JP2000509965A

JP2000509965A - 繊維芽細胞増殖因子相同因子―３（ｆｈｆ―３）および使用方法

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Publication number: JP2000509965A
Application number: JP09533753A
Authority: JP
Inventors: ネイサンス，ジャーミー; スモールウッド，フィリップ，エム．; トング，パトリック
Original assignee: ザジョンズホプキンスユニバーシティースクールオブメディシン
Priority date: 1996-03-21
Filing date: 1997-03-21
Publication date: 2000-08-08
Also published as: AU719538B2; EP0935654A4; EP0935654A1; CA2249179A1; AU2341597A; IL126298A0; WO1997035007A1

Abstract

(57)【要約】新規なタンパク質である繊維芽細胞増殖因子相同因子−３（ＦＨＦ−３）、ＦＨＦ−３をコードするポリヌクレオチド配列、および推定されるアミノ酸配列を開示する。さらに、ＦＨＦ−３ポリペプチド、ＦＨＦ−３ポリヌクレオチド配列、およびＦＨＦ−３と特異的に結合する抗体を用いる診断および治療方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】繊維芽細胞増殖因子相同因子−３（ＦＨＦ−３）および使用方法発明の背景１．発明の利用分野本発明は、一般的には増殖因子に関するものであり、より特定的には繊維芽細胞増殖因子相同因子−３（fibroblast growth factor homologous factor-3:ＦＨＦ−３）と称する繊維芽細胞増殖因子ファミリーの新規なメンバーおよびＦＨＦ−３をコードするポリヌクレオチドに関するものである。２．関連技術の説明繊維芽細胞増殖因子ファミリーは、in vivoおよびin vitroにおいて広範囲の増殖促進、生存および／または分化活性を有する、構造的に関係のあるタンパク質の一群を包含する（Baird，A．and Gospodarowicz，D.，Ann N.Y．Acad．Sci. ，638:1，1991;Eckenstein，F.P.，J．Neurobiology 25:1467，1994;Mason，I. ，J．Cell，78:547，1994に論評されている）。１９９４年１２月現在で、このファミリーの９つのメンバーが分子クローニングにより特性付けられている。特性付けられた最初の２つのメンバーである、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ／ＦＧＦ−１）と塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２）は、例えば脳、眼、腎臓、胎盤、副腎を含めて、多数の組織で見いだされている（Jayeら，Science 233:541，1986;Abrahamら，Science 233:545，1986）。これらの因子は、繊維芽細胞、内皮細胞、海馬および大脳皮質ニューロン、大グリア細胞を含めて、中胚葉および神経外胚葉由来のさまざまな組織の強力な分裂促進因子および生存因子であることが判明している（Burgess，W.H．and Maciag，T.，Ann．R ev．Biochemistry 58:575，1989）。ＦＧＦファミリーの追加のメンバーとしては、マウス乳癌ウイルスの通常の組込み部位の１つとして同定され、それゆえ発癌因子であると推定されるｉｎｔ−２／ＦＧＦ−３(Smithら，EMBO J．7:1013， 1988);NIH 3T3トランスフェクションアッセイで形質転換遺伝子として同定されたＦＧＦ−４（Delli-Boviら，Cell 50:729，1987）およびＦＧＦ −５(Zhanら，Mol．Cell Biol．8，3487，1988);ＦＧＦ−４に対する相同性に基づいて分子クローニングにより単離されたＦＧＦ−６(Maricsら，Oncogene 4:33 5，1989);ケラチノサイトの分裂促進因子として同定されたケラチノサイト増殖因子／ＦＧＦ−７(Finchら，Sclence 245:752，1989);乳癌細胞のアンドロゲン誘導分裂促進因子として同定されたＦＧＦ−８(Tanakaら，Proc．Natl．Acad．S ci．USA 89:8928，1992);および一次神経膠星状細胞の分裂促進因子としてのＦＧＦ−９（Miyamotoら，Mol．Cell Biol．13:4251，1993）などがある。ａＦＧＦおよびｂＦＧＦを含めて数種のＦＧＦは古典的なシグナル配列をもたず、それらの分泌機構は不明である。ＦＧＦファミリーの全メンバーはおよそ２５％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有し、この相同度はそれらがほぼ同一の三次元構造を共有するらしいことを示唆する。この推論はＸ線回折により測定されたｂＦＧＦとインタ．ロイキン１−βの三次元構造の比較により支持される（Erikssonら，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 88:3441，1991;Zhangら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:3446，19 91;Agoら，J．Biochem．110:360，1991）。これらのタンパク質はアミノ酸同一性が１０％しかないが、２つの結晶構造のα炭素バックボーンは２オングストローム未満の二乗平均の平方根の偏差でもって重ね合わせることができる(Zhangら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:3446，1991)。両タンパク質はほとんど完全にβシートから成っていて、３コピーの四本鎖β曲折モチーフから構成されたバレルを形成している。ヘパリン結合性およびレセプター結合性と思われる両領域が該タンパク質の一面上の近接した領域に位置づけられる。ａＦＧＦ、ｂＦＧＦおよびＦＧＦ−７／ＫＧＦは、細胞表面のチロシンキナーゼ受容体への高親和性結合を介して生物学的活性の一部または全部を発揮することがわかっている(例えば、Lee，P.L．ら，Science 245:57，1989;Johnson，D.E ．and Williams，L.T.，Adv．Cancer Res．60:1，1993)。また、ＦＧＦファミリーの多くのメンバーはヘパリンに強固に結合し、ヘパリンとＦＧＦと膜貫通受容体の三成分複合体は生物学的に有意義なシグナル伝達種であり得る。これまでに、ＦＧＦファミリーのメンバーの受容体をコードする４種類の遺伝子が同定されている。最近の研究から、細胞外リガンド結合ドメイン内の示差的ｍＲＮＡスプライシングにより受容体多様性が増加することがわかり、異なるリガンド結合特性をもつ複数の受容体イソ型が同一の遺伝子によってコードされ得るという結果をもたらした（Johnson，D.E．and Williams，L.T.，Adv．Cancer Res．60: 1，1993）。組織培養系において、ａＦＧＦまたはｂＦＧＦのその細胞表面受容体への結合はホスホリパーゼＣ−γを活性化し（Burgess，W.H．ら，Mol．Cell Biol．10:4770，1990）、このホスホリパーゼＣ−γはさまざまな分裂促進シグナルを統合することが知られている経路である。ＦＧＦファミリーの新メンバーを同定し特性決定することにより、細胞や臓器がその増殖、生存、老化、分化、損傷からの回復をコントロールする作用機構を洞察することができよう。発明の概要本発明は細胞の増殖、生存、分化因子としてのＦＨＦ−３および該因子をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。この因子は中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢組織の細胞の増殖、生存および／または分化に関与している。本発明は、神経変性疾患または腫瘍性疾患の診断に役立つＦＨＦ−３遺伝子発現における変化を検出する方法を提供する。もう一つの態様において、本発明はＦＨＦ−３の発現または活性を調節することにより神経変性疾患または腫瘍性疾患を治療する方法を提供する。図面の簡単な説明図１は、ヒトＦＨＦ−３のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す（配列番号１および２）。図２は、ヒトＦＨＦ−３のアミノ酸配列と、ＦＧＦファミリーの他の９つのメンバーのそれぞれのアミノ酸配列とのアライメント（並列化）を示す。保存された残基を強調してある。ＦＧＦファミリーのメンバーは次のとおりである：ａＦＧＦ／FＧＦ−１（Jayeら，Science 233:541，1986）、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２（ Abrahamら，Science 233:545，1986）、ｉｎｔ−２／ＦＧＦ−３（Smithら，EMB O J．7:1013，1988)、ＦＧＦ−４（Delli-Boviら，Cell 50:729，198 7）、ＦＧＦ−５（Zhanら，Mol．Cell Biol．8，3487，1988)、ＦＧＦ−６（Mar icsら，Oncogene 4:335，1989)、ケラチノサイト増殖因子／ＦＧＦ−７（Finch ら，Science 245:752，1989）、ＦＧＦ−８(Tanakaら，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 89:8928，1992)、およびＦＧＦ−９（Miyamotoら，Mol．Cell Blol．13:4 251，1993）。図３は、ＦＧＦファミリーのメンバーの任意の対をつなぐ直線の長さがその対のアミノ酸配列の分岐度に比例する樹状図を示す。図４は、ＦＨＦ−３をコードする遺伝子がヒト17番染色体上に位置することを示す。ヒト特異的ハイブリダイゼーションが17番染色体上に見いだせる。図５は、ＦＨＦ−３発現の組織特異性を示す。図示したマウスの組織由来の全ＲＮＡ10μｇを調製し（Chomczinski & Sacchi．Anal．Biochem．162:156，19４ 87）、5'非翻訳配列の70塩基とコード領域の最初の130塩基を含むクローン化ｃＤＮＡの200塩基に及ぶマウスＦＨＦ−３アンチセンスプローブを用いるＲＮアーゼプロテクションに使用した（Ausabelら，Current Protocols in Molecular Biology;New York:Wiley Interscience，1987）。脳および眼由来のＲＮＡでは、予想されたサイズ（矢印）で最も強くＲＮアーゼプロテクションが観察され、肺および精巣由来のＲＮＡでは弱いプロテクションが見られた。図６は、一時的にトランスフェクトしたヒト胚腎細胞（細胞系293）にて産生されたＦＨＦ−３の免疫ブロットを示す。ＦＨＦ−３でトランスフェクトした細胞（右レーン）は、見掛けの分子量が30kDの免疫反応性ポリペプチドを合成する。この免疫反応性ポリペプチドは、関連のＦＧＦファミリーメンバー（ＦＨＦ− ２）でトランスフェクトした細胞（中央レーン）または偽トランスフェクトした細胞（左レーン）では見られないものである。前もって染色したタンパク質サイズ標品の見掛けの分子量(kD)を左側に示す。図７ａおよび７ｂは、各々ＦＨＦ−１およびＦＨＦ−２のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す（配列番号６〜９）。発明の詳細な説明本発明は増殖因子ＦＨＦ−３およびＦＨＦ−３をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。ＦＨＦ−３は脳と眼の組織で高レベルに発現され、肺および精巣で低レベルに発現される。一つの態様において、本発明は、ＦＨＦ−３の発現または機能と関連がある中枢神経系の細胞増殖性疾患または細胞変性疾患を検出する方法を提供する。もう一つの態様において、本発明は、ＦＨＦ−３の発現または活性を抑制または増強する薬剤を用いることにより細胞増殖性疾患または免疫学的疾患を治療する方法を提供する。本発明のＦＨＦ−３タンパク質とＦＧＦファミリーのメンバーとの構造相同性は、ＦＨＦ−３がこの増殖因子ファミリーの新メンバーであることを示す。多くの他のメンバーの公知の活性に基づくと、ＦＨＦ−３も診断および治療用の薬剤として有用な生物学的活性を保持することが期待される。多くの増殖因子は神経系の機能に関係する発現パターンまたは活性を有する。例えば、ＴＧＦファミリーの一つの増殖因子、すなわちＧＤＮＦはドーパミン作動性ニューロンの生存を促進することができる強力な神経栄養因子であることがわかった(Linら，Science 260:1130)。もう一つのファミリーメンバーであるドーサリン−ｌ１は神経冠細胞の分化を促進することが可能である（Baslerら，Ce ll 73:687，1993）。インヒビンおよびアクチビンは脳において発現されることが明らかになり（Meunierら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:247，1988;Sawc henkoら，Nature，334:615，1988）、アクチビンは神経細胞生存分子として機能する能力をもつことがわかった(Schubertら，Nature，344 868，1990)。別のＴＧＦファミリーメンバーであるＧＤＦ−１はその発現パターンが神経系特異的であり(Lee，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88:4250，1991)、また、いくつかの他のファミリーメンバー、例えばＶｇｒ−１(Lyonsら，Proc．Natl．Acad．Sci．U SA，86:4554，1989;Jonesら，Development，111:581，1991)、ＯＰ−１(Ozkayna kら，J．Biol．Chem.，267:25220，1992)およびＢＭＰ−４(Jonesら，Developme nt，111:531，1991)も神経系で発現されることが知られている。脳内でのＦＨＦ−３の発現は、神経系の機能に関係する活性がＦＨＦ−３にもありうることを示唆する。ＦＨＦ−３は、各種ニューロン集団の神経栄養活性をもつのかもしれない。それゆえ、ＦＨＦ−３は筋萎縮性側索硬化症のような神経変性疾患を治療したり、移植に先立って細胞または組織を培養下で維持するといったin vitroおよびin vivo用途をもつ可能性がある。第一の態様において、本発明は、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したときの分子量が約26〜28ｋＤでありかつ本質的に配列番号２(図１)のアミノ酸配列を有することにより特性付けられる、実質的に純粋な繊維芽細胞増殖因子相同因子−３（ＦＨＦ−３）を提供する。本明細書中で用いる「実質的に純粋な」とは、他のタンパク質、脂質、炭水化物またはＦＨＦ−３が天然で結合している他の物質を実質的に含まないＦＨＦ−３のことである。当業者であれば、標準的なタンパク質精製法を用いてＦＨＦ−３を純化することが可能である。実質的に純粋なポリペプチドは非還元性ポリアクリルアミドゲル上で単一の主要バンドをもたらすだろう。ＦＨＦ−３ポリペプチドの純度はアミノ末端アミノ酸配列解析により測定することもできる。ＦＨＦ−３の活性が残っている限り、ＦＨＦ−３ポリペプチドにはこのポリペプチドの機能性断片も含まれる。ＦＨＦ−３の生物学的活性を有する小型のペプチドは本発明に含まれる。本発明はＦＨＦ−３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドとして、ＦＨＦ−３をコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡ配列がある。ＦＨＦ−３の全部または一部をコードする全てのポリヌクレオチドは、それらがＦＨＦ−３活性をもつポリペプチドをコードする限り、本発明に含まれることを理解すべきである。このようなポリヌクレオチドとしては、天然に存在するポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、意図的に操作されたポリヌクレオチドがある。例えば、ＦＨＦ−３ポリヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発にかけることができる。ＦＨＦ−３のポリヌクレオチド配列にはアンチセンス配列も含まれる。本発明のポリヌクレオチドは遺伝子コードの結果として縮重している配列を包含する。２０種類の天然アミノ酸があり、そのうちの大部分は２以上のコドンにより規定されている。したがって、あらゆる縮重ヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列によりコードされるＦＨＦ−３ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化していない限りでは、本発明に含まれる。ヒトＦＨＦ−３ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列がここに詳細に開示される。この配列は長さが225アミノ酸からなるポリペプチドをコードする読取り枠（オープンリーディングフレーム）を含有する。図１の位置74に示されるヒトＦＨＦ−３の開始メチオニンコドンは読取り枠の合った最初のATGコドンであり、良好なコンセンサスリボソーム結合部位（GCGCTATGG；Kozak，Nucleic Acids Re s.，15:8125，1987）がこの位置に存在する。読取り枠内の次のメチオニンコドンは、推定上の開始メチオニンコドンの124コドン3'側に見られる。ａＦＧＦとｂＦＧＦの場合に観察されるように、ＦＨＦ−３の一次翻訳産物のアミノ末端は、小胞体の膜を通過する同時翻訳挿入(cotranslational insertion)を指令するシグナルペプチドのコンセンサス配列と一致しない。ＦＨＦ−３配列は、潜在的なアスパラギン結合グリコシル化のためのasn-X-ser/thr部位を欠く。好ましくは、ヒトＦＨＦ−３ヌクレオチド配列は配列番号１であり、推定アミノ酸配列はおそらく配列番号２である（図１参照）。ＦＨＦ−３をコードするポリヌクレオチドは配列番号１だけでなく配列番号１に相補的な核酸配列も含む。相補的配列にはアンチセンスヌクレオチドが含まれ得る。この配列がＲＮＡであるときは、配列番号１のデオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣおよびＴがそれぞれリボヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣおよびＵにより置き換えられる。鎖長が少なくとも15塩基である上記核酸配列の断片も本発明に含まれ、この15塩基という鎖長は、断片が生理的条件下で配列番号２のタンパク質をコードするＤＮＡに選択的にハイブリダイズすることを可能にするに十分である。特に、これらの断片は中程度のストリンジェント条件下でＦＨＦ−３タンパク質をコードするＤＮＡにハイブリダイズすべきである。ＦＨＦ−３に対して最も相同性が高いＦＧＦファミリーメンバーはＦＧＦ−９であり、ＦＧＦ−９は８個のギャップを加えてアライメントするとき、ＦＨＦ− ３と30％のアミノ酸同一性を共有する。ＦＨＦ−３の一次アミノ酸配列のわずかな修飾により、本明細書に記載するＦＨＦ−３ポリペプチドと実質的に同等の活性を有するタンパク質が得られる。このようなタンパク質には、「本質的に配列番号２のアミノ酸配列を有する」という表現で規定されるタンパク質が含まれる。こうした修飾は、例えば部位特異的突然変異誘発によるように、意図的であっても、自然発生的であってもよい。これらの修飾により産生されるポリペプチドはすべて、ＦＨＦ−３の生物学的活性がまだ存在する限り、本発明に含まれる。さらに、１以上のアミノ酸を欠失させることによっても、その生物学的活性を有意に変えることなく、得られた分子の構造を修飾することができる。これはよリ広範な有用性を有する小型の活性分子の開発へとつながる。例えば、ＦＨＦ−３の生物学的活性にとって必要でないアミノ末端またはカルボキシ末端のアミノ酸を除くことができる。本発明のポリヌクレオチドによってコードされる本発明のＦＨＦ−３ポリペプチドには、開示された配列（配列番号２）およびその保存的変異が含まれる。本明細書中で用いる「保存的変異」という用語は、あるアミノ酸残基を生物学的に類似した別のアミノ酸残基と置換することをいう。保存的変異の例として、イソロイシン、バリン、ロイシン、メチオニンのような、ある疎水性残基の他の疎水性残基による置換、または、ある極性残基の他の極性残基による置換、例えばアルギニンのリシンによる置換、グルタミン酸のアスパラギン酸による置換、グルタミンのアスパラギンによる置換などが挙げられる。「保存的変異」という用語はまた、無置換の親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することを含むが、この置換ポリペプチドに対して誘導された抗体は無置換ポリペプチドと免疫反応しなければならない。本発明のＤＮＡ配列はいくつかの方法により得ることができる。例えば、当該技術分野で周知のハイブリダイゼーション技法を用いてＤＮＡを単離することができる。これらの技法として、１）相同なヌクレオチド配列を検出するためのプローブとゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーとのハイブリダイゼーション、２）目的のＤＮＡ配列にアニーリングすることができるプライマーを用いるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および３）構造的特徴を共有するクローン化ＤＮＡ断片を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニングがあるが、これらに限らない。本発明のＦＨＦ−３ポリヌクレオチドは好ましくは哺乳動物に由来するものであり、ヒトに由来するものが最も好ましい。核酸ハイブリダイゼーションによるスクリーニング法は、適当なプローブが入手可能であるという前提で、どのような生物からも任意の遺伝子配列を単離することを可能にする。問題のタンパク質をコードする配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプローブを化学的に合成することができる。それには、短いオリゴペプチド領域のアミノ酸配列が既知である必要がある。タンパク質をコードするＤＮＡ配列は遺伝子コードから推測することができるが、遺伝子コードの縮重を考慮しなければならない。配列が縮重するときは混合付加反応を行うことが可能である。これは変性した二本鎖ＤＮＡの異種混合物を含む。このようなスクリーニングの場合、一本鎖ＤＮＡまたは変性二本鎖ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションを実施することが好ましい。ハイブリダイゼーションは、目的のポリペプチドに関係するｍＲＮＡ配列の量が極端に少ない供給源に由来するｃＤＮＡクローンを検出する際に特に有用である。換言すると、非特異的結合を回避するように設定したストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いることにより、例えば、混合物中の単一プローブ（標的ＤＮＡの完全な相補鎖である）への標的ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより特定のｃＤＮＡクローンのオートラジオグラフによる可視化が可能である(W allaceら，Nucl．Acid Res.，9:879，1981;Maniatisら，Molecular Cloning:A L aboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y．1988)。ＦＨＦ−３をコードする特定のＤＮＡ配列は、１）ゲノムＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡ配列の単離、２）目的のポリペプチドの必要なコドンを提供するＤＮＡ配列の化学合成、および３）真核ドナー細胞から単離したｍＲＮＡの逆転写による二本鎖ＤＮＡ配列のin vitro合成、によっても得ることができる。後者の場合、結局ｍＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ相補体が形成され、これは一般的にｃＤＮＡと呼ばれている。組換え法で使用する特定のＤＮＡ配列を得るための上記３つの方法のうち、ゲノムＤＮＡ分離物の単離は最も一般的でない。このことは、イントロンが存在するために、哺乳動物ポリペプチドの微生物による発現を得ることが望まれる場合には特に当てはまる。ＤＮＡ配列の合成は、しばしば、所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列が既知である場合には最上の方法である。所望のポリペプチドのアミノ酸残基の全配列が不明である場合には、ＤＮＡ配列の直接合成は不可能であって、最上の方法はｃＤＮＡ配列の合成である。目的のｃＤＮＡ配列を単離するための標準的な方法は、中でも、高レベルの遺伝子発現を有するドナー細胞内に豊富に存在するｍＲＮＡの逆転写から誘導されるプラスミドまたはファージに担持されるｃＤＮＡライブラリーの作製である。ポリメラーゼ連鎖反応の技術と組み合わせて用いると、稀な発現産物でさえもクローニングすることができる。ポリペプチドのアミノ酸配列のかなりの部分が知られている場合には、標的ｃＤＮＡ中に存在すると推定される配列を複製する一本鎖または二本鎖の標識ＤＮＡまたはＲＮＡプローブ配列を作製して、一本鎖の形に変性しておいたｃＤＮＡのクローン化コピーに対して実施されるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法において使用する（Jayら，Nucl．Acid Res.，11:2325，1983）。ＦＨＦ−３に特異的な抗体を用いて、少なくとも１つのエピトープを有するＦＨＦ−３ペプチドに関して、ラムダgt11のようなｃＤＮＡ発現ライブラリーを間接的にスクリーニングすることができる。このような抗体はポリクローナル的に誘導されてもモノクローナル的に誘導されてもよく、ＦＨＦ−３のｃＤＮＡの存在を示す発現産物の検出に用いられる。ＦＨＦ−３をコードするＤＮＡ配列は適当な宿主細胞へのＤＮＡ移入によりin vitroで発現させることができる。「宿主細胞」はベクターを増やすことができかつそのＤＮＡを発現させることができる細胞である。この用語はその宿主細胞のあらゆる子孫をも包含する。複製中に突然変異が起こることがあるので、全部の子孫が親細胞と同一であるとは限らないことを理解すべきである。しかしながら、用語「宿主細胞」が用いられるときは、このような子孫も含まれる。安定した移入法（外来ＤＮＡが宿主中に連続して維持されることを意味する）は当技術分野で公知である。本発明において、ＦＨＦ−３ポリヌクレオチド配列は組換え発現ベクター中に挿入される。「組換え発現ベクター」という用語は、ＦＨＦ−３遺伝子配列の挿入または組込みにより操作されたプラスミド、ウイルスまたは当技術分野で公知の他の運搬体を意昧する。このような発現ベクターは宿主の挿入遺伝子配列の効率的な転写を促進するプロモーター配列を含有する。発現ベクターは典型的には複製起点、プロモーター、さらに形質転換細胞の表現型選択を可能にする特定の遺伝子を含有する。本発明で使用するのに適したベクターとしては、細菌発現用のＴ７ベースの発現ベクター（Rosenbergら，Gene，56:125，1987）、哺乳動物細胞発現用のpMSXND発現ベクター（Lee and Nathans，J．Biol．Chem.，263:352 1，1988)および昆虫細胞発現用のバキュロウイルス由来のベクターがあるが、これらに限らない。ＤＮＡセグメントは調節要素、例えばプロモーター（例：Ｔ７、メタロチオネインＩまたはポリヘドリンプロモーター）に機能的に連結された状態でベクター中に存在する。ＦＨＦ−３をコードするポリヌクレオチド配列は原核または真核生物内で発現させることができる。宿主として、微生物、酵母、昆虫および哺乳動物が挙げられる。原核生物内で真核生物またはウイルスの配列を有するＤＮＡ配列を発現させる方法は当技術分野で公知である。宿主内で発現および複製する能力を有する、生物学的に機能性のウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターは当技術分野で公知である。本発明のＤＮＡ配列を組み入れるためにこの種のベクターが用いられる。組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に公知であるような慣用の技術により行われる。宿主が大腸菌のような原核生物である場合、ＤＮＡを取リ込む能力があるコンピテント細胞を調製するには、指数増殖期後に細胞を回収し、その後当技術分野で公知の手順を用いるCaCl₂法により処理する。また、MgCl₂ やRbClを使用してもよい。所望により、宿主細胞のプロトプラストを形成した後で形質転換を行うこともできる。宿主が真核生物である場合は、リン酸カルシウム共沈、マイクロインジェクションやエレクトロポレーションなどの通常の機械的方法、リポソーム内に封入したプラスミドの挿入、またはウイルスベクターのようなＤＮＡトランスフェクション法が用いられる。また、真核細胞は本発明のＦＨＦ−３をコードするＤＮＡ配列および選択可能な表現型をコードする第二の外来ＤＮＡ分子（例えば、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子）により同時形質転換することもできる。もう一つの方法は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）やウシ乳頭腫ウイルスのような真核生物ウイルスベクターを用いて真核細胞を一時的に感染または形質転換し、タンパク質を発現させるものである（例えば、Eukaryotic Viral V ectors，Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzman編，1982を参照されたい）。本発明により提供される、微生物において発現されたポリペプチドまたはその断片の単離および精製は、分離用クロマトグラフィー、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いる免疫学的分離を含めて慣用の手段により行うことができる。本発明のＦＨＦ−３ポリペプチドはまた、ＦＨＦ−３ポリペプチドのエピトープと免疫反応するまたは結合する抗体を産生するためにも使用される。エピトープ特異性が異なるモノクローナル抗体のプールから成る抗体、および明確に区別されるモノクローナル抗体調製物が提供される。モノクローナル抗体は当技術分野で公知の方法によりタンパク質の抗原含有断片から作られる（Kohlerら，Natu re，256:495，1975;Current Protocols in Molecular Biology，Ausubelら編，1 989）。本発明で用いる「抗体」という用語は、完全な分子だけでなく、エピトープ決定基と結合する能力があるFab、F(ab')₂、Fvなどのそのフラグメントも含む。これらの抗体フラグメントはその抗原または受容体と選択的に結合する能力をいくらか保持しており、次のように定義される。（１）Fab、抗体分子の一価の抗原結合性フラグメントを含むこのフラグメントは、完全な抗体を酵素パパインで消化して無傷のＬ鎖とＨ鎖の一部を生成することにより得られる。（２）Fab’、抗体分子のこのフラグメントは完全な抗体をペプシンで処理した後に還元して無傷のＬ鎖とＨ鎖の一部を生成することにより得られる。抗体１分子につき２個のFab’フラグメントが得られる。（３）F(ab')₂、この抗体フラグメントは完全な抗体を酵素ペプシンで処理する（後続の還元を行わない）ことにより得られる。F(ab')₂は２つのFab’フラグメントが２つのジスルフィド結合により一緒に結合した二量体である。（４）Fv、２本の鎖として発現されたＬ鎖可変部とＨ鎖可変部を含む遺伝子工学的に作製されたフラグメントとして定義される。（５）単鎖抗体（single chain antibody:ＳＣＡ）、遺伝的に融合された単鎖分子として適当なポリペプチドリンカーにより連結された、Ｌ鎖可変部とＨ鎖可変部を含む遺伝子工学的に作製された分子として定義される。これらのフラグメントの調製方法は当技術分野で公知である（例えば、参考としてここに組み入れられるHarlow and Lane，Antibodies:A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988)を参照されたい）。本発明で用いる「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上の抗原決定基を意味する。エピトープ決定基はアミノ酸や糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面グルーピング(groupings)から成り、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性をもつのが普通である。本発明のＦＨＦ−３ポリペプチドと結合する抗体は、無傷のポリペプチドまたは目的の小型ペプチドを含む断片を免疫用抗原として用いて調製することができる。動物の免疫化に用いられるポリペプチドまたはペプチドは、翻訳されたｃＤＮＡ（例えば実施例４および６参照）から、または所望により担体タンパク質に結合させることができる化学合成により誘導される。ペプチドに化学的に結合される慣用の担体として、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、破傷風毒素などがある。その後、結合したペプチドを用いて動物（例：マウス、ラット、ウサギ）を免疫する。所望により、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、例えば、抗体の誘導に使用したポリペプチドまたはペプチドを結合させたマトリックスに結合させて、そのマトリックスから溶出することにより、さらに精製することができる。当業者であれば、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の精製および／または濃縮に関する、免疫学の分野で公知のさまざまな技法を熟知しているだろう（例えば、参考として組み入れられるColiganら，Unit 9，Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，1994を参照されたい）。抗イディオタイプ技法を用いて、エピトープを模倣するモノクローナル抗体を作製することも可能である。例えば、第一のモノクローナル抗体に対して作製された抗イディオタイプモノクローナル抗体は、第一のモノクローナル抗体が結合するエピトープの「イメージ」である結合ドメインを超可変部にもつだろう。「細胞増殖性疾患」という用語は、しばしば形態も遺伝子型も周囲の組織と違っているような、悪性細胞と非悪性細胞の集団を表す。悪性細胞（すなわち、癌）は複数の過程を経て発生する。アンチセンス分子であるＦＨＦ−３ポリヌクレオチドは種々の器官系の悪性疾患、特に、神経組織を含む中枢神経系、精巣、眼の細胞の悪性疾患を治療するのに有用である。本質的に、ＦＨＦ−３発現の変化と病因的に関連がある疾患はどれも、ＦＨＦ−３抑制剤を用いる治療に感受性であると考えられる。このような疾患の一つが例えば悪性の細胞増殖性疾患である。本発明の目的のため、ＦＨＦ−３に特異的な抗体または核酸プローブを用いて生物学的液体または組織中のＦＨＦ−３ポリペプチド（抗体を使用）またはＦＨＦ−３ポリヌクレオチド（核酸プローブを使用）を検出することができる。本発明は、例えば、抗ＦＨＦ−３抗体または核酸プローブを、ＦＨＦ−３関連疾患が疑われる細胞と接触させ、前記抗体または核酸プローブへの結合を検出することを含んでなる、神経組織または精巣の細胞増殖性疾患の検出方法を提供する。ＦＨＦ−３に反応性の抗体または核酸プローブはＦＨＦ−３への結合の検出を可能にする化合物で標識することが好ましい。検出可能な量の抗原またはポリヌクレオチドを含有するどのような検体を使用してもよい。本発明の好適なサンプルはＣＮＳ、例えば神経組織または脳脊髄液または眼の組織である。前記疾患が疑われる細胞中のＦＨＦ−３のレベルを正常細胞におけるそのレベルと比較して、被験者がＦＨＦ−３関連細胞増殖性疾患をもつかどうか判定することができる。好ましくは被験者はヒトである。細胞成分が核酸である場合、ＦＨＦ−３特異的プローブとの結合に先立って核酸を増幅することが必要になるかもしれない。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することが好ましいが、他の核酸増幅法、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、連結活性化転写（ligated activated transcription:ＬＡＴ）および核酸配列に基づく増幅（nucleic acid sequence-based amplification:ＮＡＳＢＡ）を使用してもよい。本発明の抗体は、in vitroまたはin vivo免疫診断または免疫治療を施すことが望まれるどのような患者にも使用することができる。本発明の抗体は、例えば抗体を液相中でまたは固相担体に結合させて利用するイムノアッセイにおいて使用するのに適している。さらに、これらのイムノアッセイでは抗体をさまざまな方法で検出可能に標識することができる。本発明の抗体を利用しうるイムノアッセイの種類としては、直接または間接フォーマットでの競合および非競合イムノアッセイがある。このようなイムノアッセイの例はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびサンドイッチ（イムノメトリック）アッセイである。本発明の抗体を用いる抗原の検出は、生理学的サンプルに対する免疫組織化学的アッセイを始めとする、フォワード、リバースまたは同時モードで実施されるイムノアッセイを用いて行うことができる。当業者であれば、他のイムノアッセイのフォーマットを熟知しており、また、過度の実験を行わなくとも他のフォーマットを容易に見つけ出すことができよう。本発明の抗体は、多種多様な担体に結合させて、本発明のポリペプチドを含む抗原の存在を検出するために使用される。公知の担体の例として、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改質セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、磁鉄鋼が挙げられる。担体の性質は本発明においては可溶性であっても不溶性であってもよい。当業者であれば、抗体を結合させるのに適した他の担体について熟知しているか、ルーチンな実験操作を用いてそのような担体を確認できるだろう。さまざまな標識および標識化方法が当業者に公知である。本発明において使用できる標識の種類として、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物、リン光化合物、生物発光化合物が挙げられる。当業者は抗体に結合させるのに適した他の標識を熟知しているか、ルーチンな実験操作を用いてそのような標識を確認できるだろう。より高い感度をもたらし得るもう一つの技法は、抗体を低分子量のハプテンにカップリングさせることから成る。その後これらのハプテンは第二の反応手段により特異的に検出される。例えば、アビジンと反応するビオチン、または特異的な抗ハプテン抗体と反応し得るジニトロフェニル、ピリドキサール、フルオレセインのようなハプテンを用いることが一般的である。抗原のin vivo検出のために本発明のモノクローナル抗体を用いるにあたって、検出可能に標識された抗体は診断的に有効な用量で投与される。「診断的に有効」という用語は、検出可能に標識されたモノクローナル抗体の量が、本発明のポリペプチド（これに対してモノクローナル抗体は特異的である）を含む抗原を有する部位の検出を可能とするのに十分な量で投与されることを意味する。検出可能に標識されたモノクローナル抗体の投与濃度は、該ポリペプチドを有する細胞への結合がバックグラウンドに対して検出可能であるように十分なものとすべきである。さらに、最良の標的対バックグラウンドのシグナル比を与えるために、検出可能に標識されたモノクローナル抗体はすみやかに循環系から排出されることが望ましい。一般に、検出可能に標識されたモノクローナル抗体のin vivo診断用の投与量は個体の年齢、性別、疾患の重症度といった要因に応じて変化するだろう。例えば、このような投与量は、注入が複数回行われるのか、抗原の負担量、当業者に公知の他の要因に応じて変化しうる。 in vivo診断映像化の場合は、利用可能な検出装置のタイプが特定のラジオアイソトープを選択する際に主な要因となる。選択されたラジオアイソトープは所定の装置で検出できるタイプの崩壊を示す必要がある。in vivo診断用のラジオアイソトープを選択する上でさらに重要な要因は、宿主に対して有害な放射線を最小限にすることである。理想的には、in vivo映像化に用いるラジオアイソトープは、粒子を発生しないが、通常のγカメラで容易に検出できる140〜250keV の範囲で多数の光子を発生するものである。 in vivo診断のために、ラジオアイソトープを直接、または中間官能基を用いて間接的に、免疫グロブリンに結合させることができる。金属イオンとして存在するラジオアイソトープを免疫グロブリンに結合させるためにしばしば用いられる中間官能基は二官能性キレート剤、例えばジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および類似の分子である。本発明のモノクローナル抗体に結合させることができる金属イオンの代表的な例は¹¹¹ Ｉｎ、⁹⁷Ｒｕ、⁶⁷Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、⁷²Ａｓ、⁸⁹Ｚｒおよび²⁰¹Ｔｌである。本発明のモノクローナル抗体は、磁気共鳴映像化（ＭＲＩ）または電子スピン共鳴（ＥＳＲ）のようなin vivo診断のために常磁性アイソトープで標識することもできる。一般的に、診断用画像を可視化する従来の方法はどれも利用できる。通常、カメラ映像化のためにはγ線および陽電子発生ラジオアイソトープが、そしてＭＲＩのためには常磁性アイソトープが用いられる。こうした技術において特に有用な元素としては¹⁵⁷Ｇｄ、⁵⁵Ｍｎ、¹⁶²Ｄｙ、⁵²Ｃｒおよび⁵⁶Ｆｅが挙げられる。本発明のモノクローナル抗体またはポリヌクレオチドは、被験者のＦＨＦ−３関連疾患の回復過程をモニターするためにin vitroおよびin vivoで使用することができる。こうして、例えば、本発明のポリペプチドを含む抗原を発現する細胞の数の増加または減少を測定するか、または種々の体液中に存在する前記抗原の濃度の変化を測定することにより、ＦＨＦ−３関連疾患を軽減することに目標を定めた特定の治療計画が果して有効であるのか否かを調べることができるだろう。「軽減する」という用語は、治療を受ける被験者においてＦＨＦ−３関連疾患の有害作用が減少することを意昧する。本発明により、正常細胞における発現と比べて変化した方法で発現されるヌクレオチド配列を同定することができ、それゆえ、この配列に向けられた適当な治療法または診断法を設計することが可能である。ＦＨＦ−３の上昇した発現レベルの検出は、ＦＨＦ−３関連増殖性疾患が疑われる細胞から単離した核酸を、本発明のＦＨＦ−３ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることにより達成される。ノーザンブロット分析のような分析を用いてＦＨＦ−３の発現を定量する。その他の標準的な核酸検出法は当業者に公知である。ＦＨＦ−３関連細胞増殖性疾患の治療として、ＦＨＦ−３遺伝子発現およびＦＨＦ−３活性を調節することが含まれる。「調節する」という用語は、ＦＨＦ− ３が過剰発現されるときはＦＨＦ−３の発現を抑制し、ＦＨＦ−３が過小発現されるときはＦＨＦ−３の発現を増強することを意味する。細胞増殖性疾患がＦＨＦ−３の発現と関連がある場合、ＦＨＦ−３の発現を翻訳レベルで妨害する核酸配列が使用される。このアプローチは、例えば、アンチセンス核酸、リボザイムまたはトリプレックス（三重らせん）薬剤を利用するもので、特定のＦＨＦ−３ｍＲＮＡをアンチセンス核酸またはトリプレックス薬剤でマスクするか、またはそれをリボザイムで切断することにより、そのｍＲＮＡの転写または翻訳をブロックする。この種の疾患としては例えば神経変性疾患がある。アンチセンス核酸は特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ分子である（Weintraub，Scientific American，262:40，1990）。細胞において、アンチセンス核酸は対応するｍＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。この細胞は二本鎖であるｍＲＮＡを翻訳しないであろうから、アンチセンス核酸はｍＲＮＡの翻訳を妨害することとなる。約15ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好適である。なぜならば、それらを容易に合成することができ、しかも標的ＦＨＦ−３産生細胞に導入するとき、より大きな分子よりも問題を引き起こす可能性が少ないからである。遺伝子のin vitro翻訳を阻害するアンチセンス法の使用は当技術分野で公知である（Marcus-Sakura，Anal．Bio chem.，172:289，1988）。転写を停止させるためのオリゴヌクレオチドの使用は、そのオリゴマーが二本鎖ＤＮＡの回りに巻きついて三重らせんを形成することから、トリプレックス戦略として知られている。したがって、これらのトリプレックス化合物は所定の遺伝子のユニークな部位を認識するように設計される(Maherら，Antisence Res．a nd Dev.，1(3):227，1991;Helene，C.，Anticancer Drug Design，6(6):569，19 91)。リボザイムはＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと類似した方法で他の一本鎖ＲＮＡを特異的に切断する能力があるＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の修飾により、ＲＮＡ分子の特定のヌクレオチド配列を認識して切断する分子を作製することが可能である(Cech，J．Amer．Med．Assn.，26 0:3030，1988)。このアプローチの主な利点は、それらが配列特異的であるので特定の配列をもつｍＲＮＡのみが不活性化されるという点である。リボザイムの基本的なタイプには２種類あり、すなわちテトラヒメナ型(Hasse lhoff，Nature，334:585，1988)と「ハンマーヘッド」型である。テトラヒメナ型リボザイムは長さが４塩基である配列を認識し、一方「ハンマーヘッド」型リボザイムは長さが11〜18塩基の配列を認識する。認識配列が長くなればなるほど、その配列が標的ｍＲＮＡ種中に独占的に存在する可能性が高くなる。その結果、特定のｍＲＮＡ種を不活性化するにはハンマーヘッド型リボザイムの方がテトラヒメナ型リボザイムよりも好ましく、18塩基の認識配列の方がより短い認識配列よりも好ましい。本発明はまた、ＦＨＦ−３タンパク質により媒介される細胞増殖性疾患または免疫疾患を治療するための遺伝子治療を提供する。このような治療は、増殖性疾患にかかっている細胞にＦＨＦ−３アンチセンスポリヌクレオチドを導入することによりその治療効果を奏するだろう。アンチセンスＦＨＦ−３ポリヌクレオチドの送達は、キメラウイルスのような組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を用いて達成される。アンチセンス配列の治療的送達には標的化リポソームの使用が特に適している。本明細書において教示されるような遺伝子治療に利用できる種々のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または好ましくは、レトロウイルスのようなＲＮＡウイルスがある。好ましくは、レトロウイルスベクターはマウスまたはトリのレトロウイルスの誘導体である。単一の外来遺伝子を挿入し得るレトロウイルスベクターの例は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）であるが、これらに限らない。患者がヒトであるときは、テナガザル(gibbon ape)白血病ウイルス（ＧａＬＶ）のようなベクターを利用することが好ましい。多数の追加のレトロウイルスベクターは複数の遺伝子を組み入れることができる。これらのベクターはどれも、形質導入された細胞を同定して増やせるように、選択マーカーの遺伝子を組み入れることができる。目的のＦＨＦ−３配列を、特定の標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードする別の遺伝子とともにウイルスベクターに挿入することにより、このベクターはまさに標的特異性となる。例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を結合させることで、レトロウイルスベクターを標的特異性とすることができる。好適な標的化（ターゲッティング）は抗体を用いてレトロウイルスベクターを標的特異性とすることにより達成される。当業者であれば、ＦＨＦ−３アンチセンスポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベクターの標的特異性送達を可能にするようにレトロウイルスゲノムに挿入し得るまたはウイルスエンベロープに結合し得る特定のポリヌクレオチド配列を熟知しているか、または過度の実験操作を行うことなく容易に確認できるだろう。組換えレトロウイルスは欠損ウイルスであるので、感染性のベクター粒子を産生するには介助が必要である。この介助は例えばＬＴＲ内の調節配列の制御下にレトロウイルスの全構造遺伝子をコードするプラスミドを含むヘルパー細胞系を用いることにより提供される。これらのプラスミドはパッケージング機構に包膜用のＲＮＡ転写物を認識できるようにするヌクレオチド配列を欠失している。パッケージングシグナルを欠失しているヘルパー細胞系としては、例えばΨ２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２があるが、これらに限らない。これらの細胞系はゲノムがパッケージされないので中空ビリオンを産生する。レトロウイルスベクター（パッケージングシグナルが無傷であるが、構造遺伝子が目的の他の遺伝子で置き換えられている細胞）をこのような細胞に導入すると、そのベクターはパッケージされて、ベクタービリオンを産生する。あるいは、NIH 3T3または他の組織培養細胞を、慣用のリン酸カルシウムトランスフェクションによりレトロウイルス構造遺伝子gag、polおよびenvをコードするプラスミドで直接トランスフェクトすることもできる。次に、これらの細胞を目的の遺伝子を含有するプラスミドでトランスフェクトする。得られた細胞は培地中にレトロウイルスベクターを放出する。ＦＨＦ−３アンチセンスポリヌクレオチドの別の標的送達系はコロイド分散系である。コロイド分散系として、巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビーズ、水中油型エマルジョンを含む脂質ベースの系、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを挙げることができる。本発明の好適なコロイド分散系はリポソームである。リポソームはin vitroおよびin vivoでの送達用ビヒクルとして有用な人工膜小胞である。サイズが0.2〜4.0μｍである大型の単ラメラ小胞（ＬＵＶ）は大きな巨大分子を含有する水性バッファーを十分な割合でカプセル化することができる。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび無傷のビリオンを水性の内部にカプセル化して、生物学的に活性な形で細胞に送達することができる（Fraleyら，Trends Biochem ．Sci.，6:77，1981）。哺乳動物細胞に加えて、植物、酵母および細菌細胞内にポリヌクレオチドを送達するためにもリポソームが使用されている。リポソームが効率的な遺伝子移入ビヒクルであるためには、次の特性が存在する必要がある。すなわち、（１）目的の遺伝子を高効率的にカプセル化するが、その生物学的活性を損なわない；（２）非標的細胞と比べて標的細胞に優先的にかつ強固に結合する；（３）小胞の水性内容物を標的細胞の細胞質に高効率的に送達する；および（４）遺伝情報を正確かつ効率よく発現させる、ことである（Mann inoら，Biotechniques，6:682,1988）。リポソームの組成は、通常ステロイド（特にコレステロール）と組み合わせた、リン脂質（特に相転移温度が高いリン脂質）類の混合物である。他のリン脂質や他の脂質を使用してもよい。リポソームの物理的特性はｐＨ、イオン強度および二価のカチオンの存在に影響を受ける。リポソームの調製に有用な脂質の例として、ホスファチジル化合物、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドが挙げられる。特に有用なものはジアシルホスファチジルグリセロールであり、脂質成分が14〜18個の炭素原子、特に16〜18個の炭素原子を含み、飽和であるものである。リン脂質の例には卵のホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。リポソームの標的化（ターゲッティング）は解剖的および機械的要因に基づいて分類することができる。解剖的分類は選択性のレベル、例えば器官特異性、細胞特異性およびオルガネラ（細胞小器官）特異性のレベルに基づいている。機械的ターゲッティングはそれが受動的であるか能動的であるかに基づいて区別することができる。受動的ターゲッティングはリポソームが洞様毛細血管を含む器官の細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞に分布しやすいという傾向を利用するものである。一方、能動的ターゲッティングはリポソームを特定のリガンド（例えば、モノクローナル抗体、糖、糖脂質またはタンパク質）に結合させることによるか、または天然に存在する局在部位以外の器官または細胞型へのターゲッティングを達成するためにリポソームの組成またはサイズを変えることによる、リポソームの変更を含むものである。標的送達系の表面をさまざまな方法で修飾してもよい。リポソーム標的送達系の場合には、ターゲッティング用のリガンドをリポソームニ重層との安定した結合状態に維持するために、リポソームの脂質二重層に脂質基を組み込むことができる。脂質鎖をターゲッティング用のリガンドに結合させるために種々の連結基を用いることができる。ＦＨＦ−３が精巣、眼および脳、または神経組織において発現されるため、これらの組織に関係した、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体を用いるさまざまな用途が存在する。そのような用途として、これらの組織と他の組織に係わる細胞増殖性疾患および免疫疾患の治療がある。加えて、ＦＨＦ−３は各種の遺伝子治療法にも有用でありうる。ＦＨＦ−３は精巣で高レベルに発現されるため、この組織に関連する本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体を使用する用途は広範囲にわたる。このような用途には、精巣でのＦＨＦ−３発現と関連がある細胞増殖性疾患の治療が含まれる。各種の精巣発育異常または後天性疾患にＦＨＦ−３を適用することが可能である。これらの疾患には、ウイルス感染症（例えば、ウイルス性精巣炎）、自己免疫疾患、精子産生または機能不全、外傷、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限らない。精巣における高レベルのＦＨＦ−３の存在は、ＦＨＦ−３またはＦＨＦ−３の類似体を使用して男性の生殖能力を増加または低下させ得ることを示唆する。ＦＧＦファミリーの新規メンバーの同定はＦＨＦ−３媒介疾患の診断、予後および治療戦略のための有用なツールを提供する。抗ＦＨＦ−３抗体を用いてＦＨＦ−３レベルを測定することは、癌、卒中、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病）、網膜疾患（例えば、色素性網膜炎）またはウイルス脳炎を含めて、神経系の疾患の進行または回復をモニターするのに有用である。中枢神経系における高レベルのＦＨＦ−３の存在は、多くの末梢組織で観察された低レベルのＦＨＦ−３が末梢神経におけるＦＨＦ−３および後根神経節や３叉神経節における感覚ニューロンでの存在を反映するため、抗ＦＨＦ−３抗体を用いるＦＨＦ−３レベルの測定が末梢神経疾患の診断に役立つことを示唆する。精巣における高レベルのＦＨＦ−３の存在は、抗ＦＨＦ−３抗体を用いるＦＨＦ− ３レベルの測定が精巣癌の診断に有用であることを示唆する。ＦＧＦファミリーの他のメンバーと同様に、ＦＨＦ−３は分裂促進活性および／または細胞生存活性をもつようであり、それゆえ、ＦＨＦ−３またはＦＨＦ− ３作用を模倣する類似体を用いて組織の修復または置換を促進することができるだろう。ＣＮＳにおけるＦＨＦ−３の存在は、卒中、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病）を含めた神経系の疾患、網膜変性疾患（例えば、色素性網膜炎または黄斑変性）または末梢神経疾患におけるこのような治療的役割を示唆する。反対に、抗ＦＨＦ−３抗体またはＦＨＦ−３アンタゴニストを用いてＦＨＦ−３の作用をブロックすることは、過度の細胞増殖が病因となる疾患（最も明白には癌）を遅延させたり軽減させたりするかもしれない。以下の実施例は本発明を例示するためのもので、本発明を制限するものではない。それらは使用可能な手順の代表であり、当業者に公知の他の手順を代わりに使用することができる。実施例１ＦＧＦファミリーの新しいメンバーであるＦＨＦ−３の同定ヒト網膜で発現する新規な遺伝子産物を同定するために、ヒト網膜ｃＤＮＡクローンのランダムなセグメントを部分的に配列決定し、得られた部分配列を公のデータベースで利用できる配列と比較した。詳細には、ラムダgt10で構築した成人網膜ｃＤＮＡライブラリー(Nathansら， Science，232:193，1986)を増幅し、EcoRIでの開裂によりｃＤＮＡインサートを大量に切除し、アガロースゲル電気泳動によって精製してベクターを除いた。こうして精製したｃＤＮＡインサートを熱変性した後、５’端にEcoRI部位をもち３’端に６つのランダムなヌクレオチドを含有する合成オリゴヌクレオチド（5' GACGAGATATTAGAATTCTACTCGNNNNNN）（配列番号３）をプライマーとして用いて大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのKlenow断片の存在下で連続して二回ＤＮＡ合成を行なった。得られた二重鎖分子の増幅を、独特な５’フランキング配列に対応するプライマー（5'CCCCCCCCCGACGAGATATTAGAATTCTACTCG）（配列番号４）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して行なった。元のｃＤＮＡインサートのランダムなサンプル採取に相当するこれらのＰＣＲ産物をEcoRIで開裂し、分取用アガロースゲル電気泳動によりサイズ分画して長さが約５００ｂｐのセグメントのみとし、ラムダgt10にクローン化した。この誘導体ライブラリーに由来する 3000個の単一プラークを96ウェルのトレーに並べ、これらのクローンから、フランキングベクタープライマーを用いたＰＣＲによりインサートを増幅した後、ジデオキシ法と自動化蛍光検出(Applied Biosystems)を用いて配列決定した。各インサートの一端から一回配列決定したものを３つの読取り枠（リーディングフレーム）すべてにおいて両方の鎖上で概念的に翻訳し、得られた６つのアミノ酸配列を使用して、BLASTX検査アルゴリズムを用いた重複のないGenBankタンパク質データベースで相同性を検査した。すでに記載されているＦＧＦファミリーのメンバーに対して統計的に有意な相同性を示す部分ｃＤＮＡ配列がひとつ見つかった。この部分ｃＤＮＡをプローブとして使用して、読取り枠（オープンリーディングフレーム）全体を含むもの２つを含めて多数の独立したｃＤＮＡクローンをヒト網膜ｃＤＮＡライブラリーから単離し、この２つにつき、完全なヌクレオチド配列を決定した。この配列はＦＧＦスーパーファミリーの新規かつ高度に分岐したメンバーをコードしており、繊維芽細胞増殖因子相同因子−１（ＦＨＦ−１）と命名されている。続いて、２番目の密接に関連する配列（ＦＨＦ−２）がそのＦＨＦ−１配列に対する類似性に基づいて特性決定された（配列番号６〜９、図７ａおよび７ｂ）。ＦＨＦ−１およびＦＨＦ−２アミノ酸配列を使用して、統計的に有意な類似性を有するアミノ酸配列について概念的に翻訳したＤＮＡ配列（ＤＢＥＳＴ）の公的利用可能なGenbankデータベースをスクリーニングした。ヒトゲノムＤＮＡの短い領域（ＤＢＥＳＴ受け入れ番号76387）が、ＦＨＦ−１およびＦＨＦ−２アミノ酸配列の約25％に対して有意な相同性を有する翻訳配列を有することを見出した。このゲノムセグメントは、17番染色体上の乳癌感受性遺伝子の検索の際にランドマークとして使用された多くのゲノムセグメントのうちの一つであった。配列76387に基づく合成ＤＮＡプライマーを使用して、ヒトゲノムＤＮＡおよびヒト網膜由来のｃＤＮＡからこの領域部分を増幅した。次いでこれらのＰＣＲ産物をプローブとして使用し、前記ヒト網膜ｃＤＮＡライブラリーから全長ｃＤＮＡクローンを単離した。実施例２ＦＨＦ−３の推定一次構造２つの独立したヒト網膜ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列から推定されたヒトＦＨＦ−３の配列を図１に示す。ヒトＦＨＦ−３の一次翻訳産物は長さが２ 25個のアミノ酸であると予想される。図１の位置74に示したヒトＦＨＦ−３開始メチオニンコドンは、読取り枠が合った最初のATGコドンである。この位置に良好なコンセンサスリボソーム結合部位(GCGCTATGG（配列番号５）;Kozak，Nuclei c Acids Res.，15:8125，1987)が見られる。読取り枠内にある次のメチオニンコドンは推定開始メチオニンコドンの124コドン３’側に見られる。ａＦＧＦとｂＦＧＦに対して観察されているように、ＦＨＦ−３の一次翻訳産物のアミノ末端は、シグナルペプチドの小胞体膜を横切る同時翻訳挿入を指令するためのコンセンサス配列と一致しない。ＦＨＦ−３配列は、アスパラギン結合グリコシル化のための潜在的なasn-X-ser/thr部位を欠く。ＦＨＦ−３をＦＧＦファミリーの公知の他のメンバーと並べて図２に示し、また、アミノ酸の類似度を示す樹状図を図３に示す。最も相同性の高いＦＧＦファミリーのメンバーは、８個のギャップをもって並べたときにＦＨＦ−３と30％のアミノ酸が同一であるＦＧＦ−９である。各々のポリペプチドの中央領域で、ＦＨＦ−３も含めたすべてのＦＧＦファミリーのメンバーが約50％のアミノ酸同一性を共有していることに注目されたい。実施例３ＦＨＦ−３の染色体位置決定各々が異なるヒト染色体(Oncor，Gaithersburg，MD)を含有している24のヒト ‐マウスおよびヒト‐ハムスター細胞系のパネルから誘導され制限酵素で消化したＤＮＡを含有するサザンブロットを探査することによってＦＨＦ−３の染色体位置を決定した。図４に示されているように、ヒトＦＨＦ−３プローブとヒト、マウスおよびハムスターのゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって異なるサイズのハイダリダイズ断片が生成する。ハイブリッドパネルのうち、ヒト特異的ハイブリダイゼーションパターンはヒト17番染色体を担持するハイブリッド細胞系に相当するレーンのみに見られる。実施例４ＦＨＦ−３ｍＲＮＡの組織分布ＦＨＦ−３のｍＲＮＡの組織分布を決定するために、マウスの脳、眼、心臓、腎臓、肝臓、肺、脾臓および精巣に由来する全ＲＮＡならびに酵母ｔＲＮＡ陰性対照に対してＲＮアーゼプロテクション解析を実施した。使用したプローブは、全長ヒトＦＨＦ−３ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションによってマウス眼ｃＤＮＡライブラリーから単離したマウスＦＨＦ−３遺伝子のセグメントから誘導したものである。図５に示されているように、ＦＨＦ−３の発現は脳および眼で最も高レベルである。肺および精巣では、オートラジオグラムをさらに長く露出させて検出されたＦＨＦ−３の発現レベルは低かった。実施例５図６は、一時的にトランスフェクトしたヒト胚腎細胞（細胞系293）にて産生されたＦＨＦ−３の免疫ブロットを示す。完全ＦＨＦ−３タンパク質にカルボキシ末端で結合したバクテリオファージT7由来の遺伝子10タンパク質を含む融合タンパク質に対して抗ＦＨＦ−３抗体を誘導させた（Studier and Moffatt，J．Mo lec．Biol．189:113，1986）。得られた融合タンパク質を分取用ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて精製し、ウサギに注射した。ＦＨＦ−３をヒト細胞で発現させるために、完全な読取り枠（オープンリーディングフレーム）を真核細胞用発現ベクターpCISへ挿入した（Gormanら，DNA Protein Eng．Tech.，2:3，1990 ）。翻訳の効率を向上させるために、開始メチオニンコドンのすぐ5'側の領域を、所望の配列を担持したプライマーを用いるＰＣＲ増幅によって適切なリボソーム結合部位（CCACCATGG）へ変換した。この発現構築物およびシミアンウイルス4 0（SV40）ラージＴ抗原を発現するプラスミド（pRSV-TAg;Gormanら，DNA Protei n Eng．Tech.，2:3，1990）でヒト胚腎細胞を一時トランスフェクトした24時間後に、細胞を回収し、タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、1: 5000の希釈率のウサギ抗ＦＨＦ−３抗血清を用いて免疫ブロットした。図６に示すように、ＦＨＦ−３でトランスフェクトした細胞（右レーン）は、見掛けの分子量が30kDの免疫反応性ポリペプチドを合成する。この免疫反応性ポリペプチドは、関連のＦＧＦファミリーメンバー（ＦＨＦ−２）でトランスフェクトした細胞（中央レーン）または偽トランスフェクトした細胞（左レーン）では見られないものである。前もって染色したタンパク質サイズ標品の見掛けの分子量(kD)を左側に示す。組換えＦＨＦ−３の見掛けの分子量は一次翻訳産物の推定分子量（25kD）よりも５kD多く、この不一致はおそらくこのタンパク質の等電点（10.275）が高いことを反映している。現状で好ましい態様に関して本発明を説明してきたが、本発明の範囲から逸脱することなくさまざまな修正をすることができるものと理解されたい。したがって、本発明は請求の範囲によってのみ制限されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 35/76 48/00 48/00 49/00 49/00 Ａ 51/00 Ｃ０７Ｋ 14/50 Ｃ０７Ｋ 14/50 16/22 16/22 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 15/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｂ 21/08 15/00 ＣＡ６１Ｋ 49/02 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者スモールウッド，フィリップ，エム. アメリカ合衆国 21797―9621 メリーランド州，ウッドバイン，ウッドバインロード 5022 (72)発明者トング，パトリックアメリカ合衆国 21210―1522 メリーランド州，ボルティモア，ハムレットヒルロード 111，1209番

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的に純粋な繊維芽細胞増殖因子相同因子−３（ＦＨＦ−３）ポリペプチド。２．ａ．還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したときの分子量が約30kDであり、ｂ．17番染色体上に染色体位置を有するポリヌクレオチドによってコードされることを特徴とする請求項１記載のポリペプチド。３．配列番号２（図１）に示したアミノ酸配列を有する請求項２記載のポリペプチド。４．請求項１記載のＦＨＦ−３ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド配列。５．ＦＨＦ−３ヌクレオチド配列が、ａ．配列番号１（図１）（ここでＴはＵでもよい）；ｂ．配列番号１に相補的な核酸配列；ｃ．鎖長が少なくとも１５塩基であり、かつ中程度のストリンジェント条件下で配列番号２（図１）のＦＨＦ−３タンパク質をコードするＤＮＡに選択的にハイブリダイズする、ａまたはｂの断片；よりなる群から選択される、請求項４記載のポリヌクレオチド。６．前記ポリヌクレオチドが哺乳動物細胞から単離されたものである、請求項４記載のポリヌクレオチド配列。７．哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項６記載のポリヌクレオチド。８．請求項４記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。９．前記ベクターがプラスミドである、請求項８記載のベクター。 10．前記ベクターがウイルスである、請求項８記載のベクター。 11．請求項８記載のベクターで安定に形質転換された宿主細胞。 12．前記細胞が原核細胞である、請求項11記載の宿主細胞。 13．前記細胞が真核細胞である、請求項11記載の宿主細胞。 14．ＦＨＦ−３ポリペプチドと結合する抗体またはその免疫反応性フラグメント。 15．前記抗体がポリクローナルである、請求項14記載の抗休。 16．前記抗体がモノクローナルである、請求項14に記載の抗体。 17．ＦＨＦ−３関連細胞増殖性疾患が疑われる被験者の検体を、ＦＨＦ−３と結合する薬剤と接触させ、この薬剤のＦＨＦ−３への結合を検出することを含んでなる、細胞増殖性疾患の検出方法。 18．前記細胞が脳、精巣、肺または眼の細胞よりなる群から選択される、請求項 17記載の方法。 19．前記薬剤がＦＨＦ−３と結合する抗体である、請求項17記載の方法。 20．前記薬剤がＦＨＦ−３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその断片である、請求項17記載の方法。 21．前記検出をin vivoで行う、請求項17記載の方法。 22．前記検出をin vitroで行う、請求項17記載の方法。 23．前記薬剤が検出可能に標識されている、請求項19または20記載の方法。 24．検出可能な標識が放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物および化学発光化合物よりなる群から選択される、請求項23記載の方法。 25．ＦＨＦ−３の発現と関連した細胞増殖性疾患を有するかまたは該疾患が疑われる細胞を、ＦＨＦ−３活性を抑制する薬剤と接触させることを含んでなる、ＦＨＦ−３関連細胞増殖性疾患の治療方法。 26．前記薬剤が抗ＦＨＦ−３抗体である、請求項25記載の方法。 27．前記薬剤がＦＨＦ−３アンチセンス配列である、請求項25記載の方法。 28．前記細胞が精巣、脳、肺、または眼の細胞である、請求項25記載の方法。 29．ＦＨＦ−３活性を抑制する薬剤がベクターを使って細胞に導入される、請求項25記載の方法。 30．前記ベクターがコロイド分散系である、請求項29記載の方法。 31．前記ベクターがウイルスである、請求項29記載の方法。 32．前記ＲＮＡウイルスがレトロウイルスである請求項31記載の方法。