JP2000507260A

JP2000507260A - 少なくとも三つのトランス遺伝子を発現する抗腫瘍性細胞組成物

Info

Publication number: JP2000507260A
Application number: JP9534086A
Authority: JP
Inventors: マジド、メターリ; ホルスト、ホーマン; イブ、ポワトバン
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1996-03-25
Filing date: 1997-03-25
Publication date: 2000-06-13
Also published as: AU729908B2; WO1997035995A1; AU2511897A; EP0906441A1; CA2250332A1

Abstract

(57)【要約】少なくとも３つの抗腫瘍治療遺伝子、特に免疫刺激性および／または細胞障害性遺伝子の発現を可能とする細胞集団を含んでなる新規な抗腫瘍組成物が開示される。また、インターロイキン−２を発現するパッケージング細胞およびガンマ−インターフェロンおよび単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）のチミジンキナーゼ遺伝子を発現するレトロウイルスのベクター、ならびに癌を予防および治療するためのそれらの使用が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】少なくとも三つのトランス遺伝子を発現する抗腫瘍性細胞組成物本発明の目的は、ヒトまたは動物における治療または予防のための細胞組成物である。さらに詳しくは、細胞組成物は抗腫瘍作用を有する少なくとも３つの治療遺伝子組合わせを発現することができる細胞集団を含んでなる。また、本発明は、癌腫学の分野におけるこのような組成物の治療的使用に関する。過去１０数年の間、腫瘍を排除する可能性、あるいは遺伝子転移の技術による腫瘍の進行の遅延の失敗が、多くの刊行物に記載されている。実施された多くの臨床的実験は、癌の遺伝子治療の重要性を示している。大部分のプロトコールはレトロウイルスベクターを使用する。なぜなら、レトロウイルスベクターは分裂する細胞の中に組込まれて抗腫瘍関係遺伝子を転移する能力を有するからである。これらのベクター、ならびにそれらの産生を可能とする包膜系統は、多くの先行技術の文献に記載されている。特に、腫瘍に対する細胞の免疫応答を誘発または活性化できる免疫刺激遺伝子（免疫治療）、腫瘍遺伝子を発現する細胞に対して毒性を与える細胞障害遺伝子、および抗ガン遺伝子（腫瘍抑制遺伝子またはガン遺伝子の活性を阻害できる遺伝子）の転移について、いくつかのアプローチが考察されてきている。これらの種々のアプローチは先行技術において要約されている（例えば、下記の文献を参照のこと：Moolten、1994、Cancer Gene Therapy 1、279-287;Anderson、199 4、Human Gene Therapy 5、1-2、VileおよびRussel、1994、Gene Therapy 1、88-89;CulverおよびBlaese、1994、Trends in Genetics 10、174-178;Zie r et al.、1996、Immunology Today、17、39-45）。免疫治療は、腫瘍細胞をいっそう免疫原性としかつ宿主の抗腫瘍免疫応答を強化する目的で、サイトカインおよび共同刺激分子をコードする遺伝子の転移に基づいて実施されている。サイトカインはこうしてネズミのモデルにおいて評価され、抗腫瘍性質が証明されたサイトカインは、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファ型、ＧＭ-ＣＳＦ（顆粒球−マクロファージのコロニー刺激因子について）およびインターフェロン（ＩＦＮ）である。したがって、ＩＬ−２を産生する異種細胞は抗腫瘍作用を示した（欧州特許（ＥＰ）第０，５７９，７９１号を参照のこと）。細胞障害アプローチは、その産物が不活性の前駆体を高度に細胞障害性の産物に変換することができる、いわゆる自殺遺伝子を転移することによって、化学療法に対する腫瘍細胞の感受性を特異的に増加することにある。現在まで最も広く使用されている遺伝子は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）酵素をコードする単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）ｔｋ遺伝子であり、これはアシクロビア（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）およびガンシクロビア（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）をヌクレオシドのリン酸化類似体に変換する性質を有する。次いで、これらの異常なヌクレオシドは、細胞分裂の間に、新しく形成した染色体ＤＮＡ鎖の中に組込まれ、その結果遺伝的複製は阻害され、そして分裂する腫瘍細胞は死亡する（Moolten、986、Cancer Res.46、5276-5281）。このアプローチの更なる利点は付近の細胞に対する細胞障害性の伝播から生ずるバイスタンダー(bystander) 作用により付与され、それらの細胞を破壊する（Freeman、1993、Cancer Res.5 3、5274-5283）。したがって、ｔｋ遺伝子を有するレトロウイルスは、ガンシクロビアの投与後に細胞の自殺を誘発する目的で、悪性脳腫瘍の治療の関係において使用されてきている（Izquierd et al.、1996、Gene Therapy 3、491-495 ）。同一目的で、出願ＷＯ９５／０６４８６号明細書において、細胞障害性遺伝子を発現するレトロウイルスのベクターを産生するネズミ繊維芽細胞の注入が提案されている。最後に、抗ガン遺伝子戦略は、腫瘍サプレッサー遺伝子（例えば、網膜芽細胞腫またはｐ５３に関連する遺伝子）の機能的コピーを腫瘍細胞の中へ導入することに基づくか、あるいは、癌細胞の増殖を減少または壊滅する目的で、ガン遺伝子のメッセンジャーＲＮＡを分解できるアンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムをコードする遺伝子の転移により、オンコジーンの発現を阻害することに基づく。多数の最近の実験の抗癌プロトコールは、いくつかの治療遺伝子を組合わせて相乗的効果を得ることを提案している（例えば、下記の文献を参照のこと：出願 PCT/FR94/00192号;Rosenthal et al.、1994、Blood 83、1289-1298;0’Malle y et al.、1996、Cancer Res.56、737-1741;Lollini et al.、1995;Human GeneTherapy 6、743-752）。しかしながら、多数の治療遺伝子およびそれらの多様性から、現在、すべてのこれらの研究によっても、明瞭に同定すべき所定の腫瘍の治療に、分子または分子の組合わせを最良の状態で適用させることができない。ＩＬ−２を分泌しかつＨＳＶ−１ウイルスのｔｋ遺伝子およびＩＦＮγを発現するレトロウイルス粒子を産生するために、遺伝的に修飾された細胞を基礎とする抗腫瘍組成物が同定された。このような組成物は、腫瘍細胞の特異的死亡を誘発し、抗原をよりよく提示し、そして宿主の免疫細胞を刺激することによって、細胞の増殖を阻害または遅延することを可能とする。本発明は、ヒトまたは動物において癌を治療する先行技術に対する有効な代替技術を提供する。したがって、本発明の主題は、少なくとも３つの抗腫瘍治療遺伝子の発現を可能とする細胞集団を含んでなる抗腫瘍組成物である。「抗腫瘍治療遺伝子」は、その発現産物が抗腫瘍作用を有する遺伝子、特に特異的に腫瘍に対して向けられた免疫を増強し、および／または細胞分裂を少なくとも部分的に阻害する抗腫瘍作用を有する遺伝子を意味する。好ましくは、抗腫瘍治療遺伝子は免疫応答のための免疫刺激性ポリペプチドおよび／または細胞障害性ポリペプチドをコードする遺伝子である。「免疫刺激性」は、腫瘍細胞および抗原に対して向けられた抗体の産生を増強することができるポリペプチド、あるいはＴリンパ球を活性化して、細胞障害性応答または腫瘍細胞に対する有意な遅延された過敏型の応答を誘発することによって、細胞仲介免疫応答を刺激することができるポリペプチドを意味すると理解される。「細胞障害性」は、独立的に投与することができる薬剤により、直接的または間接的に、細胞の死亡を誘発することができるポリペプチドを意味すると理解される。本発明の範囲内で使用できる免疫刺激性遺伝子の中で、下記のものをコードする遺伝子を考慮することができる：サイトカイン、特にインターロイキン（ＩＬ）、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、共同刺激因子、例えば、ポリペプチドＢ７．１およびＢ７．２、およびクラスＩＩの組織適合性抗原の発現を活性化する因子。現在までに、１６のインターロイキンが同定されてきた。それらは多面発現的効果を発揮するので、特定の機能をそれらに帰属させることは特に困難である。本発明の範囲内で、すべてのインターロイキンは重要性を有するが、特にＩＬー２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２を挙げることができる。これに関して、ＩＬ−２は特に好ましい。それは活性化されたＴリンパ球の増殖に関係し、ＩＦＮγに関連して、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＴ細胞を刺激する。さらに、ＩＬ−２が腫瘍のレベルにおいて産生されるとき、それはリンパ球について化学走性的役割を有することを、いくつかの研究は示しているように思われる。インターフェロンは抗ウイルスおよび免疫調節性質を有する。インターフェロンは主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）のクラスＩおよびＩＩの表面抗原の発現を増加し、また、ＮＫ細胞および腫瘍細胞に対するリンホカインにより活性化された細胞（リンホカイン活性化キラーについてＬＡＫ）の細胞障害性を刺激する。ＩＦＮの３つの主なクラス、それぞれ、α、βおよびγは本発明の範囲内で重要であるが、ＩＦＮγが最も好ましい。コロニー刺激因子は、造血幹細胞の成熟および血流中の成熟細胞へのそれらの分化に関係する。ＧＭ-ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦ（それぞれ、顆粒球−マクロファージ、顆粒球およびマクロファージ）を、成熟段階およびこれらの因子が影響を発揮する細胞の型に従い区別することができる。腫瘍壊死因子に関すると、マクロファージにより産生されるＴＮＦαおよびＴリンパ球より産生されるＴＮＦβに区別することができる。双方はマクロファージおよびリンパ球の抗腫瘍細胞障害活性、および炎症反応において観察される組織の局所的損傷に関係する。細胞障害遺伝子の中で、下記のものをコードする遺伝子を挙げることができる：チミジンキナーゼ、特に単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）のチミジンキナーゼ（ＴＫ）、シトシンデアミナーゼ、シトクロムＰ４５０２Ｂ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｅｏＤ遺伝子によりコードされるプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ニトロレダクターゼおよびβ−グルコロニダーゼ。一般に、これらの毒性遺伝子は文献に記載されている（例えば、Moolten、1994、Cancer Gene Therapy 1、279-287）。本発明の他の好ましい態様によれば、本発明の範囲内で使用される３つの治療遺伝子はポリペプチドＨＳＶ１−ＴＫ、ＩＬ−２およびＩＦＮγをコードする。本発明による抗腫瘍組成物が意図する宿主において免疫刺激遺伝子が機能的であることができるように、免疫刺激遺伝子の起源を選択する。ヒト宿主の場合において、ヒトＩＬ−２およびＩＦＮγのコーディング配列を選択することが好ましい。普通に使用される慣用技術に従うクローニング、ＰＣＲ、または化学的合成により、治療遺伝子を得ることができる。治療遺伝子は天然の遺伝子であるか、あるいは１またはそれより多いヌクレオチドの突然変異、欠失、置換および／または付加により天然の遺伝子から誘導される遺伝子であることができる。もちろん、治療遺伝子は転写調節の適当な因子ならびにそれらの発現を可能とする翻訳の開始および停止のシグナルを含むことができる。一般に、治療を望む宿主の細胞、好ましくはヒト細胞において機能的であるプロモーター領域を使用する。それは前記遺伝子の発現を自然に制御するプロモーター領域または異なる起源のプロモーター領域、例えば、真核性またはウイルス性遺伝子由来であるプロモーター領域であることができる。そのうえ、プロモーター領域は、調節配列、例えば、転写活性化因子（エンハンサー）を含有するように修飾することができる。選択するプロモーター領域は構成的または調節可能であることができ、後者の場合において、ある種の細胞のシグナルに応答する。治療すべき腫瘍が特定の細胞の型から誘導されるとき、組織特異的プロモーターを使用することが好都合である。また、特異的に腫瘍のシグナルに対して応答する（例えば、腫瘍細胞により過度に発現される因子に対して応答する）プロモーターの使用は、発現が腫瘍細胞に制限されるので、好都合であることが証明された。このようなプロモーターは一般に当業者に知られている。特に、下記のものを挙げることができる：ＳＶ４０（Simian Virus ４０）、ＰＧＫ（Adra et al. 、1987、Gene 60、65-74）、ＨＭＧ（ヒドロキシ−メチル−グルタリル補酵素Ａ）およびＴＫ（チミジンキナーゼ）のプロモーター：ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、Ｍｏ−ＭＬＶ（マロネーネズミ白血病ウイルス）のＬＴＲ（長い末端の反復）およびＩＦＮγにより活性化されるクラスＩのＭＨＣ抗原をコードする遺伝子のプロモーター。これらの例は限定的ではない。本発明の範囲内で、治療遺伝子はそれらの独立または一緒の発現を可能とする因子の制御下に配置することができる。換言すると、治療遺伝子はモノシストロン的またはポリシストロン的方法で発現されることができる。後者の場合において、第２シストロンのレベルにおける翻訳の再開始を可能とする因子、例えば、当業者によく知られている内部のリボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）を使用する。今日まで、多数のＩＲＥＳがウイルスのｍＲＮＡの５’領域、特にピコルナウイルス、例えば、灰白髄炎ウイルス（Pelletier et al.、1988、Mol.Cell .Biol.8、1103-1112）およびＥＭＣＶ（脳心筋炎ウイルス；Jang et al.、198 8、J.Virol.62、2636-2643）からのｍＲＮＡの５’領域において同定された。また、国際出願ＷＯ９６／０１３２４号明細書に記載されているＩＲＥＳを使用することができる。更に、本発明による抗腫瘍組成物を構成する細胞の外側において免疫刺激性ポリペプチドを分泌させることが有利であることがある。これに関して、対応する遺伝子はシグナル配列を含むこともできる。これは宿主細胞において機能的であるかぎり、天然のシグナル配列または異種配列を含むこともできる。もちろん、前記細胞集団は一次細胞または腫瘍細胞、細胞系統から由来するか、あるいは種々の治療遺伝子の発現を可能とする細胞の混合物を含んでなることができる。この態様を例示するために、細胞の混合物、例えば、Ｖｅｒｏ系統（ＡＴＣＣから入手可能である）由来の細胞、ＩＬ−２を発現する１つの部分、ＩＦＮγを発現する他の部分の混合物を、必要に応じてヴィリオンまたは細胞障害ＴＫ遺伝子を発現するウイルス集団の産生を可能とするレトロウイルスの包膜系統と組合わせて、使用することができる。もちろん、他の組合わせを考えることもできる。例えば、また、ＩＬ−２遺伝子の発現を可能とする系統（例えば、Ｖｅｒｏ）と、下記において定義する本発明によるレトロウイルスのベクターを含んでなる感染粒子の産生を可能とするレトロウイルスの包膜系統とを含んでなる細胞混合物を使用することができる。特に有利な態様によれば、本発明による抗腫瘍組成物を構成する細胞集団は、レトロウイルスのベクターを含んでなる感染粒子の産生を可能とするレトロウイルスの包膜細胞を含んでなるか、あるいはこれらから成る。一般に、安全性の理由で、レトロウイルスのベクターはウイルスのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の欠失または突然変異により欠陥があり、その結果、自律的に複製することができない。その増殖はそれが欠如するウイルスのポリペプチドの供給を必要とする。包膜細胞は、レトロウイルスのベクターが合成することができずかつ感染粒子の構築に必要であるポリペプチドのすべてをトランスで（ｉｎｔｒａｎｓ）提供することができる。好ましくは、本発明において使用する包膜細胞は、ヒト起源の系統、特に２９３系統由来である。２９３系統は、ＦＢ２９株のＦＭｕＬＶウイルス（フレンドネズミ白血病ウイルス）のｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子および両種性ウイルス４０７０Ａのｅｎｖ遺伝子の発現を可能とするベクターのトランスフェクションにより、発生させることができる。一例として、国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ９６／００４３９号明細書（その内容は引用することによって本明細書の一部とされる）に記載されているＥ１７を挙げることができる。本発明による好ましい抗腫瘍組成物は、ＩＬ−２をコードする遺伝子の発現を可能としかつ感染粒子（ＨＳＶ−１ウイルスのチミジンキナーゼをコードする遺伝子およびＩＦＮγをコードする遺伝子を発現するレトロウイルスのベクターを組込んでいる）の産生を可能とするベクターを含有する細胞集団を含んでなる。好都合な態様によれば、本発明の範囲内で使用する細胞集団はその排除を可能とする薬剤に対して感受性である。細胞集団がＨＳＶ−１ｔｋ遺伝子を発現する場合において、アシクロビア、特にガンシクロビア由来である薬剤の使用を考えることができる。細胞集団は、さらに、陽性選択マーカー、例えば、その選択を促進する抗生物質に対して耐性の遺伝子を発現することができる。抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（ネオマイシン）遺伝子、ｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）遺伝子、ｐａｃ（プロアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子（MorgensternおよびLand、1990、Nucleic Acids Res.18、3587-3596）、ヒグロマイシンＢ遺伝子およびｇｐｔ（キサンチンホスホリボシル）遺伝子を挙げることができる。また、本発明は、包膜細胞に関し、この包膜細胞は、２９３系統由来であり、かつ − ＦＢ２９株のＦＭｕＬＶウイルス（フレンドネズミ白血病ウイルス）のｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子、および両種性ウイルス４０７０Ａのｅｎｖ遺伝子、および − ＩＬ−２をコードする遺伝子の発現を可能とするベクター、を含んでなる。適当なベクターは後述するベクターｐＴＧ５３２４から成ることができ、ここでＩＬ−２の発現はＣＭＶ（サイトメガロウイルス）の初期プロモーターにより指令される。しかしながら、他の発現べクターをもちろん使用することができる。本発明の主題は、また、レトロウイルスのベクターであり、このレトロウイルスのベクターは、５’→３’の方向において、 − ５’ＬＴＲ、 − 包膜領域、 − ガンマ−インターフェロンをコードする遺伝子、 − 構成的な内部のプロモーター、 − ＨＳＶ−１ウイルスのチミジンキナーゼをコードする遺伝子、 − 内部のリボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、 − 陽性選択マーカーをコードする遺伝子、および − ３’ＬＴＲ、を含んでなることを特徴とする。本発明によるベクターは、任意のレトロウイルス由来であることができる。例えば、トリのレトロウイルス、例えば、トリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、鳥肉腫ウイルスー（ＡＳＶ）、牌臓ネクローシスウイルス（ＳＮＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ウシのレトロウイルス、ネコのレトロウイルス、ネズミのレトロウイルス、例えば、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、フレンドウイルス（Ｆ−ＭＬＶ）およびネズミ肉腫ウイルス (ＭＳＶ）および霊長類レトロウイルスを挙げることができる。しかしながら、マロネーネズミ白血病ウイルス（MoMuＬV）が最も好ましい。マロネーネズミ白血病ウイルス由来の、文献に記載されている多数のレトロウイルスのベクター、特にＮ２ベクターまたはその誘導体の１つを本発明の範囲内において使用することができる。本発明は、また、ヒトまたは動物における癌または癌の症状の治療または予防の薬剤の製造のための、本発明による抗腫瘍組成物、包膜細胞またはレトロウイルスのベクターの使用に関する。こうして治療できる癌は、好都合には固形腫瘍、例えば、腎臓、乳房、肺および結腸の癌および黒色腫である。本発明から誘導される薬剤は、普通の使用の一般的経路により、特に非経口的経路，例えば、全身的、筋肉内または腹腔内の経路により投与することができる。一般に、腫瘍内経路は、特に好都合であるので、推奨される。一般に、投与は単一の投与で、あるいは１回またはある時間間隔で数回の反復投与で実施することができる。本発明の他の好ましい態様によれば、薬剤は、さらに、薬学上許容される担体を含む。また、薬剤は薬学上許容されるビヒクル、希釈剤またはアジュバントを含んでなることができる。適当な投与量は、種々のパラメーター、例えば、投与の経路、治療すべき個体、腫瘍の症状の特質および重篤度、および使用する治療遺伝子の型に従い変化する。最後に、本発明の主題は、また、哺乳動物における癌の治療法であり、この方法に従い、薬学上有効量の本発明による抗腫瘍組成物、包膜細胞またはレトロウイルスのベクターを、このような治療を必要とする個体に、注射する。下記の実施例により、本発明を例示する。これらの実施例は本発明を限定しない。第１図は、ＣＭＶ初期プロモーターからのヒトＩＬ−２の発現を可能とするベクタ−ｐＴＧ５３２４を示す。それはＳＶ４０プロモーターにより指令される選択可能な遺伝子ｐａｃを含んでなる。第２図は、レトロウイルスのベクターｐＴＧ９３４４を示す。このベクターは５’ＬＴＲ、包膜領域、ネズミＰＧＫプロモーターにより指令されるビシストロン性発現カセット「ＨＳＶ−１ウイルスｔｋ遺伝子、次いでＥＭＣＶＩＲＥＳおよびｎｅｏ選択可能な遺伝子」を含んでなる。第３図は、イヌＩＦＮγをコードする遺伝子の挿入によりべクターｐＴＧ９３４４から誘導されるレトロウイルスのベクターｐＴＧ９３２６を示す。実施例後述する構築物は、Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．（1989、Laboratory Manual、Cold Spring Harbor,Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY )に詳述されている一般的遺伝子工学および分子クローニング技術に従うか、あるいは商用キット使用するとき、製造業者の推奨に従い製造される。細菌プラスミドを使用するクローニングエ程は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−ＢｌｕｅまたはＤＨ５ａ株（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中で実施することが好ましい。Ｍ１３ベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１１０またはＮＭ５２２株中で増幅される。制限部位の修復に関すると、この手順は突起５’末端を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩの大きいフラグメント（クレノー）の助けにより充填するか、あるいはＳ１ヌクレアーゼで消化し、次いでクレノーで処理することによって実施される。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅技術は当業者に知られている（例えば、PCR Protocols−A guide to methods and applications 、 1990、Innis、Gelfand、Sninsky and White、NAcademic Press,Inc.発行、を参照のこと）。下記の実施例において、ネズミ細胞系統ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＲＬ１６８５）、イヌ系統ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣＣＣＬ３４）、ネズミ黒色腫（ＡＴＣＣＣＲＬ６３２２）由来のＢ１６系統、ネズミ肥満細胞腫（ＥＣＡＣＣＮｏ．８７０４２３０１）由来のＰ８１５系統、Ｅ１７系統（国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ９６／００４３９号明細書に詳述されている）およびＰＡ３１７系統（MillerおよびButtimore、1986、Mol.Cell.Biol.6、2895-2902）。指針として、Ｅ１７系統はレトロウイルスの包膜系統であり、この系統はヒト２９３系統（Graham et al.、1977、J.Gen.Virol.36、59-72）から、それぞれ、ＦＢ２９株のＦＭｕＬＶウイルス（フレンドネズミ白血病ウイルス）のｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子および両種性ウイルス４０７０Ａのｅｎｖ遺伝子を発現するベクターのトランスフェクションにより誘導される。細胞を当業者によく知られている標準的技術に従いトランスフェクトする。カルシウム沈降技術を挙げることができるが、他のプロトコール、例えば、ＤＥＡＥデキストラン技術、エレクトロポレーション、浸透圧ショックによる方法またはリポソームの使用による方法を使用することもできる。培養条件に関すると、一般に、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、３ｇ／ｍｌのグルコース、２ｍＭのグルタミン、１％の非必須アミノ酸および４０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有するＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）を使用し、ただしＭＤＣＫおよびＰ８１５細胞については、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのグルタミン、１％の非必須アミノ酸および４０ｐｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地を使用する。ｎｅｏ遺伝子を発現するレトロウイルスのベクターで形質導入された細胞を、Ｇ４１８の存在下に１ｍｇ／ｍｌまたは５ｍｇ／ｍｌの最終濃度において培養する。Ｅ１７包膜細胞を選択因子プロマイシン（１μｇ／ｍｌ）の存在下に培養する。実施例１：ヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）を産生するレトロウイルスの包膜系統の構築（Ｅ１７−ＴＧ５３２４）ｈＩＬ−２をコードする配列をベクタ−ｐＴＧ３６（フランス国特許第８５０９４８０号に記載されている）からＰｓｔＩフラグメントの形態で単離し、ベクタ−Ｍ１３ＴＧ１３０（Ｋｉｅｎｙｅｔａｌ．、１９８３、Ｇｅｎｅ２６、９１−９９）の中にサブクローニングし、部位特異的突然変異誘発に付して、停止コドンより１２ヌクレオチド下流にＳａｌＩ部位を導入する（アマーシャム変異誘発キット、ＲＰＮ１５２３）。ｈＩＬ−２ｃＤＮＡを突然変異したベクターからＳａｌＩ消化により精製し、ウサギβ−グロビン遺伝子の、それぞれ、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルの３’および５’に位置するｐＢＣＭＧｎｅｏ１（Karasuyama and Melchers、1988、Eur.J.Immunol.18、97-104)のＸｈｏＩ部位の中に挿入する。ｐＴＧ５３２０が得られる。平行して、ｐＬＮＣＸ（MillerおよびRosman、1989、BioTechniques 7、980- 988）から精製されたＣＭＶウイルス（サイトメガロウイルス）の初期プロモーターを有するＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、同一酵素で処理したベクターｐｐｏｌｙＩＩＩ−Ｉ^*（Lathe et al.、1987、Gene 57、193-201 ）の中に導入する。ｐＴＧ５３２０から精製され、β−グロビンイントロン、ｈＩＬ−２ｃＤＮＡおよびβ−グロビンポリアデニル化シグナルを有するＳａｌＩ −ＢａｍＨＩフラグメントを、このプロモーターの下流に位置するＳａｌＩ部位とＢｇｌＩＩ部位との間に導入する。生ずるベクターｐＴＧ５３２１を酵素ＢａｍＨＩで線状化し、初期プロモーターの制御下に位置する選択可能な遺伝子ｐａｃおよびＳＶ４０ウイルスのポリアデニル化シグナルを含有するＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントを挿入する。こうして得られたベクターをｐＴＧ５３２２と表示する。最後に、ＢａｍＨＩで線状化された、先行するベクターの中に、ネズミ１２Ｓミトコンドリア配列を含んでなるＢａｍＨＩフラグメント（Luftalla et al. 、1985、Som.Cell.Mol.Genet.11、223-238）を挿入することによって、ベクターｐＴＧ５３２４（第１図）を発生させる。慣用のカルシウム沈降技術に従い、２０μgのプラスミドｐＴＧ５３２４を使用してＥ１７細胞を４０〜５０％の密度でトランスフェクトする。次の日に、トランスフェクトされた細胞をプロマイシンの存在下に配置する。選択培地中で２週後、耐性クローンを継代培養し、増殖させ、ｈＩＬ−２を分泌するクローンの能力を検査するために待機している間、液体窒素中で凍結する。これを実施するために、６ウェルの培養プレートを使用し、それらの中に試験すべき４×１０⁵ 細胞を接種する。次の日に、培地を交換し、２４時間後に収獲する。細胞の上清の中に存在するｈＩＬ−２の量をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Systems、Minneapolis、 D2050）により推定する。試験したクローンの約１／４は、２μｇ／ｍｌ／１0⁶ 細胞／２４時間を超える量のＩＬ−２を分泌する。Ｅ１７−５３２４−クローン２と表示し、３μｇ／ｍｌ／１０⁶細胞／２４時間のＩＬ−２を分泌する、最も産生的クローンを、引き続く研究のために選択する。Ｅ１７−５３２４細胞はヒトの治療における使用に意図されるので、ヒト補体により不活性化に対する耐性能力を試験することは好都合である。これを実施するために、５×１０⁴細胞を適当な支持体中の培地の中に入れる。次の日に、培地を取り出し、２つの異なる個体またはＦＣＳ（陰性の対照）から集めた０．５ｍｌの新鮮なヒト血清または熱不活性化ヒト血清（陰性の対照）に、細胞を暴露する。１５０分後、培養を慣用の培地中で２４時間続ける。トリプシンで処理し、トリパンブルーで染色した後、生活可能な細胞を計数する。また、実験を平行に２９３細胞（Ｅ１７細胞が由来する系統）、包膜系統ＰＡ３１７およびネズミ細胞３Ｔ３について実施する。期待されるように、試験したすべての系統の生活能力はＦＣＳまたは不活性化された血清への暴露により影響を受けない。他方において、新鮮な血清を使用する処理は３Ｔ３およびＰＡ３１７細胞の死を誘発する（生活能力＜０．０１５％）。この現象は２９３細胞（血清に依存して８０％および１００％の生活能力）で観察されず、またＥ１７−５３２４細胞（７５％および７０％の生活能力）で観察されない。実施例２：レトロウイルスのベクターｐＴＧ９３４４の構築レトロウイルスのベクターｐＴＧ９３４４は細胞障害遺伝子、この場合においてＨＳＶ−１ｔｋ遺伝子および陽性選択のｎｅｏ遺伝子、のビシストロン的発現を可能とする。親ベクターはｐＬＸＳＰであり、これはｐＬＸＳＮ（MillerおよびRosman、1989、上掲）から誘導される。プラスミドＰＫＪ−Ｉ（Adra et al .、1987、Gene 60、65-74）からＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメント（転写開始部位に関して位置−５１７〜−２０）の形態で得られたＰＧＫプロモーターを、包膜領域の下流に導入する。ｔｋ遺伝子をベクターｐＴＫ−１（Spandidos et al.、1982、Exp.Cell.Res.141、149-158;Wagner、1981、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 78、1441-1445）から単離し、ｐＢＲ３２８（CovarrubiasおよびBolivar、 1982、Gene17、79-82）のＢａｍＨＩ部位の中にサブクローニングする。非コーディング３’領域をＳｍａＩ−ＸｂａＩ消化により排除し、オリゴヌクレオチドｏＴＧ４３２２およびｏＴＧ４３２３（配列番号１および２）の再アソシエーションから生ずるＳｍａＩ−ＸｂａＩアダプターを導入し、これによりＳｍａＩ部位の３’に位置する少なくとも７つのコドンを再構築し、停止コドン後４塩基対（ｂｐ）にＸｂａＩ部位をつくることができる。次いで、こうして修飾されたｔｋ遺伝子を１１９１ｂｐのＢｇＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメントの形態で単離し、ＰＧＫプロモーターの下流に挿入する。次いでＥＭＣＶウイルスのＩＲＥＳ部位をｔｋ遺伝子の下流に挿入して、ビシストロン性ｍＲＮＡの第２シストロンの翻訳の再開始を可能とする。それをベクターＩＲＥＳ−βｇｅｏ（国際出願ＷＯ９４／２４３０１号明細書に記載されている）からＸｂａＩ−ＮｃｏＩ消化により単離する。最後に、同一酵素で切断し成されたＢｇｌＩＩ−ＳｍａＩフラグメントの形態でｎｅｏ遺伝子をＩＲＥＳ配列の下流に挿入する。最終ベクターｐＴＧ９３４４を第２図に示す。ＩＲＥＳ部位からの翻訳の再開始はキャップされたｍＲＮＡからの開始よりも効率が低いことは知られている。ベクターｐＴＧ９３４４由来の粒子により形質導入された細胞に関すると、選択因子Ｇ４１８に対する耐性はＥＭＣＶＩＲＥＳからの再開始の効率に依存する。結局、培養を選択的培地中で実施するとき、大量のビシストロン性ｍＲＮＡを産生する細胞のみが生存することができ、これにより高いレベルのｔｋ遺伝子の発現が保証される。実施例３：イヌＩＦＮγを含有するレトロウイルスのベクターｐＴＧ９３２６の構築ベクターｐＴＧ９３４４は、５’ＬＴＲレトロウイルスのプロモーターの制御下に追加の遺伝子の挿入を可能とするユニークＥｃｏＲＩ制限部位を含んでなる。コンカナバリンＡにより刺激されたイヌＴリンパ球から単離された細胞のＲＮＡから、イヌＩＦＮγをクローニングする。デジェネレイトプライマーｏＴＧ４０３１（配列番号３）を使用して、細胞のＲＮＡを逆転写する。特異的フラグメントを２段階で増幅する。最初に、ｏＴＧ４１６９およびおよびｏＴＧ４１７０（配列番号４および５）により、内部のフラグメントを生成する。次に、２つの特異的オリゴヌクレオチドｏＴＧ４３２１およびｏＴＧ４３１９（配列番号６および７）を２つのオリゴ−ｄＴアダプターおよびプライマーと組み合わせて使用して、ＲＡＣＥ法（Frohman et al.、1988、Proc．Natl.Acad.Sci.USA 85、89 98-9002）に従い５’および３’フラグメントを発生させる。２つのＰＣＲフラグメントをＳｐｈＩおよびＡｆｌＩＩで切断した後、Ｍ１３ＴＧ１３１（Kieny et al.、1983、上掲）のＳｐｈＩ部位の中に挿入し、慣用技術による配列分析に付す。データによりＺｕｃｋｅｒｅｔａｌ．（1992、J.Interferon Res.12、 191-194）が発表した配列と同一であることを確認する。前のベクターＭ１３ＴＧ８１７３をＰＣＲにより鋳型として使用して、２つの変異誘発プライマーｏＴＧ６２７２およびｏＴＧ６７８８（配列番号８および９）により、ＩＦＮγ配列を単離し、これにより、それぞれ、開始コドンおよび停止コドンの上流および下流にＥｃｏＲＩ部位を導入することができる。ＥｃｏＲＩで切断した後のＰＣＲ生成物をベクターｐＴＧ９３４４の中にクローニングして、ｐＴＧ９３２６（第３図）を生成する。実施例４：ネズミＩＦＮγを含有するレトロウイルスのベクターｐＴＧ９３３７の構築配列のデータ（GrayおよびGoeddel、1983、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80、584 2-5846）に基づいてＰＣＲにより、プライマーｏＴＧ７２９５およびｏＴＧ７２９６（配列番号１０および１１）により、ネズミＩＦＮγを単離する。ｐＴＧ９３４４のＥｃｏＲＩ部位の内部においてＥｃｏＲＩで切断した増幅フラグメントの挿入から、レトロウイルスのベクターｐＴＧ９３３７が得られる。実施例５：ヒトＩＦＮγを含有するレトロウイルスのベクターの構築ｐＴＧ２３（Tessier et al.、1984、Nucleic Acids Res.12、7663-7676）から単離されたＩＦＮコーディング配列を、ベクターＭ１３ＴＧ１３１の中にサブクローニングすることによって得られるベクターＭ１３ＴＧ２４３７から、ＰＣＲにより、ヒトＩＦＮγを単離する。プライマーｏＴＧ６１４７およびｏＴＧ４９８３（配列番号１２および１３）を使用する。増幅されたフラグメントをＳ１ヌクレアーゼで処理し、次いでクレノーで処理した後、中間体ベクターの中にクローニングし、これからヒトＩＦＮγを単離して、ｐＴＧ９３４４のＥｃｏＲＩ部位の中に挿入することができる。実施例６：ｈＩＬ−２を分泌しかつレトロウイルスのベクターｐＴＧ９３２６を産生する包膜系統の構築Ｅ１７細胞をリン酸カルシウム法により１０μｇのプラスミドｐＴＧ９３２６およびｐＴＧ５３２４の各々でトランスフェクトし、トランスフェクション後２４時間に、選択的培地（１μｇ／ｍｌのプロマイシンおよび１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８）中で培養する。１４日後、耐性細胞を限界希釈法によりサブクローニングする（９６ウェルのプレート中の培地の中に２００μｌ／ウェルの希釈物を１．５細胞／ｍｌの密度で入れる）。２週の培養後、慣用法により、細胞のクローンを回収し、増幅する。クローンを培地の中に４×１０⁵細胞の量で入れる。培地を交換した後、２４時間の培養上清を収獲し、これから分泌されたｈＩＬ−２およびＩＦＮγの量を推定する。ｈＩＬ−２に関し、前述のＥＬＩＳＡ法（Ｒ＆Ｄ Systems、Minneapolis、D2 050）を使用する。イヌ腎臓の上皮細胞系統ＭＤＣＫ（Steward II、in The I nterferon System、pp.17-19、Springer-Verlag、NY;Familletti et al.、19 81、Methods Enzymology 78、387）に対するＶＳＶウイルス（小胞性口内炎ウイルスＩｎｄｉａｎａ株、ＡＴＣＣＶＲ１５８）の細胞変性作用を阻止する方法により、ＩＦＮγをアッセイする。簡単に述べると、３×１０⁴ＭＤＣＫ細胞／ウェルを９６ウェルのマイクロタイタープレート中の培地の中に入れ、次いでプロマイシンおよびＧ４１８に対して耐性のクローンから得られる上清の連続希釈物を添加する。次に、細胞を１０³ｃｆｕ（コロニー形成単位）のＶＳＶウイルスに暴露し、２４時間後に細胞変性を測定する。ＩＦＮγは細胞をＶＳＶ感染に対して耐性とする。結果を任意の単位として記載し、これらの単位は５０％の保護が得られる希釈の逆数に相当する。対照細胞は９０％より大きい細胞変性を示す。最後に、１〜２×１０⁵の許容性３Ｔ３細胞を感染させることによって、これらのクローンによるレトロウイルス粒子の産生を評価する。２４時間の培養後、２００μｌの試験すべき細胞上清の１０倍連続希釈物および２００μｌの１６μ ｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を含有する培地に、それらを９０分間暴露する。培養を開始時の慣用の培地中で続け、次いで感染後２４時間に選択的培地（５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８）中で続ける。２週後、耐性であるコロニーをクリスタルバイオレット（１０％エタノール−９０％水の混合物中の０．０５％）で染色する。産生クローンの上清中に存在するレトロウイルス粒子の数を、Ｇ４１８に対して耐性である３Ｔ３コロニーの数から計算する。１μｇ／ｍｌ／１０⁶細胞／２４時間のｈＩＬ−２、３２Ｕ／ｍｌのＩＦＮγおよび４．５×１０⁶ｃｆｕ／ｍｌのウイルス粒子を産生するクローン（以後Ｅ１７−ＴＧ５３２４＆ＴＧ９３２６＃２８と表示する）を選択する。実施例７：ｈＩＬ−２を分泌しかつレトロウイルスのベクターｐＴＧ９３３７を産生する包膜系統の構築細胞Ｅ１７−５３２４を２０μｇのプラスミドｐＴＧ９３３７でトランスフェクトし、耐性クローンをＧ４１８培地（１ｍｇ／ｍｌ）中で選択する。サブクローニング後、ｈＩＬ−２、ネズミＩＦＮγおよびウイルス粒子の力価の分泌により最も産生的なクローンを評価する。ＥＬＩＳＡ試験（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、マサチュセッツ州、Ｎｏ．８− ６７１６）により定量されるネズミＩＦＮγのアッセイ技術以外は、前の実施例に記載されている方法を使用する。選択したクローンＥ１７−ＴＧ５３２４＆ＴＧ９３３７＃３３は、１μｇ／ｍｌ／１０⁶細胞／２４時間のｈＩＬ−２、６０ｎｇ／ｍｌ／１０⁶細胞／２４時間のＩＦＮγを産生し、そして１．３×１０⁶ｃｆｕ／ｍｌのウイルス力価を示す。実施例８：標的細胞のトランスダクション産生系統Ｅ１７−ＴＧ５３２４＆ＴＧ９３２６およびＥ１７−ＴＧ５３２４＆ＴＧ９３３７から産生されたウイルス粒子が標的細胞を形質導入することができること、および治療遺伝子の発現が細胞の関係において悪影響を受けないことを検査する。この研究は確立されたネズミ系統（３Ｔ３細胞）および２つの一次系統（Ｐ３Ｄ６ＭおよびＰ３Ｄ４Ｍ細胞）について実施する。後者はイヌ黒色腫由来であり、免疫不全ＳＣＩＤマウス上の１継代に付して、均質一次系統を発生させる。継代５段階における２×１０⁷細胞を皮下経路により動物に注射する。腫瘍を３週後に取り出し、骨髄腫細胞を慣用の条件下に培養して維持する。標的細胞を培地中に１〜２×１０⁵細胞／ウェルの量で入れ、次の日に、前もって０．４５μｍの膜を通して濾過した０．５ｍｌの産生細胞の培養上清で感染させる。感染を１〜２時間続け、次いで細胞を再び新鮮な培地の中に入れる。通常、２つのトランスダクションサイクルを同一の日に実施し、形質導入された細胞をＧ４１８（５ｍｇ／ｍｌ）の存在において培養する。耐性コロニーが出現するまで培地を３日毎に交換し、コロニーのガンシクロビアに対する感受性を評価する。この試験において５×１０⁶細胞を使用し、これらの細胞を、培地の中に入れた次の日に、０〜１０００μＭの濃度のガンシクロビアの存在下に置く。１週後、細胞の生活能力をトリパンブルー試験により測定する。培養をガンシクロビアの非存在において実施したウェルにおいて計数した細胞の数は１００％を表す。レトロウイルスのベクターｐＴＧ９３２６およびｐＴＧ９３３７由来の粒子により形質導入された標的細胞の３つの型ならびに対応する産生系統は、ガンシクロビアに対して感受性であることを結果は示す。換言すると、それらの生活能力は低い投与量のガンシクロビア（ＬＤ５０、すなわち、５０％の生活能力が得られるガンシクロビアの濃度、０．１μＭより低い）の存在下に影響を受けるが、非形質導入細胞は非常に高い濃度（ＬＤ５０＞１０μＭ）に対して耐性である。これらの結果が示すように、形質導入された腫瘍細胞中のｔｋ遺伝子の発現レベルは、正常細胞に対して非毒性であるガンシクロビアの投与量に対してそれらを感受性とするために十分に高い。実施例９：バイスタンダー効果形質導入された細胞における細胞障害性バイスタンダー効果を誘発するベクターｐＴＧ９３４４のウイルス粒子の能力を検査する。第１の場合において、一次Ｐ３Ｄ６Ｍ細胞をウイルス粒子ｐＴＧ９３４４で形質導入し、影響を受けた細胞をＧ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）の存在下に選択する。次に、非形質導入されたＰ３Ｄ６Ｍ細胞およびある百分率の形質導入された培養物（それぞれ、０、１０、３０、５０、８０および１００％）を含有する同時培養物を調製する。同時培養物をガンシクロビア（１μＭ）の存在下に７日間維持し、細胞の生活能力をトリパンブルーを使用する染色により推定する。この濃度はチミジンキナーゼを発現する形質導入された細胞に対して毒性であるように選択された（１００％の試験について３％の生存する細胞）が、それは自殺遺伝子を発現しない細胞の生活能力に影響を与えないか、あるいはわずかにのみ影響を与える（０％の試験について８６％の生存する細胞）ことが示される。同時培養試験に関すると、ガンシクロビアは低い百分率の形質導入された細胞においてさえ顕著な毒性作用を発揮する。細胞混合物がわずかに１０％の形質導入された細胞を含有するとき、生活能力の著しい減少が既に観察される（１０％の試験について１８％の生存する細胞および３０％の試験について５％）。この結果が示すように、ベクターｐＴＧ９３４４は影響を受けた細胞の細胞障害性を誘発しかつこの作用を隣接する非形質導入細胞に伝達するために十分な量のＴＫを発現する。実施例１０：形質導入された細胞におけるクラスＩおよびＩＩのＭＨＣ抗原の発現の誘発この研究は、ベクターｐＴＧ９３２６およびｐＴＧ９３３７が担持するＩＦＮ γ遺伝子の機能性を検査することを意図する。ＩＦＮγの生物学的作用の１つは、クラスＩおよびＩＩのＭＨＣ抗原の発現を誘発することである。Ｐ８１５（ネズミ肥満細胞腫）およびＢ１６（ネズミ骨髄腫）細胞を陰性対照としてベクターｐＴＧ９３４４（ｔｋ−ｎｅｏ）またはｐＴＧ９３３７（ネズミＩＦＮγ−ｔｋ−ｎｅｏ）で形質導入し、そして影響を受けた細胞の表面におけるクラスＩおよびＩＩの抗原の存在を慣用の免疫蛍光およびフロー・サイトメトリー（ＦＡＣＳ）技術により測定する。Ｐ８１５およびＢ１６細胞の表面に存在するクラスＩＩのＭＨＣ抗原を、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）にカップリングした抗マウス抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）により検出する。クラス１抗原の検出のために、抗Ｈ２Ｋ^b抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎｅ）をＢ１６細胞について使用し、そして抗Ｈ２Ｋ^d 抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎｅ）をＰ８１５細胞について使用する。感染させ、選択的培地（Ｇ４１８、５ｍｇ／ｍｌ）中で約２週間維持した後、細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１０ｍＭのＥＤＴＡの作用により分離し、下記の緩衝液中の２回洗浄する（ＰＢＳ、１％のウシ血清アルブミン、０．１％のヒトガンンマグロブリン、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび０．０２％のアジ化ナトリウム）。１×１０⁶細胞を４℃において暗所で、２００μｌの前述の抗体の各々の１：５０の希釈物の存在下に、あるいは、陰性対照として、抗体の非存在下にまたは非特異的抗体（抗マウスＣＤ８）の存在下に、４５分間インキュベートする。洗浄後、細胞を固定し（ＰＢＳ緩衝液中の２％のホルムアルデヒド）、ＦＡＣＳ（Becton Dickinson サイトメーター、カリフォルニア州サンジョーズ）により分析する。これらの結果が示すように、癌ネズミ細胞Ｂ１６およびＰ８１５の表面におけるクラスＩのＭＨＣ抗原の発現（Ｐ８１５細胞について８０％およびＢ１６細胞について９５％）は、ベクターｐＴＧ９３３７の転移により高度に誘発され、後者が機能的ＩＦＮγを発現することを示す。他方において、ベクターｐＴＧ９３４４により形質導入されたＰ８１５およびＢ１６細胞は蛍光を示さない（０％）。さらに、形質導入された細胞についての蛍光の強度は、未処理細胞を使用して得られた強度よりも約３０〜４０倍大きい。したがって、クラスＩ抗原について陽性細胞の大きい数およびＩＦＮγの発現によるこれらの細胞の表面における発現の強度は、癌細胞を排除する目的で、免疫エフェクター細胞のよりよい認識に寄与する。クラスＩＩのＭＨＣの発現は弱く誘発される。ベクターｐＴＧ９３２６（イヌＩＦＮγ−ｔｋ−ｎｅｏ）または、陰性の対照として、ｐＴＧ９３４４（ＩＦＮγの発現なし）およびｐＴＧ９３３７（ネズミＩＦＮγの発現）で感染させた一次イヌ細胞Ｐ３Ｄ６Ｍについて、同様な実施例を実施する。クラスＩおよびＩＩのＭＨＣ抗原を、それぞれ、抗Ｈ２ｋ^k分子を認識するモノクローナル抗体Ｈ５８Ａ、およびイヌを包含するいくつかの種からのＤＲアレレ同等物に対して向けられたＴＨ１４Ｂ抗体（VRMD Inc.、ワシントン州プルマン）（Davis et al.、1987、Vet.Immunol.Immunopathol.15、337-3 76）により検出する。免疫染色を前述したように実施するが、ただし抗体溶液とインキュベートした後、細胞を２００μｌのＦＩＴＣに結合した抗マウス免疫グロブリンＧウサギ抗体の１：２５６希釈物を含有する洗浄緩衝液の存在下に配置する。４℃において暗所で４５分間接触させた後、細胞を洗浄し、固定し、クラスＩおよびＩＩの抗原の存在をＦＡＣＳにより評価する。これらの結果が示すように、クラスＩおよびＩＩのＭＨＣ抗原の発現は、ベクターｐＴＧ９３２６により形質導入された一次癌細胞Ｐ３Ｄ６Ｍの９５％より多い表面において強く誘発される。ＩＦＮγを発現する形質導入された細胞についての蛍光強度は、未処理細胞を使用して得られた強度よりも、クラス１のＭＨＣについて約２５倍大きく、そしてクラスＩＩのＭＨＣにっいて３００倍大きい。ベクターｐＴＧ９３４４およびｐＴＧ９３３７で形質導入されたＰ３Ｄ６Ｍ細胞において、誘発は存在しない。実施例１１：ｉｎｖｉｖｏにおける評価ネズミＢ１６細胞をベクターｐＴＧ９３４４およびｐＴＧ９３３７で形質導入するか、あるいは、陰性対照として、β−ガラクトシダーゼをコードするＬａｃｚマーカー遺伝子を発現するレトロウイルスのベクター（ｐＴＧ５３９１）で形質導入する。感染した細胞をＧ４１８の存在下に１４日間選択し、トリプシン処理し、ＰＢＳ緩衝液中に２×１０⁷細胞／ｍｌの密度で再懸濁させる。この懸濁液の１００μｌを免疫担当Ｆ１世代Ｂ６／Ｄ２マウスに皮下注射する。２日後および次の６日間、動物にガンシクロビア（１００ｍｇ／ｋｇ／日）を腹腔内注射し、移植後４４日までに腫瘍の数および腫瘍の大きさを検査する。対照として、平行して非形質導入細胞で処理したマウス、および形質導入するが、ガンシクロビア（ＧＣ）で処理しない細胞を移植したマウスを使用する。下記表に要約するように、合計１０匹の動物の５グループを構成する。 Δ 死亡したか、あるいは腫瘍の大きさが大きいために犠牲となったマウス。グループ４および５（双方はベクターｐＴＧ９３３７で形質導入したが、ガンシクロビアで処理するか、あるいはその他の方法で処理した細胞の移植から得られる）を比較すると、腫瘍の発生に対するガンシクロビアの効果が明瞭に示される。更に、治療遺伝子を発現するベクター（ｐＴＧ９３４４およびｐＴＧ９３３７）で形質導入された細胞を移植したマウスは第２５日の前に腫瘍を発生しないが、ベクターを投与されなかった動物（グループ１）または非治療的ベクター（グループ２）を投与された動物は第２１日の前に死ぬ。さらに、いくつかの治療遺伝子の作用を組合わせる利点はこの分析から明らかである。事実、ｔｋ遺伝子単独の発現は腫瘍の発生を遅延させる（グループ３）が、Ｂ１６−９３３７細胞（ｔｋ遺伝子およびＩＦＮγ遺伝子の同時発現）を投与された動物の大部分（９／１０）は移植後４４日より長い期間にわたって腫瘍を示さない。これらのデータが示すように、ＩＦＮγの免疫刺激作用と、チミジンキナーゼおよびガンシクロビアの細胞障害作用との組合わせは、腫瘍の頻度を著しく減少させる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年６月４日（１９９８．６．４）【補正内容】請求の範囲１．細胞集団を含んでなる抗腫瘍組成物であって、前記細胞集団は少なくとも３っの抗腫瘍治療遺伝子の発現を可能しかつ前記抗腫瘍治療遺伝子の発現を可能とする混合物を含んでなることを特徴とする前記抗腫瘍組成物。２．前記細胞集団がＶｅｒｏ系統由来の細胞の混合物を含んでなることを特徴とする、請求項１に記載の抗腫瘍組成物。３．前記細胞集団がヒト起源であることを特徴とする、請求項１に記載の抗腫瘍組成物。４．前記細胞集団が２９３系統由来であることを特徴とする、請求項３に記載の抗腫瘍組成物。５．前記細胞集団が、ＦＢ２９株のＦＭｕＬＶウイルス（フレンドネズミ白血病ウイルス）のｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子と、両種性ウイルス４０７０Ａのｅｎｖ遺伝子とを含んでなることを特徴とする、請求項１に記載の抗腫瘍組成物。６．前記細胞集団がレトロウイルスのベクターを含有する感染粒子の産生を可能とするレトロウイルスの包膜系統を含んでなることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物。７．治療遺伝子が免疫刺激性および／または細胞障害性ポリペプチドをコードすることを特徴とする、請求項１に記載の抗腫瘍組成物。８．免疫刺激性ポリペプチドがインターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、顆粒球型（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球−マクロファージ型（ＧＭ−ＣＳＦ）のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、アルファ−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、共同刺激因子および、特にポリペプチドＢ７．１およびＢ７．２から成る群より選択され、そして前記因子がクラスＩＩの組織適合性抗原の発現を活性化することを特徴とする、請求項７に記載の抗腫瘍組成物。９．細胞障害性ポリペプチドがチミジンキナーゼおよび、特に単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）のチミジンキナーゼ（ＴＫ）、シトシンデアミナーゼ、シトクロムＰ４５０２Ｂ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ニトロレダクターゼおよびβ−グルコロニダーゼから成る群より選択されることを特徴とする、請求項２に記載の抗腫瘍組成物。１０．前記細胞集団がポリペプチドＨＳＶＩ−ＴＫ、ＩＬ−２およびガンマ −ＩＦＮをコードする遺伝子の発現を可能とすることを特徴とする、請求項１２に記載の抗腫瘍組成物。１１．前記細胞集団がＩＬ−２をコードする遺伝子の発現を可能とし、そしてＨＳＶ−１ウイルスのチミジンキナーゼをコードする遺伝子の発現およびガンマ−インターフェロンをコードする遺伝子の発現を可能とするレトロウイルスのベクターを含んでなる感染粒子の産生を可能とすることを特徴とする、請求項１０に記載の抗腫瘍組成物る１２．前記細胞集団がＶｅｒｏ系統由来の細胞の混合物と、ＩＬ−２遺伝子の発現を可能とする１つの部分と、ＩＦＮ−γ遺伝子の発現を可能とする他の部分とを含んでなることを特徴とする、請求項２または１０に記載の抗腫瘍組成物。１３．感染粒子の産生を可能とするレトロウイルスの包膜系統またはＨＳＶ −１−ＴＫ遺伝子の発現を可能とするレトロウイルスのベクターを含んでなる感染粒子とさらに、組合わされていることを特徴とする、請求項１３に記載の抗腫瘍組成物。１４．前記細胞集団がその排除を可能とする薬剤に対して感受性であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物。１５．前記薬剤がアシクロビア（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）の誘導体、特にガンシクロビア（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）であることを特徴とする、請求項１４に記載の抗腫瘍組成物。１６．前記細胞集団が、さらに、陽性選択マーカーの発現を可能とすることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物。１７．前記包膜系統が２９３系統由来であり、かつ − ＦＢ２９株のＦＭｕＬＶウイルス（フレンドネズミ白血病ウイルス）のｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子、および両種性ウイルス４０７０Ａのｅｎｖ遺伝子、および − ＩＬ−２をコードする遺伝子の発現を可能とするベクター、を含んでなることを特徴とする、請求項６に記載の抗腫瘍組成物。１８．前記レトロウイルスのベクターが、５’→３’の方向において、 − ５’ＬＴＲ、 − 包膜領域、 − ガンマ−インターフェロンをコードする遺伝子、 − 構成的な内部のプロモーター、 − ＨＳＶ−１ウイルスのチミジンキナーゼをコードする遺伝子、 − 内部のリボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、 − 陽性選択マーカーをコードする遺伝子、および − ３’ＬＴＲ、を含んでなることを特徴とする、請求項６に記載の抗腫瘍組成物。１９．ヒトまたは動物における癌または癌の症状の治療または予防のための薬剤の製造のための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物の使用。２０．前記抗腫瘍組成物が腫瘍内経路により投与することを意図する、請求項１９に記載の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/21 Ｃ０７Ｋ 14/53 38/46 14/535 Ｃ０７Ｋ 14/15 14/54 14/53 14/555 14/535 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 14/54 5/00 Ｂ 14/555 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 37/66 Ｂ 15/09 37/54 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＳＧ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも３つの抗腫瘍治療遺伝子の発現を可能とする細胞集団を含んでなる抗腫瘍組成物。２．治療遺伝子が免疫刺激性および／または細胞障害性ポリペプチドをコードすることを特徴とする、請求項１に記載の抗腫瘍組成物。３．免疫刺激性ポリペプチドがインターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、顆粒球型（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球−マクロファージ型（ＧＭ−ＣＳＦ）のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、アルファ−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、共同刺激因子および、特にポリペプチドＢ７．１およびＢ７．２から成る群より選択され、そして前記因子がクラスＩＩの組織適合性抗原の発現を活性化することを特徴とする、請求項２に記載の抗腫瘍組成物。４．細胞障害性ポリペプチドがチミジンキナーゼおよび、特に単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）のチミジンキナーゼ（ＴＫ）、シトシンデアミナーゼ、シトクロムＰ４５０２Ｂ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ニトロレダクターゼおよびβ−グルコロニダーゼから成る群より選択されることを特徴とする、請求項２に記載の抗腫瘍組成物。５．前記細胞集団がポリペプチドＨＳＶ１−ＴＫ、ＩＬ−２およびガンマ− ＩＦＮをコードする遺伝子の発現を可能とする、ことを特徴とする請求項２に記載の抗腫瘍組成物。６．前記細胞集団がレトロウイルスのベクターを含んでなる感染粒子の産生を可能とするレトロウイルスの包膜系統を含んでなることを特徴とする、請求項１に記載の抗腫瘍組成物。７．前記細胞集団がヒト起源であることを特徴とする、請求項６に記載の抗腫瘍組成物。８．前記細胞集団が２９３系統由来であることを特徴とする、請求項７に記載の抗腫瘍組成物。９．前記細胞集団が、ＦＢ２９株のＦＭｕＬＶウイルス（フレンドネズミ白血病ウイルス）のｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子と、両種性ウイルス４０７０Ａのｅｎｖ遺伝子とを含んでなることを特徴とする、請求項６〜８のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物。１０．前記細胞集団がＩＬ−２をコードする遺伝子の発現を可能とし、そしてＨＳＶ−１ウイルスのチミジンキナーゼをコードする遺伝子の発現およびガンマ−インターフェロンをコードする遺伝子の発現を可能とするレトロウイルスのベクターを含んでなる感染粒子の産生を可能とすることを特徴とする、請求項６〜９のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物。１１．前記細胞集団がその排除を可能とする薬剤に対して感受性であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物。１２. 前記薬剤がアシクロビア（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）の誘導体、特にガンシクロビア（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）であることを特徴とする、請求項１１に記載の抗腫瘍組成物。１３. 前記細胞集団が前記抗腫瘍治療遺伝子の発現を可能とする細胞の混合物を含んでなることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物。１４．前記細胞集団が、Ｖｅｒｏ系統由来の細胞の混合物と、ＩＬ−２遺伝子の発現を可能とする１つの部分と、ＩＦＮ−γ遺伝子の発現を可能とする他の部分とを、必要に応じて感染粒子の産生を可能とするレトロウイルスの包膜系統またはＨＳＶ１ＴＫ遺伝子の発現を可能とするレトロウイルスのベクターを含んでなる感染粒子と組合わせて含むことを特徴とする、請求項１３に記載の抗腫瘍組成物。１５．前記細胞集団が、さらに、陽性選択マーカーの発現を可能とすることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物。１６．２９３系統由来であり、かつ − ＦＢ２９株のＦＭｕＬＶウイルス（フレンドネズミ白血病ウイルス）のｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子、および両種性ウイルス４０７０Ａのｅｎｖ遺伝子、および − ＩＬ−２をコードする遺伝子の発現を可能とするベクター、を含んでなる包膜細胞。１７．５’→３’の方向において、 − ５’ＬＴＲ、 − 包膜領域、 − ガンマ−インターフェロンをコードする遺伝子、 − 構成的な内部のプロモーター、 − ＨＳＶ−１ウイルスのチミジンキナーゼをコードする遺伝子、 − 内部のリボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、 − 陽性選択マーカーをコードする遺伝子、および − ３’ＬＴＲ、を含んでなることを特徴とするレトロウイルスのベクター。１８．ヒトまたは動物における癌または癌の症状の治療または予防のための薬剤の製造のための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物、請求項１６に記載の包膜細胞または請求項１７に記載のレトロウイルスのベクターの使用。１９．前記抗腫瘍組成物が腫瘍内経路により投与することを意図する、請求項１８に記載の使用。