JP2000500338A

JP2000500338A - Ｍｃｈ３、アポトーシス性プロテアーゼ、コードする核酸、および使用方法

Info

Publication number: JP2000500338A
Application number: JP9518998A
Authority: JP
Inventors: エス．アルネムリ，エマド; フェルナンデス−アルネムリ，テレサ; リトワック，ジェラルド; アームストロング，ロバート; トマセリ，ケビン
Original assignee: アイドゥンファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド; トマスジェファーソンユニバーシティ
Priority date: 1995-11-13
Filing date: 1996-11-12
Publication date: 2000-01-18
Also published as: US6716960B2; US6462175B1; US20020102648A1; DE69632963T2; US6686459B1; CA2237618A1; DE69632963D1; ATE271609T1; NZ322796A; WO1997018313A1; EP0866866B1; AU728859C; US20030119169A1; CA2237618C; AU728859B2; EP0866866A1; AU7678296A

Abstract

(57)【要約】本発明は、Mch3またはその機能的フラグメントをコードする、単離された遺伝子を提供する。Mch3またはその機能的フラグメントをコードする、単離された核酸配列もまた提供される。遺伝子または核酸配列は、Mch3ヌクレオチド配列のコード鎖または非コード鎖に対応する、１本鎖または２本鎖の核酸であり得る。単離されたMch3ポリペプチドまたはその機能的フラグメントもまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 Mch3、アポトーシス性プロテアーゼ、コードする核酸、および使用方法本発明は、国立衛生研究所からのAI 35035-01補助金の下、政府の援助によって成された。従って、政府は本発明に対して一定の権利を有する。本出願を通じて、様々な出版物が括弧内に参照される。これらの出版物の開示は、本発明が関係する到達水準をより十分に記載するために、その全体が本出願に参照として援用される。発明の背景本発明は、一般的にアポトーシスまたはプログラム細胞死に関連し、そしてより詳細には、ヒト疾患の治療的処置のためにアポトーシスを調節するために用いられ得る、新規なシステインプロテアーゼに関連する。アポトーシスは、通常の生理学的な細胞死のプロセスであり、これは細胞分裂により産生された新たな細胞蓄積の速度が、死による細胞喪失の釣り合った速度によって相殺されることを保証することにより、組織ホメオスタシスの調節において重要な役割を果たす。正常な細胞の代謝回転を妨げるかまたは遅延させる、アポトーシス（生理学的細胞死またはプログラム細胞死とも呼ばれる）における妨害が、増殖の調節および細胞周期における既知の異常と全く同様に、疾患の病原に対して重要であり得ることは、現在明白になっている。細胞周期調節タンパク質間の複雑な相互作用を通じて制御される細胞分裂のように、アポトーシスは、細胞死を誘導するか、または阻害するかのいずれかで、遺伝子産物の相互作用によって、通常の環境下で類似的に制御される。これらのアポトーシス性遺伝子産物の機能を調節する刺激は、細胞外および細胞内のシグナルの両方を含む。特別な刺激の存在または除去のいずれもが、正または負のアポトーシス性シグナルを惹起するのに十分であり得る。例えば、アポトーシスを妨げるかまたは阻害する生理学的刺激として、成長因子、細胞外マトリックス、CD40リガンド、ウイルス遺伝子産物中性アミノ酸、亜鉛、エストロゲン、およびアンドロゲンが挙げられる。対照的に、アポトーシスを促進する剌激として、例えば、腫瘍壊死因子（TNF）、Fas、および形質転換成長因子β（TGF β）のような成長因子、神経伝達物質、成長因子の離脱、細胞外マトリックス付着の喪失、細胞内カルシウム、および糖質コルチコイドが挙げられる。環境性および病原性起源の刺激を含む他の刺激がまた存在し、これらはプログラム細胞死を誘導するかまたは阻害し得る。アポトーシスは、種々のシグナルおよび細胞性遺伝子産物の複雑な相互作用によって媒介されるが、これらの相互作用の結果は、最終的に、ヒトと無脊椎動物との間で進化的に保存された細胞死経路に送り込まれる。アポトーシスプロセスを調節するいくつかの遺伝子産物が、現在同定されている。これらの産物は、一般的に、２つの基本的なカテゴリーに分けられ得るが、各カテゴリー由来の遺伝子産物は、プログラム細胞死を阻害するかまたは誘導するために機能し得る。遺伝子産物の１つのファミリーは、Bcl-2タンパク質ファミリーのメンバーである遺伝子産物である。Bcl-2は、このファミリーの最も良く特徴付けられたメンバーであり、そして細胞内で過剰発現された場合にアポトーシスを阻害する。この遺伝子ファミリーの他のメンバーとして、例えば、Bax 、Bak、Bcl-x_L、Bcl-x_S、およびBadが挙げられる。これらのタンパク質のいくつかはアポトーシスを妨げるが、残りはアポトーシスを増加させる（例えば、それぞれ、Bcl-x_LおよびBak）。遺伝子産物の第２のファミリーである、インターロイキン-1-β変換酵素（ICE ）プロテアーゼファミリーは、C．elegans Ced-3遺伝子産物と遺伝的に関連し、これは最初に、線形動物であるC．elegansにおけるプログラム細胞死に必要であると示された。ICEプロテアーゼファミリーとして、ヒトICE、ICH-1_L、ICH-1_S、 CPP32、Mch2、ICH-2、およびICE_rel ^-IIIが挙げられる。これらの遺伝子産物の共通の特徴には、以下が含まれる；１）それらは、Asp-x結合における基質切断に特異性を有するシステインプロテアーゼである、２）それらは、活性部位の内に保存されたペンタペプチド配列（QACRG）を共有する、そして、３）それらは、プロテアーゼ活性の活性化のために特定のアスパラギン酸残基におけるタンパク質分解性の切断を必要とする、プロ酵素として合成される。プロ酵素の切断は、約20kD（p20）および10kD（p10）の２つのポリペプチドプロテアーゼサブユニットを生成し、ICEの場合、それらは非共有的に結合し、２つのp20:p10ヘテロ二量体から成る四量体を形成する。これらのプロテアーゼは、細胞内で発現された場合に細胞死を誘導するが、これらプロテアーゼのいくつかの代替的な構造形成（例えばICEδ、ICEε、ICH-1_S、およびMch2β）は、実質的にアポトーシスを阻害するように機能する。哺乳動物細胞中のアポトーシスにおいて役割を果たすBcl-2およびCed-3/ICE遺伝子ファミリーに加え、哺乳動物の細胞死において重要であり、そしていずれ同定されなければならない他の遺伝子産物が存在することが、だんだん明らかになっている。例えば、Ced-3に加え、Ced-4として知られる別のC．elegans遺伝子が存在し、これはまたC．elegansにおけるプログラム細胞死に必要とされる。しかし、このタンパク質の哺乳動物ホモログは不可解なままであり、そしてまだ同定されていない。さらに、上記の２つのアポトーシス性遺伝子ファミリーのいずれかに属する他の遺伝子が存在するかどうか、またはプログラム細胞死経路においてそれらがどのような役割を果たし得るかは不明確である。前記のように、アポトーシスは、組織ホメオスタシス保持において重要な生理学的役割を果たす。プログラム細胞死は、生理学プロセス（例えば、胚発生、免疫細胞調節および正常な細胞の代謝回転）において機能する。従って、機能不全、または調節されたアポトーシスの減損は、種々の病理学的疾患状態を導き得る。例えば、アポトーシスの減損は、多くの自己免疫疾患に生じるような自己反応性リンパ球の病理学的蓄積を導き得る。適切でないアポトーシスの減損はまた、ウイルスに感染した細胞、および新形成細胞または腫瘍細胞のような過剰増殖細胞の蓄積を導き得る。同様に、適切でないアポトーシスの活性化はまた、例えば、後天性免疫不全症候群(AIDS)、神経変性性疾患、および虚血性損傷を含む種々の病理学的疾患状態に寄与し得る。これらおよび他の病理学的状態におけるアポトーシス経路を調節するために特に設計された処置は、これらの多くの疾患の自然な進行を変化し得る。従って、新しいアポトーシス遺伝子およびそれらの遺伝子産物を同定する必要性、そしてヒトの疾患の治療的処置のためにこのプロセスを調節する方法の必要性が存在する。本発明はこの必要性を満たし、そして関連する利点をさらに提供する。発明の要旨本発明は、Mch3をコードする単離された遺伝子、またはその機能的フラグメントを提供する。Mch3をコードする単離された核酸配列またはその機能的フラグメントがまた提供される。遺伝子または核酸配列は、Mch3ヌクレオチド配列のコード鎖または非コード鎖に対応する、１本鎖または２本鎖の核酸であり得る。単離されたMch3ポリペプチドまたはその機能的フラグメントがまた、提供される。図面の簡単な説明図１は、それぞれヒトMch3α（配列番号１および２）ならびにMch3β（配列番号３および４）のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。Mch3αのヌクレオチド配列と異なるMch3βのヌクレオチド配列を、Mch3αのヌクレオチド配列の下に示す。Mch3αの推定アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列の上に示される。Mc h3αの推定アミノ酸配列と異なるMch3βのヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列の下に示す。点線は、Mch3αおよびMch3βにおいてスプライシングされた配列を示す。下線のMch3αヌクレオチド配列は、Mch3βにおいて欠失され、そして下に示されるイントロン配列によって置換されている。Mch3αの５ペプチド推定活性部位を四角で囲む。推定p20、p17、およびp12切断部位を水平の矢印で示す。垂直の矢印はイントロンの位置を示す。アミノ酸およびヌクレオチド残基は、各々の配列の右に番号が付けられている。図２は、以下の組換えバキュロウイルスで感染されたSf9細胞を示す：カラム１、AcNPV-Mch3α-p17；カラム２、AcNPV-Mch3α-p12；カラム３、AcNPV-Mch3α -p17およびAcNPV-Mch3α-p12；カラム４、AcNPV-CPP32-p17；カラム５、AcNPV-C PP32-p12；カラム６、AcNPV-CPP32-p17およびAcNPV-CPP32-p12；カラム７、AcNP V-MCH3α-p17およびAcNPV-CPP32-p17；カラム８、AcNPV-Mch3α-p12およびAcNPV -CPP32-p12；カラム９、AcNPV-Mch3α-p17およびAcNPV-CPP32-p12；カラム10、A cNPV-CPP32-p17およびAcNPV-Mch3α-p12。感染42時間後、細胞を顕微鏡で検査し、そしていくつかの視野を数えた（平均1500細胞／状態）、そしてアポトーシス細胞の数を、計数した総数細胞のパーセンテージとして示した。図３は、CPP32によるProMch3αの切断を示す。 (A)T7プロモーターのもとでGST-Mch3α2またはGST-CPP32インサートを含むpbl uescriptベクターを、矢印で示される適切な制限酵素で線状化し、そして次に³⁵ Ｓメチオニンの存在下でインビトロ転写および翻訳のテンプレートとして使用した。 (B)レーン１および２、GST-Mch3a2DNAテンプレートを、転写／翻訳の前にEcoR Iで線状化し、そして翻訳の産物を緩衝液（レーン１）またはCPP32（レーン２）と30分間、30℃でインキュベートした。少量の完全長GST-Mch3a2が、64kDaの翻訳産物（レーン１）として、またはDNAテンプレートのEcoRIでの不完全な消化による35kDaの切断産物として見られ得る。レーン３〜６、転写／翻訳の前にGST-M ch3a2 DNAテンプレートをXhoIで線状化し、そして翻訳の産物を緩衝液（レーン３）と氷上で30分間、または緩衝液（レーン４）、CPP32（レーン５）またはMch 3a（レーン６）と30℃でインキュベートした。 (C)GST-CPP32 DNAテンプレートを、転写／翻訳の前にEcoRIで線状化し、そして翻訳の産物を緩衝液（レーン１）、Mch3a（レーン２）またはCPP32（レーン３）と30分間、30℃でインキュベートした。 (D)GST-Mch3aを、GST-セファロース樹脂上に固定し、そして樹脂-GST-Mch3a2 を１時間緩衝液（レーン１）と氷上で、またはCPP32（レーン２）と30℃でインキュベートした。ＢおよびＣにおけるタンパク質産物を、14％SDSゲルによって、Ｄを10〜20％勾配SDSゲルによって分析した。ＢおよびＣの右の矢印は、切断産物を示す。発明の詳細な説明本発明は、Mch3と名付けた新規のアポトーシス性システインプロテアーゼに関する。このプロテアーゼは、例えば、ICE、ICH-1_L、ICH-1_S、CPP32、Mch2、ICH- 2、およびICE_rel ^-IIIを含むシステインプロテアーゼのICEファミリーのメンバーである。他のICE関連プロテアーゼに類似して、Mch3は、より大きなプロ酵素として合成され、そして約17kD（p17）および12kD（p12）の２つのサブユニットへのタンパク質分解後活性になる。２つのサブユニットは、互いに会合して活性複合体となるヘテロダイマーを形成する。Mch3は、システインプロテアーゼのICE ファミリーの外側に、既知の機能的に有意な配列同一性を含まない。これらの他のシステインプロテアーゼに類似して、基質特異性は、P1'位の小さな、好ましくは疎水性の残基と共に基質結合部位のP1位にAsp残基を唯一必要とする。Mch3 プロテアーゼの過剰発現は、アポトーシスの誘導を生じる。１つの実施態様において、本発明は、アポトーシス性システインプロテアーゼ Mch3をコードする核酸に関する。その核酸を使用して、組換えMch3プロテアーゼを産生し、その活性は、酵素的に測定され得る。組換えMch3ポリペプチドを使用して、Mch3阻害化合物をスクリーニングする。このような薬学的化合物は、アポトーシス性細胞死によって特徴付けられる疾患の処置または予防に有用である。あるいは、Mch3ポリペプチドを使用して、プロ酵素のその活性サブユニットへの分解を誘導することによるように、Mch3を活性化するかまたはそのアゴニストとして作用する薬学的化合物をスクリーニングし得る。このような化合物は、アポトーシス性細胞死の損失によって特徴付けられる疾患の処置または予防に有用である。本明細書中で使用される用語「実質的に」は、Mch3ヌクレオチドまたはアミノ酸配列をいう場合、約15〜30またはそれ以上のヌクレオチド長の間の２つの配列が、当業者によって機能的に等価であるとみなされるように同一であるかまたは類似である程度をいうことを意図する。例えば、本発明のMch3核酸は、図１ならびに配列番号１および３に示される配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する。従って、第２の配列が図１（配列番号１および３）に示される配列と実質的に同一である場合、それは当業者によって機能的に等価であるとみなされる。配列比較および類似性の決定のための方法は、当該技術の範囲内で周知であり、そして日常的である。機能的に等価な核酸配列は、例えば、関連するが異なり、かつ遺伝コードの同義性のために同一のMch3ポリペプチドをコードする配列、ならびに関連するが異なり、かつ類似の機能的活性を示す異なるMch3ポリペプチドをコードする配列を含む。両方の場合において、核酸は機能的に等価な遺伝子産物をコードする。Mc h3をコードする核酸の機能的フラグメント（例えば、オリゴヌクレオチド、ポリオリゴヌクレオチド、プライマーなど）もまた、用語の定義および請求された発明の範囲内であるとみなされる。機能的等価性はまた、例えば、遺伝子産物をコードしないが、そのかわりとしてそれら自身の中のおよびそれら自身の機能的工レメントであるMch3核酸に関連する。このような機能的核酸の特定の例は、例えば、プロモーター、エンハンサー、および他の遺伝子発現調節エレメントを含む。本発明のMch3ポリペプチドは、図１ならびに配列番号２および４に示された配列に実質的に類似のアミノ酸配列を有する。同様に、機能的に等価なMch3アミノ酸配列は、例えば、異なるペプチドがMch3の少なくとも１つの機能的活性を示す限り、関連するが異なる配列を含む。このような関連するが異なるポリペプチドは、例えば、保存されかつ必須でないアミノ酸の置換物を含む。同様に、Mch3のフラグメントおよび機能的ドメインは、用語および請求された発明の定義の範囲内に含まれる。従って、限定された改変がMch3ポリペプチドの生物学的機能を破壊することなく行われ得、そしてその全体の一次構造の一部のみが活性をもたらすために必要とされ得ることが理解される。例えば、Mch3アミノ酸の活性を破壊しないMch3アミノ酸配列（配列番号２および４）の軽度の改変はまた、Mch3の定義の範囲内およびそれ自体請求されたポリペプチドの定義の範囲内である。また、例えば、測定可能な酵素活性を保持する遺伝子操作されたMch3フラグメントの単独または異種タンパク質と融合した遺伝子操作されたフラグメント（例えば、融合タンパク質）は、例えば、それ自体請求されたポリペプチドの定義の範囲内である。一次アミノ酸配列の軽度の改変が、図１（配列番号２および４）に示された配列と比較して実質的に等価の機能または増大された機能を有するポリペプチドを生じ得ることが理解される。これらの改変は、部位特異的変異誘発を介する場合意図的であり得、またはMch3プロデューサーである宿主における変異を介する場合偶発的であり得る。Mch3の生物学的機能が保持されている場合に限り、これらの全ての改変が含まれる。さらに、種々の分子（例えば、他のタンパク質、炭水化物、脂質、または化学部分）が、Mch3に付着され得る。このような改変は、Mch3ポリペプチドの定義の範囲内に含まれる。本発明は、Mch3をコードする遺伝子またはそのフラグメントを提供する。本発明はまた、Mch3をコードする単離された核酸配列、またはそのフラグメントを提供する。遺伝子および核酸配列は、配列番号１および３に示す配列を実質的にコードする。配列番号１および３に示す配列を実質的に有する１本鎖または２本鎖の核酸を含む遺伝子または核酸配列のフラグメントが提供される。本発明のMch3核酸が、種々のストリンジェンシー下で発現配列タグ(EST)のヒトデータベースを検索する新規なアプローチによって同定されそして単離されて、システインプロテアーゼのICEファミリーに対して相同性を有し得る潜在的に新しい配列フラグメントを同定した。アポトーシス性プロテアーゼのICEファミリーに対して潜在的に相同性を有するとして同定された新規な配列を用いて、PC R増幅を試みるためのプライマーを設計し得る。第２のプライマーは、公知のICE プロテアーゼファミリーメンバーをコードする核酸配列中の相同領域を含むように設計される。この特定の場合において、プライマーは、多くのICE/Ced-3ファミリーのプロテアーゼにおいて保存されているGSWFI/GSWYIペンタペプチド配列に指向された。プライマーの設計には、EST配列プライマーおよび既知のプライマーの両方の予測される鎖の形成を考慮に入れるべきである。従って、相同性検索およびハイブリダイゼーション条件が首尾よく決定された場合にのみ、このようなアプローチが推定の新規プロテアーゼcDNAのフラグメントのPCR増幅を可能にする。遺伝子データベースの検索は任意の疑いのあるヌクレオチド配列に対して相同配列マッチを生じるので、さらなる規準が、非特異的相同性マッチのうちから真のICEファミリーホモログを同定するために使用されなければならない。I CEファミリーメンバーは、活性部位および触媒的に重要なアミノ酸残基において最も高い程度の相同性を共有する。検索によって得られる所定のESTは、これらの相同性の高い部位を含まないかもしれないが、むしろ、隠れた相同性を有するプロテアーゼ内の領域のみを含み得る。ESTを新規なICEプロテアーゼとして確認することは、３つの異なるリーディングフレームにおける全ての陽性ESTヒットの翻訳、およびその後の保存的な活性部位または触媒的に重要なアミノ酸配列モチーフの同定を包含する。次いで、従来のcDNAクローニングを用いて、推定の新規プロテアーゼの完全長cDNAを得、そして１）ICEファミリーメンバーに対する全ての構造的相同性を分析し、２）組換え的に発現させ、そしてシステインプロテアーゼ活性について分析し、そして３）適切な細胞におけるcDNAの異種発現によって、プログラム細胞死の誘導を分析し得る。 Mch3コード核酸を単離するための上記以外の別の方法が、同様に用いられ得る。例えば、本明細書中に記載される教示を用いて、当業者は、当該分野で周知の方法を用いて、Mch3核酸を慣例的に単離しそして操作し得る。Mch3コード核酸( 図１ならびに配列番号１および３)またはMch3アミノ酸配列(図１ならびに配列番号２および４)の配列さえあればよい。このような方法は、例えば、ハイブリダイゼーションプローブとして合成オリゴヌクレオチド、核酸フラグメント、またはプライマーを使用することによって、cDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングする工程を包含する。あるいは、Mch3アミノ酸配列またはそのフラグメントに対する抗体を生成し、そして発現ライブラリーをスクリーニングするために使用して、Mch3コード核酸を単離し得る。Mch3ポリペプチドに対する他の結合試薬が同様に、実質的に図１に示すアミノ酸配列を有するMch3ポリペプチドを単離するために使用され得る。同様に、システインプロテアーゼの切断不可能なペプチドアナログのような基質試薬を、Mch3ポリペプチドをスクリーニングしそして単離するために使用し得る。さらに、当業者により現在使用されている組換えDNA法は、本明細書中に記載されるMch3ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列と組み合わせて、Mch3コード配列の再産生を容易にさせる、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を包含する。所望の配列は、PCRによって、たった１つの遺伝子コピーから指数関数的に増幅され得る。PCR技術は、米国特許第4,683,195号、同第4,800,159号、同第4,754,065号、および同第4,683,202号の主題であり、その全ては本明細書中で参考として援用される。上記の方法は、当業者に公知であり、そして例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(19 92)、およびその中で援用される種々の参考文献、ならびにAnsubelら、Current Protocols in Molecular Biology ，John WileyおよびSons，Baltimore，MD(198 9)；およびHarlowら、Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Nuw York(1989)に記載されている。それらの中で援用されるこれらの参考文献および刊行物は、明らかに参考として本明細書中で援用される。本発明は、図１(配列番号２および４)に示すアミノ酸配列を実質的に含む単離されたMch3ポリペプチドを提供する。Mch3機能的フラグメントもまた提供される。Mch3機能的フラグメントの特定の例は、活性部位アミノ酸配列QACRGを含む触媒ドメインである。本発明の単離されたMch3ポリペプチドは、当該分野で公知の種々の方法によって得られ得る。例えば、単離されたペプチドは、例えばアフィニティークロマトグラフィーを含む生化学的方法によって精製され得る。Mch3単離に使用され得るアフィニティーマトリクスは、図１(配列番号２および４)に示す配列に対して調製された抗Mch3モノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得るか、または合成ペプチドのようなそのフラグメントであり得る。あるいは、Mch3の基質アナログまたは酵素インヒビターは、実質的に純粋な本発明のMch3ポリペプチドを単離するためのアフィニティーマトリクスとして同様に使用され得る。 Mch3ポリペプチドはまた、当業者に公知の組換え方法によって産生され得る。組換えMch3ポリペプチドは、例えば、図１(配列番号２および４)に示すものと実質的に同じアミノ酸配列ならびにその融合タンパク質およびそのフラグメントを含む。Mch3コード核酸は、増殖、操作、および発現に適したベクター中にクローニングされ得る。このようなベクターは、当業者に公知であるか、または当業者によって構築され得、そして転写、翻訳、調節、および所望であればMch3ポリペプチドの選別に必要な全ての発現エレメントを含むべきである。ベクターはまた、発現および調節エレメントが適合性の起源である限りは、原核生物または真核生物の宿主系のいずれかにおいて使用され得る。当業者には、どの宿主系が特定のベクターと適合性であるかが公知である。産生された組換えポリペプチドは、上記の方法によって単離され得る。アポトーシスは、プログラム細胞死が阻害される(これは細胞生存を増大させる)か、または増強される(これは細胞の生存能を失わせる)ことにおける多くの病理学的状態において重要な役割を果たしている。増大した細胞生存からもたらされる病理学的状態の例として、リンパ腫、ガン腫、およびホルモン依存性腫瘍のようなガンが挙げられる。このようなホルモン依存性腫瘍として、例えば、乳ガン、前立腺ガン、および卵巣ガンが挙げられる。自己免疫疾患(例えば、全身性エリテマトーデス、および、免疫媒介性糸球体腎炎)、ならびにウイルス感染( 例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびアデノウイルス)はまた、増大した細胞生存またはアポトーシスの阻害によって生じる。対照的に、プログラム細胞死の増加が流行の原因であるアポトーシス疾患には、一般的に、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性症、および小脳変性のような変性性障害が含まれる。アポトーシスの増強と関連した他の疾患は、例えば、再生不良性貧血のような脊髄形成異常症候群、ならびに心筋梗塞、脳卒中および再灌流障害を含む虚血性障害を含む。本発明の核酸およびポリペプチドをコードするMch3は、上記に記載のような細胞死媒介疾患、およびプログラム細胞死の増加または減少のいずれかによって媒介される他の疾患の重篤度を診断、処置、または低減するために使用され得る。さらに、本発明の核酸およびポリペプチドをコードするMch3は、Mch3媒介アポトーシスを阻害または促進する薬学的組成物および巨大分子をスクリーニングするために使用され得る。例えば、核酸、ポリペプチドおよびそれらの機能的フラグメントをコードする Mch3は、プログラム細胞死によって媒介または特徴付けられる疾患を診断するため、もしくは診断するための試薬を生成するために使用され得る。診断は、Mch3 結合試薬での検出を媒介するヌクレオチド配列、抗体またはリガンドを含むMch3 とハイブリダイズする核酸プローブによって、もしくは検出可能なMch3基質の酵素触媒によってなされ得る。そのような方法は、当業者にとって日常的である。検出は、例えば、細胞または組織試料を、細胞死媒介疾患を示すまたは示すと思われる個体から取り除くことによって、エクスビボで行われ得る。Mch3発現または活性の増加は、プログラム細胞死の増加によって特徴付けられる疾患と相互関係を示し、一方Mch3発現または活性の減少は、プログラム細胞死の阻害によって特徴付けられる疾患と相互関係を示す。上記Mch3ポリペプチドはまた、細胞生存および細胞増殖の増加によって特徴付けられる細胞死媒介疾患の処置のために、当業者に公知の薬学的組成物へ処方され得る。Mch3の触媒ドメインのような機能的フラグメントおよびペプチドは、同様に、細胞生存および細胞増殖の増加に関連するような疾患の処置のために、処方され得る。Mch3ポリペプチドおよびそれらの機能的フラグメントの投与により、処理された細胞でのアポトーシスを誘導し、そして細胞生存または細胞増殖の増加によって特徴付けられるそれらの細胞を排除する。Mch3基質に直接作用しないがMch3プロテアーゼの活性化を誘導する非Mch3ポリペプチドの投与は、同様に細胞生存および細胞増殖の増加によって特徴付けられる疾患の処置のために使用され得る。効果的であるためには、Mch3ポリペプチドは、細胞生存の増加によって特徴付けられる細胞へ導入されなければならない。導入は、当該分野で公知の種々の方法（例えば、脂質小胞およびレセプター媒介のエンドサイトーシスを含む）によって成し遂げられ得る。適切な細胞型への標的化は、特異的レセプターリガンド、特異的標的細胞抗体などとの結合により、同様に達成され得る。 Mch3ポリペプチドは、細胞生存または細胞増殖の増加によって特徴付けられる細胞中で、アポトーシスを誘導するのに十分な投薬で、従来の方法によって投与される。そのような投薬は、当業者に公知であるかまたは当業者によって容易に決定され得る。投与は、例えば、静脈内注入、腹膜間注入または皮下注入によって成し遂げられ得る。投与は、単回の高用量投与または複数回の少用量の投与もしくは両方の組み合わせを含む、種々の異なる形態で行われ得る。用量は、細胞型、病気の進行および個体の全体的な健康に依存し、そして当業者に公知であるかまたは当業者によって決定され得る。細胞生存または細胞増殖の増加によって特徴付けられる病理学的状態の処置に対するMch3媒介アポトーシスの誘導とは対照的に、Mch3インヒビターは、プログラム細胞死の増加によって特徴付けられる疾患の処置に使用され得る。そのようなインヒビターとは、例えば、抗Mch3抗体、タンパク質、または所望の細胞型への導入を可能にする培地に処方される小さなペプチジルプロテアーゼインヒビターであり得る。あるいは、そのようなインヒビターは、細胞媒介エンドサイトシスおよび他のレセプター媒介事象によって導入するための標的化リガンドへ結合し得る。Mch3ペプチジルインヒビターの特定の例は、実施例IIの表１に記載され、そして自殺インヒビターおよび基質アナログ（例えば、テトラペプチドDEVDアルデヒド、YVADアルデヒドおよび牛痘ウイルスタンパク質Crm A）を含む。Mch3 の他のインヒビターは、例えば、競合型または非競合型メカニズムによって、Mc h3に結合しそれを不活性化する小さな分子および有機化合物を含む。Mch3経路を非直接的に阻害する分子または化合物もまた、Mch3のインヒビターとして使用し得る。Mch3インヒビターは、特異的または有利なMch3阻害活性を示す分子に対するスクリーニングによって同定され得る。そのような方法は、以下にさらに記載され、そして本明細書中に記載のMch3ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を与えられた当業者によって行われ得る。 Mch3のドミナント／ネガティブインヒビターはまた、プログラム細胞死の増加によって特徴付けられる重症な疾患を処置または低減するために使用され得る。この点について、活性部位QACRG（配列番号４）が欠如したMch3βポリペプチドは、Mch3のp12サブユニットに結合し、そして活性４量体複合体を形成することを妨ぐために使用され得る。Mch3αのMch3βドミナント阻害のメカニズムは、Ic h-1₅によるIch-1_Lのドミナントネガティブ阻害と同様であることを示す。他のIC E関連システインプロテアーゼ由来のサブユニットは、Mch3活性のドミナント／ネガティブインヒビターとして同様に使用され得、そしてそれゆえプログラム細胞死によって媒介される疾患を治療し得る。そのようなサブユニットは、p17またはp12 Mch3ポリペプチドのいずれかに結合し、そして活性４量体プロテアーゼ複合体へのそれらのアセンブリを防ぐように選択されるべきである。さらに、触媒的に不活性化するために改変されたMch3サブユニットはまた、Mch3のドミナントネガティブインヒビターとして使用され得る。そのような改変は、例えば、アラニンまたはグリシンを含むがこれらに限定されない活性部位システイン残基の変異を含む。 Mch3基質アンタゴニストは、増大したプログラム細胞死によって媒介される疾患の重篤度を処置または低減するために同様に用いられ得る。このような基質アンタゴニストはMch3に結合し、そしてMch3による切断を阻害し得る。基質切断の阻害は、プログラム細胞死の確実な進行を防止する。基質アンタゴニストには、例えば、リガンドおよび小分子化合物が含まれる。疾患によって媒介される細胞死の重篤度の処置または低減はまた、Mch3ポリペプチドまたはその機能的フラグメントをコードする発現可能な核酸を、このような疾患によって特徴付けられる細胞に導入することによって達成され得る。例えば、Mch3の合成速度を上昇させることは、例えば、組換え発現ベクターおよび遺伝子移入技術を用いて達成され得る。このような方法は、当該分野で周知であり、そして組換えウイルスベクターに関連して以下に記載される。適切な標的細胞と適合性である他のベクターは同一の目的を達成し得、そしてそれゆえ本明細書中で記載される方法において、組換えウイルスベクターの代わりに置換され得る。組換えウイルスベクターは、所望の核酸のインビボ発現に有用である。なぜなら、これらは、側方感染（lateral infection）および標的特異性のような利点を提供するからである。側方感染は、例えば、レトロウイルス生活環において固有のものであり、そしてこれによって１つの感染細胞が、分裂しそして近隣の細胞を感染させる多くの後代ビリオンを産生するプロセスである。その結果、そのほとんどが元のウイルス粒子によってはじめは感染されていなかった大きな領域が、迅速に感染される。これは、感染性因子が、娘後代を介してのみ拡がる縦型の感染とは対照的である。側方に拡がり得ないウイルスベクターもまた産生され得る。この特徴は、所望の目的が、特定された遺伝子を制限された数の標的細胞中のみに導入することである場合に有用であり得る。代表的には、ウイルスは、特定の細胞型において感染しそして伝播する。それゆえ、ウイルスベクターの標的特異性はこの生来の特異性を利用して、所望の遺伝子を所定の細胞型に順に特異的に導入する。本発明の方法において用いられるべきベクターは、標的とされるべき所望の細胞型に依存する。例えば、神経変性性疾患が、患部の神経細胞のMch3活性を減少させることによって処置されるべきである場合には、神経細胞系統の細胞に特異的なベクターが用いられるべきである。同様に、造血系の疾患または病理学的な状態が処置されるべきである場合には、血球およびそれらの前駆体、好ましくは造血細胞の特定の型に特異的なウイルスベクターが用いられるべきである。さらに、このようなベクターは、特定のレセプターまたはリガンドなどを用いてさらに改変され、レセプター媒介性事象を介して標的特異性を改変または変更し得る。これらの改変手順は、例えば、組換えDNA技術または合成化学手順によって行われ得る。特定のタイプのベクターは、意図される適用に依存する。実際のベクターはまた、公知であり、そして当該分野で容易に入手可能であるか、または周知の方法論を用いて当業者によって構築され得る。 Mch3核酸をコードするウイルスベクターまたはMch3のインヒビターは、このような配列の発現を得るためにいくつかの様式で投与され得、そしてそれゆえ疾患または病理学的状態によって影響された細胞において、Mch3の活性を増加するかまたは減少する。例えば、ウイルスベクターが用いられる場合、手順は、それらの標的特異性を利用し、そしてその結果、疾患の部位に局所的に投与される必要がない。しかし、局所投与は、より迅速かつ効果的な処置を提供し得る。投与はまた、例えば、被験体への静脈内注入または皮下注入によっても行われ得る。ウイルスベクターの脊髄液への注入はまた、１つの投与の形態として、特に神経変性性疾患の場合に用いられ得る。注入の後、ウイルスベクターは、それらが感染に対する適切な標的特異性を有する宿主細胞を認識するまで循環する。上記のように、Mch3をコードするベクターの１つの投与形態は、疾患または病理学的状態の部位での局所的な直接接種によることであり得る。局所投与は、利点を有する。なぜなら、希釈の影響が全くなく、それゆえ、より少ない用量が、大部分の標的細胞においてMch3発現を達成するために必要とされる。さらに、局所接種は、他の投与形態で要求される標的要件を軽減する。なぜなら、接種領域における全ての細胞を感染させるベクターが用いられ得るからである。接種領域内の特定のサブセットの細胞においてのみ発現が所望される場合、所望のサブセットに特異的なプロモーターおよび発現エレメントが、この目的を達成するために用いられ得る。このような非標的ベクターは、例えば、ウイルスベクター、ウイルスゲノム、プラスミド、ファージミドなどであり得る。リポソームのようなトランスフェクションビヒクルは、上記の非ウイルスベクターを、接種領域内のレシピエント細胞に導入するために用いられ得る。このようなトランスフェクションビヒクルは、当業者に公知である。しかし、あるいは、非標的ベクターは、任意の個体の組織中に直接投与され得る。このような方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、Wolffら(Science 247:1465-1468(1990))によって記載されている。さらなる特徴が、安全性を保証するため、および/または治療効果を増強するためにベクターに加えられ得る。このような特徴には、例えば、組換えウイルスによって感染された細胞に対してネガティブに選択するために用いられ得るマーカーが含まれる。このようなネガティブ選択マーカーの例として、抗生物質ガンシクロビルに対して感受性を与える上記のTK遺伝子が挙げられる。ネガティブ選択は、それゆえ、それによって感染を制御し得る手段である。なぜなら、それは、抗生物質を添加することによる誘導性の自殺を提供するからである。このような保護は、例えば、Mch3の変異形態を産生する変異が生じる場合に、アポトーシスの機能障害が起こらないことを保証する。上記に記載されたように、Mch3プロテアーゼ活性の発現を阻害するまたは増強する化合物についてスクリーニングするために、本発明のMch3コード核酸配列およびMch3ポリペプチドが使用され得る。そのようなスクリーニング方法は、当業者に公知であり、そしてインビトロ手順またはインビボ手順のいずれかによって実施され得る。例えば、Mch3活性についての特異的なインビトロアッセイを実施例IIに記載する。このアッセイは、E.coliにおいて組換えで、活性なプロセシングされた形態で発現されたMch3ポリペプチドを用い、そのプロテアーゼ活性は蛍光基質（DEVD-AMC）とのインキュベーションによって測定される。そこには、Mc h3のペプチドおよびポリペプチドインヒビターもまた記載される。このアッセイは、Mch3活性を阻害するかまたは増強するかのいずれかの薬剤について、巨大分子を含む合成または天然の化合物ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。アッセイにおいて使用されるべきMch3ポリペプチドは、例えば、インビトロ翻訳、組換え発現または生化学的手順によって得られ得る。実施例IIに記載される方法以外の方法もまた、Mch3を阻害する化合物をスクリーニングおよび同定するために使用され得る。具体的な例は、10⁸より多いペプチド配列が一回のパンニングにおいてスクリーニングされ得るファージディスプレイペプチドライブラリーである。そのような方法ならびに他の方法は、当該分野において公知であり、そしてMch3活性を阻害するまたは増強する化合物の同定のために利用され得る。本発明の種々の実施態様の活性に実質的に影響しない改変もまた本明細書中に提供される本発明の定義内に含まれることが理解される。従って、以下の実施例は本発明を例証することが意図されるが、本発明を限定することは意図されない。実施例Ｉ Mch3 のクローニングおよび特徴付け本実施例は、Mch3のクローニング、配列分析、および組織分布を示す。本明細書中に記載される結果は、Mch3がシステインプロテアーゼのICEファミリーの新規のメンバーであることを示す。システインプロテアーゼのICEファミリーの潜在的に新規のメンバーを同定するために、ヒト発現配列タグ（EST）のGenbankデータベースからの情報およびPC Rを組み合わせたアプローチを用いた。最初に、JurkatＴリンパ球由来のCed-3/I CE様アポトーシス性システインプロテアーゼを、保存されたGSWFI/GSWYIペンタペプチドをコードする縮重PCRプライマーを使用するヒトJurkat cDNAライブラリーの増幅によって富化した（Fernandes-Alnermiら、Cancer Res. 55:2737-2742( 1995)）。このアミノ配列は、ICEファミリーメンバーの間で保存されいることが見出されている。手短に言えば、約10⁸pfuを含むヒトJurkatλUni-Zap^TM XR cDN Aライブラリーの10μlのアリコートを99℃で５分間変性し、そしてペンタペプチドGSWFI/GSWYIをコードする縮重プライマーおよびT3ベクター特異的プライマー（Stratagene）を用いるPCR増幅のための基質として使用した。次いで、富化ライブラリーを、非翻訳ヌクレオチドを除くCPP32 cDNA配列（例えば、CPP32コード配列）に対応する照会ヌクレオチド配列を使用するGenbankデータベースの相同性検索において同定されたEST配列（T50828）由来のプライマーを用いて増幅した。この二次増幅を、Genbank配列T50828由来のプライマー（プライマーT50-pr1:CCGTGGAATAGGCGAAGAG、配列番号５）および第２のベクター特異的プライマー（SK-Zap:CAGGAATTCGGCACGAG、配列番号６）と組み合わせた上記の増幅配列の10μlのアリコートで開始して実施した。二次増幅産物をSmaI切断pBluescript II KS⁺ベクターにクローン化した。全てのクローンを、保存された活性部位アミノ酸配列QACRGに対応する縮重オリゴヌクレオチドおよびSK-Za pプライマーを使用するPCRによってスクリーニングした。次いで、QACRGコード配列の存在について陽性であったクローンを、T3およびT7配列決定プライマー（ Stratagene）を使用するDNA配列決定に供した。この増幅およびスクリーニングによって、CPP32およびCed-3に高い相同性を有するCed-3/ICE様部分cDNAを得た。次いで、この部分cDNAをベクターから切り出し、放射能標識し、そして元のJu rkatλUni-Zap^TMXR cDNAライブラリーをスクリーニングするために使用した。陽性λクローンを精製し、pBluescript II SK^-中でレスキューし、そして配列決定した。 JurkatλUni-Zap^TMXR cDNAライブラリーの第２のスクリーニングによって、いくつかのcDNAクローンの単離がもたらされた。Mch3と名付けた１つのcDNAは、約 34kDの予想される分子量を有する303アミノ酸のタンパク質をコードする909bpのオープンリーディグフレームを含む（図１ならびに配列番号１および２）。ヌクレオチド44の開始メチオニンは、コンセンサスKozak翻訳開始配列に従う（20）。Mch3βと名付けた第２のクローン（配列番号３）もまた、同定され、そしてMc h3α配列（図１）（配列番号１）のヌクレオチド488〜592（アミノ酸149〜183）に対応し、欠失および挿入を含むことが見出された。Mch3βはまた、長い5'非翻訳配列を有する。 Mch3βにおける欠失／挿入に対応するMch3ゲノム領域のエキソン／イントロン分析は、Mch3β mRNAが２つの同時のオルタナティブスプライシング事象に起因したことを明らかにした。第１の事象は、5'エキソンのコード領域内に位置するオルタナティブスプライスドナーおよび3'イントロン内に位置するオルタナティブスプライスアクセプターの使用に起因するMch3α配列（配列番号１）のヌクレオチド488〜592の欠失を引き起こした。第２のスプライシング事象は、イントロン内に位置するオルタナティブスプライスドナーおよび3'エキソンの正常なスプライスアクセプターの使用に起因する74bpのイントロン性配列の挿入を引き起こした。これらの事象において使用された全てのオルタナティブスプライスドナー／アクセプター部位は、GT/AG規則に従う。欠失および挿入の結果として、Mch3 β cDNAは、アミノ酸148以降ではMch3αとは同じリーディグフレームを維持しなかった。Mch3βにおける新たなリーディグフレームは、QACRGペンタペプチド配列をコードせず、そしてそれはMch3βのbp 837〜839に対応するTGA停止コドンで終結する（図１；配列番号１）。Mch3βは、約28kDの予想される分子量を有する 253アミノ酸のタンパク質をコードする（配列番号４）。インビトロで翻訳されたMch3αおよびMch3βは、36kDaおよび33kDaのタンパク質産物として移動する。Mch3αおよびMch3βの翻訳反応で見られるより小さな翻訳産物は、恐らく、内部で翻訳された産物である。Mch3βの計算された分子量は，約28kDaであるが、33kDaとしてのその移動は、リン酸化のような翻訳後修飾を示す。この結果は、Mch3αとは異なるMch3β配列における多数のセリン残基、および鋭い明瞭なバンドというよりむしろぼやけたバンドとしてのSDSゲルにおけるその移動から明らかである。Mch3αの機能および活性は、以下にさらに議論される。しかし、オルタナティブスプライシングされたIch-1アイソフォーム(Ich- 1s)、(Wangら、Cell 78: 739-750(1994))と類似して、Mch3βは、アポトーシスのネガティブレギュレーターであると考えられ、そしてドミナントインヒビターとして作用することにより、親酵素の活性を阻害し得る。推定された完全長Mch3αタンパク質配列の配列比較から、ヒトCPP32およびMch 2αならびにC.elegans CED-3タンパク質に対する最も高い相同性が示される(Fer nandes-Alnemriら、J.Biol.Chem. 269: 30761-30764(1994))。全体的に、Mch3α タンパク質は、CPP32と約53％の同一性（67％の類似性）、Mch2αと約35％の同一性（56％の類似性）、およびCED-3と約33％の同一性（55％の類似性）を共有する。Mch3αは、他のファミリーのメンバー（例えば、ICE、NEDD/ICH-1、Tx(IC H-2、ICE_rel-II)、またはICE_relIII）と30％未満の同一性を示す。活性部位QACR Gペンタペプチドの保存に加えて、Mch3αの推定構造は、CPP32に類似すると思われる。CPP32は、Asp28およびAsp175で切断されて、17kDa(p17)および12kDa(p12) の分子量の２つのポリペプチドを生じ、これらは活性なCPP32酵素複合体を形成する。Mch3αとCPP32との間の高い相同性に基づいて、Mch3αにおける切断部位は、Asp53およびAsp198（図１）であると思われる。これらの部位での切断により、CPP32のp17およびp12サブユニットに等価な２つのポリペプチドが生じる。しかし、Mch3αの活性酵素へのプロセシング間に短いポリペプチドを取り除くために使用され得る３つの潜在的なアスパラギン酸切断部位が、15位、20位、および23位に存在する。実際に、テトラペプチドDSVD（Mch3αのアミノ酸20〜23）は、CPP32のDEVDテトラペプチド基質と非常に類似している。この結果は、Mch3α はCPP32の基質であることを示している。さらに、２つのサブユニット間に位置する３つのAsp切断部位（Asp193、Asp204、およびAsp206）は、２つのサブユニットを分離するための潜在的なプロセシング部位として作用し得る。 Mch3がアポトーシス活性を示すかどうかを決定するために、本発明者らは、この遺伝子産物が、Sf9バキュロウイルス細胞において初期アポトーシスを誘導するか否かを調べた。簡単には、Sf9細胞を、完全長Mch3α、完全長CPP32、または短縮されたMch3αもしくはCPP32改変体を別々にまたは種々の組合せでコードする組換えバキュロウイルスで感染させた。次いで、細胞を、細胞質膜の気泡形成 (blebbing)、核クロマチンの凝縮、および小アポトーシス体の放出のようなアポトーシスの形態学的徴候について顕微鏡的に調べた。ゲノムDNAに加えて、内部ヌクレオソームDNA切断について調べた。移入ベクターおよび組換えバキュロウイルスの構築のために、Mch3 cDNAを、プライマーT50-pr3 GCCATAAACTCTTCCTCACTT（配列番号７）およびT50-pr4 ATGGC AGATGATCAGGGC（配列番号８）を用いてPCRにより増幅し、そしてpBluscript II SK^-ベクターにサブクローン化した。次いで、Mch3配列を、BamHIで切り出し、そしてBamHI切断pVL1393(Invitrogen，San Diego，California)にサブクローン化して、pVL-Mch3α移入ベクターを作製した。Mch3のp20およびp12サブユニットをコードするcDNAを、以下のプライマー（p20サブユニット；T50-pr4（配列番号８）およびMch3-p20-TAG-CTAGTCGGCCTGGATGCCATC（配列番号９）、ならびにp12サブユニット；Mch-p12-ATGATGTCGGGGCCCATCAATGAC（配列番号１０）、およびT50- pr9-GACCCATTGCTTCTCAGC（配列番号１１））を用いてPCRにより増幅した。次いで、PCR産物を、SmaI切断pVL1393にクローン化して、pVL-Mch3-p20およびpVL-Mc h3-p12移入ベクターを作製した。次いで、組換え移入ベクターを使用して、以前に記載されたように（Summersら、「Manual of Methods for Baculovirus Vecto rs and Insert Culture Procedures」、Texas Experimental Station Bulletin No.1555 (Texas A & M University，College Station，Texas（1987）；および Alnemriら、J.Biol.Chem ．266: 3925-3936(1991))、組換えバキュロウイルスを作製した。 Sf9細胞におけるMch3αおよびCPP32によるアポトーシスの誘導について、内部ヌクレオソームDNA切断を、特徴的なマーカーとして評価した。簡単には、全細胞DNAを、以前に記載された（Summersら、およびAlnemriら、上述）、野生型バキュロウイルス、または組換えバキュロウイルスAcNPV-Mch3αもしくはAcNPV-IC Eで感染させたSf9細胞から、感染の42時間後に単離した。DNAサンプルを、臭化エチジウムを含む1.8％アガロースゲル内での電気泳動により分析した。 Sf9細胞における完全長Mch3αの発現により、感染の48時間後までに約50％の細胞がアポトーシスを受け、これはまた、内部ヌクレオソームDNA切断の誘導により明らかにされた。この結果は、ICE、CPP32、およびMch2αが同様の結果を生じるので、Mch3がアポトーシス性プロテアーゼであることと一致する。一方、p2 0サブユニットのみをコードする短縮されたMch3α（アミノ酸１〜198）、または p12サブユニットのみをコードする短縮されたMch3α（アミノ酸199〜303）は、別々に発現した場合、Sf9細胞においてアポトーシスを誘導し得なかった（図２、カラム１およびカラム２）。しかし、これらの２つのサブユニットが同時に発現した場合、約49％の細胞は、アポトーシスにより死んだ（カラム３）。同様に、CPP32の２つのプラスミドは、別々に発現した場合アポトーシス性ではなかったが（カラム４およびカラム５）、同時に発現した場合アポトーシス性であった（カラム６）。Mch3-p20サブユニットが、CPP32-p12サブユニットと同時発現した場合、またはその逆（すなわちCPP32-p20とMch3-p12）において、最も興味深い結果が得られた。これらの組合せは、50％を超える細胞においてアポトーシスを引き起こし得る（カラム９およびカラム１０）。Mch3-p20およびCPP32-p20を共に同時発現するコントロール細胞、またはMch3-p12およびCpp32-p12を共に同時発現する細胞においては、有意なアポトーシスの誘導は観察されなかった（カラム７およびカラム８）。これらのデータは、Mch3αおよびCPP32は、真核生物細胞においてインビボでヘテロダイマー化して、活性なアポトーシス性複合体を形成し得ることを示す。このようなダイマー化は、哺乳動物細胞におけるアポトーシス応答の複雑さをまさに増大させる。現在までの１つの興味深い観察は、全ての既知の哺乳動物Ced3/ICE様システインプロテアーゼが、単一の細胞株（すなわち、ヒトJurkat Ｔリンパ球）において発現することである。ICEファミリー（例えば、Mch3およびCPP32、またはICEおよびTx）の異なるメンバーのヘテロダイマー化する能力は、未だに特徴付けられていないが、機能がある程度重複しているかもしれないし、または特性(specification)がわずかに異なっているかもしれないことを示す。さらにMch3を特徴付けるために、異なるヒト組織から単離したポリA+ RNAのノーザンブロット分析により、組織分布を分析した。２μg／レーンのポリA+ RNA を含むClontechにより調製したノーザンブロット上で、分析を行った。[α³²P]U TPの存在下で、Sma Iで直線化したpBluescript II SK^--Mch3αをT7 RNAポリメラーゼのための基質として使用して、Mch3αの放射性リボプローブを調製した。ブロットをハイブリダイズし、洗浄し、次いでオートラジオグラフィーで可視化した。結果は、試験した全ての組織において、主要な2.4KbのMch3メッセージが検出可能であったことを示す。Mch3 mRNAの最も低い発現は、全脳において見られた。脳の異なった領域におけるMch3 mRNAの試験もまた、低いが検出可能である発現を示した。脳組織においてCPP32メッセージはMch3メッセージよりも大量であるが、同様の組織分布が、CPP32mRNAでも見られた。Mch3 mRNAのサイズはクローニングされたMch3αおよびβ cDNAの長さと一致した（図１；配列番号：１および３）。二つのより大量でないメッセージ（0.8および3.3Kb）もまた、小腸のようないくつかの組織で検出可能であった。より大きなメッセージは、不完全にプロセシングされたMch3 RNAまたはオルタナティブスプライシングされたMch3アイソフォームであり得る。より小さなメッセージは、分解産物またはオルタナティブスプライシングされたMch3アイソフォームであり得る。 Mch3αの酵素活性もまた、インビトロで特徴付けた。Mch2α、ICE、およびCPP 32について記載（例えば、Alnemriら、J.Biol.Chem. 270:4312-4317(1995)を参照のこと）のように、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として、E.coli内で、Mch3を発現した。二つのGST-Mch3α発現ベクターを構築し、そしてDH5α細菌に形質転換した。Mch3α1 cDNAを、細菌発現ベクターp GEX-2T（Pharmacia、Biotech、Inc.）のBam HI部位に、インフレームでサブクローニングした。第一の構築物（Mch3α1）は、GSTのC末端と融合したMch3αのアミノ酸１〜303をコードするPCRで産生したcDNAを含む。第二の構築物（Mch3α2 ）は、完全長Mch3αをコードするMch3 λライブラリークローン由来のBam HIフラグメントおよびGSTのC末端と融合した５’非翻訳領域由来の余分の16個のアミノ酸を含む。IPTGを用いた誘導の後に、細菌抽出物を、組換え融合タンパク質を発現しているE.coli.から調製した。抽出物をグルタチオン−セファロース樹脂に吸着させ、数回洗浄し、次いでSDS-PAGEにより分析した。 Mch3α1調製物は、約30kDaのバンドとして移動する主要なGST-融合タンパク質を含んだ。一方、Mch3α2調製物は、約32kDaのバンドとして移動する主要なGST- 融合タンパク質を含む。GST非融合タンパク質コントロールは、約28kDaのタンパク質として移動した。これらの結果は、30kDaおよび32kDaのGST-プロドメイン（ prodomain）融合を生成するMch3αの、細菌中での、最もおそらくは、Asp23での GST-Mch3αの自己触媒的プロセシングおよび切断と一致する。Mch3α1調製物中3 3kDaのバンドとして、およびMch3α2調製物中35kDaのタンパク質として移動する微量のGST-融合タンパク質はまた、主要な30kDaおよび32kDaのバンドより上にそれぞれ観察された。これら二つのバンドは、Mch3αのAsp23のC末端側部位での切断により生成される中間切断産物である。これは、Mch3αプロセシングの最終産物はAsp23のC末端側のAsp部位で切断され、Asp53であるらしいことを示す。実施例II Mch3 αの動力学的性質および酵素活性この実施例は、アポトーシス性システインプロテアーゼMch3のプロテアーゼ活性および基質特異性を特徴付ける。細菌的に発現される組換えMch3αおよびCPP32の動力学的性質を、テトラペプチド基質（substate）DEVD-AMCを用いて、連続的な蛍光定量的なアッセイにおいて測定した。DEVD-AMC基質は、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）切断部位P1-P4テトラペプチド（Nicholsonら、Nature 376:37-43(1995)）である。簡単に述べれば、Mch3αおよびCPP32の活性を、ICE緩衝液（25mM HEPES、1mM EDTA 、5mM DTT、0.1％ CHAPS、10％スクロース、pH 7.5）中の細菌溶解液を使用して、室温（24〜25℃）で測定した。K_iを、阻害剤との酵素の30分間のプレインキュベーションの後に、ICE緩衝液中の50μM DEVDamc（CPP32については10μM）の加水分解速度から測定した。酵素とのインキュベーションの前に、精製したcrmAを、 5mM DTTとの10分間、37℃でインキュベーションによって活性化した。 Mch3αおよびCPP32の両方は、この基質の切断において、それぞれK_m値が51μM および13μMであるミカエリス−メンテンのキネティクスを示した（表Ｉ）。これらのKm値および他の動力学的パラメータを、上記表Ｉに示す。例えば、組換え CPP32（13μM）のK_m値は、最近報告された精製されたヒトCPP32のK_m値（9.7±1. 0μM）（Nicholsonら、前出）に匹敵した。ペプチドアルデヒドDEVD-CHOもまた、低nM濃度（K_iMch3=1.8nMおよびK_iCPP32=0.59nM）で、Mch3αおよびCPP32両方の強力な阻害剤だった。対照的に、ICEインヒビターペプチドアルデヒドYVAD-CH O（K_iICE=0.76nM）は、Mch3αおよびCPP32両方の非常に弱い阻害剤であった（K_i _Mch3 >10μMおよびK_iCPP32=8.5μM）。ICEインヒビター牛痘セルピンであるCrm A もまた同様に、Mch3αおよびCPP32両方の非常に弱い阻害剤であった（K_iMch3>1 μMおよびK_iCPP32 ⁼0.56μM）。これらのデータは、二つの酵素（Mch3αおよびCP P32）が類似の基質特異性を有することを示す。さらに、CPP32またはMch3のいずれかの阻害に必要な高濃度のCrm Aは、アポトーシスにおけるCrm A阻害の標的は、CPP32またはMch3αではないらしいことを示す。従って、アポトーシスのCrm A阻害は、Mch3またはCPP32ではなくICEまたはI CE関連プロテアーゼで媒介されるようである。CPP32もまた、アポトーシスにおけるPARP切断酵素であることが最近報告された（Nicholsonら、前出、およびTew aviら、Cell 81:1-9(1995)）。しかし、本発明者らのデータは、Mch3αが、PARP に対してCPP32と同様の基質特異性を有することを示すので、以前に報告されたこの活性のいくらかはMch3αに起因することがあり得る。例えば、Mch3αとの精製されたウシのPARPまたはヒトのHela細胞の核のインキュベーションは、15分未満でPARPの完全な切断を生じる。同様の活性もまた、アポトーシスに陥ったCPP3 2およびニワトリのDU249細胞由来のS/M抽出物で観察された。セリンプロテアーゼTLCKおよびTPCK（それぞれ、N-トシル-L-リジルクロロメチルケトンおよびN-トシル-L-フェニルアラニルクロロメチルケトン）を用いた阻害の研究は、興味深い結果を明らかにした。１mMのDTT濃度で、TPCKは、Mch3 αおよびCPP32の両方のPARP切断活性を阻害し得た。同じDTT濃度で、TLCKは、Mc h3αを阻害しなかったが、CPP32活性を阻害した。対照的に、５mMのDTT濃度では、TLCKおよびTPCKの両方は、Mch3αもCPP32活性も阻害し得なかった。これらの結果は、チオール試薬の濃度は、システインプロテアーゼの活性ならびにTLCKおよびTPCKのようないくつかの阻害剤に対するこれらの感受性に、有意に影響を与えることを示す。実施例III MCH3 αおよびCPP32の相互関係本実施例は、Mch3αがCPP32の基質であることを示している。 CPP32由来のサブユニットと活性複合体を形成するMch3α由来のサブユニットの能力は、Mch3αがCPP32の基質である（逆もまた同様である）可能性を高めた。この可能性を試験するために、GST-Mch3αおよびGST-CPP32融合タンパク質を、³⁵S-メチオニンの存在下で網状赤血球溶解物中でインビトロ翻訳した。簡単には、Mch3α、Mch3β、GST-Mch3αおよびGST-CPP32のcDNAを、T7プロモーター下のpBluescript II KS⁺プラスミドにサブクローン化した。これらのベクターを、適切な制限酵素で線形化し、そしてT7 RNAポリメラーゼのテンプレートとして用いた。次いでインビトロ合成されたmRNAを、上記のように網状赤血球溶解物でインビトロ翻訳に用いた（Alnemriら、前出）。これらのプロテアーゼの基質特異性を評価するために、標識化した溶解物を、組換え活性CPP32またはMch3α酵素（等しいDEVD-AMC切断活性）とともにインキュベートした。インキュベーション期間の後、切断産物をGST-セファロースに固定化し、数回洗浄し、そしてSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーによって分析した。ベクターの模式図を、図３Ａに示す。切断産物の結果は、CPP32のインビトロ翻訳されたGST-Mch3αとのインキュベーションは、分子量32kDaのGST-プロドメイン切断産物を生じたことを示している（図３Ｂ、レーン５）。このバンドは、細菌で発現されたGST-プロドメインと大きさが類似しており、そして同時に移動した。Mch3αは、インビトロで翻訳されたGST-Mch3αに対するCPP32よりも著しく低い活性を示したが、類似の切断産物が観察された（図３Ｂ、レーン６）。中間体36kDaの小さいGST-プロドメイン切断産物はまた、この反応で見られた。CPP32をインビトロで翻訳されたGSTコントロールとともにインキュベートした場合、またはインビトロで翻訳されたGST-Mch3αを緩衝液とともにインキュベートした場合に切断は観察されなかった（図３Ｂ、レーン２〜４）。同様の実験を、インビトロで翻訳されたGST-CPP32で行った（図３Ｃ）。この場合、CPP32は、その前駆体に対して非常に弱い活性を示し、そしてAsp28での切断から期待されたような30kDaの大きさのかすかなGST-プロドメインのバンドを生じた（レーン３）。緩衝液コントロールまたはMch3α反応では、切断は、観察されなかった（図３Ｃ、レーン１および２）。細菌内で過剰発現した場合に、Mc h3αまたはCPP32は自己活性化／自己プロセスし得るが、そのような工程は、哺乳動物細胞中では調節されるようである。それゆえ、Mch3α前駆体をMch3α自身よりも良好に切断するCPP32の活性、およびCPP32前駆体に対するCPP32またはMch 3αの弱い活性は、Mch3α前駆体がCPP32の下流にあり、そしてCPP32がインビボ活性化のために上流プロテアーゼに依存するらしいことを示している。 CPP32が、GST-Mch3α前駆体を効率的に切断することを観察したという事実を考慮して、GST-プロドメイン由来の切断産物のさらなる精製を行い、そして分析した。簡単には、標識化³⁵S-GST-Mch3α前駆体を、GST-セファロースに固定化し、そして数回洗浄した。樹脂−GST-Mch3α前駆体を、活性CPP32とともにインキュベートし、次いで、固定化GST-Mch3α前駆体から切断した可溶生産物を、10〜 20％勾配SDSゲルで分析し、そしてオートラジオグラフィーで視覚化した（図３Ｄ）。17〜19kDaのタンパク質として移動する３つのバンドは、異なるプロセシング段階でのMch3の大きなサブユニットを示す。同様に、12〜13kDaのサイズの２つのバンドは、Mch3αの小さなサブユニットを示す。30および35kDaのタンパク質として移動するバンドは、プロドメインがないMch3α前駆体を示す。結論として、Mch3遺伝子は、２つのMch3タンパク質（活性Mch3αおよび決定されていない活性を有するMch3βスプライス変異体）をコードする。Mch3とCPP32 との間の高度な相同性、および活性ヘテロマー複合体を形成するためにヘテロ二量体化する能力のために、Mch3β変異体は、Mch3βとCPP32の両方の優性インヒビターとして機能すると思われる。DEVDペプチドおよびPARPに対するそれらの動力学的特性およびそれらの基質特異性に関して、CPP32とMch3αとの間の類似性は、CPP32がアポトーシスにおける唯一のPARP切断酵素でないかもしれないことを示している。Mch3αがCPP32の下流に存在するという可能性は、CPP32がアポトーシスの初期段階でPARP切断酵素となり得たが、Mch3αがPARP切断およびアポトーシスの最終段階に関連し得ることを示唆する。それゆえ、哺乳動物細胞の死プログラムの活性化は、複数の経路によって調節され、そしてアポトーシスの実行は、システインプロテアーゼの異なるカスケードを含み得ると思われる。実施例IV Mch3 インヒピターの同定本実施例は、合成有機化合物のライブラリーからのMch3インヒビターの同定を記載する。アポトーシスを調節するのに有用な化合物を同定するために、化合物のライブラリーを、Mch3阻害活性についてスクリーニングした。簡単には、Mch3を、実施例IIに記載のように細菌内で発現させて、活性プロテアーゼを得た。組換えプロテアーゼの活性を、実施例IIに記載と同様にアッセイした。このアッセイを、30 0を超える合成化合物のライブラリーからMch3αのインヒビターのスクリーニングおよび同定に用いた。スクリーニングにより、強力な阻害活性（IC₅₀ ＜100 nM ）を有する10を超える化合物を同定した。このように同定されたインヒビターの構造は、4.0 nMのIC₅₀を示すベンジルオキシカルボニル-Asp-Glu-Val-Asp-アルデヒドである。本発明は、開示された実施態様に関して記載されているが、当業者は、詳述された特定の実験が、本発明を例示するだけであることを容易に認識する。種々の改変は、本発明の精神を逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は、以下の請求項によってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者アルネムリ，エマドエス. アメリカ合衆国ペンシルバニア 19002, アンブラー，ミーティングハウスロード 805 (72)発明者フェルナンデス−アルネムリ，テレサアメリカ合衆国ペンシルバニア 19002, アンブラー，ミーティングハウスロード 805 (72)発明者リトワック，ジェラルドアメリカ合衆国ペンシルバニア 19096, ウィネウッド，モントゴメリーアベニュー 380 (72)発明者アームストロング，ロバートアメリカ合衆国カリフォルニア 92122, サンディエゴ，スクリップスストリート 5663 (72)発明者トマセリ，ケビンアメリカ合衆国カリフォルニア 92037, ラホヤ，ウェストボーンストリート 539

Claims

【特許請求の範囲】１．Mch3またはその機能的フラグメントをコードする、単離された遺伝子。２．配列番号１または３のコード配列を実質的に含む、請求項１に記載の単離された遺伝子。３．前記機能的フラグメントが、配列番号１または３に示される配列の１本鎖または２本鎖の核酸を含む、請求項１に記載の単離された遺伝子。４．前記機能的フラグメントが、配列番号１または３に示される配列のコード鎖または非コード鎖を含む、請求項１に記載の単離された遺伝子。５．配列番号１もしくは３に示される配列、またはそれらの機能的フラグメントを実質的に含む、Mch3をコードする単離された核酸配列。６．前記機能的フラグメントが、配列番号１または３に示される配列の１本鎖または２本鎖の核酸を含む、請求項３に記載の単離された核酸配列。７．前記機能的フラグメントが、配列番号１または３に示される配列のコード鎖または非コード鎖を含む、請求項３に記載の単離された核酸配列。８．配列番号２および４に示されるアミノ酸配列、またはそれらの機能的フラグメントを実質的に含む、単離されたMch3ポリペプチド。９．前記機能的フラグメントがそのプロテアーゼの触媒ドメインをさらに含む、請求項８に記載の単離されたMch3ポリペプチド。