JP2000504266A

JP2000504266A - 既知の分離物質の使用および該物質の新規形態

Info

Publication number: JP2000504266A
Application number: JP9525930A
Authority: JP
Inventors: バーグレン，エヴァ; セリクマン，イリア
Original assignee: アメルシャム・ファルマシア・バイオテック・アクチボラグ
Priority date: 1996-01-18
Filing date: 1997-01-18
Publication date: 2000-04-11
Also published as: SE9600171D0; US6319380B1; EP0885054A1; WO1997026071A1

Abstract

(57)【要約】アルケン構造を有する基を含むデキストラン誘導体の重合化により製造したゲルの、核酸の電気泳動分離における使用。

Description

【発明の詳細な説明】既知の分離物質の使用および該物質の新規形態発明の分野本発明は、一本鎖または二本鎖核酸(それぞれssおよびds)、主に５−２０,０００ヌクレオチド(あるいは塩基対)の配列から成るポリヌクレオチドの電気泳動に関する。とりわけ、アガロース、ポリアクリルアミド、ビスアクリルアミド等を基にしたゲルが核酸の電気泳動に使用できることは既知である。ゲルは通常電気泳動緩衝剤の存在下で注形まては成形される。一本鎖ＤＮＡの電気泳動(配列決定)において、分離は、鎖を離しておくために通常尿素の存在下で行う(Manitatis et al.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第２版，Co1d Spring Habor Laboratoey Press(１９８９)New York，Ｕ.Ｓ.Ａ.)。従って、ゲルをその使用に直接関連した約８のpHで、尿素と共に注形している。高いpH値の緩衝剤を使用する努力も試されている(Ｓmith et al.， Amer．Biotechnol．８(１９９０)，４８−５４)。今日まで知られている方法の問題および関連するゲルの望ましい特性サンプルのＤＮＡ配列決定のための良好なふるい特性を有するアガロースゲルは、製造が困難である。アガロースはまたゲルが容易に不透明に成り、従って、光学測定に関連した使用が困難であるという欠点も有する。電気泳動におけるポリアクリルアミドの欠点は、モノマー(アクリルアミドおよびビスアクリルアミド)が毒性であり、結果としてモノマーを取り扱う時には非常に注意が必要であり、また、アクリレートおよびアクリルアミドが加水分解感受性であるということである。尿素を含む予備製造ゲルの場合、尿素もまた容易に加水分解する。尿素のような変性剤存在下で一本鎖核酸を電気泳動に付す代替として、電気泳動を高いpH(通常約１１および／または高い温度(約８０〜９０℃)で行い得る。両方の代替は、ポリアクリルアミドの加水分解をもたらす。核酸の電気泳動に使用できる新規ゲル材料の発見の強い要望がある。新規ゲル材料に関する目的は、それらが: １．一本鎖および／または二本鎖核酸、主にＤＮＡを、商業的ポリアクリルアミドゲル（＝ＰＡＡ）と同程度かそれ以上の分解能で分離可能にする。２．勾配ゲルおよび異なるゾーンを有するゲルの製造を可能にする。３．好ましくはＰＡＡと同程度か、それより良好な低い電気内方浸透を提供する。４．電気泳動に関連するpH、通常４〜１３で安定である。５．尿素８Ｍおよび他の変性剤および核酸の通常の染色法（例えば、銀染色およびエチジウムブロマイド染色)に耐容性である。６．良好な光学的特性、即ち、２８０〜８００nmの高い光伝達を有しおよび特に４８０、５９０および６３０nmで妨害蛍光を発しないか低い。７．非毒性である。べきであるということである。タンパク質電気泳動のためのデキストラン誘導体ゲルの使用は、約２０年前(S oderberg，Ｌ.，Ｕ.Ｓ．４,０９４,８３２)に提案されていた。ゲルはＨ₂Ｃ＝ＣＲ−Ａ− および／またはＨ₂Ｃ＝ＣＲ−ＣＯ− ［式中、−Ａ−はＣＨ₂−または−Ｏ−およびＲはＨ、ＣＨ₃、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＣＮである］から選択されるビニル基を含むデキストラン誘導体のフリーラジカル重合化により製造された。タンパク質電気泳動への適用は記載されていた。得られる利点は、ゲルが生理学的物質に対して不活性であり、強く、包含された電気泳動緩衝剤と共に注形でき、ビニル置換基、荷電置換基およびコポリマー等の選択に関して適した特性を有する容易に取り扱えるプレートの形に注形または成形できることが挙げられた。低分子量、低“スマイリング(smiling)”化合物の改善された分析能および改善された光学特性を与える電気泳動ゲルの製造の試みにおいて、ポリマー中のＯＨ基とエーテル架橋を提供する試薬と架橋するポリヒドロキシポリマーの提案されたゲルがある(Kozu1ic，Ｂ.，Ｕ.Ｓ. ５,３７１,２０８; 特にカラム１１参照) 。ゲルの機能は制限酵素の助けを借りて消化したＤＮＡの電気泳動に関して示されている。アリルアガロース(実施例１)およびデキストラン(実施例１４および１６)が多数の実施例の中から特記できる。アクリルアミドとアリル置換アガロースのコポリマー(Nochumssonm Ｓ.，ＥＰ８７,９９５)は、電気泳動のためのゲルとして提案されている。なぜなら、このようなゲルは慣用の担体または基材物質に良好に粘着するためである。本発明の目的本発明の目的は、核酸の分離に適しており、前記目的に関して改善された特性を有する電気泳動のための新規ゲルの発見である。本発明本発明により、アルケン構造(＞Ｃ＝Ｃ＜)を有する基を含むデキストラン誘導体から重合化した電気泳動ゲルが、一本鎖および二本鎖核酸の両方の電気泳動分離に適していることが判明した。ゲルは、高pHレベルでの化学的安定性、光学的透明性のような前記性質の幾つかに関して改善された特性を有し、非毒性であり、長い貯蔵寿命を有する。ポリマーは低分子量ビニルモノマーとのコポリマーの形であり得る。関連するゲルは、その原則は先に定義されていた(Soderberg,Ｌ. ，Ｕ.Ｓ．４,０９４,８３２)。本発明の主要な態様は、核酸のゲル電気泳動分離法に関する。本方法の主な特性は、Soderberg(Ｕ.Ｓ. ４,０９４,８３２)により使用されたのと同じタイプのフリーラジカルポリマーであるゲルの使用に関する。本方法は、核酸のゲル電気泳動に典型的な方法を含み、即ち、サンプルをゲルに置き、ボルト数をかける。電気泳動を一本鎖ＤＮＡで行いたい時、方法を二本鎖ＤＮＡを分離する変性剤の存在下で行う。下記参照。あるいは、電気泳動を上昇した温度(例えば、５０℃ を越える温度、変性剤は必要であれば存在し得る)で行う。アルケン構造を含む好ましい基は、式Ｈ₂Ｃ＝ＣＲ−Ｂ− ［式中、ＲはＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＣＮもしくは飽和または不飽和または芳香族構造を有し得る直鎖または分枝鎖環状炭化水素基］を含む。飽和炭化水素基の中で、例えば式CnH₂n＋₁(nは整数)を有する基で、１０個またはそれより少ない炭素原子を有する(n＜１０の整数)が特記できる。最も好ましい基Ｒは水素(Ｈ)および１〜４の炭素原子を有する低級アルキル、特にメチル(ＣＨ₃)である。Ｈ₂Ｃ＝中の水素原子はハロゲン、特にＣｌまたはＦで置換され得る。基Ｒ中の炭化水素鎖は中断され得るか、または１個またはそれ以上の炭素原子が橋Ｂと同様の方法(下記参照)で１個またはそれ以上の酸素原子で置換され得る。橋Ｂは、デキストランのヒドロキシル基の酸素原子に直接結合する。橋Ｂは飽和または不飽和であり得る直鎖、分枝鎖または環状炭化水素橋であり、所望により酸素で中断されるかおよび／またはアルコール性ヒドロキシル基で置換された１個またはそれ以上の炭素原子を有する。橋Ｂはフェニレン(環状構造として； −Ｃ₆Ｈ₄−)のような芳香族構造を含み得る。橋Ｂはあるいは一重結合であり得る。多くて、一つの酸素原子が直接一つのそして同じ炭素原子に結合する。橋の長さは通常１〜１５原子より短く、任意の酸素原子を含む。非置換炭化水素橋は、例えば−(ＣＨ₂)_n−(ここで、nは１〜１０の整数、例えば２、３または４である)である。フェニレン、シクロヘキサンジイル等が橋に包含できる環状構造の例である。基Ｈ₂Ｃ＝ＣＲ−Ｂ−の具体的例は、アリル、３−アリルオキシ−２−ヒドロキシプロピル、３−(スチリル−４−オキシ)−２−ヒドロキシプロピル、１−メチルアリル、１−クロロアリルおよび非置換ビニル等である。更なる例としては、Soderberg，Ｌ.，(Ｕ.Ｓ．４,０９４,８３２)参照。デキストラン誘導体のアルケン含有基に関する置換率は、適当には０.０５〜１.９、好ましくは０.５〜１.２nmol／g乾燥デキストラン誘導体である(＝それぞれ１〜３０％および５〜２５％)。デキストラン誘導体の分子量は、広範囲で変化し得る。非置換デキストランから出発して、平均分子量(Mw)は好ましくは１０,０００〜１０,０００,０００Ｄa 、特に７０,０００〜５,０００,０００Daの範囲である。重合化条件の適当な組み合わせ（置換率、イニシエーター、デキストラン濃度、デキストランの分子量等)により、異なる特性を有するゲルが核酸の電気泳動のために製造できる。デキストラン誘導体は既知の方法で製造する(例えば、Soderberg，Ｌ.，Ｕ．Ｓ．４,０９４,８３２、参照)。共重合化を行い得る低分子量ビニル化合物(通常、モノビニル化合物またはジビニル化合物)は、窒素原子または二重結合炭素原子のーつで置換されていてもよいアクリルアミドまたはメタクリルアミドであり得る。あるいは、関連するpH 範囲および温度範囲で加水分解に対して同程度の安定性を有する他の低分子量ビニルを使用し得る。ビニル化合物は好ましくは最大２０個の炭素原子、好ましくは最大１０個の炭素原子を含む。Soderberg，Ｌ.，Ｕ.Ｓ．４,０９４,８３２参照。重合化条件は、アルケン基の重合化に典型的なものであり(電子放射またはγ −放射、酸化的ラジカル重合等)、好ましくはフリーラジカル重合化がこの点で選択される。例えば、ベンゾフェノンまたはベンゾイル誘導体のＵＶ−イニシエーシエーターが使用できる。アクセレレーターを必要な場合使用する。使用するデキストラン誘導体の量は、重合可能反応物の全重量に対して計算して、２０〜１００％(w／w)に対応する。デキストランゲルは、重合化溶液に包含される緩衝剤システムと注形できる。例えば、関連するpH範囲、例えばpH７〜１０または１０〜１３のpHを提供する緩衝成分を含む予備製造ゲルを製造することができる。緩衝性分は、通常関連する範囲のpKa値を有する。前記に従って、二本鎖核酸を分解できる変性剤、主に尿素およびホルムアミドを低濃度で包含し得る。Levine et al.，Biochemistry ２ (１)(１９６３)，１６８〜１７５(引用して本明細書に包含させる)参照。上限に関して、適当な緩衝成分はアンモニアより強い塩基、例えばボレート、可溶性ヒドロキシド(ＯＨ)、カーボネート(ＣＯ₃ ^2-)、ホスフェート(ＰＯ₄ ^3-)および、ある一級および二級アミン(とりわけ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールを特記できる)である。緩衝成分は好ましくは揮発性ではなく、これはその沸点が通常１２０℃以上であることを意味する。典型的電気泳動緩衝システムはＵ.Ｓ.５,００５,５１７（１５〜１６欄）に記載されている（引用して本明細書に包含させる)。ゲルは、例えば、低い密度のスタッキングゾーンと高密度分離ゾーンのような異なるゾーンを含むように注形できる。ゲルはまた勾配ゲルとして、および方形カセット、キャピラリーを含む異なる形の断面を有する通管のような異なるジオメトリーに注形し得る。関連するタイプのゲルは、しばしば機械的には相対的に弱い。ゲルを“スラブ ”ゲルとして処理しなければならず、ゲルはこのましはく既知の方法で、担体または基材、通常ポリマーフィルム(例えば、GelBond(登録商標)ＰＡＧ(ＦＭＣ，ＵＳＡ))上で注形する。本発明の一つの特異的態様において、電気泳動ゲルは前記に従ってデキストラン誘導体から製造する。この本発明の態様は、ゲルが前記に従って緩衝成分および変性剤を含むことを特徴とする。重合化およびデキストラン誘導体の製造に関する更なる情報のために、読み手は前記特許公報（引用して包含させる）およびまた本主題のテキストを参考とする。実験部分アリルデキストラン溶液の製造アリルデキストラン溶液(Mw２,０００,０００g／mol、アリル含量１.２〜１. ５mmol／g乾燥物質(ＣＨ₂＝ＣＨ−ＣＨ₂−はデキストランのＯＨで置換されている))を、所望よりわずかに少ない量の緩衝剤（ＴＲＩＳ−ＨＣｌ０.３７５Ｍ、pH８.８)中に一定量のアリルデキストランを溶解して製造した。これは、緩衝剤の容量がデキストランを溶解した時に増加するからである。全デキストランが溶解した後、容量を緩衝剤で所望の容量に調節した。尿素をある例に関しては添加した。実施例Ｉ．一本鎖核酸の電気泳動ゲル注形および処理Ａ．尿素含有ゲル、pH約８.２ＴＲＩＳ−ＨＣｌ(０.３７５Ｍ、pH８.８)および尿素(７Ｍ)中に１４％w／vアリルデキストランを含む溶液を製造した。２５０μｌ硫酸アンモニウム溶液(ＴＲＩＳ−ＨＣｌ０.３７５、pH８.８中０.１g／ml)をアリルデキストランの溶液５０ml中に撹拌しながら入れた。溶液を約３〜５分、バキュームポンプの助けを借りて脱気した。２５μｌのアクセレレーター(ＴＥＭＥＤ＝Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'− テトラメチルエチレンジアミン)を、空気の混入を避けるために注意深く撹拌しながら添加した。混合物を、全気泡が消えるまで約５分放置した。次いで、溶液をシリンジ(３０ml)に吸引し、ＡＬＦexpress ＤＮＡシーケンサーのためのカセット(短１５cm)を、溶液の毛細管吸引によりゲルで満たした。ＴＥＭＥＤを添加した時点から計測して、カセットを充填するのに約５分かかり、溶液を重合化するのに約３０〜４５分かかった。ゲルを一本鎖ＤＮＡ(ssＤＮＦ)の分離により、ＡＬfexpress ＤＮＡシーケンサーで電気泳動的に評価した。分離したサンプルは、５０塩基対ラダ−５０〜５００bpおよび配列サンプルＭ１３であった。両方のサンプル共ラベルするかCy- ５でマークし、Pharmacia Biotech ＡＢ，Reagents Division(Mi1waukee，Ｕ .Ｓ.Ａ.)から得た。サンプルをポリアクリルアミドゲルでＡＬＦexpressを処理する標準法に従って製造した。タンク緩衝剤はＴＲＩＳ−ホウ酸−ＥＤＴＡ(０. １Ｍ、０.０８Ｍ、１mM、pH８.２)であった。ゲルを以下のパラメーターで処理した: Ｕ＝１０００Ｖ、１＝６０mA、Ｐ＝１５Ｗ、Ｔ＝５５℃。作用を限定した。ゲルをこれらのパラメーターで、サンプル添加前５０分、予備処理した。Ｂ．尿素無しのゲル、pH約１１２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール(１００mM、pH１１.２)中の１３％w／vアリルデキストランを含む溶液を調整した。５００μｌの過硫酸アンモニウム溶液(２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール中に０.１g／ml(１００mM ))を５０mlのアリルデキストラン溶液中に撹拌しながら入れた。溶液をバキュームポンプの助けを借りて約３〜５分脱気した。次いで、システムを注意深く撹拌しながら５０μｌＴＥＭＥＤを添加した。次いで、ゲルをＡＬＦexpress ＤＮＡシーケンサーのためのカセット(短１５cm)に注形する前に、前記実施例と同様の方法で溶液を処理した。ゲルを前記実施例と同じサンプルで、同じ方法で評価した。タンク緩衝剤は１００mM ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、pH１１.２であった。結果および考察ＡＬＦexpress ＤＮＡシーケンサーのためのゲル注形: イニシエーターシステム過硫酸アンモニウム−ＴＥＭＥＤはアリルデキストランのために良好に機能した。ゲルカセットを反応溶液で満たすのに必要な時間は、慣用のアクリルアミド溶液の場合よりもわずかに長かった。溶液を脱気し、ゲルカセットを重合化処理の開始前に満たすために、導入時間を適合させることは可能であった。モル基本で、尿素が存在する時に使用するイニシエーターの量は、ＡＬＦexpress ＤＮＡシーケンサーのためのアクリルアミド−尿素ゲルの製造に通常使用される量と同じであった。イニシエーターおよびアクセレレーターの２倍量が、尿素無しであるが、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールを含む緩衝剤で、同じ時間枠内に重合化を得るために必要であった。これは、恐らく高pHで、アミンが存在する時に重合化が阻害され、重合化を開始するために高濃度のイニシエーターとアクセレレーターが必要となるためである。光学的質: イニシエーターシステム過硫酸アンモニウムとＴＥＭＥＤと共に注形したゲルは、検出目的で使用するためのレーザー誘導蛍光(例えば、ＡＬＦexp ress ＤＮＡシーケンサー)を可能にするための十分に良好な光学的質を示した。第１のゲルを注形する溶液は、注形前に脱気しなかった。これは、透明度が低いゲルをもたらす傾向にあった。これは恐らく小さい気泡が光の拡散をもたらし、透明度が低いゲルをもたらすためであり、レーザー検出の達成がより困難となった。電気泳動、尿素含有ゲル、pH８.２: システムを、選択緩衝システムが不連続( ゲル中のＴＲＩＳ−ＨＣｌおよびタンク中のＴＲＩＳ−ホウ酸−ＥＤＴＡ)のため、５０分予備作動させた。予備作動無しでは、低分子量フラグメントが先端塩素イオンの後ろに堆積する恐れがある。サンプル含有フラグメントの場合、プライマーピークは約２０分後に現れ、１０フラグメントが続いた。分離はポリアクリルアミドゲルで達成させたのと同じ質であった。約２４０塩基までを配列サンプルとして分離した。次いで、ピークは広くなり、配列を読むのが不可能であった。最初の２００塩基対のうち、１６個が間違えていた。一つを除いた失敗は、全て欠失であり、即ち、配列中に１個またはそれ以上の同じ塩基があるべきである場合、一つ少ない塩基、即ち、２個中１個または４個中３個が同定された。この偏りは、使用したアルゴリズムが使用したゲルに適合していなかったためであり得る。試験は、過硫酸アンモニウムとＴＥＭＥＤのシステムで重合化したアリルデキストランゲルでssＤＮＡの分離が可能であり、検出がレーザー誘発蛍光で行うことができることを示した。電気泳動、尿素無しのゲル、pH１１.２: ゲルをタンクおよびゲルで同じ緩衝剤を使用して、連続システムで流した。フラグメントサンプルの場合、プライマーピークが２０分より若干遅く現れた。最初のフラグメント(５０および１００b p)は明白なピークを与えなかった(曲線的)。これについての明白な説明は見つからなかった。一方、続くフラグメント(１５０〜５００bp)は非常に明白であり、分離は通常であるように見えた。全分離時間は尿素を含む対応するアリルデキストランとほぼ一緒であった。配列サンプル(Ｍ１３)の場合、配列決定は得られなかった。プライマーピークが見られたが、その後はノイズしかなかった。実験を繰り返したが、同じ結果であった。サンプル供給者からの情報によると、標識サンプル中のフルオロフォアは高いpHでおよびあるアミンに対して限定された安定性を有していた。これは配列サンプルについての“結果無し”の結果の一つの説明となり得る。プライマーおよびフラグメントサンプルの標識またはマーキングが幾分強く、これがなぜ示されたかの理由であり得る。選ばれた結果は、尿素無しで高いpHを有するゲルが、尿素を含み低いpHを有するゲルとほぼ同程度の分解能で一本鎖フラグメントサンプルを分離できることを示した。なぜ配列サンプルが見れないのかを確立するために、更なる研究が必要である。実施例ＩＩ．二本鎖核酸の電気泳動、ゲル注形および処理過硫酸アンモニウム溶液(ＴＲＩＳ−ＨＣｌ０.３７５、ｐＨ８.８)１２０μ ｌをＴＲＩＳ−ＨＣｌ（０.３７５、pH８.８)中の１７％w／vアリルデキストランの溶液に撹拌しながら入れた。溶液を約５分、真空ポンプの助けを借りて脱気した。１５μｌＴＥＭＥＤ＝Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミンを次いで注意深く溶液に撹拌しながら入れた。溶液を気泡が消えるまで、約５分放置した。次いで、溶液をシリンジに吸引し、ガラスプレートおよび酸化アルミニウムプレートから成るゲルカセットに輸送した。ゲルは８.５×９cmの大きさを有した。同じサイズのフィルム(GelBond(登録商標)、ＦＭＣ，ＵＳＡ)を酸化アルミニウムシートに対して敷いた。フィルムは、アリルデキストランゲルがそれ自体で作業するのに機械的に弱すぎるため、担体として機能する。ゲルはスタックゾーン無しで、サンプル注入のための鋭く境界定義された穴を製造するための櫛と共に注形した。重合化過程は、ＴＥＭＥＤ添加後約４５分かかった。ゲルを処理する前、１時間放置させた。ゲルをMighty Small ＳＥ２６０(Hoefer Scientific Instruments,Califo rnia，Ｕ.Ｓ.Ａ.)で、フラグメントサンプルHincおよびHac(Hinc ＩＩＤＩＧＥＳＴＦＸ−１７４−ＲＦ(１０５７−７９塩基対由来の１３フラグメント)およびHac ＩＩＩＤＩＧＥＳＴＦＸ−１７４−ＲＦ(１３５３から７２塩基対由来の１１フラグメント))(Pharmacia Biotech ＡＢ，Uppsala， Sweden)で評価した。使用したタンク緩衝剤はＴＲＩＳ−グリシン(０.０２５Ｍ、０.１９２Ｍ、pH８.３)であった。ゲルをサンプルを変える前に１＝１５mMで、約１２分流した。この時間中、ボルト数は６０Ｖから１１０Ｖに変化した。次いで、サンプルをゲルに輸送し、分離をＩ＝２５mAで行った。ゲルは、ブロモフェノールブルーを伴って前に移動し、ゲルの端から約２cmであった。これは約５０分かかり、ボルト数は１９０Ｖから４００Ｖに、出力は５Ｗから１０Ｗに変化した。ゲルを銀染色により展開した。ゲルの展開時はポリアクリルアミドゲルの展開時間よりも約３０分長かった。ゲルの表面は展開方法中に固定浴(１０％酢酸溶液)で“ ひび割れ”た。これは、ゲルの表面収縮のためであり得る。このひび割れは、選ばれたバンドの解析を難しくした。全バンドは含まれていないが、dsＤＮＡフラグメントの分離は明白であった。実施例ＩＩＩ．ＵＶ−イニシエーターの助けを借りたゲル製造ゲルをＵＶ−イニシエーター(Irgacure(登録商標)１８４（１−ヒドロキシ− シクロヘキシルフェニルケトン)分子量２０４、Ciba−Geigy)および上記で定義の同じアリルデキストラン誘導体の助けを借りて分離試験で製造した。製造は、イニシエーターの可溶性特性のため、不安定であることが判明した。この方法で得られたゲルは化学的イニシエーション（過硫酸アンモニウムとＴＥＭＥＤ）により得られたものと十分類した。要約: 合成ゲルの他の特性ゲルで妨害電気内方浸透は観察されなかった。濁度は、概して、慣用ポリアクリルアミドゲルで選ばれるのと同程度であった。内在性蛍光値は、６３０nmで測定して、許容可能なバックグラウンド蛍光を示した。３％のバックグラウンドが６３０nmで観察され、これはポリアクリルアミドゲルで選ばれた値よりわずかに高かった。しかしながら、これは決して妨害しない。関連する担体物質に対する粘着は良好であった。GelBond Pagに関して、ゲルは親水性および疎水性側の両方に粘着した。完了したゲルは、銀染色を使用するための溶液で処理する間、安定したままであった。ゲルの機械的特性は、ポリアクリルアミドゲルより弱かった。担体基材無しで作業した場合、容易に壊れた。電気泳動中、ゲルの膨張に関する問題はなかった。優先権主張年中に得られた実験的支持優先権主張年中にスウェーデン特許出願９６００６１２−７が出願された。これはスチリルエーテル基を有するポリヒドロキシポリマーに関するものである。ＳＥ９６００６１２−７を引用して本明細書に包含させる。この出願は、最初にＮａＯＨ、テトラ−n−ブチルアンモニウムヨウジドおよびジメチルスルフォキシドの存在下、４−ヒドロキシベンズアルデヒドおよびエピウロロヒドリンから４−(２,３−エポキシプロポキシ)ベンズアルデヒドを合成することによりスチリルグリシジルエーテルの製造を提供した。４−(２,３− エポキシプロポキシ)ベンズアルデヒドを次いで、懸濁メチルートリホスホニウムブロミド、触媒量の１８−クラウン−６−エーテルおよびt−ブトキシドカリウムを含む乾燥テトラヒドロフラン溶液(０℃、アルゴン雰囲気下)に添加した。この混合物から、次いで、収率７０％でスチリルグリシジルエーテルが得られた。次いで、スチリルグリシジルエーテルをデキストラン(Mw４０,０００Daまたは５００,０００Da)と反応させた。種々の率のスチリルグリシジルエーテル対デキストラン、種々の溶媒(純水、純ＤＭＳＯ)、種々の溶媒混合物(水、ＤＭＳＯ、トルエン)、種々の塩基源(ＮａＯＨおよび適当な場合、ジムシルナトリウム)およびある例では相移動触媒も使用した。０から５０％までの間の置換率が達成された。トリス−ＨＣｌ緩衝剤(０.３７５Ｍ、pH８.８)含有尿素(７Ｍ)に１５％(w／v) の濃度で溶解したこのようにして得られたスチリルエーテルデキストラン（置換率２.８％)を、ラジカルイニシエーターでゲルへ重合化させた。次いで、ゲルの利用性を二本鎖ＤＮＡを含むサンプルをゲル電気泳動に付すことにより解析した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年１月１３日（１９９８．１．１３）【補正内容】請求の範囲１．アルケン構造を有する基を含むデキストラン誘導体の重合化により製造した電気泳動用ゲルの、核酸の電気泳動分離における使用。２．基が式Ｈ₂Ｃ＝ＣＲ−Ｂ− ［式中、・ＲはＨ、炭化水素基、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＣＮであり、好ましくはＨ、ＣＨ₃ 、および・デキストラン中の水酸基酸素への自由な割合の結合、および・Ｂは直鎖、分枝鎖または環状炭化水素橋であり、所望により酸素で中断されるかおよび／またはアルコール性ヒドロキシル基で置換された１個またはそれ以上の炭素原子を有する］を有するものであることを特徴とする、請求項１記載の使用。３．Ｒが水素であることを特徴とする、請求項２記載の使用。４．Ｂが−ＣＨ₂−または−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ(ＯＨ)−ＣＨ₂−からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２〜３いずれかに記載の使用。５．核酸がＤＮＡであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。６．核酸が一本鎖であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。７．核酸が二本鎖であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。８．核酸が２,０００塩基(二本鎖核酸に関しては２０,０００塩基対)より少ないことを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。９．電気泳動を、核酸が一本鎖形を示す温度、好ましくは＞５０℃、またはpH ７〜１０、または上昇したpH１０〜１３で核酸を一本鎖形にさせる変性剤の存在下で行うことを特徴とする、請求項６または８のいずれかに記載の使用。１０．水和され、１０〜１３の範囲のpH値を付与する緩衝剤を含むゲルであるか、または勾配ゲルであることを特徴とする、アルケン構造を有する基を含み、好ましくは該基が請求項２〜４のいずれかに記載のものである、デキストラン誘導体の重合化により製造した、電気泳動用ゲル。１１．７〜１０の範囲にpH値を調整する緩衝剤で水和され、二本鎖核酸を分解する変性剤を含むゲルであることを特徴とする、アルケン構造を有する基を含み、好ましくは該基が請求項２〜４のいずれかに記載のものである、デキストラン誘導体の重合化により製造した、電気泳動用ゲル。１２．ゲルが密度の低いゲル構造のスタッキングゾーンおよび高密度ゲル構造の分離ゾーンを含むことを特徴とする、アルケン構造を有する基を含み、好ましくは該基が請求項２〜４のいずれかに記載のものである、デキストラン誘導体の重合化により製造した、電気泳動用ゲル。１３．ゲルが支持プラスチック物質、好ましくは粘着性および安定性を促進する中間フィルムにより担持されていることを特徴とする、アルケン構造を有する基を含み、好ましくは該基が請求項２〜４のいずれかに記載のものである、デキストラン誘導体の重合化により製造した、電気泳動用ゲル。１４．ゲルが水管または方形型に注形されることを特徴とする、アルケン構造を有する基を含み、好ましくは該基が請求項２〜４のいずれかに記載のものである、デキストラン誘導体の重合化により製造した、電気泳動用ゲル。

Claims

【特許請求の範囲】１．アルケン構造を有する基を含むデキストラン誘導体の重合化により製造したゲルの、核酸の電気泳動分離における使用。２．基が式Ｈ₂Ｃ＝ＣＲ−Ｂ− ［式中、・ＲはＨ、炭化水素基、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＣＮであり、好ましくはＨ、ＣＨ₃ 、および・デキストラン中の水酸基酸素への自由な割合の結合、および・Ｂは直鎖、分枝鎖または環状炭化水素橋であり、所望により酸素で中断されるかおよび／またはアルコール性ヒドロキシル基で置換された１個またはそれ以上の炭素原子を有する］を有するものであることを特徴とする、請求項１記載の使用。３．Ｒが水素であることを特徴とする、請求項２記載の使用。４．Ｂが−ＣＨ₂−または−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ(ＯＨ)−ＣＨ₂−からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２〜３いずれかに記載の使用。５．核酸がＤＮＡであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。６．核酸が一本鎖であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。７．核酸が二本鎖であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。８．核酸が２,０００塩基（二本鎖核酸に関しては２０,０００塩基対）より少ないことを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。９．電気泳動を、核酸が一本鎖形を示す温度、好ましくは＞５０℃、またはpH ７〜１０、または上昇したpH１０〜１３で核酸を一本鎖形にさせる変性剤の存在下で行うことを特徴とする、請求項６または８のいずれかに記載の使用。１０．水和され、１０〜１３の範囲のpＨ値を付与する緩衝剤を含むゲルであるか、または勾配ゲルであることを特徴とする、好ましくは請求項２〜４の、アルケン構造を有する基を含むデキストラン誘導体の重合化により製造したゲル。１１．７〜１０の範囲にpH値を調整する緩衝剤で水和され、二本鎖核酸を分解する変性剤を含むゲルであることを特徴とする、好ましくは請求項２〜４の、アルケン構造を有する基を含むデキストラン誘導体の重合化により製造したゲル。１２．ゲルが密度の低いゲル構造のスタッキングゾーンおよび高密度ゲル構造の分離ゾーンを含むことを特徴とする、好ましくは請求項２〜４の、アルケン構造を有する基を含むデキストラン誘導体の重合化により製造したゲル。１３．ゲルが支持プラスチック物質、好ましくは粘着性および安定性を促進する中間フィルムにより担持されていることを特徴とする、好ましくは請求項２〜４の、アルケン構造を有する基を含むデキストラン誘導体の重合化により製造したゲル。１４．ゲルが水管または方形型に注形されることを特徴とする、好ましくは請求項２〜４の、アルケン構造を有する基を含むデキストラン誘導体の重合化により製造したゲル。