JP2000501611A - アクリル酸アンモニウムの製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 高濃度の（メタ）アクリル酸アンモニウムを有し、かつ（メタ）アクリロニトリルを実質的に含まない溶液を、５００μＭ以下の（メタ）アクリロニトリルに対するＫｍ及び１００，０００以上の（メタ）アクリル酸アンモニウムに対するＫｉを有する酵素を用いて水の存在下に（メタ）アクリル酸を酵素的に加水分解することによって製造する。

Description

【発明の詳細な説明】 アクリル酸アンモニウムの製造 本発明は、アクリル酸アンモニウム及び他のアクリル系単量体の水溶液を製造 する方法に関する。 アクリル酸水溶液またはアクリル酸アンモニウム若しくはアクリル酸ナトリウ ムなどの水溶性塩を製造することが、例えば、重合性単量体として使用するため に、工業的に大いに必要とされている。この水溶液は、環境的観点から、または 、その後の重合に支障を来すゆえに、望ましくない不純物をできるだけ排除する ことが必要である。 工業的にアクリル酸を製造する一般的一方法は、アクリロニトリルを加水分解 して、アクリルアミドを生成し、次に、このアクリルアミドを加水分解して、ア クリル酸アンモニウムまたはアクリル酸を生成することから成る。この種の最も 商業的な方法は、化学的加水分解に頼っているが、酵素的加水分解が、各工程（ 即ち、ニトリルをアミドに転化するニトリルヒドラターゼ、及びアミドを酸塩に 転化するアミダーゼ）に関し知られている。この技術によるアクリル酸の製造は 、例えば、二工程用の高価な装置を必要とするので、経済的に不都合である。し かも、多大の精製処置が一般に必要である。例えば、不純物量のアクリロニトリ ルを非常に低レベルまで除去することが必須であり、これは、大規模な蒸留を必 要とする。 アクリル酸を製造するための他の一般に使用される方法は、プロピレンオキサ イドの水和によるものである。この方法は、アクリロニトリル汚染を排除するた めに精製処置を行う必要を回避するが、 この方法は、複雑な、一般に加圧された装置で行わねばならないという不利があ る。 文献中で、アクリロニトリル水溶液をアクリル酸アンモニウムに直接転化する ためのニトリラーゼ酵素の使用について、若干の提案がなされている。直接転化 は、脂肪族ニトリル類より、芳香族ニトリル類により効果的であることが一般に 容認されている、例えば、スティーブンソン等、Ｂｉｏｔｅｃｈ．ａｎｄ Ａｐ ｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５，２８３−３０２（１９９２）。 ＥＰ−Ａ−４４４６４０の一実施例において、２００ｍＭ以下の濃度のアクリ ロニトリルをニトリラーゼ触媒を使用して加水分解して、若干量のアクリルアミ ド汚染物と共にアクリル酸へのほとんど定量的な転化を達成している。 特公昭６３−２５９６号公報では、２％アクリロニトリル溶液を一実施例にお いて利用し、また、他の実施例において、２５％アクリロニトリル溶液を３２． ９％アクリル酸アンモニウムに加水分解している。さらに他の実施例において、 １５％（メタ）アクリロニトリル溶液を利用して、２３％（メタ）アクリル酸ア ンモニウム溶液を得ている。 Ｂｉｏｔｅｃｈ．ａｎｄ Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１，５８１−６０ １（１９８９）では、その文献に述べられた特定の酵素が、１７ｍＭのアクリロ ニトリルに対するＫｍを有していることが述べられている。操作条件は示されて いないが、この値は、かなりの量のアクリロニトリルが生成物中に残留している ことを必然的に示している。この文献は、４〜６％のアクリルアミドが生成され ると指摘している。同文献は、その文献に述べられた酵素が、アクリロニトリル に対するよりも、ベンゾニトリルに対し一層高い活性 を有していることも指摘している。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９９０，第４８０７〜４８ １５頁では、ロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｋ２２ の特性を分析して、これが、１．１４ｍＭのアクリロニトリルに対するＫｍを有 すると述べている。この値も、最終生成物中にかなりの量のアクリロニトリルが 必然的に存在することを示している。得られるアクリル酸アンモニウムの濃度に ついての情報は、示されていないが、この文献は、酵素活性が、５５℃以上で急 速に失われると述べている。 Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈ，１９９０，３４，第３２２ 〜３２４頁には、アクリロニトリルをアクリル酸に転化する流加法が記載されて いる。このアクリロニトリルは、２００ｍＭ（１．０６％）以下の濃度に保持さ れねばならず、また、生成物は、２４時間後に３８％のアクリル酸を含んでいる と言われている。生成物を溶媒抽出によって抽出し、引き続き、蒸発及び蒸留を 行っている。 これらの酵素的転化法は、二段酵素転化法（即ち、アクリロニトリルをアクリ ルアミドに、次いで、アクリルアミドをアクリル酸アンモニウムに）、及び化学 的転化法に対する有効な別法を提供するが、これら全ては、アクリロニトリル量 を低減するために、多大の精製処置の要件を抱えている。 本発明に従って、我々は、水及び加水分解に際して、少なくとも３０重量％の 濃度の（メタ）アクリル酸またはその塩を与えるのに十分な量の（メタ）アクリ ロニトリルを供給し、そして、（メタ）アクリロニトリルを（メタ）アクリル酸 アンモニウムに転化するための酵素であって、５００μＭ以下の（メタ）アクリ ロニトリルに 対するＫｍ及び１００，０００μＭ以上の（メタ）アクリル酸アンモニウムに対 するＫｉを有する酵素を、工程中に（メタ）アクリロニトリルと接触して供給し 、（メタ）アクリロニトリルの加水分解を生じさせて、０．２％以下の（メタ） アクリロニトリル濃度及び３０％以上の（メタ）アクリル酸アンモニウム濃度を 有する反応液を提供し、そして、３０％以上の（メタ）アクリル酸アンモニウム 濃度及び０．２％以下のアクリロニトリル濃度を有する溶液を回収することから 成る方法によって、少なくとも３０重量％の（メタ）アクリル酸またはその塩及 び０．２％以下の（メタ）アクリロニトリルを含有する水溶液を製造する。 例えば、本発明において、我々は、反応液中に存在する（メタ）アクリル酸ア ンモニウムまたは他の（メタ）アクリル酸塩の量が非常に多い場合でさえ、（メ タ）アクリル酸アンモニウムを製造するために、（メタ）アクリロニトリルを極 めて低い濃度に掃去することができる酵素を使用する。その結果、我々は、非常 に少ない量の（メタ）アクリロニトリルのみに汚染された高濃度の（メタ）アク リル酸アンモニウムまたは他の（メタ）アクリル酸単量体を初めて得ている。特 に、非常に低いＫｍ値を有する酵素を使用することによって、我々は、最終生成 物中に非常に低い（メタ）アクリロニトリル含有率を達成することができ、また 、非常に高いＫｉ値を有する酵素を使用することによって、我々は、高濃度の（ メタ）アクリル酸アンモニウムの存在下に（メタ）アクリロニトリルの低濃度化 を達成することができる。 高濃度の（メタ）アクリル酸アンモニウムまたは他の（メタ）アクリル酸塩、 及び非常に低濃度の（メタ）アクリロニトリルを製造することができる方法を提 供することができるのは、非常に驚くべ きことである。特に、好ましい希釈濃度のアクリロニトリルを使用して、これを 達成できるのは、驚くべきことである。本発明を使用することによって、（メタ ）アクリロニトリルを除去する精製の必要をこのようにして排除して、単一工程 、良好な収率、及び優れた純度で、所望の生成物を得ることさえ可能である。こ のことが、＜０．２：＞３０の出発原料：最終生成物濃度比で行われる方法で達 成することができるのは、特に驚くべきことである。 本発明において、我々は、加水分解による（メタ）アクリル酸またはその塩へ の反応のために、（メタ）アクリロニトリル及び水を供給する。化学的手段を用 いて加水分解の大半を行って、（メタ）アクリル酸（またはその塩）を含有する 水溶液を製造することが可能である。次に、定義した酵素を（メタ）アクリロニ トリルと接触させて供給し、そして、反応液が０．２％以下の（メタ）アクリロ ニトリル濃度及び３０％以上の（メタ）アクリル酸アンモニウム濃度を有するま で、未反応の（メタ）アクリロニトリルの加水分解をさらに生じさせる。 （メタ）アクリロニトリルの量は、通常０．１％以下であり、そして、従来の 分析技術によって検出できないほど低くてもよい。 本発明の方法は、単一反応器中で二段で行うこともできる。あるいは、１つの 反応器中で化学的工程を行い、そして、溶解（メタ）アクリル酸または塩及び残 留（メタ）アクリロニトリルを含有する得られた溶液を、残留（メタ）アクリル アミドの還元が定義酵素との接触に際して行われる生物学的反応器に移すことが できる。 しかしながら、（メタ）アクリロニトリルの実質的に全ての加水分解を定義酵 素によって触媒するのが好ましい。この場合、生成した溶液は、少なくとも３０ 重量％の（メタ）アクリル酸アンモニウ ムを含有している。したがって、我々は、反応器にアクリロニトリル、酵素、及 び水を仕込み、最終溶液を回収するのが好ましい。 我々は、本発明の完全に酵素的な方法によって製造されたアクリル酸アンモニ ウム単量体（生合成アクリル酸アンモニウム）が、プロピレンオキサイドから得 られたアクリル酸からなどの別の化学的経路によって製造された単量体類の特性 と、同等かそれより優れた特性を示すことを見出している。本発明の方法によっ て製造された単量体を使用して製造した重合体も、優れた特性を示す。本発明に よって製造した生合成アクリル酸アンモニウムを他の化学的形態、例えば、アク リル酸またはそのナトリウム若しくは他のアルカリ金属塩、若しくは他の関連ア クリル酸系単量体に転化して、アクリル酸系重合体の製造用出発単量体として使 用することができる。あるいは、転化することなく、アクリル酸アンモニウムと して使用することができる。それを使用して、単独重合体を形成し、あるいは他 の単量体類と併用して共重合体を製造することができる。 本明細書において、本発明を（メタ）アクリル酸アンモニウムの製造のための 好ましい実質的に酵素的方法に関連して論ずるが、論じた原理は、他の（メタ） アクリル酸塩または（メタ）アクリル酸それ自体を製造する方法、及び第一工程 が（メタ）アクリロニトリルの化学的加水分解によるものである方法に適用でき ることを理解されたい。 本発明の方法は、一段法として操作することができる。そのような方法におい て、水、及び加水分解に際して少なくとも３０重量％の濃度の（メタ）アクリル 酸アンモニウムを与えるのに十分な量の（メタ）アクリロニトリルを反応器に供 給し、そして、定義した酵素も供給する。次に、反応器中の溶液が０．２％以下 （多くの場合 ０．１％以下）の（メタ）アクリロニトリル濃度及び３０％以上の（メタ）アク リル酸アンモニウム濃度になるまで、加水分解を生じさせる。次に、反応器から この溶液を回収する。 この種の方法は、連続法として操作することができる。そのような方法におい て、反応器中で、０．２％以下、多くの場合０．１％以下、好ましくは０．０５ ％以下（それぞれ、２、１及び０．５ｇ／ｌ）の（メタ）アクリロニトリル濃度 となるように、（メタ）アクリロニトリルを連続式反応器に供給する。反応器中 の（メタ）アクリル酸アンモニウムの濃度を３０重量％以上に保持する。したが って、少なくとも３０％の（メタ）アクリル酸アンモニウム、及び０．２％以下 の（メタ）アクリロニトリルを含有する生成物を得るように、反応器からの物質 を連続的に引き出すことができる。通常は、反応器中で一定の使用容積を保持す るように、混合物は、反応物の供給速度と同じ速度で引き出す。 水もまた反応物であり、かつ、（メタ）アクリロニトリルと（メタ）アクリル 酸アンモニウムの溶媒である。水は、反応の初めに、必要な全量を反応器中に含 有させることができる。しかしながら、より一般的には、水を反応中に反応器に 供給することができる。アクリロニトリルの周囲温度における水中溶解限度は、 約７重量% であるので、（メタ）アクリロニトリル溶液は、通常、飽和される。 （メタ）アクリロニトリルを溶液の形で添加するならば、溶液以外に生（ｎｅａ ｔ）の（メタ）アクリロニトリルを添加するのが望ましい場合が多い。生の（メ タ）アクリロニトリルは、液状または蒸気として供給することができる。水を生 の（メタ）アクリロニトリルと全く別個に反応器に添加することができる。 種々のタイプの反応器が、この方法に適している。それらには、 連続攪拌槽反応器、抜取り−充填及びループ型反応器、及びプラグ流れ反応器が ある。適切な系には、各々に（メタ）アクリロニトリル及び水を供給する一連の 充填床反応器がある。反応液を第一の充填床反応器から第二の反応器に、次に、 第三の反応器等に通す。少なくとも３０重量％の（メタ）アクリル酸アンモニウ ム及び０．２重量％以下の（メタ）アクリロニトリルを含有する反応液を、最後 の充填床反応器から引き出す。流動床反応器も、特に充填床反応器の代りに使用 することができる。 あるいは、この種の一段法は、流加式方法であってもよい。そのような方法に おいて、（メタ）アクリロニトリルを反応器中に供給して反応させ、（メタ）ア クリル酸アンモニウムを製造する。これは、（メタ）アクリロニトリルの濃度を 、上限及び下限の間に維持するような方法でなされる。（メタ）アクリロニトリ ルを連続的に反応器中に供給し、この範囲内の濃度を維持することができる。あ るいは、それを、（メタ）アクリロニトリルの濃度が範囲の上限に達する程度に 供給してもよい。次に、（メタ）アクリロニトリルの濃度が範囲の下限に低下す るまで、供給を停止する。その低下した時点で、さらに供給を開始して、（メタ ）アクリロニトリルの濃度を再度上昇させる。（メタ）アクリル酸アンモニウム の濃度が、少なくとも３０重量％である所定のレベルに達するまで、この工程を 継続する。 流加法用反応器中の（メタ）アクリロニトリルの濃度は、全反応を通して、０ ．２％以下に維持する。選択した範囲の上限及び下限は、共にこのレベル以下で ある。あるいは、濃度を反応中にこのレベル以上に上昇させても、また実質的に 全反応を通してこのレベル以上であってもよい。その上限は、通常１または２重 量％以下、多 くの場合０．５重量％以下、好ましくは０．２重量％以下である。しかしながら 、流加反応の終了に際して、（メタ）アクリロニトリルの濃度を、０．２％、好 ましくは０．１％又は０．０５％以下に低下させることがぜひとも必要である。 （メタ）アクリロニトリルの濃度が０．２％以下で、（メタ）アクリル酸アン モニウムの濃度が、３０％以上である場合、溶液を反応器から回収する。次に、 新規の流加法を開始する。 水は、上記連続法に対すると同様に、反応が生じる前、あるいは反応中に、反 応器に添加することができる。 流加反応に適した反応器には、連続反応器に有用なものと同種のもの、並びに 流加攪拌槽反応器がある。 連続及び流加法が、本発明によれば好ましい。しかしながら、本発明は、一段 法としての回分法の使用も包含する。回分法においては、反応に際し適当に高い 濃度の（メタ）アクリル酸アンモニウムを得るのに十分な（メタ）アクリロニト リルを反応容器に供給し、酵素の存在下に反応させておく。反応は、（メタ）ア クリロニトリルが、常に０．２％以下、多くの場合０．０５％以下である所定の レベルに低減するまで継続する。 回分反応に適した反応器には、回分攪拌槽反応器がある。 他方において、本発明の方法は、二段階酵素加水分解法として実施することが できる。この種の方法では、開始工程を行うが、その工程の間に、（メタ）アク リロニトリルの加水分解が（メタ）アクリル酸アンモニウムの重量％が３０％未 満または非常に低い、あるいは、残留（メタ）アクリロニトリルの重量％が０． ２％または他の所望の最終濃度より高いのいずれか、あるいはその両方である程 度まで生じる。標準的には、（メタ）アクリル酸アンモニウムは少 なくとも３０重量％の量で存在するが、残留（メタ）アクリルアミド量は０．２ 重量％より多い。この開始工程は、第一反応器中で行う。 次に、この第一反応器からの反応液を、１つまたはそれ以上の後続の反応器に 移す。後続の反応器において、少なくとも３０重量％の（メタ）アクリル酸アン モニウム及び０．２％以下の（メタ）アクリロニトリルを含有する水溶液を製造 するように、更なる加水分解を、定義した種類のさらに別の酵素によって触媒さ せる。このような後続工程は、「仕上げ」工程としてよく知られている。 開始工程及び１つまたはそれ以上の後続工程は、連続、流加、または回分法と して行うことができる。即ち、開始工程を、上記した方法のいずれかの連続法、 流加法、または回分法として行うことができる。次に、得られた溶液を後続仕上 げ工程に通す。この仕上げ工程において、（メタ）アクリル酸アンモニウム及び （メタ）アクリロニトリルの要求含有率の最終生成物を得るように、定義した酵 素によって更なる加水分解を触媒する。次に、この生成物を最後の反応器から回 収する。 好ましい二段法において、反応混合物を連続または他の反応器中で酵素的に加 水分解して、少なくとも３０重量％の（メタ）アクリル酸アンモニウム及び約０ ．５重量％から（約４重量％から約７重量％でありうる）飽和までの量の（メタ ）アクリロニトリルを含有する生成物を製造する。この生成物を、アクリロニト リルの濃度を酵素的加水分解によって０．２％以下、多くの場合０．１％以下に 低下させ、かつ、（メタ）アクリル酸アンモニウム濃度を増大させる仕上げのた めの後続工程に通す。 後続工程は、少なくとも２個のタンク等の反応器から成る。第一 の反応器に、開始工程からの反応液を仕込む。第一反応器に仕込むと、（メタ） アクリロニトリルは、反応器中に存在する定義した酵素によって加水分解される 。第一反応器が満たされたら、０．２重量％以下、多くの場合、検出可能レベル 未満の（メタ）アクリロニトリル含有率の最終生成物を反応器から回収する。こ の時点で、第二の、通常は同等の、反応器の仕込みを開始する。反応器に同様に 仕込み、一杯になったら、反応混合物を第二反応器からポンプで引き出し、第一 反応器の仕込みを再開する。このようにして、各反応器は、交互の流加法方式で 作用する。 交互の仕上げ工程は、定義した酵素を含有する充填床反応器または一連の充填 床反応器から成ることもできる。 更なる別の二段法は、第一工程として、充填床反応器を含んでいる。水及び（ メタ）アクリロニトリルを、それらが系中の混合機で混合され、そして充填床反 応器に送られるサイクルに送る。充填床反応器から出てくる生成物は、少なくと も３０重量％の（メタ）アクリル酸アンモニウム及び通常は０．５重量％から飽 和までの量の（メタ）アクリロニトリルを含んでいる。この生成物の一部を仕上 げ工程に送り、また、一部は、連続開始工程に再循環させる。 更なる別の二段法は、第一工程によって、３０重量％までの（メタ）アクリル 酸アンモニウム及び少なくとも１重量％の（メタ）アクリロニトリルを含有する 溶液を製造することを含む。この溶液を３５〜４０重量％の（メタ）アクリル酸 アンモニウムになるように濃縮する蒸留工程に送る。次に、この生成物を、本発 明に従う酵素的仕上げ工程に送って、（メタ）アクリロニトリルの量を０．２重 量％以下に減少させる。 仕上げ工程は、定義した特性を有する最終生成物をその単一工程 では生じない、上記開始工程のいずれとも一緒に使用することができる。 二段法において、第一工程から出てくる溶液中の（メタ）アクリロニトリルの 量は、多くの場合０．５〜７重量％、例えば、少なくとも１重量％であり、また 、約３または４重量％までである。 これらの二段法において、本発明の特に驚くべき特徴は、同種の酵素を開始工 程及び仕上げ工程の両工程に使用可能なことである。例えば、この酵素は、上記 したように非常に高レベルの生成物（仕上げ工程における）の存在下に非常に低 レベルの（メタ）アクリロニトリルを掃去することができるという点で異常であ る。しかしながら、さらに、大抵のニトリラーゼ酵素は、比較的高レベル、例え ば、約０．５または１重量％以上のレベル、特に飽和及びその近辺のレベルの（ メタ）アクリロニトリルの存在下に、失活する傾向がある。本発明で使用する酵 素は、開始工程の比較的高レベルの（メタ）アクリロニトリル環境及び仕上げ工 程の比較的低レベルの（メタ）アクリロニトリル環境で、転化を触媒することが できる。 本発明の方法に使用するために特に好ましい酵素は、１２０〜１７５ｍＭのア クリロニトリル及び２，４７５〜２，５２５ｍＭのアクリル酸アンモニウムを含 有する水溶液中で測定して、少なくとも５日の半減期を有している。好ましくは 、半減期は、少なくとも７日、より好ましくは、少なくとも７．５日である。ア クリロニトリル及びアクリル酸アンモニウムの正確な含有量は、試験中に変化し うるが、特定の濃度範囲内に常に保持する。アクリロニトリルは、ニトリラーゼ によってアクリル酸アンモニウムに転化されるので、アクリロニトリルの濃度は 次第に低下する。濃度が１２５ｍＭの下限に達したら、さらにアクリロニトリル を添加して、濃度を１７５ｍＭの上限 まで上昇させる。同様に、アクリル酸アンモニウムの量は、アクリル酸アンモニ ウムの濃度を調節して、特定量の間で変化させて、濃度が２００，５２５ｍＭの 特定した最大値より高くなるのを防止する。 本発明の方法の全てにおいて、（メタ）アクリロニトリルの最終濃度は、０． ２％以下、多くの場合０．１５％または１％以下、好ましくは０．０５％以下で ある。この濃度は、好ましくは０．０３％以下、より好ましくは０．０２％また は０．０１％以下であり、また、実質的に検出できない程低いのがよい。 （メタ）アクリル酸アンモニウムの最終濃度は、少なくとも３０重量％、多く の場合少なくとも３５重量％、好ましくは少なくとも４０または４５重量％であ る。（メタ）アクリル酸アンモニウムの最高濃度は、通常４８〜５０重量％であ る。なぜならば、これ以上の濃度では、（メタ）アクリル酸アンモニウムが、溶 液から沈殿しがちであるためである。 酵素は、いかなる適切な形態でもプロセスに含みうる。酵素は、触媒として使 用する前に、培養微生物から抽出した純粋な形で使用することができる。使用す る抽出法は、酵素の活性及び安定性を失わないことを確実にするべきである。 酵素は、半純粋形、例えば、培養液または処理をしていない細胞若しくは粉砕 細胞のような細菌細胞分画として使用することもできる。酵素は、粗不純酵素溶 液の形で使用してもよい。酵素は、架橋重合体マトリックス、例えば、架橋ポリ ビニルアルコールまたは架橋ポリアクリルアミド等の担体に支持若しくは固定し てもよい。酵素は、表面に結合した酵素を有する非膨潤粒子の形で使用すること もできる。酵素は、処理していない細菌細胞または架橋重合体マト リックスに支持させた形で使用するのが好ましい。 我々は、流加式反応には、酵素を遊離細胞として純粋または半純粋の形で使用 するのが特に有利であることを見出している。この形での使用は、細胞を担体に 固定化する必要性を排除する。また、このような使用は、貯蔵に際し、あるいは 反応混合物中で、過度の安定性の低下に至らないことがわかっている。 連続式方法に関し、我々は、酵素を固定化した形で使用する方を好む。なぜな らば、このような使用は、使用する反応器でより大きな長期安定性を与える傾向 があるためである。特に、ある環境において、固定化した形態の酵素は、貯蔵し ていると同様に、反応混合物中で安定であることを見出した。最終生成物からの 触媒の分離も一般により容易である。 酵素を、特に重合体ビーズの形で固定化する場合、より大きなサイズの重合体 ビーズの製造が、重合体中の酵素の安定性を改善することを見出した。特に、８ ５０μｍより、好ましくは１ｍｍより大きなサイズのビーズが好ましい。 重合体マトリックスは、いかなる方法でも、例えば、粒状重合または懸濁重合 によって、製造することができる。単量体混合物に増粘剤を添加することも有効 である。 製造中の酵素の安定性は、低い細胞添加率、即ち、重合体マトリックスに対す る乾燥細胞の重量％、特に５％以下、好ましくは１％以下、例えば約０．５重量 ％で、最高になることが見出された。しかしながら、安定性は、例えば、３０ま たは２０℃以下、多くの場合１５℃以下の低い重合温度を使用することによって も達成することができる。これは、例えば、少なくとも４重量％、好ましくは少 なくとも５重量％、例えば、約６．５または６．８重量％のより高 い細胞添加率と組合せて使用することができる。 好ましい方法において、酵素を、反応器中で所望の活性を与えるように反応混 合物に含有させる。反応器に加えるこの種の触媒は、通常５０〜１００，０００ ニトリラーゼ単位／グラム、典型的には５００〜５０００ニトリラーゼ単位／グ ラムの活性を有している。この場合、１ニトリラーゼ単位は、５０ｍＭリン酸緩 衝液中、３０℃、ｐＨ７．０、及び５０ｍＭアクリロニトリルの条件で、アクリ ロニトリルを１μモル／分の速度でアクリル酸アンモニウムに転化する活性と定 義される。触媒は、菌細胞の形態、あるいは、より一般的には、重合体ゲルマト リックスに固定化した形態でありうる。定義された活性を有する触媒は、反応混 合物の１〜５０重量％の量で反応器中に含有させる。 特に、酵素を、１リットルの反応混合物当たり、３，０００〜５０，０００ニ トリラーゼ単位の活性を示すように、反応混合物に添加するのが好ましい。 本発明の二段法において、我々は、より多い量の酵素触媒を開始工程における よりも仕上げ工程において含有させるのが望ましいことを見出した。 好ましい方法において、通常、必要な酵素の全量を反応の初め、即ち、（メタ ）アクリロニトリル反応物または反応液を添加する前に、関連反応器に供給する 。しかしながら、反応中に連続的または定期的に追加の酵素を関連反応器に加え て、好ましい方法を実施することも可能である。 反応は、水溶液中で行う。水溶液の最良の成分は、一般に水、酵素（菌細胞、 重合体マトリックス等を含む）、（メタ）アクリロニトリル、及び（メタ）アク リル酸アンモニウムである。 反応は、いかなる適切な時間で実施しうる。連続反応は、１０時間、一般に、 少なくとも２０または３０時間、多くの場合５０または６０時間、あるいはそれ 以上と、長い間行うことができる。連続反応の期間は、一般に、少なくとも一部 は、反応液中の酵素の安定性に依存する傾向にある。非常に安定な酵素は、反応 混合物に追加の新鮮な酵素を添加する必要なしに、かなり長い期間連続反応を続 けることを可能とする。 流加法及び回分法は、一般に１〜２４時間、例えば約５時間を要する。この種 の反応の期間は、酵素の活性及び酵素が（メタ）アクリロニトリルを（メタ）ア クリル酸アンモニウムに転化する速度に依存する。アクリル酸アンモニウムに対 する高いＫｉ値を有する酵素は、生成物濃度が、３５％、さらには４０％にも達 する場合でさえ、著しい生成物阻害が２５〜３０％のアクリル酸アンモニウムと 明らかに低い転化率によって証明されているＡｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂ ｉｏｔｅｃｈ．，１９９０，３４，第３２２〜３２４頁と違って、アクリロニト リルの迅速な転化を可能とする。 本発明の方法は、一般に５〜７０℃、好ましくは２０〜６０℃の温度で行われ る。我々は、低い反応温度を使用して、（メタ）アクリル酸アンモニウムの収率 を顕著に低減することなく、酵素活性の損失を少なくすることができることを見 出している。例えば、３０℃以下、特に２０℃以下の温度が有効である。反応温 度は、１５℃以下、さらには１０℃と低くすることができる。 ｐＨ条件は、通常３〜９．５、好ましくは５〜９、より好ましくは６〜８であ る。 反応器中に存在する（メタ）アクリロニトリルの非常に低い濃度は、特に流加 法及び連続法に関し、反応物濃度の注意深い制御を必 要とする。 （メタ）アクリロニトリル濃度の測定及び制御は、液相に関するいかなる従来 の方法（例えば、分光またはクロマトグラフィー）で行うことができるが、特に 便利かつ迅速な方法は、反応混合物と平衡しているヘッドスペースガス中の（メ タ）アクリロニトリルの検出である。これは、Ｕ．Ｖ．分析を用いて行うことが できる。 反応器がヘッドスペースを有していない場合、分析を、例えば、ブリードによ って反応混合物と平衡して保持することができるいかなる蒸気に対して行うこと ができる。 さらに別の監視技術は、導電率を使用するものである。反応混合物の一部を、 例えば、サンプリングまたはブリードによって取り出す。導電率と（メタ）アク リル酸アンモニウムの濃度との関係が、（メタ）アクリル酸アンモニウムの低い 濃度、例えば、約２０重量％以下で非常に敏感であり、かつ、本質的に線形であ ることを見出した。本発明の方法は、これより高い濃度で実施される傾向にある ので、反応液試料を、（メタ）アクリル酸アンモニウムの濃度がこの敏感な線形 域内にあるように希釈する。 次に、導電率を用いて（メタ）アクリル酸アンモニウムのレベルを非常に精密 に測定する。次に、（メタ）アクリロニトリルの割合を物質収支計算を用いて確 定する。 （メタ）アクリル酸アンモニウムの高濃度、例えば３０重量％以上において、 存在する（メタ）アクリロニトリルが、導電率に観測可能な作用を及ぼすことも 見出している。この作用を用いて、反応混合物中の（メタ）アクリルニトリルの レベルを算定することも可能である。 本発明の方法において、特に連続法において、またしばしば流加 法において、低い（メタ）アクリロニトリルの濃度を維持することが非常に望ま しい。一般に、例えば、（メタ）アクリロニトリルを反応器中に供給する場合、 非常に高濃度の（メタ）アクリロニトリルの局在する領域をできるだけ少なくす ることが重要である。一般に、触媒の寿命は、低い（メタ）アクリロニトリル濃 度で最高にされる。平均濃度が、非常に低い場合、０．２％より高い、さらには １または２％より高い（メタ）アクリロニトリル濃度との過渡的な接触は、許容 しうる。同様に、平均値が低く、また、変動がそんなに長く続かない場合、経時 的な濃度の一時的変動も許容しうる。 （メタ）アクリロニトリルの局所的な高濃度化の発生率は、添加装置を適切に 選択し、また、適当な攪拌を反応器中で確実に保持することによって、低減する ことができる。 流加反応の制御は、プログラム制御装置、例えば、計算機制御装置を用いて行 うことができる。そのような制御装置は、所定の速度での液状または蒸気状の（ メタ）アクリロニトリルの供給に対し、プログラムされる。 流加及び連続反応、特に、連続攪拌槽反応器中で実施されるものは、フィード バック系を用いて制御することができる。反応混合物の分析を、例えばヘッドス ペースで、あるいは上記したいかなる他の方法で行い、得られた測定値を用いて 、液体若しくは蒸気として（メタ）アクリロニトリルの反応器への供給を制御す ることができる。 制御は、反応器を通る循環ガスまたは不混和液によって行うことができる。ガ スは、例えば、（メタ）アクリロニトリル蒸気または他のガスと混合した（メタ ）アクリロニトリル蒸気でありうる。不混和液は、反応混合物と混和しない如何 なる液であってもよい。ま た、（メタ）アクリロニトリルを、この不混和液に溶解若しくはそれと混合させ ることもできる。ガスまたは不混和液は、反応混合物より低密度であるように選 択されることが多いので、ガスまたは不混和液は、通常、反応混合物中を上方に 通過する。次に、これを引き出し、分析する。この分析の結果を用いて、ガスま たは不混和液の反応混合物への供給を制御することができる。ガスまたは不混和 液は、水を反応混合物中に運ぶこともできる。特に、このような系は、特に連続 攪拌槽における連続反応、及び流加反応に使用することができる。 反応混合物自体を、ループによって引き出して循環させ、反応混合物に戻すこ ともできる。ループは、（メタ）アクリロニトリルの源、及びしばしば水の源に 、接続することができる。分析は、ループのライン中またはヘッドスペースで行 って、ルーペへの反応物の添加を制御することができる。反応が、連続式のもの である場合、反応混合物をループから取り出すことができるブリードを設けても よい。 全ての場合に、必ず必要というのではないが、反応器に攪拌機を備えることが できる。 連続反応に関し、反応混合物を引き出す如何なる適切な方法も用いることがで きる。適切な方法には、上記したブリード及び反応混合物があふれて、反応器か ら出ていくことができる堰がある。 酵素は、アクリロニトリル及び（メタ）アクリロニトリルのどちらかが転化さ れる場合、（メタ）アクリロニトリルに対する５００μＭ以下のＫｍ、及びどち らか生成されるアクリル酸アンモニウムまたはメタクリル酸アンモニウムに対す る１００，０００μＭ以上のＫｉを有する必要がある。本明細書において、Ｋｍ 及びＫｉは、 酵素が、特にｐＨ７においてミカエリス−メンテン反応速度論に従う条件下に測 定する。好ましい測定技術は、ｐＨ７、及び３０℃で５０ｍＭリン酸ナトリウム 緩衝液中で全細胞形の酵素を使用し、また、０．０１〜０．５ｍＭのアクリロニ トリル濃度（Ｋｍに関し）及び１．２Ｍのアクリル酸アンモニウムと０．０７９ 〜０．５５４ｍＭのアクリロニトリル濃度（Ｋｉに関し）を使用する。 Ｋｍは、好ましくは３００μＭ以下、より好ましくは１００μＭ以下、最も好 ましくは６０μＭ以下である。初期の実験を行った好ましい酵素は、全細胞の形 で３０．６μＭのＫｍを有するので、我々は、標準の技術及び選択手順、例えば 、シルマン等（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３５，３１５ ３−３１６４において、アミダーゼに対して記載されたもの、及びワグナー（１ ９９０），Ｔｉｂｔｅｃｈ．，８，２６３−２７０によって、ラクテートデヒド ロゲナーゼに対して記載されたものの適用によって、９．４６、さらには３．８ μＭまでのＫｍ値を持つ酵素を得ることを予測する。 Ｋｉは、好ましくは、少なくとも１５０，０００または２００，０００、より 好ましくは、少なくとも２５０，０００μＭである。初期の実験を行った好まし い酵素は、３０９，０００μＭと推定したＫｉを有している。上記Ｋｍに関し述 べたもののような標準の技術及び選択手順によって、３００，０００μＭまで、 さらには８００，０００μＭ以上のＫｉを有する酵素を得る。 Ｋｉ／Ｋｍ比は、一般に、少なくとも２００、好ましくは、少なくとも３００ 、より好ましくは、少なくとも５００、特に、少なくとも１，０００である。本 発明の方法に使用する酵素は、少なくとも５，０００、さらには９，０００以上 のＫｉ／Ｋｍ比を有することができ、また、我々が初期の実験を行った酵素は、 １０，０００ より高いこの比の値を有している。 本発明の方法で使用するために、特に好ましい酵素は、我々が単離した新規の 微生物である。これは、ロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）の菌株であり、受託番号ＮＣＩＭＢ ４０７５７を 受けて、１９９５年８月８日にＮＣＩＭＢに寄託された。他の好ましい酵素は、 我々が受託番号ＮＣＩＭＢ ４０８３３を受けて、１９９６年１２月１１日に、 ＮＣＩＭＢに寄託したロドコッカス・ロドクラウスの菌株である。したがって、 本発明の好ましい態様は、酵素が、ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ ４ ０７５７またはＮＣＩＭＢ ４０８３３あるいはこれらのいずれかの突然変異体 若しくは変異体の特性を有する微生物から得ることができるものである方法であ る。 これらの微生物及びこれらが産生するニトリラーゼ酵素は、英国特許出願番号 第９５２５３７２．０に基づく優先権を主張する本日出願した本願の同時係属国 際出願第・・・号（参照番号６０／３５７４／０３）に述べられている。実施例１ ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バク テリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ ｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ）に、培養コレクション番号ＮＣ ＩＭＢ ４０７５７を受けて寄託された、ニトリラーゼ酵素を含有する、または ニトリラーゼ酵素を誘発することができるロドコッカス・ロドクラウスの菌株の 原分離菌を、以下の表に示す液体培養培地を含有するエーレンマイヤーフラスコ に移す。 エーレンマイヤーフラスコを攪拌しながら２４時間保温する。次に、細胞を液 から分離し、５０ｍＭ、ｐＨ７のリン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁させた後、懸 濁液から分離する。細胞の一部を−２０℃で凍結貯蔵し、その残りを５０ｍＭの アクリロニトリルを含有する５０ｍＭのｐＨ７のリン酸ナトリウム緩衝液に再懸 濁する。細胞の比ニトリラーゼ活性を測定したところ、１０６０μモル／分／ｇ （細胞の乾燥重量）であった。 次に、細胞を３０℃で精製水に懸濁させた。アクリロニトリルを細胞懸濁液に 定期的に添加して、アクリロニトリルの濃度を１９０ｍＭに上昇させた。各添加 前に、試料を取り出し、細胞懸濁液中のアクリロニトリル、アクリルアミド、及 びアクリル酸アンモニウム濃度を測定した。以下の表は、初期、最高及び最終比 ニトリラーゼ活性、最終アクリル酸アンモニウム濃度及びその濃度に達するのに 要した時間を示す。 細胞物質を遠心分離及び濾過によってアクリル酸アンモニウム溶液から除去し て、測定した溶液中のアクリロニトリル、アクリルアミド、及びアクリル酸アン モニウムの濃度を以下の表に示す。 同様にして、さらに反応を行ったところ、検出限度以下のアクリロニトリルと 共に、０．１５重量％のアクリルアミド濃度及び４６重量％のアクリル酸アンモ ニウムが得られた。実施例２ 本発明の連続方法を、実施例１に説明したような酵素を用いて行う。酵素を重 合体ビーズ中に封入して、固定化細胞を用意する。これらの固定化細胞ビーズを 反応器に移して、２０℃で３３重量％のアクリル酸アンモニウム及び３．６重量 ％のアクリロニトリルの溶液中に懸濁させる。固定化触媒の作用によって、反応 器中のアクリル酸アンモニウムの濃度を３５重量％に上昇させた。次に、アクリ ロニトリル及び水を別々に自動的に反応器に供給して、アクリル酸アンモニウム の濃度を３３〜３５重量％に維持し、かつ、アクリロ ニトリルの濃度を２．４〜３．６重量％に維持する。操作中、アクリロニトリル ／アクリル酸アンモニウム溶液及びビーズ材のブリードを反応器から連続的に引 き出し、一定の反応器使用容積を保持する。次に、反応器中の内容物をサイクロ ンに入れ、ビーズを分離して反応器に戻す。次に、生成物の流れを一対の仕上げ 用反応槽の一方に供給する。これらの槽も固定化酵素物のビーズを含んでいる。 一工程において、一方の槽にアクリロニトリルで汚染されたアクリル酸アンモニ ウム溶液を仕込み、他方の槽は、酵素的加水分解条件に保持する。酵素的加水分 解を、アクリロニトリルを実質的に検出されないレベルまで減少させる程度に行 った後、その槽を、酵素を含むビーズ及び他の固体成分を、アクリロニトリルを 実質的に含まない３９％のアクリル酸アンモニウム溶液から分離するフィルター を通して空にする。実施例３ 本発明の繰り返し流加方法を、実施例１で説明した酵素を用いて行う。酵素を 重合体ビーズ中に封入して、固定化細胞を用意する。これらの固定化細胞ビーズ を反応器に移して、２０℃で水に懸濁させ、そして、１．２重量％の濃度になる ようにアクリロニトリルを添加する。固定化細胞のニトリルが、アクリロニトリ ルの加水分解を触媒して、アクリル酸アンモニウムを生成する。反応器中のアク リロニトリルの濃度が、０．９重量％に低下したら、さらにアクリロニトリルを 反応器に自動的に添加して、再びアクリロニトリルの濃度を１．２重量％に上げ る。この自動的供給手順は、反応器中のアクリル酸アンモニウムの濃度が４３． ５重量％に上昇するまで継続する。１回分の反応の完了に際し、アクリロニトリ ルの供給を止 め、反応器中の残っているアクリロニトリルを、アクリル酸アンモニウムの濃度 が４５重量％になり、アクリロニトリルの濃度が実質的にゼロになるまでアクリ ル酸アンモニウムに転化させる。 製造されたアクリル酸アンモニウム溶液を反応器から引き出し、濾過して、細 胞物質の固定化生触媒を回収する。次に、この物質を引き続き２０℃で水を再仕 込みされる反応器に戻して、工程を繰返す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 ヒューズ ジョナサン イギリス国 エイチディー６ ３イーダブ リュー ハリファックス、ブリグハウス、 ラストリック、スコリー ロード 22

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 水と、加水分解に際し少なくとも３０重量％の濃度の（メタ）アクリル 酸またはその塩を与えるのに十分な量の（メタ）アクリロニトリルとを供給し、 そして（メタ）アクリロニトリルを（メタ）アクリル酸アンモニウムに転化する 酵素であって、５００μＭ以下の（メタ）アクリロニトリルに対するＫｍ及び１ ００，０００μＭ以上の（メタ）アクリル酸アンモニウムに対するＫｉを有する 酵素を、工程中に（メタ）アクリロニトリルと接触して供給し、反応液が０．２ ％以下の（メタ）アクリロニトリル濃度及び３０％以上の（メタ）アクリル酸ア ンモニウム濃度になるまで（メタ）アクリロニトリルの加水分解を生じさせ、そ して３０％以上の（メタ）アクリル酸アンモニウム濃度及び０．２％以下のアク リロニトリル濃度を有する溶液を回収することを特徴とする少なくとも３０重量 ％の（メタ）アクリル酸またはその塩及び０．２％以下の（メタ）アクリロニト リルを含有する水溶液を製造する方法。 ２． （メタ）アクリロニトリルを化学的に加水分解して、（メタ）アクリル 酸アンモニウム及びアクリロニトリルを含有する水溶液を用意し、次いで、得ら れた溶液を前記酵素と接触させ、そして反応液が０．２％以下の（メタ）アクリ ロニトリル濃度を有するまで、（メタ）アクリロニトリルの加水分解を生じさせ る請求項１記載の方法。 ３． （メタ）アクリロニトリルの実質的に全ての加水分解が、前記酵素を用 いる酵素的加水分解によるものである請求項１記載の 方法。 ４． 反応器に、水と、加水分解に際し少なくとも３０重量％の濃度の（メタ ）アクリル酸アンモニウムを与えるのに十分な量の（メタ）アクリロニトリルと を仕込み、そして反応液が０．２％以下の（メタ）アクリロニトリル濃度及び３ ０％以上の（メタ）アクリル酸アンモニウム濃度になるまで、（メタ）アクリロ ニトリルの酵素的加水分解を生じさせる請求項３記載の方法。 ５． （メタ）アクリロニトリルの最終濃度が、０．１％以下、好ましくは０ ．０２％以下である請求項４記載の方法。 ６． （メタ）アクリル酸アンモニウムの最終濃度が、少なくとも４０％であ る請求項４または請求項５記載の方法。 ７． Ｋｍが、１００μＭ以下である請求項４〜６のいずれかに記載の方法。 ８． Ｋｉが、少なくとも２００，０００μＭである請求項４〜７のいずれか に記載の方法。 ９． Ｋｉ／Ｋｍ比が、少なくとも５，０００である請求項４〜８のいずれか に記載の方法。 １０． 前記酵素が、ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ ４０７５７ま たはＮＣＩＭＢ ４０８３３の特性を有する微生物を 培養することによって得ることができる請求項４〜９のいずれかに記載の方法。 １１． 工程中に、反応器に、前記酵素、水、及び（メタ）アクリロニトリル を仕込み、そして反応器中で加水分解を生じさせ、次に溶液を反応器から回収す ることによって行われる請求項４〜１０のいずれかに記載の方法。 １２． 第一工程中に（メタ）アクリロニトリルの加水分解が、（メタ）アク リル酸アンモニウムの重量％が所望の最終濃度未満であるか、あるいは、残留（ メタ）アクリロニトリルの重量％が所望の最終濃度より高い程度に生じ、そして 、次に、この溶液を、それをさらに酵素的に加水分解して、回収される所望の最 終溶液を得る１つまたはそれ以上の後続反応器に移す、二段酵素加水分解法とし て行われる請求項４〜１０のいずれかに記載の方法。 １３． 水及び（メタ）アクリロニトリルから成る反応混合物を連続式反応器 中で酵素的に加水分解して、少なくとも３０重量％の（メタ）アクリル酸アンモ ニウム及び０．５％から飽和までの量の（メタ）アクリロニトリルを含有する生 成物を生成し、そして、次に、この生成物を、（メタ）アクリロニトリルの濃度 を酵素的加水分解によって０．１％以下に低下させ、かつ、（メタ）アクリル酸 アンモニウムの濃度を増大させる後続反応器に移す請求項１２記載の方法。 １４． 後続反応を、交互に流加法で操作される少なくとも２つ の後続反応容器を利用して行う請求項１２または請求項１３記載の方法。 １５． 第一工程を充填床反応器中で行って、０．５％から飽和までの（メタ ）アクリロニトリルを含有する溶液を生成し、そしてこの溶液の一部を、残りを 再循環させながら、さらに酵素的に加水分解する請求項１２〜１４のいずれかに 記載の方法。 １６． 第一工程の酵素的加水分解で得た溶液を、第二工程の酵素的加水分解 の前に蒸留する請求項１２〜１５のいずれかに記載の方法。 １７． 同一の酵素を、方法全体を通して使用する請求項１２〜１６のいずれ かに記載の方法。 １８． 方法の制御が、酵素的加水分解を行う反応器のヘッドスペースでの（ メタ）アクリロニトリルの検出から成る前記請求項のいずれかに記載の方法。 １９． 反応器の制御が、溶液を２０％以下のアクリル酸アンモニウム濃度に なるように希釈し、そして、前記希釈液の導電率を測定することから成る前記請 求項のいずれかに記載の方法。