JP2000508361A - 多孔性架橋多糖ゲルの製造方法並びにゲル濾過媒質としておよびクロマトグラフィーにおけるその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 多孔性架橋多糖ゲルの製造方法並びにａ）多糖類の溶液または分散液を製造し、ｂ）１活性部位および１不活性部位を有する２官能性架橋剤を段階ａ）からの溶液または分散液に加え、ｃ）多糖類のヒドロキシル基を架橋剤の活性部位と反応させ、ｄ）多糖ゲルを形成させ、ｅ）架橋剤の不活性部位を活性化し、ｆ）段階ｅ）からの活性化部位を多糖ゲルのヒドロキシル基と反応させることにより、ゲルの架橋が行われるという段階により得られるゲル。得られた架橋多糖ゲルは慣用的方法によりさらに１回または数回架橋され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 多孔性架橋多糖ゲルの製造方法並びにゲル濾過媒質として およびクロマトグラフィーにおけるその用途 この発明は、品質が改善された架橋多糖ゲルの製造方法およびその方法により 得られるゲルおよびその用途に関するものである。より正確には、この発明は、 新規架橋方法であって、エマルジョンおよびゲル形成前に２官能性架橋剤を多糖 溶液中に導入する方法に関するものである。 クロマトグラフィー方法は、分子、例えばタンパク質、核酸、多糖類などの分 離および精製に常用される。無機材料並びに合成ポリマーおよび多糖類など広範 な種類の分離媒質が使用可能である。 多糖類のゲルマトリックスは、品質が良いため長年の間分離媒質として使用さ れており、上記マトリックスは現在では生化学研究室における標準備品である。 多糖類は広い範囲の条件下で生体分子に対し不活性である。多糖類は天然物質で あり、多くの適用分野に関して当局（例えばアメリカ合衆国では食品医薬品局（ ＦＤＡ））により認可されている。クロマトグラフィー分離方法を用いる場合、 分離生成物中に分離媒質の痕跡が残存し得る。多糖類が分離媒質として使用され る場合、この物質は毒性がないので無害である。 一般に、クロマトグラフィー分離は、粒子ビーズ形態の分離マトリックスによ りパッキングされたカラムで行われる。急速な流速で反応速度が速い分離媒質は 、生産性を高めるもので、粒子サイズの低減化により達成され得る。しかしなが ら、ビーズが小さいと、パッキングベッドにおける粒子間の対流的フローチャン ネルが狭まるため背圧が高くなる。高分子を分離させ得るためには、粒子は大き な孔をもつべきであるが、孔が大きいと、粒子構造は弱くなり得る。多糖類は軟 物質であるため、粒子は特に高い流速では容易に崩壊し得る。すなわち、より安 定した多糖粒子の製造方法が要望されている。ポリマーを架橋することにより、 多糖粒子の安定性が高められることはよく知られている。架橋プロセスでは、ポ リマー鎖をそれぞれの遊離ヒドロキシル基のところで互いに化学結合させること により多糖ゲルマトリックスが安定化される。架橋は、ヒドロキシルおよびクロ スリンカーの官能基間で行われる。これは粒子剛性に影響を及ぼすが、孔のサイ ズに はそれほどまたは全く影響しない。異なる架橋方法を開示している特許および文 献も幾つかある。公知架橋剤は、エピクロロヒドリン、ビス−エポキシド類、ジ ビニルスルホンである。 ＥＰ２０３０４９では、使用される架橋剤が単官能性であるが、後で活性化さ れ得る追加の遮蔽官能基も含んでいると、多糖類の剛性はかなり改善されると報 告されていた。架橋は２段階で為された。まず多糖を単官能基により誘導体化し た。そして次の段階で、遮蔽基を活性化し、多糖類のヒドロキシル基と反応させ た。こうして架橋の長さが制御され、所望の剛性が得られた。 当業界の現行方法に共通した特徴は、架橋がゲル粒子形成後の多糖ポリマーで 行われることである。すなわち、架橋は、既製構造で為される。例えばアガロー スの粒子は、加熱して水にアガロースを溶かすことにより製造される。次いで、 温水溶液を乳化すると、有機溶媒、例えばトルエン中に球形粒子が形成される。 冷却後粒子が沈澱する。次いで粒子を架橋する。アガロース溶液の濃度を変える ことにより、様々な孔サイズが得られる。アガロース溶液の濃度が低いと、大き な孔が得られる。 この発明の目的は、改善された架橋多糖ゲル製造方法を得ることであった。 この発明のさらに別の目的は、高い流速／背圧に耐える吸収力が改善されてい るが、分離特質は保持している剛性多糖ゲル粒子を製造することであった。 この発明の目的は、請求の範囲に記載された製法および多糖ゲルにより達成さ れる。この発明によると、多孔性架橋多糖ゲルの製造方法であって、次の段階： ａ）多糖類の溶液または分散液を製造し、 ｂ）段階ａ）で得られた溶液または分散液に１活性部位および１不活性部位を 有する２官能性架橋剤を加え、 ｃ）多糖類のヒドロキシル基を架橋剤の活性部位と反応させ、 ｄ）多糖ゲルを形成させ、 ｅ）架橋剤の不活性部位を活性化し、 ｆ）段階ｅ）の活性化部位を多糖ゲルのヒドロキシル基と反応させることによ り、ゲルの架橋が行われる ことを特徴とする方法が得られる。 この発明のさらに別の態様によると、多孔性架橋多糖ゲルは、次の段階： ａ）多糖類の溶液または分散液を製造し、 ｂ）段階ａ）で得られた溶液または分散液に１活性部位および１不活性部位を 有する２官能性架橋剤を加え、 ｃ）多糖類のヒドロキシル基を架橋剤の活性部位と反応させ、 ｄ）多糖ゲルを形成させ、 ｅ）架橋剤の不活性部位を活性化し、 ｆ）段階ｅ）の活性化部位を多糖ゲルのヒドロキシル基と反応させることによ り、ゲルの架橋が行われる ことにより得られる。 この発明によると、驚くべきことに、既知ゲルと比べて、３００％を越える割 合で大きな圧力／フロー吸収力をもつゲルが得られることが見いだされた。粒子 直径も小さい（約１０μｍ）高度剛性ゲル粒子を製造することが可能であった。 この発明の新規方法によると、ゲル形成前に架橋剤を多糖溶液または分散液に 導入する。架橋剤は、１活性部位および１不活性部位をもつ２官能性剤である。 多糖溶液または分散液に加えられると、薬剤の活性部位と多糖類のヒドロキシル 基との反応が行われる。それにより架橋剤がポリマー鎖に化学結合した後、ゲル 形成プロセスが開始される。こうして内部架橋剤は多糖類に導入される。 このプロセスの第１段階では、多糖類の溶液または分散液が形成される。多糖 類と一緒に常用される溶媒または分散剤として、例えばアセトン、アセトニトリ ル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ピリジン、ｓ−およびｔ− アルコール類、例えばイソプロパノールなどが使用され得る。しかしながら、こ の発明の好ましい態様によると、多糖類の水溶液が使用される。 架橋剤導入後、ゲルが多糖から形成される。溶媒として水を使用しなかった場 合、溶媒または分散剤を捨て、多糖を水に溶かす。水溶液を有機溶媒、例えばト ルエンまたはヘプタン中で乳化することにより、ゲルが形成される。次いで、架 橋剤の不活性部位を活性化し、多糖類のヒドロキシル基と反応させることにより 、ゲルが架橋される。 架橋ゲルは、当業界の現段階までに知られている慣用的方法によりさらに架橋 され得る。このさらなる架橋は、どの程度の剛性の粒子が要求されるかにより１ 度または数回行われ得る。この慣用的架橋はまた、段階ｅ）およびｆ）における 架橋剤の不活性部位の活性化および反応の前またはそれと同時に段階ｄ）のゲル で行われ得る。この発明のさらに別の態様では、段階ｂ）およびｃ）を段階ｄ） またはｅ）の後に１度または数回反復することにより、段階ｅ）およびｆ）また は段階ｆ）を行う前にさらに架橋剤を加えることができる。 この発明に従い使用される２官能性架橋剤は、１活性部位および１不活性部位 を含む。活性部位とは、多糖類のヒドロキシル基と反応し得る基を全て包含する 。上記基の例は、ハライド、エポキシド、メチロール基である。不活性部位とは 、反応性部位に関する反応条件下では反応しないが後に活性化されて多糖類のヒ ドロキシル基と反応し得る基である。二重結合を含む基、例えばアリル、ビニル 、アクリル基が適当である。活性および不活性部位を結合する基は不可欠という わけではないが、当然結合活性を欠き、長すぎないものであるべきである。好ま しい架橋剤は、アリルグリシジルエーテルおよびアリルハライド、好ましくはア リルブロミドであるが、例えばＮ−メチロールアクリルアミド、ビニルベンジル クロリド、シナモイルクロリドを使用することも可能である。ヒドロキシル基お よび活性部位および活性化不活性部位間の反応、並びにこの部位の活性化は、そ れ自体公知の化学反応である。 ２官能性架橋剤との反応は、次の反応式をもつアガロース（ＡＧ）に関して説 明され得る。 アリルグリシジルエーテルの活性部位との反応： 不活性部位の活性化および反応： 慣用的方法によるさらなる架橋は、公知架橋剤のいずれかにより達成され得る 。適当な化合物は、エピハロヒドリン、ビス−エポキシド、ジビニルスルホン、 アリルグリシジルエーテルおよびジブロモプロパン−１−オールの群から選ばれ る１種または数種の物質である。すなわち、慣用的架橋は、内部第一架橋段階の 場合と同じクロスリンカーまたは別のクロスリンカーまたはクロスリンカーの混 合物により行われ得る。 この発明による方法は、あらゆるタイプの多糖類、例えばアガロース、アガロ ース誘導体、澱粉誘導体、デキストランまたはその誘導体、アルギナート、カラ ゲーニンにおいて使用され得る。しかしながら、アガロースが好ましい物質であ る。 この発明によるゲルマトリックスは、好ましくは粒子として製造される。ゲル の製造はよく知られた方法により行われる。アガロースは例えば、アガロースに 関するゲル点より高温に溶液を加熱することにより水に溶解する。架橋剤を温水 アガロース溶液に加え、薬剤の活性部位をアガロースのヒドロキシル基と反応さ せる。 次いで、アガロース溶液を有機溶媒、例えばトルエン中で乳化する。冷却によ りゲル粒子が沈澱する。その後、架橋剤の不活性部位を活性化し、アガロース粒 子のヒドロキシル基と反応させることにより、ゲルが架橋される。 粒子のサイズは、アガロース溶液を乳化するときの撹拌速度により決まる。要 求される最終粒子サイズは、ふるいにより達成される。孔サイズは、例えば多糖 濃度を変えることにより調節される。この発明による方法を用いることにより、 慣用的直径および孔サイズをもつ多糖粒子を製造することができる。アガロース 粒子を製造する場合、濃度は好適には０.５−２０重量％、好ましくは１−１２ 重量％である。粒子直径は、１ｍｍ−１μｍ、好ましくは５００μｍ−１μｍ、 最も好ましくは２００μｍ−１μｍである。 この発明によると、高度剛性多糖粒子を製造することが可能である。多糖濃度 も上述した孔サイズに対してだけでなく剛性にとっても重要であるにせよ、剛性 に影響する主要パラメーターは、加えられるクロスリンカーの量である。剛性粒 子を得るため、クロスリンカー濃度は、ゲル１ｇに対し好ましくは３０−８０マ イクロモル、最も好ましくは４５−６０マイクロモルの範囲内とすべきである。 ３０マイクロモル／ｇより濃度が低いと、ゲルの圧力／フロー吸収力が比較的低 いものとなる傾向がある。８０マイクロモル／ｇより濃度が高いと、収縮し過ぎ て許容し得ないゲルになり得る。 この発明による多孔性架橋多糖ゲルは、分子をそれらのサイズの差異によって 分離するゲル濾過媒質として使用され得る。それらはまた修飾後、様々なタイプ のアフィニティー・クロマトグラフィーにおいても使用され得る。ゲルは、自体 公知の方法で多くの異なる基により置換され得る。それらの基の中では、次のも のが挙げられる： １．正に荷電した基（第１級、第２級、第３級または第４級アミノ基） ２．負に荷電した基（例、カルボキシ、ホスホン酸、スルホン酸など） ３．両性基 ４．特異的親和力をもつ基（例、ＩｇＧ−結合タンパク質（プロテインＡ、Ｇ 、Ｌなど）およびＩｇＧ、レクチンおよび炭水化物、抗原／ハプテンおよび抗体 、（ストレプト）アビジンおよびビオチン間における場合）、 ５．相補的核酸／オリゴヌクレオチド、 ６．パイ電子系をもつ基 ７．キレート基 ８．疎水性基。 これらの基を伴うと、マトリックスは、アフィニティー・クロマトグラフィー 、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相ク ロマトグラフィー、共有結合クロマトグラフィーなどで使用され得る。 以下、実施例によりこの発明について説明するが、それらはこの発明の限定を 意図するものではない。部およびパーセントは、特に明記していなければ重量部 および重量パーセントを意味する。 実施例１ アガロース溶液の製造 アガロース溶液は、バッチ反応器中９５℃で２時間７ｇのアガロースを撹拌し ながら１００ｍｌの蒸留水に加えることにより製造される。 ２時間の反応後、溶液を７０℃に冷却し、１ｍｌの４５％ＮａＯＨおよび１． ６７ｍｌのアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）をアガローススラリーに加える 。この反応を、７０℃で撹拌下２時間続行させる。次いで溶液を０.１５ｍｌの ６０％酢酸およびＨＣｌにより中和する（ｐＨ７−８）。 エマルジョン媒質 エマルジョン媒質は、エマルジョン反応器中６０℃で撹拌下５.３ｇのエチル セルロース（Ｎ−５０乳化剤）を１１７ｍｌのトルエンに加えることにより製造 される（トルエン中におけるＮ−５０の溶解は約２時間かかる）。 エマルジョン反応器へのアガロース溶液の移入 アガロース溶液をエマルジョン媒質へ移す。撹拌を１３０ｒｐｍに調節する。 それによりアガロースゲル粒子が形成され、それらのサイズは撹拌装置の回転速 度を変え、さらにＮ−５０を加えることにより制御され得る。 所望の最大粒子サイズは１５０μｍである。ゲル粒子が大きすぎる場合、回転 速度は２２０ｒｐｍまで増大され得、追加のＮ−５０が加えられ得る。最大粒子 サイズは、約１０分ごとにサンプルを採取し、サイズ目盛りが組み込まれた顕微 鏡で分析することにより制御される。 １５０μｍに達すると、溶液を冷却する。 冷却工程 溶液を約３０分で６０℃〜＜２５℃に冷却する。 ゲル洗浄工程 ゲル粒子を撹拌下で１リットルの９９.５％エタノールにより洗浄し、傾斜す る。次いで、ゲルを、吸引漏斗（nutsch）で４×１リットルの９９.５％エタノ ールおよび４×１リットルの蒸留水により洗浄する。 アリルグリシジルエーテルの不活性部位の活性化およびアガロースの架橋＝架 橋番号１ 臭素化 １０ｇのＮａＡｃ（酢酸ナトリウム）を、１００ｍｌのゲルおよび２００ｍｌ の蒸留水から成る溶液を含む反応器中に撹拌しながら加える。５分後、暗黄色と なるまで臭素−水（Ｂｒ₂／Ｈ₂Ｏ）を溶液に加え、１分間にわたって維持する。 反応が約１５分間続いた後、蟻酸ナトリウムを加えるとゲルは白くなる。ゲルを ３×１リットルの蒸留水により洗浄する。 架橋 ５ｇのＮａ₂ＳＯ₄を、１００ｍｌの臭素化ゲルおよび１００ｍｌの蒸留水から 成る溶液を含む反応器に撹拌しながら加える。１５分後、１０ｍｌの４５％Ｎａ ＯＨおよび０.３ｇのＮａＢＨ₄を溶液に加える。反応は３時間続き、次いで溶液 温度を４０℃に高め、反応を１６時間続行させる。ゲルをｐＨ＝７になるまで蒸 留水で洗浄する。 慣用的方法によるさらなる架橋＝架橋番号２ ４５.３ｇのＮａ₂ＳＯ₄を、１００ｍｌのＡＧＥ架橋ゲルおよび３３.３ｍｌの 蒸留水から成る溶液（７５％ゲルスラリー）を含む反応器に撹拌しながら加える 。反応温度を５０℃に高め、２時間後、１.３３ｍｌの４５％ＮａＯＨおよび０. ４ｇのＮａＢＨ₄を加え、並びに９.３３ｍｌの４５％ＮａＯＨおよび１０ｍｌの エピクロロヒドリン（ＥＣＨ）を６−８時間の間に加える。反応は一夜にわたっ て（約１６時間）続く。ゲルを蒸留水で洗浄し、６０％酢酸を加えてｐＨ＝５− ６にする。 次いで、ゲルをふるいにかけて、所望の粒子サイズ間隔（４０−１００μｍ） にする。 実施例２ この実施例では、この発明による架橋後慣用的方法により２回架橋された粒子 が製造される。すなわち、実施例１により製造された粒子を、架橋番号２方法で 架橋した。 １１８ｇのＮａ₂ＳＯ₄を、２６０ｍｌのＥＣＨ架橋ゲルおよび８７ｍｌの蒸留 水から成る溶液に撹拌しながら加える。温度をゆっくりと５０℃に高め、２時 間後３.５ｍｌの４５％ＮａＯＨおよび０.３５ｇのＮａＢＨ₄を加え、２４ｍｌ の４５％ＮａＯＨおよび２６ｍｌのＥＣＨをゆっくりと（６−８時間）溶液中へ 注入する。反応を１６時間保ち、次いでゲルをｐＨ＝５−６になるまで蒸留水（ および０.６ｍｌ酢酸）により洗浄する。ゲルをふるいにかけ、試験する。 実施例３ 比較実施例として、エマルジョン工程後にアリル化されたアガロースゲルマト リックスを製造する。乳化前のアリル化について実施例１に記載された合成方法 に類似した合成方法を使用する。これらの生成物は、新たに開発された技術によ り製造されたものと同じアリル濃度を有する。これらのゲルを製造するのに使用 される別の合成方法は、次の段階により構成される。 エマルジョン ２８ｇのアガロースを４００ｍｌの蒸留水に加え、２時間９５℃に加熱する。 その後、溶液を７０℃に冷却し、４７０ｍｌトルエンおよび３５ｇのＮ−５０（ 乳化剤）を含む６０℃温溶液に移す。約４５分の撹拌後、１５０μｍの平均粒子 サイズが得られる。溶液を約３０分間２２℃に冷却し、無水エタノール（４×２ リットル）および蒸留水（４×２リットル）により洗浄する。 アリル化： ３３.５ｇのＮａ₂ＳＯ₄および１.８ｇのＮａＢＨ₄を、３５５ｍｌのアガロー スゲルおよび１０６.５ｍｌの蒸留水を含む溶液に加える。この溶液を３０℃の 温度で５分間撹拌し、次いで２５ｍｌのＡＧＥおよび７１ｍｌの４５％ＮａＯＨ を溶液にゆっくりと（６−８時間）注入する。撹拌を同温度で１６時間続行する 。アリル化ゲルを蒸留水（３×２リットル）で洗浄する。 臭素化： ３６ｇの酢酸ナトリウムを、３６０ｍｌのアリル化ゲルおよび７２０ｍｌの蒸 留水の溶液に加える。５分撹拌後、１４６ｍｌのＢｒ₂／Ｈ₂Ｏを溶液に加え、反 応を１５分間行わせる。次いで、０.５ｇの蟻酸ナトリウムを加えると、ゲルは 白くなる。ゲルを３×２ゲル体積の蒸留水により洗浄する。 架橋番号１： １８ｇのＮａ₂ＳＯ₄を、３６０ｍｌの臭素化ゲルおよび３６０ｍｌの蒸留水 から成る溶液に加える。混合物を撹拌し続け、１５分後、７２ｍｌの４５％Ｎａ ＯＨを１.０８ｇのＮａＢＨ₄と一緒に溶液中に注入する（３０分間）。３時間後 、温度を４０℃に高め、反応を１６時間持続する。次いでゲルをｐＨが約７にな るまで蒸留水で洗浄する。 架橋番号２： １５６.４ｇのＮａ₂ＳＯ₄を、３４５ｍｌの架橋ゲルおよび１１５ｍｌの蒸留 水を含む溶液に加える。溶液を撹拌し続け、ゆっくりと５０℃に加熱する。２時 間後、４.６ｍｌの４５％ＮａＯＨおよび０.４６ｇのＮａＢＨ₄を混合物に加え 、その間３２.２ｍｌの４５％ＮａＯＨおよび３４.５ｍｌのＥＣＨを６−８時間 で溶液に注入する。反応は１６時間続き、次いでゲルをｐＨが約５−６になるま で蒸留水（および０.６ｍｌの酢酸）で洗浄する。ゲルをふるいにかけ、試験す る。 実施例４ 架橋番号１後のアリル化アガロースゲルマトリックスの追加的アリル化 アガロース溶液のアリル化工程中、２官能性ＡＧＥ分子は、活性部位から不活 性部位を遊離させたアガロースポリマー鎖に結合する。遊離部位をまず臭素化し 、架橋番号１中それをＮａＯＨでエポキシド化することにより、ＡＧＥ分子は第 ２アガロースポリマー鎖に結合され得る。ここでの別の合成方法は、下記段階で 実験的に説明されているとおり、第１架橋開始前にアリル化工程を複数回反復す ることによりさらにＡＧＥをポリマー鎖に結合させることを目的とする。 臭素化： ３５ｇの酢酸ナトリウムを、実施例１に従い製造された３５０ｍｌのアリル化 ゲルおよび７００ｍｌの蒸留水から成る溶液に加える。混合物を撹拌し続け、５ 分後１６０ｍｌのＢｒ₂／Ｈ₂Ｏを加える。反応を１５分間続行させ、次いで０． ５ｇの蟻酸ナトリウムを加える。ゲルの色が白く変わると、ゲルを蒸留水（３× １リットル）で洗浄する。 アリル化： １７．５ｇのＮａ₂ＳＯ₄、０.５ｇのＮａＢＨ₄および３５ｍｌの４５％ＮａＯ Ｈを、３５０ｍｌの臭素化ゲルおよび１７５ｍｌのＨ₂Ｏから成る溶液に加え る。混合物を４０℃で撹拌し続け、１時間後２０ｍｌのＡＧＥを加える。反応を １６時間続行させた後、ｐＨが約７になるまでゲルを蒸留水で洗浄する。 臭素化： ３８.５ｇの酢酸ナトリウムを、３８５ｍｌの２度アリル化されたゲルおよび ７７０ｍｌの蒸留水を含む撹拌溶液に加える。５分後、８５ｍｌのＢｒ₂／Ｈ₂Ｏ を加え、反応を１５分間維持し、次いで０.５ｇの蟻酸ナトリウムを加えると、 白いゲルが得られる。次いでゲルを蒸留水（３×１リットル）で洗浄する。 架橋番号１： １９.２５ｇのＮａ₂ＳＯ₄を、上述の臭素化ゲル３８５ｍｌおよび蒸留水３８ ５ｍｌから成る撹拌混合物に加える。１５分後、３８.５ｍｌの４５％ＮａＯＨ を、１.１６ｇのＮａＢＨ₄と一緒に溶液に注入する（注入期間＝３０分）。反応 を４５分間続行させた後、温度を４０℃に高める。溶液を１６時間撹拌し続ける 。次いでｐＨが約７になるまでゲルを蒸留水で洗浄する。 架橋番号２： １７４.４ｇのＮａ₂ＳＯ₄を、３８５ｍｌの架橋ゲルおよび１２８ｍｌの蒸留 水から成る撹拌溶液に加える。混合物をゆっくりと５０℃に加熱し、２時間後５ .１３ｍｌの４５％ＮａＯＨおよび０.５１ｇのＮａＢＨ₄を溶液に加えながら、 ３６ｍｌの４５％ＮａＯＨおよび３８.５ｍｌのＥＣＨを反応器中にゆっくりと （６−８時間）注入する。反応は１６時間続き、次いでｐＨ＝５−６になるまで ゲルを蒸留水（および０．６ｍｌ酢酸）で洗浄する。 ゲルをふるいにかけ、試験する。 実施例５ 第１架橋前の第２架橋 この合成では、ＥＣＨ架橋は、架橋番号１前に行われる。実験手順は次の段階 で説明されている。 架橋番号２： 実施例１記載の方法に従いアリル化ゲルが製造される。１５８.８ｇのＮａ₂Ｓ Ｏ₄を、このアリル化ゲル３５０ｍｌおよび蒸留水１１７ｍｌを含む溶液に加え る。混合物を撹拌し、ゆっくりと５０℃に加熱し、２時間後４.６７ｍｌの４ ５％ＮａＯＨおよび０.６７ｇのＮａＢＨ₄を溶液に加え、かつ３２.７ｍｌの４ ５％ＮａＯＨおよび３５ｍｌのＥＣＨをゆっくりと（６−８時間）反応器中に注 入する。この反応は１６時間続けられ、次いでｐＨが約５−６になるまでゲルを 蒸留水により洗浄する。 臭素化： ２０.５ｇの酢酸ナトリウムを、２０５ｍｌのＥＣＨ−架橋ゲルおよび４１０ ｍｌの蒸留水から製造された溶液に加える。混合物を撹拌し、５分後、７０ｍｌ のＢｒ₂／Ｈ₂Ｏを加え、１５分の反応時間後、０.５ｇの蟻酸ナトリウムを加え ると、ゲルは白色になる。次いでゲルを蒸留水（３×１リットル）で洗浄する。 架橋番号１： １０.２５ｇのＮａ₂ＳＯ₄を、２０５ｍｌの臭素化ゲルおよび２０５ｍｌの蒸 留水を含む溶液に加える。混合物を１５分間撹拌し、次いで２０.５ｍｌの４５ ％ＮａＯＨおよび０.６１ｇのＮａＢＨ₄を加える。３時間の反応時間後、温度を ４０℃に高め、溶液をさらに１６時間撹拌し続ける。次いで、ｐＨが約５−６に なるまでゲルを蒸留水で洗浄する。 ゲルをふるいにかけ、試験する。 実施例で製造されたゲルを、アリル濃度、圧力／フロー吸収力、Ｋａｖ値（Ｋ ａｖは相対孔サイズについて容認された定義）およびそれに応じて粒子サイズ分 布に関して分析した。 アリル濃度分析 標準方法に従い、０.１モルＡｇＮＯ₃を含むメットラーＤＬ４０ＧＰメモ・タ イトレーターにおいてアリル濃度を分析した。 圧力／フロー吸収力分析 器械：ＸＫ−１６／４０カラム ＨＲ１０／３０カラム ＦＰＬＣディレクター（商標）システムコントロールユニット（最大圧力 ／フロー出力：２６−３０バールまたは２００−２１０ｍｌ／分）： １台のファルマシア・バイオテク・コントローラーＬＣＣ−５０１プラス およびビルトイン接続器を備えた２台のファルマシア・バイオテク・ポン プＰ−６０００およびＰＣ−ユニット。 方法：ゲルマトリックスの圧力／フロー耐性試験は、ゲル平均ビーズサイズおよ びカラムパッキングプロセスに左右される。製造されたゲルビーズは２種 の平均サイズ間隔ａ）８−１２μｍおよびｂ）４０−１００μｍを有する。 パッキング： ａ）平均サイズ８−１２μｍのゲルビーズに対するカラムパッキング方法は、 Ｋａｖ試験（次項参照）の場合と同様にして一連の圧力／時間変動を伴いＨＲ１ ０／３０カラムで行われる。 ｂ）平均サイズ４０−１００μｍのゲルビーズに対するカラムパッキング方法 は、ベッドの高さが３１±１ｃｍのＸＫ１６／４０カラムで行われた遊離沈降方 法である。 圧力／フロー試験： ａ）ＨＲ−１０／３０カラムでの試験は、５分ごとに流速０.１ｍｌ／分を増 し、５分ごとに背圧変化を読み取ることにより行われる。 ｂ）ＸＫ−１６／４０カラムでの試験は、５分ごとに流速１または５ｍｌ／分 を増し、５分ごとに背圧変化を読み取ることにより行われる。 Ｋａｖ値測定分析 器械：ファルマシアＵＶＭ−検出装置 ファルマシア・バイオテク・ＦＰＬＣディレクター（商標）システムコントロ ール２チャンネル記録装置（プロッティングユニット） 方法：ゲルマトリックスのＫａｖ値の決定により、ゲルビーズの孔サイズが推 定される。この決定は、最終産物（架橋ゲル）において下される。これは、ゲル マトリックスを含むカラムに注入された幾つかのタンパク質の遅延時間をグラフ 解釈することにより行われる。 パッキング： 最終産物を、１７バールの圧力下ＨＲ１０／３０カラムに充填する。使用する パッキング溶媒は、下記組成の溶液である。 １０００ｍｌ当たり６０ｇのＨＡｃ＋１ｇのトゥイーン（商標）２０ カラムを充填するため、３０ｇのゲルを３０ｇパッキング溶媒に分散させる。 ゲルマトリックスを、まず５０分間６バール、次いで１０分間１７バールの圧 力下で充填する。 タンパク質注入およびＫａｖ測定： Ｋａv値を４タンパク質について測定する。 ・チログロブリン（ＭＷ＝６６９０００ｇ／モル） ・フェリチン（ＭＷ＝４４００００ｇ／モル） ・ＢＳＡ（ＭＷ＝６７０００ｇ／モル） ・リボヌクレアーゼ（ＭＷ＝１３７００ｇ／モル） これらのタンパク質を、一度に１または２種ずつ（部分的重複が起こるのを防 ぐため）カラムに注入する。 この処理中に使用される溶離液媒質は、ｐＨ＝７.２で下記組成を有する緩衝 溶液である。 ・５０ミリモルのジヒドロリン酸ナトリウム（ＮａＨ₂ＰＯ₄×２Ｈ₂Ｏ） ・１５０ミリモルの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ） ・０.０２％アジ化ナトリウム（ＮａＮ３） Ｋａｖ値を測定するためには、空隙が占める容積（アガロースビーズ周囲の容 積）を知ることが必要であり、これはブルーデキストランをカラムに注入するこ とにより行われる。 得られたプロットを解釈し、所望のＫａｖ値を計算するＰＣによりデータを分 析する。 粒子サイズ分布分析： 平均粒子サイズ分布（ｄ５０ｖ）を、コールターマルチサイザーにより行った 。 実施例１−５からの結果を、標準アガロースゲル（セファロース（商標）６Ｆ Ｆ）と比較し、下表に示す。 ＊ 流速が５分ごとに１５０ｃｍ／時ずつ増加するときに圧力増加が１または １.５バールを越える場合の圧力。 ＊＊≧６０００ｃｍ／時は、器械が送達し得る最大フローを示す。ゲルの最大 フロー受容力はこの値より上に位置する。 実施例６ この実施例では、この発明による方法を用いて、アガロース含有率８.１ｗ／ ｖ％の高度剛性アガロースゲルビーズを製造した。実施例２による方法を反復し たが、アガロース溶液製造時、１００ｍｌの水に対し８.１ｇのアガロースを使 用した。ゲルをふるいにかけると、２種の異なる粒子サイズを有する２フラクシ ョンが得られた（実施例６ａおよび６ｂ）。さらに別の粒子サイズ、実施例６ｃ も同様にして製造された。上述の方法と同様にしてゲルビーズを試験した。製造 された粒子を、アガロース含有率８.１ｗ／ｖ％（ファルマシアからのスパロー ス（商標））の慣用的粒子と比較した。試験結果を表２ａおよび２ｂに一緒に示 す。 ＊２６バールは、器械が送達し得る最大圧に相当する。上記で得られた最大圧お よびフロー値はさらに高いと予想される。 以下の実施例では、アガロース含有率が異なるゲルが製造された。 実施例７ 実施例１による方法を反復したが、アガロース含有率は異なっていた。結果を 下表３ａおよび３ｂに示す。アガロース７％の実施例７ａは実施例１の場合と同 一である。 実施例８ この実施例では、異なるアガロース含有率を用い、実施例５による方法を使用 した。結果を下表に示す。 ＊ 流速が５分ごとに１５０ｃｍ／時ずつ増加するときに圧力増加が１または １.５バールを越える場合の圧力。 ＊＊≧６０００ｃｍ／時は、器械が送達し得る最大フローを示す。ゲルの最大 フロー受容力はこの値より上に位置する。 結論： この発明による新規架橋方法を用いると、ゲルのＫａｖ値は類似しているが、 慣用的ゲル粒子または既知方法（実施例３）により製造された粒子の場合よりも ３倍を越える割合で高いフローに耐え得るゲルが得られることは、表から明らか である。 この発明のゲルの優れた性質は図１−３においても説明され得る。図面の説明 は次の通りである。 図１は、実施例１−５および同等化合物の背圧に対するフローのプロットであ る。 図２は、実施例６ａ、６ｂ、６ｃおよび同等化合物の背圧に対するフローのプ ロットである。 図３ａは、実施例７ａ、７ｂ、８ａ、８ｂ、８ｃ、８ｄおよび同等化合物に関 する最大フローに対するＫａｖ値のプロットである。 図３ｂは、図３ａの場合と同じ実施例に関する背圧に対するフローのプロット である。 当業界で現在使用されている粒子の場合フローが適度の値を越えて増加すると 背圧が急速に上昇することが図面から明らかであり、フローが増加し過ぎると、 粒子が崩壊することを示している。しかしながら、この発明によるゲルに関する 圧力／フロープロットはかなり低い勾配を示しており、流速が増しても背圧がゆ っくりと上昇するだけであることを示している。 図３ａでは、実施例７ａ、ｂおよび８ａ、ｂ、ｃ、ｄによるゲルマトリックス に関するＫａｖが、最大フローに対してプロットされている。アガロースｗ／ｖ パーセンテージとは無関係に、実施例７または実施例８に従い製造されたマトリ ックスの場合最大許容流速が３００％の割合で増していることは図から容易にわ かる。しかしながら、アガロースｗ／ｖパーセンテージは、Ｋａｖ値で表される ゲルビーズ孔サイズに対して重要な影響力を有しており、ゲルビーズ中のアガロ ースの量が減少すると上記値は増加する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．次の段階： ａ）多糖類の溶液または分散液を製造し、 ｂ）１活性部位および１不活性部位を有する２官能性架橋剤を段階ａ）からの 溶液または分散液に加え、 ｃ）多糖類のヒドロキシル基を架橋剤の活性部位と反応させ、 ｄ）多糖ゲルを形成させ、 ｅ）架橋剤の不活性部位を活性化し、 ｆ）段階ｅ）からの活性化部位を多糖ゲルのヒドロキシル基と反応させること により、ゲルの架橋が行われる ことを特徴とする、多孔性架橋多糖ゲルの製造方法。 ２．得られた架橋多糖ゲルが、１回または数回慣用的方法によりさらに架橋さ れることを特徴とする、請求項１記載の方法。 ３．段階ｄ）からのゲルが段階ｅ）およびｆ）が行われる前に慣用的方法によ り架橋されることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。 ４．段階ｄ）からのゲルが段階ｅ）およびｆ）を行うと同時に慣用的方法によ り架橋されることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。 ５．段階ｂ）およびｃ）が、段階ｄ）またはｅ）の後、段階ｅ）およびｆ）ま たは段階ｆ）を行う前に１回または数回反復されることを特徴とする、請求項１ または２記載の方法。 ６．水溶液が段階ａ）における多糖類から製造されることを特徴とする、請求 項１〜５のいずれかに記載の方法。 ７．有機溶媒中、粒子に対して段階ｃ）からの水溶液を乳化することによりゲ ルが形成されることを特徴とする、請求項６記載の方法。 ８．２官能性架橋剤がアリルグリシジルエーテルまたはアリルブロミドである ことを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。 ９．慣用的方法によるさらなる架橋が、エピハロヒドリン、ビス−エポキシド 類、ジビニルスルホン、アリルグリシジルエーテルおよびジブロモプロパン−１ −オールのいずれかからの１種または数種の化合物により達成されることを特徴 とする、請求項２−５記載の方法。 １０．多糖がアガロースであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに 記載の方法。 １１．次の段階： ａ）多糖類の溶液または分散液を製造し、 ｂ）１活性部位および１不活性部位を有する２官能性架橋剤を段階ａ）からの 溶液または分散液に加え、 ｃ）多糖類のヒドロキシル基を架橋剤の活性部位と反応させ、 ｄ）多糖ゲルを形成させ、 ｅ）架橋剤の不活性部位を活性化し、 ｆ）段階ｅ）からの活性化部位を多糖ゲルのヒドロキシル基と反応させること により、ゲルの架橋が行われること により得られる多孔性架橋多糖ゲル。 １２．得られた架橋多糖ゲルが、１回または数回慣用的方法によりさらに架橋 されることを特徴とする、請求項１１記載の多糖ゲル。 １３．段階ｄ）からのゲルが段階ｅ）およびｆ）が行われる前に慣用的方法に より架橋されることを特徴とする、請求項１１または１２記載の多糖ゲル。 １４．段階ｄ）からのゲルが段階ｅ）およびｆ）を行うと同時に慣用的方法に より架橋されることを特徴とする、請求項１１または１２記載の多糖ゲル。 １５．段階ｂ）およびｃ）が、段階ｄ）またはｅ）の後、段階ｅ）およびｆ） または段階ｆ）を行う前に１回または数回反復されることを特徴とする、請求項 １１または１２記載の多糖ゲル。 １６．水溶液が段階ａ）における多糖類から製造されることを特徴とする、請 求項１１〜１５のいずれかに記載の多糖ゲル。 １７．有機溶媒中、粒子に対して段階ｃ）からの水溶液を乳化することにより ゲルが形成されることを特徴とする、請求項１６記載の多糖ゲル。 １８．２官能性架橋剤がアリルグリシジルエーテルまたはアリルハライドであ ることを特徴とする、請求項１１〜１７のいずれかに記載の多糖ゲル。 １９．得られた架橋多糖ゲルが、エピハロヒドリン、ビス−エポキシド類、ジ ビニルスルホン、アリルグリシジルエーテルおよびジブロモプロパン−１−オー ルのいずれかからの１種または数種の化合物によりさらに架橋されることを特徴 とする、請求項１２記載の多糖ゲル。 ２０．多糖がアガロースであることを特徴とする、請求項１１〜１９のいずれ かに記載の多糖ゲル。 ２１．ゲル濾過媒質として、アフィニティー・クロマトグラフィー、イオン交 換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラ フィー、キレートクロマトグラフィー、共有結合クロマトグラフィーにおける、 請求項１１〜２０のいずれかに記載の多孔性架橋多糖ゲルの用途。