つは多座配位リボヌクレオシドに結合す る。 更に、共有結合した電子移動部分を含む核酸の製造方法であって、結合した遷 移金属があってもなくてもよい多座配位ヌクレオシドを核酸に組込む工程を含む 、前記方法が提供される。 図面の簡単な説明 図１は、一本鎖核酸についての電子ドナー(EDM)と電子アクセプター(EAM)部分 の可能な配向の全てを示す図である。 図２は、２つの隣接した一本鎖核酸についての電子移動部分EDMとEAMの可能な 配位を示す図である。これらの配向は、２つのプローブが介在配列によって分け られる場合にもあてはまる。 図３は、オリゴヌクレオチドへ組込まれる前の一連のアミノ修飾ヌクレオシド 前駆体を示す図である。 図4A及び図4Bは、電子移動部分を示す構造である。図4Aは、代表的な種類の電 子ドナーとアクセプターを示す一般式である。図4Bは、リガンドとしてビスビピ リジンとイミダゾールを用いたルテニウム電子移動部分を示す個々の例である。 図５は、様々な位置でリボース−リン酸骨格に結合した遷移金属を示す式であ る。Mは遷移金属である。M₁はリボースの2'炭素上のアミンに結合する。電子は 、重層塩基のπ軌道(“πウェイ”)に入るために４σ結合を進まなければならな い。 M₂とM₃は、ホスホルアミド型結合によって結合し、電子はπウェイに入るために 各々７σ結合を進まなければならない。M₄は、リボースの3'炭素上のアミンを介 して結合し、電子は５σ結合を進む。 図6A、図6B、図6C及び図6Dは、修飾したヌクレオシドの調製ポアガラス(CPG) への結合及び例示した電子移動部分としての遷移金属錯体の延長と結合による一 本鎖核酸の形成を示す図である。実験条件は実施例９に示す。図6Aは、調製ポア ガラス(CPG)へ誘導した2'−アミノ−2'−デオキシウリジンの形成を示す図であ る。2'−アミノ修飾ウリジンが示されているが、任意の塩基が用いられる。当該 技術において既知であるように、ホスホルアミダイトヌクレオシを誘導したヌク レオシドに付加した後、図6Bに一般的に示されるように一例としてのUCTCCTACAC 配列を用いてDMT保護基を除去する。DMT保護基を有する5'末端ホスホルアミダイ ト２−アミノ−デオキシウリジンを付加すると3'及び5'2'−アミノ修飾ヌクレオ シドを含む一本鎖核酸が得られる。図6Cは、２種のルテニウム遷移金属錯体、im (bpy)₂RuとRu(II)(NH₃)₄pyによって例示される電子移動種の付加を示す図である 。図6Dは、3'末端において2'−アミノ修飾ヌクレオシドで工程5'末端において多 座配位ヌクレオシドで修飾された一本鎖核酸の合成を示す図である。 図７は、多座リガンドをPNAのＣ末端に付加する図である。 図8A及び図8Bは、本発明のアミノ修飾核酸を電極に結合する図である。(A)は 、ガラス状炭素電極に結合する図である。(B)は、シラン反応を用いて本発明の アミノ修飾核酸を酸化表面に付加する図である。 図9A及び図9Bは、多座配位ヌクレオチドの合成を示す図である。図示されてい ないが好ましい合成はアルデヒドと共に含まれたBH₄の代わりにNaCNBH₄を１段合 成として用いる。還元は徐々に起こり、アミンとアルデヒドの反応は急速に起こ り、最終生成物の合成を可能にする。図9Bは、エタノール中過剰量のS-エチルト リフルオロチオアセテートとの反応を介したトリフルオロアセトアミドとしての 第二アミンの保護を示す図である。 詳細な説明 特にことわらない限り、“核酸”又は“オリゴヌクレオチド”又は文法上の同 義語は、共に共有結合した少なくとも２個のヌクレオチドを意味する。本発明の 核酸は、一般的にはホスホジエステル結合を含むが、下記に示されるようにある 場合には、例えば、ホスホルアミド(Beaucageら，Tetrahedron 49(10):1925(199 3)及びその中の参考文献;Letsinger，J．Org．Chem．35:3800(1970);Sprinzlら ，Eur．J．Biochem．81:579(1977);Letsingerら，Nucl．Acids Res．14:3487(19 86);Sawaiら，Chem．Lett．805(1984)，Letsingerら，J．Am．Chem．Soc．110:4 470(1988);Pauwelsら，Chemica Scripta 26:141(1986)）、ホスホロチオエート 、ホルホロジチオエート、O-メチルホスホロアミダイト結合（Eckstein，Oligon ucleotides & Analogues:A Practical Approach，Oxford University Press参照 ）、及びペプチド核酸骨格及び結合(Egholm，J．Am．Chem．Soc．114:1895(1992 );Meierら，Chem．Int．Ed．Engl．31:1008(1992);Nielsen，Nature，365:566(1 993);Carlssonら，Nature 380:207(1996)，これらの文献の記載は全て本願明細 書に含まれるものとする）を含む他の骨格をもつ核酸類縁体が含まれる。リボー ス−リン酸骨格の修飾は、電子移動部分の付加を容易にするために、又は生理的 条件においてかかる分子の安定性及び半減期を増大するために行われる。 ペプチド核酸(PNA)が特に好ましい。その骨格は、天然に存在する核酸の高度 に荷電したホスホジエステル骨格と対照的に中性条件下で実質的に非イオン性で ある。これにより２つの利点がもたらされる。まず第１にPNA骨格はハイブリッ ド形成速度論が改善される。PNAは、完全にマッチした塩基対と比較してミスマ ッチの融解温度(Tm)の変化が大きい。DNAやRNAは、内部ミスマッチのTmが典型的 には２〜４℃降下する。非イオン性PNA骨格においては、降下は７〜９℃に近い 。これにより、ミスマッチの検出がより可能になる。同様に、非イオン性である ために骨格に結合したハイブリッド形成が塩濃度に相対的に感受性でない。これ は、還元した塩ハイブリッド形成溶液が生理的塩溶液よりファラデー電流が小さ いので本発明のシステムに特に有利である(150mMの範囲で)。 核酸は、指定される一本鎖又は二本鎖であり、二本鎖又は一本鎖配列の双方の 一部を含むこともできる。核酸は、DNA、ゲノムとcDNAの双方、RNA又はハイブリ ッドとすることができ、デオキシリボとリボヌクレオチドの組合わせ、及びウラ シル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサタニン及びヒ ポキサタニン等を含む塩基の組合わせを含む。ある場合、例えば、“介在核酸” の場合には、核酸は１個以上のヌクレオシドを意味する。本明細書に用いられる “ヌクレオシド”はヌクレオチドを包含する。 “電子ドナー部分”、“電子アクセプター部分”、及び“電子移動部分”又は 文法上の同義語は、ある条件下で電子移動が可能な分子を意味する。電子ドナー 及びアクセプター能が相対的であることは理解される。即ち、ある実験条件下で 電子を供与する分子は別の条件下で電子を受容することができる。可能な電子ド ナー部分と電子アクセプター部分の数は非常に大きく、電子移動化合物の当業者 は本発明において多くの化合物を用いることができることは理解されるべきであ る。好ましい電子移動部分としては、遷移金属錯体、有機電子移動部分及び電極 が含まれるがこれらに限定されない。 好適実施態様においては、電子移動部分は遷移金属錯体である。遷移金属は、 原子が電子の不完全なｄ殻をもつものである。本発明に使用するのに適切な遷移 金属としては、カドミウム(Cd)、マグネシウム(Mg)、銅(Cu)、コバルト(Co)、パ ラジウム(Pd)、亜鉛(Zn)、鉄(Fe)、ルテニウム(Ru)、ロジウム(Rh)、オスミウム (Os)、レニウム(Re)、白金(pt)、スカンジウム(Sc)、チタン(Ti)、バナジウム(V )、クロム(Cr)、マンガン(Mn)、ニッケル(Ni)、モリブデン(Mo)、テクネチウム( Tc)、タングステン(W)及びイリジウム(Ir)が含まれるがこれらに限定されない。 即ち、第１に遷移金属系、白金金属(Ru、Rh、Pd、Os、Ir及びpt)がRe、W、Mo及 びTcと共に好ましい。ルテニウム、レニウム、オスミウム、白金及び鉄が特に好 ましい。 遷移金属は、当該技術において周知であるように様々なリガンドと錯体形成し て適切な遷移金属錯体を形成する。適切なリガンドとしては、-NH₂;ピリジン;ピ ラジン;イソニコチンアミド;イミダゾール;ビピリジン及びビピリジンの置換誘 導体;フェナントロリン、特に1,10−フェナントロリン（phenと略す）及び4,7− ジメチルフェナントロリンのようなフェナントロリンの置換誘導体;ジピリドフ ェナジン;1,4,5,8,9,12−ヘキサアザトリフェニレン(hatと略す);9,10−フェナ ントレンキノンジイミン;1,4,5,8−テトラアザフェナントレン(tapと略す);1,4, 8,11−テトラアザシクロテトラデカン;ジアミノピリジン(damp と略す);ポルフィリン及びポルフィリン系の置換誘導体が含まれるがこれらに限 定されない。用いられる代表的な種類のドナーとアクセプターである一般式を図 4Aに示す。R¹、R²、R³、R⁴及びR⁵は選定金属に共有結合することができる配位し ているリガンドであり、上記リガンドのいずれかが含まれる。好適実施態様にお いては、下で詳述されるように２個以上の配位原子がリボースに共有結合し、下 で一般的に記載されるように共有結合した多座リガンドを形成する。リガンドと してビスビピリジンとイミダゾールを用いるルテニウム電子移動種の構造を図4B に示す。有用な電子移動錯体の個々の例としては、表１に示されるものが挙げら れるがこれらに限定されない。 表１ ドナー アクセプター Ru(bpy)₂im-NH₂-U Ru(NH₃)₅-NH₂-U Ru(bpy)₂im-NH₂-U Ru(NH₃)₄py-NH₂-U Ru(bpy)₂im-NH₂-U Ru(NH₃)₄im-NH₂-U trans-Ru(cyclam)py 式中、Ru=ルテニウム bpy=ビスビピリジン im= イミダゾール py= ピリジン cyclam=1,4,8,11−テトラアザシクロテトラデカン 他の適切な部分としては、ビス(フェナントロリン)(ジピリドフェナジン)Ru(I I)([Ru(phen)₂dppz]⁺²と略す);ビス(9,10−フェントレンキノンジイミン)(フェ ナントロリン)Ru(III)、[Ru(phi)₂phenｒ]⁺³、トリス（フェナントロリン）Ru(I I)（[Ru(o-phen)₃]⁺²と略す）、Co(phen)₃ ⁺³、Co(bpy)₃ ⁺³、Rh(phen)₃ ⁺³、Ru(bp y)₂(dppz)⁺²及びRh(bpy)₃ ⁺²が含まれる。 電子移動部分が遷移金属錯体である場合、好適実施態様はリボースに共有結合 した遷移金属をキレート化するために２個以上の配位原子を用いる。多座リガン ドをリボースに共有結合することにより、２個以上の配位原子が得られる。 従って、好適実施態様においては、本発明は、多座配位ヌクレオシド及びそれ を含む核酸を提供する。 共有結合した配位原子を修飾したリボースに更に付加することにより、安定性 と遷移金属錯体のリボースへの結合が著しく増大する。これは多くの点で有益で ある。まず、リボースに結合した多座リガンドにより核酸のリボースへの金属の 強固な結合が得られる。これにより遷移金属錯体の一本鎖への選択的付加が可能 になる。例えば、核酸の一端に記載された2'及び3'アミノ修飾ヌクレオチドのよ うな単座リガンドを含むヌクレオチドをもう一端に二座又は多座リガンドを含む ヌクレオチドを組込むと、下で詳述される全部で４つの可能な組合わせを生じる ことなく一端に電子ドナー又はアクセプターの選択的付加が可能になり、続いて もう一端に他の電子移動部分の付加が可能になる。更に、多座リガンドのために 安定性と遷移金属錯体のヌクレオチドへの結合が増大したことにより、遷移金属 錯体をヌクレオチドへ結合した後に核酸に組込むことが可能になる。従って、遷 移金属錯体が結合した修飾ヌクレオチドが生成され、固相オリゴヌクレオチド合 成に加えられ、遷移金属電子移動部分をいずれかの位置に付加することが可能に なり、本発明の核酸の合成のしやすさがかなり高まる。これにより、例えば、２ つの異なる遷移金属錯体、即ち、電子ドナーと電子アクセプターを同じオリゴヌ クレオチドに伝統的な固体支持体合成を用いて組込むことが可能になる。 従って、本発明は、多座配位ヌクレオシドを形成するために多座リガンドが2' 位か又は3'位でリボースに結合したヌクレオシドを提供する。“多座リガンド” は、少なくとも２個の配位原子を含む遷移金属のリガンドである。多座リガンド は本明細書に示されるヌクレオシドに共有結合して下記構造１に示される一般構 造の多座ヌクレオシドを形成する。 R₁-(X-R₂)_nは多座リガンドであり、ｎは二座リガンドを形成する１から具体 的な遷移金属によって結合される配位原子の数までの範囲である。例えば、Ru、 Rh、Os、Fe、Reらの６個の配位原子を結合する金属の例においてはｎの上限が六 座リガンドを形成する６である。 Y₁及びY₂は、水素、ヒドロキシ、ホスホルアミダイト部分、保護基、又はホス ホジエステル結合又は多座配位リボースを3'か又は5'位で核酸に結合する類似結 合、例えば、ホスホルアミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、O- メチルホスホロアミダイト結合及びペプチド核酸骨格と結合である。Y₂は、また 、調製ポアガラス(CPG)又は当該技術において既知の他の高分子支持体のような 固体支持体である。 構造１におけるR基、R₁及びR₂は遷移金属の配位原子であり、一般的には独立 して窒素又は酸素であり、当該技術において既知であるように遷移金属に依存す る。例えば、Ru、Rh、Re、Os等については窒素配位原子が好ましく、Fe及びCoに ついては窒素と酸素の混合物が好ましい。Ｒ基は、第二アミンの場合の水素原子 のような原子が更に結合することができる。 Ｘは、遷移金属に結合するのに適切なコンホメーションにおいてＲ基を共有結 合するために働くアルキル又はアリールリンカー部分である。一般的には、Ｘは アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール 又はヘテロアリール部分とすることができる。Ｘ部分は選定した遷移金属の正し い配位形を多座リガンドに与えるように選ばれる。当業者に理解されるように、 種々のＸ部分が用いられる。例えば、Ru、Fe、Os、Re、Cr、Mn、Rh、Re等の八面 体の配位形を取る金属が選ばれやすい。 同様に、四角の平面形（即ち、Pt及びPd）又は四面体形（即ち、Ni）を取る遷 移金属に適切なＸ部分が選ばれる。 2'位に結合した二座リガンドを下記構造２に示すが、当業者に理解されるよう に3'位にも多座リガンドが結合することができる。 ２つのＲ基と共に結合するＸ部分は、Ｒ基の１つと縮合して下記構造３（実施 例に記載される）又は構造４に示される単環か又は多環式の環構造を形成するこ とができる。 同様に、ＸとＲ基はモルホリン、フェナントロリン、ビピリジン、カタコール 及び他のヘテロアリールを形成することができる。 好ましいＸ基としては、エチレン(-CH₂CH₂-)、ベンジル及び他の多芳香環、例 えば、アリールやヘテロアリールが含まれるがこれらに限定されない。 当業者に理解されるように、配位原子Ｒは更にＸ基を介して構造１のヌクレオ チドに付加されて三座、四座、五座又は六座リガンドを形成する。代表的な三座 リガンドを構造５に示す。配位原子の上限は、用いられる遷移金属に依存する。 例えば、本明細書において有用な遷移金属の多くは六座配位(Fe、Os、Ru、Rh、 Re等）であるので６配位原子まで結合することができる。 R₃は追加の配位原子である。X₂は追加のリンカー部分であり、X₁と同じでも異 なってもよい。構造５の多座リガンドの形と角度が正確でなく単に例示であるこ とは理解されるべきである。 結合した多座リガンドの構造は直鎖状、即ち、多座リガンドの一端だけが構造 において一般的に示されるようにリボースに結合してもよく、環構造、即ち、多 座リガンドとしてシッフ塩基、テトラアゾ又はポルフィリン構造を用いて多座リ ガンドの両端がリボースに結合される環構造を形成してもよい。 実施態様においては、下記構造６に示されるようにリボース上の2'と3'位双方 にアミノ基を含むヌクレオシドを用いて多座ヌクレオシドが形成される。 本明細書においては遷移金属と必要な追加のリガンドの存在しない構造が示さ れ、図4Aと図4Bも同様であるが、化合物としては下記構造７に示されるように金 属も追加のリガンドも含まれる（構造２に対応する）。 Ｌは、コリガンド、但し、金属イオンをキレート化する少なくとも１個の配位 原子である。当業者に理解されるように、コリガンドの数と種類は金属イオンの 配位数に依存する。単座、二座又は多座コリガンドが用いられる。例えば、金属 の配位数が６である場合、２個の配位原子がヌクレオシドに共有結合した二座リ ガンドによって占められ、４個の配位原子がコリガンドによって占められる。従 って、全てのコリガンドが単座配位である場合、m=4;コリガンドが二座配位であ る場合、m=2;又は２つの単座コリガンドと二座コリガンドの場合、m=3である。 適切なリガンドは上に示されている。 本明細書において構造は多座リボースがリボースの2'位で結合した多座リガン ドと共に示されている。当業者に理解されるように、多座リガンドはリボースが 核酸の3'末端にある場合に3'位に結合される。 好適実施態様においては、R₁配位原子は、2'又は3'炭素を介してリボース環に 直接結合する。他の実施態様においては、R₁の配位原子と炭素間に追加の原子が あるが、本明細書に示されるようにインターカレーションを防止するために短い ことが好ましい。従って、メチレン(-CH₂-)、エチレン(-CH₂CH₂-)、アセテン(-C HCH-)等が用いられる。 遷移金属錯体のほかに、他の有機電子ドナーとアクセプターが本発明に使用す るために核酸に共有結合される。その有機分子としては、リボフラビン、キサン テン染料、アジン染料、アクリジンオレンジ、N,N'−ジメチル−2,7−ジアザピ レニウムジクロリド(DAP²⁺)、メチルビオローケン、臭化エチジウム、キノン、 例えば、N,N'−ジメチルアントラ(2,1,9−def:6.5.10−d'e'f')ジイソキノリン ジクロリド(ADIQ²⁺);ポルフィリン([メソテトラキス(N−メチル−ｘ−ピリジニ ウム）ポルフィリンテトラクロリド]、バールアミンブルーＢ塩酸塩、ビンドシ ェドラーグリーン;2,6−ジクロロインドフェノール、2,6−ジブロモフェノール インドフェノール;ブリリアントクレジルブルー(3−アミノ−９−ジメチルアミ ノ−10−メチルフェノキシアジンクロリド)、メチレンブルー;ナイルブルーA(ア ミノアントジエチルアミノフェノキサジンスルフェート)、インジゴ−5,5',7,7' −テトラスルホン酸、インジゴ5,5',7-トリスルホン酸;フェノサフラニン、イン ジゴ−５−モノスルホン酸;サフラニンT;ビス（ジメチルグリオキシマト）塩化 鉄(II);インズリンスカーレット、ニュートラルレッド、及びその化合物の置換 誘導体が含まれるがそれらに限定されない。 実施態様においては、電子ドナーとアクセプターは、当該技術において既知の レドックスタンパク質である。しかしながら、多くの実施態様においてレドック スタンパク質は好ましくない。 特に好適な実施態様においては、電子移動部分は核酸が共有結合等で結合する 電極のような固体支持体を含む。即ち、電極は、下で詳述されるように電子ドナ ーか又はアクセプターとして働く。この実施態様に用いられる手法は、レドック スタンパク質ではなくて本発明の核酸が用いられる以外はタンパク質を電極にワ イヤリングすることに似ている（例えば、Greggら，J．Phys．Chem．95:5970(19 91);Hellerら，Sensors & Actuators R.，13-14:180(1993);Pishkoら，Anal.Che m.，63:2268(1991)を参照されたい）。 電極結合は、印加した電圧によって電子移動を開始するのに及び電子移動モニ タリングの電子的方法のために用いられる。 好適実施態様においては、電極と核酸間の電子輸送は間接的であり、電極と核 酸間の電子カップリングを与える溶液中に遊離するか又はゲル又はポリマーに埋 め込まれた電子輸送伝達物質を用いることができる。好適実施態様においては、 本発明の電子移動部分修飾核酸はそのようなマトリックスを介して結合される。 マトリックスの結合は、核酸遺伝子センサでの使用に対していくつかの利点があ る。ポリマーが３次元であることから、多数の修飾した核酸プローブが小さい面 積の電極に結合される。高度に多孔性の“ヒドロゲル”を用いると核酸のハイブ リッド形成速度が非常に高くなり、溶液中の核酸にほぼ匹敵する。 例えば、レドックス分子を共有結合したポリマーは非常に効果的な電子移動伝 達物質としてふるまう。フェロセン分子で修飾したシロキサンとエチレンオキシ ドポリマーは、酵素と電極間の電子移動を示した。例えば、フェロセン又はOs(b py)₂に共有結合した可撓性シロキサンとエチレンオキシドポリマーは、いくつか の酵素から電極へ電子移動を仲介する非常に効果的なレドックスポリマーである ことがわかった。(Boguslavskyら，Solid State Ionics，V.60，p.189(1993)参 照)同様に、レドックス導電性エポキシセメントが調製された（Hellarら，J．Ph ys．Chem.，95:5970(1991)参照）。電流滴定バイオセンサ用の架橋レドックスゲ ルは電極に接続したグルコースオキシダーゼを用いて調製され、電子が酵素から ポリマーを介して電極へ流動することがわかった(Hellar，A.ら，Anal．Chem.， 62，258(1990)参照)。 この実施態様においては、Os(bby)₂Clのポリ（ビニルピリジン）錯体ようなレ ドックスポリマーがジエポキシドのようなエポキシドで架橋されて金、ガラス質 の炭素、グラファイトや他の導電物質のような導電物質でつくられた電極に強力 に結合することができるレドックス導電性エポキシセメントを形成することが好 ましい。この強力な結合は、この実施態様のための“共有結合”の定義に含まれ る。次に、エポキシ架橋ポリマーを上記のアミノ修飾核酸のアミンのようなむき だしのアミンと反応させ、核酸と錯体を共有結合し、電極の表面上に“レドック スヒドロゲル”を形成する。 類似の方法においては、レドックス酵素又は伝達物質が化学的に修飾したDNA に置き換えられ、遷移金属修飾DNA部分から結合レドックス導電性ポリマーを介 して電極への電子移動プロセスの結果が見られる。 適切な伝達物質は、可溶性フェロセン／フェリシニウム、ヒドロキノン／キノ ン、有機塩の還元できる成分及び酸化できる成分、コバルトセン、モリブデン、 タングステン及び鉄のヘキサ及びオクタシアニドが含まれる。更に、Co(エチレ ンジアミン)₃及びRu(エチレンジアミン)₃及びCo、Ru、Fe及びOsのような遷移金 属のトリスビピリジルとヘキサミンの錯体を含むコバルト、ルテニウム及びニッ ケルのような遷移金属のマクロサイクルやキレート化リガンドが用いられる（上 記Alyanasundaramを参照されたい）。 好適実施態様においては、電極と核酸間の電子輸送は、共有結合を介して直接 することができる。そのシステムの利点は、DNAプローブの配向が電極上でプロ ーブが逆に曲がることを減少させるように影響することである。また、印加電圧 と測定電流の正確な制御がゲルやポリマーと比べて短い共有結合と関連がある。 好適実施態様においては、レドックスポリマーでのように高度に導電性でなけ ればならない(Hellar，A．Acc．Chem．Res．Vol．23．p．128，1990)。また、導 電性が不十分である場合には結合の長さを短くしておかなければならない。従っ て、好適実施態様の電子は約５σ結合を超えず、３σ結合を超えないことが特に 好ましい。感受性のあるグルコースオキシダーゼ酵素系バイオセンサを含む種々 の化学センサにおいてカーボンペーストやガラス状炭素棒が電極として信頼でき 効果的であり、本発明に用いられる。更に、フェロセン又はOs(bpy)₂分子に共有 結合した可撓性シロキサンやエチレンオキシドエチレンポリマーがいくつかの酵 素から電極までの電子移動を仲介する非常に効果的なレドックスポリマーである ことがわかった。アミノリボース修飾核酸は、文献の方法を変更することにより 炭素電極に結合される。更に、核酸は、既知のカルボジイミドとN-ヒドロキシス クシンイミド化学を用いてグアノシン残基を介して酸化炭素電極により直接的に 結合される。 好適実施態様においては、ガラス状炭素電極(GCE)が用いられる。この実施態 様においては、リボースの2'又は3'炭素上の上記のようなアミン基が結合に用い られる。反応は、アミンとGCE表面のとがった面の間で化学的に安定な共有結合 を形成するカチオンラジカルに対するアミン基の酸化によって進行する（Deinha mmer,R，ら，Langmuir 10:1306(1994)参照）。この合成方法は、Ｘ線光電子分光 法及びボルタンメトリーを用いて十分に確認された。この化学を用いる収量は非 常に高く、約１×10¹⁰分子/cm²である。アミン化合物は炭素表面に安定な結合を 生じ、立体作用が結合効率に影響する。第一アミンの反応性は、第二アミンより かなり高く、第三アミンの結合は全く見られない。 前述のアミノ修飾（第一アミン基）オリゴヌクレオチドを用いて、アミン含有 溶液中で電気化学処理用GCEを調製するDeinhammer，R.らにより開発された手順 を図8Aに示す。 更に、水溶性カルボジイミドを用いてGCEに固定した(Mikkelsenら，Electroan alysis 4:929(1992))。 好適実施態様においては、本発明の核酸は金電極に結合される。レドックス活 性種の金表面への共有結合とその物質が観察された電子移動反応についていくつ かの方法が利用できる。長さの異なるヒドロキシチオール(OH(CH₂)_xSH）を文献 の手順を変更して調製する（Miller，C.ら，J．Phys．Chem．95:877(1991);Chid sey，C.E.D.，Science，V.251，p.919(1991)参照）。実施例８は、金電極に結合 するヒドロキシチオールの調製を示すものである。 ヒドロキシチオールの調製の代替的手順も当該技術において既知である。Au電 極又は表面が文献の手順によって調製され、修飾したヒドロキシチオールがAu上 に吸着される。 実施態様においては、更に、本発明の修飾された核酸が薄膜酸化表面に共有結 合される。種々の化合物が薄膜のSnO₂、TiO₂及びRuO₂とPt電極に共有結合される ことが報告されている（Lenhard，J．& Murray，R．J．Electroanal．Chem．78: 195(1977)参照）。電極に表面結合した3,5−ジニトロベンズアミドのような錯体 の可逆電気化学が見られた。その錯体は、アミド結合を介して電極に結合される ことが報告されている。その文献の手順を用いて本研究に記載されたアミノ修飾 オリゴヌクレオチドを用いて類似の誘導体が調製され、図8Bにスキームで示す。 従って、上記の方法を用いてオリゴヌクレオチドが固体支持体に結合され、電 極が電子ドナー部分か又は電子アクセプター部分として働く。 このように、電子ドナーとアクセプターの全ての組合わせが生成される:２つ の遷移金属錯体;２つの有機電子移動種;１つの遷移金属、１つの有機部分;１つ の遷移金属と電極;及び１つの有機部分と電極。電子移動種の選択は、下で詳述 される開始及び検出方法に必要とされるものに一部依存する。 本明細書において“標的配列”又は文法上の同義語は核酸の一本鎖上の核酸配 列を意味する。標的配列は、遺伝子、調節配列、ゲノムDNA、cDNA、mRNA等の部 分である。任意の長さであり、長いほうがより特異的であることが理解される。 下で詳述されるように、試料中の標的配列の有無を求めるために標的配列に対し てハイブリッド形成するプローブが作成される。一般的に言えばこの用語は当業 者によって理解される。 本発明のプローブは、標的ハイブリッド形成に相補的であるように設計され、 本発明の標的配列とプローブのハイブリッド形成が起こる。下記のようにこの相 補性は完全である必要はない。本発明の標的配列と一本鎖核酸間のハイブリッド 形成を妨害する塩基対ミスマッチの数があってもよい。しかしながら、突然変異 の数が少なくともストリンジェントのハイブリッド形成条件下でさえハイブリッ ド形成が起こらないほど多い場合にはその配列は相補的標的配列ではない。 種々のハイブリッド形成条件が本発明に用いられる。当該技術において既知で あるように、“高度”ストリンジェントは0.1×SSC,65℃のような条件を意味し 、低ストリンジェント条件は２〜５×SSC,25〜50℃が含まれる。ハイブリッド形 成条件は、当該技術において既知であるように非イオン性骨格、即ち、PNAが用 いられる場合に異なってもよい。 本明細書における“第１標的ドメイン”及び“第２標的ドメイン”又は文法上 の同義語は、試験中の核酸内の標的配列の２つの部分を意味する。第１標的ドメ インは第２標的ドメインに直接隣接し、第１と第２標的ドメインが介在標的ドメ インによって分けられてもよい。“第１”及び“第２”は、標的配列の5'−3'方 向について配列の向きを与えることを意味しない。例えば、相補的標的配列を5' −3'方向と考えると第１標的ドメインは5'から第２ドメインまでか又は3'から第 ２ドメインまでに位置される。 本発明は、部分的には、核酸マトリックスを介して長距離電子移動が可能な新 規な一連のバイオマテリアルを調製するための遷移金属錯体のようなレドックス 活性部分による核酸の部位選択的修飾に関する。本発明は、一本鎖又は二本鎖核 酸上の所定の部位における電子移動ドナーとアクセプター部分の正確な配置を提 供する。一般的には、二重らせん核酸において電子ドナーとアクセプター部分間 の電子移動は、ヌクレオチド塩基対が二重らせん構造の電子ドナーとアクセプタ ー間の配列に存在しない限り認知できる速度で起こらない。 電子移動の速度におけるこの相違は、プローブとして使用するための本発明の 有用性の根拠をなすものである。本発明のシステムにおいて、電子移動部分が核 酸の骨格に共有結合する場合、電子は推定上二本鎖核酸の重層塩基対のπ軌道を 介して進む。電子移動速度は、電子ドナー−アクセプター対間の距離、配列の自 由エネルギー(△G)、再構築エネルギー（λ）、介在媒体の寄与、ドナーとアク セプター対の配位と電子カップリング、及び塩基間の水素結合を含むいくつかの 要因に依存する。 介在媒体の寄与は、部分的には、電子が電子ドナーから塩基の重層に到達する ために又は重層を出て電子アクセプターに到達するために横切らなければならな いシグマ（σ）結合の数に依存する。図５に示されるように、金属がリボースの 2'炭素のアミン部分を介してリボース−リン酸骨格に結合する場合、重層:金属 から窒素結合まで、窒素から2'炭素結合まで、及び2'炭素から塩基まで又はその 逆に電子流の方向に依存して到達するために４つのσ結合を進まなければならな い。ヌクレオチドの塩基がある程度共役しているので、塩基は“πウェイ”の端 、即ち、重層塩基対の共役π軌道であると考えられる。金属がリボースの3'炭素 を介してリボース−リン酸骨格に結合する場合、電子は５σ結合を通って横切ら なければならない。金属がホスホルアミド型結合を介して結合する場合、電子は ７σ結合を通って横切らなければならない。好適実施態様においては、本発明の 組成物は、電子移動部分が二重らせん核酸の二次構造や三次構造、特にワトソン ・クリック型塩基対を有意に妨害することなく“πウェイ”にできるだけ近いよ うに設計される。 塩基間の水素結合による電子移動速度に対する作用は、A-T対がC-G対より水素 結合が１つ少ないので実際の核酸配列に依存する。しかしながら、この配列依存 性は、DNA塩基対マトリックス中の電子移動速度とリボース−リン酸骨格、溶媒 又は他の電子トンネルを通る速度間に測定可能な差があることを求めることによ り影が薄くなる。この速度差は、少なくとも数桁の大きさであると考えられ、他 の電子移動経路に比べて重層ヌクレオチド塩基を通る方が４桁の大きさ程大きい 。従って、例えば、遺伝子プローブ分析において二本鎖核酸の存在は、ハイブリ ッド形成されないプローブの電子移動速度とハイブリッド形成されたプローブの 速度と比較することにより求められる。 実施態様においては、本発明は、分子生物学及び診断薬に有効である新規な遺 伝子プローブを提供する。この実施態様においては、所定の配列及び共有結合し た電子ドナーと電子アクセプター部分を有する一本鎖核酸が合成される。配列は 既知の標的配列に基づいて選ばれ、相補的な標的配列に対するハイブリッド形成 が電子ドナーと電子アクセプター間の領域で起こる場合には、電子移動は認知で き検出できる速度で進行する。従って、本発明は、標識遺伝子プローブの新規な 形として幅広い一般的な使用がある。更に、ハイブリッド形成されないプローブ において検出できる電子移動が認知できないので、本発明のプローブはハイブリ ッド形成されないプローブを除去することなく標的配列の検出が可能である。従 って、本発明は自動遺伝子プローブ分析又はフィールド試験に適することがユニ ークである。 好適実施態様においては、プローブは遺伝子診断に用いられる。例えば、非ポ リープ結腸がんの遺伝子、様々ながんと関連がある遺伝子であるBRCA1乳がん遺 伝子，P53、アルツハイマー病の危険が大きいApo E4遺伝子のような標的配列を 検出するために本明細書に開示される方法を用いてプローブが生成され、患者の 前兆前の容易なスクリーニング、嚢胞性線維症遺伝子の突然変異、又は当該技術 において周知のものを可能にする。 実施態様においては、更に、本発明の錯体を用いてウイルスや細菌の検出が行 われる。この実施態様においては、種々の細菌やウイルスからの標的配列を検出 するようにプローブが設計される。例えば、現在の血液スクリーニング技術は抗 HIV抗体の検出に頼っている。本明細書に開示される方法は、HIV核酸配列、特に 高度に保存されたHIV配列を検出するために臨床試料の直接のスクリーニングを 可能にする。更に、これにより抗ウイルス治療の効能を評価する改善方法として 患者の中の循環しているウイルスの直接のモニタリングを可能にする。同様に、 白血病、HTLV-I及びHTLV-IIと関連があるウイルスがこの方法で検出される。結 核のような細菌感染症も検出される。 好適実施態様においては、本発明の核酸は水や食品試料のスクリーニングにお いて毒性細菌のプローブとしての使用がある。例えば、試料を処理して細菌を溶 解してその核酸を遊離してからサルモネラ、カンピロバクター、ビブリオコレレ 、大腸菌のエンテロトキシン株、及びレジオネラ症細菌のような病原株を含むが これらに限定されない細菌株を認識するようにプローブが設計される。同様に、 本 発明の組成物を用いてバイオリミジエーション戦略が評価される。 実施態様においては、更に、被害者と容疑者から採取した試料に対して犯罪現 場のDNAを適合するために法廷で用いる“DNM濫定”にプローブが用いられる。 本発明は、また、標的核酸配列内の突然変異の検出のユニークな方法としての 使用がある。結果として、電子移動部分を含む一本鎖核酸が標的配列に対してハ イブリッド形成される場合には得られたヌクレオシドの塩基対の混乱が電子移動 速度に測定できるほどに影響する。これは、突然変異が置換、挿入又は欠失であ る場合の例である。また、標的配列に対して近接してハイブリッド形成する共有 結合電子移動種を各々が含む２本の一本鎖核酸も用いられる。従って、本発明は 、標的配列における突然変異の検出を提供する。 従って、本発明は、ある実施態様においては、ハイブリッド形成されないプロ ーブを除去することなく標的配列を検出することができる非常に特異的で感受性 のあるプローブを提供する。これは、自動遺伝子プローブ分析の作成に有効であ る。 他の実施態様においては、二本鎖核酸は対向鎖上に共有結合した電子ドナーと 電子アクセプター部分を有する。かかる核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に おいて巧みな遺伝子増幅を検出するのに有効であるので巧みなPCR反応が標的配 列の有無を示すことを可能にする。PCRはいくつかの点でこの方法で用いられる 。例えば、２つのPCRプライマーの一方が5'末端結合電子ドナーを含み、他方が5 '末端結合電子アクセプターを含む場合には、数ラウンドのPCRが二重に標識され た二本鎖断片(“アンプリコン)と言われることがある）を生じる。適切な光誘起 後、電子移動の検出は増幅が起こらない場合に比べて標的配列の巧みな増幅を示 す。本発明の具体的な利点は、電子移動部分を含むプローブ配列について上で述 べたように増幅した二本鎖DNAからの一本鎖プライマーの分離が必要でないこと である。また、PCRによる標的配列の検出は、プライマーの一方又は双方に一方 の電子移動部分種を結合することにより行われる。他方の電子移動部分種は、本 明細書に記載されるようにPCR反応プールの個々のヌクレオシドに結合される。P CR反応中に電子移動部分を含むヌクレオシドを核酸に組込むことにより、同じ単 鎖か又は対向鎖か又は双方に結合されている両電子移動種が得られる。新たに 合成した核酸をハイブリッド形成した形で保つことができることにより電子移動 による巧みな延長の検出、よって標的配列の検出が可能になる。このように、本 発明は標的配列のPCR検出に用いられる。 他の実施態様においては、本発明は、バイオコンダクタ又は“分子ワイヤ”と して働く共有結合した電子ドナーと電子アクセプター部分を有する二本鎖核酸を 提供する。電子輸送は、電子ドナーとアクセプター対に対して28Åまで及びそれ を超える距離にわたって起こる。更に、電子移動速度は、電子ドナーとアクセプ ター部分間の距離に依存しても非常に速い。核酸を電子ドナー及び／又は電子ア クセプター部分で一定の間隔で修飾することにより、長距離にわたって電子を輸 送することが可能であり、よってバイオコンダクタを生じる。そのバイオコンダ クタは、電気化学反応やプロセスの伝達物質のようなコンダクタとしての伝統的 な用途を含む多くの用途に有用である。 更に、そのバイオコンダクタは、光合成性反応のプローブとして及び合成集光 性システムの構成に有用である。人工集光性システの電子移動成分の現在のモデ ルは、溶媒極性や組成に対する依存性、及び困難な合成をせずに十分な剛直性が ないことを含む上記のいくつかの問題がある。従って、本発明は、新規な形態の バイオコンダクタ及び新規な遺伝子プローブとして共に有効である。 本発明は、電子移動部分を共有結合した核酸を提供する。電子移動部分は、様 々な位置で核酸に結合される。 実施態様においては、電子ドナーとアクセプター部分は糖−リン酸骨格か又は 末端塩基の核酸の3'及び／又は5'末端に付加される。他の実施態様においては、 電子ドナーとアクセプター部分は１個以上の内部ヌクレオシド、即ち、3'又は5' 末端ヌクレオシドではないヌクレオシドの骨格に付加される。実施態様において は、更に、電子ドナーとアクセプター部分は内部及び末端ヌクレオシドの双方の 骨格に付加される。 好適実施態様においては、電子移動部分はリボース−リン酸骨格に多くの位置 で付加される。図５に示されるように、いくつかの位置が可能であり、リボース −リン酸骨格のリボースへの結合が特に好ましい。従って、図５では、電子移動 部分の最も好ましい結合部位はM₁、続いてM₄、M₂及びM₃の順である。好適実施態 様においては、電子移動部分はリボースの2'又は3'位に付加され、2'が特に好ま しい。 好適実施態様においては、電子移動部分は挿入されず、挿入しないように付加 される。従って、核酸に電子移動部分を結合する別の二重結合のような“リンカ ー”を用いることが可能であるが、リンカーは長さが好ましくは１又は２個のヌ クレオチドの等価物より長くないか又はインターカレーションを可能にする可撓 性があまりないものである。好ましくは、リンカーが用いられる場合には核酸骨 格のリボースを介して結合される。 実施態様においては、電子移動部分は末端ヌクレオシドの塩基に付加される。 従って、検出すべき標的配列がｎ個のヌクレオシドの長さである場合、核酸の末 端の一方又は両方に余分の末端ヌクレオシドをもつプローブが作成され(n+1又は n+2)、それらは電子移動部分を共有結合するために用いられるが塩基対ハイブリ ッド形成に関与しない。その余分の末端ヌクレオシドは、電子移動部分の内部ヌ クレオシド塩基への結合がワトソン−クリック型塩基対を混乱させることが子想 されるので重要である。即ち、共有結合に用いられる塩基は、標的配列を同定す るために用いられる領域の外側でなければならない。更に、プローブハイブリッ ド形成の際に、塩基に共有結合した電子移動部分を含む末端ヌクレオシドはワト ソン・クリック型塩基対ヌクレオシドに直接隣接することが好ましい。即ち、電 子移動部分は、電子が“πウェイ”に到達するために最少のσ結合を進むように 塩基の重層のπ軌道にできるだけ近くなければならないか又はπウェイに電子的 に接触させることができる。 実施態様においては、一本鎖核酸は両端の末端塩基を介して電子移動部分で標 識される。他の実施態様は、末端塩基と上記の5'又は3'末端リボース−リン酸結 合を用いる。実施態様においては、更に、末端塩基に共有結合した電子ドナーを 含む第１一本鎖核酸及び上記の位置、即ち、5'、3'又は内部位置に共有結合した 電子アクセプターを含む第２一本鎖核酸を含み、その電子ドナーとアクセプター がスイッチされる組成物が提供される。特に好ましい実施態様は、電子移動部分 の一方として電極を用い、他方の電子移動部分は末端塩基、好ましくは同じ単鎖 に結合される。 本発明は、電子移動部分を核酸に部位特異的に付加する方法を提供する。上記 のように、電子移動部分はリボース−リン酸骨格のリボースの2'又は3'位置、3' 又は5'末端塩基、又は内部ヌクレオシドにペプチド核酸結合、ホルホルアミデー ト結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、又はO-メチルホ スホルアミデート結合を用いて付加される。 分子力学の計算から、核酸の末端ヌクレオシドのリボースの修飾による混乱は 最少であり、ワトソン・クリック型塩基対は破壊されない（モレキュラーシミュ レーション社、カリフォルニア州サンディエゴからのバイオグラフを用いた末発 表データ）。 リボースへの結合については、好適実施態様は電子移動部分を結合するために 修飾したヌクレオシドを用いる。好ましくは、１個又は複数のアミノ修飾ヌクレ オシドが用いられる。他の実施態様においては、本発明の電子移動部分を結合す るためにチオ修飾したヌクレオシドが用いられる。 次に、修飾ヌクレオシドを用いて遷移金属電子移動部分を核酸の3'又は5'末端 か又は内部ヌクレオシドに部位特異的に付加する。3'末端の結合についてはリボ ースの2'か又は3'位が変わり、内部リボース又は5'末端への結合については2'が 好ましい。例えば、デオキシリボ又はリボヌクレオシドのリボースの2'位は電子 移動種の付加前に修飾され、必要な場合には後続の鎖結合のために朱修飾のリボ ースの3'位置が残る。好適実施態様においては、アミノ基は確立された化学的手 法を用いて糖の2'又は3'炭素に付加される。(Imazawaら，J．Org．Chem.，44:20 39(1979);Hobbsら，J．Org．Chem.42(4):714(1977);Verheydenら，J．Org．Chem ．36(2):250(1971)) 好適実施態様においては、2'又は3'アミノ修飾ヌクレオシドは本明細書及び実 施例９に記載される多座リガンドに変換される。これは、当業者によって理解さ れるように様々な方法で行われる。 酸素配位原子を含む多座リガンドについては、当業者によって理解されるよう に多座リガンドを形成するためにリボースの2'及び3'位のヒドロキシル基が用い られる。 上記のように生成されたアミノ修飾ヌクレオシドは、標準生化学方法を用いて 2'又は3'修飾ヌクレオチド３リン酸に変換される（Fraserら，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA，4:2671(1973)）。 好適実施態様においては、修飾したヌクレオシドは本明細書に記載されるよう に多座ヌクレオシドを含む。図９に例示されるように、アミノ修飾ヌクレオシド から出発して種々の多座リガンドが生成される。 電子移動部分を塩基に結合するために修飾されるヌクレオシドは上記Telserに 記載されるように行われ、それらの文献の記載は共に本願明細書に含まれるもの とする。次に、修飾したヌクレオシドは3'か又は5'末端に下記のように組込まれ る。 従って、修飾したヌクレオシドとしては、2'又は3'−アミノ又はチオ修飾ヌク レオシド、塩基において修飾されたヌクレオシド、又は多座配位ヌクレオシドが 含まれる。 修飾したヌクレオシドが調製、保護及び活性化されると、標準合成法(Gait，O ligonucleotide Synthesis:A Practical Approach，IRL Press，オックスフォー ド，英国1984;Eckstein)によって成長しているオリゴヌクレオチドにいくつかの 点で組込まれる。実施態様においては、１個以上の修飾したヌクレオシドが酵素 DNAポリメラーゼI、T4 DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメ ラーゼ、逆転写酵素及びRNAポリメラーゼの使用によるような標準分子生物学技 術を用いて成長しているオリゴヌクレオチド鎖に組込まれる。3'修飾ヌクレオシ ドの核酸への組込みについては、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラー ゼが用いられる。(Ratliff，Terminal deoxynucleotidyltransferase，The Enzy mes，Vol 14A．P.D．Boyer ed．pp105-118．Academic Press，サンディエゴ，カ リフォルニア1981)また、アミノヌクレオシドはホスホルアミダイト又はH-ホス ホネートに変換され、次にオリゴヌクレオチドの固相又は溶液合成に用いられる ことが好ましい。このようにしてリボース（即ち、アミノ又はチオ修飾ヌクレオ シド）か又は塩基での結合に修飾したヌクレオシドが内部位置か又は5'末端のオ リゴヌクレオチドに組込まれる。これは、一般的には、リボースの5'位を4',4− ジメトキシトリチル(DMT)で保護し、続いてジイソプロピルアンモニウムテトラ ゾリドの存在下に２−シアノエトキシ−ビスジイソプロピルアミノホ スフィンと反応させて当該技術において既知のホスホルアミダイトを得ることに より行われるが、当業者によって理解されるように他の手法も用いられる。上記 Gait;Caruthers，Science 230:281(1985)を参照されたい。これらの文献の記載 は共に本願明細書に含まれるものとする。 電子移動部分の3'末端への結合については、好ましい方法は、オリゴヌクレオ チドの合成の技術において既知であるように修飾したヌクレオシドを調製ポアガ ラス(CPG)又は他の高分子支持体のような固体支持体へ結合することを用いる。 この実施態様においては、修飾したヌクレオシドの5'末端をDMTで保護してから コハク酸無水物と活性化と共に反応させる。得られたスクシニル化合物を当該技 術において既知であるようにCPG又は他の高分子支持体に結合する。更に、修飾 した又は修飾しないホスホルアミダイトヌクレオシドを5'端に付加した後、脱保 護される。 別の実施態様において、一つ以上の電子伝達部分は核酸の中央、即ち、内部ヌ クレオシドに付加される。これは三つの方法で達成し得る。 好ましい実施態様において、修飾ヌクレオシドが上記のように5'末端でとり込 まれる。この実施態様において、オリゴヌクレオチド合成は通常の技術を使用し て修飾ヌクレオシドから5'末端を単に延長する。これは内部修飾オリゴヌクレオ チドをもたらす。 一実施態様において、ヌクレオシドがリボースの2'位または3'位で電子伝達部 分を結合することができる芳香族アミンを含むように修飾される。例えば、イミ ダゾールの窒素の一つがリボースの2'位または3'位で結合され、こうして遷移金 属錯体の如き電子伝達部分を結合するのに使用し得る。これはσ結合（その中を 通って電子が移動して“パイ−ウェイ(pi-way)”に達する必要がある）の数を有 効に減少し得る。何とならば、イミダゾールはσ結合と比べて電子伝達に対する 実質的に小さい抵抗を与えるからである。好ましい実施態様において、イミダゾ ールはリボースの2'位で結合される。別の実施態様において、イミダゾールは3' 位で結合される。イミダゾール修飾ヌクレオシドは修飾ヌクレオシドについて本 明細書に概説されたようにオリゴヌクレオチドにとり込まれてもよい。 別の実施態様において、電子伝達部分はリボース以外の部位で主鎖に付加され て、内部結合をもたらす。例えば、ホスホジエステル結合ではなくホスホルアミ ド結合が遷移金属修飾の部位として使用し得る。これらの遷移金属は電子伝達反 応のドナー及びアクセプターとして利用することができる。天然ホスホジエステ ル結合からの構造のずれが起こり、CD及びNMRを使用して研究されていたが(He-l ler，Acc.Chem.Res．23:128(1990);Schuhmannら，J.Am.Chem.Soc．113:1394(199 1))、ホスホルアミジトヌクレオチド間結合が相補ポリヌクレオチドに結合する ことが報告されており、安定である(Beaucageら，上記文献、及びその中の文献; Letsinger,上記文献;SaWal,上記文献;Jager，Biochemistry 27:7237(1988))。こ の実施態様において、ヌクレオチドのダイマーが2'-5'位または3'-5'位でホスホ ルアミド結合でつくられる。好ましい実施態様はホスホルアミド結合に3'-5'位 を利用し、その結果、その後のワトソン−クリック塩基対合の構造破壊が最小に される。これらのダイマー単位は以下に概説されるように特定の間隔で上記の成 長オリゴヌクレオチド鎖にとり込まれる。 ロビンがここで開始する こうして、本発明は共有結合された電子伝達部分を有する核酸の生産方法を提 供する。好ましい実施態様において、その方法は前記核酸の3'末端で結合された 電子伝達部分を有する核酸の生産に関する。その方法は修飾ヌクレオシドを固体 担体に結合し、ホスホルアミジトヌクレオシドを修飾ヌクレオシドの5'末端に付 加して核酸を生成する。次いで既知の方法を使用して、核酸が必要によりCPGか ら開裂される。次いで核酸はその補体にハイブリッド形成されて塩基を修飾から 保護してもよく、電子伝達部分が2'−アミノ修飾ヌクレオシドに付加される。 好ましい実施態様において、5'末端で結合された電子伝達部分を有する核酸の 生産方法が提供される。その方法はヌクレオシドを調節細孔ガラスに結合し、ホ スホルアミジトヌクレオシドを修飾ヌクレオシドの5'末端に付加して核酸を生成 することを含む。2'又は3'アミノ修飾ヌクレオシドが5'末端に付加され、核酸が CPGから開裂される。核酸がその補体にハイブリッド形成され、電子伝達部分が 2'または3'アミノ修飾ヌクレオシドに付加される。 好ましい実施態様において、3'末端及び5'末端の両方で結合された電子伝達部 分を有する一本鎖核酸の生産方法が提供される。その方法は修飾ヌクレオシドを 調節細孔ガラスに結合することを含む。修飾ヌクレオシドは本明細書に記載され たようなリボースによる結合のためにアミノ修飾されていてもよく、又は塩基で 修飾されていてもよい。付加的なホスホルアミジトヌクレオシドが修飾ヌクレオ シドの5'末端に付加されて核酸を生成する。修飾ホスホルアミジトヌクレオシド が核酸の5'末端に更に付加され、次いでこれが調節細孔ガラスから開裂されて除 かれ、その補体にハイブリッド形成される。電子ドナー部分が一つの修飾ヌクレ オシドに付加され、電子アクセプター部分が別の修飾ヌクレオシドに付加される 。 ヌクレオシド塩基の塩基対合はハイブリダイゼーション、良好な電子伝達速度 、及びミスマッチの検出を可能にするために有意に乱されないことが重要である ことが理解されるべきである。こうして、例えば、遷移金属部分は、本発明の核 酸に結合された時に、二本鎖核酸の塩基対の間にインターカレートせず、即ち、 挿入したり、スタッキングしたりすることがない。随伴リガンドによる遷移金属 のインターカレーションは塩基対合を乱し、こうして電子の伝達及びミスマッチ の同定を妨げる。同様に、末端塩基を除いて、以下に概説されるように、遷移金 属錯体をヌクレオシド塩基で結合すること(Teiserら，上記文献)は又塩基対合を 乱し、ミスマッチの同定を妨げる。 内部残基の修飾に上記技術を使用する場合、次から最後までの3'末端ヌクレオ シドに電子伝達種を有する核酸をつくることが可能であり、こうして3'末端標識 ヌクレオシドを生成するのに必要とされる余分の工程に対する必要をなくすこと が注目されるべきである。 内部残基の修飾のための更に別の実施態様において、2'又は3'修飾ヌクレオシ ドトリホスフェートが3'ヌクレオシド修飾について上記された技術を使用して生 成される。修飾ヌクレオシドはＤＮＡ及びＲＮＡを標識するのに通常の分子生物 学的技術を使用して核酸に内部挿入される。前記標識に使用される酵素として、 ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ポリメラーゼＩ、T4 DNAポリメラーゼ、T7 DNAポ リメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、逆転写酵素及びＲＮＡポリメラーゼ、例え ば、E.coli RNAポリメラーゼ又はファージSP6、T7もしくはT3からのＲＮＡポリ メラーゼが挙げられる(Short Protocols in Molecular Biology，1992 Ausubel ら編集，3.11-3.30頁)。 上記のように、電子伝達部分、好ましくは遷移金属錯体が５種の塩基（アデニ ン、チミン、ウラシル、シトシン、グアニン及びその他の天然産塩基、中でも、 イノシン、キサンチン、及びヒポキサンチン）のいずれかに結合し得る。これは 公知の技術を使用して行われる。Teiserら，J.Am.Chem.Soc．111:7226-7232(198 9);Teiserら，J.Am.Chem.Soc．111:7221-7226（1989）を参照のこと。本明細書 に概説されたように、これらの末端修飾ヌクレオシドは当業界で知られているよ うにＤＮＡポリメラーゼを使用して酵素により核酸に結合し得る。又、修飾ヌク レオシドは本明細書に概説されるようにオリゴヌクレオチド合成中に従来のホス ホルアミジト化学を使用して成長オリゴヌクレオチド鎖にとり込まれてもよい。 本発明に有益なリボースの2'位又は3'位にある露出されたアミン又はその他の リガンド、ホスホルアミド結合、又はその他の結合は当業界で容易に知られてい る技術により種々の電子伝達部分、特に遷移金属錯体で容易に修飾される（例え ば、Milletら，Metals in Biological Systems，Sige1ら編集，27巻，223-264頁 ，Marcell Dekker Inc．New York，1991及びDurhamら，ACS Advances in Chemis try Series，Johnsonら編集，226巻，180-193頁，American Chemical Society， Washington D.C.;並びにMeadeら，J.Am.Chem.Soc．111:4353(1989))。一般に、 これらの技術は部分キレート化遷移金属錯体を修飾ヌクレオシドのアミン基と接 触させることを伴う。 又、有機電子伝達種が当業界で知られている技術を使用して修飾ヌクレオシド の官能基、例えば、アミン基に付加される。ペプチド核酸(PNA)が使用される場 合、電子伝達部分の結合は以下のように進行する。PNAのＮ末端のアミノ基は部 分キレート化遷移金属又はアミノ修飾リボースと同様の有機電子伝達部分を結合 するであろう（図9A）。カルボキシ末端への付加は図9Bに一般に概説されるよう に進行する。更に、一本鎖PNAについて、一つの電子伝達部分がＮ末端に結合さ れてもよく、別の電子伝達部分がカルボキシ末端で末端塩基に結合される。又、 両方の伝達部分が末端塩基に結合される。同様の組み合わせが、夫々電子伝達部 分を含む、２種の一本鎖核酸についてつくられてもよい。 加えて、本発明は既に修飾されたヌクレオシドへの電子ドナー部分及び電子ア クセプター部分の核酸のリボース−ホスフェート主鎖への部位特異性付加のため の新規な方法を提供する。 一実施態様において、電子ドナー部分及びアクセプター部分が特異な保護ハイ ブリダイゼーション工程を使用する方法により修飾ヌクレオシドに結合される。 この実施例において、修飾一本鎖核酸が末修飾相補配列にハイブリッド形成され る。これは遷移金属電子伝達種による攻撃を受け易い複素環塩基の部位をブロッ クする。 末端塩基が電子伝達種で標識される場合、相補配列は標識される塩基まで延長 しない。即ち、長さがｎヌクレオシドの相補配列がｎ＋１又はｎ＋２のプローブ 配列へのハイブリダイゼーションに選ばれ、その結果、末端塩基が保護されない 。こうして、未保護塩基が電子伝達部分に露出され、その結果、その部分が塩基 に結合される。 所望の金属錯体の成功裏の付加後に、当業界で公知の技術を使用して、修飾二 重らせん核酸が一本鎖に分離される。 好ましい実施態様において、一つの電子ドナー部分及び一つのアクセプター部 分を含む一本鎖核酸がつくられる。電子ドナー部分及び電子アクセプター部分が 一本鎖核酸の5'末端又は3'末端で結合されてもよい。又、電子伝達部分が内部ヌ クレオシドに結合されてもよく、又は一つが内部ヌクレオシドに、そして一つが 末端ヌクレオシドに結合されてもよい。 核酸の5'-3'配向に対する電子伝達種の配向は決定的ではないことが理解され るべきである。こうして、図１に概説されるように、内部ヌクレオシド及び末端 ヌクレオシドのあらゆる組み合わせがこの実施態様において利用されてもよい。 別の好ましい実施態様において、少なくとも一つのドナー部分及び少なくとも 一つのアクセプター部分を有する一本鎖核酸が相補標的配列中の突然変異体を検 出するのに使用される。突然変異体（それは一つ以上のヌクレオシドの置換、挿 入又は欠失である）は核酸のハイブリッド形成された二重らせん中の不正確な塩 基対合をもたらす。それ故、電子ドナー部分から電子アクセプター部分までの電 子の通路がミスマッチがある領域をスパンする場合、電子伝達が排除又は減少さ れ、その結果、相対速度の変化が見られるであろう。それ故、この実施態様にお いて、電子ドナー部分が突然変異体から5'位で核酸に結合され、電子アクセプタ ー部分が3'位で結合され、又はその逆も真である。 この実施態様において、修飾一本鎖核酸に付加的な標識を使用して、一つ以上 のミスマッチがあるハイブリダイゼーションを検出することが又可能である。相 補標的核酸が突然変異を含む場合、電子伝達が減少又は排除される。コントロー ルとして作用するために、修飾一本鎖核酸は放射能標識又は蛍光標識されてもよ く、その結果、標的配列へのハイブリダイゼーションが従来の分子生物学技術に 従って検出し得る。これは、標的配列が存在するが、一つ以上のヌクレオシドの 置換、挿入又は欠失を含む測定を可能にする。又、少なくとも一つの電子ドナー 部分及び一つの電子アクセプター部分を有する一本鎖核酸（これらは正確なマッ チを含む領域にハイブリッド形成する）が標的配列の存在についての対照として 使用し得る。 二本鎖核酸らせん中の電子伝達の速度は電子ドナー部分と電子アクセプター部 分の問のヌクレオシド距離に依存することが理解されるべきである。長い距離は 遅い速度を有し、速度の考慮はプローブ及びバイオコンダクターの設計における パラメーターであろう。こうして、100を越えるヌクレオシドの距離について速 度を測定することが可能であるが、好ましい実施態様は少なくとも３かつ100以 下のヌクレオシドだけ分離された電子ドナー部分及び電子アクセプター部分を有 する。これらの部分は８〜64のヌクレオシドだけ分離されることが更に好ましく 、15が最も好ましい距離である。 加えて、或る距離が異なる検出系の利用を可能にし得ることが注目されるべき である。例えば、幾つかの検出系の感度が極めて速い速度の検出を可能にし得る 。即ち、電子伝達部分が一緒に非常に接近していてもよい。その他の検出系はわ ずかに遅い速度を必要とすることがあり、こうして、電子伝達部分が更に離れて いることを可能にする。 別の実施態様において、一本鎖核酸が一つより多い電子ドナー部分又は電子ア クセプター部分で修飾される。例えば、これらのプローブから得られるシグナル を増加し、又は必要とされる検出器感度を低下するために、電子ドナー−アクセ プター対の多数の組が使用し得る。 先に概説したように、幾つかの実施態様において、異なる電子伝達部分が一本 鎖核酸に付加される。例えば、電子ドナー部分及び電子アクセプター部分、又は 幾つかの異なる電子ドナー及び電子アクセプターが付加される場合、一本鎖核酸 の合成は数工程で進行する。最初に、先に概説した技術を使用して、部分核酸配 列がつくられ、夫々が単一電子伝達種、即ち、単一伝達部分又は幾つかの同伝達 部分を含む。次いで当業界で普通の技術、例えば、相補一本鎖への個々の修飾部 分核酸のハイブリダイゼーション、続いて市販のリガーゼによる連結反応を使用 して、これらの部分核酸配列が一緒につながれる。 又、一本鎖核酸は上記技術を使用してアミノ修飾ヌクレオシドを二つの位置で とり込むことによりつくられてもよい。合成の結果として、アミノ修飾ヌクレオ シドの一つがアミンに一時保護基、例えば、DMTを有する。相補末修飾ストラン ドへのハイブリダイゼーション後に、末保護アミンが第一電子伝達部分、即ち、 ドナー又はアクセプターに露出され、共有結合をもたらす。次いで保護アミノ修 飾ヌクレオシドの保護基が除去され、ハイブリッドが第二電子伝達種と接触され 、ストランドが分離され、ドナー及びアクセプターの両方で標識されている一本 鎖をもたらす。次いで従来技術を使用して、適当な電子伝達部分を含む一本鎖が 精製される。 好ましい実施態様において、一つの電子ドナー部分又は一つの電子アクセプタ ー部分を含む一本鎖核酸がつくられる。電子ドナー部分及び電子アクセプター部 分は一本鎖核酸の5'末端又は3'末端で結合される。又、電子伝達部分が内部ヌク レオシドに結合される。 電子ドナー部分及び電子アクセプター部分の異なる種が一本鎖核酸に結合され てもよいことが理解されるべきである。こうして、電子ドナー部分又は電子アク セプター部分の一つより多い型があらゆる一本鎖核酸に結合されてもよい。 好ましい実施態様において、結合された一つ以上の電子ドナー部分を有する第 一一本鎖核酸がつくられる。第二一本鎖核酸は結合された一つ以上の電子アクセ プター部分を有する。この実施態様において、一本鎖核酸は相補標的配列のプロ ーブとしての使用のためにつくられる。一実施態様において、相補標的配列は第 一標的ドメイン及び第二標的ドメインからつくられ、この場合、その第一配列及 び第二配列は互いに直接隣接する。この実施態様において、第一修飾一本鎖核酸 （これは電子ドナー部分又は電子アクセプター部分のみを含むが、両方を含まな い）は第一標的ドメインにハイブリッド形成し、第二修飾一本鎖核酸（これは相 当する電子伝達種のみを含む）は第二標的ドメインに結合する。電子伝達種の相 対配向は図２に概説されるように重要ではなく、本発明は全ての可能な配向を含 むことを意図している。 隣接する第一標的配列及び第二標的配列にハイブリッド形成する２種の一本鎖 核酸を含むプローブの設計において、幾つかの因子が考慮されるべきである。こ れらの因子として、ハイブリッド形成された形態中の電子ドナー部分と電子アク セプター部分の間の距離、及び個々の一本鎖プローブの長さが挙げられる。例え ば、5'末端標識プローブのみを合成することが望ましいかもしれない。この場合 、第一配列にハイブリッド形成する一本鎖核酸は比較的短くてもよく、その結果 、プローブ間の望ましい距離が達成し得る。例えば、電子伝達部分間の最適距離 が15ヌクレオシドである場合、第一プローブは15ヌクレオシドの長さであっても よい。この実施態様の一局面において、隣接する第一標的ドメイン及び第二標的 ドメインにハイブリッド形成した２種の一本鎖核酸は電子伝達反応の前に一緒に つながれる。これはＤＮＡリガーゼ、例えば、T4ＤＮＡリガーゼを利用する通常 の分子生物学技術を使用して行い得る。 別の実施態様において、相補標的配列は第一標的ドメイン、介在標的ドメイン 、及び第二標的ドメインを有するであろう。この実施態様において、第一修飾一 本鎖核酸（これは電子ドナー部分又は電子アクセプター部分のみを含むが、両方 を含まない）は第一標的ドメインにハイブリッド形成し、第二修飾一本鎖核酸（ これは相当する電子伝達種のみを含む）は第二標的ドメインに結合する。介在一 本鎖核酸が介在標的配列にハイブリッド形成する場合、ドナーとアクセプターの 間の電子伝達が可能である。介在配列はあらゆる長さであってもよく、又単一ヌ クレオシドを含んでもよい。しかしながら、その長さは第一修飾核酸及び第二修 飾 核酸の電子ドナー部分及び電子アクセプター部分の間の望ましい距離を考慮すべ きである。14より大きい長さの介在配列が望ましい。何とならば、長い介在配列 が使用される場合、介在配列はおそらくハイブリッド形成されたまま残って二本 鎖核酸を形成するからである。介在配列の存在又は不在が挿入及び欠失を検出す るのに使用し得る。 この実施態様の一局面において、第一標的ドメインにハイブリッド形成された 第一一本鎖核酸、介在ドメインにハイブリッド形成された介在配列、及び第二標 的ドメインにハイブリッド形成された第二一本鎖核酸は、電子伝達反応の前に一 緒につながれてもよい。これは通常の分子生物学技術を使用して行い得る。例え ば、核酸がＤＮＡである場合、T4ＤＮＡリガーゼの如きＤＮＡリガーゼが使用し 得る。 本発明の相補標的一本鎖核酸は多くの形態をとり得る。例えば、そうほ標的一 本鎖核酸配列は大きい核酸配列、即ち、中でも、遺伝子又はｍＲＮＡの全部又は 一部、プラスミド又はゲノムＤＮＡの制限フラグメント内に含まれてもよい。分 子生物学の当業者は本発明を使用して種々の標的配列に有益なプローブを構築す る方法を理解するであろう。 一実施態様において、共有結合された電子伝達部分を有する２種の一本鎖核酸 は相補配列を有し、その結果、それらは一緒にハイブリッド形成してバイオコン ダクターを形成し得る。この実施態様において、ハイブリッド形成された二重ら せんは少なくとも一つの電子を電子ドナー部分から電子アクセプター部分に伝達 することができる。好ましい実施態様において、個々の一本鎖核酸は、それらが ブラントエンドを有するように配列される。別の実施態様において、核酸は、二 重らせんが付着末端を有するように配列される。両実施態様において、電子ドナ ー部分と電子アクセプター部分の間に中断されていない二重らせん塩基対合があ ることが好ましく、その結果、電子がスタッキングされた塩基対中を移動し得る 。 一つのバイオコンダクター実施態様において、二本鎖核酸は電子伝達部分の全 てを有する一つの一本鎖核酸を有する。 別の実施態様において、電子伝達部分はあらゆる配向で両ストランドで保有さ れてもよい。例えば、一つのストランドが電子ドナーのみを保有していてもよく 、 別のストランドが電子アクセプターのみを保有していてもよく、又は両方のスト ランドが両方を保有していてもよい。 一実施態様において、二本鎖核酸は電子の長い範囲の伝達を促進するために一 定の配向で共有結合された異なる電子伝達部分を有していてもよい。この型の系 は、電子伝達種がそれらの酸化状態に応じて電子ドナー及び電子アクセプターの 両方として作用し得るという事実を利用する。こうして、電子ドナー部分は、電 子の損失後に、電子アクセプターとして作用でき、その逆も真である。こうして 、電子伝達部分は二本鎖核酸の両ストランドで逐次配向されてもよく、その結果 、非常に長い距離にわたる電子の方向性伝達が達成し得る。例えば、二本鎖核酸 は分子中に一つの末端にある単一電子ドナー部分と同じ組成又は異なる組成の電 子アクセプター部分とを含み得る。電子伝達のカスケード効果がこの様式で達成 でき、これが電子の極めて長い範囲の伝達をもたらし得る。これは、例えば、金 属中心でなされたリガンド置換のために酸化電位の或る範囲を有する遷移金属錯 体をとり込むことにより達成し得る。 特定の電子ドナー及び電子アクセプターの対の選択は使用される電子伝達測定 の型により影響されるであろう。総説について、Winklerら，Chem.Rev.92:369-3 79(1992)を参照のこと。長寿命励起状態が酸化還元部位の一つについて調製し得 る場合、光誘導後の電子伝達速度の直接測定が、例えば、Changら，J.Amer.Chem .Soc.113:7057(1991)のフラッシュー消光方法を使用して測定し得る。この好ま しい実施態様において、基底状態種よりも良好なアクセプター及びドナーの両方 である励起酸化還元部位は電子を酸化還元パートナーに又は酸化還元パートナー から伝達することができる。この方法の利点は、二つの電子伝達速度：光誘導電 子伝達速度及び熱電子−正孔再結合反応が測定し得ることである。こうして、示 差速度が完全相補核酸及びミスマッチを有する核酸とハイブリッド形成された核 酸について測定し得る。 別の実施態様において、いずれの酸化還元部位が長寿命励起状態を有しておら ず、電子伝達測定が速度論的中間体の２分子生成に依存する。総説について、Wi nklerら，上記文献を参照のこと。次いでこの中間体が以下に見られるようにク エンチャーを使用して分子内電子伝達により熱力学的生成物に緩和する。 D-A+hv→D-A^* D-A^*+Q→D-A^*+Q^- D-A^*→D⁺-A D⁺-A+Q^-→D-A+Q この方法を使用して測定できる分子内電子伝達速度の上限は約10⁴/秒である。 別の実施態様は還元ラジカル又は酸化ラジカルのパルスー放射能分解生成を使 用し、これらはWinklerらの上記文献に総説されたように電子をドナーに注入し 、又は電子をドナーから除去する。 当業界で理解されているように、電子伝達を開始し、検出するのには種々の方 法がある。電子伝達は電気放射線、電気化学放射線、電磁放射線（光学）及び化学的方法を 含むが、これらに限定されない種々の方法を使用して開始され、検出し得る 電 子伝達の開始及び電子伝達の検出の所望の方法に応じて異なる電子伝達部分を利 用して種々の組成物をつくることが可能である。表２は本発明の錯体中の雷子伝 達の開始及び検出に好ましい種々の組み合わせを示す。 表２ 開始 検出 説明 光 光 吸光度、蛍光、りん光、 屈折率、表面プラズモン共鳴、 電子スピン共鳴 光 電流 電流測定法、ボルタンメトリー、キャパシタンス、 インピーダンス、オプトエレクトロニック検出、 光−電流測定法 光＋ 光 吸光度、蛍光、りん光、 電子 屈折率、表面プラズモン共鳴、開始 電子スピン共鳴 光＋ 電流 電流測定法、ボルタンメトリー、キャパシタンス、 電子 インピーダンス、オプトエレクトロニック検出、 開始 光−電流測定法、電流測定検出、 サイクリック・ボルタンメトリー 電子 電流 電流測定法、ボルタンメトリー、キャパシタンス、 開始 インピーダンス、電流測定検出、サイクリック・ボルタ ンメトリー 電子 光 ケミルミネセンス、 開始 エレクトロケミルミネセンス、 エレクトロルミネセンス 本明細書中の“光”は電磁放射線を意味し、UV光、可視範囲及び赤外範囲が好 ましく、UV及び可視が最も好ましい。 好ましい実施態様において、電子伝達の開始は直接又は間接の光活性化（“ラ イト・イゾ”）による。簡単には、適当な波長の電磁放射線がＤＮＡの一つの末 端の酸化還元分子に衝突して、ドナー部分電子の励起を生じ、これが直ちに崩壊 し、又は分子内電子伝達に関係する。電子伝達が誘導される効率は電子ドナーと 電子アクセプターの間の電子結合に依存し、それ故、核酸が一本鎖又は二本鎖の いずれであるのかに依存する。加えて、電子伝達の効率は使用した光の波長にお ける電子ドナーの吸光係数（高い方が良好である）及びドナー電子励起状態の寿 命（長い方が良好である）に依存する。それ故、好ましいドナー錯体はアクリジ ンオレンジ、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−２，７−ジアザピレニウムジクロリド(DAP²⁺ )、メチルビオロゲン、エチジウムブロミド、キノン、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジメ チルアントラ（２，１，９−ｄｅｆ．６，５，10−ｄ’ｅ’ｆ’）ジイソキノリ ンジクロリド(ADIQ²⁺)、ポルフィリン（［メソーテトラキス（Ｎ−メチル−χ− ピリジニウム）ポルフィリンテトラクロリド］を含む。遷移金属ドナー及びアク セプターはルテニウム、レニウム及びオスミウム（最も好ましい）の錯体を含み 、この場合、リガンドの少なくとも一つは発色団である。 又、光活性化がエネルギーを分子間プロセスによりＤＮＡの電子ドナー部分に 伝達する“媒介物質”を励起するのに使用し得る。このような媒介物質として、 モリブデンハライド及びタングステンハライド、レニウム、オスミウム及びルテ ニウムのトリスビピリジル錯体を含む遷移金属の水溶性かつ安定な錯体が挙げら れる。加えて、その他の例として、ビピリジル錯体及びピリジル錯体、例えば、 Re(bpy)(CO)₃X(式中、Ｘはハライドである)及びRe(py)₄O₂が挙げられる。その他 の例として、遷移金属ダイマー、例えば、[Re2C18］²⁺及び［Pt₂(P₂O₅H₂)₄］^4- が挙げられる。ルテニウムトリスビピリジン(Ru²⁺(bpy)₃）が最も好ましい。 好ましい実施態様において、電子伝達はレーザーによる光誘導後に起こる。こ の実施態様において、電子ドナー部分は、電子を供与した後に、或る状況下で電 子アクセプターとして利用できる。同様に、電子アクセプター部分は或る状況下 で電子ドナーとして利用できる。 好ましい実施態様は電子活性化を利用し、電圧が好ましい。電位は電極への修 飾核酸の直接結合により、又は電子輸送媒介物質を使用して修飾核酸プローブを 含むサンプルに適用される。直接結合は電子を電極から（電極が又検出に使用さ れる場合には電極へ）シャトルするために酸化還元活性ポリマーを伴い得る。こ のようなポリマーが以下に概説される。又、直接接続は、結合がかなり短く保た れること（６未満のシグマ結合）を条件として比較的不十分な導電結合を伴い得 る。好ましい結合は以下に概説されるように電極からの電子の有効な伝達を可能 にする長さの３以下のシグマ結合であろう。 間接電子伝達開始は電子伝達媒介物質又は有効な拡散可能な電子ドナー及びア クセプター、例えば、水溶性フェロセン／フェリシニウム、ヒドロキノン／キノ ン、有機塩の還元成分及び酸化成分、コバルトセン、モリブデン、タングステン 及び鉄のヘキサシアニド及びオクタシアニドを伴う。加えて、その他の例として 、Co（エチレンジアミン）₃及びRu（エチレンジアミン）₃並びに遷移金属、例え ば、Co、Ru,.Fe、及びOsのトリスビピリジル錯体及びヘキサミン錯体を含む、遷 移金属、例えば、コバルト、ルテニウム及びニッケルの巨大環及びキレートリガ ンドが挙げられる。K.Alyanasundaram，Coord.Chem.Rev.46巻，159頁，1982を参 照のこと。最後に、フェロセンが最も好ましい場合、有機分子、例えば、４， ４’−ビピリジン及び４−メルカプトピリジンが例である。 適用電位の正確な調節及び変化はポテンシオスタット及び３電極系（一つの基 準電極、一つのサンプル電極及び一つの対向電極）によるものであってもよい。 これは核酸に結合された電子アクセプターの選択に一部依存する系のピーク電子 伝達電位に対する適用電位のマッチングを可能にする。遷移金属のビスビピリジ ル錯体、例えば、ルテニウムビスビピリジル錯体及びレニウムビスビピリジル錯 体、例えば、（Ru(bpy)₂im-)を電子アクセプターとして使用して、高い駆動力が 得られる。 又、電子伝達の電気化学的開始が使用されてもよい。核酸に結合された電子ド ナー部分及び電子アクセプター部分の酸化還元状態は、光活性化又は電気活性化 を用いて、又は用いずに、水溶性化学酸化剤及び還元剤を使用して電気化学的に 変化し得る。このような化合物として、当業界で知られている多数の誘導体(T.K uwana,Electrochemical Studies of Biological Systems，(D.T.Sawyer編集)ACS Symp.Series#38，(1977))が挙げられ、又ヘキサシアノ鉄錯体、亜鉛−水銀アマ ルガム、並びにルテニウム及び鉄のトリスフェナントロリン錯体が挙げられる。 核酸中の電子伝達は種々の方法で検出し得る。種々の検出方法が使用されても よく、光学検出（これは蛍光、りん光、及び屈折率を含む）；並びに電子検出（ 電流測定法、ボルタンメトリー、キャパシタンス及びインピーダンスが挙げられ るが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。これら の方法として、AC電流又はDC電流、パルス化方法、ロック−イン技術、フィルタ リング（高域、低域、帯域）、及び時間分解蛍光を含む時間分解技術に基く時間 又は周波数依存方法が挙げられる。幾つかの実施態様において、必要とされる全 てが電子伝達検出である。その他の実施態様において、電子伝達の速度が測定し 得る。 一実施態様において、核酸二重らせんの一つの末端から他の末端への電子の有 効な伝達は電子ドナー及びアクセプターの両方の酸化還元状態のステレオタイプ 変化をもたらす。ビピリジン環、ピリジン環及びイミダゾール環を含むルテニウ ムの錯体を含む多くの電子伝達部分では、酸化還元状態のこれらの変化はスペク トル特性（“ライト・アウト”）の変化と関連している。吸光度の有意な差がこ れらの分子の還元状態及び酸化状態の間に観察される。スペクトロフォトメータ ー又は簡単な光電子倍増管装置を使用して、これらの差が監視し得る。 この実施態様において、可能な電子ドナー及び電子アクセプターとして、光活 性化又は開始について上記された全ての誘導体が挙げられる。好ましい電子ドナ ー及び電子アクセプターは酸化及び還元後に特徴的に大きいスペクトル変化（大 きい吸光係数“デルタ”）を有し、電子伝達の高感度監視をもたらす。このよう な例は、好ましい例としてRu(NH₃)₄py及びRu(bpy)₂imを含む。ドナー又はアクセ プター（これは吸光度により監視される）のみが理想的なスペクトル特性を有す る必要があることが理解されるべきである。即ち、電子ドナーのみが吸光度変化 について監視される場合、電子アクセプターが光学的に非可視性であってもよい 。 好ましい実施態様において、電子伝達は蛍光検出される。ルテニウムの錯体を 含む種々の遷移金属錯体が特有の蛍光特性を有する。それ故、核酸に結合された 電子ドナー及び電子アクセプターの酸化還元状態の変化が蛍光を使用して非常に 感度良く監視し得る。例えば、二本鎖核酸中の高度に有効な電子伝達は、他方の 末端の電子伝達部分が励起される時に核酸プローブの一つの末端で蛍光Ru（４， ７−ビフェニル₂−フェナントロリン）₃ ²⁺の生成をもたらす。この化合物の生成 は通常の蛍光アッセイ技術を使用して容易に測定し得る。例えば、レーザー誘導 蛍光が通常の単一セルフルオリメーター、フロースルー“オンライン”フルオリ メーター（例えば、クロマトグラフィー系に結合されたもの）又は96ウェルイム ノアッセイのために市販されたものと同様のマルチサンプル“プレート−リーダ ー”中で記録し得る。 又、蛍光は、溶液中又は繊維光学装置に結合された核酸プローブを含む繊維光 学センサーを使用して測定し得る。蛍光は光電子倍増管又は繊維光学装置に結合 されたその他の光検出装置を使用して監視される。この系の利点は分析し得るサ ンプルの極めて小さい容積である。 加えて、走査蛍光検出器、例えば、モレキュラー・ダイナミクスにより販売さ れるフルオリメジャーが固体表面に配列された修飾核酸分子の蛍光を監視するの に理想的に適している。この系の利点は数千の特有の核酸プローブで覆われたチ ップを使用して一度に走査し得る多数の電子伝達プローブである。 多くの遷移金属錯体が大きいストークスシフトで蛍光を示す。好適な例として 、ルテニウムの如き遷移金属のビスフェナントロリン錯体及びトリスフェナント ロリン錯体並びにビスビピリジル錯体及びトリスビピリジル錯体が挙げられる(J uris,A.，Balzani,V.ら，Coord.Chem.Rev.，84巻，85-277頁，1988を参照のこと )。好ましい例は有効な蛍光（かなり高い量子収量）だけでなく、低い再編成エ ネルギーを示す。これらとして、Ru（４，７−ビフェニル₂−フェナントロリン ）₃ ²⁺及びRu（４，４’−ジフェニル−２，２’−ビピリジン）₃ ²⁺が挙げられる 。 又、ハイブリダイゼーションと関連する蛍光の低下がこれらの系を使用して測 定し得る。一本鎖核酸（他方の末端に“アクセプター”を有する）にある時に容 易に蛍光を発する電子伝達“ドナー”分子は、相補核酸がプローブを結合する時 に蛍光強さの低下を受けて励起状態電子の有効な伝達を可能にする。蛍光のこの 低下が上記と同じ方法を使用して標的配列の存在のインジケーターとして容易に 監視し得る。 更に別の実施態様において、エレクトロケミルミネセンスが電子伝達検出の基 礎として使用される。或る種の電子伝達部分、例えば、Ru²⁺(bpy)₃では、直接ル ミネセンスが励起状態崩壊を伴う。この性質の変化は核酸ハイブリダイゼーショ ンと関連し、簡単な光電子倍増管配置で監視し得る(Blackburn,G.F．C1in.Chem. 37:1534-1539(1991);及びJurisらの上記文献を参照のこと）。 好ましい実施態様において、電流測定法、ボルタンメトリー、キャパシタンス 、及びインピーダンスを含む電子検出が使用される。好適な技術として、電解重 量法、クーロメトリー（調節電位クーロメトリー及び一定電流クーロメトリーを 含む）、ボルタメトリー（サイクルボルタメトリー、パルスボルタメトリー（通 常のボルタメトリー、方形波ボルタメトリー、差動パルスボルタメトリー、オス ターヤング方形波ボルタメトリー、及びクーロスタチックパルス技術）、ストリ ッピング分析（アニオンストリッピング分析、カチオンストリッピング分析、方 形波ストリッピングボルタンメトリー）、コンダクタンス測定（電解コンダクタ ンス、直接分析）、時間依存性電気化学分析（クロノ電流測定、クロノポテンシ オメトリー、サイクルクロノポテンシオメトリー及び電流測定法、ACポログラフ ィ ー、クロノガルバメトリー、及びクロノクーロメトリー）、ACインピーダンス測 定、キャパシタンス測定、並びに光電気化学が挙げられるが、これらに限定され ない。 好ましい実施態様において、核酸中の電子伝達の監視は、共有結合電極を直接 使用し、又は電子伝達“媒介物質”を間接的に使用して電子を核酸から電極にシ ャトルして、電流測定検出による。核酸を電極及び可能な媒介物質に結合する様 式が以下に記載される。電流測定検出器は、例えば、血液グルコースを監視する のに現在使用されている多数の酵素をベースとするバイオセンサーに似ているで あろう。検出のこの方法は関係する標的遺伝子を含むサンプル中で電位（セパレ ート基準電極と比較して）核酸結合電極と補助（対向）電極の間に適用すること を伴う。異なる効率の電子伝達が標的核酸の存在又は不在下でサンプル中で誘導 される。即ち、一本鎖プローブは標的配列にハイブリッド形成されたプローブと は異なる速度を示す。電子伝達の異なる効率は異なる電流が電極中で発生される ことをもたらす。 電子伝達を電流測定により測定するための装置は感度の良い（ナノアンペア〜 ピコアンペア）電流検出を伴い、電圧電位を調節する手段、通常ポテンシオスタ ットを含む。この電圧は核酸の電子供与錯体の電位を基準として最適化される。 可能な電子供与錯体として、前記のものが挙げられ、ルテニウムの錯体が好まし く、レニウムの錯体が最も好ましい。 好ましい実施態様において、別の電子検出様式が利用される。例えば、ポテン シオメーター測定（又はボルタンメトリー測定）は非ファラデー（正味の電流で はない）プロセスを伴い、従来pH検出器及びその他のイオン検出器に利用されて いる。同様のセンサーが核酸中の電子伝達を監視するのに使用される。加えて、 絶縁体のその他の性質（例えば、抵抗）及びコンダクターのその他の性質（例え ば、導電性、インピーダンス及びキャパシタンス）が核酸中の電子伝達を監視す るのに使用し得る。最後に、電流（例えば、電子伝達）を発生するあらゆる系は 小さい磁場を発生し、これが幾つかの実施態様において監視し得る。 本発明の組成物中で観察される電子伝達の速い速度の一つの利点は、時間分解 が吸光度、蛍光及び電流に基くモニターのシグナル対ノイズ結果を大いに増進し 得ることが理解されるべきである。本発明の電子伝達の速い速度は高いシグナル 及び電子伝達開始と完結の間のステレオタイプの遅延の両方をもたらす。特別な 遅延のシグナルを増幅することにより、例えば、電子伝達のパルス化開始及び検 出の“ロック−イン”増幅器の使用により、シグナル対ノイズの２〜４倍の大き さの改良が達成し得る。 好ましい実施態様において、ＤＮＡが電子ドナー部分及び電子アクセプター部 分の付加により修飾される。別の実施態様において、ＲＮＡが修飾される。更に 別の実施態様において、バイオコンデンサー用の二本鎖核酸は或る種のデオキシ リボースヌクレオシド、或る種のリボースヌクレオシド、及びアデノシン塩基、 チミジン塩基、シトシン塩基、グアニン塩基及びウラシル塩基の混合物を含むで あろう。 本発明の更に別の局面によれば、ドナー及びアクセプターに好ましい製剤は一 連のリガンドに共有結合され、更にリボース環（2'位又は3'位）の一部としてア ミン基又はペプチド結合、ホスホルアミデート結合、ホスホロチオエート結合、 ホスホロジチオエート結合又はＯ−メチルホスホルアミデート結合により結合さ れたヌクレオシドダイマーの一部として窒素原子もしくは硫黄原子に共有結合さ れた遷移金属を有するであろう。 好ましい実施態様において、少なくとも一つの電子伝達部分を含むオリゴヌク レオチドが電極に結合され、これが又電子伝達部分として利用でき、こうして先 に概説された様式で結合された電子ドナー部分及び電子アクセプター部分の両方 を有する一本鎖核酸を形成する。電子伝達部分を含む一本鎖核酸は共有結合され 、又は電子ドナーと電子アクセプターの間の電子伝達を可能にするために電極か ら一本鎖核酸への電子の伝達を可能にするような方法で結合されることが好まし い。非電極電子伝達部分はオリゴヌクレオチドの末端付近で結合されることが好 ましく、その結果、標的配列にハイブリッド形成されるプローブ配列がドナーと アクセプターの間にある。電極は標的配列を含むサンプル中に浸漬されてもよく 、その結果、標的配列がプローブにハイブリッド形成し、先に概説された技術を 使用して、電子伝達が検出し得る。 付加的な実施態様において、２種の核酸が前記のようにプローブとして利用さ れる。例えば、一つの核酸が電子伝達部分として利用できる固体電極に共有結合 され、共有結合された電子伝達部分を含む他方の核酸が溶液中で自由である。標 的配列のハイブリダイゼーション後に、２種の核酸は、ハイブリッド形成された 核酸の電子伝達部分と電極の間の電子伝達が起こるように配列される。当業界で 公知の技術を使用して、電子伝達が先に概説されたように検出される。 下記の実施例は上記発明の使用様式を更に充分に記載するのに利用できるだけ でなく、本発明の種々の局面を実施するのに意図される最良の様式を示すのに利 用できる。これらの実施例は本発明の真の範囲を限定するのに利用できないが、 説明の目的のために示されることが理解される。本明細書に引用された文献は明 らかに参考として含まれる。 実施例 アミノ修飾モノマー単位を種々の公表された操作により調製し、通常の合成技 術により成長しているオリゴヌクレオチドにとり込む。その操作がＤＮＡ誘導体 及びＲＮＡ誘導体の両方に適用できる。 実施例１ 5'末端に電子伝達部分を有するオリゴヌクレオチド二重らせんの合成 この実施例において、８種のヌクレオチド二本鎖核酸を生成し、夫々の一本鎖 がリボース糖の2'炭素で5'末端ウリジンヌクレオチドに共有結合された単一電子 伝達部分を有していた。 工程１：５’−ジ（ｐ−メトキシフェニル）メチルエーテル−２’−（トリフル オロアセトアミド）−２’−デオキシウリジンの合成 公表された操作(Imazawa，上記文献）をわずかにに改良して調製した２’−（ トリフルオロアセトアミド）−２’−デオキシウリジン(2.0g、5.9ミリモル)を 非常に乾燥したCH₃CNの最小量に繰り返して溶解し、回転蒸発させて乾燥させ、 次いで不活性雰囲気真空ラインに移し、更に１時間の期間にわたって乾燥させた 。その物質の合成について下記の操作をGait（上記文献）から採用した。正圧の ア ルゴンの雰囲気下で、物質を新たに乾燥し、蒸留したピリジンに攪拌しながら溶 解し、４−ジメチルアミノピリジン(DMAP)0.05当量（重量）、トリエチルアミン (TEA)1.5当量及び４，４’−ジメトキシトリチルクロリド(DMTr-Cl)1.2当量を反 応混合物に添加した。反応の進行をシリカゲルTLC(98:2の塩化メチレン：メタノ ール、移動相)により監視した。30分後に、追加の夫々0.5当量のDMTr-Cl及びTEA を添加し、反応を更に３時問進行させた。この反応混合物に、等しい容積の水を 添加し、その溶液をジエチルエーテルで数回抽出した。エーテル層を回転蒸発さ せて乾燥させ、少量の塩化メチレンに再度溶解し、フラッシュクロマトグラフィ ー(99:1の塩化メチレン：メタノール、移動相）により精製して５’−ジ（ｐ− メトキシフェニル）メチルエーテル−２’−（トリフルオロアセトアミド）−２ ’−デオキシウリジン生成物を得た。 工程２：５’−２’−アミノウリジン−GCTACGA及び５’−２’−アミノウリジ ン-CGTAGCA ５’−ジ（ｐ−メトキシフェニル）メチルエーテル−２’−（トリフルオロア セトアミド）−２’−デオキシウリジンを減圧（ガラス）で乾燥させ、新たに乾 燥し、蒸留したCH₃CNに溶解し、特別につくった円錐バイアルに入れ、ABI DNA合 成装置に入れた。標準（即ち、末修飾）のオリゴヌクレオチドの調製のプログラ ムを最終の塩基（アミノ修飾）添加中に15-30分のカップリング時間に変更した 。オリゴヌクレオチドを通常の操作によりカラムから開裂し、C-18逆相HPLCによ り精製した。この様式において、５’−２’−アミノウリジン−GCTACGA及び５ ’−２’−アミノウリジン−CGTAGCAを調製した。加えて、両生成物の未修飾相 補ストランドを以下の電子伝達部分合成における使用のためにつくった。 工程３：５’−２’−ルテニウムビスビピリジンイミダゾール−アミノウリジン −GCTACGA 先の工程で生成した５’−２’−アミノウリジン−GCTACGAを、通常の技術を 使用して相補末修飾ストランドにアニールした。アニールされた二重らせんの全 ての操作を、遷移金属錯体の添加の前に４℃で取り扱った。ＤＮＡが修飾中にア ニールされたまま残ることを保証するために、反応を1Mの塩中で行った。5'−ア ミノ修飾二重らせんＤＮＡを0.2MのHEPES、0.8MのNaC1、pH6.8に溶解し、シュレ ンクラインで繰り返して排気した。先に調製したルテニウムビスビピリジンカー ボネートを上記緩衝液に溶解し、酸素を反復排気及びシュレンクラインによるア ルゴンによるパージにより除去した。ルテニウム錯体をカニューレ（アルゴン／ 真空）によりＤＮＡ溶液に移し、反応を正圧アルゴン雰囲気下で24時間攪拌して 進行させた。この反応に、50当量のイミダゾールをフラスコに添加し、反応を更 に24時間進行させた。反応混合物を真空ラインから除去し、PD-10ゲル濾過カラ ムに適用し、水で溶離して過剰のルテニウム錯体を除去した。回収したフラクシ ョンの容積をスピード・バクにより減少して乾燥させ、固体を0.1Mのトリエチル アンモニウムアセテート(TEAC)pH6.0に吸収させた。二重らせんＤＮＡを50％の ホルムアミドとともに15分間にわたって60℃に加熱して二重らせんを変性した。 ダイオードアレイ検出器を備えたC-18逆相HPLCカラムを使用し、0.1MのTEAC、pH 6.0中の３％〜35％のアセトニトリルの勾配を使用して、一本鎖ＤＮＡを精製し た。 工程４：５’−２’−ルテニウムテトミンピリジン−アミノウリジン−CGTAGCA ５’−アミノウリジン−CGTAGCA(O.3μｍ)を0.2MのHEPES、0.8MのNaCl緩衝液 、pH6.8に溶解し、真空ラインで脱気した。攪拌棒及び栓を備えた10mlの円錐形 フラスコに、同緩衝液中でRu(III)テトラアミンピリジンクロリド(10μm)をスラ リーにした。セパレートフラスコ中で、Zn/Hgアマルガムを調製し、減圧で乾燥 させ、ルテニウム(III)溶液を（カニューレにより）Zn/Hgアマルガムに移した。 透明な黄色の溶液（λ_max=406nm）の即時の生成は、ルテニウムの還元形態が得 られたことを示し、その反応を30分間にわたって進行させた。この溶液をアミノ 修飾ＤＮＡを含むフラスコに移し、反応を室温で24時間にわたってアルゴン雰囲 気下で進行させた。その反応混合物を真空ラインから除去し、50倍過剰のコバル トEDTA（Kirschner，Inorganic Synthesis(1957)，186頁）をその溶液に添加し た。溶液をセファデックスG-25ゲル濾過カラムに適用して過剰のルテニウム錯体 を除去し、上記のようにして逆相HPLCにより精製した。２種のルテニウム修飾ヌ クレオチドを通常の技術によりアニールし、特性決定した（実施例５を参照のこ と）。 実施例２ 5’末端に電子伝達部分を有する長いＤＮＡ二重らせんの合成 この実施例において、in vitroＤＮA増幅技術、PCR(Abramsonら，Curr.Op.inB iotech.4:41-47(1993))を使用してヌクレオチド・オフ修飾プライマーストラン ドの重合(Saikiら，Science 239:487(1988))により修飾二重らせんＤＮＡを生成 する。長さ18塩基の互いに相補性ではない２種のオリゴヌクレオチドを実施例１ のように5'ヌクレオチドの2'-リボース位置にアミノ修飾により合成する。 40塩基で開始して次第に増加する長さの一連のオリゴヌクレオチドを、通常の 化学を使用して化学合成する。PCR鋳型の夫々が一つの修飾18merと同じ5'配列を 共有する。鋳型オリゴヌクレオチドの3'末端は別の18merに相補性の配列を共有 する。 PCRは鋳型としての未修飾ストランドを使用して修飾18merの夫々の5'-3'ＤＮ Ａ合成の触媒作用により修飾二重らせんＤＮＡを生成する。夫々100ナノモルの ２種の修飾18merを、2,000単位のTaqポリメラーゼ、夫々0.2Mのデオキシリボヌ クレオシドトリホスフェート、50mMのKCl、10mMのトリス-C1、pH8.8、1.5mMのMg Cl₂、３mMのジチオスレイトール及びO.1mg/mlのウシ血清アルブミンを含む水溶 液１mlと混合する。長さ40塩基の鋳型ストランド１モル％(ferntomole)を混合物 に添加する。サンプルを変性のために１分間で94℃で加熱し、アニールのために 55℃で２分間加熱し、伸長のために72℃で３分加熱する。自動化熱サイクラーを 使用して、このサイクルを30回繰り返す。 5'末端の両方に遷移金属錯体を有する増幅された鋳型配列をアガロースゲル電 気泳動により精製し、電子伝達用途に直接使用する。 実施例３ 二重らせんＤＮＡのヌクレオチド間結合で共有結合された電子伝達部分の合成 この実施例において、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合とは別の主 鎖を使用する。これらのヌクレオチド間結合にとり込まれた官能基は電子伝達部 分の共有結合のための部位として利用できる。これらの別のヌクレオチド間結合 として、ペプチド結合、ホルホルアミデート結合、ホスホロチオエート結合、ホ スホロジチオエート結合及びＯ−メチルホスホルアミデート結合が挙げられるが 、これらに限定されない。 ペプチド核酸(PNA)の調製は選択された塩基（チミジン）のBoc-保護ペンタフ ルオロフェニルエステルの合成により文献操作（Engholm・,上記文献を参照のこ と）に従う。メリーフィールド固相アプローチ(Merrifield，Science，232:341( 1986))を使用し、CH₂Cl₂中30％(v/v)のDMF中のチミニルモノマー0.1Mによる単一 カップリングプロトコルを使用して、得られるPNAを調製し得る。その反応の進 行に続いて、定量的ニンヒドリン分析(Sarin,Ana1.Biochem.，117:147(1981))を 行う。得られるPNAを実施例１に概説したように適当な遷移金属錯体で修飾し得 る。 ホスホルアミデート(Beaucage,上記文献、Letsinger,上記文献、Sawai,上記文 献）及びＮ−アルキルホスホルアミデート(Jager，上記文献)ヌクレオチド間結 合の合成はごくわずかな改良で通常の文献操作に従う（その操作は固体担体への 単一塩基の添加後に停止され、次いで開裂されてジヌクレオチドホスホルアミデ ートを得る）。典型例は5'Ｏ−イソブチルオキシカルボニルチミジル−（３’− ５’）−５’−デオキシチミジンのフェニルエステルの調製である(Letsinger,J .Org.Chem.,上記文献）。確立された自動化技術を使用して、ダイマー単位をＤ ＮＡの調製中に選択された間隔で通常のオリゴヌクレオチドに代えて置換する。 修飾結合の遷移金属修飾は実施例１に記載されたように起こる。 ホスホロチオエート及びホスホロジチオエート(Eckstein,上記文献、及びその 中の引用文献）ヌクレオチド間結合の合成が良く報告されている。公表されたプ ロトコルはテトラエチルチウラムジスルフィド(TETD)(Iyer，J.Org.Chem.55:469 3(1990))による硫化後にキャップする修飾β−シアノエチルホスホルアミジトサ イクルを使用してアプライド・バイオシステムズＤＮＡ合成装置を利用する。ホ スホロチオエート類似体及びホスホロジチオエート類似体をダイマーとして調製 し、固体担体から開裂し、HPLC（アセトニトリル／トリエチルアンモニウムアセ テート移動相）により精製する。 実施例４ 夫々5'末端に電子伝達部分を有する２種のオリゴヌクレオチドの合成 この実施例において、単一標的配列にハイブリッド形成し、介在配列を含まな い２種のオリゴヌクレオチドをつくる。一種のオリゴヌクレオチドは5'末端に共 有結合された電子ドナー部分を有し、他方のオリゴヌクレオチドは5'末端に共有 結合された電子アクセプター部分を有する。この実施例において、電子伝達種を ウラジンヌクレオチドにより結合するが、当業者は本法がヌクレオチドのいずれ をも修飾するのに使用し得ることを理解するであろう。加えて、当業者は、その 操作が8-merの生成に限定されないが、種々の長さのオリゴヌクレオチドプロー ブの生成に有益であることを認めるであろう。 生成された8-merが互いに相補ではなく、その代わりに16ヌクレオチドの標的 配列に相補性であること以外は、操作は正確に実施例１と同様である。こうして 、実施例１の工程４の最終アニール工程は行われない。その代わりに、２種の修 飾オリゴヌクレオチドを標的配列にアニールし、得られる錯体を実施例５のよう にして特性決定する。 実施例５ 修飾核酸の特性決定 酵素消化 確立されたプロトコルを使用して、実施例１の修飾オリゴヌクレオチドを酵素 消化にかけ、ホスホジエステラーゼ及びアルカリ性ホスファターゼとの逐次反応 によりそれらの構成ヌクレオシドに変換した。標準物質（２’−アミノウリジン 及び２’−アミノアデニンを含む）に対する消化オリゴヌクレオチドの実験で得 られた積分HPLCプロフィール及びUV-visスペクトルの比較により、子想された保 持時間におけるアミノ修飾塩基の存在及び特徴的なUV-visスペクトルを確認した 。同じ操作を遷移金属修飾二重らせんＤＮＡについて行い、構成ヌクレオシドの 帰属は予想された部位における単一部位修飾を実証した。蛍光標識アミノ修飾オリゴヌクレオチド 蛍光色素、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)は修飾オリゴヌクレオチ ドの一級アミンを標識するのに特異性であるが、一方、ヌクレオチド塩基に存在 するアミン又はアミドに結合しないことが実証されていた(Haugland,Handbook o f Fluorescent Probes and Research Chemicals,第５編，(1992))。実施例１に 記載されたようにして合成したアミノ−オリゴヌクレオチドを使用し、２’−ア ミノ−リボース基が存在しない同じ塩基配列について、この反応を行った。蛍光 分光測定をこれらのオリゴヌクレオチドの両方について得、結果は５’−末端リ ボース環にアミンの存在を確認する。修飾二重らせんＤＮＡの熱力学的融解曲線 二重らせんＤＮＡの熱力学的パラメーターの測定について良く確立された技術 はＤＮＡ融解曲線の獲得である。当業界で公知の技術を使用して、修飾二重らせ んＤＮＡの濃度の関数としての一連の融解曲線を温度調節UV-vis（ヒューレット ・パッカード）により測定した。これらの結果は、アミノ修飾ＤＮＡ及び遷移金 属修飾ＤＮＡのハイブリダイゼーションが起こったことを確認する。加えて、こ れらの結果は、修飾ＤＮＡが未修飾オリゴヌクレオチド標準物質の安定性に匹敵 する安定な二重らせんを形成することを示す。二次元核磁気共鳴(NMR)分光分析 この研究の一部として合成したアミノ修飾オリゴヌクレオチドを充分な量（６ マイクロモル）で調製して600MHzバリアンNMRスペクトロメーターを使用する¹H プロトンNMRスペクトルの帰属を可能にした。電子伝達の速度の測定 測定技術の優れた総説がWink1erら，Chem.Rev．92:369-379（1992）に見られ る。ドナーはRu(bpy)₂(NHウリジン)im、Ｅ⁰約1Vであり、アクセプターはRu(NH₃)₄ py(NHウリジン)im、Ｅ⁰約330mVである。精製遷移金属修飾オリゴヌクレオチド （U_NHRu(_bpy)_2immGCATCGA及びU_{NHRu(NH3)4(py)im}CGATGCA)を、等モル量のオリゴ ヌクレオチドの混合物（緩衝液２ml中のＤＮＡの30μモル:60nモ ル）をpH6.8（100mMのNaPi、900mMのNaCl）中で10分間にわたって60℃に加熱し 、４時間の期間にわたって室温に徐々に冷却することによりアニールした。その 溶液を真空ラインへの付着のためのアダプター及び磁気撹拌棒を備えた不活性雰 囲気キュベットに移した。溶液を数回脱気し、シールした装置をArガスで繰り返 し再充満した。 XeCl励起剤ポンプ輸送色素レーザーを使用して、全装置をセットアップの一部 としてキュベットホルダーに挿入し、データを360、410、460及び480nmを含む幾 つかの波長で獲得した。光誘導電子伝達速度は28Åの距離にわたって1.6Ｘ10⁶s^{- 1} である。 実施例６ 二つの電子伝達部分で標識された一本鎖核酸の合成 この実施例は先に記載された基本操作を使用して結合された電子伝達部分を夫 々有する２種の修飾オリゴヌクレオチドを生成する。互いの２種の修飾ストラン ドの連結反応は四つの配置：5'及び3'標識末端、5'標識末端及び内部ヌクレオチ ド標識、3'標識末端及び内部ヌクレオチド標識、及び二重内部ヌクレオチド標識 のいずれかを有する二重標識核酸を生じる。詳しくは、5'末端の電子伝達ドナー 部分及び内部電子伝達部分を有する長さ24塩基のオリゴヌクレオチドの合成が記 載される。 長さ12塩基の２種の5'標識オリゴヌクレオチドの夫々500ナノモルを一種のオ リゴヌクレオチド、“Ｄ”についてルテニウム(II)ビスビピリジンイミダゾール を、又第二オリゴヌクレオチド、“Ａ”についてルテニウム(II)テトラアミンピ リジンを用いて上記のようにして合成する。 オリゴヌクレオチド“Ｄ”、続いて5'から3'方向にオリゴヌクレオチド“Ａ” の並置に相補性の長さ24塩基の未修飾オリゴヌクレオチドを標準合成技術により 生成する。このハイブリダイゼーション鋳型500ナノモルを500mMのトリス-Cl、p H7.5、50mMのMgCl₂、50mMのジチオスレイトール及び５mg/mlのゼラチンを含む水 溶液5ml中のオリゴヌクレオチド“Ａ”及び“Ｄ”の混合物に添加する。相補ス トランドへの標識オリゴヌクレオチドの最大ハイブリダイゼーションを促進 するために、その混合物を60℃で10分間インキュベートし、次いで約10℃／時間 の速度で12℃の最終温度に徐々に冷却する。二つの標識ストランドの酵素連結反 応を12℃でT4DNAリガーゼで行ってその他の二重らせんへの二重らせんＤＮＡの 連結反応（ブラントエンド連結反応）及びオリゴマー化を阻止する。又、E.coli ＤＮＡリガーゼを使用することができる。何とならば、それはブラントエンド連 結反応を触媒作用しないからである。 T4DNAリガーゼ100ワイス単位をアニールされたＤＮＡに添加し、アデノシント リホスフェートを0.5mMの最終濃度まで添加する。オリゴヌクレオチド“Ａ”の5 '末端ホスフェートとオリゴヌクレオチド“Ｄ”の3'末端ヒドロキシル基の間の ホスホジエステル結合の形成を触媒作用する反応を12℃で18時間進行させる。そ の反応を75℃で10分間の酵素の熱不活化により停止する。二重標識オリゴヌクレ オチドを先の実施例のように尿素の存在下でHPLCにより単一標識オリゴヌクレオ チド及び相補末標識オリゴヌクレオチドから分離する。この実施例の二重標識オ リゴヌクレオチドは以下に詳述されるような光活性遺伝子プローブとしての使用 に理想的に適している。 実施例７ 相同核酸配列検出の光活性プローブとしての電子伝達部分を有する二重修飾オ リゴヌクレオチドの使用 この実施例は、シグナル検出の前の未ハイブリッド形成プローブの除去が必要 とされない遺伝子プローブアッセイの特異な型において実施例６のオリゴヌクレ オチド24merを利用する。そのアツセイ操作において、ヒト免疫不全ウィルス型 Ｉ(HIV-1)のgag遺伝子の領域をポリメラーゼ連鎖反応(Saikiら，Science239:487 -491(1988)）により増幅する。HIV-1のこの領域は異なる臨床分離株の間で高度 に保存される。 増幅された標的ＤＮＡvsHIV-1 DNAを欠いている対照を、実施例６の二重標識2 4merプローブ50ナノモルを含む6XSSC（0.9MのNaCl、0.09Mのクエン酸Na、pH7.2) のハイブリダイゼーション溶液に添加する。ハイブリダイゼーションを60℃で10 分間にわたって穏やかに攪拌しながら進行させる。レーザー励起後の電子伝 達の検出を実施例５のようにして行う。ハイブリッド形成したプローブを欠いて いる対照サンプルはごくわずかの電子伝達速度を示す。gag配列にハイブリッド 形成したプローブはＤＮＡ二重らせん中の有効かつ迅速な電子伝達を示し、高度 に特異性の均一かつ自動化可能なHIV-1検出アッセイを与える。 同様の均一遺伝子プローブアッセイは、一つが電子ドナーであり、他方が電子 アクセプターである二つのプローブの使用を伴い、これらはHIV-1のgag領域とタ ンデム形態でハイブリッド形成し、一つのプローブが他のプローブに隣接する。 このアッセイにおいて、二つの電子伝達部分間の電子結合は標的ＤＮＡとのハイ ブリダイゼーションに完全に依存する。適当な場合、一つのプローブから他のプ ローブへの電子伝達は、実施例６のようにしてT4DNAリガーゼを使用する並置末 端の連結反応により増進される。 実施例８ 金電極への結合のためのヒドロキシチオールの調製 OH(CH2)₁₆OHをアルドリッチから購入し、その物質を乾燥CH₂Cl₂中でスラリー にすることによりモノアセテート形態を調製した。ジメチルアミノピリジン0.5 当量をトリエチルアミン1.4当量及び無水酢酸１当量とともに添加した。その反 応を２時間進行させ、フラッシュクロマトグラフィー（80:20のヘキサン：ジエ チルエーテル）により精製した。 文献操作によりp-TS0Clを使用して、モノアセテート化合物をモノトシレート −モノアセテートに変換し、次いでトリフェニルメチルメルカプタンで処理した 。モノアセテートを除去するために、生成物をMeOH（１ミリモル、９ml）に溶解 し、０℃に冷却し、NaOH（１ミリモル、水２ml中）の水溶液を添加した。温度を 室温に徐々に上昇させ、反応をTLC(５％のMe0H/CH₂Cl₂)により追跡した。エステ ルが消失した後、その混合物を０℃に再度冷却し、pH紙を使用してKHSO₄でpH5-6 に酸性にした。Me0Hを蒸発させ、残渣をCH₂Cl₂(200m1)で抽出し、乾燥させ(Na₂S O₄)、蒸発させ、TLCによりチェックした。その物質を通常の操作によりホスホロ アミジト化した。この物質をＤＮＡ合成装置に挿入し、修飾オリゴヌクレオチド を生成した。Ru(bpy)₂CO₃、続いてイミダゾールを添加することにより、ホスホ ロアミジト化オリゴヌクレオチドをルテニウム錯体で修飾してRu(bpy)₂im オリゴヌクレオチドを得た。そのヌクレオチドを0.1Mのトリエチルアンモニウム アセテート(TEAA)緩衝液、pH7.5 200μｌにより溶解することにより、トリチル 保護基を除去した。1Mの硝酸銀溶液30μｌを添加し、その混合物を攪拌し、室温 で30分間インキュベートした。1Mのジチオスレイトール(DTT)50μを添加し、そ の混合物を攪拌し、15分間インキュベートし、その時点でそれを15分間にわたっ て微量遠心分離して沈殿したAg＋DTTを除去した。上澄みを回収し、ペレットをT E最緩衝液100μｌで洗浄し、溶液を溜めた。次いで得られたオリゴヌクレオチド を通常の技術により金表面に付着した。 実施例９ 電子アクセプター部分及び電子ドナー部分の両方を含む一本鎖核酸の合成 二重らせんＤＮＡ中の電子伝達プロセスの通路依存性を評価するために、3'末 端に電子ドナー及び5'末端に電子アクセプターを有するオリゴヌクレオチドを調 製した。両末端の末端リボースの2'位にアミンを有する誘導体を合成することに より、このマルチプライ修飾オリゴヌクレオチドを調製した。 ビス−３’，５’−２’−デオキシウリジンオリゴヌクレオチドの合成 ２’−アミノ−２’−デオキシウリジン(U_NH2)のDMT−２’−Ｎ−トリフルオ ロアセチル保護ホスホロアミジトを先に記載したようにして調製し、無水コハク 酸と反応させた。この物質をｐ−ニトロフェノールと反応させて図6Aのようなコ ントローラー細孔ガラス(GPG)樹脂への結合のための前駆体を生成した。修飾オ リゴヌクレオチドを通常の固相自動化ＤＮＡ合成技術により集合し、ビス−３’ ，５’−２’−アミノ−２’−デオキシウリジンオリゴヌクレオチドを単離し、 質量分光分析及びHPLC消化分析により特性決定した。加えて、アミノリボースオ リゴマー及びそれらの補体を一級アミンの標識を有利にする条件下でFITCと反応 させた。予想されたように、２’−アミノ−２’−デオキシリボース部位のみが 標識され、ＤＮＡの一級アミンの存在を確認した。例として、11塩基対配列を調 製し(U_NH2CTCCTACACU _NH2としての計算値3229;実測値3229.1)、その後の消化地 図は提案された構造と一致した。ビス−アミノ修飾オリゴヌクレオチドの金属修 飾を同様の様式で行った。新規な金属修飾オリゴヌクレオチドを蛍光標識、酵素 消化、及び二重らせん融解温度研究により特性決定した。熱変性実験及びアニー ル実験はルテニウムオリゴマー及びアミノリボースオリゴマーの両方について同 様の融解温度を示す。加えて、アミノ修飾二重らせんＤＮＡを2D NMRにより特性 決定した。これらのデータは、ドナー及びアクセプターが２’−アミノ−２’− デオキシリボース位置に共有結合されることを確認し、ＤＮＡ構造がルテニウム 錯体の存在により乱されないことを示す。 実施例10 多座ヌクレオシドの合成 ２’−アミノウリジン(10ミリモル)及びピリジン−２−カルボキシアルデヒド (11ミリモル)を、TLC(シリカゲル、30:70のMeOH:CHCl₃)が無極性生成物へのアミ ノウリジンの完全な変換を示すまで、無水エタノール中で加熱、還流させた。溶 媒を蒸発させ、残渣をメタノールに溶解し、NaBH₄11ミリモルを激しく攪拌しな がら添加した。水素発生が静まった時、その混合物を２時間にわたって加熱、還 流させ、溶媒を蒸発させた。残渣を水に溶解し、溶離剤として2MのNH₃を使用し てダウエックスAG-50による陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。 本明細書で注目されたように、NaCNBH₄の使用は生成物のワンポット合成を可能 にした。次いで生成物を図９に示されたように保護した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ウェルチ トーマス ダブリュー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 91101 パサディナ サウス マディソン 239―＃５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 共有結合された多座リガンドを含むヌクレオシドであって、前記リガンドが 前記ヌクレオシドの2'位又は3'位で結合したことを特徴とするヌクレオシド。 2. 前記結合が2'位である請求の範囲第１項に記載のヌクレオシド。 3. 前記結合が3'位である請求の範囲第１項に記載のヌクレオシド。 4. 共有結合された多座リガンドを含むホスホルアミジトヌクレオシドであって 、前記リガンドが前記ヌクレオシドの2'位で結合したことを特徴とするホスホル アミジトヌクレオシド。 5. 共有結合された多座リガンドを含む第一ヌクレオシドを含む組成物であって 、前記リガンドが前記ヌクレオシドの2'位で結合し、前記ヌクレオシドが調節細 孔ガラス(CPG)に共有結合したことを特徴とする組成物。 6. 調節細孔ガラス(CPG)に共有結合されたオリゴヌクレオチドを含む組成物で あって、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも一つのヌクレオシドが多座修飾ヌ クレオシドであることを特徴とする組成物。 7. 前記多座修飾ヌクレオシドが前記オリゴヌクレオチドの5'末端にある請求の 範囲第６項に記載の組成物。 8. 前記多座修飾ヌクレオシドが前記オリゴヌクレオチドの内部ヌクレオシドに ある請求の範囲第６項に記載の組成物。 9. 前記オリゴヌクレオチドに共有結合された第二２’−アミノ修飾ヌクレオチ ドを更に含む請求の範囲第６項に記載の組成物。 10．前記多座ヌクレオシドにキレート化された遷移金属を更に含む請求の範囲第 １項、第４項、第５項、又は第６項に記載の組成物。 11．少なくとも一つの電子ドナー部分及び少なくとも一つの電子アクセプター部 分を含む一本鎖核酸であって、前記電子ドナー部分及び前記電子アクセプター部 分が前記核酸に共有結合され、かつ前記電子ドナー部分及び前記電子アクセプタ ー部分の少なくとも一つが多座ヌクレオシドに結合されることを特徴とする一本 鎖核酸。 12．前記電子ドナー部分及び電子アクセプター部分の両方が多座ヌクレオシドに より結合される請求の範囲第11項に記載の核酸。 13．前記電子ドナー部分及び電子アクセプター部分の他方が末端塩基により結合 される請求の範囲第11項に記載の核酸。 14．前記電子ドナー部分及び電子アクセプター部分の他方がリボースホスフェー ト主鎖のリボースの2'位又は3'位により結合される請求の範囲第11項に記載の核 酸。 15．前記電子ドナー部分及び前記電子アクセプター部分の少なくとも一つが遷移 金属錯体である請求の範囲第11項、第12項、第13項、又は第14項に記載の核酸。 16．前記電子ドナー部分及び前記電子アクセプター部分の少なくとも一つが電極 である請求の範囲第11項、第13項、第14項、又は第15項に記載の組成物。 17．前記電子ドナー部分及び前記電子アクセプター部分の少なくとも一つが有機 電子ドナー又はアクセプターである請求の範囲第11項、第12項、第13項、第14項 、第15項、又は第16項に記載の組成物。 18．少なくとも一つの共有結合された電子ドナー部分を含む第一一本鎖核酸と少 なくとも一つの共有結合された電子アクセプター部分部分を含む第二一本鎖核酸 とを含む組成物であって、前記電子ドナー部分及び電子アクセプター部分の少な くとも一つが多座ヌクレオシドに結合されることを特徴とする組成物。 19．核酸サンプル中の標的配列の検出方法であって、 a)少なくとも一つの共有結合された電子ドナー部分及び少なくとも一つの共有 結合された電子アクセプター部分を含む一本鎖核酸を前記標的配列にハイブリッ ド形成してハイブリダイゼーション錯体を形成し（前記電子ドナー部分及び電子 アクセプター部分の少なくとも一つが多座ヌクレオシドに結合される）、そして b)前記標的配列の存在又は不在のインジケーターとしてハイブリダイゼーショ ン錯体中の前記電子ドナー部分及び電子アクセプター部分の間の電子伝達を検出 することを特徴とする検出方法。 20．核酸中の標的配列の検出方法（前記標的配列は第一標的ドメインと前記第一 標的ドメインに隣接する第二標的ドメインとを含む）であって、前記方法が a) 少なくとも一つの共有結合された電子ドナー部分を含む第一核酸を前記第一標的 ドメインにハイブリッド形成し、 b)少なくとも一つの共有結合された電子アクセプター部分を含む第二核酸を前 記第二標的ドメインにハイブリッド形成し（前記電子ドナー部分及び電子アクセ プター部分の少なくとも一つが多座リボヌクレオシドに結合される）、そして c)前記第一核酸及び第二核酸が前記核酸サンプル中の前記標的配列の存在又は不 在のインジケーターとして前記第一標的ドメイン及び第二標的ドメインにハイブ リッド形成される間に、前記電子ドナー部分と電子アクセプター部分の間の電子 伝達を検出することを特徴とする検出方法。 21．前記電子ドナー部分及び電子アクセプター部分の両方が多座ヌクレオシドに 結合される請求の範囲第19項又は第20項に記載の方法。 22．前記電子ドナー部分及び電子アクセプター部分の他方が末端塩基により結合 される請求の範囲第19項又は第20項に記載の方法。 23．前記電子ドナー部分及び電子アクセプター部分の他方がリボースホスフェー ト主鎖のリボースの2'位又は3'位で結合される請求の範囲第19項又は第20項に記 載の方法。 24．前記電子ドナー部分及び前記電子アクセプター部分の少なくとも一つが遷移 金属錯体である請求の範囲第19項及び第20項に記載の方法。 25．前記電子ドナー部分及び前記電子アクセプター部分の少なくとも一つが電極 である請求の範囲第19項及び第20項に記載の方法。 26.前記電子ドナー部分及び前記電子アクセプター部分の少なくとも一つが有機 電子ドナー又はアクセプターである請求の範囲第19項及び第20項に記載の方法。 27.核酸の3'末端で結合された電子伝達部分を有する前記核酸の生産方法であっ て、前記方法が a)多座ヌクレオシドを調節細孔ガラスに結合し、そして b)ホスホルアミジトヌクレオシドを前記修飾ヌクレオシドの5'末端に付加して 核酸を形成することを特徴とする核酸の生産方法。 28．核酸の5'末端で結合された電子伝達部分を有する前記核酸の生産方法であっ て、前記方法が a)ヌクレオシドを調節細孔ガラスに結合し、 b)ホスホルアミジトヌクレオシドを前記修飾ヌクレオシドの5'末端に付加して 核酸を形成し、そして c)多座ヌクレオシドを前記核酸の5'末端に付加することを特徴とする核酸の生 産方法。 29．内部ヌクレオシドで結合された電子伝達部分を有する核酸の生産方法であっ て、前記方法が a)ヌクレオシドを調節細孔ガラスに結合し、 b)必要によりホスホルアミジトヌクレオシドを前記ヌクレオシドの5'末端に付 加して核酸を形成し、 c)多座ヌクレオシドを前記核酸の5'末端に付加し、そして d)ホスホルアミジトヌクレオシドを前記多座ヌクレオシドの5'末端に付加する ことを特徴とする核酸の生産方法。 30．核酸の3'末端及び5'末端で結合された電子伝達部分を有する前記核酸の生産 方法であって、前記方法が a)第一多座ヌクレオシドを調節細孔ガラスに結合し、 b)ホスホルアミジトヌクレオシドを前記多座ヌクレオシドの5'末端に付加して 核酸を形成し、そして c)第二多座ヌクレオシドを前記核酸の5'末端に付加することを特徴とする核酸 の生産方法。 31．前記多座ヌクレオシドが結合された遷移金属を更に含む請求の範囲第27項、 第28項、第29項、又は第30項に記載の方法。 32．前記核酸を前記担体から開裂する工程を更に含む請求の範囲第27項、第28項 、第29項、又は第30項に記載の方法。