【発明の詳細な説明】
非対称ハンマーヘッド型リボザイム
〔序論〕
ハンマーヘッド型リボザイムは、多数の小環状植物病原性ＲＮＡ中の自己開裂
性モチーフとして見出された(Buzayanら，1986;Hutchinsら，1986;Symonds，199
2)。Uhlenbeck（Uhlenbeck，1987）は、リボザイムが、一定の二次構造と厳密な
配列要件とを有する非常に特異的な基質上で、真の酵素として二分子的に作用し
うることを示した。HaseloffおよびGerlach（Haseloffら，1988）は、該ハンマ
ーヘッドが、該酵素鎖上に保存ヌクレオチドを有する形態に分割され、該基質に
対する唯一の配列要件は、開裂部位の直ぐ5'側のＧＵＣであることを記載してい
る。この配列要件は過度に限定的であることが示されており、活性のためには、
開裂部位の直ぐ5'側の配列ＵＨが要求されるにすぎなかった（Perrimanら，1992
;Shimayamaら，1995;Zoumadakisら，1995）(Ｈ=Ａ，ＵまたはＣ)。この立体配置
は、1988年以降、ハンマーヘッド型リボザイムの設計のための範例となっている
。ハンマーヘッド型リボザイムの開裂機構は、普通は通常の酵素機構（すなわち
、可逆的酵素結合、開裂工程、可逆的な生成物の解離）に従って分析され、その
生成物は該反応中で消費されない(Hertelら，1994)。開裂工程は、ヘリックスＩ
およびIIIの長さおよび配列に実質的に左右されないと考えられている(Fedorら
，1992)。本発明者ら（Hendryら，1995）は既に、開裂速度定数がヘリックスＩ
およびIIIの長さおよび／または配列に依存しうることを示唆する多数の観察を
行なっている。
大きな触媒速度を有するリボザイムの必要性は大きい。高効率リボザイムに対
する要求は、修飾されたオリゴヌクレオチドを有するリボザイム化合物の場合に
は、出発物質の費用上の観点から特に重要である。現在までに、研究者らは、5'
および3'の両方のハイブリダイズ性（hybridizing）アーム（それぞれ、ヘリッ
クスＩおよびIII）の長さが様々のハンマーヘッド型リボザイムを製造している
が(Denmanら，1995;Ellisら，1993;Fedorら，1990;
Gastら，1994;Homannら，1994;Zoumadakisら，1995)、本発明は、劇的な速度の
増加を示す特異的非対称ハンマーヘッド型化合物の最初の開示である。
〔発明の概要〕
本発明は、後記の詳細な説明において定義される式：
で表される化合物に関する。該化合物は、デリバリー剤に共有結合していてもよ
い。また、本発明は、許容されるキャリアと共に該化合物を含んでなる組成物を
包含する。本発明はまた、ＲＮＡ標的配列の開裂方法であって、該標的配列を前
記化合物と接触させることを含んでなる方法を包含する。さらに、ある特定のＲ
ＮＡに関連したヒトまたは動物における疾患の治療方法であって、前記のヒトま
たは動物に該化合物を投与することを含んでなる方法も包含する。さらに、本発
明は、該化合物を含んでなる診断試薬も包含する。
〔図面の簡単な説明〕
図の注釈
図 １
相補的基質と複合体を形成しているハンマーヘッド型リボザイムの概要図。該
基質とリボザイムとの間で形成されるヘリックスはＩおよびIIであり、ヘリック
スIIは該リボザイム内で形成される。開裂部位において、Ｈ＝Ｃ、ＵまたはＡで
ある。ヌクレオチドのいくつかは、Hertelら（Hertelら，1992）の番号付けを用
いて表示されている。
図 ２
命名系を例示するための、いくつかのクルッペル基質およびリボザイムの
配列および構造。大文字はＲＮＡであり、小文字はＤＮＡである(配列番号5、7
〜13および15)。
図 ３
ヘリックスIIIの長さを一定（10bp）にした場合のヘリックスＩの長さに対す
る速度定数の依存性。開裂部位の3'側に種々のヌクレオチド数を有し5'側に10ヌ
クレオチドを有する基質が、それらの対応リボザイムにより開裂される；■Ｋｒ
ＲＡ-10/10。反応条件；10ｍＭＭｇＣｌ２、37℃、ｐＨ6.42。
図 ４
ヘリックスIIIの長さを一定（10bp）にした場合のヘリックスＩの長さに対す
る速度定数の依存性。開裂部位の3'側に種々のヌクレオチド数を有し5'側に10ヌ
クレオチドを有する基質が、それらの対応リボザイムにより開裂される；■Ｋｒ
ＲＡ-10/10；●ＴＡＴＲＢ-10/10。反応条件；10ｍＭＭｇＣｌ2、37℃、ｐＨ7.1
3。
図 ５
ヘリックスIIIの長さを一定（10bp）にした場合のヘリックスＩの長さに対す
る速度定数の依存性。開裂部位の3'側に種々のヌクレオチド数を有し5'側に10ヌ
クレオチドを有する基質が、それらの対応リボザイムにより開裂される；■Ｋｒ
ＲＡ-10/10；▲ＫｒＲＢ-10/10；●ＴＡＴＲＢ-10/10。反応条件；10ｍＭＭｇＣ
ｌ2、37℃、ｐＨ8.00。
図 ６
スキーム１および２は反応工程を示す。
図 ７
基質中のＣ17の3'側のヌクレオチド数に対する速度定数の依存性。以下の系が
示されている；■ＯＵＲＡ-8/8＋ＯＵＳ；□ＯＵＲＡ-8/8＋ＯＵＣＳ；●ＯＵＲ
Ａ-6/8＋ＯＵＳ；○ＯＵＲＡ-6/8＋ＯＵＣＳ。反応条件；10ｍＭＭｇＣｌ2、25
℃、ｐＨ7.60。
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、式：
で表される化合物に関する。この化合物中、それぞれのＮは、同一または異なっ
ていてもよいヌクレオチドであって、その糖、塩基またはリン酸において置換ま
たは修飾されていてもよいヌクレオチド（ただし、すべてのＮがリボヌクレオチ
ドとなることはない）を表す。ハイブリダイズ性アーム3'-(Ｎ)ｎＮＮＮＮＮＮ
ＡおよびＮＮＮ(Ｎ)ｎ'5'はそれぞれ、開裂されるＲＮＡ標的配列と相補的な予
め決められた配列を有するオリゴヌクレオチドを表す。該アーム中、ｎおよびｎ
'は、該オリゴヌクレオチドのヌクレオチド数を定める整数を表し(ただし、ｎは
1〜5であり、ｎ'は1〜3である)、それぞれの*は、その両側に位置するヌクレオ
チド間の塩基対合を表す。該化合物中、各実線は、その両側に位置するヌクレオ
チド間の共有結合を与える化学結合を表す。記号「a」は、ヌクレオチド数を定
める整数を表す(ただし、ａは０または１となることが可能であり、０の場合、(
Ｎ)aの5'側に位置するＡは、(Ｎ)aの3'側に位置するＮに結合している)。該化合
物のステムループにおいて、それぞれのｍおよびｍ'は、２より大きな整数を表
し、Ｐは、非ヌクレオチドリンカーまたはヌクレオチドリンカー(Ｎ)bを表し、(
Ｎ)bは、ｂが３以上の整数を表す場合に存在しうるオリゴヌクレオチドを表す。
本発明の好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチド3'-(Ｎ)ｎＮＮＮＮＮＮ
Ａは、3'-(Ｎｎ)ＮＮＮＮＮＣＡである。もう１つの好ましい実施態様では、(Ｎ
)aが存在しない。化合物中、(Ｎ)bの整数ｂは、４以上であってもよく、ｍおよ
びｍ'のそれぞれは４であってもよい。
１つの実施態様では、該化合物中のそれぞれのＮは、デオキシリボヌクレオチ
ドであってもよい。あるいは、3'-(Ｎ)ｎＮＮＮＮＮＮＡおよびＮＮＮ(Ｎ)ｎ'5'
のそれぞれのＮは、デオキシリボヌクレオチドであってもよい。さらにもう１つ
の実施態様では、ヌクレオチドＮ、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵのいくつかは、Ｏ−メチ
ルまたはＯ−アルキルリボヌクレオチドである。該化合物のＲＮＡ標的配列は、
ウイルスＲＮＡ標的配列であってもよい。
前記化合物は、デリバリー剤に共有結合していてもよい。デリバリー剤は、ペ
プチド、ペプチド類縁体、コレステロール、ステロイド、コレステロール類縁体
、脂肪、ビタミン、ビオチン、葉酸、レチノイン酸、タンパク質、フェリチン、
ＬＤＬ、インスリン、抗体、糖またはオリゴ糖、ポリエチレングリコールまたは
アミノ酸のホモポリマーもしくはコポリマーである。
本発明はまた、許容されるキャリアと共に前記化合物を含んでなる組成物を包
含する。許容されるキャリアは、陽イオン性脂質、コレステロール、コレステロ
ール誘導体、リポソーム、またはアミノ酸のホモポリマーもしくはコポリマーで
あってもよい。
本発明はまた、原核ホスト細胞または真核ホスト細胞であってもよい前記化合
物を含んでなるホスト細胞を包含する。原核ホストは、大腸菌（E.coli）ホスト
細胞であってもよい。真核ホスト細胞は、サルＣＯＳホスト細胞、チャイニーズ
ハムスター卵巣ホスト細胞、哺乳動物ホスト細胞、植物ホスト細胞または酵母細
胞であってもよい。
本発明はまた、ＲＮＡ標的配列の開裂方法であって、該標的配列を前記化合物
と接触させることを含んでなる方法を包含する。さらに、ある特定のＲＮＡに関
連したヒトまたは動物における疾患の治療方法であって、前記のヒトまたは動物
に該化合物を投与することを含んでなる方法も包含する。さらに、本発明は、該
化合物を含んでなる診断試薬も包含する。
通常は、ハンマーヘッド型リボザイムと比較的短いヘリックスＩおよびIIを形
成する基質が、より長い結合ヘリックスを形成する基質より迅速に開裂される(
表１を参照されたい)。リボザイム一基質複合体において迅速なコンホメーショ
ン変化を可能とするためには、１個またはそれ以外め個数の結合ヘリックスが比
較的弱くなる必要があった。２個の独立した非対称（10＋10）ハンマーヘッド型
リボザイムは、５ヌクレオチドのヘリックスIIIを形
成する基質より数桁速い速度で５ヌクレオチドのヘリックスＩを形成する基質を
開裂することが判明した(それぞれの場合の残りのヘリックスは10ヌクレオチド
である)。この現象は、すべてＲＮＡおよびＤＮＡを備えた（all-ＲＮＡ and Ｄ
ＮＡ-armed）リボザイムで認められた。ヘリックスＩおよびIIIの長さが、リボ
ザイムのハイブリダイズ性アームの長さによって限定される場合に同様の結果が
得られ、5'アーム中に５個のハイブリダイズ性ヌクレオチドを有し3'アーム中に
10個のハイブリダイズ性塩基を有する非対称リボザイムは、対称な21両体の基質
を逆（10/5）非対称リボザイムより100倍以上速く開裂する。標的ＲＮＡ中の好
ましい開裂部位は、配列「ＵＨ」、好ましくは、ＧＵＣ、ＧＵＵ、ＧＵＡ、ＵＵＡ
およびＵＵＣを有する。適当な反応条件は、例えば、約4℃〜約60℃、好ましく
は約10℃〜45℃、より好ましくは約20℃〜43℃の温度、約6.0〜約9.0のｐＨ、お
よび0.1〜100ｍＭ（好ましくは0.2〜20ｍＭ、より好ましくは0.5〜5ｍＭ）の濃
度の二価陽イオン(例えば、Ｍｇ2+)を含むことが可能である。前記化合物の配列
3'-(Ｎ)ｎＮＮＮＮＮＮＡおよびＮＮＮ(Ｎ)ｎ'5'のヌクレオチドは、本明細書に
記載の標的ＲＮＡ中のヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを可能にするの
に十分な任意のヌクレオチド数および配列となることが可能である。さらに、こ
れらの化合物は、10〜100塩基長のアンチセンス分子に共有結合していてもよい
。哺乳動物または植物中のＲＮＡとハイブリダイズしうるアンチセンス配列は、
よく知られている(Shewmakerら,1992年４月21日付け発行の米国特許第5,107,065
号を参照されたい)。該リボザイムは、代謝回転を示す酵素として作用するため
、基質に対するリボザイムの比率は非常に様々となる可能性がある。
ＵＨ部位などの適当な開裂部位を含有する標的ＲＮＡを、前記化合物と共にイ
ンキュベートすることができる。前記化合物のヌクレオチド配列3'-(Ｎ)ｎＮＮ
ＮＮＮＮＡおよびＮＮＮ(Ｎ)ｎ'5'は、それらの基質とハイブリダイズするよう
に選択する。それらは、標的ＲＮＡ中の開裂部位に隣接するヌクレオチド配列と
相補的となるように選択することができる。該リボザイムまたはリボザイム組成
物とその基質とのインキュベーションの際に、該リボザイムおよび基質中の対応
ヌクレオチド間の塩基対合の結果、酵素／基質複合体が
形成される。基質中の開裂部位に隣接する前記化合物の3'-(Ｎ)ｎＮＮＮＮＮＮ
ＡおよびＮＮＮ(Ｎ)ｎ'５に相補的なヌクレオチド配列は、塩基対合により二本
鎖デュプレックスを形成することが可能である。この塩基対合は、当該技術分野
でよく知られている[例えば、Sambrook，1989を参照されたい]。該ヌクレオチド
間の二本鎖デュプレックスの形成は、ハイブリダイゼーションと称されることも
ある[Sambrook，1989]。該リボザイムとその基質との間のハイブリダイゼーショ
ンまたはデュプレックス形成の程度は、例えば、一方または両方の成分を放射能
標識などで標識し、ついで非変性条件下で該反応混合物をポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動に付すことにより、容易に評価することができる[Sambrook，1989]。
該化合物は、その標的と相補的であることが好ましい。該化合物とのインキュベ
ーションの際に標的が特異的に開裂される場合には、該化合物は活性であり、本
発明の範囲内に含まれる。したがって、保存領域中に置換または修飾されたヌク
レオチドを含有するリボザイムを、エンドヌクレアーゼ活性に関して常法により
簡便に試験することができる。
本発明に関連した分野の当業者には容易に理解されるとおり、標的ＲＮＡの開
裂は、当該技術分野でよく知られている種々の方法［例えば、Sambrook，1989を
参照されたい］により容易に評価することができる。例えば、変性条件下、アク
リルアミド、アガロースまたは他のゲル系上で反応産物（基質が放射能標識され
ている場合）を移動させ、ついで該ゲルをオートラジオグラフィーまたは開裂断
片の検出のための他の分析技術に付すことにより、開裂を評価することができる
[Sambrook，1989]。
もう１つの実施態様では、本発明は、許容されるキャリアと共に前記化合物を
含んでなる組成物を提供する。本発明はまた、原核ホスト細胞または真核ホスト
細胞［例えば、酵母細胞または酵母プロトプラスト、大腸菌（E.coli）ホスト細
胞、サルホスト細胞(例えば、ＣＯＳ)、チャイニーズハムスター卵巣ホスト細胞
、哺乳動物ホスト細胞、植物ホスト細胞または植物プロトプラストホスト細胞］
であってもよい前記化合物を含有するホスト細胞を提供する。
もう１つの実施態様では、該組成物は、前記のとおり、許容されるキャリアと
一緒になっている。本発明はまた、該オリゴヌクレオチドが、そのヌクレオチド
中の糖、塩基またはリン酸基において置換または修飾されていてもよいヌクレオ
チドを含むＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分子である本明細書中に前記した組成物
を提供する。該オリゴヌクレオチドは、ハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ分子である
ことが好ましい。しかしながら、エンドヌクレアーゼ活性が失われない限り、該
ヌクレオチド中の他の置換または修飾が可能である。そのような誘導体または修
飾は、後記で説明する。
該オリゴヌクレオチド化合物は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチ
ド、デオキシリボヌクレオチド・リボヌクレオチドハイブリッド、または糖、リ
ン酸または塩基中で修飾されたヌクレオチドを含むこと、あるいはそれらのいず
れかの混合物、本明細書中に記載のそれらの誘導体を含むオリゴヌクレオチドを
含むことが可能である。フランキング配列3'-(Ｎ)ｎＮＮＮＮＮＮＡおよびＮＮ
Ｎ(Ｎ)ｎ'5'は、分解に対するリボザイムの安定性を最適化するように選択する
ことができる。例えば、デオキシリボヌクレオチドは、リボヌクレアーゼの作用
に対して抵抗性である。修飾された、ヌクレオチドの塩基、糖またはリン酸結合
（例えば、3'-(Ｎ)ｎＮＮＮＮＮＮＡおよびＮＮＮ(Ｎ)ｎ'5'の糖リン酸鎖中のホ
スホルアミダートまたはホスホロチオアート結合）もまた、ヌクレアーゼの攻撃
に対する抵抗性を付与しうる。また、ヌクレオチドをリボヌクレオチド、デオキ
シリボヌクレオチドまたはそれらの組合わせのみの形態とすることにより、個々
の場合において結合親和性を最適化することができる。場合によっては、標的Ｒ
ＮＡの開裂を最大にするために、配列3'-(Ｎ)ｎＮＮＮＮＮＮＡおよびＮＮＮ(Ｎ
)ｎ'5'の組成物を最適化する必要があるかもしれない。標的配列とハイブリダイ
ズするフランキングヌクレオチド配列を有するリボザイムの開裂活性は、専らデ
オキシリボヌクレオチドよりなることが可能である。そのような場合には、最適
化は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの混合物をヌクレオチド
配列3'-(Ｎ)ｎＮＮＮＮＮＮＡおよびＮＮＮ(Ｎ)ｎ'5'中に提供することを含むこ
とが可能である。例えば、標的ＲＮＡ中の開裂部位付近のリボザイム中のヌクレ
オチド
はリボヌクレオチドであってもよい。
該リボザイムを分解に対して安定化させるために、配列3'-(Ｎ)ｎＮＮＮＮＮ
ＮＡおよびＮＮＮ(Ｎ)ｎ'5'のそれぞれの3'および5'末端、または該リボザイム
の3'および5'末端を修飾することができる。例えば、エキソヌクレアーゼの攻撃
、特に、3'-5'進行性エキソヌクレアーゼ活性を防ぐために、保護基を付加する
ことができる。例えば、置換または非置換アルキル、置換または非置換フェニル
、置換または非置換アルカノイルから保護基を選択することができる。置換基は
、Ｃ2-Ｃ5アルキル；Ｆ、Ｃ、Ｂｒなどのハロゲン；ヒドロキシ；アミノ；Ｃ1-
Ｃ5アルコキシなどから選択することができる。あるいは、ヌクレアーゼの攻撃
に対して抵抗性のホスホロチオアート、メチルホスホナート、ホスホルアミダー
トなどのヌクレオチド類縁体またはヌクレオシド誘導体（例えば、リボース部位
のα−アノマー）を、末端保護基として使用することができる。保護基は、3'-3
'チミジン結合、3'-3'アベイシック（abasic）リボースまたはデオキシリボース
結合、グアノシンキャップなどにおける5'-5'三リン酸結合などの逆方向結合で
あってもよい。
あるいは、他のヌクレアーゼに対するリボザイム分子の感受性を変化させる基
を、該リボザイムの3'および／または5'末端中に挿入することができる。例えば
、該リボザイムに結合した９−アミノーアクリジンは、ヌクレアーゼの攻撃に対
する抵抗性を該リボザイム分子に付与するように末端保護基として作用し、およ
び／または、該リボザイムのエンドヌクレアーゼ加水分解活性を補助するように
インターカレート剤として作用しうる。他の種々の化学基（例えば、スペルミン
またはスペルミジン）を同様に使用しうると容易に理解されるであろう。
本発明の化合物を、タンパク質、ステロイド、ホルモン、脂質、核酸配列、イ
ンターカレート分子（例えばアクリジン誘導体、例えば９−アミノアクリジン）
などの親和性剤に共有結合または非共有結合させて、基質ヌクレオチド配列に対
する結合親和性を修飾したり、あるいは標的細胞に対する親和性または細胞画分
の局在性などを増加させることができる。例えば、標的配列のハイブリダイゼー
ションおよび開裂が生じうるように標的核酸と並列にリ
ボザイムを架橋するのを補助しうるＲＮＡ結合性ペプチドまたはタンパク質に、
本発明のリボザイムを結合させることができる。もう１つの誘導体として、ある
特定のアプタマー（aptamer）基質に対する結合に際して組織または細胞特異的
に該リボザイムが活性化されるように、該化合物に結合したアプタマーを挙げる
ことができよう(Huizengaら，1995)。また、該アプタマーは、ある特定の組織、
細胞または細胞画分（例えば、トロンビン）に該リボザイムを局在化するための
親和性剤として機能することも可能である(Brachtら，1995，1994)。基質に対す
る親和性を増加させるために、配列3'-(Ｎ)ｎＮＮＮＮＮＮＡおよびＮＮＮ(Ｎ)
ｎ'5'のそれぞれの3'および5'末端、あるいは該リボザイムの3'および5'末端に
ヌクレオチド配列を付加することができる。そのような追加的なヌクレオチド配
列は、分子内でフォールディングした基質との相互作用を可能にしうる標的配列
との三重らせんを形成することが可能である[Strobel，1991]。あるいは、一本
鎖または二本鎖のいずれかのＤＮＡと結合して該基質中のヌクレオチドと塩基対
、トリプレットまたはクワドルプレット（quadruplet）相互作用を引き起こす、
追加的ヌクレオチド配列内の修飾塩基（Principles of Nucleic Acid Structure
[Saenger，1984]に記載の非天然または修飾塩基）を使用することができる。
適当な塩基には、イノシン、5−メチルシトシン、5−ブロモウラシルおよび当
該技術分野でよく知られている他の塩基（例えば、Principles of Nucleic Acid
Structure[Saenger，1984]に記載されているもの）が含まれよう。
本発明の化合物は、例えばCarruthersら、FoehlerらおよびSproatら［Carruth
ersら，1987;Foehlerら，198G;Sproat，1984］に記載されている当該技術分野で
公知のヌクレオチド合成技術により製造することができる。一般には、そのよう
な合成方法は、活性化され保護されたヌクレオチド塩基を連続的にカップリング
させて、保護ヌクレオチド鎖を得ることを含み、ついで適当な処理により保護基
を除去することができる。好ましくは、自動合成装置［例えば、Applied Biosys
tems(Perkin Elmerの一部門)、PharmaciaまたはMillipore製のもの］上で該化合
物を合成する。あるいは、本発明の
リボザイムを、ホスト細胞中またはＴ3、ＳＰ6またはＴ7 ＲＮＡポリメラーゼな
どの酵素を利用する無細胞系中における、該リボザイムをコードするヌクレオチ
ド配列の転写により製造することが可能であり、また、修飾ヌクレオシド三リン
酸オリゴヌクレオチドを用いて製造したり、あるいは転写後に修飾することが可
能である。
ヌクレオシド5'−Ｏ−(１−チオトリホスファート)を使用するインビトロ転写
により、ＲＮＡのホスホジエステル結合をホスホロチオアート結合で置換するこ
とができる。Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼは、α−ホスホルチオトリホスファートＳ
ｐ異性体を特異的に取込み、この場合、立体配置の反転を伴い、該ホスホロチオ
アート結合のＲｐ異性体を与える。ある与えられたヌクレオチドに隣接するホス
ホロチオアート結合で完全に置換された転写産物の製造法、約１個のホスホロチ
オアート結合を含有する部分的に置換された転写産物の製造法、ある与えられた
ヌクレオチドに隣接するホスホロチオアート結合で完全に置換された転写産物の
製造法、または１分子当たり約１個のホスホロチオアート結合を含有する部分的
に置換された転写産物の製造法が、RuffnerおよびUhlenbeck（1990）に記載され
ている。Conradら（1995）は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチ
ド(ホスホロチオアート結合を有するもの及び有さないもの)、また、リボヌクレ
オチドおよび2'−Ｏ−メチルヌクレオチド（ホスホロチオアート結合を有するも
の及び有さないもの）を含有するキメラ転写産物を製造するためにＴ7 ＲＮＡポ
リメラーゼを使用する方法を記載している。これらの方法は、50％以下のデオキ
シリボヌクレオチド、および58％以下の2'−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有する
転写産物を与えることが示されている。Aurupら（1992）は、2'-フルオロ−2'−
デオキシウリジン、2'−フルオロ−2'−デオキシシチジンおよび2'−アミノ−2'
−デオキシウリジンを含有する転写産物を製造するためにＴ7ポリメラーゼを使
用する方法を記載している(Aurup，1992;Conrad，1995;Rufrner，1990)。さらに
別の方法については、後記で説明する。
前記化合物中に表されているヌクレオチドは、糖、塩基および一リン酸基また
はホスホジエステル結合を含む。したがって、糖、塩基、一リン酸基ま
たはホスホジエステル結合のレベルのヌクレオチド誘導体または修飾体を製造す
ることが可能である。前記化合物中のヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたは
ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドであることが好ましいが、エンドヌクレアーゼ活性
が失われない限り、ヌクレオチド中の他の置換または修飾が可能である。
本発明の１つの態様では、ヌクレオチドがリボヌクレオチドまたはデオキシリ
ボヌクレオチドとなるように、ヌクレオチドの糖が、それぞれ、リボースまたは
デオキシリボースとなることが可能である。さらに、当該技術分野でよく知られ
ている方法に従い、ヌクレオチドの糖部分を修飾することができる[例えば、Sae
nger，1984;Sober，1970を参照されたい]。本発明は、ヌクレオチドの糖部分に
対する種々の修飾を包含するが、これは、そのような修飾が、該リボザイムの開
裂活性を損なわない場合に限られる。修飾された糖には、例えば、ハロゲン、ア
ミノまたはアジド基による第二級ヒドロキシル基の置換；2'−アルキル化；グリ
コシルＣ1'−Ｎ結合に対してO2'−ヒドロキシルがシス配向してアラビノヌクレ
オシドを与えるコンホメーション変異体、およびα−ヌクレオシドを与えるよう
なＣ1'炭素におけるコンホメーション異性体などが含まれる。７デアザグアノシ
ン、ｚデアザアデノシンなどにおけるように環窒素を炭素で置換することができ
る。さらに、本発明は、置換された2'ヒドロキシル（例えば、2'Ｏ−アリルまた
は2'Ｏ−メチル）を有する化合物に関する。あるいは、2'Ｃ−アリルなどにおけ
るように、糖の炭素バックボーンを置換することができる。
したがって、ヌクレオチドの塩基は、アデニン、2−アミノアデニン、シトシ
ン、グアニン、ヒポキサンチン、イノシン、メチルシトシン、チミン、キサンチ
ン、ウラシルまたはその他の修飾塩基（後記を参照されたい）となることが可能
である。
ヌクレオチド塩基、デオキシヌクレオチド塩基、およびリボヌクレオチド塩基
は、当該技術分野でよく知られており、例えば、Principles of NucleicAcid St
ructure[Saenger，1984]に記載されている。さらに、ヌクレオチド、リボヌクレ
オチドおよびデオキシリボヌクレオチド誘導体、置換体および／
または修飾体は、当該技術分野でよく知られており［例えば、Saenger，1984;So
ber，1970を参照されたい]、該リボザイムのエンドヌクレアーゼ活性を失わない
限り、該リボザイム中にこれらを取込ませることができる。前記のとおり、エン
ドリボヌクレアーゼ活性は、常法で容易に評価することができる。
さらに、多数の修飾塩基が天然に存在し、広範な修飾塩基が合成的に製造され
ている[例えば、Saenger，1984;Sober，1970を参照されたい]。例えば、アミノ
基および環窒素をアルキル化することができ、例えば、環窒素原子または炭素原
子（例えば、グアノシンのＮ1およびＮ7、およびシトシンのＣ5）のアルキル化
、チオケト基によるケトの置換、炭素−炭素二重結合の飽和、プソイドウリジン
中のＣ−グリコシル結合の導入が可能である。チオケト誘導体としては、例えば
、6−メルカプトプリンおよび6−メルカプトグアニンが挙げられる。塩基を、ハ
ロゲン、ヒドロキシ、アミン、アルキル、アジド、ニトロ、フェニルなどの種々
の基で置換することができる。また、ヌクレオチドのリン酸部分またはオリゴヌ
クレオチドのホスホジエステル結合を、当該技術分野でよく知られている誘導体
化または修飾に付す。例えば、窒素、硫黄または炭素による酸素の置換により、
それぞれ、ホスホルアミダート、（ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート
）およびホスホナートが得られる。架橋または非架橋位置で窒素、硫黄または炭
素誘導体による酸素の置換を行なうことができる。ホスホジエステルおよびホス
ホロチオアート誘導体が(特に、短い長さの場合に)、おそらく細胞受容体との結
合により、効率的に細胞に侵入することが、アンチヤンスオリゴヌクレオチドを
用いた研究［Uhlmann，1990］から十分に立証されている。メチルホスホナート
は、おそらく、それが電気的に中性であるため、細胞に容易に取込まれる。
本発明のさらにもう１つの態様は、通常のホスホジエステル結合が、アミド、
スルホンアミド、ヒドロキシルアミン、ホルムアセタール、3'−ホルムアセター
ル、スルフィドまたはエチレングリコールなどの機能で置換された結合体を提供
する。これらの修飾は、細胞ヌクレアーゼに対する抵抗性を
増加させ、および／または、薬物動態を改善しうる。可能なヌクレオチドの修飾の非限定的な一覧 糖の修飾体は、2'フルオロ、2'アミノ、2'Ｏ−アリル、2'Ｃ−アリル、2'Ｏ−
メチル、2'Ｏ−アルキル、4'−チオ−リボース、α−アノマー、アラビノース、
他の糖または非環状類縁体であることが可能である。
リン酸の修飾体は、ホスホロチオアート(非架橋)、ホスホロジチオアート(非
架橋)、3'架橋ホスホロチオアート、5'架橋ホスホロチオアート、ホスホルアミ
ダート(置換ホスホルアミダートを含む)、3'架橋ホスホルアミダート、5'架橋ホ
スホルアミダート、メチルホスホナート、他のアルキルホスホナートまたはリン
酸トリエステルであることが可能である。
ホスホジエステル結合は、アミド、カルバメート、チオカルバメート、尿素、
アミン、ヒドロキシルアミン、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、アリ
ルエーテル、アリル、エーテル、チオエーテルまたはＰＮＡ（ペプチド性核酸）
結合で置換することができる。
塩基中の修飾は、プリン、2,6−ジアミノプリン、Ｏ6−メチルグアノシン、5
−アルケニルピリミジン、５−プロピンピリミジン、イノシン、５−メチルシト
シン、プソイドウリジン、一リン酸アルカンジオールまたは他のアルカンジオー
ルの重合体であることが可能である。
いくつかのヌクレオチドは、以下のリンカーで置換することができる：1,3−
プロパンジオール、他のアルカンジオール、またはエチレングリコールの種々の
重合体（例えば、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコール）
またはアベイシック（abasic）リボースまたはデオキシリボース。
他の修飾：3'または5'末端は、3'-3'逆方向結合(逆方向ジエステルまたは逆方
向ホスホルアミダート)、3'-3'結合のアベイシック（abasic）リボースまたはデ
オキシリボースまたは末端キャップ化（例えば、Ｇ−キャップ）アルキル基、コ
レステロール、またはエキソヌクレアーゼの活性を阻止する他の任意の基から選
択することができる。糖、リン酸または塩基中で修飾された単量体の合成
修飾された糖は、以下のとおりに合成することができる。2'−デオキシ−2'−
フルオロウリジン(Sinha，1984)；2'−デオキシ−2'−フルオロシチジン(Sinha
，1984)；2'−デオキシ−2'フルオロアデノシンの合成およびリボザイム中への
取込み(Olsen，1991)；2'−デオキシ−2'−アミノウリジンおよび2'−デオキシ
−2'−アミノシチジン(Heidenreich，1994)；2'−Ｏ−アリル−（ウリジンまた
はシチジンまたはアデノシンまたはグアノシン）(Boehringer Mannheim，Mannhe
im，Germanyから入手可能)；2'−デオキシ−2'−Ｃ−アリル−リボヌクレオチド
(Beigelmanら，1995Ｂ)；2'−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（総説Sproat，B.S.
，1991Ａを参照されたい）(同様にChemgenes，Waltham，ＭＡまたはGlen Resear
ch，Sterling，VAから入手可能)、他の2'−Ｏ−アルキル−リボヌクレオチドの
合成(Monia，B.P.，1993;Sproat，B.S.，1991Ｂを参照されたい)；ウリジン、シ
チジン、アデノシンおよびグアノシンのα−アノマー(Debart，F.，1992および
そこに引用されている参照文献を参照されたい)；他の修飾糖など、アラビノー
ス(Garbesl，A.，1993)；ヘキソース−チミジン（Augustyns，K.，1992）および
糖の直列（linear）置換。
修飾されたリン酸は以下のとおりに合成することができる；ホスホロチオアー
ト;ホスホルアミジット合成における酸化法の修飾により合成される(試薬は、Pe
rkin Elmerなどから商業的に入手可能であり、生成物は、異性体の混合物となる
；ホスホロチオアートの立体特異的合成に利用可能ないくつかの方法についは、
Stec，1991;Stec，1995を参照されたい)；ホスホロジチオアート(Eldrup，A.B.
，1994;Caruthers，1991;Beaton，1991)；3'−架橋ホスホロチオアート；5'架橋
ホスホロチオアート；ホスホロアミダート(非架橋)；(Froehler，B.，1988;Jage
r，A.，1988;Letsinger，R.L.，1988)；3'架橋ホスホルアミダート(ＮＨによる3
'Ｏの置換)(Letsinger，1992;Gryaznov，S.M.，1995;Chen，J.K.，1995)；5'架
橋ホスホルアミダート(ＮＨによる5'Ｏの置換)(Gryaznov，S.M.，1992)；メチル
ホスホナート(試薬は、Glen ResearchまたはChemgenesから商業的に入手可能;Sa
vchenko，1994;Miller，1991)；5'−デオキシ，5'−メチルホスホナート(Szabo
，1995)；他
のアルキルーホスホナート(Fathi，1994Ａ;Fathi，1994Ｂ)；ホスホナートトリ
エステル(Summers,1986)。
ホスホジエステル結合の置換体は、以下のとおりに合成することができる：再
検討にはDe Mesmaker，1995を参照されたい；アミド(Chur,1993;Blommers，1994
;De Mesmaeker，1993;De Mesmaeker，1994Ａ;De Mesmaeker，1994Ｂ;Lebreton，
1993;Lebreton，1994Ａ;Lebreton，1994Ｂ;Idsiak，1993)；カルバメート(Waldn
er，1994;Stirchak，1987;Habus，1994)；チオカルバメート(Waldner，1995)；
尿素(Waldner，1994)；アミン(De Mesmaeker，1994Ｃ;Caulfield，1994)；ヒド
ロキシルアミン（Debart，1992;Vasseur，1992)；ホルムアセタール(Matteucci
1990;Jones，1993)；チオホルムアセタール(Jones,1993)；アリルエーテル(Cao
，1994)；アリルエーテル、チオエーテル(Cao，1994)；アルカン(De Mesmaeker
，1994)；ＰＮＡ(Nielsen，1993Ａ;Hanvey 1992;Egholm，1993;Nielsen，1993Ｂ
);ＰＮＡ合成(Egholm，1992Ａ;Egholm，1992Ｂ)；ブリンＰＮＡ単量体およびオ
リゴ体の製造(Millipore corporationから商業的に入手可能)。
修飾された塩基は、以下のとおりに合成することができる：プリンの合成およ
びリボザイム中への取込み(Slim，1992;Fu，1992;Fu，1993)；7−デアザグアノ
シンの合成およびリボザイム中への取込み(Fu，1993)；イノシンの合成およびリ
ボザイム中への取込み(Slim，1992;Fu，1993)；7−デアザアデノシンの合成およ
びリボザイム中への取込み（Fu，1992;Seela，1993）；Ｏ6−メチルグアノシン
の合成およびリボザイム中への取込み(Grasby，1993)；2,6−ジアミノプリンの
合成(Sproat，1991)；2−アミノプリンの合成およびリボザイム中への取込み(Ng
，1994;Tuschl，1993)；イソグアノシンの合成およびリボザイム中への取込み（
Ng，1994;Tuschl，1993);キサントシンの合成およびリボザイム中への取込み(Tu
schl,1993)；6−アザチミジン、６−アザ−2'−デオキシシチジンの合成および
オリゴヌクレオチド中への取込み(Sanghvi，1993)；5−アルケニルピリミジン；
5−プロピン(Fensterら，1994)；イノシン(Chemgenes)；5−メチルシトシン；プ
ソイドウリジン；アベイシック（abasic）リボースまたはデオキシリ
ボース(Beigelmanら，1995Ａ)。
リボザイム中で試験されたヌクレオチド修飾の詳細な一覧
＜糖＞
全ての非保存ヌクレオチドにおける糖の2'ＯＨ基に修飾を施すことができる。
試験した修飾は、2'Ｈ(ＤＮＡ)、2'Ｆ、2'アミノ、2'−Ｏ−アリル、2'−Ｏ−メ
チル、2'−Ｃ−アリルである。
選択した修飾を、保存ヌクレオチドＣ3、Ｕ4、Ａ6、Ｎ7、Ａ9、Ｇ12、Ａ13、
Ａ14、Ｎ15.2の2'ＯＨ基に施すことができる。
修飾は、Ｇ5、Ｇ8およびＡ15.1の2'ＯＨには施すことができない(図１を参照さ
れたい)。
リボザイムが優れた開裂活性を有するためには、Ｇ5、Ａ6、Ｇ8、Ｇ12、Ａ15.
1に修飾を施すべきではない(ただし、Ｇ12は2'Ｈ(ＤＮＡ)となることが可能であ
る)。
一般には、Ｇ5、Ｇ8およびＡ15.1での修飾を除き、単一の修飾が開裂活性の大
きな減少を引き起こすことはないが、リボザイム中に導入される修飾が増すにつ
れて活性は減少する。
＜リン酸＞
非保存ヌクレオチドのリン酸基は、ホスホロチオアートであることが可能であ
る(ホスホロチオアート化ＤＮＡまたはＲＮＡ)。好ましくは、非保存ヌクレオチ
ドはＤＮＡであり、該リボザイムの3'または5'末端の２個または３個のリン酸の
みがホスホロチオアートとなる。
保存ヌクレオチドＣ3、Ｕ4、Ｇ5、Ｇ8およびＧ12の5'側、およびＡ9およびＮ1
5.2の3'側のリン酸がホスホロチオアートであることは可能であるが、Ａ9、Ａ13
およびＡ14の5'側のリン酸がホスホロチオアートとなることはできない。
保存ヌクレオチド（番号付けに関しては図１を参照されたい）
＜Ｃ3＞
糖‐2'ＯＨ基を修飾することができる(ただし、おそらく2'アミノは例
外となる)。2'Ｈ(Yang，1992)、2'Ｆ(Pieken，1991;Heidenreich,1992)、2'−Ｏ
−アリル(Paolella，1992)、2'−Ｏ−メチル（Usman，1995）はすべて、開裂を
許容する修飾である。
2'アミノ修飾はおそらく不可能であろう（該リボザイム中のいくつかのＣは、
活性の減少を引き起こす2'アミノ修飾を有していたが、その効果はおそらく、Ｃ
3および／またはＣ15.2上の2'アミノによるものであろう）(Pieken，1991)。
リン酸 ‐5'リン酸はホスホロチオアートであることが可能である(Shimayama
，1993)。
＜Ｕ4＞
糖 ‐2'ＯＨ基を修飾することができる。2'Ｈ(Yang，1992)、2Ｆ'(Pieken，1
991;Heidenreich，1992)、2'アミノ(Pieken，1991)、2'−Ｃ−アリル(Usman，19
95)、2'−Ｏ−アリル（しかし、Ａ6が2'−Ｏ−アリルの場合には、2'ＯＨのまま
とする）(Paolella，1992)は、開裂を許容する修飾である。
リン酸 ‐5'リン酸はホスホロチオアートであることが可能である(Shimayama
，93)。
＜Ｇ5＞
塩基‐Ｇ塩基上の２−アミノ基は必須である（イノシンとなることはできない
）(Odai，1990;Fu，1992)。
糖‐Ｇ5の2'ＯＨに修飾を施すことはできない。2'Ｈ(Perreault，1990;Perrea
ult，1991，Fu，1992;Williams，1992)、2'アミノ(Pieken，1991;Williams，199
2)、2'−Ｏ−メチル(Paolella，92)、2'Ｆ(Williams，1992)を有することはでき
ない。
＜Ａ6＞
塩基 ‐ プリンであることが可能である（すなわち、６−アミノ基は必須で
はない）(Fu，92)。Ａ塩基において、Ｎ7はＣ7となることはできない(Fu，1992)
。
糖 ‐2'ＯＨ基は修飾することができる。2'Ｈ(Perreault，1990;Olsen，1991
;Yang，1992;Fu，1992)、2'Ｆ(Olsen，1991)、2−Ｏ−アリル(ただし、
Ｕ4が2'ＯＨである場合に限る)（Paolella，1992）は、開裂を許容する修飾であ
る。
＜Ｎ7＞
ピリミジンエンドヌクレアーゼの感受性部位であると考えられる。ｒＮがｒＧ
またはｒＡである場合には、保護を行なう(Shimayama，1993)。
糖‐2'ＯＨ基は修飾することができる。2'Ｈ（試験されたｄＴ）(Yang，1992)、
2'Ｆ(Pieken，1991，Heidenreich,1992)、2'−アミノ(Pieken，1991)、2'−Ｏ−
アリル(Paolella，1992)、2'−Ｏ−メチル（Usman，1995）は、開裂を許容する
修飾である。
3'リン酸は、ホスホロチオアートであることが可能である（Ｎ＝Ｕに関して試
験）(Shimayama，1993)。
＜Ｇ8＞
糖‐Ｇ8の2'ＯＨに修飾を施すことはできない。2'Ｈ(Fu，1992;Williams，199
2;Yang，1992)、2'Ｆ(Williams，1992)、2'アミノ(Williams，1992)、2'−Ｏ−
アリル（Paolella，1992）を有することはできない。(Perreault(1991)は、2'Ｈ
が可能であると認めているが、Yang(1992)は、他の多数の保存ヌクレオチドがＤ
ＮＡであれば、この部位が決定的に重要であると記載している)。
リン酸‐5'リン酸は、おそらく、ホスホロチオアートであることが可能であろ
う(Ｎ7リン酸を参照されたい)。
＜Ａ9＞
糖 ‐2'ＯＨ基は修飾することができる。2'Ｈ(Olsen，1991;Fu，1992;しかし
Perreault(1991)は、2'Ｈとなることはできないと記載している)、2'Ｆ(Olsen,1
991;Pieken,1991)、2'−Ｏ−アリル(Paolella，1992)、2−Ｏ−メチル（Usman，
1995）はすべて、開裂を許容する修飾である。
リン酸 ‐5'リン酸は、ホスホロチオアートとなることはできない(Buzayan，
1990;Ruffner,1990)。3'リン酸は、ホスホロチオアートであることが可能である
(Shimayama，1993)。
＜Ｇ12＞
塩基 ‐２−アミノ基は必須である（イノシンとなることはできない）(Slim
，1992)。
糖‐2'ＯＨ基は、いくつかの修飾を許容しうる。2'Ｈ(Perreault，1991;Yang
，1992;Williams，1992)、2'アミノ(Pieken，1991;Williams，1992)は可能であ
る。2'Ｆ(Williams，1992)、2’−Ｏ−アリル（Paolella，1992）となることは
できない。
リン酸 ‐5'リン酸は、ホスホロチオアートとなることが可能である(Shimayama
，1993)。
＜Ａ13＞
塩基 − アデニン塩基において、Ｎ7を炭素に変化させることができる(Fu，19
92)。6−アミノ基は必須である（プリンとなることはできない）(Slim，1992)。
糖‐2'ＯＨ基は、いくつかの修飾を許容しうる。2'Ｈ(Perreault，1991;Yang
，1992)、2'−Ｏ−アリル(Paolella，1992)、2'−Ｏ−メチル（Usman，1995）は
、開裂を許容する修飾である。Ａ13、Ａ14、Ａ15.1のそれぞれが2'Ｆを有する場
合には、2'Ｆを有することはできない(Pieken，1991)。
リン酸 ‐5'リン酸はホスホロチオアートとなることはできない(Ruffner，1990
)。
＜Ａ14＞
塩基 ‐Ｎ7を炭素に変化させることができる(Fu，1992)。プリンであること
が可能である(Slim，1992)。
糖 ‐2'ＯＨ基は、いくつかの修飾を許容しうる。2'Ｈ(Perreault，1991;Yan
g，1992)、2'−Ｏ−アリル(Paolella，1992)、2'−Ｏ−メチル（Usman，1995）
は、開裂を許容する修飾である。Ａ13、Ａ14、Ａ15.1のそれぞれが2'Ｆを有する
場合には、2'Ｆを有することはできない(Pieken，1991)。
リン酸 ‐5'リン酸は、ホスホロチオアートであることが可能である(Ruffner，
1990)。
＜Ａ15.1＞
塩基 ‐Ｎ7をＣに変化させることができる(Fu，1992)。６−アミノ基は
必須である（プリンとなることはできない）(Slim，1992)。
糖 ‐2'ＯＨを修飾することはできない。2'Ｈ(Yang，1992)、2−Ｏ−アリル(
Paolella，1992)、2'Ｆ(Ａ13およびＡ14が共に2'Ｆである場合)（Pｉeken，1991
）を有することはできない。
＜Ｎ15.2＞
糖 ‐選択された修飾は開裂を許容する。2'Ｆ(Pieken，1991;Heidenreich，1
992)、2'−Ｏ−アリル(Paolella，1992)、2'−Ｏ−メチル(Usman，1995)は、開
裂を許容する修飾である。
2'Ｈの場合は速度が遅い(Yang，1992)。おそらく、2'アミノ修飾を有すること
はできないであろう（リボザイム中のいくつかのシトシンは、活性の減少を引き
起こす2'アミノ修飾を有していたが、その効果はおそらく、Ｃ3および／または
Ｃ15.2によるものであろう）(Pieken，1991)。3'リン酸はホスホロチオアートと
なることが可能である(Shimayama，1993)。
オリゴヌクレオチドまたはリボザイムの3'末端における修飾
最後の２つ（または最後）のヌクレオチド間結合中の3'ＭＥＡ（メトキシエチ
ルアミン）ホスホルアミダート；3'-3'逆方向ジエステル結合または3'-3'逆方向
ホスホルアミダート(Shaw，1991)。
3'-3'逆方向チミジンまたは3'-3'結合アベイシック(abasic)リボース(Usman，19
95)。
エンドヌクレアーゼ活性が失われない限り、糖、塩基または一リン酸基または
ホスホジエステル結合のレベルで行なう前記で挙げたヌクレオチド修飾、置換ま
たは誘導体化の任意の組合わせを該化合物中で行なうことができる。
また、本発明の化合物は、ＲＮＡ分子合成の技術分野における自体公知の方法
により製造することができる(例えば、Promega（Madison，Wis.，USA）の推奨プ
ロトコールに従う)。特に、本発明のリボザイムは、Ｔ3またはＴ7ポリメラーゼ
またはＳＰ6 ＲＮＡボリメラーゼ用のプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼプ
ロモーターに作動的に結合した対応するＤＮＡ配列（転写されるとリボザイムを
与え、ＤＮＡ合成の技術分野の自体公知の方法に従い合成されうるＤＮＡ）から
製造することができる。ついで該ＲＮＡを修飾した
り、あるいは修飾ヌクレオチドを直接取込ませることができる。運搬に関しては
、例えば、“Targeting and Delivery of Genes and Antiviral Agents into Ce
lls by the Adenovirus Penton”G．Nemerowら，米国特許出願第08/046,159号お
よび第08/015,225号を参照されたい。該標的とリボザイムとを同じ細胞画分中に
封鎖するのが望ましいかもしれない[SullengerおよびCech，1993]。
該化合物を、エレクトロポレーション、ＰＥＧ、高速粒子射撃またはリポフェ
クタントにより細胞中に導入し、あるいはマイクロインジェクションなどのマイ
クロマニュピレーション技術により細胞中に導入して、該化合物をホスト細胞に
侵入させることができる。また、本発明は、とりわけ遺伝子銃（例えば、ＤＮＡ
被覆タングステン粒子、高速微粒子射撃）およびエレクトロポレーションなどの
他の導入手段を包含する[Maliga，1993;Bryant，1992;またはShimamoto，1989]
。
本発明の化合物は、広範な治療用途および生物学的用途を有する。例えば、ウ
イルスの特異的ＲＮＡ転写産物とハイブリダイズしそれを開裂するように適合さ
せた本発明の化合物を、ウイルスに感染した対象に投与することにより、ヒトお
よび動物中の病原ウイルスを不活化することができる。そのような化合物は、非
経口的投与手段または他の投与手段により運搬することができる。
本発明の化合物は、例えば単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）またはヒト免疫不
全ウイルス（ＨＩＶ-1、ＨＩＶ-2）が引き起こすウイルス疾患に対する特定の用
途を有する。本発明のリボザイムで治療しうるヒトおよび動物の疾患のさらに別
の非限定的な例には、乾癬、頚部前新形成、乳頭腫疾患、細菌および原核生物感
染症、ウイルス感染症が含まれる。具体例には、いぼ、う歯、歯肉炎、サイトメ
ガロウイルス、肝炎および新形成状態のうち、例えば慢性骨髄性白血病、悪性黒
色腫、膀胱癌、膵臓癌、急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)、再発狭窄症および急
性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬまたはＡＰＬ）において生じる異常ＲＮＡの産生
に関連したもの、および遺伝子発現パターンの変化を伴う任意の疾患、あるいは
異常または有害なＲＮＡおよび／またはタンパク
質を与える遺伝子の発現を伴う任意の疾患が含まれるが、これらに限定されるも
のではない。
治療期間は、治療する個々の疾患によって異なり、医師により容易に決定され
るであろう。一般には、治療中の疾患が改善するまで治療を継続する。
本発明のリボザイムはまた、細菌および他の原核細胞、動物および酵母細胞中
のＲＮＡ転写産物の不活性化のための特定の用途を有する。
原核細胞および真核細胞中にＲＮＡおよびＤＮＡ配列を導入する方法は、当該
技術分野でよく知られており、例えば、CottonおよびFriedman[Cotton，1990;Fr
iedman，1989]に記載されている。同じく広く知られている方法を本発明で使用
することができる。
本発明の化合物は、直接的な細胞の取込みにより細胞中に取込ませることがで
き、この場合、本発明のリボザイムは、細胞外環境から細胞膜または細胞壁を通
過する。細胞の取込みを増強するために、リポソームまたは親油性ビヒクル、細
胞透過剤（例えば、ジメチルスルホキシド）などの物質を使用することができる
。運搬／標的化分子は、例えば、ＲＮＡ；修飾ＲＮＡ；ＤＮＡ；修飾ＤＮＡ；ペ
プチド；ペプチド類縁体；ステロイド、コレステロールおよび誘導体；他のステ
ロイド；脂肪(飽和および部分不飽和)；ビタミンまたは類縁体、例えばビオチン
；葉酸；レチノイン酸；タンパク質、例えばフェリチン、ＬＤＬインスリンまた
は特異的抗体；糖およびオリゴ糖であることが可能である。本発明は、アビジン
、ビオチン(Partridgeら，1991，1993)、ポリ(Ｌ−リシン)(Bunnell，1992)、コ
レステロールまたはチオコレステロール(Bouterin,1989;Letsinger，1989;Oberh
auser，1992)、リン脂質(Shea，1990)、長鎖ジオール(Kabanov，1990)、ネオ糖
タンパク質、糖タンパク質(Bonfils，1992)、プロテインＡ、抗体(Leonetti，19
90)、陽イオン性脂質、リポフェクタミン、リポフェクチン（ＣＯＴＭＡ、ＤＯ
ＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ）(Bennett，1992)、標的化リポソーム（Leonetti,1990;Lok
e，1988;Stullら1995）などの他の物質に対する結合を含む。
本発明の化合物は、当該技術分野でよく知られている医薬上および獣医学上許
容されるキャリアおよび賦形剤と組合せることができ、これらには、例
えば、参考として本明細書に組入れるRemmgton's Pharmaceutical Sciences，第
17版,Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，Ostolら編に記載されている水、塩類
液、デキストロースおよび種々の糖溶液、脂肪酸、リポソーム、油、皮膚透過剤
、ゲル形成剤などのキャリアが含まれる。
本発明の化合物は、例えば、Merck Index(1989)第11版,Merck & Co．Inc．に
記載されている１以上の抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗細菌剤、抗寄生体剤、抗原
生動物剤、抗蠕虫剤などと一緒になった組成物として提供することができる。
治療用組成物は、罹患部位に対するリボザイムの局所適用を伴うことが可能で
ある。例えば、ヘルペスウイルス病変の治療においては、0.1ｎＭ〜100ｍＭ、好
ましくは1ｎＭ〜1ｍＭのリボザイムを含有するクリーム剤に、リボザイムを製剤
化することができる。ついで、感染症状を改善するために、該クリーム剤を1〜1
4日間にわたり感染部位に適用する。ウイルス感染治療用の局所製剤の最終的な
開発の前に、該リボザイムおよびそれを含む製剤の有効性および毒性を、例えば
、動物モデル（例えば、乱切されたマウスの耳）上で試験することができ、この
場合、該動物モデルに、例えば2×106プラーク形成単位のウイルス粒子を加える
。ついで、治療後のその耳における感染ウイルス粒子の力価を測定して、治療の
有効性、リボザイムの必要量などの考慮事項を検討することができる。また、ヒ
トでの試験の前の動物モデルにおける同様の検討を、例えば、乾癬、乳頭腫疾患
、頚部前新形成、およびＨＩＶ感染症、細菌および原核生物感染症、ウイルス感
染症などの疾患、および種々の新形成状態（有害なＲＮＡ種に関連したもの）の
治療に関して行なうことができる。
局所適用組成物は、一般には、クリーム剤の形態であり、この場合、本発明の
リボザイムを、粘性成分と混合することができる。ヌクレアーゼの攻撃または他
の分解因子（例えば、紫外線などの劣悪な環境条件）から該リボザイムを保護す
るために、本発明の化合物をリポソームまたは他のバリヤー型（barrier type）
製剤中に取込ませることができる。
カプセル剤（例えば、ゼラチンカプセル剤）、錠剤、坐剤などの単位投与
形として、組成物を提供することができる。注射用組成物は、塩類液、デキスト
ロース中、または緩衝剤であるか若しくは安定化剤、抗酸化剤または同様の物質
を含有する他の媒体中の、リボザイムの無菌溶液の形態であってもよい。経口投
与用組成物は、懸濁剤、液剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤などの形態であっ
てもよい。また、徐放用装置、含浸包帯、絆創膏などの形態で、リボザイムを提
供することもできる。本発明の化合物は、リポソームまたは生分解性重合体（例
えば、ポリ乳酸）中に包埋することができる。本発明において使用することがで
きる医薬組成物は、例えばRemington's Pharmaceutlcal Sciences（前記を参照
されたい）に記載されている。
また、本明細書に記載の化合物は、診断剤として使用することができる。前記
化合物は、ある特定の遺伝的欠損を検出するように、あるいはＲＮＡ制限酵素と
して、あるいは遺伝子マッピング用に設計することができる。２つの反応（その
一方は、該触媒活性化合物と接触させるものである）を平行して行なうことによ
り、遺伝子の突然変異、欠失または転座を検出することができる。該方法は、該
触媒性化合物との反応の前後に増幅工程を伴うことが可能である。その増幅は、
ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、Ｑβレプリカーゼ(Stefano，J.E.の米国特許第
5,472,840号を参照されたい)；リガーゼ連鎖反応(Kramerら，ＷＯ 94/16105)；
逆転写ＰＣＲ(ＲＴ-ＰＣＲ)、自立配列複製（self sustained sequence replica
tion;3ＳＲ）(ＳＩＢＩＡ，Baxter Diagnostics)；核酸配列に基づく増幅（nucl
eic acid sequence based amplification;ＮＡＳＢＡ）(Cangene Corp)、ライゲ
ーション活性化転写（ligation activated transcription;ＬＡＴ）(Life Techn
ologies Inc.，Gaithersburg，ＭＤ)；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（OmniGene
，Inc.，Cambridge，ＭＡ;Abbott Labs，Abbott Park，IL;Applied Biosystems
，Foster City，ＣＡ;Amgen，Thousand Oaks，ＣＡ;Beckman Research Institut
e);修復連鎖反応(repair chain reaction;RCR)(ImClone Systems Inc．ＮＹ,Ｎ
Ｙ)；および鎖置換活性化（strand displacement activafion;SDA）（Becton Di
ckenson Research Center，Research Triangle Park，NC）に基づくものであっ
てもよい。他の診断方法は、De La Monteら，ＷＯ94/23756;
Bockmanら，ＷＯ94/13833またはLamondら，ＥＰ519,463に記載されている。ある
いは、該方法を、抗体／ＰＣＲ型アッセイ（Carterら，1992，Science258;120）
などの非常に高感度の技術と組合せることができる。
次に、以下の非限定的な実施例および図面に関して、単なる非限定的な具体例
として、本発明を説明する。
〔実験〕命名法
種々のハンマーヘッド型リボザイムによる多くの基質の開裂速度論を調べた。
基質分子の配列は、自然に存在するｍＲＮＡｓから採用し、起源により識別され
る。ＧＨシリーズは、ラット成長ホルモンのｍＲＮＡに見られる配列に由来し、
ＴＡＴシリーズは、ＨＩＶ−１のＴＡＴｍＲＮＡに由来し、Ｋｒシリーズは、キ
イロショウジョウバエのクルッペル遺伝子のｍＲＮＡに由来する。
接頭語ＯＵを付したリボザイムおよび基質は、ＨＨ１６というタイトルの十分
に特性決定されたハンマーヘッドに似ており、幾つかの場合には同一である(Her
telら、1994；Hertelら、1996)。ＯＵリボザイムに対する２シリーズの基質は、
ＯＵ ＳおよびＯＵ ＣＳを接頭語として付ける。ＯＵ Ｓシリーズは、５’末
端から１３番目の位置にグアニンヌクレオチドを有し、ＯＵリボザイムと複合体
を形成して、これはＧ−Ｕ塩基対を形成する。ＯＵＣＳ（相補的基質）シリーズ
は、その位置にアデニンヌクレオチドを含むので、ＯＵリボザイムとの複合体で
ワトソン−クリックのＡ−Ｕ塩基対を形成する。
リボザイムは、上記の識別用接頭語に続く、Ｒにより記号で示され、基質は文
字Ｓにより示され、ヌクレオチドの長さを表す数によりさらに特定される(例え
ばＳ１３)。この文書で使用されるハンマーヘッド型リボザイムには２つのバー
ジョンがあり、リボザイムＡおよびＢとして記号で示される。リボザイムＡ（Ｒ
Ａ）は、（３’ヌクレオチドを除いて）ＲＮＡのみから成るが、リボザイムＢ（
ＲＢ）は、ＲＮＡのまま残っているヌクレオチド１５．
１および１５．２を除いて、基質にハイブリダイズするアームにＤＮＡを有して
いる(図１)。全体を通して、Hertelらのナンバリングシステムが終始使用される
(Hertelら、1992)。ハイブリダイズ性アームにおけるヌクレオチドの数(リボザ
イムについて)、またはＣ17の各側におけるヌクレオチドの数（基質について）
が、名前の接尾語として付けられ、最初の数字は５’側をいい、二番目の数字は
３’側を指している。例えば、Ｋｒ Ｓ１７−１０／６は、Ｃ17の５’側に１０
ヌクレオチドおよび３’側に６ヌクレオチドを有する１７merの基質であり、リ
ボザイムＫｒ ＲＡ−６／１０に相補的な基質である(図２)。オリゴヌクレオチドの調整
オリゴヌクレオチドは、Applied Biosystems（フォスターシティ、ＣＡ）モデ
ル391のＤＮＡ合成機を用いて合成した。接頭語ＯＵを付したオリゴヌクレオチ
ドは、Perkin Elmer（Applied Biosystems Division、フォスターシティ、Ｃ
Ａ）から入手した試薬を用いて調整した。保護されたＤＮＡホスホラミダイトモ
ノマーは、Millipore（ベッドフォード、ＭＡ）またはAuspep（メルボルン、オ
ーストラリア）から入手した。ＲＮＡモノマーは、２’水酸基においてtert-ブ
チルジメチルシリル基（ｔＢＤＭＳ）で保護され、同所から入手した。合成の便
宜上、全オリゴヌクレオチドは、３’末端にデオキシリボヌクレオチドを有して
いる。オリゴヌクレオチドの脱保護および精製は、２’位置からのｔ−ＢＤＭＳ
基の除去に関して、溶媒なしのトリエチルアミン三フッ酸塩を室温で２４時間使
用し、その後のゲル精製に先立つて１０倍体積の１−ブタノールでオリゴヌクレ
オチドを沈殿させることを除いて、以前に記載されたとおりに行った(McCallら
、1992)。各オリゴヌクレオチドの純度は、その５’末端をＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（New England Biolabs、ビバリー、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて32Ｐ
リン酸およびγ−32Ｐ ＡＴＰ（Bresatec、Adelaide、Ｓ．Ａ．オーストラリア
）で標識し、７Ｍ尿素を含む１０％または１５％ポリアクリルアミドゲル上でそ
の分子を電気泳動し、オートラジオグラフィーまたはMolecular Dynamics Phos
phorImaging System（サニベール、ＣＡ）を用いて、
その分子を可視化することで検査された；全オリゴヌクレオチドの純度は、この
アッセイで判断すると、少なくとも９８％であった。精製されたオリゴヌクレオ
チドの濃度は、以下の２６０ｎｍにおける種々のヌクレオチドのモル吸光係数を
用いてＵＶ分光器により測定された：Ａ、１５．４×１０3；Ｇ、１１．７×１
０3；Ｃ、７．３×１０3；Ｔ／Ｕ、８．８×１０3Ｌｍｏ１-1ｃｍ-1。全オリゴ
ヌクレオチドは、蒸留し、イオン交換し、オートクレーブをかけた水中に、−２
０℃で保存した。オリゴヌクレオチド配列
この研究で使用されたオリゴヌクレオチドは、以下のとおりである。大文字は
リボヌクレオチドを指し、小文字はデオキシリボヌクレオリドを指す。成長ホルモンシステム
（ＧＨ）．GH RA-10/10,5'GACACUUCAU CUGAUGA GUCC UUUU
GGAC GAAACC CGCAGGT 3';GH RB-10/10,5'gacacttcat CUGAUGA GUCC UUUU GGAC
GAAAC ccqcaggt 3';GH S13-6/6，5'GCGGGUCAUGAAg 3';GH S21-10/10，5'ACCUGCG
GGUCAUGAAGUGUc3'.（配列認識番号1-4）クルッペル システム
（Ｋｒ）．Kr RA-10/10,5'CUCCAGUGUG CUGAUGA GUCC UUUU
GGAC GAAAC UCGCAAAt 3';KrRB-10/10，5'ctccagtgtg CUGAUGA GUCC UUUU GGAC G
AAAC tcqcaaat 3';Kr RA-6/10,5'AGUGUG CUGAUGA GUCC UUUU GGAC GAAAC UCGCAA
At 3';Kr S21-10/10,5'AUU UGC GAG UCC ACA CUG GAg3';Kr S18-10/7;5'AUU UGC
GAG UCC ACA CUg 3';Kr S17-10/6;5'AUU UGC GAG UCC ACA Ct 3';Kr S16-10/5
，5'AUU UGC GAG UCC ACA c 3';Kr S15-10/4，5'AUU UGC GAG UCC ACa 3'；Kr S
14-10/3，5'AUU UGC GAG UCC Ac 3';Kr S13-6/6，5'GCGAGUCCACACt 3';Kr S16-5
/10，C GAG UCC ACA CUG GAg 3'．（配列認識番号5-15）ＴＡＴシステム
（ＴＡＴ）．TAT RA-10/10，5'GUCCUAGGCU CUGAUGA GUCC UUUU G
GAC GAAAC UUCCUGGa 3';TAT RA-6/6，5'UAGGCU CUGAUGA GUCC UUUU GGAC GAAAC
UUCc 3;TAT RB-10/10，5'gtcctaggct CUGAUGA GUCC UUUU GGAC GAAAC ttcctgga
3';TAT RA-10/5，5'GUCCUAGGCU CUGAUGA GUCC UUUU GGAC GAAAC UUc 3; TAT RA
-5/10,5'AGGCU CUGAUGA GUCC UUUU GGAC GAAAC UUCCUGGa 3';TAT S13-6/6,5'GGA
AGUCAGCCUa 3'，TAT S21-10/10,5'TCC AGG AAG UCA GCC UAG GAc 3';TAT S16-10
/5，5'TCC AGG AAG UCA GCC t 3';TAT S16-5/10，5'GAAG UCA GCC UAG GAc 3';T
AT S14-10/3，5'TCC AGG AAG UCA GC 3';TAT S15-10/4，5'TCC AGG AAG UCA GCc
3';TAT S17-10/6，5'TCC AGG AAG UCA GCC Ua;TAT S18-10/7，5'TCC AGG AAG U
CA GCC UAg 3';TAT S19-10/8，5'TCC AGG AAG UCA GCC UAG g 3'（配列認識番号
16-29）ＯＵシステム
OU RA-8/8，5'GCG AUG AC CUGAUGA GGCC GAAA GGCC GAAAC GUU C
CC dT 3';OU RA-6/8，5'G AUG AC CUGAUGA GGCC GAAA GGCC GAAAC GUU CCC dT 3
';OU S-13-8/4，5'GGG AAC GUC GUC dG 3';OU S-14-8/5，5'GGG AAC GUC GUC G
dT 3';0U S-15-8/6，5'GGG AAC GUC GUC GU dC 3';OU S-16-8/7，5'GGG AAC GUC
GUC GUC dG 3';OUS-18-8/8，5'GGG AAC GUC GUC GUC GC dC 3';OU CS-13-8/4，
5'GGG AAC GUC GUC dA 3';OU CS-14-8/5，5'GGG AAC GUC GUC A dT 3';OU CS-15
-8/6，5'GGG AAC GUC GUC AU dc 3';OU CS-16-8/7，5'GGG AAC GUC GUC AUC dG
3';OU CS-18-8/8，5'GGG AAC GUC GUC AUC GC dC 3'.速度論的実験 リボザイム過剰の実験
別段記載のない限り、この速度論的実験は、３７℃でリボザイムおよび（32Ｐ
−リン酸で5’末端をラベルした）基質を使って、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2
と５０ｍＭ緩衝液（TrisまたはMes）中で、以下の手法を使用して行った。基質
濃度は、完全な複合体形成を確実にするために非常に高く保ち、２〜４μＭの範
囲（典型的には２μＭ）で、リボザイム濃度は少なくとも基質濃度の１．５倍（
典型的には３μＭ）であった。緩衝液中のリボザイムおよび基質ともに、８５℃
で２分間熱し、短時間遠心し、その後数分間、反応温度に置くことで前処理した
。その反応は、ＭｇＣｌ2の添加で開始した。サンプルをさまざまな時間間隔で
取り出し、８０％ホルムアミドと２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む２倍体積のゲルロー
ディング緩衝液を加えることで反応を停止した。各サンプル中の開裂した基質の
分画を、７Ｍ尿素を含む１５％ポリアクリルアミドゲル中で５’生成物から基質
を分離し、Molecular Dynamics PhosphorImaging systemとImageQuant softwar
e（Molecular Dynamics、サニベール、ＣＡ）を使用して各々の量を定量するこ
とで測定した。速度論的パラメーターは、所定の時間（ｔ）において、形成され
た生成物のパーセンテージ（Ｐt）のデータを以下の等式にあてはめることで得
られた。
Ｐt＝Ｐ∞−（ｅｘｐ（−ｋobsｔ）ＰΔ）
ここでＰtは時間ｔにおける生成物の量であり、Ｐ∞はｔ＝０における生成物の
量であり、ｋobsは反応のための一次速度定数であり、ＰΔは、ｔ＝∞（無限大
）とｔ＝０における生成物のパーセンテージの差である。これは一次速度論方程
式であり、この式から、ｋobs、Ｐ∞およびＰΔをデータの最小自乗法解析によ
り決定した。Ｐ∞は、約０．７から０．８、つまり基質の約７０％から８０％が
反応終結時に開裂された。観察された速度定数、ｋobsは、表１に示されており
、これは少なくとも２回の独立実験の平均値±標準偏差である。
ＯＵシステムを用いた実験は、２５℃でリボザイムと（32Ｐ−リン酸で５’末
端をラベルした）基質を使って、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2と５０ｍＭ緩衝液（Tris
、２５℃でｐＨ７．６０）中で行った。基質濃度は１８ｎＭで、リボザイム濃度
は、２．２μＭであった。緩衝液中のリボザイムおよび基質ともに、８５℃で２
分間前もって熱し、短時間遠心し、その後数分間２５℃に置いた。その反応は、
ＭｇＣｌ2の添加で開始した。開裂生成物からの基
質の分離および速度論的解析は、前述のとおり行った。
＜結果＞長アームリボザイムは、長い基質より短い基質を迅速に開裂する
各ハイブリダイズ性アームに１０ヌクレオチドを有するリボザイムは、ヘリッ
クスＩおよびIIIの各々に６塩基対を含む対称型１３ヌクレオチドの基質と複合
体を形成する一方、同じリボザイムは、これら各々のヘリックスに１０塩基対を
有する対称型２１ヌクレオチドの基質と複合体を形成する。このようなリボザイ
ム（ＴＡＴ ＲＡ−１０／１０を除く）は、対応する２１ｍｅｒ基質より有意に
速く１３ｍｅｒ基質を開裂する(表１)。ＴＡＴ ＲＡ−１０／１０の反応性は例
外らしく、いくつかの偽の塩基対合によって明らかに変えられている（考察参照
）。短い二重ヘリックスは、一般に長い二重ヘリックスより不安定なので、１０
／１０リボザイムによる２１ヌクレオチド基質に対する１３ヌクレオチド基質の
相対的開裂速度は、ヘリックスＩおよびIIIの一方または両方を比較的不安定に
することを要求する開裂メカニズムと矛盾しない。開裂はヘリックスＩが短いときに急速である
ヘリックスのどちらが不安定になることを要求されるのかを解明するために、
対称型（１０／１０）リボザイムと異なる長さのヘリックスを形成する一連の基
質がつくられた。同系リボザイムによるこれら基質の開裂速度は、表２に示され
ている。例外的なＴＡＴ ＲＡ−１０／１０を除いて、リボザイムは、ヘリック
スIIIで５塩基対を形成する基質（Ｓ１６−５／１０）より、有意に大きな速度
定数で、ヘリックスＩで５塩基対を形成する基質（Ｓ１６−１０／５）を開裂し
た。各々の場合、他方のヘリックスは１０塩基対から成る。コントロール実験に
おいて、ＴＡＴ Ｓ１６−１０／５およびＴＡＴ Ｓ１６−５／１０は、短アー
ムリボザイムＴＡＴ ＲＡ−６／６により同じ効率で開裂され(ｐＨ７．１３で
各々ｋobs＝３．１ｍｉｎ-1と３．８ｍｉｎ-1)、このことは、二つのＴＡＴ基質
の開裂能力において本質的な
違いがないことを実証している。同様の結果は、ヘリックスの長さが、基質の長
さよりもリボザイムのハイブリダイズ性アームの長さによって制限されるときに
観察される。例えば、二つの非対称型リボザイム、ＴＡＴ ＲＡ−１０／５およ
びＴＡＴ ＲＡ−５／１０を合成して、対称型２１ｍｅｒ基質、ＴＡＴ Ｓ２１
−１０／１０を開裂する能力を調べた(表３)。５塩基対のヘリックスＩを有する
複合体中の基質は、１０塩基対のヘリックスＩを有する複合体中の基質の時より
効率よく開裂される。こうした結論は、リボザイムＫｒ ＲＡ−６／１０が、ｐ
Ｈ７．１３で速度定数６．７ｍｉｎ-1で基質Ｋｒ Ｓ２１−１０／１０を開裂し
(表３)、ｐＨ８．０における対称型リボザイムＫｒ ＲＡ−１０／１０の速度定
数より１０倍以上大きい（表１）という観察により確証される。ヘリックスＩおよびIIIの最適な長さ
ヘリックスＩの最適な長さを決定するために、ＴＡＴおよびＫｒ基質を、開裂
部位の３’側に種々の数のヌクレオチド、および５’側に一定の１０ヌクレオチ
ドを付して調製した。ＴＡＴ ＲＢ−１０／１０、Ｋｒ ＲＡ−１０／１０およ
びＫｒ ＲＢ１０／１０による基質の開裂速度定数を、いくつかのｐＨで測定し
た（図３，４，５）。これらのデータは、ヘリックスIIIの１０塩基対に対して
、ヘリックスＩの最適な長さは５±１塩基対であることを示している。Ｋｒ Ｒ
Ｂ−１０／１０の活性における明らかな二重ピークは、何ら重視することではな
い。何故なら、約１５ｍｉｎ-1以上と測定された速度定数は、このような短い時
間間隔で反応をサンプリングすることに関わる困難さのため、とても当てになら
ないからである。ヘリックスIIIの最適な長さは、ヘリックスＩほど広範囲にわ
たって調べられなかった。しかし、有効なデータにより、ヘリックスＩが６塩基
対を有するとき、１０塩基対ヘリックスIIIを有する複合体を形成する基質は、
６塩基対ヘリックスIIIを形成する基質より速く開裂されることが示される。表
４は、３種のリボザイムＴＡＴ ＲＢ−１０／１０、Ｋｒ ＲＡ−１０／１０お
よびＫｒＲＢ−１０／１０による基質Ｓ１７−１０／６およびＳ１３−６／６の
開裂
速度定数を示しており、ここで、リボゾーム一基質複合体は、ヘリックスIIIに
１０塩基対または６塩基対を有する一方、ヘリックスＩに一定の６塩基対がある
。しかし、速度定数における違いは、多くても２倍しかない。従って、ヘリック
スIIIの長さの開裂速度定数に対する効果は、ヘリックスＩの長さの効果ほど、
顕著なものではない。基質におけるミスマッチ
表５および図７における結果は、以前に広範囲にわたって特徴づけられた（He
rtelら、1994）ＯＵシステムにおいて、最適開裂速度が、６ヌクレオチドのヘリ
ックスＩの長さで達成されることを明らかに実証している。
リボザイム基質複合体の位置１．４におけるグアノシンリボヌクレオチドの存
在は(Hertelら、1992による番号付け)、６ヌクレオチドおよびそれ以下のヘリッ
クス長さのハンマーヘッドの反応性を明らかに抑制している。
＜考察＞
この一連の実験を通して、リボザイムは基質より過剰で、高濃度の前もって形
成されたリボザイムと基質の複合体が使用された。従って、リボザイムと基質の
結合もリボザイムからの開裂生成物の解離も、観察された開裂速度定数を限定す
るのに何の役割も果たしていない。これらの結果は、開裂ステップｋ2（図式１
）がヘリックスＩの長さによって有意に影響を受けることを初めて実証している
。ヘリックスＩのコンフォメーション融通性およびヘリックスIIIの安定性
これらの実験は、開裂反応のモデルと一致しており、このモデルにおいては、
へリックスＩの一時的、部分的または完全な解離により、保存されたドメインの
強制的な構造再編成が可能となる。このモデルを使って、へリックスＩは特定の
長さを有し、かつへリックスIIIについては明確な最適な長さが存在しないとい
う要件が説明できる。もしヘリックスＩが長すぎたら、そのプロセスは、そのヘ
リックスの遅い解離によって妨げられ；もしヘリック
スＩが短すぎたら、活性のある複合体はあまりに不安定になり得る。もしヘリッ
クスIIIが短すぎたら、ヘリックスＩの解離の際に基質全体が解離する可能性が
非常に高く、全体的な開裂速度定数の低下という結果に至る。リボザイム開裂の
このモデルにより、リボザイムのハイブリダイズ性アームにおける(Hendryら、1
992；Shimayamaら、1993)、または基質の部位における（Shimayama、1994）ＤＮ
ＡのＲＮＡとの置換が、いくつかの状況で、開裂ステップの速度定数を明らかに
増大させるという観察結果も説明することができる。
多くの刊行物が、電気泳動の移動度および他の方法により測定されたヘリック
ス間の角度における、マグネシウムイオン濃度に応じた主要な変化を実証してい
る(Bassiら、1995；Amiriら、1994；Gastら、1994)。マグネシウムイオンは、ヘ
リックスＩがヘリックスIIと小角度をなすコンフォメーションにハンマーヘッド
を折りたたむように明らかに誘導する(Basslら、1995)。興味深いことに、２ｍ
ＭのＭｇ2-イオンの存在と、９塩基対の比較的安定なヘリックスIIIのみで、ヘ
リックスＩとIIが接近して一緒に動くことが分かった(Amiriら、1994；Gastら、
1994)。リボザイムの活性型は、比較的近接してヘリックスＩとIIを有している
ようである。これら研究で見られたヘリックスＩのマグネシウムイオン誘導によ
る融通性は、ヘリックスＩのある程度の不安定さという要件に関して我々がここ
で得た観察結果と関連している可能性がある。しかし電気泳動研究で見られたヘ
リックスＩの移動において、鎖の解離した証拠はない。
他の研究は、ヘリックスＩが比較的不安定である必要があり、ヘリックスIII
がより安定である必要があるという見解と一致している。非常に長いヘリックス
IIIという状況において、ヘリックスＩは活性を低下させることなく、わずか３
塩基対に減少させることができた(Tablerら、1994)；しかし、この場合、リボザ
イムと基質を前もってアニール化した事実にもかかわらず、観察された速度定数
は、ｐＨ８、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2でわずか約０．０１ｍｉｎ-1であり、これは
、短い基質の効率的な開裂で期待されたよりも約１０００倍遅い。保存されたド
メインに近いヘリックスＩまたはヘリックス
IIIにおけるミスマッチは、活性の劇的な低下を引き起こすことが示されたが、
ヘリックス１における末端のミスマッチは、最低限の影響しか示さなかった(Zou
madakisら、1994)。比較的短い基質に結合するヘリックスという状況において(W
ernerら、1995)、ヘリックスＩの中心に近いミスマッチは、ヘリックスIIIの中
心よりずっと寛容であるが、最も内部の４塩基対のいずれものミスマッチは、ｋ2
における有意な低下を引き起こした。非常に長いヘリックスＩとIIを有したハ
ンマーヘッドという状況において、ヘリックスIIIの３塩基対から９塩基対への
延長は、観察された速度定数の１００倍以上の増加を引き起こした(Amiriら、19
94)。別の研究において(Ellisら、1993)、開裂反応が律速であるとは考えられな
かった条件下とはいえ、ヘリックスIIIを８個から４個の有効塩基対に減少させ
たとき、過剰なリボザイムを使った比較的長い転写産物の開裂は、非常に有意な
活性低下を示した。
コンフォメーション変化の分子的根拠は、我々がここで行った観察結果からは
推論できない。基質類似体とハンマーヘッド型リボザイムとの複合体の結晶構造
は(Pleyら、1994)、潜在的な求核試薬が適切なリン酸基へのインライン攻撃に対
して正しく配置されていない不活性な構造を示している。いくつかのグルーブが
どのようにしてこのことが起こるかを推測したけれども(Scottら、1995；Setlik
ら、1995)、固体状態でみられたその不活性な構造がどのようにして活性型に変
換するのかは明らかではない。ヘリックスＩを介してコンフォメーション変化を制限する特別な因子
ハンマーヘッド型リボザイムが基質類似体と複合体をつくった結晶構造におい
て(Pleyら、1994；Scottら、1995)、リボザイムの５’アームのあるリン酸基お
よび糖グループは、ループII近くのヘリックスIIの端部におけるリン酸基に接近
している。とりわけ、Pleyらによる結晶構造において(Pleyら、1994)、相互作用
は、リボザイムの５’アームの４番目と５番目のヌクレオチド（ヌクレオチド２
．４および２．５）、およびヘリックスIIの２ヌクレオチド（ヌクレオチド１１
．３と１１．４）に関係があり；Scottらに
よる構造においては(Scottら、1995)、相互作用はヌクレオチド２．５とヌクレ
オチド１１．４との間である。我々は、ヘリックスＩが５±１塩基対の長さであ
るときに最適開裂速度が観察されることに気づいたので、これらヘリックス間の
相互作用は、開裂メカニズムにおける重要な要素であり得るかもしれない。もし
これが事実なら、最適開裂速度は、相互作用の強度にかかわりなく、約５ヌクレ
オチドのヘリックスＩで常に観察されるはずである。この研究は進行中である。
リボザイムＴＡＴ ＲＡ−１０／１０は、特別な事例であると思われる。この
リボザイムは、ｐＨ８．００で、短い類似体ＴＡＴ ＲＡ−６／６が開裂するよ
り４０倍以上遅い速度で１３ｍｅｒの基質ＴＡＴ Ｓ１３−６／６を開裂する点
で例外的な活性を示す(Hendryら、1995)。例外的活性の原因は、リボザイムの５
’アームの末端ヌクレオチドにあるはずである。何故なら、ＴＡＴ ＲＡ１０／
５は、ｐＨ７．１３で、わずか０．０９±０．０１ｍｉｎ-1の速度定数でＴＡＴ
Ｓ１３−６／６を開裂し、同じ条件下でＴＡＴ ＲＡ−５／１０によるその基
質の開裂より５０倍遅いからである。この状況から、我々は、リボザイムの５’
アームにおける末端ヌクレオチドが塩基配列５’ＧＵＣＣを有することに気づき
、これはヘリックスIIの４塩基に相補的であり、その上、Ａ2.5からＣ3とＧ8か
らＵL2.1との配列の間に高度な相補性がある。従って、ＴＡＴ ＲＡ−１０／１
０の例外的開裂速度は、偽の塩基対合の相互作用により引き起こされると思われ
る。
ＨＨ１６の速度論は、短くしたヘリックスＩの効果に関する最近の論文も含め
て(Hertelら、1996)、広範囲にわたって研究されてきた(Hertelら、1994)。この
リボザイムは、十分理解され、且つ使い易いハンマーヘッドリボザイムの例であ
ることが広く受け入れられており、そのリボザイムにおいては、開裂ステップが
律速である。不思議なことに、ＨＨ１６は、標準的命名法における位置１．４−
２．４にＧ−Ｕミスマッチを有している。Uhlenbeckのデータは、ヘリックスＩ
が約５または６ヌクレオチドの長さであるとき、開裂速度定数に（我々の考え方
による）期待ピークを示さなかった。我々は、このシステムをさらに調査し、一
連の基質だけでなく、１３
から１８ヌクレオチドの種々の長さのＨＨ１６の類似システムを合成し、ここで
は、位置１．４−２．４でのミスマッチは、ワトソン−クリックのＡ−Ｕペアに
置換した。
ＨＨ１６に最も類似したハンマーヘッドである、ＯＵ ＲＡ−８／８＋ＯＵ
Ｓ−１８−８／８の開裂速度定数は、ｐＨ７．６、２５℃で、１．４±０．１ｍ
ｉｎ-1であることが分かった。正常なｐＨ依存を仮定して、これをｐＨ７．５に
調整すると、１．１ｍｉｎ-1の速度定数が得られ、この値はこれらの条件下で公
表された速度定数１．０ｍｉｎ-1とかなり一致している。
完全に相補的な基質（ＯＵ ＣＳ）を持ったハンマーヘッドにおいて、ヘリッ
クスＩの長さによる開裂速度定数の通常の傾向が観察され(ＯＵ ＲＡ−８／８
＋ＯＵ ＣＳシリーズ)、開裂速度定数は、ヘリックスＩの長さ６塩基対でピー
クとなり、このピークの両側で有意に減少した。
短くしたリボザイムを、４塩基対（２．５ｍｉｎ-1）から６塩基対（８ｍｉｎ-1
）までのヘリックスＩの長さによって速度定数が増加する相補的基質（ＯＵ
ＲＡ−６／８＋ＯＵ ＣＡシリーズ）とともに使用すると、不思議なことに、リ
ボザイム上の５’アームの長さにより制限されるため、ヘリックスＩの長さをさ
らに増加することは不可能であるが、基質の長さを増加すると、観察される開裂
速度が有意に低下するという結果が得られた(ＯＵ ＲＡ−６／８＋ＯＵ ＣＳ
−１８−８／８；ｋobs＝４．３ｍｉｎ-1)。その速度は、対称型リボザイムにつ
いて観察された程度までは低下しないが(ＯＵ ＲＡ−８／８＋ＯＵ ＣＳ−１
８−８／８；ｋobs＝０．７１ｍｉｎ-1)、有意な低下である。それは、ＯＵ Ｒ
Ａ−６／８（８．０ｍｉｎ-1）とＯＵ ＲＡ−８／８（３．９ｍｉｎ-1）につい
てのＯＵ ＣＳ−１５−８／６の速度定数の違いにより反映される。このことは
、この特定のシステムにおいて、ヘリックスＩ末端でのリボザイムまたは基質の
突出を有することにより受けるカイネティックペナルティがあることを示唆して
いる。これは、別の（不活性な）構造を形成する能力におそらく関連している別のコンフォメーション融通性
in vitro開裂が、ヘリックスＩもIIIも非常に長い場合に観察されるという事
実により(Homannら、1993；Loら、1992)、リボゾーム−基質複合体が活性なコン
フォメーションに達するための別の経路の存在が示唆される。例えば、ヘリック
スIIはコンフォメーション変化を許容するのに十分ゆるめ得ることが可能であろ
う。この仮説を支持して、我々は、各ハイブリダイズ性アームに１０ヌクレオチ
ドを有するミニザイム（ヘリックスIIの欠損したリボザイム）が、常に、対称型
１３ｍｅｒ基質より対称型２１ｍｅｒ基質を効率良く開裂することを観察し、さ
らに、（複合体のヘリックスＩに、それぞれ５塩基対および１０塩基対を有する
）１０／１０基質と比べて１０／５基質を開裂するこれらミニザイムに関して、
開裂速度定数の向上は観察されていない。従って、ミニザイムにより所持された
コンフォメーションの融通性は、ヘリックスIIの欠損のため、ヘリックスＩの解
離なしで、活性コンフォメーションに達することを可能にする。その他の研究
Denmanらは(Denmanら、1995)、不安定化しているヘリックスＩの効果を調査す
る明確な目的で、β−アミロイドペプチド前駆体（β−ＡＰＰ）を標的にした多
くのリボザイムを研究した。多様な基質コンフォメーションにより明らかに複雑
化した彼らの研究において、観察された開裂速度は非常に低かった。最も活性な
リボザイムは、ヘリックスＩおよびヘリックスIIIがそれぞれ７塩基対および８
塩基対を有するものであると彼らは結論づけた。Amiri and Hagerman（Amiriら
、1994）は、非常に長いヘリックスＩおよびIIを有する前もってアニール化した
リボザイムが、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2の添加により、ｐＨ８、２５℃で、５ｍｉ
ｎ-1以上の速度定数で、そのアニール化した基質を開裂できることを主張してい
る。しかし添付した図（Amiri自ら、1994における図２）は、約０．５ｍｉｎ-1
の速度定数で、その条仲下での開裂を示していると思われる。リボザイムの設計
この研究においてリボザイム設計には非常に明白な意味がある。in vitroにお
ける最適開裂速度にとって、５’ハイブリダイズ性アームは、約５±１ヌクレオ
チドを含むべきである。３’ハイブリダイズ性アームのヌクレオチドの数は、あ
まり重要ではない；しかし、約５ヌクレオチドより大きいべきである。もし多様
な代謝回転が必要なら、開裂による５’生成物のリボザイムの３’アームからの
解離速度（つまり開裂後のヘリックスIIIの解離速度）も考慮しなければならな
い。
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21
5/10 5/00 Ａ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ
，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ
，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，
ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ
Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ
，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，
ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ
Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ
，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，
ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ
(72)発明者 マッコール、マキシン・ジェイ
オーストラリア国、エヌエスダブリュ
2112、プットニー、チャールズ・ストリー
ト 125