JP2000508074A - 癌増殖状態の免疫組織化学的検出分析試験 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 癌の増殖状態を決定する方法が開示されている。患者試料を採取し、ＮＧＡＬ遺伝子発現生成物の試料を定量分析する。ＮＧＡＬ発現生成物の量を標準曲線と比較し、Ｓ期値を決定する。試料は乳房組織または乳房液吸引物であってもよい。或いはこのマーカーについて血液を分析し、転移を診断することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 癌増殖状態の免疫組織化学的検出分析試験 本発明は、米国政府が後援し、ＮＩＨによって授与された基金＃ＣＡ５８３２ ８によってなされた。米国政府は、本発明について一定の権利を有する。 発明の背景 本発明は癌増殖状態を決定する方法に関するものである。乳癌および隣接組織 については、免疫組織化学的染色法を用いてＮＧＡＬタンパク質が試験される。 オンコジーンｃ−ｅｒｂＢ−２はヒト乳癌の臨床的進行に関連することが知ら れている。ｃ−ｅｒｂＢ−２のげっ歯動物同族体、ｎｅｕを用いる生体内（in v ivo ）モデルが開発され、哺乳動物の発癌および腫瘍生物学におけるｃ−ｅｒｂ Ｂ−２の役割を評価することが試みられてきた。あるモデルにおいて、乳腺特異 的プロモーターを用い、乳腺を標的にして活性化ｎｅｕを発現するトランスジェ ニックマウスが作製された。第２のモデルにおいては、複製−欠損レトロウィル ス・ベクターを用いて、活性化ｎｅｕオンコジーンをその場にてラット乳房上皮 細胞に直接かつ安定的に導入した。両方法で、ｎｅｕは強力な腫瘍誘発物質であ ることが判明した。 以前我々は、「ｎｅｕ開始−ラット乳癌における独特に過剰発現したリポカリ ンの分離」を報告した(ステーツ（S.Stoesz）ら、１９９４ ＡＡＣＲ Ａｂｓ ｔｒａｃｔ)。このリポカリンは「ＮＲＬ」 （neu-related lipocalin、ｎｅｕ関連性リポカリン）と命名された。この要約 書および本明細書において参照するその他の全ての出版物の開示は、ここで完全 に説明されたものとして参照して本明細書の記載の一部とする。リポカリン類は 広範囲の機能を有することが知られているが、ＮＲＬの特異的機能は知られてい ない。 ラットＮＲＬに若干類似するタンパク質、ヒトＮＧＡＬ、が分離され、配列決 定された。ＮＧＡＬおよびＮＧＡＬのタンパク質配列をコードする種々のｃＤＮ Ａ遺伝子配列がキールドセン（L.Kjeldsen）らのJ ．Biol．Chem. ２６８：１０ ４２５−１０４３２（１９９３）；バンドガード（Ｊ．Bundgaard）ら、Biochem .Biophys.Res ．Comm． ２０２[３]：１４６８−１４７５(１９９４)；バーチュ（ S.Bartsch）ら、FEBS Let ．３７：２５５−２８９（１９９５）に報告されてい る。ＮＧＡＬ（ヒト好中性リポカリン（ＨＮＬ）としても知られている）は種々 の細胞型（例えば骨髄、卵巣細胞癌）に見いだされている。この場合もその特異 的機能は知られていない。なお、バンドガードが成熟タンパク質の第１塩基をＣ ＡＧからのＱとして報告し、一方、キールドセンがこの位置にＥを報告したこと に注目されたい。本願請求の範囲では、これらの両方の変種を網羅するために「 ＮＧＡＬ」を用いる。 乳癌の治療および診断は癌の増殖状態を正確に決定することによって改善する ことができる。増殖状態の一つの重要な尺度は、「Ｓ期」細胞のパーセンテージ である。Ｓ期は細胞周期中の、ＤＮＡ複製が起きる時期である。一般的には、ク ロス（F.Cross）らのAnnu.Rev ．Cell Biol. ５：３４１−３９５（１９８９） を参照。Ｓ期にある生検試料における細胞のパーセンテージの測定は、細胞増殖 状 態の指標である。高いパーセンテージのＳ期細胞は、非常に積極的な治療法がな い、腫瘍の好ましくない予後を示すことが知られている。 Ｓ期の癌細胞のパーセンテージは、細胞染色、フローサイトメトリーによって 、およびある種のマーカーの分析によって測定される。公知の技術には問題があ り（コスト高、時間を要する等）、かつ特殊な装置も必要であるため、この技術 に対して日常的臨床的に検査室で使用する興味を欠わせるものとしている。この ため、癌の増殖状態を決定するための改良された分析試験が必要とされている。 発明の概要 一面において、本発明はヒト乳癌の相対的増殖度を測定する方法を提供する。 その癌の試料を採取した後、ＮＧＡＬタンパク質に特異性を有する抗体を用いて 、試料中のＮＧＡＬタンパク質に結合させる。次に、抗体に結合したマーカーを 用いて、癌中にＮＧＡＬタンパク質がどの程度存在するかその程度をマークする 。本明細書で用いるＮＧＡＬタンパク質とは、少なくとも配列番号１の配列２１ −１９７を有するタンパク質である。 好適な態様において、試料は癌に隣接する組織も含む。そこでマーカーは隣接 組織においてＮＧＡＬタンパク質がどの程度存在するかその程度も記マークする 。 一面において、上記方法は免疫組織化学的染色分析試験であり、マーカーは可 視色を発し、ＮＧＡＬの存在をマークする。 本発明の目的の一つは乳房組織における癌増殖の分析試験法を提供することで あると理解できるであろう。 本発明の別の目的は、周囲組織のＮＧＡＬも分析することによって偽陽性を最 小にする技術を提供することである。 本発明のその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる明細書および請求の 範囲を検討した後に明らかになるだろう。 発明の詳細な説明 フローサイトメトリーによってヒト乳腺腫瘍細胞パネルのＳ期値を測定し、公 知の同一試料について例えばクー(S.Xu)ら、J ．Immunol.Meth. １７１：２４５ −２５２（１９９４）のＮＧＡＬタンパク質分析試験を用いてＮＧＡＬタンパク 質濃度を測定するという方法により、標準曲線を作成することができる。我々は 、癌中のＮＧＡＬタンパク質濃度がＳ期値を予測することを見いだした。免疫組 織化学的染色「標準」は、これらの知見により開発できるものである。初期の相関試験用ヒト試料の採取 癌が疑われるヒト女性乳房組織を当業者に公知の標準的生検法によって採取し た。例えば、吸引（または細針）生検を用いた。それは疑わしい組織に導入した 針によって細胞および組織断片を吸引することを含む。 針（またはコア）生検がもう一つの方法である。これは疑わしい組織に導入す るために特別に設計された針によって組織の中心を採取することを含む。他には 、より大きい腫瘍塊から小さいＶ字型組織を取り出すことを含む切開生検、およ び疑わしい全腫瘍組織を周囲の正常組織の境界をほとんどもしくは全く含まずに 切除することを含む切除生検が、Ｓ期との相関性を確認するために適した組織抽 出法の例である。一般的には、デヴィタ（V.DeVita,Jr.）ら、Cancer Princip1e s and Practice of Oncology 、Vol１、第４版、Ｊ．Ｂ．リッピンコット社(J.B. Lippincott Co.)、２４３−２４４頁（１９９３）を参照。 タンパク質分析のためには、組織を次のように調製してもよい。タンパク質を 抽出するために、組織を、ＰＢＳＴＤＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、二塩基性 ；１５４ｍＭ塩化ナトリウム；１２ｍＭデオキシコール酸、ナトリウム塩；１ｍ Ｍフッ化ナトリウム；３．５ｍＭドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）;３１ｍＭ アジ化ナトリウム；１％トリトン（Triton）Ｘ−１００；１ｍＭフェニルメチル スルホニルフルオリド）中で、１００ｍｇ／ｍｌの濃度で、ポリトロン（Polytr on）で均質化し、４℃、１０，０００ｇで１５分間遠心分離すればよい。その後 、可溶性タンパク質を含む上澄液を移す。分析試験 我々は患者の乳癌組織についてＮＧＡＬタンパク質の絶対量を試験した。この 試験はＲＩＡによって行われた。例えばクーら、J ．Immunol.Meth. １７１：２ ４５−２５２（１９９４）を参照。また、酵素結合イムノソルベント検定法（Ｅ ＬＩＳＡ）反応によって行うことができる。ＥＬＩＳＡでは、試料をＮＧＡＬに 特異的な抗体に曝す。ＮＧＡＬに対するポリクローナル抗血清はＮＧＡＬで免疫 したウサギから得ることができる。ポリクローナル抗体とＮＧＡＬタンパク質と の結合後、その混合物を、酵素的変色標識と結合した第２抗体（例えばヤギ抗ウ サギ）に曝す。この標識の検出は、ＮＧＡＬ抗原の存在を示す。 より詳細には、抗ＮＧＡＬ（モノクローナルまたはポリクローナル）捕獲抗体 をミクロタイタープレートに被覆してもよい。洗浄後、未知濃度のＮＧＡＬ抗原 を含む患者試料をプレート上でインキュベートする。非結合抗原を洗い去った後 、第２の抗ＮＧＡＬ抗体をウェルに加え、インキュベートする。この第２の抗体 は酵素標識されていてもよいし、或いはその後、第２の抗体類であって捕獲抗体 ではない抗体類を識別する、第３の酵素標識抗体を添加してもよい。非結合の抗 体を洗い去った後、適切な発色性酵素基質をウェルに加える。基質のインキュベ ーションで生じた変色度は腫瘍試料中のＮＧＡＬ由来タンパク質の濃度に比例す る。これを、平行して実験した組換えＮＧＡＬの既知濃度の標準物質と比較する 。一般的ＥＬＩＳＡ法については、エングヴァル（E.Engvall）ら、Immunochemi stry ８：８７１−８７９（１９７１）を参照。 ＥＬＩＳＡの結果分析から、患者組織試料に存在するＮＧＡＬタンパク質の濃 度を決定し、これを既知の予後およびＳ期履歴を含む腫瘍パネルと比較すること ができる。ウェスタンブロット等のその他の方法を用いて試料中のＮＧＡＬタン パク量を分析することもできる。既知ヒト乳腫瘍試料 Ｓ期パーセンテージが既知のヒト乳腫瘍１５例から無作為に採取した組織を試 験した（Ｓ期パーセンテージは他の人から我々に報告された)。我々は４つの試 料が高濃度のＮＧＡＬ発現生成物の存在を示したことを見いだした。その結果を 以下の表１に示す。 ＋または＋＋の記号は、それぞれ発現または強く発現したＮＧＡＬ発現生成物が 検出されたことを示す。統計分析は、Ｓ期とＮＧＡＬとの関連がｐ＝０.００５ １であることを示す。ポリクローナル抗体の産生および精製 まず、３匹の病原体フリーのニュージーランド白色ウサギ（ヘーゼルトン(Haz elton)、カラマズー、ＭＩ）を４００μｇの精製ＮＧＡＬ組換えタンパク質で免 疫した。ルアー・フィッティング（luer fitting）によって結合した２本の注射 器を用い、そのタンパク質を等量のコンプリートフロイント・アジュバント（シ グマ(Sigma)、セントルイス、ＭＯ）中で乳化した。混合物を１０−２０部位に 皮内注射により投与した。ダルベッコリン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ） （ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、ゲーザーズバーグ、ＭＤ）にて 希釈し、インコンプリートフロイント・アジュバント（シグマ）中に乳化させた １００−３００μｇタンパク質を用いて、ブースター（追加抗原剌激）注射を皮 下に４週ごとに４回増量させながら行った。３０ｍｌの全血を追加抗原剌激の１ ２日後に集め、凝固させ、４℃、３０００ｇで１５分間遠心分離し、抗血清を− ８０℃で冷凍した。相対的抗体産生、特異性およびバックグラウンドを間接的酵 素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）（ピアース(Pierce)）によって測 定した。陰性対照群としてウシ血清アルブミンおよび免疫前ウサギ血清を用いた 。 アミノリンク（AminoLink）固定キット（ピアース）及び予めセントリプラス （Centriplus）濃縮器で０.５ｍｌに濃縮した３ｍｇの精製組換えＮＧＡＬ、１ ０ｋＤのカットオフ（アミコン(Amicon)、ビバリー、ＭＡ）とを用いて、アフィ ニテイー（親和性）カラムを作製した。ハイトラップ（HiTrap）１ｍｌタンパク 質Ａカラム（ファルマシア・バイオテク(Pharmacia Biotech)）を用いて抗血清 から精製したＩｇＧ（８ｍｇ）をアフィニテイーカラムにかけ、５０ｍＭトリス （ｐＨ７．５）で洗浄し、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．９）で溶出した 。カラム分画について、ピークＩｇＧを２８０ｎｍの吸光度でモニターした。免疫組織化学 免疫組織化学のための新鮮組織を乳房生検標本から採取し、腫瘍組織および隣 接正常乳房組織の小試料をＯＣＴコンパウンド（マイルズ(Miles)、エルクハー ト、ＩＮ）に埋め込み、急速冷凍し、− ７０℃で保存した。５μｍの凍結切片をポリ−Ｌ−リジン被覆スライド上に載せ 、７０％エタノール中で５分間固定した。内因性ベルオキシダーゼ活性をメタノ ール中３％Ｈ₂Ｏ₂、１０分間で失活させた。パワーブロック試薬（ＤＡＫＯ、カ ーピンテリア、ＣＡ）で５分間ブロッキングした後、スライドを１８μｇ／ｍｌ 濃度のアフィニテイー精製抗ＮＧＡＬウサギポリクローナル抗体と共にインキュ ベートした。免疫前ＩｇＧを、同じタンパク質濃度で、陰性対照として用いた。 ＬＳＡＢ＋検出システム（ＤＡＫＯ）および３，３’−ジアミノベンチジン（Ｄ ＡＢ）ペルオキシダーゼ基質を用いて結合を可視化した。褐色着色度はＮＧＡＬ 濃度に比例した。 別法として、パラフィン埋封切片を作ることができる。若干の我々の実験にお いては、乳癌の日常的に処理したパラフィンブロックをウィスコンシン大学病理 保菅庫から得た。そのようなスライドをオーブン中（５５−６０℃）で乾燥した 後、キシレンを数回代えながらパラフィンを除去し、一連の段階的な比のアルコ ール／水で水和した。公知の陽性対照を前記試験した場合と同様に処理した。抗 原回復（retrieval）のためにスライドを１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中で ２０分間マイクロウエーブ処理した後、流水で２０分間冷却した。スライドにバ ーコードを付け、１×ＡＰＫ洗浄溶液に入れた(全ての器具および試薬は特に記 載のない限りヴェンタナ・バイオテク・システムズ(Ventana Biotek Systems)、 ツーソン、ＡＺ、から入手した)。 スライドを自動免疫染色器（Ventana gen¹¹）上に、標準インキュベーション 時間および温度でかけた。抗ＮＧＡＬアフィニテイー精製ウサギ抗血清または免 疫前ＩｇＧを陰性対照として、１.７５μｇ ／ｍｌ濃度、３７℃で３０分間用いた。ジアミノベンチジン基質を用いるビオチ ン−アビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ法を用いて抗原を検出した 。スライドをこの機器でヘマトキシリン（シグマ、セントルイス、ＭＯ）で対比 染色した。全スライドを染色器から取り出し、洗剤水ですすぎ、カバーグラスオ イルを除去した。スライドを一連の段階的アルコールで脱水し、キシレンを数回 取り代えて清浄にした後、カバーグラスを合成固定媒体と共に載せた。ＮＧＡＬの免疫組織化学的定位 乳腫瘍は、癌において高い陽性反応性（褐色染色）を示し、その外側は隣接正 常管以外はほとんど着色しなかった。この結果からＳ期と関係しない一般炎症は ＮＧＡＬの原因ではないことが確認された。 有用性 本発明は医学的スクリーニングのために、および診断手段として有用であると 考えられる。若干の既存の生検法は分析用の凍結またはパラフィン埋封切片の作 製を既に含むため、本発明は補助的診断手段として容易に実施できる。 上記の好適実施態様は本発明の単なる例に過ぎないことが理解されるであろう 。この他にも多くの変形が請求の範囲の範囲内にあると考えられる。例えば、我 々は低濃度のＮＧＡＬが低濃度のエストロゲン受容体タンパク質および低濃度の プロゲステロン受容体タンパク質とも相関することを確認した。既知濃度のエス トロゲン／プ ロゲステロンの試料（例えば既知の方法で測定された）を用いて、エストロゲン ／プロゲステロン濃度に対するＮＧＡＬ免疫組織化学的分析試験の標準曲線を容 易に作成することができる。 本発明は他のＮＧＡＬ分析試験における偽陽性をチェックする技術も提供する 。我々の試験ではＮＧＡＬ陽性の４％までが、癌とは無関係の組織の意義のある （significant）ＮＧＡＬを示した。 このため、本発明の全範囲を判断するためには請求の範囲を参照するべきであ る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ステーツ，ステイーブン ピー. アメリカ合衆国 07960 ニユージヤージ ー モーリスタウン ウイザースプーン コート 40

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 請求の範囲 １． （ａ）ヒト乳癌試料を採取し、 （ｂ）ＮＧＡＬタンパク質に特異性を有する抗体を用いて前記試料中のＮＧＡ Ｌタンパク質に結合させ、 （ｃ）前記抗体に結合したマーカーを用いて前記癌中におけるＮＧＡＬタンパ ク質の存在の程度を示す ことを含んでなるヒト乳癌の相対的増殖度を決定する方法。 ２． 前記試料が前記癌に隣接する組織も含み、前記マーカーが前記隣接組織中 におけるＮＧＡＬタンパク質の存在の程度も示す請求項１記載の方法。 ３． 前記方法が、前記試料が切片で、前記マーカーがＮＧＡＬタンパク質の存 在を示す可視色を作り出すような、免疫組織化学的染色分析試験である請求項２ 記載の方法。 ４．前記癌中におけるＮＧＡＬタンパク質の存在の程度を用いて、前記癌中にお けるエストロゲン受容体タンパク質およびプロゲステロン受容体タンパク質の存 在の程度を決定する段階をさらに含む請求項１記載の方法。