JP2000350597A

JP2000350597A - 内分泌撹乱物質に結合する一本鎖核酸を得る方法及び内分泌撹乱物質に結合する一本鎖核酸

Info

Publication number: JP2000350597A
Application number: JP11163593A
Authority: JP
Inventors: Shinichi Uechi; 真一上地; Yasuto Ebara; 靖人江原; Nobuyuki Nishiguchi; 信幸西口; Toshio Nakanishi; 俊夫中西
Original assignee: Kubota Corp
Current assignee: Kubota Corp
Priority date: 1999-06-10
Filing date: 1999-06-10
Publication date: 2000-12-19

Abstract

(57)【要約】【課題】内分泌撹乱物質を特異的に認識可能な物質
を、短期間で得る方法を提供する。【解決手段】内分泌撹乱物質と、互いに異なる塩基配
列を有する多数種の一本鎖核酸からなる核酸混合物とを
混合させる混合工程、前記内分泌撹乱物質に対して結合
能を有する前記一本鎖核酸と、前記内分泌撹乱物質との
複合体を形成させる複合体形成工程、前記複合体を遊離
の内分泌撹乱物質及び遊離の一本鎖核酸から分離する分
離工程、分離された前記複合体を前記一本鎖核酸と前記
内分泌撹乱物質に解離させる解離工程を有する内分泌撹
乱物質に結合する一本鎖核酸を得る方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、内分泌撹乱物質、
特にダイオキシン類と結合する一本鎖核酸及びこれを得
る方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、ホルモンのアゴニスト、アンタゴ
ニストとして、又はその他の作用機構によって、化学物
質が動物の内分泌系を撹乱する可能性が示唆されてい
る。そして、このような作用を示す化学物質は、「内分
泌撹乱物質」又は「環境ホルモン」と称されている。前
記内分泌撹乱物質に共通する性質としては、その分子骨
格の中にベンゼン環構造を有するものが多く、又、夫々
の内分泌撹乱物質毎に多くの構造異性体が存在すること
が知られている。

【０００３】ここで、ベンゼン環構造を分子骨格内に有
する内分泌撹乱物質としては、以下のような化学物質が
知られている。工業用化学物質として利用されているも
のとしては、オクチルフェノール、ノニルフェノール、
ペンチルフェノール、ブチルベンジルフタレート、ブチ
ルフタレート及びビスフェノールＡがあり、ポリ塩素化
ビフェニル（ＰＣＢ）類の様に使用が禁止されたものも
ある。殺虫剤として使用されていたものには、ｏ，ｐ′
−ジクロロジフェニルトリクロロエタン（ＤＤＴ）、
ｐ，ｐ′−ＤＤＴ、ｐ，ｐ′−ジクロロジフェニルジク
ロロエチレン（ＤＤＥ）、ｐ，ｐ′−ジクロロジフェニ
ルジクロロエタン（ＤＤＤ）、メトキシクロール、モノ
フェノールメトキシクロール、ビスフェノールメトキシ
クロール、ディコホル及びパーメトリンがある。又、そ
の他にも、アノール、ジヒドロベンツアントラセン等が
知られている。又、前掲の化合物のほかに、内分泌撹乱
物質として特に注目されているものとして、産業活動等
に伴って非意図的に生成されるダイオキシン類が挙げら
れる。ダイオキシン類とは、ポリクロロジベンゾ-パラ-
ジオキシン及び前記ポリクロロジベンゾ-パラ-ジオキシ
ンと同様な毒性を示す類縁化合物を含めた化合物の総称
をいう。そして、前記類縁化合物の例としては、ポリク
ロロジベンゾフラン、コプラナーＰＣＢ、テトラブロモ
ジベンゾチアントレイン、テトラブロモジベンゾ-パラ-
ジオキシン、テトラクロロビフェニレン、テトラクロロ
アゾベンゼン、ヘキサクロロビフェニル等が挙げられ
る。

【０００４】尚、ベンゼン環構造を有しない内分泌撹乱
物質としては、ヘプタクロール、ケポン（クロールデコ
ン）、ジエルドリン、エンドサルファン及びヘキサクロ
ロシクロヘキサンが知られている。

【０００５】又、上述した内分泌撹乱物質の生体或いは
生態系への影響は、まだ研究段階にあり、その影響を把
握するために、前記内分泌撹乱物質を異性体レベルで認
識可能な好感度な分析方法を確立することが重要である
とされている。ここで、従来の手法としては、液体クロ
マトグラフィーを用いたものが知られている。又、ダイ
オキシン類に関しては、抗ダイオキシン類抗体を用いた
イムノアッセイ法を用いて、前記ダイオキシン類を生化
学的に検出する方法も知られている。更に、特開平１０
−２７４６５４号公報に記載されているように、圧電振
動子の表面に、前記内分泌撹乱物質に特異的に結合する
抗体を固定化したバイオセンサも提案されている。

【０００６】ここで、前記イムノアッセイ法及びバイオ
センサにおいて、ターゲット分子を特異的に認識する抗
体は、以下の様に作成される。前記内分泌撹乱物質は、
それ自体、免疫原性を有しないもの(いわゆる、ハプテ
ン)であることが多い。そこで、免疫原性を有する担体
に前記内分泌撹乱物質を結合させたハプテン−担体複合
体を得た後に、これをマウス等の実験動物に接種して、
免疫する。そして、前記免疫された実験動物から抗体生
産細胞（Ｂリンパ球）を採取し、このＢリンパ球と腫瘍
細胞とを融合させて、不死化した融合細胞(以下、「ハ
イブリドーマ」という。)を作成する。更に、前記ハイ
ブリドーマの中から、栄養要求性、抗体生産能の有無等
によって、抗前記内分泌撹乱物質抗体を産生するハイブ
リドーマを選抜して、夫々の単一クローンを単離する。
前記各々の単一クローン由来のハイブリドーマは、特定
の抗原認識部位のみを認識する抗体を生産するものであ
って、前記ハイブリドーマにより産生される抗体を「モ
ノクローナル抗体」と称する。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上述した従来の内分泌
撹乱物質の分析方法によれば、液体クロマトグラフィー
では、サンプルの前処理が煩雑であると共に、構造異性
体の分離が非常に困難であり、前記内分泌撹乱物質、特
に、異性体間で毒性の評価が大きく分かれるダイオキシ
ン類を分析するには、精度及び感度の点で問題があっ
た。一方、前記モノクローナル抗体を用いる内分泌撹乱
物質の分析方法では、免疫されたＢリンパ球を得るため
に、衛生的な環境で、長期間に亘って、前記Ｂリンパ球
の採取源となる実験動物を飼育及び管理しなければなら
ない。従って、前記動物の飼育等のために多大な労力と
投資を要するという問題点があった。又、前記ハイブリ
ドーマから目的とするモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマを選別・単離するために、煩雑な操作と長
い期間を要するという問題点があった。更に、前記モノ
クローナル抗体を用いる手法は、前記液体クロマトグラ
フィーと比較して、内分泌撹乱物質に対する認識能が向
上しているものの、検出感度が不十分であるという問題
点があった。

【０００８】従って、本発明の目的は、上記欠点に鑑
み、前記内分泌撹乱物質を特異的に認識可能な物質を、
短期間で得る方法を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】この目的を達成するため
の本発明に係る内分泌撹乱物質に結合する一本鎖核酸を
得る方法の特徴構成は、内分泌撹乱物質と、互いに異な
る塩基配列を有する多数種の一本鎖核酸からなる核酸混
合物とを混合させる混合工程、前記内分泌撹乱物質に対
して結合能を有する前記一本鎖核酸と前記内分泌撹乱物
質との複合体を形成させる複合体形成工程、前記複合体
を遊離の内分泌撹乱物質及び遊離の一本鎖核酸から分離
する分離工程、前記複合体を前記一本鎖核酸と前記内分
泌撹乱物質に解離させる解離工程を有する点にあり、更
に、前記混合工程において、反応基として内分泌撹乱物
質又はその誘導体を有する充填剤が充填されたアフィニ
ティーカラムに、前記核酸混合物を含む溶液を供給し、
前記複合体形成工程において、前記内分泌撹乱物質に対
して結合能を有する一本鎖核酸と前記内分泌撹乱物質又
はその誘導体との複合体を形成させ、前記分離工程にお
いて、前記アフィニティーカラムに洗浄液を供給して、
前記複合体を遊離の内分泌撹乱物質及び遊離の一本鎖核
酸から分離し、前記解離工程において、前記アフィニテ
ィーカラムに前記複合体を前記一本鎖核酸と前記内分泌
撹乱物質に解離させる溶出液を供給して、前記複合体を
前記一本鎖核酸と前記内分泌撹乱物質に解離させ、前記
内分泌撹乱物質に対して結合能を有する一本鎖核酸を回
収する点にあり、更に、前記一本鎖核酸が一本鎖ＤＮＡ
である点にあり、更に、前記内分泌撹乱物質がベンゼン
環構造を有する内分泌撹乱物質である点にあり、更に、
前記ベンゼン環構造を有する内分泌撹乱物質がダイオキ
シン類である点にある。又、本発明に係る内分泌撹乱物
質に結合する一本鎖核酸の特徴構成は、内分泌撹乱物質
と、互いに異なる塩基配列を有する多数種の一本鎖核酸
からなる核酸混合物とを混合させて、前記内分泌撹乱物
質に対して結合能を有する前記一本鎖核酸と前記内分泌
撹乱物質との複合体を形成させた後に、前記複合体を遊
離の内分泌撹乱物質及び遊離の一本鎖核酸から分離し、
更に、前記複合体を前記一本鎖核酸と前記内分泌撹乱物
質に解離させて得られる点にあり、更に、内分泌撹乱
物質又はその誘導体を結合した充填剤が充填されたアフ
ィニティーカラムに、前記核酸混合物を含む溶液を供給
し、前記内分泌撹乱物質に対して結合能を有する一本鎖
核酸と前記内分泌撹乱物質又はその誘導体との複合体を
形成させた後に、前記アフィニティーカラムに、遊離の
内分泌撹乱物質及び遊離の一本鎖核酸を分離するための
洗浄液を供給し、更に、前記複合体を内分泌撹乱物質と
一本鎖核酸に解離させる溶出液を供給することによっ
て、前記複合体を前記一本鎖核酸と前記内分泌撹乱物質
に解離させて得られる点にあり、更に、前記一本鎖核酸
が一本鎖ＤＮＡである点にあり、更に、前記内分泌撹乱
物質がベンゼン環構造を有する内分泌撹乱物質である点
にあり、更に、前記ベンゼン環構造を有する内分泌撹乱
物質がダイオキシン類である点にある。そして、これら
の作用効果は、以下の通りである。

【００１０】発明者らは、一本鎖核酸の塩基配列及び構
造解析が容易であること、化学合成又はクローニングに
よって容易に入手可能であること、更に、低分子量化合
物（例えば、ＡＴＰ、糖脂質等）に対して結合能を有す
るとの報告がなされており分子認識のツールとして利用
可能であることに着目して、前記内分泌撹乱物質に対し
て結合能を有する一本鎖核酸を検索することに想到し、
本発明を完成した。

【００１１】特に、前記内分泌撹乱物質に対して結合能
を有する分子種として核酸を用いた利点は、保存そのも
のが容易である上に、一旦塩基配列が明らかになれば必
ずしもその配列を有する核酸を保存する必要はなく、化
学合成によって新規に入手可能である点にある。前記モ
ノクローナル抗体の場合、前記モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマが死滅すると入手不能となる。ここで、
発明者らは、二本鎖核酸と比較して一本鎖核酸は立体的
構造のとり得る範囲の自由度が高いことに注目して、二
本鎖の核酸ではなく、一本鎖の核酸を用いて、前記内分
泌撹乱物質に対する結合能を有する核酸の検索を行なっ
た。二本鎖ＤＮＡは、通常、相補的な塩基配列を有する
核酸同士が規則正しく水素結合を形成して非常に安定な
螺旋構造をとっている。そして、この螺旋構造を構成す
る二本鎖ＤＮＡと、前記内分泌撹乱物質のような低分子
量化合物が相互作用する場合、配列非特異的なインター
カレーションとなることが多い。一方、一本鎖ＤＮＡの
立体構造は特に定まった構造を有するものではなく、こ
れを構成する塩基の配列とその分子を取り巻く環境に依
存して種々変化するために、多様な立体構造をとり得
る。従って、前記内分泌撹乱物質に対する結合能を有す
る核酸を検索する際には、一本鎖核酸を用いるほうが効
率的である。

【００１２】そして、具体的には、前記内分泌撹乱物質
に対して結合能を有する一本鎖核酸は、以下のようにし
て得られる。先ず、前記内分泌撹乱物質を、互いに異な
る塩基配列を有する多数種の前記一本鎖核酸からなる核
酸混合物と混合して、前記内分泌撹乱物質に対して結合
能を有する前記一本鎖核酸と、前記内分泌撹乱物質との
複合体を形成させる。ここで、前記モノクローナル抗体
の場合は、通常、前記内分泌撹乱物質のような非タンパ
ク質性低分子化合物を直接認識することは出来ないの
で、免疫源性を有する担体とのハプテン−担体複合体を
作成する必要がある。ところが、前記一本鎖核酸の場合
は、それ自身が直接ターゲットとなる分子に結合する。
この段階では、前記複合体は、遊離の内分泌撹乱物質及
び遊離の一本鎖核酸と混在しているので、不必要な遊離
の内分泌撹乱物質及び遊離の一本鎖核酸を、前記複合体
から分離して除去する。更に、分離された前記複合体
を、前記一本鎖核酸と前記内分泌撹乱物質に解離させる
と、前記内分泌撹乱物質に対して結合能を有する一本鎖
核酸を得ることが出来る。

【００１３】更に具体的には、前記の操作は、アフィニ
ティークロマトグラフィーにより行なうことが出来る。
即ち、前記内分泌撹乱物質を結合した充填剤を調製し
て、この充填剤が充填されたアフィニティーカラムを作
成し、これを用いて前記内分泌撹乱物質に対して結合能
を有する一本鎖核酸を分離するものである。尚、目的と
する内分泌撹乱物質そのものを充填剤に結合させること
が困難である等の事情がある場合には、前記充填剤との
結合が容易となるべく鎖状構造等を付加した前記内分泌
撹乱物質の誘導体を用いても良い。前記アフィニティー
カラムに、前記核酸混合物を含む溶液を供給して、前記
充填剤に結合した前記内分泌撹乱物質と、前記内分泌撹
乱物質に対して結合能を有する一本鎖核酸との複合体を
形成させた後に、前記アフィニティーカラムに洗浄液を
供給して、前記複合体を遊離の内分泌撹乱物質及び遊離
の一本鎖核酸から分離する。そして、前記複合体を前記
一本鎖核酸と前記内分泌撹乱物質に解離させる溶出液
を、前記アフィニティーカラムに供給すると、前記複合
体が前記一本鎖核酸と前記内分泌撹乱物質に解離し、前
記内分泌撹乱物質に対して結合能を有する一本鎖核酸
が、前記アフィニティーカラムを通過した前記溶出液に
含まれることとなるので、これを回収すれば良い。

【００１４】尚、前記一本鎖核酸として、一本鎖ＤＮＡ
を用いると、化学的安定性に優れているため、分離操作
時のハンドリングが容易になると共に、前記方法によっ
て得られた前記内分泌撹乱物質に対して結合能を有する
一本鎖核酸の取り扱いも容易となる。

【００１５】前記内分泌撹乱物質の中でもベンゼン環構
造を有するものは、構造異性体が生じ易く、前記液体ク
ロマトグラフィー等では、夫々の異性体を正確に区別す
ることが困難である。ここで、本発明に係る内分泌撹乱
物質に対して結合能を有する一本鎖核酸は、これらの異
性体を正確に区別することが出来る点で、優れている。

【００１６】又、前記ベンゼン環構造を有する内分泌撹
乱物質の中でも、異性体間で毒性評価が大幅に異なるダ
イオキシン類を、異性体レベルで認識可能な分子は、そ
の分析等において利用価値が高いものである。

【００１７】

【発明の実施の形態】以下に本発明の実施の形態を、ダ
イオキシン類に対して結合能を有する一本鎖ＤＮＡを例
に挙げて説明する。

【００１８】〔一本鎖ＤＮＡプールの構築〕まず、目的
とするダイオキシン類に対して結合能を有する一本鎖Ｄ
ＮＡ（以下、「ダイオキシン結合一本鎖ＤＮＡ」とい
う。）の分離源となる一本鎖ＤＮＡプールを調製する。
前記一本鎖ＤＮＡプールは、市販のＤＮＡライブラリを
用いても良く、又、自ら調製することも可能である。こ
こで、生物由来の一本鎖ＤＮＡプールは前記塩基配列の
組み合わせが生物種や細胞の状態によって限定されるの
で、塩基配列のバリエーションを考慮すると、化学合成
された一本鎖ＤＮＡプールを使用することが好ましい。
前記化学合成一本鎖ＤＮＡプールでは、実質的にその塩
基長でとり得るすべての組み合わせを有するように、互
いに異なる塩基配列を有する多数種の一本鎖ＤＮＡの混
合物によって構成することが出来る。ここで、更に前記
塩基配列のバリエーションを豊富なものとするために、
前記ＤＮＡとして、核酸の構成要素として自然界に存在
する塩基の代わりに、それらを化学修飾した誘導体に置
換したＤＮＡを用いても良い。又、前記一本鎖核酸プー
ルを構成する各々の一本鎖ＤＮＡを、その端部に制限酵
素の認識配列となるリンカー配列又はＰＣＲプライマー
結合配列を含むように調製すると、後述するＰＣＲ増幅
・クローニング操作が容易となる。尚、前記一本鎖ＤＮ
Ａプールを化学合成により構築する場合、合成方法の制
約から、前記一本鎖ＤＮＡの塩基配列の全長が各々１３
０塩基以内となるように設計することが好ましい。

【００１９】〔ダイオキシン類結合一本鎖ＤＮＡの選
抜〕充填剤に結合させるために必要な構造（例えば、ア
ミノ基、カルボキシル基等）を付加したダイオキシン誘
導体を作成し、定法に従って、前記ダイオキシン誘導体
を充填剤（例えば、アガロース、セファロース（ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ製）等）に結合させて、ダイオキシン類を
特異的に吸着可能なアフィニティーカラムに用いる充填
剤を得る。そして、前記ダイオキシン誘導体を結合させ
た充填剤を充填したカラムに、前記一本鎖ＤＮＡプール
を含む液を供じた後に、洗浄液（例えば、Ｔｒｉｓ緩衝
溶液等）を前記カラムに流して、前記ダイオキシン類誘
導体と結合しなかった一本鎖ＤＮＡを取り除く。次い
で、前記ダイオキシン類誘導体に結合した一本鎖ＤＮＡ
を前記ダイオキシン類誘導体から解離させるべく、溶出
液（例えば、アルカリ性水溶液（ｐＨ１２）等）を前記
カラムに供じる。前記カラムを通過した溶出液（ダイオ
キシン結合画分）には、前記ダイオキシン類誘導体に結
合していた一本鎖ＤＮＡが含まれるので、これを回収し
て以下の操作に供じる。

【００２０】〔ダイオキシン結合画分から得られたＤＮ
Ａの増幅〕前記ダイオキシン結合画分に含まれる一本鎖
ＤＮＡ（必要に応じて、前記ダイオキシン結合画分から
前記一本鎖ＤＮＡを精製して供じても良い）を鋳型とし
て、ポリメラーゼの連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」とい
う。）を行なって、前記一本鎖ＤＮＡを増幅する。ここ
で、ある物質に特異的に結合する一本鎖ＤＮＡの相補鎖
が、必ずしも前記物質に結合するものではないことが知
られているので、かかる不活性な相補鎖が、前記ＰＣＲ
によって増幅し、前記ダイオキシン類と結合した一本鎖
ＤＮＡと混合することを抑制する必要がある。そのた
め、目的とする一本鎖ＤＮＡを主として増幅させる非対
称ＰＣＲを行なったり、或いは、前記一本鎖ＤＮＡを複
製するためのプライマーをビオチンで標識しておいて、
アビジン（又はストレプトアビジン）を備えた充填剤を
充填したカラムで分別回収する等の対策を講じることが
好ましい。

【００２１】尚、前述の選抜によって得られるダイオキ
シン結合一本鎖ＤＮＡの量は極僅かであることが多いの
で、後述する解析操作等の便宜のために、増幅・選抜操
作を複数回行なっても良い。このとき、前述の選抜条件
又は増幅条件を厳しくしながら前記選抜又は増幅操作を
繰り返し行うことによって、更に結合能の高い一本鎖Ｄ
ＮＡを選抜することも可能である。

【００２２】〔クローニング・塩基配列決定〕前記ダイ
オキシン結合一本鎖ＤＮＡを安定に保存し、又容易に入
手可能とするために、前記ダイオキシン結合一本鎖ＤＮ
Ａをウィルス、プラスミド等にクローニングすることが
好ましい。そして、前述の操作を経て選抜された前記ダ
イオキシン結合一本鎖ＤＮＡの塩基配列の解析は、酵素
法等の定法に従って行なうことが出来る。このようにし
て、単離・同定された前記ダイオキシン結合一本鎖ＤＮ
Ａは、化学合成により、又は前記クローニングによって
得られたプラスミドクローン、ファージクローン等から
調製することによって容易に且つ大量に得ることが出来
る。

【００２３】尚、前記塩基配列が決定された一本鎖ＤＮ
Ａを結合させた充填剤を調製して、前記充填剤が充填さ
れたアフィニティーカラムに、目的とするダイオキシン
類を含む溶液を流し、目的とするダイオキシン類と前記
一本鎖核酸が結合することを確認した後に、後述する実
施例に提供することが好ましい。

【００２４】上述した本発明に係るダイオキシン結合一
本鎖ＤＮＡを得る方法によれば、理論的には１ヶ月ほど
で前記ダイオキシン結合一本鎖ＤＮＡを同定することが
可能である。従って、前記モノクローナル抗体を作成す
る場合と比較して、短期間で前記ダイオキシン類を認識
可能な分子を得ることが出来る。又、前記ダイオキシン
結合一本鎖ＤＮＡを得るために、動物を飼育する必要が
なく、労力と投資を削減することも出来る。更に、単離
操作は、クローニングを除いて全て無生物系で行なわれ
るので、再現性が良いと考えられる。又、上述した本発
明に係るダイオキシン結合一本鎖ＤＮＡを、前記ダイオ
キシン類の分析に用いれば、前掲の液体クロマトグラフ
ィー法と比較して、サンプルに含まれる夾雑物の影響が
少なく、又、容易に構造異性体レベルで前記ダイオキシ
ンを認識することも可能であると考えられる。従って、
精度及び感度の点で、前掲の液体クロマトグラフィーに
勝る分析方法を提供することが出来ると考えられる。

【００２５】

【実施例】〔ダイオキシン類除去装置〕図１（ａ）及び
（ｂ）は、本発明に係るダイオキシン結合一本鎖ＤＮＡ
を利用したダイオキシン類除去装置１を表わしたもので
ある。前記ダイオキシン類除去装置１は、図１（ａ）に
示すように、ステンレス鋼製又はＦＲＰ製のケーシング
１０に、処理すべき溶液を供給するための給水孔１１及
び処理した前記溶液を排出するための排水孔１２を設け
てあると共に、前記ケーシング１０の内部には、ガラス
又はプラスチックを基材としてその表面に前記ダイオキ
シン結合一本鎖ＤＮＡを担持したフィルタ２が積層して
設けられている（前記ダイオキシン結合一本鎖ＤＮＡを
前記基材に固定する為に、前記基材をアビジンでコーテ
ィングしても良い。）。尚、前記ダイオキシン類除去装
置１は、前記ダイオキシン結合一本鎖ＤＮＡを担持した
フィルタ２に代えて、前記ダイオキシン結合一本鎖ＤＮ
Ａを担持した粒子状の充填剤を内蔵して構成されていて
も良い。

【００２６】ダイオキシン類を含む溶液を、前記給水孔
１１より前記ケーシング１０に注入すると、前記溶液
は、前記フィルタ２を通過して前記排水孔１２から排出
されることとなる。ここで、前記ダイオキシン類３は、
図１（ｂ）に示すように、前記フィルタ２を通過する際
に基材２１に担持された前記ダイオキシン結合一本鎖Ｄ
ＮＡ２２に吸着されて、前記溶液から除去される。従っ
て、前記排水孔１２から排出された溶液は、前記ダイオ
キシン類３を含まない。尚、前記フィルタ２は、使用後
に回収して、前記ダイオキシン類３を分解処理して処分
することも出来、又、前記ダイオキシン類３を前記ダイ
オキシン結合一本鎖ＤＮＡ２２から解離させることが出
来る溶出液で洗浄することによって再生して再利用する
ことも出来る。

【００２７】前記ダイオキシン類除去装置１は、ダイオ
キシン類を含む溶液を浄化する設備、例えば、下水処理
施設、工業排水処理施設、又は埋立地等における浸出水
処理施設に適用可能であると考えられる。前記浸出水処
理施設４は、図２に示すように、ｐＨ調整装置４０、生
物的処理装置４１、凝集・沈殿処理装置４２及び前記ダ
イオキシン類除去装置１を記載順に夫々接続して構成す
ることが出来る。浸出水は、ｐＨ調整装置４０によっ
て、微生物の生育に適したｐＨ域に調整された後に、前
記生物的処理装置４１に送られる。ｐＨ調整された浸出
水の有機物等は、膜に固定された微生物によって分解さ
れる。そして、前記凝集・沈殿処理装置４２において、
前記生物的処理を受けた浸出水に凝集剤を添加して、前
記浸出水に残存する汚濁物質を凝集させて重力沈降作用
によって除去する。このように処理された前記浸出水
は、最終的に前記ダイオキシン類除去装置１を通過して
ダイオキシン類を除去した後に、埋立地外へと放流され
る。

【００２８】〔別実施形態〕以下に別実施形態を説明す
る。本発明に係る内分泌撹乱物質に対して結合能を有す
る一本鎖核酸と前記内分泌撹乱物質との結合能を利用し
た例として、前記ダイオキシン類除去装置１を例示した
が、同様に、内分泌撹乱物質の検出並びに定量に利用す
ることが出来ると考えられる。又、前記内分泌撹乱物質
に対して結合能を有する一本鎖核酸と、これに結合した
前記内分泌撹乱物質は、容易に解離させることが出来る
ので、前記内分泌撹乱物質を濃縮或いは回収するために
用いることも可能であると考えられる。

【００２９】又、前記ＤＮＡプールからダイオキシン類
結合一本鎖ＤＮＡを選抜するために、アフィニティーク
ロマトグラフィーを用いたが、マグネティックビーズ、
水晶発振子又は表面プラズモン共鳴バイオセンサを用い
て、前記ダイオキシンと結合するＤＮＡを選抜しても良
い。

【００３０】本発明の実施形態についてダイオキシン結
合一本鎖ＤＮＡを例示して説明したが、本発明に係る内
分泌撹乱物質と結合する一本鎖核酸を得る方法は、前記
ダイオキシン類と前記一本鎖ＤＮＡとの間でのみ観察さ
れる特殊な相互作用に基づくものではなく、前記内分泌
撹乱物質と一本鎖核酸との間に広く生じ得る相互作用に
基づくものである。従って、前記内分泌撹乱物質と結合
する一本鎖核酸を得る方法を用いることによって、前掲
のベンゼン環構造を有する内分泌撹乱物質或いは他の構
造からなる内分泌撹乱物質と結合する一本鎖核酸を得る
ことが出来ると考えられる。ここで、前記一本鎖核酸と
して一本鎖ＲＮＡを用いる場合には、前記ＰＣＲによる
核酸の増幅に際して、ＲＮＡをＤＮＡの形態に変換して
供する必要がある。従って、一本鎖ＲＮＡをＤＮＡに転
写してこれをＰＣＲに供し、又、前記ＰＣＲにより得ら
れた産物をＲＮＡに逆転写した後に選抜する必要があ
る。そこで、これらの操作の便宜のために、前記一本鎖
ＲＮＡを、前記転写反応と逆転写反応を触媒する酵素の
認識塩基配列を含むように設計することが好ましい。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係るダイオキシン類と結合能を有する
一本鎖ＤＮＡを用いたダイオキシン類除去装置の断面図

【図２】前記ダイオキシン類除去装置を備えた浸出水処
理施設の概略図

【符号の説明】

１ダイオキシン類処理装置２フィルタ２２ダイオキシン類に対して結合能を有する一本鎖Ｄ
ＮＡ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｒ 30/88 30/88 Ｅ // Ｃ１２Ｎ 15/09 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者西口信幸兵庫県尼崎市浜１丁目１番１号株式会社クボタ技術開発研究所内 (72)発明者中西俊夫兵庫県尼崎市浜１丁目１番１号株式会社クボタ技術開発研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA09 HA12 4B063 QA01 QQ42 QR32 QR54 QS02 QS15 4D017 AA01 BA04 CA11 DA03 4D024 AA04 AB11 BA17 4G066 AB30B CA01 CA20 CA33 DA08 EA02 FA11 FA40

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】内分泌撹乱物質と、互いに異なる塩基配
列を有する多数種の一本鎖核酸からなる核酸混合物とを
混合させる混合工程、前記内分泌撹乱物質に対して結合能を有する前記一本鎖
核酸と、前記内分泌撹乱物質との複合体を形成させる複
合体形成工程、前記複合体を遊離の内分泌撹乱物質及び遊離の一本鎖核
酸から分離する分離工程、分離された前記複合体を前記一本鎖核酸と前記内分泌撹
乱物質に解離させる解離工程を有する内分泌撹乱物質に
結合する一本鎖核酸を得る方法。
【請求項２】前記混合工程において、内分泌撹乱物質
又はその誘導体を結合した充填剤が充填されたアフィニ
ティーカラムに、前記核酸混合物を含む溶液を供給し、前記複合体形成工程において、前記内分泌撹乱物質に対
して結合能を有する一本鎖核酸と前記内分泌撹乱物質又
はその誘導体との複合体を形成させ、前記分離工程において、前記アフィニティーカラムに洗
浄液を供給して、前記複合体を遊離の内分泌撹乱物質及
び遊離の一本鎖核酸から分離し、前記解離工程において、前記アフィニティーカラムに前
記複合体を前記一本鎖核酸と前記内分泌撹乱物質に解離
させる溶出液を供給して、前記複合体を前記一本鎖核酸
と前記内分泌撹乱物質に解離させ、前記内分泌撹乱物質
に対して結合能を有する一本鎖核酸を回収する請求項１
に記載の内分泌撹乱物質に結合する一本鎖核酸を得る方
法。
【請求項３】前記一本鎖核酸が一本鎖ＤＮＡである請
求項１又は２に記載の内分泌撹乱物質に結合する一本鎖
核酸を得る方法。
【請求項４】前記内分泌撹乱物質がベンゼン環構造を
有する内分泌撹乱物質である請求項１乃至３の何れか一
項に記載の内分泌撹乱物質に結合する一本鎖核酸を得る
方法。
【請求項５】前記ベンゼン環構造を有する内分泌撹乱
物質がダイオキシン類である請求項４に記載の内分泌撹
乱物質に結合する一本鎖核酸を得る方法。
【請求項６】内分泌撹乱物質と、互いに異なる塩基配
列を有する多数種の一本鎖核酸からなる核酸混合物とを
混合させて、前記内分泌撹乱物質に対して結合能を有す
る前記一本鎖核酸と前記内分泌撹乱物質との複合体を形
成させた後に、前記複合体を遊離の内分泌撹乱物質及び
遊離の一本鎖核酸から分離し、更に、前記複合体を前記
一本鎖核酸と前記内分泌撹乱物質に解離させて得られる
内分泌撹乱物質に結合する一本鎖核酸。
【請求項７】内分泌撹乱物質又はその誘導体を結合し
た充填剤が充填されたアフィニティーカラムに、前記核
酸混合物を含む溶液を供給し、前記内分泌撹乱物質に対
して結合能を有する一本鎖核酸と前記内分泌撹乱物質又
はその誘導体との複合体を形成させた後に、前記アフィ
ニティーカラムに、遊離の内分泌撹乱物質及び遊離の一
本鎖核酸を分離させるための洗浄液を供給し、更に、前
記複合体を内分泌撹乱物質と一本鎖核酸に解離させる溶
出液を供給することによって、前記複合体を前記一本鎖
核酸と前記内分泌撹乱物質に解離させて得られる請求項
６に記載の内分泌撹乱物質に結合する一本鎖核酸。
【請求項８】前記一本鎖核酸が一本鎖ＤＮＡである請
求項６又は７に記載の内分泌撹乱物質に結合する一本鎖
核酸。
【請求項９】前記内分泌撹乱物質がベンゼン環構造を
有する内分泌撹乱物質である請求項６乃至８の何れか一
項に記載の内分泌撹乱物質に結合する一本鎖核酸。
【請求項１０】前記ベンゼン環構造を有する内分泌撹
乱物質がダイオキシン類である請求項９に記載の内分泌
撹乱物質に結合する一本鎖核酸。