JP2000503847A - 植物におけるトランスジーンの発現のためのキイチゴプロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、キイチゴゲノム由来の２つの異なるプロモーター領域の同定および単離に関する。このプロモーター領域は、ネイティブなキイチゴゲノムにおいて、キイチゴdru1遺伝子のコード領域に作動可能に連結されている。本発明のプロモーターは、その制御下に異種植物遺伝子の中程度の構成的発現を制御し得る。本発明はさらに、キメラ遺伝子、カセットベクター、キット、トランスジェニック植物、およびこのようなプロモーターを使用する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 植物におけるトランスジーンの発現のためのキイチゴプロモーター 本発明の分野 本発明は、異種植物遺伝子の構成的発現を提供し得るキイチゴ由来のプロモー ターの同定、およびキメラ遺伝子、カセットベクター、キット、トランスジェニ ック植物、およびそのようなプロモーターを使用する方法に関する。参照文献 Adams,D.O.,and Yang,S.F.,Plant Physiology 70:117-123(1977). Akama,K.et al.,Plant Cell Reports 14(7):450-454(1995). Ausubel,F.M.,et al.,in CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John W iley andSons,Inc.,Media PA(1992). Balazs,E.,et al.,Gene 19(3):239-249(1982). Beachy,R.,et al.,Annu.Rev.Phytopathol.28:451-74(1990). Beck,et al.,Gene 19:327-336(1982). Bellini,C.,et al.,Bio/Technol 7(5):503-508(1989). Benfey,P.N.,et al.,Science 250:959-966(1990). Benvenuto,E.,et al.,XXIst Annual Meeting of the Italian Society for Agricultural Genetics,Como,Italy,September 30-October 2,1987 Genet.Agrar .42(1)(1988). Bestwick,R.K.,et al.,PCT International Publication No.WO 95/35387,pu blished 28December 1995. Brunke,K.J.and Wilson,S.L.,European Patent Publication No.0 559 603 A2,publishedSeptember 08,1993. 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19Sプロモーター(Fraleyら，1994)、およびゴマノハ グサモザイクウイルス（FMV)（Rogers，1995）プロモーターを含む。植物におい て遺伝子発現を調節するために有用であって、そして細菌供給源から得られたプ ロモーター（例えば、Agrobacterium由来のプロモーター）が、同定され、そし て単離されている。このようなプロモーターはAgrobacterium Ｔ-DNAオパイン（ opine）シンターゼ遺伝子由来のプロモーターを含み、そして、ノパリンシンタ ーゼ（nos）プロモーター（Rogers，1991）、およびオクトピンシンターゼ（ocs ）プロモーター（LeisnerおよびGelvin，1988）およびマンノピンシンターゼ（m as）プロモーターを含む。 構成的発現を提供するのに有効な植物プロモーター（植物供給源由来のプロモ ーター）は、あまりよく知られておらず、そしてhsp80（カリフラワー由来の熱 ショックタンパク質80）（BrunkeおよびWilson，1993）、およびトマトユビキチ ンプロモーター（Pictonら、1993）を含む。これらのプロモーターは、異種核酸 配列の形質転換植物組織における構成的発現を指向するのに使用され得る。現在 のところ、比較的少数の植物プロモーター、特に構成的植物プロモーターが同定 されている。このようなプロモーターの植物遺伝子工学における使用は、現在の 所、かなり限定されている。なぜなら、植物における遺伝子発現は、大部分は、 典型的には、組織、発達または環境調節型であるからである。発明の要旨 本発明は、制御下に配置された核酸配列の中程度のレベルの構成的発現を別々 におよび組み合わせで提供するキイチゴプロモーターに関する。本発明のプロモ ーターはまた、異種の非構成的プロモーターにおける構成的発現をも与える。 本発明は、ネイティブなキイチゴゲノムにおいて、dru1遺伝子のコード領域に 作動可能に連結したプロモーターに関する。本発明のキメラ遺伝子は、キイチゴ dru1プロモーターの転写制御下に目的の産物をコードするDNA配列を含む。このD NA配列は、典型的にはプロモーターに対して異種であり、そして産物の構成的発 現を可能にするようにプロモーターに作動可能に連結されている。 一つの実施態様において、産物は、このような細胞が、非形質転換細胞に対し て毒性である抗生物質のある量に対して耐性であるようにすることにより、キメ ラ遺伝子を含む形質転換植物細胞の選択を可能にするポリペプチドである。産物 の例は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼおよびハイグロマイシンホスホ トランスフェラーゼのようなアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼを含む がこれらに限定されない。１つのこのような実施態様において、本発明のキメラ 遺伝子は、dru1プロモーターの転写調節下にあるハイグロマイシンホスホトラン スフェラーゼIIをコードするhpt遺伝子配列を含む。代替の実施態様において、 本発明のキメラ遺伝子は、dru1プロモーターの転写調節下にあるネオマイシンホ スホトランスフェラーゼをコードするnptII遺伝子配列を含む。 別の実施態様において、産物は、ポリペプチドを発現する形質転換植物細胞に 除草剤耐性を与えるポリペプチドである。１つのこのような実施態様において、 本発明のキメラ遺伝子は、dru1プロモーターの転写調節下にあるブロモキシニル 特異的ニトリラーゼをコードするbxn遺伝子を含む。このキメラ遺伝子を含む形 質転換植物はブロモキシニル特異的二トリラーゼを発現し、そしてブロモキシニ ル含有除草剤の適用に対して耐性である。除草剤耐性を与える遺伝子をコードす る他のDNA配列の例は、グリフォセートに対する耐性を与えるEPSPシンターゼ遺 伝子（5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸シンターゼ酵素をコードする）； 除草剤「GLEAN」に対して耐性を与える、アセトラクテートシンターゼ遺伝子； ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（PAT）をコードするビアラホ ス耐性遺伝子（bar遺伝子）、ならびにグリフォセート耐性遺伝子、CP4およびGO Xを含む。本発明のキメラ遺伝子は、dru1プロモーターに作動可能に連結されて いるこれらの除草剤耐性遺伝子に１つ以上を含む。 別の実施態様において、DNA配列またはcDNA配列は、アルファルファモザイク ウイルスコートタンパク質、キュウリモザイクウイルスコートタンパク質、タバ コ条斑ウイルスコートタンパク質、ジャガイモウイルスコートタンパク質、タバ コ茎えそウイルスコートタンパク質およびタバコモザイクウイルスコートタンパ ク質のようなウイルスコートタンパク質をコードする。１つのこのような実施態 様において、本発明のキメラ遺伝子は、dru1プロモーターの転写調節下にあるAL MV、CMV、TSV，PVX、TRV、またはTMVのようなウイルスコートタンパク質を含む 。あるいは、DNA配列は、エチレン非感受性を与えるETR1遺伝子の変異形態のよ うな優性欠損タンパク質をコードする遺伝子に対応する。さらに別の実施態様に おいて、DNA配列は、ACCD遺伝子のような植物生化学経路を改変する能力のある 遺伝子に対応する。ACCD遺伝子は、エチレン生合成経路において前駆体を分解す る産物を形成する。 別の局面では、本発明は、キイチゴdru1遺伝子由来の構成的プロモーターを含 む単離されたDNA分子を含む。１つのキイチゴdru1プロモーターの例は、dru110 プロモーターであり、本明細書中で配列番号３で表される。別の構成的キイチゴ プロモーターの例は、dru259プロモーターであり、配列番号４で表される。さら なるフラグメントは、全長dru1プロモーター、配列番号２を表す配列由来であり 得、ここでこのより小さなフラグメントは、それらの制御下でDNA配列の構成的 発現を調節するのに有効である。 本発明はまた、植物形質転換ベクターを生成するための上記のキメラ遺伝子、 DNA構築物、および単離DNA配列の使用を含む。このようなベクターは、Agrobact eriumに基づく方法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、お よびマイクロプロジェクタイルボンバードメント(microprojectile bombardment )を含む任意の植物細胞形質転換方法において使用され得る。これらのベクター はまた、植物形質転換キットの一部を形成し得る。キットの他の成分は、植物細 胞形質転換に有用な試薬を含み得るが、これらに限定されない。 別の実施態様では、本発明は、上記のキイチゴプロモーター、キメラ遺伝子ま たはDNA構築物のいずれかを含む植物細胞、植物組織、トランスジェニック植物 、果実細胞、全果実、種子、またはカルスを包含する。 本発明の別の局面において、本明細書中に記載のdruプロモーターは、トラン スジェニック植物において、選択可能なマーカー遺伝子のような異種遺伝子の中 程度の発現を提供するための方法に使用され得る。この方法において、選択可能 なマーカー産物をコードするDNA配列を含む本発明のキメラ遺伝子（すなわち、 ネオマイシンホスホトランスフェラーゼまたはハイグロマイシンホスホトランス フェラーゼ）は、植物の前駆細胞に導入される。キメラ遺伝子を含むトランスジ ェニック植物は、非形質転換細胞には毒性である選択薬剤（例えば、ハイグロマ イシン、ゲネシチン、またはカナマイシン）のある量の存在下で成長できる能力 により選択される。次いで、このように選択された形質転換植物細胞が再生され て、分化した植物を提供し、続いて、産物を発現する形質転換植物の選択が行わ れる。 さらに、本発明は、トランスジェニック果実含有植物を産生する方法を含有す る。本方法において、代表的には、植物細胞において選択を可能にする発現ベク ターに有される本発明のキメラ遺伝子は、選択された植物の前駆細胞に導入され る。次いで、これらの前駆細胞が生育されて、トランスジェニック植物を産生す る。 本方法は、以下の工程による、dru１プロモーター（dru110またはdru259のよ うな）の単離をさらに包含する： （i）キイチゴdru1遺伝子DNAの領域に相同な配列を含むプローブDNA分子を選 択する工程、 （ii）プローブとキイチゴゲノムに由来する複数の標的DNA分子とを、プロー ブ分子とプローブ分子に相同な標的分子との間の特異的なハイブリダイゼーショ ンを好む条件下で接触させる工程、 （iii）キイチゴdru1遺伝子に相同なDNA配列を有する標的分子を同定する工程 、 （iv）標的分子と関連するプロモーター配列を単離する工程、および （v）１つ以上の単離された配列またはその部分を、その制御下の下流遺伝子 の構成的発現を調節する能力について評価する工程。 本発明のキメラ遺伝子、ベクター、構築物、単離されたDNA分子、産物および 方法は、本質的に上記のようなキイチゴdru1プロモーター配列を用いて産生され 得る。 本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の詳細な説明が添付の図面 および実施例とともに読まれた場合に、より十分に明らかになる。図面の簡単な説明 図１は、本明細書中でdru259proと呼ばれる例示のキイチゴdru1プロモーター およびnptII遺伝子を含むプラスミドpAG-431の作製を示した模式図である； 図２は、キメラdru110pro-nptII遺伝子を含むベクターpAG-421の構築において 従った工程を表すフローチャートである； 図３は、nptII遺伝子に融合されたdru110proを含む、pAG-1542およびpAG-421 由来のAgrobacteriumバイナリーベクターpAG-7242の構築に関与した工程を概略 する； 図４は、キメラdru259pro-nptII遺伝子を含むAgrobacteriumバイナリーベクタ ーpAG-7342の作製を示すフローチャートである； 図５は、３つの異なるプロモーター-nptIIキメラ遺伝子組み合わせについての 、10のトランスジェニック事象におけるnptII遺伝子発現の相対レベルを表すグ ラフである； 図6Aおよび6Bは、dru1遺伝子のゲノムDNA配列を示す。図で示されているのは 、 CAATボックス、TATAボックス、ATG開始コドン、２つのエキソン、１つのイント ロン、スプライス部位、終止コドンおよびポリアデニル部位である； 図7Aおよび図7Bは全長dru1プロモーターのDNA配列を示す； 図８は、dru110プロモーターのDNA配列を示す； 図９は、dru259プロモーターのDNA配列を示す； 図10は、キイチゴ小核果タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の 代表的な結果を示す； 図11Aおよび11Bは、キイチゴdru1遺伝子の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-P CR; Kawasakiら、1989;Wangら、1990）クローン化を模式的に示す； 図12は、dru1の遺伝子構成およびタンパク質構造の模式図を示す； 図13は、dru1のコード配列のKyte-Doolittleの親水性(hydrophilicity)プロッ トを示す。図において、親水性ウインドウサイズは7である； 図14は、キイチゴ葉および花托におけるdru1 RNA発現のRNAドットプロット分 析を示す。RNAは、緑(green)、成熟緑(mature green)、変色(breaker)およびオ レンジ(orange)／完熟(ripe)キイチゴ(それぞれ、I、II、IIIおよびIV期に対応 する）から単離した； 図15は、キイチゴ葉および果実におけるdru1 RNAの発現を評価するRNAハイブ リダイゼーション研究の結果を示す； 図16は、成熟の種々の期での小核果から得られるキイチゴ小核果タンパク質の ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の結果を示す、そして 図17Aおよび17Bは、プラスミドpAG-1542の構築をまとめるフローチャートを示 す。発明の詳細な説明 I．定義 本明細書中で用いられる以下の用語は、示されるような意味を有する： 本明細書中で定義される「キメラ遺伝子」は、異なる遺伝子の部分から構成さ れる非天然に生じる遺伝子をいう。キメラ遺伝子は、代表的には、「異種」DNA 配列に作動可能に連結されたプロモーター配列から構成される。植物への形質転 換のための本発明の代表的なキメラ遺伝子は、キイチゴdruプロモーター（例え ば、dru110またはdru259プロモーター）、異種構造DNAコード配列（例えば、ア ミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（nptII）遺伝子）、および３’非翻 訳ポリアデニル化部位を含む。 「構成的」プロモーターは、特定の型の細胞および組織においてより高度なレ ベルでRNA合成を指向する組織プロモーター（例えば、例えば、トマトE4またはE 8プロモーターのような果実特異的プロモーター（Cordesら,1989; Bestwickら、 1995)）に対して、植物形質転換体の多くのまたは全ての組織において、RNA産生 を指向するプロモーターをいう。 「プロモーター」とは、下流の異種遺伝子の転写を指向させ、そしてオペレー ター領域との結合、ランダムまたは調節変異誘発、エンハンサー配列の付加また は複製、合成リンカーの付加または修飾などの手段により誘導されるプロモータ ーを含むDNAの配列が意味される。 「植物プロモーター」により、ネイティブな形態で植物ゲノムDNAに由来した プロモーター（上記）が意味される。 「キイチゴプロモーター」は、ネイティブな形態でキイチゴゲノムDNAに由来 したプロモーター（上記）をいう。例えば、dru110またはdru259のようなdru1プ ロモーターは、ネイティブなキイチゴゲノムでdru1遺伝子のコード領域に作動可 能に連結した非コード調節領域である。 特定の遺伝子に由来するキイチゴプロモーター（例えば、dru110またはdru259 のようなdru1遺伝子由来のキイチゴプロモーター）は、プロモーターの少なくと も１つ以上の領域が特定のキイチゴ遺伝子に由来するプロモーターを含む。この 型のプロモーターの例は、プロモーター（例えばdru259プロモーター）の領域が 、宿主細胞における得られたキメラ遺伝子の発現を実質的に低減させたり、また は非改変dru259プロモーターの機能を改変したりすることなく、異なる遺伝子に 由来する１つ以上の配列と置き換えられているプロモーターである。 「プロモーター長」とは、適切な標準（カリモウイルスキャッサバ斑点葉脈ウ イルスプロモーターCASまたはhsp80プロモーター）と比較した、植物組織（単数 または複数）における異種遺伝子のプロモーター制御型（例えば、dru110、dru2 59）発現のレベルをいう。発現レベルは、適切なレポーター遺伝子（例えば、GU S（β-グルクロニダーゼ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、またはnptII（ネオマ イシンホスホトランスフェラーゼ））にプロモーターを連結させることにより測 定され得る。レポーター遺伝子の発現は、蛍光測定、分光光度測定、または組織 化学アッセイ（Jeffersonら、1987a;Jefferson，1987b）により、容易に測定さ れ得る。 本発明の目的のために、中程度のプロモーターとは、hsp80のようなプロモー ターにより得られるレベルの約10〜約90％でレポーター遺伝子の発現を駆動する プロモーターである。 「異種」DNAコード配列は、形質転換を受ける植物にとってネイティブでない か、またはタンパク質産物の改善された特徴付けのために操作された構造的コー ド配列である。 プロモーターに関して、異種とは、現在結合しているプロモーターと同じ遺伝 子において天然に存在しないコード配列をいう。 dru1遺伝子と配列同一性を共有するとみなされる遺伝子か、またはその特定の 領域（単数または複数）は、本明細書中に示されるキイチゴdru1ポリヌクレオチ ド配列（例えば、配列番号１〜４）に対応するポリヌクレオチド配列の長さにわ たって少なくとも約60％または好ましくは80％の全配列同一性を有する。 「配列同一性」は、本質的に以下のように決定される。同じ長さの（好ましく は、遺伝子のコード配列に対応する）２つのポリヌクレオチド配列は、もし、AL IGNプログラムを用いてそれらを整列させたとき、最高のスコアのアラインメン トにおいて核酸の60％以上か、または好ましくは80％以上が、１のktup、デフォ ルトのパラメーターおよびデフォルトのPAM行列（Dayhoff，1972）を用いて同一 に整列された場合、互いに同一（すなわち、相同）であるとみなされる。 ALIGNプログラムは、FASTAバージョン1.7配列比較プログラムのスイート（Pea rsonおよびLipman，1988; Pearson 1990;プログラムは、William R．Pearson，D epartment of Biological Chemistry，Box 440，Jordan Hall，Charlottesville ,VAから入手可能）において見い出される。 ２つの核酸フラグメントは、それらがコード配列あるいはその変異体に対して 特異的にハイブリダイズし得るか、またはポリメラーゼ連鎖増幅反応を特異的に プライムし得る場合、dru1遺伝子に由来するポリヌクレオチドに対して「選択的 にハイブリダイズ可能」であるとみなされる：（i）例えばManiatisら、1982、3 20頁〜328頁および382頁〜389頁に記載される代表的なハイブリダイゼーション および洗浄条件下で;（ii）せいぜい約25〜30％の塩基対のミスマッチを許容す るような低減したストリンジェンシーの洗浄条件を使用すること、例えば：２× SSC（ナトリウム、3.0 M NaClおよび0.3 M クエン酸ナトリウムを含む、pH7.0 ）、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）溶液、室温で30分ずつ２回；次いで、 ２×SSC、0.1％SDS、37℃、30分１回；次いで、２×SSC、室温で２回、各10分間 、または（iii）標準的な条件下の代表的なポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（例え ば、Saikiら、1988）における使用のためのプライマーを選択すること、このプ ライマーは、所望の標的配列またはその変異体の配列の特異的な増幅を生じる。 好ましくは、高度に相同な核酸鎖は、20〜40％未満の塩基対のミスマッチを含 み、さらにより好ましくは、５〜20％未満の塩基対のミスマッチを含む。これら の相同性（すなわち配列同一性）の程度は、当業者に周知の方法で、遺伝子ライ ブラリー（または、遺伝物質の他の供給源）からクローンを同定するための適切 なストリンジェンシーの洗浄条件を使用することにより選択され得る。 「dru1コード化プロペプチド」は、dru1コード化ポリペプチドに相同な（すな わち、本質的に同じ配列同一性を有する）任意のポリペプチドとして本明細書で 定義される。１つの実施態様において、ポリペプチドは、dru1またはその変異体 の配列に対して選択的にハイブリダイズする核酸によってコードされる場合、dr u1コード化ポリペプチドに相同である。 別の実施態様において、ポリペプチドは、上記のように、dru1またはその変異 体によりコードされる場合、dru1コード化ポリペプチドに相同である。この群の ポリペプチドは、代表的には、15、好ましくは25、またはより好ましくは35より 大きい連続したアミノ酸である。さらに、約60アミノ酸より長いポリペプチドに ついて、「ポリペプチド相同性」または「ポリペプチド配列同一性」を決定する ための配列比較が、局所アラインメントプログラムLALIGNを用いて実施される。 ポリペプチド配列は、上記のように、１のktup、デフォルトのパラメーターおよ びデフォルトのPAMを有するLALIGNプログラムを用いて、dru1アミノ酸配列また はその変異体のいずれかに対して比較される。 60アミノ酸より長い最適化アラインメント、および55％または好ましくは80％ より多くの同一に整列されたアミノ酸を有する任意のポリペプチドは、「相同な ポリペプチド」であるとみなされる。LALIGNプログラムは、FASTAバージョン1.7 配列比較プログラムのスイート（PearsonおよびLipman，1988; Pearson 1990;プ ログラムは、William R.Pearson,Department of Biological Chemistry,Box440 ，Jordan Hall，Charlottesville，VAから入手可能）において見い出される。 ポリヌクレオチドは、それがdru1タンパク質コード配列、dru1のcDNAまたはそ れらの相補配列の領域と同一か、実質的に同一の塩基対配列を有する場合、また は上記の相同性を示す場合、dru1「由来」である。 ポリペプチドまたはポリペプチド「フラグメント」は、それが(i)dru1遺伝子 によりコードされるか、または(ii)上記のようにdru1コード化ポリペプチドと相 同性を示す場合、dru1「由来」である。 本発明の文脈において、表現「核酸配列」は、タンパク質、ポリペプチド、ま たはペプチドをコードする配列をいう場合、相同なタンパク質、ポリペプチド、 またはペプチド配列、ならびに開示される配列をコードする縮重核酸配列を含む ことが意図される。 本明細書中で使用されるように、「植物細胞」は、未分化組織（例えば、カル ス）ならびに植物種子、花粉、プロガグル（progagule）および胚を含む植物由 来の任意の細胞をいう。 II．キイチゴdru1プロモーターの同定および単離 本発明は、１つの局面において、ネイティブなキイチゴゲノムにおいて（i）d ru1遺伝子のコード領域に作動可能に連結されていて、そして(ii)中程度の強度 の構成的プロモーターとして機能する、プロモーターに関する。本発明のこの局 面は、果実成熟において非常に高レベルで発現される、キイチゴにおけるdru1遺 伝子の発見に基づく。全長dru1プロモーターにより指向される発現は果実特異的 で、かつ果実成熟の間活性である。 dru1プロモーターの機能的活性に対して、両方が全長キイチゴdru1プロモータ ー由来の、（i）構成的プロモーターとして機能する（すなわち、果実特異的で はない）そして、（ii）中程度のレベルでその制御下で遺伝子の発現を駆動する ２つのプロモーターが、予想外に発見され、以下でより詳細が説明される。 キイチゴ由来のdru1遺伝子の同定、ならびに本発明の２つの例示のdru1プロモ ーター、dru110およびdru259の単離を、以下に説明する。 A．dru1 タンパク質同定、精製、および配列決定 キイチゴにより産生されるタンパク質のような、果実成熟により産生されるタ ンパク質（単数または複数）は、代表的にはゲル電気泳動で分析される。可溶性 小核果タンパク質のクマシーブルー染色SDSポリアクリルアミドゲルを、図１０ （実施例1A-B）に示す。図10から分かり得るように、キイチゴから単離可能な２ つの非常に豊富なタンパク質が、約17および15kDで観察され、そして、本明細書 中においては、それぞれdrupe１およびdrupe２と称する。全量に対するdrupe１ およびdrupe２の可溶性タンパク質の量は、例えば、走査型デンシトメトリーに より、決定され得る。図10において例示されたゲルの走査型デンシトメトリー分 析は、drupe１およびdrupe２がそれぞれ、キイチゴ小核果の全可溶性タンパク質 の約23％および約37％を構成することを示す。本決定の結果（すなわち、drupe １およびdrupe２の高レベル）として、drupe１およびdurpe２の精製および配列 決定は、例えば、直接ウェスタンブロットアプローチを用いることにより、実施 され得る。 ウェスタンブロット分析を実施することにおいて、全小核果タンパク質をPDVF 膜にウェスタンブロットし(実施例1B)、そしてdrupe１およびdrupe２に対応する 領域をN末端アミノ酸配列分析に供する。drupe１サンプルは30アミノ酸N末端配 列を生じる（実施例1B）。アミノ末端drupe１配列を、本明細書中で配列番号１ １として示す。 Ｂ．dru1 コード配列のクローン化 1．dru1 cDNA クローンのRT-PCRおよびクローン化。遺伝子のゲノムコピーの cDNA合成から逆PCRまでの、dru1クローン化のための全手順を、図11Aおよび11B に模式的に示す。 クローン化手順を実行することにおいて、成熟緑キイチゴ小核果mRNAを、実施 例2Aおよび2Bに記載のように調製し、そしてcDNA合成反応においてテンプレート として使用する。反応は、図11Aおよび11Bにおいて示されるdTRANDOMプライマー （配列番号12）を使用してプライムする。得られたcDNA（実施例2C）を、dTRAND OMプライマーの一部およびdrupe1アミノ末端配列に基づいた512倍縮重プライマ ー（Drupe20）に対応するプライマーを用いて標準PCR反応に供する（実施例３） 。 次いで、PCR増幅産物を分析する。上記のPCR反応からの産物は、710bp産物を 含み、これは、アガロースゲル精製され、そしてベクターpCRIIにサブクローン 化される（実施例３）。続くこれらのクローンのいくつかの配列解析により、dr upe1のアミノ末端配列に合致するタンパク質をコードする配列を有するそれらの クローンの同定が可能になる。 ２．dru1 遺伝子のゲノムコピーの逆PCRクローン化。dru1遺伝子のクローン 化のこのアプローチにおいて、ゲノムキイチゴDNAが、上記のように得られたcDN A配列に対して内部にあるプライマーを用いてPCR反応において使用される（実施 例４）。この反応は、タンパク質コード領域のほとんどを含むdru1遺伝子のゲノ ムクローンを生じる。１つのイントロンが、このクローンの続く配列分析から同 定された（図6B）。逆PCR戦略は、dru1プロモーターを含む遺伝子の５’領域を 特徴付けそして配列決定するのに使用され得る（実施例５）。図11Aおよび図11B は、これがどのようにして達成され得るかを模式的に示す。 逆PCR技術を用いるdru1ゲノムDNAの５’隣接領域の特徴づけにおいて、キイチ ゴゲノムDNAをNsiIで消化し、そして希釈条件下で連結させ、制限フラグメント の環化を行う。次いで、連結DNAを、dru1コード配列に対して内部であり、かつ 互いに反対方向を向いたプライマーを使用したPCR増幅に供する。これは、第一 エキソンの一部およびこのプロモーターの1.35kbを含むPCR反応産物を産生する 。前述のクローンからの配列情報と組み合わせた本クローンの続く配列分析は、 完全dru1配列を生じる。 ３．遺伝子発現パターンの配列決定および評価。dru1遺伝子（図6A、6B）は 、配列番号20に示された推定アミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。こ のタンパク質の推定分子量は17,088であり、これは、全小核果タンパク質のゲル 電気泳動により決定される17kdの分子量（図10を参照のこと）と密に合致する。 dru1タンパク質は、比較的酸性で、推定pIは4.8である。現在の配列データベー ス の核酸およびタンパク質相同性サーチが、有意な合致を検索するために実行され 得る。dru1については、現在の配列データベースの核酸およびタンパク質相同性 サーチは、有意な合致を生じなかった。この結果は、タンパク質のアミノ末端配 列によって得られた、drupe1が新規タンパク質であるという元の観察を支持する 。 dru1の遺伝子発現パターンはまた、全長プロモーターの組織特異性を確認する ために、RNAおよびタンパク質レベルで評価され得る。異なる成熟期におけるキ イチゴ葉および花托由来の全RNAのノーザンドットブロット（図14および図15） は、組織および期特異的な遺伝子発現パターンを示す。これは、種々の他の植物 組織に由来する全RNAのノーザンブロットの比較により確認され得る。dru1の組 織および期特異的遺伝子発現パターンは、葉、花托、および小核果由来の全RNA のノーザンブロットにおいて確認された（図14および15を参照のこと）。両方の 場合において、葉RNAではdru1発現は観察されない。花托におけるRNA発現パター ンは時間的に調節されており、一方小核果においては、分析された２つの期（す なわち緑および完熟）において完全に発現される。 異なる成熟期由来の小核果溶解物のタンパク質ゲルもまた実施され、dru1の期 特異的発現をさらに支持し得る。図16に示されるように、種々の成熟期（すなわ ち、緑、成熟緑、変色、オレンジ、および完熟）の小核果から得られたキイチゴ 小核果タンパク質の電気泳動分析は、小核果における期特異的発現パターンをさ らに支持する（図16）。 Ｃ．全長dru1プロモーターの単離 dru1ゲノムクローンの特徴付けは、dru１プロモーターの単離を可能にする。 典型的な全長dru1プロモーターのヌクレオチド配列を、配列番号２に示す。 III．プロモーターdru110およびdru259の単離 本発明の２つの代表的なキイチゴプロモーター、dru110およびdru259が、dru1 プロモーターの全長転写物から単離され、期および果実特異的プロモーターであ ると特徴づけられた。驚くことに、これらの２つの新規のdru１由来プロモータ ーは、異種遺伝子と融合され、そして形質転換植物において得られる発現パター ンの結果について評価した場合、中程度のレベルの、構成的プロモーターとして 機能することが見い出された。 切断されたdruプロモーター、dru110およびdru259は、実施例７および８に記 載のように全長dru1プロモーターから得られ得る。 このアプローチを利用することにおいて、第１エキソンの一部およびdru1プロ モーターの1.35kbを含むPCR反応産物（節II.Ｂ.2で上記）は、プラスミドpCRII （Invitrogen、Carlsbad，CA）に連結され、全長dru1プロモーターを含むサブク ローンpAG-310が、図１および２に示されるように形成する。次いで、pAG-310か らの1.3kb DNAフラグメントを、プライマーDrupeUp（５’プライマー、配列番号 ７）およびDruneLow（３’プライマー、配列番号８）を用いて標準条件下でPCR 増幅する。 増幅されたDNAの回収は、代表的には、反応混合物への溶媒の添加、続いて、 遠心分離、水相の回収、および酢酸ナトリウムによる沈澱により実施される。次 いで、回収されたDNAは、代表的には、遠心および洗浄の反復、それに続く回収 されたペレットの乾燥により精製される。 1.3kb DNAフラグメントは、制限酵素NsiIおよびXbaIを用いて完全に消化され 、続いて精製およびXbaIおよびPstIで消化された植物発現ベクターp35S-GFP（Cl ontech，Palo Alto，CA）に連結される。制限酵素PstI（p35S-GFPを消化するの に用いられた）およびNsiI（dru1 PCR産物を消化するのに用いられた）の両方が 、同じ３’突出付着末端（TGCA）を生成し、それゆえ連結の際にどちらの制限部 位も再構築されない。得られた中間プラスミドは、pAG-155と命名され、模式的 に図１および２に示される。 キイチゴdru259プロモーターの単離は、プラスミドpAG-155を、ともに平滑末 端カッターである、制限酵素SnaBIおよびEcoRVで消化し、259bp dru1プロモータ ーフラグメント（本明細書中でdru259という）を放出することにより達成される 。 キイチゴdru110プロモーターの単離は、プラスミドpAG-155において、プライ マーdru1-118H3（配列番号９）およびGFPStartR（配列番号10）を用いて、標準 的なPCR反応条件下で行われるdru1の166bpフラグメントを増幅することにより達 成される。次いで、増幅された産物は反応混合物から回収され、そして上記のよ うに精製し、続いて、HindIIIおよびEcoRVを用いて166bpの産物を消化して、本 明細書中でdru110という112bpプロモーターを生成する。 キイチゴプロモーター、dru110およびdru259は、異種遺伝子の発現を調節する ために使用され得る。druプロモーターの例であるdru259は、本明細書中に配列 番号４で示されるヌクレオチド配列を有する。druプロモーターの例であるdru11 0は、配列番号３で示されるヌクレオチド配列を有する。 dru259およびdru110にそれぞれ対応するヌクレオチド配列を含む例示的なサブ クローンpAG-431およびpAG-421の構築は、図１および２に示される。 IV．植物dru1プロモーターの同定 本発明はまた、種々の植物供給源（例えば、キイチゴ）由来のdru1プロモータ ー（例えば、dru110およびdru20a）の同定および単離のための方法を提供する。 このようなプロモーターは、異種遺伝子（例えば、選択マーカー遺伝子および除 草剤耐性を与える遺伝子）を含むベクター構築物の作製に有用である。 サザンブロット実験は、例えば、イチゴ、モモ、またはスモモにおいてキイチ ゴdru1遺伝子と相当な配列同一性を有する（すなわち、代表的には、標準的な配 列比較プログラムを用いて、55％より高く、より好ましくは80％同一性より高い ）DNA分子の存在を実証するのに使用される。同様のサザンブロット分析が、他 の果実含有植物においてさらなるdru1遺伝子を同定するのに実施され得る。 dru1ホモログは、キイチゴdru1遺伝子のコード配列を含む標識DNAフラグメン トを用いてプローブされる植物のゲノムDNAサザンブロット(Ausubelら、1992)に おいて同定される。 プローブは、代表的には、プロモーター配列よりはむしろdru1のコード配列を 含むように選択される。なぜなら、コード配列は、代表的には、プロモーター配 列よりも種から種でより保存されているからである。プローブ分子は、プライマ ー特異的増幅（Mullis、1987；Mullisら、1987）を用いてキイチゴゲノムDNAか ら生成される。オリゴヌクレオチドプライマーは、増幅領域が本明細書中に提供 されるキイチゴdru1遺伝子の全コード配列を含むように選択される。プライマー はまた、キイチゴdru1遺伝子の選択された領域のみを増幅するように選択され得 る。 あるいは、プローブは、プラスミドDNA由来の目的の配列を含む制限消化フラ グメントを単離することにより作製され得る。 このプローブは、相同標的分子の続きの同定を可能にするために、検出可能な 部分で標識される。標識部分の例は、商業的供給源から入手可能な放射性ヌクレ オチド（例えば、³²P標識ヌクレオチド、ジゴキシゲニン標識ヌクレオチド、ビ オチン化ヌクレオチドなど）を含む。 プライマー増幅プローブの場合、標識ヌクレオチドは、増幅プロセスの間に直 接プローブに取り込まれ得る。プラスミドDNA由来の制限消化フラグメントのよ うな、すでに単離されたDNA由来のプローブ分子は、代表的には末端標識される （Ausubelら、1992）。 上記の植物のゲノム由来のHindIIIDNAフラグメントのような標識分子は、ゲル 上で電気泳動され、ナイロンまたはニトロセルロースフィルター上にブロットさ れ、そして固定化される。次いで、標識プローブ分子は、プローブ分子とプロー ブ分子に相同な標的分子との間の特異的ハイブリダイゼーションに好ましい条件 下で、標的分子と接触される（Maniatisら、1982；Sambrookら、1989;Ausubelら 、1992）。 dru1遺伝子を含む植物の同定に続いて、プロモーター領域を含む、所望の遺伝 子を含むDNAは、例えば、キイチゴdru1遺伝子の単離のために本明細書中に記載 された方法により、おのおのの種から単離され得る。切断プロモーターの生成は 、例えば、dru110およびdru259プロモーターの単離のために、本明細書中に記載 されたような５’欠失により達成され得る。 dru1プロモーターの変異体は、上述の方法により異なるキイチゴ品種および他 の植物から単離され得る。GUS（β-グルクロニダーゼ）のようなレポーター遺伝 子が、このようなプロモーターにより調節される構成的な中程度のレベルの発現 について組織を試験するのに使用され得る。GUSタンパク質の発現は、蛍光計的 、吸光度計的、または組織化学的アッセイ（Jefferson，1987a; Jefferson 1987 b）により容易に測定され得る。 さらに、レポーター遺伝子配列に作動可能に連結されたdru1プロモーター配列 を含むキメラ遺伝子を使用して、例えば、欠失分析（Benfeyら、1990）を用いて 、 調節ドメインに対応するDNA配列が同定され得る。例えば、配列番号４に示され るdru259プロモーター配列は、機能的にGUSレポーター遺伝子に連結され得る。 次いで、欠失分析が、標準方法（Ausubelら、1992；Maniatisら、1982;Sambrook ら、1989）により実行される。あるいは、全長dru1プロモーター配列の領域は、 図１および２に例示されるように配列特異的プライマーを用いてPCRで増幅され 得る。次いで、これらの増幅されたフラグメントは、GUSコード配列の５’に挿 入され、そして生じる発現パターンが、本発明のキイチゴプロモータの特徴であ る中程度レベルの構成的発現について評価され得る。 Ｖ．植物形質転換 本発明の支持において、異種DNA配列に作動可能に連結したキイチゴ植物プロ モーター配列を含む例示的なキメラ遺伝子が構築される。キメラ遺伝子構築物の 例は、dru110pro:nptII（実施例10）およびdru259pro:nptII（配列番号９）を含 む。nptII遺伝子により発現され得るタンパク質、ネオマイシンホスホトランス フェラーゼは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼであり、これは、産 物を発現するトランスジェニック植物にカナマイシン耐性を与える。このタンパ ク質、ならびに他の選択可能なマーカー産物、および除草剤耐性を与える産物は 、トランスジェニック植物において（i）構成的に、および（ii）（過剰発現よ りはむしろ）中程度のレベルで発現される場合、より効率よく機能し得る。した がって、プロモータの例、dru110およびdru259はこの目的を満たすのに理想的な プロモーターを示す。 Ａ．Agrobacterium バイナリー植物形質転換ベクターの構築 上記の代表的な２つのキメラ遺伝子を含むAgrobacteriumバイナリーベクターp AG-7242およびpAG-7342の構築は、実施例10および実施例19（図３〜４において 、それぞれdru110pro:nptIIおよびdru259pro:nptIIを模式的に示す）に記載のよ うに実施され得る。これらのバイナリーベクターはまた、SAMase、S-アデノシル メチオニンヒドロラーゼ（Ferroら、1995；Hughesら、1987）をコードする遺伝 子を含み、これらは本発明に対して未成熟である。 １．dru259::nptII キメラ遺伝子を含むバイナリー植物形質転換ベクターpAG -7342 の構築 。バイナリー植物形質転換ベクター、pAG-7342は、13kb nos pro::n ptIIフラグメントをサブクローンpAG1542からHindIIIおよびBamHIを用いた消化 により切り出し、続いて、サブクローニングベクターpAG-431由来の1.1kb HindI II-BamHIフラグメントに連結し、dru259::nptIIキメラ遺伝子を挿入することに より構築した。 プラスミドpAG-1542は、当該分野で公知の従来のクローニング技術（Sambrook ら、1989）を用いて調製され得る。この例示的なサブクローニングバイナリーベ クターは、レフトボーダーの近くに位置するnosプロモーターの制御下のネオマ イシンホスホトランスフェラーゼII選択可能マーカー遺伝子（nptII）遺伝子、 およびライトボーダー近くに位置するトマトE8プロモーター（Deikmanら、1988 ；Deikmanら、1992）によって駆動されるSAMase遺伝子(Ferroら、1995)を含む。 前述のように、トマトE8:SAMase構築物の存在は、本明細書中に記載の発現結果 に対して重要でない。 dru259::nptIIキメラ遺伝子を含むサブクローンpAG-431の構築は、実施例７に 記載される。バイナリー植物形質転換ベクターpAG-7342の構築は、図４に模式的 に示され、そして実施例９で詳細に説明される。 プラスミドpAG-1542の構築をまとめたフローチャートは図17に示される。 ２．dru110::nptII キメラ遺伝子を含むバイナリー植物形質転換ベクターの 構築 。類似のアプローチを利用して、バイナリー植物形質転換ベクター、pAG-72 42は、13kb nos pro::nptIIフラグメントを、サブクローンpAG1542からHindIII およびBamHIを用いた消化により切り出し、続いて、pAG-421由来の0.95 kb dru2 59::nptIIフラグメントに連結し、バイナリー植物形質転換べクターpAG-7242を 形成することにより構築される。 バイナリー植物形質転換ベクターpAG-7242の構築は、図３に模式的に示され、 そして実施例10で説明される。dru110::nptキメラ遺伝子を含むサブクローンpAG -421の構築は、実施例８に記載される。 Ｂ．植物の形質転換方法 上記のキメラ遺伝子は、例えば、植物細胞に挿入され得る。これらの例示的な キメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物は、本発明のキイチゴプロモーター により調節されており、抗生物質カナマイシンに対する耐性を産物を発現する植 物に与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼIIを発現する。 本発明の支持において実施された実験において、キメラ遺伝子は、トマト植物 細胞に挿入され、そして得られたnptII選択可能マーカー遺伝子の発現のレベル とパターンが試験された。nptIIは、その制御下に遺伝子の発現を調節するため の本発明のキイチゴ植物プロモーターの能力を例示するマーカー遺伝子の例とし て選択されたが、これは、任意の多数の異種遺伝子の発現が本発明のプロモータ ーにより指向され得ることが理解される。 例えば、nptIおよびnptIIは、それらのアミノ酸配列および基質特異性の両方 で差異を有する異なる別々の酵素である（Beckら、1982）。本発明のキイチゴプ ロモーターは、これらのネオマイシンホスホトランスフェラーゼのいずれかの発 現を指向するのに適している。 本発明のキイチゴプロモーターを用いた形質転換に適した植物は、キイチゴ、 トマト、イチゴ、バナナ、キーウィフルーツ、アボカド、メロン、マンゴ、パパ イヤ、リンゴ、モモ、ダイズ、ワタ、アルファルファ、アブラナ、アマ、テンサ イ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トウモロコシ、コムギ、イネ、およびレタ スを含むが、これらに限定されない。 キイチゴプロモーター（例えば、dru110およびdru259）を含むキメラ遺伝子は 、多数の植物形質転換方法のいずれかにより、植物細胞に移入され得る。本明細 書中で使用される、１つのこのような方法は、A．tumefaciensにより保有される T-DNAを欠くTiプラスミドへのキメラ遺伝子の挿入、それに続く、植物細胞とA． tumefaciens細胞の共存培養を含む。 実施例11に提供されるように、Agrobacteriumバイナリー植物形質転換ベクタ ー、pAG-7242およびpAG-7342は、個々に、エレクトロポレーション（Nagelら、1 990）によりA．tumefaciensの無毒化した株に導入され、それに続いて、トマト 植物細胞と共存培養し、キメラ遺伝子をトマト植物細胞に移入する。 Agrobacteriumに基づく方法に加えて、代替の方法（例えば、リーフディスク に基づく形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およ びマイクロプロジェクタイルボンバードメント（パーティクルガン形質転換）） が、植物宿主の形質転換を誘発するために使用され得る。これらの方法は、当該 分野で周知であり（Fryら、1987;ComaiおよびConing，1993;Kleinら、1988;Miki ら、1987;Belliniら、1989）、そして植物ゲノムへの選択されたDNAを導入する 手段を提供する。このようなDNAは、異種コード配列に機能的に隣接するキイチ ゴプロモーター（例えば、dru110、dru259）からなるDNAカセットを含み得る。 さらに、反復培養選択法が、植物形質転換体を作製するのに使用され得、そし て特にキイチゴのような木本種の形質転換に適している。この方法は、1995年12 月28日に公開された、国際公開番号第WO 95/35388号に「植物遺伝子形質転換法 およびトランスジェニック植物」というタイトルで、詳細に記載される。 反復性培養選択形質転換法の使用において、目的のキメラ遺伝子は、例えば、 目的のベクターを含むAgrobacteriumの存在下で標的外植片を共存培養すること により、標的植物組織外植片の細胞に挿入される。代表的には、共存培養は、液 体中で約１日〜約３日の間実施される。植物組織外植片は、種々の植物組織（葉 、子葉、葉柄および分裂組織を含むがこれらに限定されない）から得られ得る。 次いで、形質転換外植片細胞は、閾値濃度の選択薬剤を有する選択培地におい て培養されるそれらの能力についてスクリーニングされる。選択培地において生 長し得る外植片は、代表的には、同じ培地の新鮮な供給源へ移され、再び培養さ れる。次いで、外植片は、再生条件で培養されて、再生植物苗条を生成する。次 いで、これらの再生苗条は、外植片を生成するのに使用される。次いで、選択さ れ再生した植物苗条からのこれら外植片は、高濃度の選択薬剤で培養される。こ れらの反復培養法は、本質的に純粋なトランスジェニック外植片が得られるまで 反復される。 純粋なトランスジェニック外植片は、再生植物苗条を外植片に分け、この外植 片を培養し、そして全ての外植片の生長が使用された選択薬剤の最高濃度に耐性 であることを確かめることにより同定される。すなわち、選択薬剤の存在下で、 外植片細胞の壊死または有意な退色は存在しない。本質的に純粋なトランスジェ ニック外植片の産生の確認の際に、トランスジェニック植物は、純粋なトランス ジェニック外植片から植物を再生することにより生成される。 Ｃ．植物形質転換体の同定および評価 トランスジェニック植物は、産物mRNA、DNA、タンパク質を合成する能力につ いておよび／またはアミノグリコシド抗生物質（例えば、カナマイシン）に対す る耐性について、アッセイされる。アッセイは、代表的には、種々の植物組織供 給源（例えば、葉、茎、または果実）を用いて実施される。 葉に基づくアッセイは、異種遺伝子（トランスジーン）を駆動するキイチゴプ ロモーターが、葉の組織内で少なくともいくらか活性である場合、例示的なプロ モーターdru110およびdru259についての場合と同じように、有益である。このよ うな場合、葉に基づくアッセイは、トランスジーンの発現レベルの最初のスクリ ーニングに有用である。なぜなら、果実に基づくアッセイよりはるかに早く実施 され得るからである。反対に、果実に基づくアッセイは、果実のような標的組織 自身におけるトランスジーンの発現のより正確なデータを提供する。 RNAに基づくアッセイは、例えば、RNase保護アッセイ（RPA）を用いて実施さ れ得る。このようなアッセイを実施する場合、mRNAは、代表的には形質転換植物 および野生型植物の両方に由来する植物細胞から抽出される。RNAase保護アッセ イ（RPA）は、以前にLeeら、1987により記載されたように、Ambion Inc（Hialea h,FL）の「RPAII」キットを用いて、製造者の指示に従って実施され得る。 キイチゴプロモーターにより調節されるキメラ遺伝子を含むトランスジェニッ ク植物についての遺伝子発現パターンはまた、ノーザンドットブロットを実施す ることにより評価され得る（例えば、実施例６）。プロモーター機能（すなわち 、組織および／または期特異的な発現、あるいは構成的な発現）は、異なる成熟 期での葉と果実組織由来の総RNAのノーザンブロットと、他の種々の植物組織由 来の総RNAのノーザンブロットとを比較することにより評価され得る。 本発明の支持により実施された実験は、キイチゴプロモーターdru110およびdr u259が、期または組織特異的プロモーターとして機能しないことを示す。これは 、いくらか驚くべきことである。なぜなら、全長dru1プロモーターにより調節さ れる、dru1の組織および期特異的な遺伝子発現パターンが、葉、花托、および小 核果からの全RNAのノーザンブロットにより検証されるからである。 本発明のキイチゴプロモーターにより調節される下流異種遺伝子の発現のさら なる確認として、ウェスタンブロット分析が実施され得る。代表的なウェスタン ブロット実験の実施において、総可溶性タンパク質が、凍結植物組織から抽出さ れ、そして、例えば、Coomassie Plusタンパク質アツセイ（Pierce，Rockford,I L）を用いて測定される。既知量の可溶性タンパク質、または既知量の精製タン パク質産物（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII、ポジティブコ ントロール）をポリアクリルアミドゲルで分離し、そしてナイロンメンブランに 移される。次いで、結合したタンパク質は、タンパク質産物に特異的に免疫応答 性のモノクローナル抗体でプローブされる。 本発明のキイチゴプロモーターにより指向される遺伝子発現を確認するための 別のアプローチにおいて、サザンハイブリダイゼーション分析が実施される。代 表的には、植物DNAは、凍結植物組織を抽出緩衝液中での粉砕により抽出され、 続いて、遠心分離、得られた上清の分離、そして塩化セシウム沈澱を行う。次い で、得られたCsCl勾配物は、さらなる時間（例えば、48時間）遠心分離され、そ して回収されたDNAは透析され、そしてエタノールで沈澱される。植物DNAの回収 の際に、DNAは、DNAフラグメントを得るために適切な制限酵素で消化され、続い てアガロースゲルで電気泳動分離される。得られたバンドはニトロセルロース （Southern、1975）に移され、次いで、ブロットは、トランスジーンのヌクレオ チド配列を含む標識DNAフラグメントでプローブされて、上記のように、キイチ ゴプロモーターキメラ遺伝子構築物に対応するDNAの存在を確認する。 Ｄ．遺伝子発現およびプロモーター強度の比較評価 本発明の支持により実施された実験は、本発明のキイチゴプロモーター（例え ば、dru110、dru259）に作動可能に連結されたキメラ遺伝子によるトマト植物の 形質転換を示す。これらの実験の結果から明らかなように、本発明のキイチゴプ ロモーターは、その制御下に配置した遺伝子の発現を調節し得、そして中程度レ ベルの構成的なプロモーターとして機能する。 トマト植物は、植物形質転換ベクターpAG-7242およびpAG-7342（各々nptII遺 伝子に作動可能に連結されたキイチゴプロモーターを含む）により形質転換され た（実施例11）。上記の節V.A.1-2で詳細に説明されたように、植物形質転換ベ クターpAG-7242は、dru110::nptII遺伝子を含み；そして構築物pAG-7342は、dru 259::nptII遺伝子を含む。nptII遺伝子に融合されるhsp80プロモーターまたはCA Sプロモーター（カリモウイルスキャッサバモットルベイン(caulimovirus cassv a mottle vein）（ウイルスプロモーター）のいずれかを含むキメラ遺伝子はま た、調製され、そしてトマト植物を形質転換するのに使用され、本発明のキイチ ゴプロモーターの能力を評価するための比較基準を提供する。 上記の構築物を用いた10の別々のトランスジェニック事象からの結果は実施例 12に提供される。植物形質転換体におけるnptII酵素活性の存在を検出するため に、培養時に入手可能な根のある植物の葉組織由来のタンパク質抽出物はELISA でアッセイされた。いくつかの場合において、１つの植物のみがアッセイに利用 可能であるが（例えば、表１、最後の２行、IV列）、一方他の例においては（例 えば、表１、２行、IV列）10の別々のトランスジェニック事象が分析に利用可能 であった。 ここで、本発明のキイチゴプロモーター（dru110、dru259）を含むトランスジ ェニック植物に関連して、表１の結果（特に、３〜７行）から示され得るように 、nptII酵素活性は、アッセイした植物の高い百分率で検出され、その値は使用 された選択薬剤の濃度および試験した根のある植物の数に依存して約20〜100％ の範囲であった。これらの結果は、公知のプロモーター::nptII構築物を含むト ランスジェニック植物について得られる結果と匹敵し、そして本発明のキイチゴ プロモーターが、それらの制御下に配置される異種遺伝子の発現を調節するのに 効果的であることを示す。 表１にはまた、形質転換頻度の比較（つまり、百分率として表された、最初の 外植片の総数に対する選択薬剤の存在下で発根し得る再生苗条を生成する組織外 植片数）の割合が提供される。III列の結果に基づき、そして本発明のキイチゴ プロモーターを含む植物に関連して、平均で、キイチゴプロモーター含有構築物 で形質転換した植物の少なくとも約半数は抗生物質選択において生存した（つま り、非形質転換植物細胞にとってさもなくば毒性である、選択薬剤量の存在下で 発根し得た）。 上記のネオマイシンホスホトランスフェラーゼアッセイの場合のように、これ らの結果は公知の植物プロモーター（hsp80、CAS）で得られる結果と一致し、そ してさらに、（i）それらの制御下に配置した遺伝子の発現を調節する本発明の キイチゴプロモーターの能力、および（ii）植物宿主を形質転換して異種遺伝子 を発現するトランスジェニック植物を形成するための、キメラ遺伝子構築物およ びキイチゴプロモーター（dru110、dru259）を含む形質転換ベクターの形成およ び使用を図解する。 本発明のキイチゴプロモーターは、例示的な植物形質転換ベクターpAG-7242お よびpAG-7342で形質転換されたトランスジェニック植物から得られた全ての組織 におけるnptII活性の検出により証明されるように、異種遺伝子の構成的発現を 提供する。 プロモーターで駆動されたnptII遺伝子の発現は、形質転換体におけるnptII酵 素レベルを決定することにより評価された。結果は表２および図５に示される。 CAS::nptIIキメラ遺伝子を含む形質転換体から得られた葉組織のタンパク質レベ ルは、表にも図にも含まれない。なぜなら、２つのアッセイされたCAS::nptII事 象からの値が6000pg/mlを超えており、これはCASプロモーター（すなわち強力な プロモーター）により調節される高レベルの遺伝子発現を示すからである。本発 明のdru1プロモーターは、hsp80プロモーターについて観察されるレベルよりい くらか低いレベルでトランスジーン発現を指向するが、一方dru110およびdru259 の両方は中程度のレベルのプロモーターとして機能すると考えられる。 表２における最初の２つのトランスジェニック事象についての結果の観察にお いて、dru110（dru259）::nptII植物についての平均nptII酵素レベルは、CAS::n ptII植物について測定されるレベルの約５〜９％であった。 比較の基準としてhsp80プロモーター用いたこれらの同じ結果を試験すること において、dru110（dru259）::nptII植物について測定された平均nptII酵素活性 は、hsp80::nptII植物について測定されたnptII酵素活性の約40〜60％であった 。 従って、dru1遺伝子由来のプロモーター（例えば、dru110およびdru259）は、 hsp80プロモーターよりもいくらか低いレベルの遺伝子発現を提供したが、中程 度の強度のプロモーターとして機能もすると考えられる。上記のデータの結果に より支持されるように、本明細書中で記載される例示的なキイチゴプロモーター の各々は、多数の異種遺伝子産物のいずれかの発現を調節することにおける使用 を支持するのに十分なレベルでトランスジーンの構成的発現を指向し得る。 さらに、本発明のキイチゴプロモーターを使用したトマト植物の形質転換は、 キイチゴ由来のプロモーター領域が完全に異なる植物の属、科、または種由来の 植物細胞内の遺伝子の発現を促進するために使用され得ることを例示する。 VI．本発明のベクター 本発明は、植物の形質転換に適切なベクターを提供する。本発明のベクター、 キメラ遺伝子およびDNA構築物はまた、異種遺伝子の発現に有用である。本発明 のキメラ遺伝子を有するトランスジェニック植物は、組換え的に発現した物質の 有用な供給源であり得る。 １つの実施態様において、本発明のキメラ遺伝子は、以下の２つの成分を有す る：（i）dru1遺伝子に由来する構成的プロモーター、および（ii）所望の産物 をコードする異種DNA配列。 本発明のベクターは、目的のDNAコード配列のための挿入部位を含む発現カセ ットを有するように構築され得る。次いで、そのような挿入DNAの転写は、適切 な本発明のキイチゴプロモーター（例えば、dru110proまたはdru259pro）の制御 下にある。 そのような発現カセットは、単一または複数の転写終末シグナルを、発現され るべきDNA配列のコード３’末端に有し得る。発現カセットはまた、例えば、（i ）リーダー配列（例えば、分泌または液胞の標的化を可能にする）および（ii） 翻訳終末シグナルをコードするDNA配列を含み得る。 さらに、本発明のベクターは、植物細胞における使用のための選択可能なマー カー（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII遺伝子（nptII）また はネオマイシンホスホトランスフェラーゼI遺伝子）を含み得る。nptII遺伝子の 存在は、抗生物質、カナマイシンに対する耐性を与える。本発明のベクターにお ける使用のための別のアミノグリコシド耐性遺伝子は、ハイグロマイシンホスホ トランスフェラーゼ（すなわち、hpt遺伝子（Gritzら、1983））をコードする遣 伝子を含む。hpt遺伝子を含む植物細胞は、アミノシクリトール(aminocyclitol) 抗生物質、ハイグロマイシンＢの存在下で増殖し得る。本発明における使用のた めの他の選択可能なマーカー配列は、グリフォセート耐性CP4およびCOX遺伝子 （Zhouら、1995）を含む。これらの遺伝子のいずれかを発現するトランスジェニ ック植物は、グリフォセートに対する耐性を示し、植物形質転換体を選択するた めの選択培地中に使用され得る。 ベクターはまた、複製起点および選択可能マーカーを含む配列のような、二次 宿主において選択および増殖を可能にする配列を含み得る。代表的な２次宿主は 、バクテリアおよび酵母を含む。１つの実施態様において、二次宿主は、Escher ichia coliであり、複製起点は、colE1型であり、そして選択可能マーカーは、 アンピシリン耐性をコードする遺伝子である。このような配列は当該分野で周知 であり、市販もされている（例えば、Clontech、Palo Alto，CA；Stratagene，L aJolla，CA）。 本発明のベクターはまた、改変されて、Agrobacterium tumefaciensベクター に相同な領域、Agrobacterium tumefaciens由来のT-DNAボーダー領域、およびキ メラ遺伝子または発現カセット（上記）を含む植物形質転換プラスミドを媒介す る。さらに、本発明のベクターは、Agrobacterium tumefaciensの無力化した植 物腫瘍誘導プラスミドを包含し得る。 本発明のベクターは、植物細胞における核酸コード配列の中程度のレベルの構 成的発現に有用である。例えば、選択されたペプチドまたはポリペプチドコード 配列は、本発明のベクターの発現カセットに挿入され得る。次いで、ベクターは 、宿主細胞に形質転換され、宿主細胞は、タンパク質をコードする配列の発現を 可能にする条件下で培養され、そして発現されたペプチドまたはポリペプチドが 細胞から単離される。形質転換された前駆細胞はまた、果実を有するトランスジ ェニック植物を作製するのに使用され得る。 本発明のベクター、キメラ遺伝子、およびDNA構築物は、植物細胞形質転換に おける使用およびそれに続くトランスジェニック植物の作製のために個々か、ま たは、キット中において販売され得る。 Ａ．異種遺伝子 本明細書中で記載される方法および結果は、本発明のキイチゴプロモータの、 トランスジェニック植物における構成的中程度のレベルの遺伝子発現を提供する 能力を示す。本発明のキイチゴプロモーターは、多くの植物組織においてすぐ隣 接した（下流の）遺伝子の転写を構成的に促進するDNAの領域を含む。本発明の 方法に従って、異種遺伝子は、本発明のキイチゴプロモーターに作動可能に連結 される。 植物の形質転換のための例示的な異種遺伝子は、その産物が抗生物質耐性を与 えるのに効果的な遺伝子を含む。nptII遺伝子を含む、これらの遺伝子のいくつ かは、以上に記載される。 本発明のキイチゴプロモーター（例えば、dru110、dru259）と共に使用され得 る目的の他の遺伝子は、以下を含むが、それらに限定されない：真菌耐性を与え 得る遺伝子（例えば、Phaseolus vulgaris由来のポリガラクツロナーゼ阻害タン パク質（PGIP）遺伝子（Toubartら、1992））ならびに植物グルカナーゼ、キチ ナーゼ(Jongedijkら、1995)、および他の病原関連（PR）遺伝子（Melchersら、1 994；Ponsteinら、1994；Woloshukら、1991）の改変形態）。これらの遺伝子産 物（例えば、キチナーゼまたはβ-1,3-グルカナーゼ）は、例えば、Fusarium、S clerotinia sclerotiorum、およびRhizoctonia solaniのような真菌に対する耐 性を増強し得る。これらの産物を発現する形質転換植物は、苗立枯病、根腐れ病 などのような病気に対する増大した耐性を示す。トランスジェニック植物に対す るウイルスおよび真菌耐性の両方を与える他の代表的な遺伝子は、「VIRUS AND FUNGAL RESISTANCE: FR0M LAB0RATORY TO FIELD」（Van Den Elzenら、1994）に 記載される。 本発明のキイチゴプロモーターを用いた使用のためのさらなる例示的な異種遺 伝子は、その産物が形質転換植物細胞に除草剤耐性を与えるのに効果的な遺伝子 を含む。例示的な除草剤耐性遺伝子は、ホスフィノスリシン(phosphinothricin) アセチルトランスフェラーゼ（PAT）をコードするバイアラホス(bialaphos)耐性 遺伝子（bar）（Akamaら、1995）を含む。この遺伝子を含むトランスジェニック 植物は、除草剤「BASTA」に対する耐性を示す。この遺伝子はまた、選択可能マ ーカー遺伝子としても使用され得る。なぜなら、bar遺伝子を保有する外植片が 、バイアラホスの活性成分であるホスフィノスリシン（PPT）を含む選択培地で 生長し得るからである。 さらなる除草剤耐性遺伝子は、グリフォセート含有除草剤に対する耐性を与え る遺伝子を含む。グリフォセートは、その酸性形態またはアニオン形態のいずれ かにおいてN-ホスホノメチルグリシンをいう。この活性成分を含む除草剤は、「 ROUNDUP」および「GLEAN」を含む。例示的なグリフォセート耐性を与える遺伝子 は、EPSPシンターゼ遺伝子（5-エノールピルビル-3-ホスホシキミ酸シンターゼ ）（Delanneyら、1995；Tiniusら、1995）、またはアセトラクテートシンターゼ 遺伝子（Yaoら、1995）を含む。 他の例示的なDNAコード配列は、dru1プロモーターの転写制御下のブロモキシ ニル(bromoxynil)特異的ニトリラーゼコードするbxn遺伝子（Stalkerら、1988） を含む。このキメラ遺伝子を含む形質転換植物は、ブロモキシニル特異的ニトリ ラーゼを発現し、そしてブロモキシニル含有除草剤の適用に対して耐性である。 本発明のプロモーターを用いて発現するために有用であり得る他の遺伝子産物 は、トランスジェニック植物におけるコートタンパク質媒介ウイルス耐性を増強 するウイルスコートタンパク質をコードする遺伝子を含む。例示的な遺伝子は、 アルファルファモザイクウイルスコートタンパク質（AlMV）、キュウリモザイク ウイルスコートタンパク質（CMV）、タバコ条斑病(streak)ウイルスコートタン パク質（TSV）、ジャガイモウイルスコートタンパク質(PVY)、タバコラトル(rat tle)ウイルスコートタンパク質(TRV)、およびタバコモザイクウイルスコートタ ンパク質（TMV）（Beachyら、1990）を含む。従って、本発明のキメラ遺伝子は 、キイチゴdru1プロモーターの転写制御下で、ウイルスコートタンパク質遺伝子 （例えば、ALMV、CMV、TSV、PVX、TRV、またはTMV遺伝子）を含む。 Ｂ．異種植物系における発現 本発明の支持により実施される実験は、本発明のキメラ遺伝子構築物の汎用性 を示す。本発明のベクター構築物は、プロモーター配列の元の植物供給源に非依 存的なトランスジェニック植物における異種配列の形質転換および発現のために 使用され得る。例えば、dru110::nptIIおよびdru259::nptIIキメラ遺伝子は、ト マト植物細胞に首尾良く導入された。 これらのデータは、本発明のキイチゴプロモーター（例えば、dru110、dru259 ）が、異種植物系（すなわち、トマトのようなキイチゴ以外の植物細胞）におけ る遺伝子発現の促進に有用であることを示唆する。さらに、このプロモーター により媒介される発現は、異種植物でさえも構成的であると思われる。これらの 知見は、植物の形質転換のための本発明のベクター、キメラ遺伝子、およびDNA 構築物の有用性を支持する。 VII．利用 本発明の支持により実施される実験は、dru1プロモーター（例えば、dru110ま たはdru259）により指向されるnptIIの遺伝子発現パターンが種々の植物組織 （例えば、葉、茎、果実、根）で観察されることを示す。従って、本発明のキイ チゴプロモーターの使用は、その制御下に配置した外来遺伝子の構成的発現を可 能にする。 本発明のキイチゴdru１由来プロモーター、dru110およびdru259は、本明細書 中に記載の配列情報を利用して本明細書中上記のようにクローン化され得る。こ れらのキイチゴプロモーターは、その機能が中程度のレベルの構成的プロモータ ーにより増強されるかまたは可能になる、任意の異種遺伝子を発現するために使 用され得る。例示的な遺伝子は、以上に記載される。 これらのプロモーターの使用は、特に本発明のキイチゴプロモーターを用いた トマトの首尾良い形質転換を考慮して、キイチゴに限定されるとみなされ得ない 。キイチゴは、本質的には、小型の核果果実(drupe furuit)であり、キイチゴプ ロモーターは、おそらく他の核果果実で機能する。本発明の構築物および方法は 、全ての高等植物（以下：液果様果実、例えばVitis（ブドウ）、Fragaria（イ チゴ）、Rubus（キイチゴ、セイヨウヤブイチゴ、ローガンベリー）、Ribes（ス グリおよびセイヨウスグリ）、Vaccinium（コケモモ(blueberry)、コケモモ(bil berry)、欧州コケモモ、ツルコケモモ）、Actinida（キーウィーフルーツおよび シナスグリ）を含むが、これらに限定されない）に適用可能である。さらに、他 の核果果実は、Malus（リンゴ）、Pyrus（セイヨウナシ）、Prunus属のほとんど の一員、アカテツ科の実、マンゴ、アボカド、アンズ、モモ、サクランボ、スモ モ、およびネクタリンを含むが、これらに限定されない。さらなる植物供給源は 以上に記載される。 本発明は、構成的な様式で任意の遺伝子の植物細胞発現を調節するための組成 物および方法を提供する。１つの実施態様において、本発明のプロモーターは、 nptIIのような選択可能なマーカー遺伝子の発現を調節するのに使用され得る。 あるいは、キイチゴプロモーターは、除草剤耐性遺伝子の発現を促進するか、ま たは増強されたウイルス耐性を提供するためのウイルスコートタンパク質をコー ドする遺伝子の発現を調節するために使用され得る。 本発明のキイチゴプロモーターは、植物細胞の形質転換を促進するために、キ メラ遺伝子、植物形質転換ベクター、発現カセット、キットなどにおいて使用さ れ得る。 本明細書中に記載されたキイチゴプロモーターはまた、トランスジェニック植 物において異種遺伝子（例えば、選択可能なマーカー）の中程度のレベルの発現 を提供するための方法において使用され得る。 以下の実施例が例示されるが、本発明の範囲を制限することを決して意図され ない。 材料と方法 生物学的試薬は、代表的には以下の販売会社から得られた：５’to ３’Prime ,Boulder, CO;New England Biolabs, Beverly, MA;Gibco/BRL、Gaithersburg,MD ;Promega,Madison,WI;Clontech,Palo Alto, CA;およびOperon Alameda,CA。標準 的な組換えDNA技術が全ての構築物において使用された（AdamsおよびYang、1977 、Ausubelら、1992;HooykaasおよびSchilperoot、1985、Sambrookら、1989;Wang ら、1990;Kawasakiら、1989、Veluthambiら、1988;Benvenutoら、1988）。 実施例１ キイチゴ小核果タンパク質の特徴付けおよび精製 Ａ．タンパク質溶解物の調製およびゲル電気泳動 液体窒素を含む乳鉢と乳棒を使用して、１つの全ベリーの凍結した核果を微細 な粉末にすりつぶすことによって、キイチゴタンパク質サンプルを調製した。サ ンプル緩衝液（0.05M Tris、pH6.8、１％ SDS、５％ β-メルカプトエタノール 、10％ グリセロール；Laemelli、1970）を組織に添加（900μl）し、そしてこ のサンプルをボルテックスすることによって混合した。サンプルを、10分間90〜 9 5℃で加熱し、そして４℃で10分間、14K rpmで遠心分離した。上清を、不溶性の 細片のペレットから取り出し、そして−20℃で保存した。 小核果タンパク質を、標準的な手順を用いて、クマシーブルー染色と組み合わ せたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS PAGE）によ って分析した。可溶性小核果タンパク質のクマシーブルー染色したSDSポリアク リルアミドゲルを、図10に示す。この図において：レーン１は分子量マーカー（ BioRad，Richmond，CA）であり、レーン２、３、および５は、それぞれ個々の果 実から別々に調製した９μｇのキイチゴ小核果タンパク質溶解物を含む。レーン ４は、さらに多い量の溶解物を含んだ。 ２つの非常に豊富なタンパク質が、約17kdおよび15kdに観察され、それぞれdr upe1およびdrupe2と名付けた。図10において、これらの２つのタンパク質を矢印 で示す。このゲルの走査型デンシトメトリー分析は、drupe1およびdrupe2が、キ イチゴの小核果中の全可溶性タンパク質のそれぞれ約23％および37％を構成する ことを示した。結果として、タンパク質の精製および配列決定のための直接的な ウェスタンブロットアプローチが続いた。 Ｂ．配列決定のためのタンパク質ブロット タンパク質ブロット（Applied Biosystems，Inc．User Bulletin Number 58;A usubelら、1992）を、上記のキイチゴタンパク質溶解物を使用して調製した。種 々の量のキイチゴタンパク質溶解物（12〜36μg／ウェル）を、4.5％のスタッカ ーを有する10ウェルの18％ SDS-PAGEミニゲル（1.5m・厚）上にロードし、そし て25mM Tris、192mMグリシン、0.1％ SDS緩衝液中で２〜2.5時間、100ボルトで 電気泳動した。 タンパク質を、25mM Tris、192mM グリシン、10％ メタノール緩衝液中で90ボ ルトで２時間、４℃にて、Applied BioSystemの「PROBLOTT」ポリビニリデンジ フルオライド（PVDF）メンブレンにトランスブロットした。タンパク質の転移後 、ブロットをクマシーブルー染色し、15および17キロダルトン（kd）のタンパク 質バンドがブロット上に存在し、そしてこれらを切り出した。タンパク質のＮ末 端配列決定を、New Haven，CTのW.M．Keck Foundation，Biotechnology Resourc e Laboratoryで行った。 drupe1サンプルは、30アミノ酸のＮ末端配列を生じた。drupe2サンプルは、お そらくブロックされたアミノ末端のために、有用な配列情報を産生しなかった。 アミノ末端のdrupe1配列を、配列番号11として示す。この30アミノ酸のdrupe1配 列を、BLAST検索を使用してタンパク質データベースと比較した；有意な合致は 見られず、このことはdrupe1が新規のタンパク質であることを示す。 実施例２ Drupe1 タンパク質に対応するcDNAクローンの回収 Ａ．小核果全RNAの調製 RNAを、成熟緑キイチゴ小核果から抽出した。４つの成熟緑キイチゴの果実（ 食べ頃に摘み取り、そして−80℃で保存した）を使用してRNAを抽出した。小核 果の推定の重量は12グラムである。液体窒素を含む冷乳鉢中で、全ベリーを乳棒 でそれらを軽くたたくことによって破砕した。小核果を花托から分離した。花托 を、乳鉢から取り出し、そして破棄した。小核果を、組織を凍結状態に維持する ために必要である場合は液体窒素を添加しながら、乳鉢の中で粉末にすりつぶし た。種子を、意図的に完全なままにした。ホモジナイズ緩衝液、２ml／グラムの 組織を使用してRNAを抽出した。［ホモジナイズ緩衝液：200mM Tris-HCl pH8.5 、300mM LiCl、10mM Na₂EDTA、１％（w/v）デオキシコール酸ナトリウム、1.5％ （w/v）ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、8.5％（w/v）不溶性ポリビニルポリピ ロリドン（PVPP）、１％（v/v）NP-40、１mM アウリントリカルボン酸（ATA）、 ５mM チオ尿素、および10mM ジチオトレイトール（DTT）；最後の３つの成分は 、オートクレーブ後に添加した。］ 凍結粉末小核果組織を、添加と添加との間にボルテックスしながら、全ての組 織が湿るまで３〜５部分で緩衝液に添加した。組織および緩衝液の溶液（本明細 書中でパルプという）を、滅菌水で１：１に希釈し、そして0.75容量のホモジナ イズ緩衝液を希釈したパルプに添加した。サンプルを、65℃で10〜15分間インキ ュベートし、続いてスウィングバケットローター中で9000ｇで15分間、４℃にて 遠心分離した。上清を、清潔なチューブに移した。塩化セシウム（CsCl）を、0. 2g/mlで上清に添加した。サンプルを、CsClが溶解するまで混合した。 ４mlのクッションを、Beckman １×3.5インチポリアロマー超遠心チューブに 分配した（クッション：5.7M CsCl、10mM Tris-HCl，pH8.0、１mM Na₂EDTA，pH8 ）。サンプルをクッションの上に穏やかに上層した。サンプルを、SW 28ロータ ーを用いてBeckman L8-80M超遠心分離器中で、23,000rpmで20℃にて20時間回転 させた。超遠心分離器からサンプルを取り出した後、上清を、吸引機に取り付け た吸引（drawn）パスツールピペットを使用することによってサンプルから吸引 除去した。透明なレンズ様のペレットを、チューブの底に見ることが可能であっ た。 ペレットを、500μlのSSTEに溶解し、そしてミクロ遠心チューブに移した（SS TE：0.8M NaCl、0.4％ SDS、10mM Tris-HCl,pH8.0および1mM Na₂EDTA,pH8）。サ ンプルを、等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（24：１）で２回抽出し た。RNAを沈澱させるために、2.5容量のエタノールを、水相に添加した。サンプ ルを遠心分離によって回収し、75％エタノールで２回洗浄し、そして100μlのTE に再懸濁した。収量は、1.6mgであった。RNAを、−20℃での保存のために、1/9 容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび３容量のエタノールを用いて再び沈澱させた。 Ｂ．小核果mRNAの調製 成熟緑キイチゴ小核果の全RNAからのmRNAの単離を、「STRAIGHT A'S」mRNA単 離システム（Novagen，Madison，WI）を用いて、製造業者の説明書に従って行っ た。mRNAを、上記の成熟緑色キイチゴ小核果から抽出した1.6mgの全RNAから単離 した。この手順によるmRNAの収量は、6.6μgであった。 Ｃ．緑キイチゴ小核果mRNAからのcDNAの調製 成熟緑キイチゴ小核果RNA由来のmRNAを、cDNA合成のためのテンプレートとし て使用した。cDNA反応のためのプライマーは、dTRANDOM（配列番号12；Operon T echnologies，Inc.，Alameda，CAにより合成された）であった。オリゴ（dT）領 域が、mRNAプールのポリ（Ａ）領域にハイブリダイズした。他の15ヌクレオチド は5'オーバーハングを作製し、これは、クローニングプロセスの後の工程でPCR 増幅を容易にするために使用された。 以下の反応混合物を、cDNA合成反応のために組み立てた：H₂O，10.2μl；250n g mRNA，0.8μl；５×BRL RT緩衝液(BRL，Bethesda，MD)、4.0μl；100mM DTT （ジチオトレイトール−BRL，Bethesda，MD)、0.2μl；「RNAguard」(23.4U/μ ｌ；Pharmacia，Piscataway，NJによるRNaseインヒビター)、0.5μl；dNTP（各2 .5mM)、2.0μl；50μM プライマー、1.0μl；[³²P]dCTP（3000Ci/mmol；DuPont/ NEN，Boston，MA)、1.0μl；およびAMV-逆転写酵素（38U/μl；Life Sciences， Inc.，St．Petersburg，Florida)、0.3μl。cDNA反応を、65℃で３分間の反応お よび加熱のために、mRNAと水とを組み合わせることによって行った。混合物を氷 上で冷却し、そしてミクロ遠心分離した（縮合物を回収するために）。次いで、 残りの反応成分を添加した。 42℃で１時間のインキュベーション後、cDNA反応物を氷上に移動して、PCR反 応で使用する前に４℃で保存した。 実施例３ cDNAdru1 フラグメントのPCR増幅およびクローニング 縮重PCRプライマーDrupe20を、dru1タンパク質配列の逆翻訳に基づいてcDNAの 5'末端について設計した。dru1の既知のアミノ酸配列（配列番号13）の断片を、 アミノ末端に対するその近接、およびその逆翻訳した配列（配列番号14；Drupe2 0）における相対的に低いレベルの縮重について選択した。Drupe20プライマー（ i）は、配列番号13として示されるアミノ酸配列に対応する512倍の縮重ヌクレオ チド配列であり、そして（ii）を3'プライマーとして使用した。 5'PCRプライマー（DrupeRAN18、配列番号15、cDNAプライマーdTRANDOMに対応 ）を、3'末端について設計した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR；Perkin-Elmer Ce tus，Norwarlk，CT; Mullis，1987; Mullisら、1987）を、「AMPLITAQ」（Perki n Elmer Cetus)、PCR緩衝液II (50.0mM KCl、10mM Tris-HCl，pH8.3)、２mM MgCl₂、0.2mMの各dNTP、成熟緑小核果cDNA、ならびにDrupe20およびDrupeRAN18 プライマーを使用して、製造業者の手順に従って以下の条件下で行った： １サイクル：95℃１分 35サイクル：95℃１分、42℃１分、および72℃１分 １サイクル：72℃５分、そして５℃まで冷却。 増幅反応の２つの主要な生成物：約700bpの優勢な生成物および約500bpのより 少ない生成物が存在した。700bpのバンドを、供給者の説明書に従って、βアガ ロース（agarase）（New England Biolabs，Beverly，MA）を使用する１％「S EAPLAQUE」アガロースゲルから単離した。次いで、このフラグメントを、製造業 者の説明書に従って、Invitrogen（San Diego，CA）によるTAクローニングベク ターであるベクターpCRIIに連結した。 dru1遺伝子のcDNAクローンを、アルカリ溶解法（Ausubelら、1992）を使用し て、1.6mlの培養物から調製したプラスミドミニプレップDNAをスクリーニングす ることによって同定した。２本鎖DNAを、「SEQUENASE」ver.2酵素およびキット 成分（Uniterd States Biochemical，Cleveland，Ohio）および[α-³⁵S]-dATP（ DuPont/NEN）を使用して、ジデオキシ鎖終結法によって配列決定した。反応を、 M13ユニバーサル正方向プライマーおよび逆方向プライマー（New England Biola bs，Beverly，MA）を使用してプライムした。配列決定反応を、アクリルアミド ゲル（「LONG RANGER GEL」、FMC，Rockland，Maine）上で行い、そしてオート ラジオグラフィーでバンドを検出した。 配列を、オートラジオグラフから読み、そしてdrupe1由来の逆翻訳したＮ末端 タンパク質配列とのその相同性について分析した。タンパク質配列の逆翻訳によ って得られる縮合DNA配列に対抗するものとして、実際のDNA配列を決定した。cD NAとＮ末端タンパク質配列の残りとの間の相関関係を確認した。これらの判断基 準（criteria）後、さらなる特徴付けのために１つのクローン（pAG-301と名付 けた）を選択した。pAG301のdru1 cDNAインサートの核酸配列を、配列番号16に 示す。 遺伝子のゲノムコピーの逆PCRのためのcDNA合成による完全なdru1のクローニ ング手順を、図11Aおよび11Bに模式的に示す。 実施例４ dru1 cDNA に対応するゲノムDNAフラグメントの回収 「CTAB」（ヘキサデシル-トリメチル-臭化アンモニウム）法（DoyleおよびDoy le，1990）を使用して、キイチゴの葉からDNAを抽出した。PCRプライマー（DruG en5'、配列番号17；DruGen3'、配列番号18）を、完全なdru1 cDNA配列に基づい て設計した。プライマーの設計を容易にするための、「OLIGO」（National Bios ciences，Inc．（Plymouth，MN）による複合関数プログラム）を使用した。PCR を、「AMPLITAQ」(Perkin-Elmer Cetus)、PCR緩衝液(50.0mM KCl、10mM Tris-HC lpH8.3、および1.5mM MgCl₂)、0.2mMの各dNTP、キイチゴのゲノムDNA、ならびに DruGen5'およびDruGen3'プライマーを使用して、製造業者の手順に従って以下（ 「H0TSTART」）の条件下で行った： １サイクル：97℃５分、その後、「AMPLITAQ」を添加した、 ２サイクル：97℃１分、52℃１分、および72℃１分 25サイクル：94℃１分、52℃１分、および72℃１分、 １サイクル：72℃５分、そして５℃まで冷却。 この増幅反応は、３つの主要な生成物：710bpの優勢な生成物ならびに690bpお よび625bpの２つのより少ない生成物を産生した。次いで、PCR反応生成物を、製 造業者の説明書に従って、Invitrogen（San Diego，CA）によるTAクローニング ベクターであるベクターpCRIIに連結した。710bpのインサートを有するクローン を選択し、pAG-302と命名した。 pAG-302のプラスミドDNAを、アルカリ溶解法（Ausubelら、1992）を使用して1 .6mlの培養物から調製し、「SEQUENASE」ver.2酵素およびキット成分（USB，Cle veland，Ohio）および[α-³⁵S]-dATP（DuPont/NEN）を使用して、ジデオキシ鎖 終結法によって配列決定した。配列決定反応を、M13ユニバーサル正方向プライ マーおよび逆方向プライマー（New England Biolabs，Beverly，MA）を用いてプ ライムした。さらなる配列決定反応を、２つのさらなる内部プライマーを用いて プライムした。配列決定反応物を、アクリルアミドゲル上で分離し、そしてオー トラジオグラフィーで検出した。 pAG-302中のdru1ゲノムDNAのインサートの配列を、配列番号19として表す。 クローンの配列は、dru1 cDNAに対応するゲノムDNAフラグメントを単離したこ とを示す。実施例５ 逆PCRによるdruIゲノムDNAの5'隣接領域の回収 逆PCRプライマー（Dru1nvUp（配列番号５）およびDruInvLow（配列番号６）と 名付けた）を、ゲノムDNA配列に基づいて設計し、そしてOLIGOを使用して最適化 した。キイチゴのゲノムDNAを、制限酵素NsiIで消化した。cDNA配列に基づいて 、NsiIが遺伝子の3'非翻訳領域で切断することが公知であったので、NsiIを選択 した。NsiI消化したDNAの小さい部分を、分析用アガロースゲル上で泳動し、そ してサザントランスファーを行った（Ausubelら、1992）。 サザンブロットを、pAG-302に含まれるcDNAフラグメントでプローブした。プ ローブは、２〜2.3kbのNsiIフラグメントを同定した：このフラグメントは、ゲ ノムクローンと強力にハイブリダイズした。第２のより小さいフラグメントもま た、プローブとハイブリダイズしたが、ゲノムクローンとは弱くハイブリダイズ した。 残ったNsiI消化したキイチゴDNAを、１％「SEAPLAQUE」アガロースゲル（FMC, Rockland，ME）上で電気泳動した。BstEIIλサイズ標準を指針として使用して、 ２〜2.3kbの範囲の消化したDNAをゲルから切り出した。DNAを、製造業者の説明 書に従って、β-アガロース（New England Biolabs，Beverly，MA）を用いて精 製した。DNAを、環状の連結反応生成物の形成に片寄らせるために、比較的希釈 した濃度（１μg/ml）で自己連結させた（Ochmanら、1990）。 続いて逆PCRを、自己連結させた、NsiI消化した、サイズ選択したキイチゴの ゲノムDNAについて行った。Perkin Elmer Corporation/Applied Biosystems Div islon（Foster City，CA）による「AMPLITAQ」を使用して、DNAを増幅した。製 造業者の手順に従って、PCR緩衝液、0.2mMの各dNTP、キイチゴのゲノムDNA（本 明細書中上記のように調製した）、ならびにDruInvUpプライマー（配列番号５） およびDruInvLowプライマー（配列番号６）を使用した。以下（「H0TSTART」） の反応条件を使用した： １サイクル：97℃５分、その後、「AMPLITAQ」を添加した、 ２サイクル：97℃１分、58℃１分、および72℃１分 25サイクル：94℃１分、58℃１分、および72℃１分、 １サイクル：72℃５分、そして５℃まで冷却。 この反応は、２つの主要な増幅生成物：１つは1.8kbおよび１つは900bpを産生 した。1.8kbのバンドを、β-アガラーゼを使用する１％の「SEAPLAQUE」アガロ ースゲルから単離した。このフラグメントをpCRIIに連結して、pAG-310を生じた 。サブクローンpAG-310の調製の模式的な提示を、図１および２に示す。 pAG-310インサートを、その全体を配列決定し（配列番号１）、そしてdru1イ ンサートの配列が、配列を共有している領域内のcDNAクローン（配列番号16）お よびゲノムクローン（配列番号19）と同一であることを見出した。CAATボックス 、TATAボックス、ATG開始コドン、２つのエキソン、イントロン、スプライシン グ部位、停止コドン、およびポリアデニル化部位を含む、植物遺伝子の通常のエ レメントおよびそれらの調節構成要素を同定した（図６Ａおよび６Ｂ）。 dru1の遺伝子の構成およびタンパク質構造を、図12に模式的に示す。この遺伝 子は、配列番号20として示される推定のアミノ酸配列を有するタンパク質をコー ドする。推定のタンパク質は、17,087.64の計算された分子量および4.80の推定p Iを有する。dru1タンパク質のKyte-Doolittle疎水性(hydrophobicity)プロット を、図13に示す。 実施例６ dru1 遺伝子発現の特徴付け Ａ．RNA ドットブロット RNAドットブロットを、５μgのキイチゴの葉の全RNA、ならびに緑キイチゴ、 成熟緑キイチゴ、変色キイチゴ、およびオレンジ／完熟キイチゴ由来の全花托RN Aの各５μgを使用して、RNAドットブロットを調製した（それぞれ、図14のＩ、I I、III、IV期に対応）。ブロツトを、ランダムプライム法（Boeringer Mannheim Biochemicals，Random Primed reaction kit，Indianapolis，IN）によって[32 -P]dCTP（＞3000Ci/mmole）で標識したdru1 cDNAフラグメントでプローブした。 ブロットを、「HYBRIS0L I」（Oncor，Gaithersburg，MD）中で45℃にて一晩 、ハイブリダイズさせた。1.2×10⁷DPM/mlのプローブ濃度を使用した。ブロット を、一晩のハイブリダイゼーション後に、0.1×SSCを使用して42℃で１時間の最 終洗浄を含んで洗浄した。ハイブリダイゼーションプローブを標準的なオートラ ジオグラフィー法によって検出した。フィルムへのブロットの露出は、−80℃で 増感スクリーンを用いて４時間10分であった。 この分析の結果を、図14に示す。この図において、RNAドットは、それぞれ、 左から右に、葉RNA、ならびに緑キイチゴ（図14「Ｉ」）、成熟緑キイチゴ（図1 4「II」）、変色キイチゴ（図14「III」）、およびオレンジ／完熟キイチゴ（図 14「IV」）由来の花托RNAである。 Ｂ．さらなるRNAハイブリダイゼーション分析 植物RNA抽出法（Changら、1993）を、花托および葉について使用した。上記の キイチゴの小核果RNA抽出方法を、小核果およびストロベリーの果実について使 用した。 ノーザンブロットを、５μg／レーンの各サンプルRNAを用いて調製した。RNA サンプルは以下の通りであった：キイチゴの葉（図15、レーン１）、成熟緑キイ チゴの花托（図15、レーン２）、オレンジ／完熟キイチゴの花托（図15、レーン ３）、成熟緑キイチゴの小核果（図15、レーン４）、およびオレンジ／完熟キイ チゴの小核果（図15、レーン５）。 ブロットを、ランダムプライム反応によって[³²P]dCTP（＞3000Ci/mmole）で 標識したdru1 cDNAフラグメントでプローブした。ハイブリダイゼーションを、 「HYBRISOL I」（Oncor，Gaithersburg，MD）中で45℃にて一晩行った。4.2×10⁶ DPM/mlのプローブ濃度を使用した。ブロットを、一晩のハイブリダイゼーショ ン後に、0.1×SSCを使用して50℃で30分間の最終洗浄を含んで洗浄した。ハイブ リダイズしたプローブを、標準的なオートラジオグラフィー法によって検出した 。増感スクリーンを使用せずに、室温で１時間、ブロットをフィルムに曝した。 この分析の結果を、図15に示す。そしてこれは、小核果における期特異的発現 パターンを支持する。 Ｃ．タンパク質発現分析 タンパク質溶解物を、成熟の種々の期のキイチゴ小核果から調製した（実施例 １に記載のように）。溶解物を、PAGEによってサイズ-分画し、そしてクマシー ブルー（50％ Me0H、10mM Tris-HCl pH8.3、1.5mM MgCl₂）でゲルを染色した。 結果を図16に示す。この図において、レーン中の溶解物は以下の通りである：レ ーン１、緑色の小核果；レーン２、成熟した緑色の小核果；レーン３、変色した 小核果；レーン４、オレンジ色の小核果；およびレーン５、完熟した小核果。こ の分析の結果は、小核果における期特異的発現パターンを支持する。 実施例７ dru259 プロモーターを含有するサブクローンpAG-431の作製 全長のdru1プロモーターを含有するサブクローンpAG-310の作製を、先の実施 例５に記載する。 dru1プロモーターを含有するDNAフラグメントを、プライマー（5'プライマー 、DrupeUp（配列番号７）および3'プライマー、DrupeLow(配列番号８)）を使用 して標準的なPCR反応条件下でサブクローンpAG-310からPCR増幅した。PCR反応混 合物は、以下の成分を含んだ：79.0μlの水、10.0μlの10×Vent緩衝液、1.0μl のDrupeUpプライマー（50μMの溶液）、1.0μlのDrupeLowプライマー（50μMの 溶液）、8.0μlのdNPT（各2.5mM）、1.0μlのテンプレートDNA（100ng）。使用 したPCR反応条件は以下の通りであった： １サイクル：97℃４分、その後、AMPLITAQを添加した； 25サイクル：94℃１分、49℃１分、および72℃１分； １サイクル：72℃５分、続いて５℃まで冷却。 この増幅反応は、図１および２の上部に示されるような1.3kbフラグメント産 物を産生した。 このフラグメントを、以下のように反応混合物から精製した。PCR反応混合物 を、軽量のPhase Lock Gelチューブ（5 Prime to 3 Prime，Boulder，CO）に移 した。以下の溶媒の組み合わせ（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコ ール(25：24:１)）を、PCR反応容量と等しい容量でこのチューブに添加した。こ のチューブを、製造業者の説明書に従ってミクロ遠心分離器中で回転させた。上 部の水相を、Select G-50スピンカラム（5 Prime to 3 Prime，Boulder，CO）に 移し、そしてDNAを製造業者の説明書に従ってカラムを通して遠心分離した。D NAを沈澱させるために、溶出物に、1／10容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび2.5容 量のエタノールを添加した。サンプルを、10分程度氷上でインキュベートし、次 いで、14,000rpmで30分間、４℃でミクロ遠心分離した。上清をチューブからデ カントし、ペレットを75％エタノールで２回洗浄した。ペレットを乾燥させ、次 いで25μlの1/2強度のTE（５mM Tris-HCl、0.5mM EDTA，pH8）に再懸濁した。DN Aフラグメントを、制限酵素NsiIおよびXbaIで完全に消化して、dru1プロモータ ーフラグメントを産生した。このフラグメントを、上記のPCR産物と同じ様式で 精製した。 非組み込み型植物発現ベクターp35S-GFP（Clontech Laboratories，Palo Alto ,CA）を、XbaIおよびPstIで消化した。消化したプラスミドを、１％の低融点ア ガロースゲル（SeaPlaque，FMC BioProducts，Rockland，ME）上で泳動した。3. 7kbのフラグメントを含むゲル領域を、ゲルの本体からから切り出した。次いで 、DNAフラグメントを、New England Biolabs（Beverly，MA）によるβアガラー ゼを用いて、製造業者の説明書に従ってゲルから精製した。0.85kbの35Sプロモ ーターを含むゲル領域を廃棄した。p35S-GFP2からの3.7kbのフラグメントおよび 1.3kbのdru1プロモーターフラグメントを、Gibco/BRLのT4 DNAリガーゼを使用し て、製造業者の説明書に従って連結反応において組み合わせて中間プラスミドpA G-155を形成した。図１および２に示されるような、キイチゴdru1プロモーター を含む得られたプラスミドを、pAG-155と名付けた。 プラスミドpAG-155を、いずれも平滑切断である、SnaBIおよびEcoRVで完全に 消化して、本明細書中でdru259と称される259bpのdru1プロモーターフラグメン トを遊離させた。ここで、ヌクレオチド番号１はATG開始コドンの5'に隣接して いる。消化したプラスミドを、１％の低融点アガロースゲル（SeaPlaque，FMC B ioProducts，Rockland，ME）で泳動した。259bpのdru1プロモーターフラグメン トを含むゲル領域を、ゲルの本体から切り出した。次いで、DNAフラグメントを 、βアガラーゼ（New England Biolabs，Beverly，MA）を用いて、製造業者の説 明書に従ってゲルから精製した。プラスミドの残りを含むゲル領域を廃棄した。 nos::nptIIカセットを含むサブクローンpAG-411を、以下のように調製した。 HIで消化した。消化したプラスミドを、１％の低融点アガロースゲル（SeaPlaqu e，FMC BioProducts，Rockland，ME）で泳動した。3.2kbのフラグメントを含む ゲル領域を、ゲルの本体から切り出した。次いで、DNAフラグメントを、New Eng land Biolabs（Beverly，MA）のβアガラーゼを用いて、製造業者の説明書に従 ってゲルから精製した。 Germany）を、XbaIおよびBamHIで消化した。消化したプラスミドを、１％の低融 点アガロースゲル（SeaPlaque，FMC BioProducts，Rockland，ME）で泳動した。 1.48kbのnos::nptIIフラグメントを含むゲル領域を、ゲルの本体から切り出した 。次いで、DNAフラグメントを、βアガラーゼ（New England Biolabs，Beverly ，MA）を用いて、製造業者の説明書に従ってゲルから精製した。13.3kbのフラグ メント含むゲル領域を廃棄した。 トを、Gibco/BRLのT4 DNAリガーゼを使用して、製造業者の説明書にしたがって 連結反応において結合させて中間プラスミドpAG-411を形成した。 プラスミドpAG-411を、いずれも平滑切断であるHincIIおよびPshAIで完全に消 化して、636bpのnosプロモーターフラグメントを遊離させた。消化したプラスミ ドを、１％の低融点アガロースゲル（SeaPlaque，FMC Bio Products，Rockland ，ME）で泳動した。４kbのフラグメントを含むゲル領域を、ゲルの本体から切り 出した。次いで、DNAフラグメントを、βアガラーゼ（New England Biolabs，Be verly，MA）を用いて、製造業者の説明書に従ってゲルから精製した。636bpのno sプロモーターフラグメントプラスミドを含むゲル領域を廃棄した。 pAG-411由来の４kbのフラグメントおよびpAG-155由来の259bpのdru1プロモー ターフラグメントを、Gibco/BRLのT4 DNAリガーゼを使用して、製造業者の説明 書にしたがって連結反応において結合させて中間ＢＥクターpAG-431を形成した 。短型プロモーターdru259のヌクレオチド配列を、配列番号４として本明細書中 に示す。実施例８ dru110 プロモーターを含むサブクローンpAG-421の作製 全長のdru1プロモーターを含むプラスミドpAG-155の構築は、実施例７に記載 する。 166bpのdru1プロモーターを含有するDNAフラグメントを、プライマーDru1-118 H3（配列番号９）およびGFPStartR（配列番号10）を使用して以下のPCR反応条件 下でサブクローンpAG-155からPCR増幅した。 １サイクル：97℃３分、その後、AMPLITAQを添加した； ２サイクル：97℃１分、47℃１分、および72℃１分； 25サイクル：94℃１分、47℃１分、および72℃１分； １サイクル：72℃５分、続いて５℃まで冷却。 次いで、166bpのdru1プロモーターフラグメントを以下のように精製した。PCR 反応混合物を、軽量のPhase Lock Gelチューブ（5 Prime to 3 Prime，Boulder ，CO）に移した。フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(25：24：1 )）を含有する混合溶媒系を、PCR反応容量と等しい容量でこのチューブに添加し た。次いで、このチューブを、製造業者の説明書に従ってミクロ遠心分離器中で 回転させた。上部の水相を、Select G-50スピンカラム（5 Prime to 3 Prime，B oulder，CO）に移し、そしてDNAを製造業者の説明書に従ってカラムを通して遠 心分離した。溶出物に、1／10容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび2.5容量のエタノ ールを添加してDNAを沈殿させた。サンプルを、10分程度氷上でインキュベート した。インキュベーション後、サンプルを14,000rpmで30分間、４℃でミクロ遠 心分離した。上清をチューブからデカントし、ペレットを75％エタノールで２回 洗浄した。ペレットを乾燥させ、次いで31.6μlのH₂Oに再懸濁した。このフラグ メントを、制限酵素HindIIIおよびEcoRVで完全に消化して、112bpのdru1プロモ ーターフラグメントを産生した。このフラグメントを、上記のPCR産物と同じ様 式で精製した。 nos::nptIIカセットを含むサブクローンpAG-411の作製は、先の実施例７に記 載する。 プラスミドpAG-411を、HindIIIおよびPshAIで完全に消化して、620bpのnosプ ロモーターフラグメントを遊離させた。消化したプラスミドを、１％の低融点ア ガロースゲル（SeaPlaque，FMC BioProducts，Rockland，ME）で泳動した。４kb のフラグメントを含むゲル領域を、ゲルの本体から切り出した。次いで、DNAフ ラグメントを、New England Biolabs（Beverly，MA）のβアガラーゼを用いて、 製造業者の説明書に従ってゲルから精製した。420bpのnosプロモーターフラグメ ントを含むゲル領域を廃棄した。 pAG-411由来の４kbのフラグメントおよびpAG-155由来の112bpのdru1プロモー ターフラグメントを、Gibco/BRLのT4 DNAリガーゼを使用して、製造業者の説明 書に従って連結反応において結合させて中間ベクターpAG-421を形成した。プラ スミドpAG-421の構築における工程を、図２に模式的に示す。 実施例９ dru259::nptII キメラ遺伝子を含む バイナリー植物形質転換ベクターpAG-7342の構築 Ａ．プラスミドpAG-1542の構築 プラスミドpAG-1542の構築を要約するフローチャートを、図17に示す。プラス ミドpAG-1542を、当該分野で公知の従来のクローニング技術（Sambrookら、1989 ）を使用して構築した。サブクローニングバイナリーベクターpAG-1542は、左の 境界の近くに配置されるnosプロモーター、および右の境界の近くに配置された トマトE8プロモーター(Deikmanら、1989；Deikmanら、1992）によって駆動され るSAMase遺伝子（Ferroら、1995）の制御下にあるnptIIマーカー遺伝子を含んだ 。 Ｂ．バイナリー植物形質転換ベクターpAG-7342の構築 dru259::nptIIキメラ遺伝子を含むサブクローンpAG-431の構築を、実施例７に 記載する。 プラスミドpAG-1542を、HindIIIおよびBamHIで消化した。消化したプラスミド を、１％の低融点アガロースゲル（SeaPlaque，FMC BioProducts，Rockland，ME ）で泳動した。13kbのフラグメントを含むゲル領域を、ゲルの本体から切り出 した。次いで、DNAフラグメントを、New England Biolabs（Beverly，MA）のβ アガラーゼを用いて、製造業者の説明書に従ってゲルから精製した。1.46kbのno s::nptIIフラグメントを含むゲル領域を廃棄した。 プラスミドpAG-431を、HindIIIおよびBamHIで消化した。消化したプラスミド を、１％の低融点アガロースゲル（SeaPlaque，FMC BioProducts，Rockland，ME ）で泳動した。1.1kbのdru259::nptIIフラグメントを含むゲル領域を、ゲルの本 体から切り出した。次いで、DNAフラグメントを、New England Biolabs（Beverl y，MA）のβアガラーゼを用いて、製造業者の説明書に従ってゲルから精製した 。プラスミドの残りを含むゲル領域を廃棄した。 pAG-1542由来の13kbのフラグメントおよびpAG-431由来の1.1kbのdru259::nptI Iフラグメントを、Gibco/BRLのT4 DNAリガーゼを使用して、製造業者の説明書に 従って連結反応において結合させてバイナリー植物形質転換ベクターpAG-7342を 形成した。 バイナリー植物形質転換ベクターpAG-7342の構築を、図４に模式的に示す。 実施例10 dru110::nptII キメラ遺伝子を含有するバイナリー植物形質転換ベクターの構築 プラスミドpAG-1542の構築を、実施例９Ａに記載する。 dru110::nptIIキメラ遺伝子を含有するサブクローンpAG-421の構築を、実施例 ８に記載する。 プラスミドpAG-1542を、HindIIIおよびBamHIで消化した。消化したプラスミド を、１％の低融点アガロースゲル（SeaPlaque，FMC BioProducts，Rockland，ME ）で泳動した。13kbのフラグメントを含むゲル領域を、ゲルの本体から切り出し た。次いで、DNAフラグメントを、New England Biolabs（Beverly，MA）のβア ガラーゼを用いて、製造業者の説明書に従ってゲルから精製した。1.46kbのnos: :nptIIフラグメントを含むゲル領域を廃棄した。プラスミドpAG-421を、HindIII およびBamHIで消化した。消化したプラスミドを、１％の低融点アガロースゲル （SeaPlaque，FMC BioProducts，Rockland，ME）で泳動した。0.95kbのdru259:: nptIIフラグメントを含むゲル領域を、ゲルの本体から切り出した。次いで、 DNAフラグメントを、New England Biolabs（Beverly，MA）のβアガラーゼを用 いて、製造業者の説明書に従ってゲルから精製した。プラスミドの残りを含むゲ ル領域を廃棄した。 pAG-1542由来の13kbのフラグメントおよびpAG-421由来の0.95kbのdru110::npt IIフラグメントを、Gibco/BRLのT4 DNAリガーゼを使用して、製造業者の説明書 に従って連結反応において結合させてバイナリー植物形質転換ベクターpAG-7242 を形成した。バイナリー植物形質転換ベクターpAG-7242の構築を、図３に模式的 に示す。 実施例11 バイナリーベクターpAG-7242およびpAG7342を使用する植物の形質転換 キメラdru110::nptII遺伝子およびdru254::nptII遺伝子をそれぞれ含有するバ イナリーベクターpAG-7242およびpAG-7342を使用するAgrobacteriumに基づく植 物形質転換を、代表的プラスミドpAG-7242について以下に記載するようにトマト 子葉を使用して行った。 Sunseeds Co.（Morgan Hill，CA）から入手したチェリートマト（cherry toma to）株（CH3）を、植物形質転換実験のための標的として使用した。形質転換を 、標準的な子葉に基づくAgrobacterium同時培養法（Fillattiら、1987）を使用 して行った。 Agrobacterium tumefaciens C58株のdisarmed誘導体であるAgrobacterium tum efaciens EHA101株（Hoodら、1986）を、植物にコード配列を導入するために使 用した。この株は、T-DNAを含まないTiプラスミドを含んでいる。pAG-7242プラ スミドを、Nagelら（1990）に記載のように本質的にエレクトロポレーションを 使用してEHA101に移入した。簡潔には、Agrobacterium tumefaciens培養物を、 トリプトン（５g/l）、酵母抽出物（2.5g/l）、NaCl（５g/l）、マンニトール（ ５g/l）、グルタミン酸ナトリウム（1.17g/l）、K₂HP0₄（0.25g/l）、MgS0₄（0. 1g/l）、およびビオチン（２μg/l）を含有し、水酸化ナトリウムの添加似よっ てpH7.2に調整したMG/L寒天培地中で、log期の中間（mid-log phase）（OD 6000 .5から1.0）まで増殖させた。 トマトの子葉の各末端の約３分の１を切除した後、真ん中の３分の１を、組織 移植片として使用した。子葉外植片を、タバコフィーダープレート上で一晩、予 め馴化した（Fillattiら、1987）。予め馴化した外植片を、EHA105/pAG-7242の2 0mlの一晩培養物中で15分間置くことによって接種した。次いで、外植片を、Fil lattiら（1987）に記載されるように、タバコフィーダープレート上で２日間、E HA105/pAG-7242と同時培養した。 外植片を、2Z培地（Fillattiら、1987）、MurisheegeeおよびSkoog（MS）塩、 NitschおよびNitschビタミン、３％スクロース、２mg/l seatin、500mg/lカルベ ニシリン、60〜200mg/lカナマイシン、および0.7％寒天を含有する組織培養培地 中で増殖させた。外植片を、８〜10週間、組織培養において増殖させた。カルべ ニシリン処理を全ての培地において２〜３ヶ月間適切に保った。移植片および植 物を、対抗選択として土に鉢植えにして、それらがその植物から生存Agrobacter ium tomefaciens細胞を除去するまでカルベニシリン上に保った。 表１は、使用した選択薬剤の濃度、および形質転換頻度を含む、植物形質転換 実験の要約を示す。本発明の新規のキイチゴプロモーターを使用する植物形質転 換実験について得られた結果を、２つの異なる強力な構成的プロモーター、caul imovirusプロモーター、cassava mottle veinウイルスプロモーター（CAS）、お よびhsp80プロモーターを含むバイナリーベクターを使用して得られた結果を比 較する。CASプロモーターは、The Scripps Research Institute（La Jolla，CA ）から入手した。hsp80プロモーター、そのヌクレオチド配列、およびベクター 構築物の単離、ならびにhsp80プロモーターを含むトランスジーンの発現レベル が、記載されている（BrunkeおよびWilson、1993）。 上記の、４つのプロモーター-nptIIキメラ遺伝子の組み合わせを使用して産生 した形質転換体による10のトランスジェニック事象にわたるnptII発現の相対強 度の比較を、図５に示す。実施例12 キイチゴ由来のプロモーターを含有するトランスジェニック植物における nptII マーカー遺伝子の相対発現 キイチゴプロモーターdru110およびdru254をそれぞれ含むベクターpAG7242お よびpAG-7342を使用する10個の別々のトランスジェニック事象から、葉組織を、 (ｉ)タンパク質抽出および(ii)nptII発現レベルの決定について製造業者（5'-3' ,Inc.，Boulder，CO）に推奨されるプロトコルにしたがって、ELISAによってア ッセイしてnptII発現でベルを決定した。形質転換実験による結果を、以下の表 １および表２に示す。 nptIIアッセイを、試験時の培養物中で入手可能な根の生えた（rooted）植物 を使用するいくつかのサンプルを用いて行った。従って、全ての根の生えた植物 をnptII発現について試験したわけではない。ELISAアッセイの結果を、以下の表 １の列（IV）に示す。 表１：形質転換の結果 表１に示すデータを参照して、形質転換頻度を、最初の組織外植片の総数に対 する、選択薬剤（カナマイシン）の存在下で根を形成（rooting）し得る再生苗 条を生じる組織外植片の数の比として定義して、パーセントで示した。パーセン トとして示されるNptII発現レベルは、実施例12において記載されるELISAアッセ イの結果に基づく、nptIIについて試験した根を形成した植物の総数に対する、n ptII陽性植物の比である。陽性のnptIIの結果は、バックグラウンドより高いELI SA値である。例えば、列（IV）の最初の数字は、nptIIについて試験した10の事 象のうち10が陽性のELISAの結果を示したことを示す。 nptIIの相対的な発現レベルを表２に示す。CAS::nptII構築物を含むトランス ジェニック植物からのデータは、CASプロモーターを含む形質転換体において観 察される高い発現レベルのために、表２には含まない。アッセイした２つのCAS: :nptII事象による値は、nptIIの6000pg/mlを超えていた。 以下の表２に示され、そして図５にグラフで示される事象間の発現の範囲は、 植物におけるトランスジーンの発現の典型的なものである。 表２：nptIIの発現（pg/ml） 上記のデータは、例示的なdru259およびdu110プロモーターが、hsp80プロモー ターよりもこれらのプロモーターの制御下に配置された遺伝子のより低いレベル の発現を指向することを示す。しかし、これらの２つの例示的なキイチゴdruプ ロモーターはいずれも、トランスジェニック植物の選択を可能にするnptIIの十 分なレベルを発現し得る。 本発明は、特定の方法および実施態様に関して記載しているが、種々の改変お よび変更が本発明を逸脱することなく行われ得ることが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｈ Ｕ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．植物細胞において発現可能なキメラ遺伝子であって： 植物細胞において構成的発現を与える能力により特徴付けられ、異種DNAコー ド配列に作動可能に連結された、配列番号２またはその連続するフラグメントと 少なくとも約80％の配列同一性を有するキイチゴdru1プロモーターを含む、キメ ラ遺伝子。 ２．前記異種DNA配列が、ポリペプチドを発現する形質転換植物細胞に抗生物質 耐性を与える該ポリペプチドをコードする、請求項１に記載のキメラ遺伝子。 ３．前記ポリペプチドが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマ イシンホスホトランスフェラーゼおよびブロモキシニル特異的ニトリラーゼから なる群から選択される、請求項２に記載のキメラ遺伝子。 ４．前記異種DNA配列が、ポリペプチドを発現する形質転換植物細胞に除草剤耐 性を与える該ポリペプチドをコードする、請求項１に記載のキメラ遺伝子。 ５．前記異種DNA配列がnptII遺伝子を含む、請求項１に記載のキメラ遺伝子。 ６．前記プロモーターが、配列番号３と少なくとも約80％の配列同一性を有する 、請求項１〜５のいずれかに記載のキメラ遺伝子。 ７．前記プロモーターが、配列番号４と少なくとも約80％の配列同一性を有する 、請求項１〜５のいずれかに記載のキメラ遺伝子。 ８．前記プロモーターが配列番号３を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のキ メラ遺伝子。 ９．前記プロモーターが配列番号４を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のキ メラ遺伝子。 １０．請求項１〜９のいずれかに記載のキメラ遺伝子を含む植物細胞。 １１．請求項１〜９のいずれかに記載のキメラ遺伝子を含む植物形質転換ベクタ ー。 １２．請求項１〜９のいずれかに記載のキメラ遺伝子を含むトランスジェニック 植物。 １３．植物細胞において構成的発現を与える能力により特徴付けられた、配列番 号２またはその連続するフラグメントと少なくとも約80％の配列同一性を有する 、キイチゴdru1プロモーター。 １４．配列番号３と少なくとも約80％の配列同一性を有する、請求項１３に記載 のプロモーター。 １５．配列番号４と少なくとも約80％の配列同一性を有する、請求項１３に記載 のプロモーター。 １６．配列番号３を含む、請求項１３に記載のプロモーター。 １７．配列番号４を含む、請求項１３に記載のプロモーター。 １８．請求項１３〜１７のいずれかに記載のプロモーターを含むDNA構築物。 １９．トランスジェニック植物を産生する方法であって、以下の工程を包含する 、方法： 請求項１〜９のいずれかに記載のキメラ遺伝子で植物の前駆細胞を形質転換し て、形質転換前駆細胞を生じさせる工程；および 該形質転換前駆細胞を成長させて、トランスジェニック植物を産生する工程。 ２０．トランスジェニック植物において選択可能なマーカー遺伝子の発現を提供 するための方法であって、以下の工程を包含する、方法： （a）請求項１に記載のキメラ遺伝子で植物の前駆細胞を形質転換して形質転 換前駆細胞を生じさせる工程であって、ここで前記DNA配列が、その発現が形質 転換植物細胞に抗生物質選択薬剤の存在下で増殖する能力を与える産物をコード する選択可能なマーカー遺伝子を含む、工程、 （b）該選択薬剤の存在下で増殖する能力により、該キメラ遺伝子を含む形質 転換植物細胞を選択する工程、 （c）（b）において選択された形質転換植物細胞を再生して、分化した植物を 提供する工程、および （d）該産物を発現する形質転換植物を選択する工程。 ２１．前記形質転換工程が、Agrobacteriumに基づく形質転換、エレクトロポレ ーション、マイクロインジェクション、およびマイクロプロジェクタイルボンバ ードメントからなる群から選択される形質転換方法により実施される、請求項２ ０に記載の方法。 ２２．前記選択薬剤がハイグロマイシン、ゲネチシン、およびカナマイシンから なる群から選択される、請求項２０または請求項２１に記載の方法。 ２３．前記選択可能なマーカー遺伝子が、ネオマイシンホスホトランスフェラー ゼ（npt）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（hpt）遺伝子、 およびブロモキシニル特異的ニトリラーゼ（bxn）遺伝子からなる群から選択さ れる、請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。 ２４．前記形質転換工程における前記キメラ遺伝子が、請求項１４〜１７のいず れかに記載のプロモーターを含む、請求項２０〜２３のいずれかに記載の方法。 ２５．請求項１１に記載の植物形質転換ベクターを包含する、植物を形質転換す るためのキット。 ２６．請求項２に記載のキメラ遺伝子を含む植物形質転換ベクターを含む、トラ ンスジェニック植物において選択可能なマーカー遺伝子の発現を提供するための キット。 ２７．前記異種DNA配列がネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする 、請求項２６に記載のキット。 ２８．請求項１４〜１７のいずれかに記載のプロモーターを含む、請求項２６ま たは請求項２７に記載のキット。